CZ313499A3

CZ313499A3 - Metoda vlasové propagace

Info

Publication number: CZ313499A3
Application number: CZ19993134A
Authority: CZ
Inventors: Conradus Ghosal Gho
Original assignee: Ghost Holding B. V.
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2000-02-16
Also published as: EP0971679A1; CZ298118B6; JP2001526560A; WO1998047471A1; ES2176977T3; TR199902184T2; EP0971679B1; CA2283172A1; ATE219654T1; ID22700A; PT971679E; DK0971679T3; NL1005445C2; EA199900799A1; US6399057B1; NO994311L; NZ337640A; IL131740A; NO994311D0; DE69806232T2

Description

METODA VLASOVÉ PROPAGACE

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nejprve metody reprodukce vlasů. Vynález se také týká metody pěstováni vlasových folikulových buněk z anagenetických vlasů v anagenní fázi, dále prostředku, který je velmi vhodný pro pěstování vlasových folikulových buněk, metody přípravy takového prostředku a výchozího prostředku.

Dosavadní stav techniky

Hlavní růstové struktury vlasů jsou tzv. vlasové folikuiy, které jsou přítomny v pokožce. Vlasové folikulové buňky nebo keratinocyty se reprodukuji z těchto vlasových folikulů, během jejich cesty na povrch pokožky je přeměněna cytopiazma zmíněných buněk velkým počtem komplexních procesů v pevnou a pružnou hmotu, která je známa jako vlas. Růstový cyklus vlasu může býd rozdělen do tří fází: anagenní nebo růstová fáze, katagenní nebo přechodová fáze a telogenní nebo odumíracl fáze. Vlasový folikul je jedinečný svou cyklickou povahou tvorby vlasu a vlasového růstu. Zvláštností je, že vlasový folikul je jedinou části lidského těla, která obsahuje růstové jádro, z něhož mohou být produkovány nové vlasy po odstranění vlasu starého.

Je známo, že vlasové folikulové buňky můžou výt vypěstovány z vytrženého lidského vlasu. Je také známo, že je možné použít takto pěstovaných buněk k vytvoření diferenciovaného nebo plné rozvinutého epidermis, oba in vitro a in vivo. Vlasové folikulové buňky vypěstované u myši mohou stimulovat vlasový' růst, když jsou zmíněné buňky implantovány do testovaných zvířat Nicméně dodnes se neukázalo možným docílit nového růstu vlasů u Člověka na takovém místě, kde není žádný vlas (již dlouho) za pomoci vypěstovaných autoiogovaných vlasových folikulových buněk.

Lidé vždy považovali ztrátu vlasů z kosmetického a estetického hlediska za nežádoucí. Avšak holohlavost se vyskytuje často a je známým fenoménem, který začíná zvláště u stárnoucích mužů. Tato forma ztráty vlasů je známa jako alopeda androgenetica. Dodnes neni přesně známo, proč některé části skalpu jsou • 9 náchylné k tétoalopeciiandragogeneticeajiné ne. Avšak u žen se také pravidelně objevuje to, že vlasy Jsou slabší a dokonce do značné míry hrozí jejich vypadáváni. Hlavně pro ženy je to velmi nepříjemné z kosmetického a estetického hlediska. Známou metodou v boji proti ztrátě vlasů je transplantace vlasů. Tímto postupem se odejme včetně kůže část vlasy pokryté donorové oblasti, která se často nachází v týle hlavy, a rozřeže se na malé kousky, které mají obvykle jen jeden až tři vlasy. Tyto části jsou pak implantovány do ztrátou vlasů postižené oblastí (recepční oblasti). Velkou nevýhodou této metody je fakt, že je na úkor donorové oblasti. Vlas je odebrán z této oblasti a znovu už se tam neobjeví. Transplantačnf metoda proto nabfzi jen omezené možnosti.

Podstata vynálezu

Cílem předloženého vynálezu je poskytnout metodu, pomoci které se mohou na holých místech znovu objevit vlasy, ale která nemá nevýhody vlasové transplantace, jak bylo zmíněno výše. Druhým cílem vynálezu je poskytnout metodu, díky níž by bylo dosaženo nového růstu vlasů u člověka, pomocí vypěstovaných vlasových folikulových buněk. Dalším cílem vynálezu je poskytnout metodu, jejíž prováděni je relativně jednoduché.

Zmíněných cílů je dosaženo pomocí metody ve shodě s vynálezem, v níž je vlas reprodukován. Podle vynálezu je vlas odebrán z donorové oblasti takovým způsobem, že se nové vlasy vrátí na své místo. Zatímco jsou pěstovány nové vlasové folikulové buňky z buněk odebraných vlasů, tvoří se postupně nové vlasy. Vynález tudíž pojednává o metodě reprodukce vlasů, která obsahuje následující kroky:

(1) odebráni vlasů v anagenní fázi z jedné nebo vlče donorových oblasti tak, že je stále zachována cibulková podstata odebraného vlasu v anagenní fázi;

(2) pěstováni vlasových folikulových buněk z odebraného vlasu za takových podmínek, že vlasové folikulové buňky jsou schopné množeni; a (3) implantace vypěstovaných vlasových folikulových buněk do recepční oblasti. Metoda ve shodě s vynálezem má tu hlavni výhodu, že růstu vlasů může být dosaženo znovu na holých mistech, aniž by to bylo na úkor donorové obíastí.

Krok (1) metody podle vynálezu zahrnuje odebráni vlasu v anagenní fázi z donorové oblasti, kde se vyskytuji takové vlasy. Jak bylo vysvětleno výše, růst vlasu má tři fáze; anagannl, katagenní a telogení. Pouze vlasy v anagenní fázi jsou vhodné pro

• · metodu podle vynálezu. Ve srovnáni s vlasy v katagenní a telogennl fázi jsou vlasy v anagenní fázi charakteristické tím, že mají v dolní části vlasu - často pigmentovanou - cibulku tvaru, jenž je charakteristický pro vlasy v anagenni fázi. Toto je obecně známo, a proto pro zkušené oko je vlas v anagenní fázi ihned rozpoznatelný podle tvaru cibulky. V případě pochybnosti poskytne konečnou odpověď mikroskop. Odebráni vlasů v anagenní fázi může proto být prováděno různými způsoby, zůstane-li v anagenni fázi charakteristická cibulka vlasů na odebíraném vlasu.

Počet vlasů v anagenni fázi potřebných k vypěstování přiměřeného množství vlasových folikulových buněk neni omezený, protože v podstatě může být vypěstován nekonečný počet vlasových folikulových buněk z jediného vlasu. Subkultury můžou být postupně vypěstovány z první kultury a postupně může být vypěstováno několik kultur z každé subkultury. V praxi budou rozmnoženy 3 vlasy na 10 vlasů v anagenni fázi. Vlasy, které se konečně vytvoří v recepční oblasti z vypěstovaných vlasových folikulových buněk, přejímají vlastnosti vlasů z donorové oblasti, z nichž byly vypěstovány vlasové folikulové buňky. Proto oblast, která není náchylná k alopecii androgenetice, je považována za vhodnou donorovou oblast. Avšak to není podstatné.

Jelikož rozdíl mezi vlasy v různých stádiích růstu je nejlépe viděn, jakmile jsou vlasy odebrány, upřednostňuje se provedeni kroku (1) následujícími mezikroky:

(1a) vytrženi vlasu z donorové oblasti, a (1 b) výběr vhodných viasů v anagenni fázi.

Pro vytrhávání vlasů z donorové oblasti jsou velmi vhodné například pinzety.

Při kroku (2) metody podie vynálezu jsou vlasy pěstovány z odebraných viasů za takových podmínek, že vlasové folikulové buňky jsou schopné množení. V podstatě vlasové folikulové buňky můžou být vypěstovány z vlasů známým způsobem. Kultivační prostředky pro tento účel jsou obchodně dostupné stejně tak jakékoliv přídavné růstové doplňky. Takovými kultivačními prostředky jsou také takzvané keratinocytové kultivační prostředky neobsahující sérum a obvykle obsahující esenciální a neesenciálnl aminokyseliny, vitaminy, stopové prvky, organické složky a anorganické soli. Tyto kultivační prostředky můžou být kombinovány také s růstovými doplňkovými činidly, která obsahují růstové faktory, hormony, antibiotika a extrakty tkáně jako např. BPE (extrakt hovězí hypofýzy), inzulín, hydrokortizon, HEGP (lidský epidermálnl růstový faktor), TGF (transformační růstový faktor), Lcystein, L-leucin a gentamicin.

• · · • · · ·· · ···

Bylo zjištěno, že zvláště dobré výsledky byly získány tehdy, když kultivační prostředek, který kromě známého výše popsaného kultivačního prostředku případně doplněného jedním nebo vice růstovými činidly, obsahuje extrakty nejméně z jedné řady lidské žfrné buňky a je použít v kroku (2) metody podle vynálezu. Lidské žirné buňky jsou obecně známy. Obsahuji různé růstové faktory a jsou produkovány a spotřebovávány v různých místech těla. Výtažky z řady lidských žírných buněk a/nebo autologované (vypěstované) buňky CD34⁺ a/nebo činidla podporujíc! růst obsahuji růstové faktory. Nicméně dodnes tyto extrakty z řady lidské žirné buňky a/nebo z autologovaných (vypěstovaných) buněk CD34⁺ a/nebo činidel podporujících růst nebyly použity v prostředku pro pěstováni vlasových folikulových buněk. Řada lidské žirné buňky, z niž se použije extrakt, je HMC-1 (řada lidské žirné buňky 1) nebo buněčná řada z nl odvozená, jako jsou subklony 5C6 a KU812. Řady žírných buněk jako HMC-1 a její subklony jsou proto obchodně dostupné.

Extrakty z řad)' lidské žirné buňky můžou býtvelmi vhohně zavedeny do prostředku přidáním alespoň jedné řady lidské žirné buňky nebo jejího subkionu a nejméně jednoho degranulačnlho činidla do keratinocytového kultivačního prostředku neobsahujícího sérum. Můžou být také přidány anorganické soli pro lepší využití působeni degranulačnlho činidla. V tomto kontextu je vhodnou solí NaCI₂ . Degranulační prostředek potom takřka rozřeže žirné buňky na menší části (degranulace), výsledkem čehož je uvolněni růstových faktorů do prostředku. Po degranulaci jsou zbytky žírných buněk odstraněny např. odstředěním. Výsledný upravený prostředek lze pak použit k pěstováni vlasových folikulových buněk. Degranulační činidla jsou obecně známa a můžou být rozdělena zhruba do tří skupin:

- hormony jako estrogeny a bradykinin,

- nervové mediátory a antigeny jako apitoxin; substance P a Ig E, a

- syntetická činidla jako Compound 48/80 a Inophore A23187.

Tato degranulační činidla, která jsou schopna degranulace případně použitých žírných buněk, jsou vhodná pro použití v metodě podle předloženého vynálezu. Alternativou je nejprve oddělená příprava extraktů žírných buněk a přidáni těchto extraktů do keratinocytového kultivačního prostředku neobsahujícího sérum. Podmínky, za nichž můžou být pěstovány vlasové folikulové buňky v kroku (2) se můžou podstatně lišit a jsou závislé mj. na použitém prostředku. Nicméně bylo zjištěno, že pěstováni vlasových folikulových buněk při teplotě od 30 °C do 40 °C, • 99

9 9 • 99 ··

9· 9 9 9 9

9 9 9 9

9 999 999 pFednostně v inkubátoru, kde teplota může být udižována konstantní, v atmosféře, která Je nasycena vodou a která obsahuje 3 % až 10 % objemových procent CO₂kromě jiných složek vzduchu v obvyklých kvantitách, přináší dobré výsledky. Avšak tyto podmínky nejsou nijak omezujíc! a i jiné podmínky můžou být také využity. Doba pěstováni se liší od kultury, obvykle od 10 dnů do 40 dnů. Pro získáni dobrého výsledku se upřednostňuje nahrazeni prostředku čerstvým prostředkem každé 2 až 5 dnů.

Krok (2) metody podle vynálezu může být proveden v jednom stupni pěstováni, ale také v několika podstupnfch pěstování subkuitur z původní kultury nebo kultur. To může být uskutečněno odebráním dostatečného počtu vlasových folíkulových buněk ze základní kultury, když tato obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk. Vlasové folikulové buňky ze základní kultury jsou vypěstovány postupně, přednostně - ale ne nezbytně - ve stejném kultivačním prostředku jako byla pěstována původní základní kultura. V průběhu času je možné, ne-li žádoucí, vypěstovat ještě další kultury od zmíněných subkuitur, atd.atd.

Poté, co byly vlasové folikulové buňky vypěstovány, musí být odděleny od substrátu, na němž rostly. To je provedeno známými metodami např. užitím roztoku trypsinu (0,1 % až 0,5 % hmotnostních procent ve vodě) případně v kombinaci s roztokem EDTA (0,1 % až 0,5 % hmotnostních procent) v PBS (fosfátový pufrovaný fyziologický roztok). Takové metody jsou obecně známy. Před použitím vypěstovaných vlasových tolikulových buněk v kroku (3) je lepši odstranit žlrné buňky, jsou-li (stále) přítomny.

V kroku (3) metody podie tohoto vynálezu jsou vypěstované vlasové folikulové buňky implantovány do pokožky v recepční oblasti. Bylo zjištěno, že velmi dobré výsledky jsou získány, když vypěstované vlasové folikulové jsou implantovány přímo do pórů recepční oblasti. Pokud jsou póry špatně vidět, což se může stát hlavně u bledé barvy kůže, můžou být zviditelněny aplikací tekutiny (obvykle žlutě zbarvené) na pokožku v recepčni oblasti, která ztmavne tam, kde jsou póry, což je výsledek vyloučeni potu z potnlch žláz přítomných v pórech. Příkladem takového roztoku je 1% až 10% roztok oftaldialdehydu např. ve xylenu nebo ethylétheru, jak ho popsali L.Juhlin a W.B.Suelley v Nátuře, 28.ledna 1967, strana 408.

Přednostně je množství suspenze vypěstovaných vlasových folikulových buněk zavedeno do každého péru tak, že zmíněné množství obsahuje dostatek vlasových folikulových buněk, aby umožnilo rozvoj vlasového folikulu, z něhož může vyrůst vlas. Počet vypěstovaných vlasových folikulových buněk potřebných k tomu, aby se vytvořil vlasový folikul, je velmi závislý na stupni diferenciace nebo růstovém potenciálu vypěstovaných buněk. Přirozeně bude zapotřebí méně vypěstovaných buněk, když vypěstované vlasové folikulové buňky budou mít relativně vysoký stupeň diferenciace, než když vypěstované buňky mají tento stupeň relativně nízký. Existuje velký počet faktorů, které ovlivňuji stupeň diferenciace vypěstovaných vlasových folikulových buněk. Například použitý prostředek a doba pěstováni jsou takovými důležitými faktory. Přednostně se používá suspenze vypěstovaných vlasových folikulových buněk v prostředku, v němž zmíněné buňky byly pěstovány. Suspenze má přednostně takovou koncentraci vlasových folikulových buněk, že 0,01 μ! až 5 μΙ, lépe však 0,1 μΙ až 5 μΙ suspenze stač! na jeden pór. Toto malé množství je vstříknuto do póru pomoci dávkovacího zařízení, které je opatřeno dutou jehlou, přednostně jehlou 18 až 30 Gauche (G). Použitým dávkovacím zařízením může být např. elektronický dávkovači systém pro pipetu, jehla 18 - 30 G je na konci vybavena dávkovači hadičkou nebo pipetou. Pro průměr póru se hlavně u skalpu užívá přednostně dutá jehla 27 G. Nicméně menší nebo větší jehly můžou být také použity v jiné části těla.

Vynález se také týká metody pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi; jeden nebo více vlasů v anagenní fázi je umístěno do prostředku, který obsahuje nejméně jeden vhodný keratinocytový kultivační prostředek neobsahujícím sérum a extrakty alespoň z jedné řady lidské žlmé buňky. Způsob, jakým může být takový prostředek získán, byl již popsán výše.

Pokud jde o přednosti různých použitých látek prostředku a podmínek pěstování, jsou stejné jako ty pro prostředek a podmínky užité v kroku <2) metody již popsané výše. Proto je lepši použit extrakty řady lidské žlrné buňky HMC-1 nebo buněčnou řadu od ní odvozenou, přednostně subkiony 5C6 nebo KU812. Vhodné podmínky zahrnuji kultivační teplotu od 30 °C do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 % až 10 % objemových procent CO₂.

Vynález se také týká prostředku pro pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi a metody přípravy zmíněného prostředku. Prostředek podle vynálezu obsahuje nejméně jeden keratinocytový kultivační prostředek neobsahující sérum a extrakty alespoň z jedné řady lidské žfrné buňky. Zvláštním význačným rysem takového prostředku je hlavně to, že obsahuje růstové faktory pocházející z jedné nebo vlče řad lidských žirných buněk.

Upřednostňovaný prostředek obsahuje keratinocytový kultivační prostředek neobsahujíc! sérum a extrakty z řady lidské žlrné buňky HMC-1 nebo z buněčné • 4 ·· • · · 4 ♦ · · ·

4 ··4

4 řady z ní odvozené jako 5C6 nebo KU812. Další podrobnosti o základních složkách prostředku podle vynálezu byty už předloženy výše.

Metoda přípravy zmíněného prostředku obsahuje následující táze:

(a) přidáni nejméně jedné řady žf rné buňky nebo subktonu téže a alespoň jednoho degranulačnlho činidla případně v kombinaci s anorganickou solí jako např. CaCI₂ do keratinocytového kultivačního prostředku neobsahujícího sérum;

( b) degranulace řady (řad) lidské žírné buňky nebo subklonů téže, takže růstové faktory se uvolni do prostředku; a (c) odstraněni zbytků žlrné buňky z prostředku např. odstředěním, po kterém získáme (upravený) prostředek.

Podmínky, za kterých může být metoda provedena, nejsou nijak kritické a budou zřejmé pro každého odborníka ve stavu techniky. Degranulačnim činidlem použitým ve fázi (a) je přednostně Compound 48/80 v kombinaci s CaCb.

Nakonec se vynález týká výchozího prostředku pro pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi, který obsahuje nejméně jedno vhodné keratinocytové kultivační činidlo neobsahující sérum nejméně jednu řadu lidské žlrné buňky a/nebo alespoň jedno degranulační činidlo. Zmíněný výchozí prostředek může být užit pro přípravu vhodného upraveného prostředku pro pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi. To může být provedeno jednoduše provedením degranulace, jestliže jak řada lidské žirné buňky, tak degranulační činidlo jsou oba přítomny. Pokud jeden z nich chybf, musi být nejprve chybějící komponent přidán před provedením degranulace žírných buněk.

• to • to to to • · · toto · * • · · · • ·· · • ··· ··· • · • to to toto tototo

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 11 · • · · · · · *

(1) odebráni vlasů v anagennl táži z jedné nebo vice donorovych oblasti tak, že je stále zachována cibulková podstata odebraného vlasu v anagennl fázi;

1. Metoda reprodukce vlasů, která obsahuje následující kroky:

2. Metoda podle nároku t vyznačující se tfm, že krok (1) obsahuje následujíc! mezikroky:

(1a) vytrženi vlasu z donorové oblasti, a (1 b) výběr vhodných vlasů v anagennl fázi.

(2) pěstováni vlasových foiikuiových buněk z odebraného vlasu za takových podmínek, že vlasové folikulové buňky jsou schopné množeni; a (3) implantace vypěstovaných vlasových foiikuiových buněk do lecepčni oblastí.

3. Metoda podle nároku 1 nebo 2 vyznačujíc! se tim, že vlasové folikulové buňky jsou pěstovány v kultivačním prostředku, který obsahuje extrakty alespoň z jedné řady lidské žímé buňky.

4. Metoda podle nároku 3 vyznačující se tím, že řady lidské žímé buňky je l 'MC-1 nebo buněčná rada z ni odvozena.

5. Metoda podie jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že vlasové folikulové buňky jsou pěstovány při teplotě od 30 °C do 40 °C v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 % až 10 % objemových procení CO₂.

6. Metoda podle jakéhokoliv z předchozích nároků vyznačujíc! se tím, že vypěstované vlasové folikulové buňky jsou zaváděny do pórůrecepčni oblasti.

7. Metoda podle nároku 6 vyznačující se tim, že množství suspenze vypěstovaných vlasových foiikuiových buněk je zavedeno do každého póru tak, že zmíněné množství obsahuje dostatek vlasových foiikuiových buněk, aby umožnilo rozvoj vlasového folikulu.

ZMĚNĚNÝ ÚST’ • · • 11 1

8. Metoda podle nároku 7 vyznačující se tim, že množství suspenze zaváděné do póru je od 1 μί do 5 μΙ.

9 ··♦ ·*· • · « · 9 9 • * ·· ·

9 9 9 9

9. Metoda podle nároku 7 nebo 8 vyznačující se tím, že suspenze je vstřiknuta jednotlivě do každého póru pomocí dávkovači pipety, která je opatřena dutou jehlou přednostně jehlou 18 až 30 Gauche (G).

10. Metoda pro pěstování vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi vyznačujíc! se tím, že jeden nebo více vlasů v anagenní fázi je umístěno do prostředku, který obsahuje nejméně jeden vhodný keratinocytový kultivační prostředek neobsahující sérum a extrakty nejméně z jedné řady lidské žírné buňky.

11. Metoda podle nároku 10 vyznačující se tím, že řada lidské žírné buňky je HMC-1 nebo buněčná řada z ní odvozená.

12. Metoda podle nároku 10 nebo 11 vyznačující se tím, že vlasové folikulové buňky jsou pěstovány při teplotě od 30 °C do 40 ^eC v atmosféře, která je nasycena vodou a obsahuje 3 % až 10 % objemových procent CO₂.

13. Prostředek pro pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi vyznačující se tím, že prostředek obsahuje nejméně jeden keratinocytový kultivační prostředek neobsahující sérum a extrakty alespoň z jedné řady lidské žírné buňky.

14. Prostředek podle nároku 13 vyznačující se tim, že řada lidské žirné buňky je HMC-1 nebo bunéčná řada z ní odvozená.

15. Metoda pro přípravu prostředku podle jednoho z nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že obsahuje následující fáze:

( a ) přidáni nejméně jedné řady lidské žirné buňky nebo subklonu téže a alespoň jednoho degranulačního činidla přednostně v kombinaci s CaCi₂ do keratinocytového kultivačního prostředku neobsahujícího sérum;

( b) degranulace řady (řad) žírných buněk nebo subklonů téže, takže růstové faktory se uvolní do prostředku; a (c) odstranění zbytků žírné z prostředku.

ÉNÝusr • 9 9 9 • 9 9 9

16. Výchozí prostředek pro pěstováni vlasových folikulových buněk z vlasů v anagenní fázi vyznačujíc! se tím, že prostředek obsahuje nejméně jedno vhodné keratinocytové kultivační činidlo neobsahujíc! sérum a alespoň jednu řadu lidské žímé buňky a/nebo nejméně jedno degranulačnl činidlo.

17. Výchozí prostředek podle nároku 16 vyznačující setím, že degranulačnl činidlo je Compound 48/80, přednostně v kombinaci s CaCi₂.

«ať líný usi*