CZ308897A3 - Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy - Google Patents
Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308897A3 CZ308897A3 CZ973088A CZ308897A CZ308897A3 CZ 308897 A3 CZ308897 A3 CZ 308897A3 CZ 973088 A CZ973088 A CZ 973088A CZ 308897 A CZ308897 A CZ 308897A CZ 308897 A3 CZ308897 A3 CZ 308897A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- gene
- adenovirus
- gax
- cell
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 52
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 69
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 101100022881 Rattus norvegicus Meox2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 101150029117 meox2 gene Proteins 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 3
- 101100348341 Caenorhabditis elegans gas-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 3
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 101150036170 gas-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100447658 Mus musculus Gas1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100293593 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) nar-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N Propylene oxide Chemical compound CC1CO1 GOOHAUXETOMSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- VPEFOFYNHBWFNQ-UFYCRDLUSA-N Tyr-Pro-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VPEFOFYNHBWFNQ-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- 206010072810 Vascular wall hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004219 arterial function Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 240000004308 marijuana Species 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000008747 mitogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- -1 neurofilaments Proteins 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229940044476 poloxamer 407 Drugs 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 108091008672 sterol hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004026 tunica intima Anatomy 0.000 description 1
- 210000004231 tunica media Anatomy 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000216 vascular lesion Toxicity 0.000 description 1
- 230000006439 vascular pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nové, zvlášť účinné, metody léčení patologií spojených s hyperproliferativními onemocněními prostředky genové terapie. Způsob podle předkládaného vynálezu sestává, konkrétněji, ve specifickém blokování proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva (vasculár smooth-muscle cells - VSMC) pomocí in vivo přenosu genu gax. Způsob podle předkládaného vynálezu je velmi účinně upraven pro léčení postangioplastických restenos pomocí přeexprimování gax genu ve vaskulární stěně. Podle předkládaného vynálezu lze gax gen přenášet pomocí virových vektoru. Tyto vektory jsou s výhodou adenov.i rové vektory.
Dosavadní stav techniky
Byly izolovány různé geny, které jsou spojeny s blokováním buněčného oddělení. Tím dojde k tomu, že gas (růst-blokování specifický: gas 1 až 6) a gadd (růst-blokování a vyvolatelný DNA poškozením: gadd34, gadd45 a gaddl53) geny jsou silně exprimovány ve kv.iscentn.ich buňkách, to znamená v buňkách, které jsou blokovány v GO fázi buněčného cyklu (Schneider a kol., Cell 1988, 54: 787-793; Del Sat a kol., Cell 1992, 12:
3514-3521; Cowled a kol., Exp. Cell. Res. 1994, 211: 197-202; Brancolini a Schneider, J. Cell. Biol. 1994, 124: 743-7.56; Zhan a kol., Mol. Cell. Biol. 1993, .13: 4242-4250; Jackman a kol., Cancer Res. 54: 5656-5662, 1994). V souladu s těmito zjištěními o genové expresi, mikroinjekce gas-1 proteinu blokuje syntézu DNA (Del Sat a kol., Cell, 1992, 70: 595-607). Naopak přidání růstového faktoru jako je PDGF (platelet-derived growth factor - růstový faktor odvozený z destiček) nebo fetální telecí sérum snižuje expresi těchto genu u in vitro modelů (Coccia a kol. Mol. Cell. Biol. 1992, 12: 3514-3521) . O této specií i tě exprese ve vztahu k stavu proliferace buňky se také jeví, že má svůj protějšek in vivo. Takto je gen gas-1 silně exprimován v děloze u myší po vyjmutí vaječníků (Ferrero a Cairo, Cell. Biol. Int. 1993, 17,
857-862). U téhož zvířecího modelu vedlo léčení estrogeny k buněčné proliferaci, která je umístěna v děloze, a projevuje se zvýšením exprese proto-onkogenu c-myc a snížením exprese genu gas-1. Podobně u hepatitického modelu proliferace/regenerace je exprese genu gas-6 silně omezena po dobu čtyř hodin po částečné heptatektomii, tj. v době přenosu z GQ na Gl; tato exprese se vrátí k normálu, pravděpodobně jakmile bylo jednou iniciováno dělení hepatocytů (Ferrero a kol, J. Cell. Physiol. 1994, 158: 263-269).
Podstata vynálezu
Předkladatel vynálezu se zajímal o nový gen, tj. gen gax (růst-blokování specifický homeobox) a prokázal, že tento gen má vlastnosti, které jsou zejména výhodné pro použití v genové terapii hyperproiiferativních nemocí, zejména restenosy. Gax gen byl původně zjištěn v cDNA knihovně připravené z krysí aorty. Kóduje protein o 303 aminokyselinách. Jeho sekvence byla charakterizována a jeho cDNA byla klonována (Gorski a kol. Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733)-. Gax gen má určité vlastnosti, které jsou podobné těm u genů gas a gadd, protože se také zdá, že reguluje přenos G0/G1 v buněčném cyklu. Stejným způsobem je hladina gax mRNA snížena u krysích VSMC desetkrát po dvou hodinách po vystavení PDGF (Gorski a kol. Mol. Cell. Biol. 1993, 6, 3722-3733). Exprese gax genu je proto potlačena během VSMC mitogenní odpovědí.
Jednou z výhod způsobu podle předkládaného vynálezu je principiálně specifita exprese gax genu. Takto, u dospělých ·· ·· krys, je gax gen hlavně exprimován v kardiovaskulárním (aorta a srdce) systému. Na druhou stranu při demonstrování přítomnosti gax mRNA v játrech, mozku, žaludku nebo kosterních svalech selhal northern blott. Post-angioplasticná restenose je lokalizovaná hyperproliferativní nemoc., která se rozvíjí po nechirurgické intervenci v oblasti atherosklerotické skvrny. Díky tomu vede léčení otheroskierot.lckých lézá angi opi ast i i často (až 50 % případů v určitě studii) k restenose, po které následuje mechanické poškození arteriální stěny. Klíčovou událostí tohoto mechanismu je proliferace a migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva (VSMC) z tunice media směrem do tunice intima-, zejména z důvodu nepřítomnosti chránění a/nebo zpětné vazby endothelíálnich buněk v tunica intima. Schopnost selektivně exprimovat antiproliferativní gen podle předkládaného vynálezu ve VSMC buňkách je velmi podstatnou výhodou.
Další výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že gax gen patří do skupiny homeotických genu. Tyto geny kódují transkripční faktory, které obsahují sekvence (nebo homeodomény), které rozpoznávají kokrétní oblasti DNA (nebo homeoboxu) (review; Gehring a kol. Cell, 788: 211-223, 1994). Homeodoména krysího gax proteinu je obsažena mezi aminokyselinami 185 a 245. Zajímavé je, že homeotické geny, které byly do současné doby identifikovány jsou zahrnuty v kontrole buněčné proliferace/rustu během embryogeneze, a tak posilují terapeutický potenciál způsobu podle předkládaného vynálezu (review: Lawrence a Morata Cell 78: 181-198, 1994; Krumlauf, Cell 78: 191-201, 1994).
Předkládaný vynález se tak týká poškozeného rekombinantního viru, který obsahuje přinejmenším jeden vložený gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu. Vynález se také týká použití takových virů pro léčeni hyperproli ferativních patologií.
·> ·
Ve virech podle předkládaného vynálezu muže být vložený gen fragmentem komplementární DNA (cDNA) nebo genomické DNA (gDNA) nebo hybridní konstrukt sestávající, například, z cDNA, do které byl vložen jeden nebo více intronú. Gen také obsahuje syntetické nebo polosyntetické sekvence,.Jak již bylo uvedeno, gen muže být gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo to muže být variant tohoto proteinu. V předkládaném vynálezu označuje pojem variant jakýkoliv mutant, fragment nebo peptid, který má přinejmenším jednu biologickou vlastnost GAX, stejně jako jakýkoliv homolog GAX, který byl získán z jiných zdrojů. Tyto fragmenty a varianty lze získat jakoukoliv technikou známou odborníkům, zejména genetickými a/nebo chemickými a/nebo enzymatickými modifikacemi nebo hybridizací nebo expresním klonováním, umožňující, aby byly varianty vybrány podle jejich biologické aktivity. Genetické modifikace zahrnují supresi, deleci, mutaci atd.
V předkládaném vynálezu je vložený gen, s výhodou, gen ..kódující celý nebo část krysího GAX proteinu nebo jeho lidského homologu. Ještě výhodněji se jedná o CDNA nebo gDNA.
Obecně vložený gen také obsahuje sekvence, které umožňují, aby byl exprimován v infikovaných buňkách. Tyto sekvence mohou být sekvencemi, které jsou přirozeně odpovědné za expresi daného genu, pokud jsou tyto sekvence schopné funkce v infikované buňce. Sekvence také mohou být různého původu (odpovědné za expresi různých proteinů nebo dokonce syntetických proteinů). Zejména to mohou být sekvence eukaryotních nebo virových genu nebo odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a vyvolatelným nebo nevyvolátelným způsobem. Jako příklad se může jednat o promotorovou sekvenci, která je odvozena z genomu buňky, kterou je žádoucí infikovat nebo z genu viru, zejména promotoru adenovirové E1A a MLP genu, CMV nebo LTR-RSV promotoru atd. Eukaryotní promotory, které lze také uvést, jsou všudypřítomné promotory (HPRT, • · vimentin, aktin, tubulin, atd.), promotory přechodného vlákna (desmin, neurofilamenty, keratin, GFAP, atd.), promotory terapeutického genu (typ MDR, CFTR, faktor VIII, atd.) tkáň-specifické promotory (aktin promotor v buňkách hladkých svalu), promotory, které jsou, s výhodou aktivovány v dělicích se buňkách, nebo jiné promotory, které reagují na stimuly (receptory steroldního hormonu, receptory retinové kyseliny, atd.) Navíc, tyto expresní sekvence lze modifikovat přidáním aktivujících sekvencí, regulačních sekvencí, atd. Jinak, pokud vložený gen neobsahuje jakékoliv exprimované sekvence, lze jej vložit do genomu poškozeného viru v protisměru takové sekvence.
Navíc, vložený gen obecně zahnuje, ve směru kódující sekvence, signální sekvenci, která mé směruje syntetizovaný polypeptid do vylučovacích cest cílové buňky. I když tato .signální sekvence může být přirozená GAX signální sekvence, muže to také být jiná funkční signální sekvence (například genu pro thymidin kinasu) nebo umělá signální sekvence.
Viry podle předkládaného vynálezu jsou poškozené viry, a proto nejsou schopné autonomní replikace v cílové buňce. Obecně, gen defektních viru, které se používají podle předkládaného vynálezu neobsahuje přinejmenším sekvence, které jsou nutné pro replikaci daného viru v infikované buňce. Tyto oblasti lze buď vyjmout (celé .nebo část), vyřadit z funkce nebo je lze nahradit jinými sekvencemi, zejména vloženým genem. S výhodou si poškozený virus uchovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro zakapsidování virových částic.
Virus podle předkládaného vynálezu je odvozen od adenovirů, adenosouvisejícího viru (AAV) nebo od retroviru. Podle jednoho preferovaného provedení je virus adenovirus.
Existují různé serotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Z těchto serotypu jsou podle předkládaného vynálezu k použití preferovány typ 2 nebo typ 5 lidského adenovirů (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího • · ·· ·
původů (viz přihláška WO94/26914). Adenoviry zvířecího původu, které lze použít podle předkládaného vynálezu jsou adenoviry psí, hovězí (Mávl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), vepřové, z paviánů nebo jiných opic (SAV). S výhodou je adenovirus zvířecího původu psí adenovirus, ještě výhodněji CAV2 adenovirus [Manhattan nebo A26/61 kmen (ATCC VR-800), například]. S výhodou se podle předkládaného vynálezu používají adenoviry lidské, psí nebo směs obou.
S výhodou zahrnují poškozeně viry podle předkládaného vynálezu ITR, kapsidačni sekvenci a nukleovou kyselinu. Ještě zajímavější je v genomu adenovi.ru podle předkládaného vynálezu, že přinejmenším oblast El je nefunkční. Virový gen lze upravit tak, že je nefunkční, jakoukoliv technikou známou odborníkům, zejména úplným odstraněním, nahrazením, Částečnou deleci nebo přidáním jedné nebo více bází k uvažovanému genu (genům). Takových úprav lze dosáhnout in vitro (na izolované DNA) nebo in sítu, například použitím technik genetické manipulace nebo působením mutagenních činidel. Další oblasti lze také modifikovat, zejména oblast E3 (WO95/02697), oblast E2 (WO94/28938), oblast E4 (WO94/28152, WO94/12649 a WO95/02697) a oblast L5 (WO95/02697). Podle preferovaného provedení obsahuje adenovirus podle předkládaného vynálezu deleci oblastí El a E4 . Podle dalšího preferovaného provedení obsahuje deleci v oblasti El, do které byla vložena oblast E4 a sekvence kódující GAX (srov. FR94 13355). Ve virech podle předkládaného vynálezu delece v oblasti El sahá přes nukleotidy 455 až 3329 v sekvenci Ad5 adenovíru.
Poškozené rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu lze připravit jakoukoliv technikou známou odborníkům (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Zejména se připravují homologní rekombinací mezi. adenovirem a plasmidem, který nese, kromě jiného, požadovanou sekvenci DNA. Homologní rekombinace je vyvolána po kotransfekci daného ad.enoviru a plasmidu do vhodné buněčné linie.Použitá buněčná linie by měla, s výhodou (i) být transformovatelná uvedenými prvky a (ii) obsahovat sekvence, které -jsou komplementární k části genomu poškozeného adenoviru, s výhodou v integrované formě, aby se zabránilo riziku rekombinace. Příklady buněčných linií je buněčná linie 293 lidské embryonální ledviny (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje, zejména, integrovanou do svého genomu, levorukou část genomu Ad5 adenoviru (1.2 %) nebo buněčné linie, které jsou komplementární k funkcím El a E4 jak bylo popsáno, zejména, v přihláškách č. WG94/26914 a WO95(02697.
Následně jsou rozmnožené aďenoviry standardními molekulárně biologickými získány a čištěny technikami jak je ilustrováno v příkladech.
Adenosouv.i sej ící viry (AAV) jsou DNA viry relativně menší velikosti, které se integrují, stabilně a místně specifickým způsobem, do genomu infikovaných buněk. Jsou schopné infikovat širokou škálu buněk aniž by ovlivnily buněčný růst, morfologii nebo diferenciaci. Navíc., se zdá, že nejsou zahrnuty do lidských patologií. Genom charakterizován. Zahrnuje
AAV byl přibližně klonován sekvenován a 4700 bází a obsahuje oblast převráceného terminálního opakováni (inverted terminál repeat - ITR) o délce přibližně 145 bází na každém konci, která slouží jako výchozí bod replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou .nezbytných oblastí, které nesou kapsidační funkce: levoruká část genomu, která obsahuje rep gen zahrnutý v replikaci viru a expresi virového genu; a pravorukou část genomu, která obsahuje cap gen kódující kapsidový protein viru.
Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno v literatuře (viz, zejména, WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368., US5, 139, 941, EP 488 528). Tyto přihlášky popisují různé konstrukty odvozené od AAV, ve kterých jsou rep a/nebo cap geny odstraněny a nahrazeny • ·· · požadovaným genem, a použití těchto konstruktů pro přenos požadovaného genu in vitro (do kultivovaných buněk) nebo in vivo (přímo do organismu). Poškozené rekombinantní AAV podle předkládaného vynálezu lze připravit kotransfekcí plasmidu obsahujícího požadovanou nukleokyselinovou sekvenci, která je obklopena dvěma AAV oblastmi převráceného terminálního opakování (ITR) a plasmidu nesoucího AAV kapsidační geny (rep a cap geny), do buněčné linie, která je infikována lidským pomocným virem (například adenovirus). AAV rekombinanty, které tak byly vyrobeny, byly čištěny standardními technikami. Vynález proto také popisuje AAV odvozený rekombinantní virus jehož genem obsahuje sekvenci kódující GAX, která je obklopena AAV ITR. Vynález se také týká plasmidu obsahujícího sekvenci kódující GAX, která je obklopena dvěma ITR z AAV. Takový plasmid lze použit tak jak je pro přenos GAX sekvence s plasmidem, tam kde je to vhodné, který je zahrnut do 1 iposomální ho vektoru (pseudovirus).
Konstrukce rekombinantních retrovirových vektorů byla rozsáhle zpracována v literatuře: viz, zejména EP 453242, EP 178220, Bernstein a kol, Gent. Eng. 7 (1985) 235; .McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, atd. Zejména jsou retroviry integrační viry, které infikují dělící se buňky. Retrovirový genom zahrnuje hlavně dvě LTR, kapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env; . U rekombinantních vektorů odvozených od retroviru jsou geny gag, pol a env .obecně odstraněny, celé nebo částečně a nahrazeny požadovanou heterologní nukleokyselinovou sekvencí. Tyto vektory lze konstruovat z různých typů retroviru jako jsou, zejména, MoMuLV (murine Moloney .'leukaemia virus také označovaný jako MoMLV), MSV (murine Moloney sarcoma virus), HaSV (Harvey sarcoma virus), SNV (spleen neerosis virus), RSV (Rous sarcoma virus) nebo jiný přátelský virus.
Obecně, aby byly zkonstruovány rekombinantní retroviry obsahující sekvenci kódující GAX podle předkládaného vynálezu, · 9
9 9 je konstruován plasmid, který obsahuje, zejména, LTR, kapsidační sekvenci a kódující sekvenci, která je pak použita pro transfekci toho, co je nazýváno enkapsidační buněčná linie, která je schopna doplňovat retrovirové funkce, které chybí u plasmidu. Obecně jsou enkapsidační buněčné linie schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové enkapsidační buněčné linie byly popsány v dosavadním stavu techniky, zejména buněčná linie PA317 (US 4,861,719), buněčná linie PsiCRIP (WO 90/02806) a buněčná linie GP+envAm-12 (WO 89/07150). Navíc, rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace v LTR pro potlačení .transkripční aktivity stejně jako enkapsidační sekvence, které zahrnují část gag genu (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1693). Rekombinantní retroviry, které byly vyrobeny, byly následně čištěny běžnými Technikami.
Použití poškozených rekombinantních adenovirú pro léčení restenosy je velmi výhodné. Adenoviry mají vysokou infekční kapacitu pro proliferující buňky vaskulárního hladkého svalstva. To .umožňuje použít relativně malá množství aktivní složky (rekombinantního adenovi.ru) , která tak vedou k účinnému a velmi rychlému působení v léčených místech. Adenoviry podle předkládaného vynálezu jsou také schopny exprimovat velkými rychlostmi vložený gax gen, což vede k velmi účinnému terapeutickému působení. Navíc díky jejich episomální povaze, setrvávají adenoviry podle předkládaného vynálezu v proliferujících buňkách po omezenou dobu, a tak mají přechodný vliv, který je vynikajícím způsobem upraven pro žádaný terapeutický efekt.
Předkládaný vynález se také týká farmaceutického prostředku, který obsahuje jeden nebo více poškozených rekombinantních viru, které již byly popsány. Takové prostředky mohou být v takové podobě, která je vhodná pro plánovaný způsob jejich podávání povrchovou, orální, parenterální, intranasální,
intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární atd. cestou.
výhodou obsahuje prostředek podle předkládaného vynálezu excipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné pro injikovatelné prostředky, zejména pro injekce do buněčné stěny. Tyto excipienty jsou, zejména, sterilní, isotoňické roztoky solí (hydrogen nebo dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý, atd. nebo směsi takových solí), nebo suché, zejména lyofilizované prostředky, které se rekonstituují přidáním sterilizované vody nebo fyziologického roztoku na injikovatelné roztoky. Excipient také muže být hydrogel, který se připravuje z jakéhokoliv biokompatϊbilniho nebo ne jedovatého (homo nebo hetero) polymeru. Takové polymery byly popsány, například., v přihlášce WO 93/08845. Některé z nich, jako zejména ty z ethylenoxidu nebo propylenoxidu jsou komerčně dostupné.
Při léčení patologií, které souvisejí s hyperproliferativnimi nemocemi, lze poškozeně rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu podávat různými cestami, zejména injekčně. S výhodou, jsou při léčení restenosy adenoviry podle předkládaného vynálezu podávány přímo do stěny krevní cévy pomocí angiop1astického balónku, který je pokryt hydrofilním filmem (například hydrogelem), který je nasycený adenoviry, nebo pomoci jiného katetru obsahujícího infuzní komůrku pro roztok adenoviru, kterou pak lze aplikovat přesně do místa léčení a umožňuje adenovirúm místní a účinné uvolnění v místě léčené buňky. Tento způsob podávání s výhodou umožňuje infikovat velké množství (až 9,6 1) buněk tunica media, které tvoří preferovaný cíl pro léčení restenosy, zatímco standardní způsoby podávání (například intravenózní injekce) neumožňují, aby byly buňky infikovány v takovém rozsahu.
Způsob léčení podle předkládaného vynálezu s výhodou sestává z podávání prostředku, který obsahuje hydrogel nasycený ·· ···· rekombinantními adenoviry, do léčeného místa. Hydroge1 múze být umístěn přímo na povrch léčené tkáně, například během chirurgického zákroku. S výhodou je hydroge1 podáván na léčené místo pomocí katetru, například balónkového katetru, zejména pří angioplastii. Zejména výhodným způsobem je když je nasycený hydroge.; dodáván na léčené místo pomocí balónkového katetru.
Dávky viru, které se používají do injekcí lze upravit podle podmínek, zejména podle použitého způsobu podávání a žádaného trvání léčení. Obecně, jsou rekombinantní viry podle předkládaného vynálezu podávány ve formě dávek 10; až 10 ; pfu/ml. V případě AAV a adenovírú lze použít dávky .10' až 10 pfu/ml. Pojem pfu (jednotka tvorby destiček) odpovídá infekční síle suspenze virionú a je stanovován infikováním vhodné buněčné kultury a měřením, obecně po 48 hodinách, počtu destiček infikovaných buněk.. Techniky stanovení pfu titru virového roztoku jsou dobře dokumentovány v literatuře.
Předkládaný vynález nabízí nový a velmi účinný prostředek léčení nebo prevence patologií, které souvisejí s hyperproliferativními nemocemi jako je restenosa.
Dále lze toto léčení použít na lidech stejně jako na jakýchkoliv zvířatech jako jsou ovce, hovězí dobytek, domácí zvířata (psi, kočky, atd.), koně, ryby, atd.
Předkládaný vynález je úplněji popsán v následujících příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezující.
Popis obrázku
Obrázek 1 : Zobrazení plasmidu pCOl.
Obrázek 2 : Zobrazení plasmidu pXL-CMV-GaxHA.
Obrázek 3 : Jaderné umístění GAX-HA proteinu ve VSMC transfekovaných pXL-CMV-Gax!\
Obrázek 3A : VSMC transfekované s vektorem pCGN (chybí GAX insert).
Obrázek 3B : VSMC transf ekované s vektorem pXL-CMV-Gax™’.
Obrázek 4 : Jaderné umístění GAX-HA proteinu ve VSMC trans fekovaných Ad-CMV-Gax.
Obrázek 5 : Vliv Ad-CMV-GAX na proliferaci VSMC (t = 24 hodin)
- VSMC jsou sčítány po 24 hodinách. po působení Ad-CMV-Gax (1000 pfu/buňka) nebo kontrolním adenovirem (Ad-RSV-3Gal, 1000 pfu/buňka) . Buněčný růst je blokován (0,5 %
FCS) nebo stimulován (FCS 20 %).
Obrázek 6 : Vliv Ad-CMV-GAX na proliferaci VSMC (t = 48 hodin)
- VSMC jsou sčítány po 48 hodinách po působení Ad-CMV-Gax (1000 pfu/buňka) nebo kontrolním adenovirem (Ad-RSV-PGal, 1000 pfu/buňka). Buněčný růst je blokován (0,5 %
FCS) nebo stimulován (FCS 20 %).
Obrázek 7 : Vliv Ad-CMV-GAX na životnost VSMC, které jsou inkubovány v přítomnosti fetálního telecího séra (FCS 2.0 %).
- experimentální podmínky, srov. obrázek 6.
| Obrázek | 7A | : buňky, | které | nejsou léčeny adenovirem | |
| Obrázek | 7.B | : buňky, | které | jsou | léčeny Ad-RSV-fGal |
| Obrázek | 7C | : buňky, | které | jsou | léčeny Ad-CMV-Gax |
| Obr á ze k 8 | Vliv Ad-CMV- | Gax | a Ad-RSV-3Ga1 na krysí |
karotidovou artérii po působeni balónkového katetru. Obrázek 8A : měření povrchové oblasti v intima Obrázek 8B : měření poměru intima ku media Obrázek 8C : měření luminálního zúžení.
Obrázek 9 : Arteriální průřez kontrolních a léčených cév Obrázek 9A : kontrolní cévy léčené Ad-RSV-0Gal Obrázek 9B : cévy léčené Ad-CMV-Gax.
• · • · · · ·· ·· φ · · ·
Příklady provedení vynálezu
Obecné molekulárně biologické techniky
Standardní metody používané v molekulární biologii, jako jsou preparativní extrakce plasmidové DNA, centrifugace plasmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na -agarosovém nebo akrylamidovém gelu, čištění fragmentu DNA elektroelucí, extrakcí proteinů fenolem nebo směsí fenol/chloroform, srážením DNA v solném médiu pomocí ethanolu nebo izopropanolu, převedení do Eschericia coli, atd., ..., jsou odborníkům dobře známy a jsou rozsáhlým způsobem popsány v literatuře (Maniatis T., a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Gold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M., a kol. .(editoři), Current Protocols in Molecular Biology., John Wiley & Sons, New York, 1987].
Plasmidy typů pBR322 a puC a fágy série Ml 3 byl získány komerčně (Bethes.da Research Laboratories) ,
Pro ligace se DNA fragmenty oddělují podle velikosti e'l ektroforet icky na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahují fenolem nebo směsí fenol/chloroform, srážejí ethanolem a pak inkubují v přítomnosti T4 DNA ligasy (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
5’ prodloužené konce lze při používání vyplnit Klenowovým fragmentem E. coli DNA polymerasy Ί (Biolabs) podle údajů výrobce. 3’ prodlouženě konce jsou zničeny v přítomnosti T4 DNA polymerasy (Biolabs), která se používá podle doporučení výrobce. 5' prodloužené konce jsou zničeny opatrným působením SI nukleasy.
In vitro místně specifickou mutagenezi pomocí syntetických oligonukleotidu lze provést způsobem vyvinutým Taylorem a kol.
[Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] použitím soupravy distribuované firmou Amersham.
·· ·· · · * • 4 · · • · ·4· • * · • 4 ··
* · • · ··· • 4 ·« ····
Enzymatické zmnožení DNA fragmentů pomocí techniky označované jako PCR [polymerase-catalyzed chain reaction polymerasou katalyzovaná řetězová reakce, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mu11is K. B, a Faloona F. A.,
Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] se provádí pomocí DNA tepelného cykléru (Perkin Elmer Getus) podle doporučení výrobce.
Nukleotidové sekvence se stanovují metodou podle Sangera a kol. [Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 74, (1977) 5463-5467] pomoci soupravy dodávané firmou Amersham.
Příklad 1: konstrukce vektoru pXh-CMV-Gax'’ nesoucího gen kódující krysí gax protein pod kontrolou CMV promotoru.
Tento příklad popisuje konstrukci vektoru, který obsahuje cDNA kódující gax protein (krysí) a adenovirové sekvence, které umožňují rekombinaci. K N-konci gax proteinu (Field a kol., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165, 1988) byl přidán epitop chřipkového viru haemagglutinin (epitop HAT), zahrnující 18 aminokyselin.. Takové přidání epitopu umožňuje sledovat expresi gax,.zejména imunofluorescenčními technikami, použitím protilátek proti HA1 epitopu. Kromě své citlivosti tato metoda zároveň umožňuje vyloučit, jak in vivo tak .in vitro, šum pozadí, který odpovídá expresi endogenních gax proteinu.
1.1. Konstrukce plasmidu pCGl
A - Konstrukce plasmidu pCE
EcoRl/Xbal fragment odpovídájicí levorukému konci genomu adenoviru Ad5 byl nejprve klonován mezi EcoR a Xba místy vektoru pIC19H. Tím byl generován plasmid pCA. Plasmid pCA pak byl přestřižen Hinfl a jeho 5' prodloužené konce byly vyplněny Kl.enowovým fragmentem E. coli DNA polymerasy I; vše pak bylo přestřiženo EcoR. Fragment plasmidu pGA, který byl takto generován a který obsahuje levoruký konec genomu adenoviru Ad5, pak byl klonován mezi EcoRI a Smál místy vektoru pIC20H (Marsh a kol., Gene 32 (1984) 481). Tím byl generován plasmid
pCB. Plasmid pCB byl pak přestřižen EcoRI a jeho 5J prodloužené konce byly vyplněny Klenowcvým fragmentem E. coli DNA polymerasy I; vše pak bylo přestřiženo BamHT. Fragment plasmidu pCB, který byl takto generován a který obsahuje levoruký konec genomu adenoviru Ad5, pak byl klonován mezi Nrul a BglII místy vektoru p],C20H. Tím byl generován plasmid pCE jehož výhodná charakteristika spočívá v prvních 382 párech bází adenoviru Ad5, které následuje mnohonásobné klonovací místo.
B - Konstrukce plasmidu pCD'
Sau3A (3346)/Sstl (3645) a Sstl (3645)/Narl (5519) fragmenty z genomu adenoviru AdS byl nejprve spolu 1igovány a klonovány . mezi C.lal a BamHI místy vektoru pIC20H, čímž byl generován plasmid pPY53. Sal1/Taqí fragment z plasmidu pPY53 (připraveného z dam- pozadí), obsahující část genomu adenoviru Ad5 mezi místy Sau3A (3346) a Taql (5.207) pak byl klonován mezi Sall a Clal místy vektoru pIC20H, čímž byl generován plasmid pCA’. Taql (5207)/Narl (5519) fragment genomu Ad5 adenoviru, připraveného z dam- pozadí, a Sall-Taql fragment z .plasmidu pCA’ pak byly spolu 1igovány a klonovány mezi Sall a Narl místy vektoru plC20H. Tím byl generován plasmid pCC' . Narl (5519)/Nrul (6316) fragment genomu adenoviru Ad5, připraveného z dam- pozadí, a Sall/Narl fragment z plasmidu pCC' .pak byly spolu ligovány a klonovány mezi Sall a Nrul místy vektoru pIC.20H. Tím byl generován plasmid pCD'.
C - Konstrukce plasmidu pCOl
Částečným odbouráváním plasmidu pCD' pomocí Xhol a pak úplným odbouráváním pomocí Sall byl generován fragment, který obsahoval sekvenci adenoviru Ad5 od místa Sau3A (3446) až k místu Nrul (6316). Tento fragment byl klonován do Sall místa plasmidu pCE. Tím byl generován plasmid pCOl (obrázek 1), který obsahoval levorukou část adenoviru Ad5 až do místa Hinfl (382), mnohonásobného klonovacího místa a Sau3A (3446)/Nrul (6316) fragmentu adenoviru Ad5.
• ·
1.2 Konstrukce vektoru pXL-CMV-Gax (srov. obrázek 2)
Gax cDNA byl klonován mezi Xbal a BamHI místy vektrou pCGN (Tanaka a Herr, Cell 60: 375-386, 1990). Výsledný vektor, pCGN-Gax, obsahoval promotorovou a enhancerovou -sekvenci cytomegaloviru (CMV) (-522, +72; Boshart a kol., Cell, 41: 521-530, 1985), hlavní sekvenci herpes simplex virus thymidin kiňasy, včetně AUG inicializačního kodonu, stejně jako prvních třech aminokyselin ( + 55, +1.04; Rusconi a Yamamoto, EMBO J. , 6: 1309-1315, 1987), sekvenci kódující HA1 epitop [Y Ρ Y D V P D Y A S L G G P (sekvence id. č. 1)], krysí gax cDNA a, nakonec, polyadenylační sekvenci králičího β-globinového genu (Pábo a kol., Cell, 35: 445-453, 1983).
Vektor pCGN-Gax pak byl přestřižen XmnI a S.fil a vzniklý fragment obsahující promotor, cDNA a polyadenylační sekvenci, byl pc úpravě podle Klenowa vložen do EcoRV místa .člunkového vektoru pCOl, který obsahoval adenovirové sekvence nutné pro rekombinaci. Plasmid, který byl získán byl označen pXh-CMV-Gax (srov. obrázek 2).
Příklad 2: demonstrace proliferaěně inhibičních vlastností plasmidu pXL-CMV-gax-HA.
Tento příklad popisuje postupy, které lze použít pro demonstraci kvality homologních rekombinačnich vektoru (srov. příklad 1), v ohledu exprese (detekce gax proteinu a HA epitopu) a v ohledu aktivity (vliv na proliferaci).
Buňky vaskulárního hladkého svalstva (vascular smooth-muscle cells - VSMC) byly kultivovány enzymatickým odbouráváním NZW králičí aorty způsobem upraveným podle Chamley a kol. (Cell Tissue Res. 177: 503-522 19.77). Stručně řečeno, po vyjmutí byla aorta inkubována při 37 °C po dobu 45 minut v přítomnosti kolagenasy (kolagenasa II, Cooper Biomedical). Druhé odbourávání se pak provádělo po dobu dvou hodin v přítomnosti kolagenasy a elastasy (Biosys), čímž byla získána buněčná • · * · · · • ····· · · suspenze.. Buňky byly udržovány v přítomnosti 20 fetálního telecího séra a použity pro všechny testy (srov. .dále). Ve všech těchto experimentech byly buňky hladkého svalstva charakterizovány imunoznačením pomocí anti-aSM aktin protilátky (F-3777, Sigma).
Pro Ověření kvality expresních vektoru (srov. Přiklad 1), byly přítomnost a umístění gax proteinu monitorovány u každého konstruktu úmunof luor.escencí. Aby bylo možně toto sledování provést, buňky hladkého svalstva nebo 3T3 buňky byly transf okovány plasmidy pXL-CMV-Gax‘;' a pCGNgax v přítomnosti .směsi DOSPA/DOPE (Lipofectamine, Gibco BRL ) . Buňky byly inkubovány v přítomnosti komplexu DNA/liposom v médiu neobsahujícím fetální telecí sérum po dobu 4 až 8 hodin (optimální trvání: 8 hodin pro SMC). Po inkubaci po dobu 24 hodin v přítomnosti fetálního telecího séra byly buňky kultivovány na mikroskopické destičce (Titertek), při sledování imunofluorescence, po dobu dalších 24 hodin. Buňky pak byly fixovány v přítomnosti 4 f paraformaldehydu a následně permabilizovány přídavkem 0, 1 1 tritonu. Po nasyceni buněk v přítomnosti hovězího sérum albuminu (BSA, Sigma) , byla přidána pro úspěšné provedení pokusu anti-HA protilátka (12CA5, Bo.ehringer Mannheim) a. pak protilátka konjugované s fluoresceinem.
Imunofluorescenční pokusy provedené současně na ΝΪΗ3Τ3 buňkách a na primární kultuře králičích VSMC prokázaly, že jak plasmid pCGNgax t.ak člunkový plasmid pXL-CMV-Gaxi:/' skutečně kódují protein, který je umístěn v jádře (srov. obrázek 3A: kontrolní plasmid; 3B: plasmid pXL-CMV-GaxH'A) . Navíc bylo možné po extrakci jaderných proteinu z buněk transfokovaných pXL-CMV-Gax:: prokázat, pomocí western blottu, protein, který je detekován protilátkou proti HA epitopu.
Pak byl zjišťován vliv uvedených vektorů na proliferaci buňky. Aby bylo možné toto stanovení provést byla použita • · · · · • · nepřímá metoda, která je založena na měření tvorby kolonie. Stručně řečeno, NIH3T3 myší embryonální buňky byly použity k provedení testu vzniku kolonie upraveným způsobem podle Schweighoffer a kol. (Mol. Cell. Biol. 1993, 13: 39-43).
Stručně řečeno, buňky jsou kotransfekovány s pLasmidem, který nese gen resistence na neomycin a s přebytkem požadovaného vektoru (pCGNgax nebo pXT,-CMV-Gax: } . Po selekci v G418 byly kolonie obarveny roztokem karb.olf uchsinu (Diagnos t i ca, Merck) a spočítány. Výsledky representativního experimentu, které jsou uvedeny v tabulce 1, demonstrují snížení počtu kolonií v případě buněk transfokovaných pCGNgax.
Tabulka 1
| Podmínky transfekce 3T3 buněk | Počet kolonií po selekci v G4.18 |
| pCGN (5 μα) + pSV2neo (1 pg) (§) | 183 + 28 (*) |
| pCGNgax (5 pg) + pSV2neo (1 pg) | 93 + 11 |
(§) pCGN kontrolní vektor: nepřítomnost gax insertu {*) p < 0,01
Příklad 3: Konstrukce rekombinantního adenovirů Ad-CMVgax
Vektor pXL-CMV-GaxHA, připravený podle příkladu 1, byl následně linearizován a kotransfekován, pro rekombinaci, s poškozeným adenovirovým vektorem do pomocných buněk (buněčná linie 293), které dodávají funkce kódované oblastmi adenovirů El (E1A a E1B).
Adenovirus Ad-CMVgax byl získán prostředky in vivo homologní rekombinace mezi adenovirem Ad.RSVpgal (Stratford Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) a vektorem pXL-CMV-Gax podle následujícího postupu: vektor pXL-CMV-Gax, linearizovaný s enzymem Xmnl, a adenovirus Ad.RSVPgal, linearizovaný s Clal, byly kotransfekovány do buněčné linie 293 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého, aby mohla
probíhat homologní rekombinace. Rekombinantní adenoviry, které byly tímto způsobem generovány, byly vybrány destičkovým čištěním. Po izolaci byl rekombinantní adenovirus zmnožen v buněčné linii 293, což vede ke kapalině nad kulturou, která obsahuje nevyčištěné rekombinantní poškozené adenoviry, které mají titr 10 pfu/ml.
Virové částice byly čištěny odstřecfováním v gradientu chloridu česného podle známých pstupu (viz, zejména Graham a kol., Virologie 52 (1973) 456). Adenovirus Ad-CMVgax byl uchováván při -*80 °C ve 20 V (hmot.) glyeerolu.
Příklad 4: demonstrace proliferačhě inhibičních vlastností a deno v i ru Ad-CMVgax.
Tento příklad popisuje postupy, které lze použít pro demonstraci kvality rekombinantního adenoviru, v ohledu produkce gax proteinu a v ohledu biologické aktivity (vliv na buněčnou proliferaci).
Králičí aorta byla inkubována v přítomnosti adenoviru Ad-CMVgaxHA a kontrolního adenoviru (ad-RSVpGal: rekombinantní adenovirus exprimující β-ga1aktosidasu za kontroly RSV promotoru), který je naředěn v médiu (DMEM, 0,5 » FCS)· Po jedné hodině při 37 °C ve vlhké atmosféře bylo médium obsahující roztok adenoviru odsáto a nahrazeno novým médiem (DMEM, 0,5 FCS) na dobu 18 až 24 hodin. Pak bylo přidáno médium bohatě na FCS (konečná koncentrace FCS: 20 ), aby se stimulovala proliferace buněk a buňky byly po 24 hodinách a po 48 hodinách spočítány.
Navíc, 24 hodin po přidání roztoku adenoviru, byla monitorována exprese gax proteinu buňkami VSMC technikou popsanou v příkladu 2, zejména značením jádra prostředky imunofluorescence (lokalizace proteinu) a také western blottem. Protein produkovaný rekombinantním adenovirem je účinně detekován protilátkami, které rozpoznávají HA epitop a • · mají stejnou elektroforetickou mobilitu jako gax protein, který je detekován v jádře VSMC, které byly transfekovány s pCGNgax nebo pXL-CMV-Gax’’'. Obrázek 4 ilustruje umístění Gax proteinu ve VSMC, které byly inkubovány v přítomnosti Ad-CMVgaxHA.
Výsledky representativního experimentu, které jsou uvedeny v na obrázku 4, demonstrují znatelné snížení počtu buněk po přidání Ad-CMVgaxHA viru. Na druhou stranu, toto snížení počtu buněk nebylo pozorováno po působení kontrolního adenoviru použitého ve stejné koncentraci (M.O.I. 1000). Současně jsme pomocí imunofluorescence ověřili, že tato vysoká infekčnost umožňuje jak β-gal značkovému genu (použití anti-E.Coli β-gal protilátky, Monosan) tak gax proteinu (použití anti-HA protilátky, srov. příklad 2), áby byly exprimovány ve více než 90 i populace králičích VSMC,.
Přidání ad-RSV^gal viru je spojeno se slabým cytostatickým efektem (-13 «·) po kultivaci po dobu 24 hodin v přítomnosti fetálního telecího séra (20 %). Za stejných experimentálních podmínek vedlo působení Ad-CMVgaxHA k 57% snížení počtu buněk (srov. obrázek 5) . Biologická aktivita Ad-C-MVgaxHA viru je velmi zřejmá po 48 hodinách kultivace a dokonce může souviset i s buněčnou smrtí (srov. obrázky 6a 7).
Tak je blokování proliferace, která je způsobena Ad-CMVgaxHA, spojeno se znatelným snížením počtu buněk, které lze detekovat po kultivaci po dobu 24 hodin (srov. obrázek 5). Je zajímavé, že tento vliv Ad-CMVgaxHA byl pozorován u buněk, které byly stimulovány vysokou koncentrací FCS (20 %), ale ne u buněk, které byly zbaveny FCS (0,5 I) (srov. obrázek 6) . Tento příklad proto ukazuje, že rekombinantní adenovirus, který kóduje gax protein, muže účinně blokovat buněčné dělení bez jakéhokoliv znatelného vlivu na životnost buněk, které jsou blokovány v G0 fázi jejich cyklu.
Vliv Ad-CMVgaxHA adenoviru na životnost VSMC v kultuře je dále ilustrován obrázkem 7.
Inhibiční vlastnosti Ad-CMVgaxHA na syntézu DNA byly potvrzeny pokusy o začlenění bromdeoxyuridinu (BrdU). Stručně řečeno, po 24 hodinách po přidání adenoviru, byly inkubovány VSMC v přítomnosti FCS (10 % až 20 %) a BrdU (10 uM), který je do buněk začleňován místo thvminu při fázi DNA syntézy a lze jej detekovat specifickými protilátkami. Začlenění BrdU bylo kvantifikováno pomocí průtokové cytometrie.
Tentýž způsob průtokové cytometrie byl použit pro vizualizaci postupu králičích VSMC buněk, upravených Ad-CMVgaxHA, v jejich buněčném cyklu. Působení Ad-CMVgaxHA je spojeno s blokováním buněčného cyklu ve fázi G.0/G1.
Příklad 5: inhibice intimální hyperplasie pomocí adenovlrus-gax in vivo.
Tento příklad ukazuje účinnost rekombinantních adenoviru v modelu vaskulární patologie.
Použitý model arteriální léze je založen na obrušování krysí karotidy (Clows a kol., Lab. Invest. 49 (1983) 327-333). U tohoto modelu, VSMC dediferencují, proliferují a migrují do formy neointimy, která může částečně pohlcovat arterii, do dvou týdnu po poškození.
Sprague-Dawley krysy byly anestetikovány intraperitoneální injekcí pentobarbitalu (45 mg/kg). Následovala vnější karotidová arteriotomie, krysí karotidové arterie byly obnaženy balónkovým katetrem a vystaveny 1.10^ pfu Ad-CMVgaxHA nebo Ad-RSVPGal. Adenovirus byl použit v roztoku obsahujícím 15 i poloxameru 407, který usnadňuje přenos genu adenoviru. Dvacet minut po inkubaci byl roztok viru odebrán a byly odstraněny ligatury, čímž byla obnovena cirkulace. Krysy byly utraceny po dvou týdnech a na řezu léčených cév byly provedeny ·· ·· • · · · • · · · • · · · · ♦ · · kvantitativní morfometrické analýzy. Výsledky jsou uvedeny na obrázcích 8 a 9.
Získané výsledky ukazují, že všech devět Ad-RSVp-Gal transfekovaných karotidových arterií mělo silnou VSMC proliferaci a rozvoj znatelného neointimálního ztluštění. Plocha neointimy byla 0,186 (/-0,02 mm (SEM) s rozsahem 0,10 až 0,28. Luminální patentenee byla příslušně zúžena na 40 + /4 i (rozsah 21 až 63), obrázek 8C, Poměr intima : media byl 1,51 +/- 0,1 (rozsah 0,87 až 2,17). Tyto výsledky byly podobné výsledkům získaným drive u kontrolních cév, na které se působilo fyziologickým roztokem. Na rozdíl od toho, působení Ad-CMVgaxHA znatelně snížilo.patologickou reakci na poškození balónkem. U cév .léčených Ad-CMVgaxHA byla průměrná plocha neo: n ti má lni leze 0, 076 +/- 0,02 mm (rozsah 0 až 0,19), luminální zeslabení bylo sníženo na 17,5 + /- 5 I. Statistická analýza potvrdila, že léčení Ad-CMVgaxHA znatelně inhibuje rozvoj intimálního ztluštění relativně ke kontrolám Ad-RSVp-Gal. Konkrétně, léčení Ad-CMVgaxHA snížilo poměr intima ; media o 69 ·£, intimální plochu o 59 % a luminální zeslabení o 56 i (obrázky 8A a 8B). Znatelný vliv na intimální hyperplasii byl dále zdůrazněn výsledky získanými z průřezů kontrolních (obrázek 9A) nebo léčených (obrázek 9B) zvířat.
Tento příklad demonstruje velmi účinnou aktivitu při zastavování rustu konstruktu Ad-CMVgaxHA in vivo. Tato aktivita je vlemi specifická a nebyla pozorována u kontrolních zvířat.. Presentované výsledky jasně ukazuji terapeutickou aktivitu Ad-CMVgaxHA na vaskulární morfologii a zejména na hyperplasii, která je spojena s postangioplastickou restenosou. Použití viru, jako je adenovirus, pro přenos Gax genu in vivo je zvlášť účinné. Tento způsob je dále výhodný, protože je založen na nahrazení genu. Tento způsob je jedinečný v tom, že spojuje účinnost dopravy a genovou terapii do dvou terapeutickch vlastností: zastavení rustu a ·« ···to to· ·· • ·· ···· · ···· • · ··· · · ·· ··· · ··· ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· · konstitutivní expresi ve vaskuTárním systému. Přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu vyvolává specifickou regresi hyperproliferaťivního onemocnění vaskulární cévy a následně tak normalizuje arteriální funkce. Místní přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu je také zejména výhodný v tom, že nevadí reendothelizačnímu procesu, který následuje po lézi artěrie. Navíc, kromě přímého vlivu na buněčnou proliferaci a vaskulární morfologii, přenos gax genu podle předkládaného vynálezu může také mít užitečný nepřímý vliv na syntézu extracelulární matrice a na remodelaei. Tyto výsledky ukazují, že přenos Gax genu podle předkládaného vynálezu je výrazný nový pokrok v léčení vaskulárních lézi, které vznikají po angioplastii.
Seznam sekvencí (1) Obecné informace:
(i) Vynálezce:
Jméno: CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY
Ulice:
Město: Cleveland Stát: Ohio
Země: USA
Poštovní kód: 44106 (i) Vynálezce:
Jméno: Branellec, Didier Ulice: 1, Rue Saint-Benoit Město: 94210 La Varenne-Saint Hilaire Stát:
Země: Francie
Poštovní kód:
·· · · · · • · · • · · • · · · · • · • · · (i) Vynálezce:
Jméno: Walsh, Kenneth Ulice: 207 Judy Farm Road Město: Carlisle Stát: Massachusetts Země: USA
Poštovní kód: 01741 (i) Vynálezce:
Jméno: Isner, Jeffrey M.
Ulice: 34 Brenton Road Město: Weston
Stát: Massachusetts Země: USA
Poštovní kód: 02193 (ii) Název vynálezu: Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy (iii) Počet sekvencí: 1 (iv) Korespondenční adresa:
| (A) | Adresa | .: Rhone-Poulenc | Rorer |
| (B) | Ulice: | 500 Arco1a Rd. | 3C43 |
| (C) | Město: | Collegeville | |
| (D) | Stát: | PA | |
| (E) | Země: | USA | |
| (F) | Poštovní kód: 19426 |
(v) Forma čitelná pro počítač:
(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.30 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· · • · · (vi) Údaje o současné přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: PCT (B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(vii) Údaje o předchozí přihlášce:
(A) Číslo přihlášky: Er 95-04234 (B) Datum podáni: 31. 3. 1995 (viii) Informace o právním zástupci / ..agentovi (A) Jméno: Savifzki, Martin F.
(B) Registrační číslo: 26,699 (C) Číslo reference / označení: ST95022-US (ix) Telekomunikační údaje:
(A) Telefon: (-610)454-3816 (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Údaje o sekvenci id. č. 1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitost:
(C) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (ix) Popis sekvence: sekvence id. č. 1:
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Gly Gly Pro • · • 4 4 · • 4 4 4
4 4 4 4
4 4
Průmyslová využitelnost
Virové vektory podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné při výrobě léků pro léčeni nyperproiiferativních nemoci, zejména restenosy.
Claims (13)
- Poškozený rekombinantní virus obsahující přinejmenším
jeden vložený gen kódující celý nebo část GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu. 2. Virus podle nároku 1, ve kterém v jeho genomu chybí oblasti, které jsou nezbytné pro jeho replikaci v infikované buňce. 3. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenovirus, s výhodou typu Ad 5 nebo Ad 2. - 4. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenovirus zvířecího, s výhodou psího, původu.
- 5. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen kóduje celý nebo část krysího GAX proteinu nebo variantu tohoto proteinu.
- 6. Virus podle nároku 5, ve kterém vložený gen kóduje krysí GAX protein nebo jeho lidský homolog.
7. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen je cDNA. 8. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen j e gDNA. -9. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen obsahuje sekvence, které mu umožňuj i být exprimován v infikované buňce. 10. Virus podle jednoho z nároků 1 nebo 2, ve kterém vložený gen obsahuje signální sekvenci, která směruje syntetizovaný polypeptid do sekrecních cest cílové buňky. - 11. Adenovirus podle nároku 3, který obsahuje deleci celé nebo části oblasti El.
- 12. Adenovirus podle nároku 11, který navíc obsahuje deleci celé nebo části oblasti E4 .
- 13. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je adenosouvisející virus (adeno-associated virus - AAV).
- 14. Virus podle nároku 1 nebo 2, který je retrovirus........„ZMÉNĚNý.USr
- 15. Použití viru podle jednoho z nároku 1 nebo 2 pro přípravu farmaceutického prostředku, který je určen pro léčení nebo prevenci patologií, které Souvisejí s hyperprolíferativními nemocemi.
- 16. Použití podle nároku 15, pro přípravu farmaceutického prostředku, který je určen pro léčení restenosy.
- 17. Farmaceutický prostředek, v v z na č u j ící s e tím, že obsahuje jeden nebo více poškozených rekombinantních viru podle jednoho z nároku í nebe 2.
- 18. Farmaceutický prostředek podle nároku 17, v y z n ač u j í c í se tím, že je v injikovatelné formě a tím, že obsahuje 104 až IO54 pfu adenovi.ru/ml.
- 19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní adenovirus, který je nasycen do hydrogelu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9504234A FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1995-03-31 | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ308897A3 true CZ308897A3 (cs) | 1998-03-18 |
Family
ID=9477928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ973088A CZ308897A3 (cs) | 1995-03-31 | 1996-03-28 | Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5851521A (cs) |
| EP (1) | EP0817791A4 (cs) |
| JP (1) | JPH11503314A (cs) |
| KR (1) | KR19980703454A (cs) |
| CN (1) | CN1190402A (cs) |
| AP (1) | AP1011A (cs) |
| AU (1) | AU701345B2 (cs) |
| BR (1) | BR9608449A (cs) |
| CA (1) | CA2216878A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ308897A3 (cs) |
| FR (1) | FR2732357B1 (cs) |
| HU (1) | HUP9801767A3 (cs) |
| OA (1) | OA10516A (cs) |
| SI (1) | SI9620059A (cs) |
| SK (1) | SK132797A3 (cs) |
| WO (1) | WO1996030385A1 (cs) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
| US7727761B2 (en) * | 1995-08-01 | 2010-06-01 | Vegenics Limited | Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof |
| FR2740344B1 (fr) * | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
| FR2754822B1 (fr) * | 1996-10-18 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Polypeptides comprenant des domaines de la proteine gax, impliques dans la repression de transcription et/ou interagissant avec d'autres proteines, acides nucleiques correspondants et leurs utilisations |
| US6335010B1 (en) * | 1996-11-08 | 2002-01-01 | University Of California At San Diego | Gene therapy in coronary angioplasty and bypass |
| AU3347000A (en) | 1999-01-19 | 2000-08-01 | Children's Hospital Of Philadelphia, The | Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof |
| US6730313B2 (en) * | 2000-01-25 | 2004-05-04 | Edwards Lifesciences Corporation | Delivery systems for periadventitial delivery for treatment of restenosis and anastomotic intimal hyperplasia |
| AU2001239884B2 (en) * | 2000-02-25 | 2006-08-10 | Vegenics Limited | Materials and methods involving hybrid vascular endothelial growth factor DNAs and proteins and screening methods for modulators |
| US20030100889A1 (en) * | 2001-07-05 | 2003-05-29 | Nicolas Duverger | Method of administration of a gene of interest to a vascular tissue |
| US20030180936A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| US20080215137A1 (en) * | 2003-04-30 | 2008-09-04 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Therapeutic driving layer for a medical device |
| US20040220656A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-04 | Epstein Samuel J. | Coated medical devices and methods of making the same |
| WO2005025517A2 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-24 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Animal model for protease activity and liver damage |
| ATE507240T1 (de) | 2004-03-05 | 2011-05-15 | Vegenics Pty Ltd | Materialien und verfahren für wachstumsfaktorbindende konstrukte |
| US7319015B2 (en) * | 2004-03-16 | 2008-01-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2 |
| US7582442B2 (en) * | 2004-03-16 | 2009-09-01 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2 |
| GB0416487D0 (en) | 2004-07-23 | 2004-08-25 | Isis Innovation | Modified virus |
| US20090233986A1 (en) * | 2004-07-27 | 2009-09-17 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods and compositions for using sax2 |
| FI20050753L (fi) | 2004-09-03 | 2006-03-04 | Licentia Oy | Uudet peptidit |
| US7531523B2 (en) * | 2005-02-17 | 2009-05-12 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant |
| KR100747646B1 (ko) | 2005-02-25 | 2007-08-08 | 연세대학교 산학협력단 | 데코린 유전자를 포함하는 유전자 전달 시스템 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물 |
| AU2006279462A1 (en) | 2005-08-15 | 2007-02-22 | Vegenics Limited | Modified VEGF and PDGF with improved angiogenic properties |
| US20080200408A1 (en) * | 2005-09-30 | 2008-08-21 | Mccormack Kenneth | Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| US7972813B2 (en) * | 2005-09-30 | 2011-07-05 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit |
| DE602005023550D1 (de) | 2005-12-14 | 2010-10-21 | Licentia Ltd | Verwendungen eines neurotrophischen Faktors |
| US20090214496A1 (en) * | 2006-01-30 | 2009-08-27 | Licentia Ltd. | Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods |
| PL2018184T3 (pl) | 2006-05-17 | 2013-12-31 | The Ludwig Institute For Cancer Res | Przeciwciało Anty-VEGF-B do stosowania w leczeniu lub profilaktyce cukrzycy typu II lub zespołu metabolicznego |
| FI20070808A0 (fi) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | Mart Saarma | GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt |
| BRPI0906946A2 (pt) | 2008-01-09 | 2015-07-14 | Univ Konkuk Ind Coop Corp | Vacinas baseadas em baculovírus |
| US20090196854A1 (en) * | 2008-02-04 | 2009-08-06 | Kytos Biosystems S.A. | Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery |
| FI20080326A0 (fi) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | Licentia Oy | Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt |
| JP2011526916A (ja) | 2008-06-30 | 2011-10-20 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン | 全身性紅斑性狼瘡を同定および処置するための診断標的および治療標的としてのリソソームホスホリパーゼａ２（ｌｐｌａ２）活性 |
| EP2496268A4 (en) | 2009-11-06 | 2013-06-19 | Univ Chung Ang Ind | GENERATING SYSTEMS ON NANOPARTICLE BASIS |
| KR101232123B1 (ko) | 2010-10-08 | 2013-02-12 | 연세대학교 산학협력단 | 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체 |
| EP3623381A1 (en) | 2011-05-19 | 2020-03-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation |
| WO2013077645A1 (ko) | 2011-11-24 | 2013-05-30 | 주식회사 바이로메드 | 아데노바이러스 생산 신규 세포주 및 그의 용도 |
| WO2013079687A1 (en) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford | Inkt cell modulators and methods of using the same |
| GB201120860D0 (en) | 2011-12-05 | 2012-01-18 | Cambridge Entpr Ltd | Cancer immunotherapy |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| US9499817B2 (en) | 2012-09-06 | 2016-11-22 | The University Of Chicago | Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies |
| KR101429696B1 (ko) | 2012-11-21 | 2014-08-13 | 국립암센터 | 안전성 및 항암활성이 증가된 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도 |
| MX368730B (es) | 2013-02-18 | 2019-10-14 | Vegenics Pty Ltd | Moleculas que unen ligando y usos de las mismas. |
| WO2014191630A2 (en) | 2013-05-28 | 2014-12-04 | Helsingin Yliopisto | Non-human animal model encoding a non-functional manf gene |
| DK3283500T3 (en) | 2015-04-08 | 2020-11-16 | Univ Chicago | Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2C using exon skipping |
| WO2017065497A1 (ko) | 2015-10-12 | 2017-04-20 | 한양대학교 산학협력단 | 유전자 전달 및 유전자 치료를 위한 아데노바이러스 복합체 |
| BR112019005415A2 (pt) | 2016-09-20 | 2019-10-22 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | nova vacina contra influenza suína |
| BR112019005511A2 (pt) | 2016-09-20 | 2019-10-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | vetores de adenovírus canino |
| KR102543774B1 (ko) | 2016-09-20 | 2023-06-19 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 신규한 프로모터 |
| CA3036291A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New ehv insertion site orf70 |
| SG11202005509YA (en) | 2017-12-13 | 2020-07-29 | Genemedicine Co Ltd | Recombinant adenoviruses and stem cells comprising same |
| BR112020025203A2 (pt) | 2018-06-11 | 2021-03-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materiais e métodos para tratar distúrbios relacionados o estresse e câncer |
| EP4704807A1 (en) | 2023-05-03 | 2026-03-11 | IOX Therapeutics Limited | Inkt cell modulator liposomal compositions and methods of use |
| AR134514A1 (es) | 2023-12-01 | 2026-01-21 | Gilead Sciences Inc | Proteína de fusión anti-fap-ligera y uso de esta |
| US20260056209A1 (en) | 2024-06-14 | 2026-02-26 | Gilead Sciences, Inc. | Anti-ccr8 antibodies and uses thereof |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8424757D0 (en) * | 1984-10-01 | 1984-11-07 | Pasteur Institut | Retroviral vector |
| FR2573436B1 (fr) * | 1984-11-20 | 1989-02-17 | Pasteur Institut | Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) * | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| US4861719A (en) * | 1986-04-25 | 1989-08-29 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | DNA constructs for retrovirus packaging cell lines |
| JP3082204B2 (ja) * | 1988-09-01 | 2000-08-28 | ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ | 両栄養性および環境栄養性宿主域を持つ組換え体レトロウイルス |
| US5585362A (en) * | 1989-08-22 | 1996-12-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Adenovirus vectors for gene therapy |
| CA2039921A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Xandra O. Breakefield | Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication |
| AU7906691A (en) * | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5252479A (en) * | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| EP0957172B1 (en) * | 1992-11-18 | 2005-10-19 | Arch Development Corporation | Adenovirus-mediated gene transfer to cardiac and vascular smooth muscle |
| CA2145641C (en) * | 1992-12-03 | 2008-05-27 | Richard J. Gregory | Pseudo-adenovirus vectors |
| FR2705361B1 (fr) * | 1993-05-18 | 1995-08-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. |
| FR2705686B1 (fr) * | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| NZ269156A (en) * | 1993-07-13 | 1996-03-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Defective recombinant adenovirus vector incapable of replicating autonomously in a target cell and its use in gene therapy |
| US5856121A (en) * | 1994-02-24 | 1999-01-05 | Case Western Reserve University | Growth arrest homebox gene |
-
1995
- 1995-03-31 FR FR9504234A patent/FR2732357B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-28 CZ CZ973088A patent/CZ308897A3/cs unknown
- 1996-03-28 HU HU9801767A patent/HUP9801767A3/hu unknown
- 1996-03-28 AU AU55315/96A patent/AU701345B2/en not_active Ceased
- 1996-03-28 JP JP8529747A patent/JPH11503314A/ja not_active Ceased
- 1996-03-28 KR KR1019970706858A patent/KR19980703454A/ko not_active Ceased
- 1996-03-28 AP APAP/P/1997/001117A patent/AP1011A/en active
- 1996-03-28 CN CN96193929A patent/CN1190402A/zh active Pending
- 1996-03-28 CA CA002216878A patent/CA2216878A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-28 SK SK1327-97A patent/SK132797A3/sk unknown
- 1996-03-28 BR BR9608449-9A patent/BR9608449A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-28 EP EP96912530A patent/EP0817791A4/en not_active Withdrawn
- 1996-03-28 WO PCT/US1996/004493 patent/WO1996030385A1/en not_active Ceased
- 1996-03-28 SI SI9620059A patent/SI9620059A/sl not_active IP Right Cessation
- 1996-09-30 US US08/723,726 patent/US5851521A/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-09-29 OA OA70089A patent/OA10516A/en unknown
-
2000
- 2000-12-21 US US09/740,876 patent/USRE37933E1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| USRE37933E1 (en) | 2002-12-10 |
| JPH11503314A (ja) | 1999-03-26 |
| HUP9801767A2 (hu) | 1998-10-28 |
| FR2732357B1 (fr) | 1997-04-30 |
| AP1011A (en) | 2001-09-22 |
| CA2216878A1 (en) | 1996-10-03 |
| SK132797A3 (en) | 1998-07-08 |
| BR9608449A (pt) | 1999-11-30 |
| OA10516A (en) | 2002-04-22 |
| FR2732357A1 (fr) | 1996-10-04 |
| CN1190402A (zh) | 1998-08-12 |
| US5851521A (en) | 1998-12-22 |
| AU701345B2 (en) | 1999-01-28 |
| WO1996030385A1 (en) | 1996-10-03 |
| EP0817791A1 (en) | 1998-01-14 |
| AU5531596A (en) | 1996-10-16 |
| AP9701117A0 (en) | 1996-03-28 |
| HUP9801767A3 (en) | 1999-04-28 |
| MX9707549A (es) | 1998-07-31 |
| EP0817791A4 (en) | 1998-07-15 |
| KR19980703454A (ko) | 1998-11-05 |
| SI9620059A (sl) | 1998-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ308897A3 (cs) | Virové vektory a jejich použití pro léčení hyperprofilerativních nemocí, zejména restenosy | |
| CA2267067A1 (en) | Promoter for smooth muscle cell expression | |
| EP0938553B1 (en) | Dna encoding dp-75 and a process for its use | |
| US7329741B2 (en) | Polynucleotides that hybridize to DP-75 and their use | |
| CZ300526B6 (cs) | Lécivo obsahující jednoretezcovou protilátku, která se specificky váže na epitop prítomný v C-koncovém úseku p53, nebo nukleovou kyselinu kódující takovou protilátku | |
| KR100336551B1 (ko) | 망막아종 단백질의 조직 특이적 발현 | |
| AU730324B2 (en) | Use of protein gax for treating cancer | |
| US6610534B2 (en) | Induction of blood vessel formation through administration of polynucleotides encoding sphingosine kinases | |
| SK51199A3 (en) | Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use | |
| KR101560799B1 (ko) | 척수성 근위축증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 | |
| MXPA97007549A (en) | Viral vectors and their use to treat disordershiperproliferativos, in particular resteno | |
| CZ291533B6 (cs) | Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují | |
| US7541343B2 (en) | Inhibiting cellular proliferation by expressing yin yang-1 | |
| AU2002308413B2 (en) | Yin yang 1 | |
| HK1018066A (en) | Viral vectors and their use for treating hyperproliferative disorders, in particular restenosis | |
| WO1996029423A1 (en) | Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range | |
| AU2002308413A1 (en) | Yin yang 1 | |
| MXPA99004499A (en) | Tissue specific expression of retinoblastoma protein | |
| MXPA97008877A (en) | P62, its variants, the nucleic acid sequences that code them, and its use in anti-cancer gene therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |