CZ313499A3

CZ313499A3 - Metoda vlasové propagace

Info

Publication number: CZ313499A3
Application number: CZ19993134A
Authority: CZ
Inventors: Conradus Ghosal Gho
Original assignee: Ghost Holding B. V.
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2000-02-16
Also published as: NO312805B1; NO994311L; NL1005445C2; CN1254277A; NO994311D0; DE69806232D1; DK0971679T3; DE69806232T2; IL131740A0; AU732729B2; EA199900799A1; AU6638898A; JP2001526560A; WO1998047471A1; CZ298118B6; EP0971679B1; PL335723A1; ES2176977T3; BR9808190A; EP0971679A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká vakcinových formulací pro prevenci infekcí Chlamydiemi. Jednotlivě se týká formulace obsahující rekombinantní MOMP adjuvans s QS21 a 3D-MPL.

Dosavadní stav techniky

Obligátně intracelulární bakterie Chlamydia trachomatis infikuje slizniční epiteliální buňky spojivky a urogenitálního traktu a způsobuje široké spektrum lidských onemocnění jako je trachom a genitální infekce, které mohou vést k dlouhodobým následkům. Trachom, který je endemický v několika rozvojových zemích, je ve světě havní příčinou slepoty, které lze zabránit; genitální infekce, které representují okolo 3 milionu případů za rok v USA, činí ročně asi 200000 žen neplodnými po chlamydiové salpingitidě (1). Proto je tento patogen signifikantní problem veřejného zdravotnictví a jsou podnikány pokusy o výrobu vakciny proti lidským chlamyďiovým infekcím.

Pokusy s vakcinami provedené na lidech i na jiných primátech za použití celého organismu jako imunogenu dávaly serovar-specifickou ochranu, ale některé z vakcin způsobovaly závažnější reakce po reinfekci (2). Několik studu demonstrovalo, že patologie asociovaná s chlamydiovými infekcemi je imunologicky zprostředkovaná (3) ; kromě toho, purifikovaný Chlamydia 57 kDa (Hsp60) vykazoval zvýšení patologie podobné reinfekci u zvířat dříve infikovaných (4, 5). Toto pozorování vedlo k závěru, že ochrana proti Chlamydia trachomatis může být dosažena pouze za použití podjednotkové vakciny.

Druh Chlamydia trachomatis je serotypován do 15 serovarů, které jsou umístěny do 3 seroskupin: B komplexu (serovary B, Ba, D, E, LI a L2), intermediárního komplexu (serovary F, G, K, L3) a C komplexu (serovary A, C, Η, I a J)(6). Sexuálně přenosné choroby (STD) jsou způsobeny serovary D až K, které náleží všem třem seroskupinám. Tak by měla podjednotková vakcina proti Chlamydia STD chránit proti mnoha serovarům, které jsou více nebo méně antigenně příbuzné.

Při projektování podjednotkové vakciny byl velký zájem zaměřen na serotypizační antigen, který se skládá z 40 kDa hlavního zevního membránového proteinu (MOMP). Tento protein, u kterého bylo in vitro ukázáno, že účinkuje jako porin (7) , je přítomný během celého životního cyklu bakterie (8); tento zásadní povrchový protein je vysoce imunogení u lidi a u zvířat. MOMP vykazuje 4 variabilní domény (VD) obklopené pěti konstantními regiony, které jsou vysoce konzervovány mezi serovary (9, 10). In vitro a in vivo neutralizační epitopy pro B buňky byly mapovány na VD (11, 12, 13, 14, 15), zatímco T-buněčné epitopy byly identifikovány jak ve variabilních, tak v konstantních doménách (16, 17). Rekombinantní MOMP byl exprivován v E. coli různými autory (18, 19, 20; nicméně, Manning et al. ukázali, že jejich rekombinantní protein selhal v reakci s monoklonální protilátkou, která rozpoznávala konformační MOMP epitop (18). Imunizace rekombinantním nebo purifikovaným MOMP, po které následovala homotypická nebo heterotypická expozice Chlamydiím, byla provedena na různých zvířecích modelech s různými účinky na parametry infekce (21, 22, 23). Byl vyvinut elegantní experimentální model salpingitidy u myší, u kterých intrauterim inokulace lidského kmene Chlamydia trachomatis vedla k dlouhodobé neplodnosti (24, 25). V pokusu s heterotypickou expozicí Tuffrey et al. ukázali, že parenterální a slizniční imunizace rMOMP absorbovaným na alhydrogel redukovala závažnost salpingitidy a trvání kolonizace dolního genitálního traktu, v příslušném pořadí. Nicméně, přípravek nedával žádnou ochranu proti neplodnosti vznikající v důsleku infekce (23).

jak buňkami zprostředkované, tak o humorální imunitní odpovědi se zdá, že hrají ochrannou roli v genitálních patologiích způsobených Chlamydia trachomatis. Nicméně, Rank skupina naznačila, že u myší je T-buňami zprostředkovaná imunita zásadním imunitním mechanismem pro kontrolu chlamydiových genitálních chorob (26, 27, 28) a bylo ukázáno, že CD4 a CD8 pozitivní buňky udílejí anti-chlamydiální imunitu in vivo (29, 30) .

De-O-acetylovaný monofosforyl lipid A je známý od GB2 220 211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-deacetylovaného monofosforyl lipidu A s 4, 5 a 6 acetylovanými řetězci a je vyráběn Ribi Immunochem Montana.

QS21 je Hplc purifikovaná netoxická frakce saponinu z kůry jihoamerického stromu Quillaja saponaria molina a metoda pro jeho produkci je popsána (jako QA21) v US patentu č. 5057540. Vakciny obsahující jak QS21, tak 3D-MPL jsou popsány v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/00153.

Předkládaný vynález poprvé poskytuje kompozici vakciny, která je účinná v udělení ochrany proti neplodnosti vzniklé z infekce chlamydiemi.

V souladu s tím poskytuje předkládaný vynález vakcinovou formulaci obsahující 3D-MPL, QS21 a MOMP od Chlamydia. Konkrétně, vakcina obsahuje MOMP od seroskupiny B komplexu. Preferovaně obsahuje vakcina alespoň MOMP od serovaru L2, ale může dále obsahovat antigeny od jiných serovarů, jako je D a E.

V preferovaném provedení je QS21 presentován se sterolem, protože taková kompozice může snížit reaktogenicitu a zlepšit stabilitu QS21 vůči basemi zprostředkované hydrolýze.

V preferovaných kompozicích podle vynálezu je QS21 asociován s liposomovou strukturou obsahující cholesterol (zde označovanou jako DQ). Takové adjuvantní kompozice jsou popsány v související UK patentové přihlášce 9508326.7 a 9513107.4, které jsou zde uvedeny jako odkaz. Antigen a MPL jsou, v tomto preferovaném provedení, na zevní straně struktury liposomu.

Příprava vakciny je obecně popsána v New Trends and Developments in Vaccines, vydané Vollerem et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Enkapsulace do liposomu je popsána, například, Fullertonem, U.S. patent 4235877. Konjugace proteinů na makromolekuly je popsána, například, Likhitem, US patent 4372945 a Armorem et al., US patent 4474757.

Množství proteinu v každé dávce vakciny je vybráno jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpovědi bez signifiantních vedlejších nežádoucích účinků u typických vakcinovaných. Takové množství se bude lišit v závislosti na tom, jaký specifický imunogen je použit a jak je presentován. Obecně, je očekáváno, že každá dávka bude obsahovat 1 - 1000 μg proteinu, preferovaně 2 - 100 gg, nejlépe 4 - 40 ^g. Optimální množství pro určitou vakcinu může být ozřejměno standartními studiemi obsahujícími pozorování vhodných imunitních odpovědí u subjektů.

Po počáteční imunizaci mohou subjekty dostat jednu nebo několik dosycovacích imunizací v adekvátních intervalech.

Formulace podle předkládaného vynálezu mohou být použity jak pro profylaktické, tak pro terapeutické účely.

Podle jednoho aspektu poskytuje vynález metodu pro lecbu obsahující podání účinného množství vakciny podle předkládaného vynálezu pacientovi.

V provedení vynálezu je MOMP antigen ze serovaru 2 a je produkován v E. coli prostředky rekombinantních DNA technik. Za takových okolností je protein produkován bez sve signální sekvence.

V předkládaném vynálezu je adjuvantace antigenu s nebo bez MPL + QS21 silně ovlivněna poměrem IgGl:IgG2a u imunizovaných skupin; imunizace s 'MPL + QS21 byla asociována s nízkými poměry IgGl:IgG2a a částečnou ochranou, zatímco imunizace bez MPL + QS21 vedla k vyšším poměrům IgGl:IgG2a a nedávala žádnou ochranu.^ Zajímavé je, že přesmyk na IgG2a protilátkovou produkcibuňky je zprostředkován gamma interferonem, který je produkován Thl subsadou T-helper lymfocytů, zatímco IgGl produkce je zprostředkována interleukinem 4 secernovaným Th2 buňkami (40). Protože je IgG2a produkce kontrolována produkty Thl buněk, zda se pravděpodobné, že chráněná skupina presentovala MPL + QS21 řízenou aktivaci Thl buněk. V lidských a myších modelech jsou Thl cytokiny, IL-2 a IFN gamma, obecně asociovány s resistenci na infekci intracelulárními patogeny, zatímco Th2 cytokiny, IL-4 a IL-10, jsou asociovány s progresivním onemocněním. Toto může být ilustrováno rezistencí nebo citlivostí inbredních kmenů myší na Leishmania major, která koreluje s indukcí specifických Thl nebo Th2 odpovědí (41). Kromě toho, interferon gamma má antichlamydiální aktivitu in vitro a je zahrnut v řešení infekce in vivo (42, 43). Tak by mohla být imunostimulans řízená Thl cytokiny odpovědná za ochranu pozorovanou v tomto vakcinačním pokusu.

Dvě další pozorování podporují hypotesu o instalování ochranné buňkami zprostředkované imunity v rMOMP+MPL+QS21 vakcinovaných skupinách: za prvé, absence specifických sekrečních IgA ve vaginálních sekretech a non-neutralizační charakter silné sérové protilátkové odpovědi vylučují pravděpodobnost protilátkové ochrany; za druhé, heterotypický charakter ochrany získané za použití dvou různých serovarů významně se lišících na úrovni MOMP VD sekvence naznačuje, že epitopy T-buněk ze zpracovaných konzervovaných domén MOMP mohou být agens ochrany proti neplodnosti.

Následuje dokreslení vynálezu

1. Materiál a metody

1.1 Kmeny Chlamydií a zvířata

Chlamydia trachomatis serovar F kmen Nil izolovaný Tuffrey et al. , a laskavě poskytnutý Dr. J. Orfilou a Chlamydia trachomatis serovar L2 kmen 434 (ATCC, Rockville, Md) byly použity v této studii. Chlamydia byly inokulovány na Me Coy buňky (ATCC,

Rockville, Md) v koncentraci asi 10^s inkluse tvořících jednotek/ml (IFU/ml) v MEM doplněné 10% fetálním telecím sérem (FCS) (Gibco BRL). Po Ih centrifugaci (1500g) a 2 hodinové inkubaci při 37 °C (5% C02) bylo inokulum odstraněno a buňky byly vyživovány čerstvým mediem doplněným 0,5 μg/ml cykloheximinu (Sigma). Po inkubaci při 37 °C po 48 byly buňky rozřrušeny skleněnými korálky a sklízeny v 250 mM sacharose, 10 mM fosforečnanu sodném, 5 mM kyseliny L-glutamové pH 7,2 (SPG) do přibližné koncentrace 10⁷ až 10^s IFU/ml a uskladněny při -70 °C.

Samice C3H/HeOuJ (H-2^X) myší, 6-8 týdnů staré, byly získány od Iffa Credo (Francie). 8 až 10 týdnů staří samci téhož kmene (B & K, U.K.) byly použiti pro křížení.

1.2 PCR amplifikace a konstrukce plasmidu

Amplifikace: MOMP serovar L2 DNA byla získána lýzou 10 μΐ chlamydiového inokula ve 240 μΐ lýzovacího pufru a PCR ampifikací jak byla popsána Denamurem et al., (33). Syntetické oligonukleotidy 5¹ -GAGACTCCCATGGATCCACTGCCTGTGGGGAATCCTGC-3' A 5'- TTAGAAGCGGAATTGTGCATTTAC-3' (SB Biologicals, Belgium) byly vybrány z publikované sekvence (34). 5' oligonukleotid obsahoval nukleotidovou sekvenci kódující pro amino-konec zralého MOMP (podtrženo), před kterou je místo pro restrikční endonukleasu BamHI (tučně). Amplifikace byla provedena za použití Pfu DNA polymerasy (Stratagen) a Koch Light NBS Thermal Cycleru (New Brunswick). PCR produkt správné velikosti byl purifikován z 1% agarosového gelu za použití Geneclean II kitu (Bio 101).

1.3 Klonování

Amplifikovaná DNA MOMP serovaru L2 byla tupě zakončena Klenow fragmentem DNA polymerasy I, ligována do pGEM4Z (Promega) předem tráveného Smál a byla transformována do E. coli JM109 za použití standartního CaCL₂ protokolu. Restrikční analýza byla provedena na vznikých klonech a správný DNA konstrukt byl amplifikován a purifikován za použití nucleobond PC-100 kitu (Macherey-Nagel). MOMP DNA byla potom excidována z pGEM4Z-M0MP trávením BamHI a byla insertována do BamHI tráveného pET15 (Novagen) downstream od T71ac promotoru a His.tag sekvence. Správné klony byly selektovány restrikční analýzou po transformaci do E. coli kmene DH10B (Stratagen); kompletní nukleotidová sekvence klonované DNA byla verifikována dideoxy řetězovou terminační metodou (35). pET15-MOMP plasmid byl nakonec použit pro transformaci BL21(DE3) kmenu (Novagen), který je schopný navodit expresi rekombinantního produktu, protože má IPTG indukovatelnou T7 polymerasu.

1.4 Produkce, charakterizace, purifikace a formulace imunogenu

1.4.1 Produkce a charakterizace pET15-M0MP transformované bakterie BL2KDE3) byly kultivovány na LB mediu (Gibco BRL) doplněném 200 gg/ml ampicilinu (Sigma). Exprese byla indukována přidáním 1 mM IPTG, když optická densita kultury měřená při 600 nm dosáhla 0,6 až 0,8. Buňky jsou sklízeny 3 hodiny po indukci, jsou 3-krát promyty PBS a jsou lysovány ve vzorkovém pufru obsahujícím 2% SDS a 5% merkaptoethanol. Vzorky byly zahřátý na 3 minuty při 95 °C a celkový protein byl separován 12% SDS-PAGE za použití markérů molekulové hmotnosti separovaných na stejném gelu (Gibco BRL). Pro imunoblotování byly na 12% SDS-PAGE separované proteiny transferovány do nitrocelulosy a detekovány za použití mAB L2 1-45 a L2 1-10 laskavě poskytnutých Dr. H. Caldwellem a kozího anti-MOMP antisera (Chemicon). Buněčné umístění rMOMP bylo určeno frakcionací buněk, kterou popsal Maniatis et al., (36); peleta a supernantant byly resuspendovány nebo upraveny ve vzorkovém pufru a analyzovány jako celkový buněčný lyzát.

1.4.2 Purifikace

100 ml objem 3h IPTG indukované kultuty byl lyžován lysozymem a deoxycholátem jak bylo dříve popsáno Marstonem et al., (37) . Buněčný lyzát byl centrifugován (12000 g po 15 minut.), peleta byla resuspendována ve 2 ml SDS-PAGE vzorkového pufru obsahujícího 2% SDS, ale nikoliv merkaptoethanol, a vařena 3 minuty. Lyzát byl centrifugován (12000 g po 15 minut, peleta byla rozrušena a supernatant byl upraven 20 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,5% SDS, 500 mM NaCl, 5 mM imidazolem v konečné koncentraci. Vzorek byl potom zaveden na chromatografickou kolonu obsahující 2 ml His.Bind resin (Novagen); iontová kovová afinitní chromatografie byla potom provedena podle návodu výrobce. Identita a čistota eluovaného produktu byla potom hodnocena SDS-PAGE za redukčních podmínek, po kterých následovalo barvení Coomasí Bleu nebo imunoblotting (viz výše). Koncentrace proteinu byla určena Lowryho testem. rMOMP obsahující frakce byly shromážděny a dialyzovány přes noc proti PBS za použití Slide A Lyser kazet (Pierce).

Formulace antigenu. Byly testovány tři formulace:

1) MOMP + QS21 3DMPL

2) MOMP + SB62 emulse olej ve vodě

3) MOMP, SB62, QS21 3DMPL

Toto bylo provedeno podle postupu popsaného ve WO 95/17210 a/nebo WO 94/00153. Stručně, purifikovaný a dialyzovaný rMOMP byl ředěn v PBS na 25 μg/ml (200 μΐ) pro injekci s 5 μg MPL + 10 μg QS21 nebo na 50 μg/ml (100 μΐ) pro smísení s emulsí olej ve vodě označenou jako SB62 s nebo bez 5 μg MPL/10 μg QS21. Pro každou formulaci byly vakciny připraveny následujícím způsobem:

1) MPL/QS21 byla formulována přidáním MPL (jako 100 nm částic) k MOMP antigenu, potom následoval pufr a potom QS21.

2) MPL/QS21/SB62 byla formulována přidáním antigenu k pufru následovaným SB62 následovaným MPL jako 100 nm částice následované QS21. V této formulaci se předpokládá, že antigen je mimo (t.j. mimo kapky emulse), MPL je mimo a většina QS21 je mimo.

3) SB62 byla formulována přidáním SB62 k pufru. Antigen je mimo.

1.5 . Vakcinace v myším modelu salpingitidy, plodnosti a serologického sledování

Skupiny samic C3H/HeOuJ byly podkožně imunizovány při bázi ocasu 2 x 5 μg rMOMP v množství 200 μΐ různých formulací v týdnech 0 a 2; kontrolní skupina byla předstíraně imunizována podle stejného protokolu emulsí obsahující 5 μg MPL a 10 μg QS21.inokulace byla provedena v týdnu 6 podle protokolu popsaného Tuffreyem et al., (24). Stručně, myši dostaly 2,5 mg progesteronu subkutáně (Depo-Provera, Upjohn) 7 dní před expozicí, která byla provedena bilaterální intrauterinní inokulací 5 x 10^s IFU Chlamydia trachomatis Nil ve 100 μΐ SPG nebo ve 100 μΐ Me Coyova

buněčného extraktu.

V týdnu 10 byly ošetřené myši zavřeny v kleci se samci na^3 měsíce pro hodnocení fertility (1 samec na 2 samice, s týdení rotací samců v každé skupině). Parametry, které^byly kakulovány v době křížení byly průměrný počet nově narozených myši na skupinu (M) a průměrná velikost vrhu (N).

Krev byla odebrána v týdnu 6 a sérum bylo analyzováno na rMOMP-specifické protilátky, rozpoznání chamydiálních inklusi serovaru F kmene Nil a neutralizaci heterologní (NII) in vitro infekce. Vaginální výplachy byly odebrány v 6 týdnu pipetováním 50 μΐ PBS do a z vagíny několikrát a byly analyzovány na rMOMP specifické sekreční IgA protilátky.

1.6 Serologické analýzy

1.6.1 Určení anti-rMOMP protilátek

Titry rMOMP specifických IgG nebo IgA byly určeny za použití rMOMP jako antigenu’v enzymově vázaném imunosorbentním testu (ELISA). Plotny (Maxisorp, Nunc) byly potaženy přes noc při 4 C 5 gg/ml roztoku antigenu v 10 mM uhličitanového/hydrogenuhličitanového pufru, pH 9,6 pufr,^byly promyty 0,1% Tween 120 PBS (promývací pufr) a byly blokovaný po 1 hodinu při 37 °C v PBS 3% BSA (Sigma). Testované sérum bylo sériově ředěno v promývacím pufru obsahujícím 0,5% BSA (inkubační pufr) po 1 hodinu při 37 °C. Plotny byly potom promyty a inkubovány po 1 hodinu při 37 °C s křenová peroxidasa-konjugovaným kozím anti-myším IgG nebo IgA (Sigma). Po promytí byl přidán substrát orthofenylen-diamin (Sigma) pri pokojové teplotě na 20 minut; reakce byla ukončena přidáním 2M H S0₄ a byla měřena absorbance při 492 nm na Labsystems multiskan. Titr anti-rMOMP IgG nebo IgA byl exprivován jako reciprocita ředění vzorku séra, což dalo střední hodnotu absorbance.

Pro každý vzorek séra byla rMOMP specifická IgG odpověď rozdělena na rMOMP specifickou IgG2a, IgG2b a IgGl poměr v přímém ELISA jak je popsán výše s určitými modifikacemi. Testovaná séra byla inkubvána v trojím provedení, plotny byly promyty a byly přidány biotynylovaný anti-myším IgG2a, IgG2a nebo IgGl (Amersham) ředěné v inkubačním pufru do každé linie v trojím provedení. Po jedné hodině při 37 °C byly plotny promyty a inkubovány po 1 hodinu s komplexem streptavidin-křenová peroxidasa (Amersham). Zobrazení a určení titru bylo provedeno jak je popsáno výše. Prevalence každého ze tří IgG subtypů vyjádřená v procentech byla počítána jako poměr mezi titrem IgG subtypu a celkovými titry určenými pro 3 subtypy.

1.6.2 Heterotypová detekce chlamydiálních inklusí

Mac Coy buňky byly kultivovány na sterilních 96-jamkových mikroplotnách s plochým dnem (Nunc) a konfluentní monovrstvy byly infikovány asi 5 x 10⁴ IFU Chlamydia trachomatis serovar F kmen Nil. 24hodin po infekci byly buňky promyty PBS a fixovány 10 minut methanolem. Promytí byo opakováno a 100 μΐ vzorků séra ředěných 1/100 v PBS bylo inkubováno po hodinu při 37 °C. Plotny byly promyty a ošetřeny křenová peroxidasa-konjugovaným kozím anti-myším IgG (Sigma) po 1 hodinu při 37 °C. Po promytí PBS byla vazba protilátky vizualizována přidáním diaminobenzidin tetrahydrochloridem (DAB, Sigma). Přítomnost rMOMP IgG odhalených

Nil inklusí byla hodnocena za použití invertovaného optického mikroskopu.

1.6.3 Heterotypová in vitro neutralizační aktivita

Na komplementu nezávislý in vitro neutralizační test byl proveden jak ho popsal Su et al., (38) s určitými modifikacemi. Stručně, 50 μΐ dvojnásobného SPG ředění dekomplementovaného jednotlivého myšího séra bylo přidáno k 10^s IFU serovaru F kmene Nil ředěného v 50 μΐ SPG. Směs byla inkubována 30 minut při 37 °C (5% CO2) a potom bylo 100 μΐ inokulováno na HESS (Gibco BRL) promyté ledvinné buňky syrského křečka (HaK, ATCC, Rockville, Md) a ty byly inkubovány po 2 hodiny při 37 °C (5% CO2) . potom bylo inokulum odstraněno, buňky byly promyty HBSS a MEM obsahujícím 10% FCS, 50 μ<3/τα1 gentamycinu a bylo přidáno 0,5 μg/ml cykloheximinu. Po 24 hodinové inkubaci při 37 °C byly buňky fixovány a inkluse byly imunochemicky detekovány jak je popsáno výše za použití komerčního kozího anti-MOMP antiséra (Chemicon) a alkalická fosfatasa konjugované králičí anti kozí protilátky (Sigma). 5-bromo-4-chloro-3-indol fosfát/nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT, Sigma) byl použit jako substrát pro enzymatickou reakci. IFU byly kvantifikovány počítáním 5 polí při zvětšení 200 x za použití invertovaného mikroskopu. Průměrný počet IFU na pole získaný ze vzorku séra byl vyjádřen jako procento redukce průměrného počtu IFU získaných s negativní kontrolní směsí, která obsahovala séru od naivních myší. Neutralizační titry (NT 50) byly kalkulovány jako reciprocita ředění vzorku séra dávající 50% redukci infektivity.

1.7 Výsledky

1.7.1 Exprese a charakterizace rekombinantního antigenu

PCR amplifikovaný DNA fragment obsahující nukleotidovou sekvenci pro zralý MOMP serovar L byl insertován ve správném čtecím rámečku a orientaci do pET15 expresního vektoru; nukleotidová sekvence chlamydiálního proteinu a fúsního spojení s plynukleotidovým řetězcem kódujícím 5'-terminální His-Tag peptid byly jak bylo předpokládáno projektováním klonovací strategie. Po frakcionaci buněk byl expresní produkt umístěn v nerozpustné frakci E. coli, což naznačuje, že je exprivován ve formě nerozpustných inklusních tělísek. Rekombinantní MOMP obsahující peleta byla solubilizována ve 2% SDS pufru a byla zevedena na kolonu iontové kovové afinitní chromatografii, ve které byly použity ionty niklu pro chelaci histidinových zbytků na His.tag peptidu fušovaném s rekombinantním MOMP. Purifikovaný protein, který byl promyt a eluován v pufru bez SDS vykazoval předpokládanou molekulovou hmotnost a byl imunoreaktivní s anti-MOMP monoklonálními a polyklonálními protilátkami jak bylo ukázáno SDS-PAGE a Western blot analýzou, v příslušném pořadí. Po dialýze byla rMOMP koncentrace situována mezi 500 gg/ml a 1 mg/ml a čistota rekombinantního produktu byla určena jako 90%.

1.7.2 Účinek imunizace adjuvantováným rMOMP na serologickou odpověď u myší a na plodnost po heterotypické expozici

Výsledky pokusu projektovaného pro hodnocení profylaktického potenciálu různě adjuvantováného rekombinantního MOMP jsou uvedeny v tabulce 1. Skupiny 4 a 5 byly subkutáně imunizovány rMOMP adjuvant ováným 5 gg MPL a 10 gg QS21; ve skupině 4 byl adjuvantovaný rekombinantní protein připraven v SB62 emulsy obahující squalen a alfa tokoferol jako olejovou fázi a Tween 80 jako surfaktant. Skupina 6 byla subkutánně imunizována rMOMP kombinovaným se stejnou SB62 emulsí jako skupina 4, ale bez imunostimulans. Také byly naplánovány tři kontrolní skupiny. Skupina neošetřených zvířat (skupina 1), skupina falešně imunizovaných myší za použití imunostimulans kombinovaného s SB62 emulsí (skupina 2) a skupina 3, která byla imunizována jako skupina 4, ale byly věnovány napodobenině infekce. Skupiny 2, 4, 5 a S byly vystaveny heterotypickému kmenu Chlamydia trachomatis NII.

1.7.3 Účinek imunizace na serologické odpovědi

Pro hodnocení imunogenicity různých přípravků byly titry IgG měřeny ELISA na seru odebraném 4 týdny po druhé dávce vakciny (den expozice) a byly kalkulovány aritmetické průměry titrů (ANT) pro každou skupinu. Imunizace dvěma injekcemi 5 μ$ rMOMP vedla k objevení vysoké hladiny anti-rMOMP IgG. Jak je ukázáno v tabulce 1, AMT byly v podstatě stejné pro skupiny 4 a 6, ale kombinace emulse a imunostimulans vedla ke dvojnásobnému zvýšení rMOMP specifického průměrného tiru IgG. Zvířata, která byla falešně imunizována pouze aďjuvans (skupina 2) neměla žádný signifikantní titr protilátek proti chlamydiálnímu rekombinantnímu antigenu. V žádné skupině nebyl žádný specifický rMOMP sekreční IgA detekován ve vaginálním výplachu odebraném těsně před expozicí.

Jak je ukázáno v tabulce 1, signifikantní rozdíl v profilu podtříd IgG byl pozorován mezi imunostimulans obsahujícími skupinami (4 a 5) a skupinou 6, která byla imunizována SB62 emulsifikovaným rMOMP. 0 využití MPL+QS21 se ukázalo, že signifikantně zvyšuje relativní hladinu IgG2a a snižuje relativní hladinu IgGl; maximální účinek tohoto fenoménu byl dosažen s

neemulsifikovaným přípravkem.

Pro objasnění toho, zda rMOMP specifické IgG byly schopné zkříženě reagovat s Chlamydiemi heterotypických infekčních kmenů bylo sérum ředěno 1:100 a jednotlivě testováno v imunoenzymatickém testu na svou schopnost rozpoznat chlamydiové inkluse na methanolem fixovaných infikovaných buňkách. U všech myších ser z každé imunizované skupiny bylo ukázáno, že obsahují IgG reagující s Chlamydia trachomatis serovar F kmen Nil využitým pro expozici. Proto byly všechny testovány na in vitro na komplementu nezávislou neutralizační aktivitu proti tomuto kmenu za použití séra od falešně imunizovaných myší jako negativní kontroly. Výsledky byly inkonsistentní ve srovnání s výsledky získanými ELISA a imunoenzymatickým testem, protože žádné z imunitních sér nebylo schopné signifikantně redukovat infektivitu chlamydií.

1.7.4 Účinek heterotypické imunizace na plodnost po expozici

Osm týdnů po poslední imunizaci (nabo falešné imunizaci) rMOMP a 4 týdny po intrauteriní infekci (nebo falešné infekci) byly myši pářeny se samci po dobu 2 měsíců. Výsledek expozice heterolognímu kmenu Nil na plodnost C3H/HeOuJ myší byl měřen pomocí následujících parametrů: průměrného počtu novorozenců na skupinu (N) a průměrné velikosti vrhu (M). Při srovnání s neošetřenými myšemi byla plodnost chlamydiemi inokulovaných myší ve skupině 2 (falešně imunizované) signifikantně alterována; tento výsledek ptvrdil validitu zvířecího modelu v tomto jednotlivém případě. Zvířata, která byla imunizována a falešně infikována (skupina 3) presentovala redukované parametry plodnosti ve srovnání s neošetřenou skupinou; tato skupina projektovaná pro zabrání nepatologických alterací zvířecí plodnosti do úvah byla použita jako kontrola pro hodnocení profylaktického potenciálu rMOMP přípravků. Jak je ukázáno v tabulce 1, signifikantní rozdíly v hladině plodnosti byly pozorovány mezi imunostimulans ko-vakcinovanými skupinami (skupina 4 a 5) a skupinou 6, která byla imunizována SB62 emulsifikovaným rMOMP. Skupina 5 vykazovala nej lepší výsledky u 7 z 10 myší dávající porody v jednotlivých vrzích a maximální parametry plodnosti; N hodnota dosáhla 50% hodnoty náležící kontrolní skupině 3 a M hodnota byla srovnatelná s hodnotou kalkulovanou pro stejnou kontrolní skupinu. Oproti tomu, parametry plodnosti vykázané skupinou 6 postrádající imunostimulans jsou srovnatelné s parametry získanými v infikované kontrolní skupině 2. rMOMP imunizace kombinující imunostimulans a SB62 emulsy také vedla k ochraně proti neplodnosti, ale použití SB62 patrně částečně snižovalo stupeň ochrany. Tak, využití MPL plus QS21nabízí částečnou ochranu před chlamydiální infekcí horního genitálního traktu a maximální účinek tohoto fenoménu byl dosažen s neemulsifikovaným přípravkem.

1.8 Závěr

Naše výsledky ukazují, že parenterální imunizace MPL+QS21 adjuvantováným rMOMP částečně brání neplodnosti způsobené heterologní chlamydiální infekcí myšího genitálního traktu; oproti tomu, injekce SB62 emusifikovaného rMOMP bez obou imunostimulans neindukuje žádnou ochranu. Na druhou stranu, všechny přípravky zvyšují silnou a relativně homogenní MOMP specifickou celkovou IgG odpověď v séru imunizovaných zvířat; tyto protilátky byly schopné zkříženě reagovat s methanolem fixovanými chlamydiálními inklusemi heterotypických infikujících kmenů, ale nebyly schopné redukovat infektivitu chlamydií in vitro. Těsně před expozicí rMOMP specifické IgA nebyly detekovatelné ve vaginální sekreci, což je konsistentní s parenterální metodou podání antigenu. Tak, srovnání celkových specifických IgG titrů nebo neutralizačních titrů s výsledky patologie pro imunizované skupiny neodhalilo signifikantní korelaci pro jakékoliv z těchto srovnání.

Výsledky z předkládaných výzkumů ukazují, že rekombinantní MOMP kombinovaný s MPL+QS21 imunostimulans je schopný zvýšit imunitní ochranu proti neplodnosti způsobené Chlamydia trachomatis .

2. Druhá serie pokusů různých MOMP adjuvantních formulací

2.1 Byly testovány metody a materiál

Chlamydiální a myší kmeny byly shodné s těmi, které byly využity v pokusu popsaném v příkladu 1.

2.2 MOMP produkce' a formulace

Produkce a použití na konstruktu pET15-MOMP pro produkci antigenu jsou popsány v příkladu 1. Protokol purifikace antigenu byl modifikován tak, aby bylo produkováno větší množství endotoxin prostého antigenu. Stručně, 10 ml His.Bind resinu (Novagen) bylo promyto 25 objemy 2% SDS, 6M močoviny ve vodě před provedením kroku purifikace podle výrobce, zatímco 250 ml indukovaného lyzátu peletovaného centrifugací bylo promyto 4M močovinou, 2M NaCl a potom 2% Zwittergen (Calbiochem) před solubilizací v Tris-HCl pH 7,9, 0,5% SDS, 500 mM imidazol.

Antigen byl eluován v TRis-HCl pH 7,9, 100 mM imidazolu, extensivně dialyzován proti 5 mM Tris-HCl pH 7,4 a filtrován na 0,22 μm sterilizačním filtru (Millipore). Limulus amoebecytový lyzátový test (Coatest, Chromogenix) byl potom použit pro hodnocení obsahu LPS.

2.3 Formulace

Antigen byl formulován jak je popsáno v příkladu 1 kromě toho, že množství MPL na dávku bylo upraveno na 10 μg; skupina využívající modifikovaný QS21 jak je popsáno v souvisejících UK přihláškách 9508326.7, 9513104.4 (označené jako DQ) byla také testována a přidána k vakcině v poměru 10 μg na dávku. Přesněji byla vakcina formulována přidáním antigenu k pufru. Potom byl přidán MPL jako 100 nm částice. V separátní tubě byl QS21 smísen s malými unilamelárnímy liposomy složenými z dioleoylfosfatidylcholinu (DOPC) a cholesterolu (DOPC:cholesterol =4:1 hmotnost/hmotnost) tak, že poměr QS21 ku cholesterolu je 1:5 (Za těchto podmínek je všechen QS21 inkorporován do liposomální membrány). QS21/SUV směs (nazývaná DQ) je potom přidána ke směsi antigen/MPL. V této formulaci je antigen zevně, MPL je zevně a QS21 je v liposomech.

2.4 . Vakcinace v myším modelu salpingitidy, plodnosti a imunologických a histlogických následků

Imunizace, experimentální infekce a vzorkování bylo provedeno stejně jako je popsáno výše kromě toho, že negativní kontrolní skupina byla falešně imunizována emulsí obsahující 10 μg MPL a 10 μg QS21 a že byla přidána samostatná skupina imunizovaná antigenem kombinovaným s MPL + DQ. Skupiny byly složeny z 15

myší: 10 z nich bylo pářeno během 8 týdnů, zatímco 5 z nich bylo usmrceno 2 týdny po expozici pro histopatologické a imunocytochemické analýzy. Parametry použité pro hodnocení fertility skupin byly: F (počet myší, které vrhly jednou nebo vícekrát dělený celkovým počtem myší), M (počet nově narozených myší (živých nebo mrtvých) dělený počtem vrhů) a N (počet nově narozených myší (živých nebo mrtvých) dělený celkovým počtem myší).

Séra a vaginální výplachy byly analyzovány na rMOMP-specifické protilátky ELISA, séra byla také vyšetřována na rozpoznání chlamydiálních inklusí serovaru F kmene Nil a na neutralizaci heterologní (NII) in vitro infekce. Všechny tyto techniky jsou popsány výše.

Horní polovina genitálního traktu (vaječníky, vejcovody a vrcholy děložních rohů) byly ulženy do OCT sloučeniny (Tissue-TEK, Miles), rychle zmrazený a zmrazené řezy (10 μm) byly umístěny na skleněná sklíčka (Superforst, Menzel-glaser). Řezy byly sušeny na vzduchu, fixovány v acetonu po 5 minut a potom uskladněny při -70 ^ÓC. Pro histopatologickou analýzu byly vodou rehydratované řezy barveny haematoxilinem (H) a eosinem (E). Pro imunocytochemické barvení byly řezy rehydratovány v PBS, inkubovány po 60 minut se 2 μg biotynylované krysí anti-myší CD4 nebo CD8 mAB (Serotec) ve 100 μΐ PBS, promyty 2-krát s PBS a reinkubovány 30 minut s 1/2000 ředěním HRP streptavidin (Zymed). Po promytí byla vyvíjena barva kapalným DAB kitem (Zymed), protiznačeným haematoxylinem a permanentně umístěným v acrytolu (Surgipath).

2.5 . Test s interferonem gamma

Myši byly subkutáně injikovány při basi ocasu 200 μΐ formulace v týden 0 a 2; kontrolní skupina byla falešně imunizována 10 μg MPL a 10 μg QS21 kombinovaného s emulsí. Zvířatům byla odebrána krev pro serologickou analýzu a potom byla usmrcena v týden 4, sleziny byly asepticky odebrány, poolovány a jedna buněčná suspense byla připravena pro restimulaci 1 μg/ml rMOMP nebo 4/ml Con A (Boehringer Mannheim) jako kontrolou. Potom byly kultury umístěny na 24 jamkových kultivačních plotnách s plochým dnem za použití 10⁶ odpovídajících buněk na ml RPMI 1640 s 10% fetálním telecím sérem (Gibco BRL). Supernatanty byly sklízeny 96 hodin po restimulaci a byly testovány na IFN gamma za použití komerčního EISA kitu (Cytoscreen, Biosource).

2.6 . Výsledky

2.6.1 . Antigen

Po dialýze byla rMOMP koncentrace hodnocena okolo 2 mg/ml a kontaminace endotoxinem byla nižší než 0,05 EU/μg rMOMP/

2.6.2 . Účinek imunizace adjuvantováným rMOMP na myší protilátkovou imunitní odpověď, na jejich plodnost po heterotypické expozici a na zánětlivy infiltrát vzniklý z infekce

Výsledky pokusů projektovaných pro hodnocení profylaktického potenciálu různě adjuvantováných rMOMP jsou přítomny v tabulce 2.

2.6.3 Účinek imunizace na protilátkovou odpověď

Protilátková odpověď po vakcinaci byla hodnocena v séru a ve vaginálních výplaších odebraných den po expozici. Všechny formulace antigenu dávay podobný geometrický průměr anti-rMOMP IgG titrů )GMT) okolo 30000. Zvířata falešně imunizována adjuvans neměla žádný signifikantní titr protilátek proti chlamydiálnímu rekombinantnímu antigenu. V jakékoliv skupině, žádný rMOMP specifický sekreční IgA nebyl detekován ve vaginálním výplachu odebraném těsně před expozicí. Izotypování rMOMP-specifické IgG odpovědi ukázalo, že přítomnost MPL a QS21 nebo DQ zvyšuje relativní hladinu IgG2a ve srovnání s odpovědí vyvolanou MOMP v samotné emulsy. Ve všech imunitní sérech bylo ukázáno, že obsahují IgG reagující s methanolem fixovanými inklusemi serovaru FC trachomatis kmene Nil využitého pro expozici.

2.6.4 Účinek heterotypické imunizace na plodnost po expozici

Důsledky expozice heterolognímu kmenu Nil na myší plodnost byly měřeny pomocí F, N a M parametrů definovaných v experimentáním postupu. Pro každou skupinu byly hodnoty těchto parametrů kalkulovány v průběhu periody páření jak je resentováno v tabulce 1. Oproti'falešně infikované skupině, infekce falešně imunizované skupiny vedla k téměř kompletní neplodnosti, což ukazuje, že pozorované neplodnost je indukovaná C. trachomatis a nikoliv manipulací se zvířaty. Ve skupinách imunizovaných rMOMP adjuvantovaným jak imunostimulans, tak MPL + DQ formulacemi antigenu, došlo k částečné ochraně: v této skupině dosáhly hodnoty F a N parametrů okolo 80% hodnot zaznamenaných ve falešně infikované skupině (pozitivní kontrole). Oproti tomu, imunizace před expozicí rMOMP formulovaným v emulsi vedla k nízkým hodnotám F a N parametrů plodnosti.

2.6.5 Histopatologické změny po expozici

V histopatologickém protějšku pokusu plodnosti bylo klasické HE barvení provedeno na tkáňových řezech a neukázalo žádný významný rozdíl v zánětlivém skoré vejcovodů a vaječníků mezi falešně imunizovanými a vakcinovanými skupinami. Nicméně, při zaměření se na frekvenci podsad T-buněk imunocytochemickým barvením byly CD4 pozitivní buňky detekovány pouze v MPL + DQ vakcinované skupině (4 ze 4 myší), zatímco CD8 pozitivní T-buňky byly detekovány u imunizovaných, stejně jako u falešně imunizovaných skupin (tabulka 3). Tak, v tomto pokusu, CD4 pozitivní infiltrující T-buňky byly nalezeny pouze v MPL + DQ vakcinované skupině, která byla jedinou skupinou s ochráněnou plodností v této protějšku pokusu.

2.6.6 . Účinek formulace na TEN gamma sekreci při in vitro restimulaci

Buněčná aktivace indukovaná formulacemi antigenu (tabulka 4) byla analyzována ve zvláštním pokusu. Na jedné straně, izolované buňky sleziny od zvířat vakcinovaných rMOMP v kombinaci s MPL + QS21 nebo MPL + DQ a in vitro restimulované antigenem vykazovaly koncentrace IFN-gamma ve svých supernatantech kultur srovnatelné s těmi, které byly získány při stimulaci 4 ^g/ml konkavalinu A po stejnou dobu. Na druhé straně, buňky izolované od zvířat falešně vakcinovaných nebo vakcinovaných rMOMP bez imunostimulans neprodukovaly detekovatelné hladiny IFN gamma, zatímco jejich protějšky ko-kultivované s ConA byly všechny pozitivní na tento cytokin. Serologické analýzy provedené na poolech séra od každé skupiny ukázaly, že sekrece IFN-gamma byla asociována se zvýšeným poměrem antigen specifických IgG2a.

Závěr:

Dohromady tato data z pokusu expozice a testu detekce IFN gamma naznačují, že, u myší, kombinace dvou adjuvans MPL a QS21 nebo DQ s rekombinantním MOMP indukují antigen specifickou Thl podobnou imunitní odpověď určenou sekrecí IFN-gamma a zvýšeným poměrem IgG2a, což může vést k ochraně proti neplodnosti vzniklé z infekce chlamydiemi.

Odkazy:

1. Washington AE, Johnson RE and Sanders LL. Chlamydia trachomatis infections in the United States: what are they costing us. JAMA 1987. 257. 20702072.

2. Grayston JT and Wang SP. New knowledge of Chlamydiae and the diseases they cause. The Journal of Infectious Diseases 1975, 132: 87-105.

3. Grayston JT, Wang SP,* Yeh LJ, and Kuo CC. Importance of reinfection in the pathogenesis of trachoma. Reviews of Infectious Diseases 1985, 7, 717-725

4. Morrison RP, RJ Belland, K Lyng and HD Caidwell. Chalmydial disease pathogenesis. The 57-kD Chlamydial hypersensitivity antigen is a stress response protein. J. Exp. Med. 1989, 170, 1271-1283

5. Blander SJ and Amortegui AJ. Mice immunized with a chlamydial extract have no increase in early protective immunity despite increased inflammation

- 1825 following genital infection by ±e mouse pneumonitis agent of Chlamydia trachomatis. Infec. Immun. 1994, 62, 3617-3624. pg

6. Wang SP, Kuo CC, Barnes RC, Stephens RS and Grayston IT. Immunotyping of Chlamydia trachomatis with monoclonal antibodies. The Journal of Infectious Diseases 1985, 152, 791-800.

7. Bavoil P, Ohiin A, and Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis. Infect. Immun. 1984, 44, 479-485.

8. Hatch TP, Miceli M, Sublett JE. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during development cycle of Chlamydia psiaaci and Chlamydia trachomatis. J. Bacterio!. 1986, 165, 379-385.

9. Stephens RS, R Sanchez-Pescador. EA Wagar. C Inouye and MS Urdea. Diversity of Chlamydia trachomatis Major Outer Membrane Protein genes. J. Bacterio!. 1987, 169, 3879-3885.

10. Yuan Y, Zhang YX. Watkins NG, and Caldwell HD. Nucleotide and deduced amino acid sequences for the four variable domains of the major outer mebrane proteins of the 15 Chlamydia trachomatis serovars. Infect. Immun. 1989, 57, 1040-1049.

11. Baehr W, Zhang YX, Joseph T, Su H, Nano FE, Everett EK and Calwell HD. Mapping antigenic domains expressed by Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1988. 8o, 4000-4004

12. Lucero ME and Kuo CC. Neutralization of Chlamydia trachomatis cell culture infection by serovar-specific monoclonal antibodies. Infect. Immun. 1985, 50, 595-597

13. Zhang YX, Stewart S, Joseph T, Taylor HR and HD Caldwell. Protective monoclonal antibodies recognize epitopes located on the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J. Imunoi. 1987, 138, 575-581.

14. Peterson E, Zhong G, Carlson E and de la Maza LM. Protective role of magnesium in the neutralization by monoclonal antibodies of Chlamydia trachomatis infectivity. Infect. Immun. 1988, 56, 885-891.

15. Zhang YX, Stewart SJ and Caldwell HD. Protective monoclonal antibodies to Chlamydia trachomatis serovar- and serogroup- specific major outer membrane protein determinants. Infect. Immun. 1989, 57, 636-638

16. Allen IE, RM Loksley and RS Stephens. A single peptide from the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis elicits T cell heip for the production of antibodies to protective determinants. J. Immunol. 1991, 147, 674679

17. Su H, RP Morrison, NG Watkins and HD Caldwell. Identification and characterization of T helper cell epitopes of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J. Exp. Med. 1990, 172, 203-212

18. Manning DS and SJ Stewart. Expression of the major outer membrane protein of Chalmydia trachomatis in Escherichia coli. Infect. Immun. 1993, 61, 4093-4098.

19. Koehler JE, Birkeiund S and Stephens RS. Overexpression and surface localization of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein in Escherichia coli. Molecular Microbiology 1992, 6, 1087-1094

20. Pickett MA, ME Ward and IN Clarke. High level expression and epitope localization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis serovar LI. Molecular Microbiology 1988, 2, 681-685.

21. Taylor HR, J Whictum-Hudson, J Schachter, HD Caldwell and RA Prendergast. Oral immunization with chlamydial major outer membrane protein (MOMP). Investigative Ophthalmology and visual Science 1988, 29, 1847-1853 22. Batteiger BE, RG Rank, PM Bavoil and LSF Soderberg. Partial protection against genital reinfection by immunization of guinea-pig with isolated mouter membrane proteins of the chlamydial agent of guinea-pig inclusion conjunctivitis. Journal of General Microbiology 1993, 139, 2965-2972.

23. Tufffey M, F Alexander. W Conlan. C Woods and M Ward. Heterotypic protection of mice against chlamydial salpingitis and colonization of the lower genital tract with a human serovar F isolate of Chlamydia trachomatis by prior immunization with recombinant LI major outer-membrane protein. Journal of General Microbiology 1992, 138, 1707-1715.

24. Tuffrey Μ, P Faider, J Gale and D Tayior -Robinson. Salpingitis in mice induced by human strains of Chlamydia, trachomatis. Br. J. exp. Path. 1986, 67, 605-616.

25. Tuffrey M, P Faider, J Gale, R Quinn and D Tayior -Robinson.Infemiity in mice infected genitaily with a human strain of Chlamydia trachomatis . Br. J. exp. Path. 1986, 78, 251-260

26. Ramsey KH, LSF Soderberg and RG Rank. Resolution of Chlamydial senital infection in B-cell deficient mice and immunity to reinfection. Infect, w *

Immun. 1988, 56, 1320-1325.

27. Rank RG, LSF Soderberg and AL Barron. Chronic chlamydial genital infection in congenitally athymic nude mice. Infect. Immun. 1985. 48, 847-849 28. Igietseme JU and RG Rank. Susceptibility to reinfection after a primary chlamydial genital infection is associated with a decrease of antigen-specific T cell in the genital tract. Infect. Immun. 1991, 59, 1346-1351

29. Igietseme JU, KH Ramsey, DM Magee, DM Williams TJ Kincy and RG Rank. Resolution of murine chlamydial genital infection by the adoptive transfer of a biovar-specific, TH1 Lymphocyte clone. Regional Immunology 1993, 5, 317-324.

30. Igietseme JU, DM Magee, DM Williams and RG Rank. Role for CD8-r T cell in antichlamydial immunity defined by chlamydial-specific T-lymphocyte clones. Infect. Immun. 1994, 62 , 5195-5197.

31. Myers KR and JT Ulrich. Effective use of monophosphoryl lipid A as an adjuvant. In Novel vaccine strategies. Mucosal, adjuvant and genetic appoaches. International Business Communication, Ma, USA.

32. Newman MJ, JY Wu, BH Gardner, KJ Munroe, D Leombruno, J Recchia, CR Kensil and RT Coughlin. Saponin adjuvant induction of ovalbumin-specific CD8 + cytotoxic T lymphocyte responses. The Journal of Immunology 1992, 148, 2357-2362.

33. Denamur E, C Sayada, A Souriau, J Orfila, A Rodolakis and J Elion. Restriction pattern of the major outer membrane protein gene provides evidence for a homogeneous invasive group among ruminant isolates of Chlamydia psittaci. Journal of General Microbiology 1991, 137, 2525-2530.

34. Zhang YX, SG Morrison and HD Caldwell. The nucleotide sequence of major outer membrane gene of Chlamydia trachomatis serovar F. Nucleic Acids Research 1990, 18, 1061.

35. Tabor S and CC Richardson. Proc. Natl Acad Sci USA 1989, 86, 40764080.

36. Sambrook J, EF Fritsch and T Maniatis. Molecular cloning A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

37. Marston FAO. The purification of eukaryotic polypeptides expressed in Escherichia coli. In: DNA cloning: A Practical approach (ed. DM Glover) vol 3 p. 59. IRL Press, Oxford.

38. Su H and HD Caldwell. Immunogenicity of a synthetic oligopeptide corresponding to antigenically common T-helper and B-cell neutralizing epitopes of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Vaccine 1993. 11, 1159-11166.

39. Tuffrey M, F Alexander, C Inman and ME Ward. Correiaton of infertility with altered tubal morphology and function in mice with salpingitis induced by a human genital-tract isolate of Chlamydia trachomatis. J. Reprod. Fert. 1990, 88, 295-305.

40. Snapper CM and WE Paul. Interferon-gamma and B cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production. Science 1987, 236, 944-947.

41. Heinzel FP, MD Sadick. SS Mutha and RM Loksley. Production of Interferon-gamma, Interleukin 2, Interleukin 4, and Interleukin 10 by CD4-r lymphocytes in vivo during healing and progressive murine leishmaniasis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1991, 88, 7011.

42. Byrne Gi, LK Lehmann and GJ landry. Induction of tryptophan catabolism for gamma interferon mediated inhibition of intracellular Chlamydia psittaci replication in T24 cells. Infect. Immun. 1986, 53: 347.

43. Rank RG, KH Ramsey, EA Pack and DM Williams. Effect of gamma interferon resolution of murine chlamydial genital infection. Infect. Immun. 1992, 60, 4427-4429.

Tabulka 1

S^hflcU Η— · —*—·»·* · “*··“ ••‘“•““•i* “·“« “

infikov

ťM s Λ Mt		M S >« 5 «3 S' >z S •a Z	velikost vrhu		_______________9 1	cn	4.75	3.3
mláďat na myš	__________8 0	C4 MS	_____________Z. Ί	1.9	___8 P
r: procento plodných myší f 1 (%)	1/8 <12 5)	(06) _________01/6	Z—\ £ s	(0E) 01/E	6/8 (75)
Poměr izutypň lgG2a:jgG!:!gG2b 1____	C z 1	CM vn TF	Tt 0'	cc	C-) íc CM m
rMOMPspecifické IuG «ΜΤ	³ — ^v	³ •M r	□ “M	n T — v	O n » □ *3	3
Skupina ¢. Imunizace/ infekční proluko! _____e Π 1 SM----«!.. . .s	lil iMcgituve tlil) (SC) MPL + QS21 I SB62/ infikováno 1 á i i Urvr· « i i * > «i Z’”' a .. 1 \	U3HIVL U-U jj rMOMP L2 (sc) MPL + QS2I+SB62/ falešně infikováno m	rMOMP L2 (sc) MPL + QS2L infikováno ΓΜ	rMOMP L2 (sc) SB62/ infikováno	rMOMP L2 (sc) DQ Ψ MPL/ infikováno	•3 x * .2 2 3 S 5 f 2 i W 5. ! Λ .. 43 . 3 * S , ·. s a

Tabulka 3

CD-I nebo CD8 pozitivní skoře T buněk bzlo stupňováno od žádné buňky (-) do maximální (++4-) infiltrace uvažovaného typu buněk

Claims

1, Kompozice vakciny obsahující MOMP protein od Chlamydia v konjunkci s QS21 a 3DMPL.

2. Vakcina podle nároku 1, kde protein je odvozen od L2 serovaru.

3. Vakcina podle nároku 1 nebo 2, která dále obsahuje protein z jiných serovarů.

4. Vakcina podle nároku 1, která dále obsahuje sterol.

5. Vakcina podle nároku 4, kde sterol je cholesterol.

6. Vakcina podle nároku 5, kde je QS21 asociován s cholesterol obsahujícím liposomem.