CZ328594A3 - PURIFICATION OF CRINGL-CONTAINING PEPTIDES, PARTICULARLY t-PA - Google Patents

Description

Čištění proteinů obsahujících kringl, zvláště t-PA

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu čištění proteinů cích kringl z roztoku proteinů, který obsahuje tyto proteiny obsahující kringl. Podle tohoto způsobu se proteiny obsahující kringl, které mají schopnost vázat se na ω-aminokyseliny, selektivně eluují z kolony ionexu těmito ω-aminokyselinami.

Dosavadní stav techniky

Čištění proteinů, zvláště proteinů, o kterých se uvažuje jako proteinech použitelných pro léčení, je citlivý proces. Výchozími materiály pro čištění budou typicky biologické kapaliny, jako je plasma nebo sérum, buněčné lysáty nebo kultivační media, pokud se protein připravuje kultivací buněčné linie schopné produkovat tento protein. Bez ohledu na zdroj výchozího materiálu, tento materiál normálně obsahuje četné nechtěné proteiny a další materiály, od nichž se musí žádaný protein oddělit. Mezi tradiční stupně čištění patří oddělení zbytků buněk nebo podobných materiálů filtrací nebo odstřelováním, vysrážení proteinového matě’řiálu a rozdělení proteinového materiálu, čímž se získá roztok proteinů, který obsahuje žádaný protein, avšak stále ještě znečištěný jinými proteiny. Tento roztok proteinů se pak typicky nanese na vhodné čištící kolony, jako jsou kolony pro afinitní chromatografií nebo chromatografií na iontoměniči nebo na podobné.

Afinitní chromatografie je vhodná pro čištění v malém měřítku, například pro výzkumné účely. Pro komerční přípravu ve velkém měřítku je však méně přitažlivá vzhledem k vysoké ceně materiálu kolony, ale vzhledem také k neuspokojivé chemické stabilitě tohoto materiálu. Po jisté době používání bude materiál kolony znečištěn a protože se nedá regenerovat, musí se často nahrazovat novým materiálem, který zvyšuje cenu výroby.

Kolony pro afinitní chromatografii tedy nejsou nijak zvlášt vhodné pro počáteční stupně čištění ve velkém měřítku, jestliže je přítomno mnoho nečistot.

Při čištění proteinů ve velkém měřítku je výhodné, aby v počátečních stupních byl používán takový materiál kolony, který má nízkou cenu a. dobrou chemickou a fyzikální stabilitu. Tento materiál by měl být také schopen odolávat vysokým průtokům, například 10 až 20 objemům kolony za hodinu. Tato kriteria typicky splňují kolony s iontoměničem.

Tradiční způsob eluce proteinů z iontoměničové kolony je změnou pH nebo iontové síly nebo obou. Žádaný produkt a nečistoty se pak objeví v různých eluátech podle, mimo jiné, jejich isoelektrického bodu (pl). Jestliže žádaný protein a nečistoty, které se musí oddělit, mají pl ve stejném rozmezí, tato eluce může být nespecifická, protože proteiny s podobnými hodnotami pl budou do jistého stupně eluovány z kolony společně. Mohou být tedy nutné další stupně čištění s další spotřebou času a zvýšením ceny a také s rizikem zvýšené degradace a ztráty žádaného proteinu.

V evropském patentu 0 256 836 B je popsán způsob čištění t-PA, při kterém se směs částic t-PA s různými molekulovými hmotnostmi oddělují po tom, co se směs uvede do kontaktu s hydroxyapatitem a různé frakce se postupně eluují při různých pH, koncentracích soli nebo obojím. Tento způsob má tedy shora uvedené nedostatky. Totéž platí u způsobu popsaného v evropské patentové přihlášce 0 261 941 A, podle níž se t-PA vyčiští na koloně s katexem elucí solným gradientem. Japonská patentová přihláška č. 63-091080 popisuje způsob čištění t-PA adsorbováním t-PA na adsorpčním nosiči, jako je sklo o regulované velikosti pórů (CPG), silikagel nebo k.řemelina, eluce se provádí roztokem obsahujícím ω-aminokyselinu. Adšorpční matrice se podstatně liší od materiálu iontoměniče. Při adšorpční chromatgorafii jsou zpožďovacími silami na matricích převážně povrchová energie a Van der Waalsovy síly a dělení závisí na polárních a sterických faktorech. Při iontoměničové chromatografii jsou zpožáovacími silami převážně síly elektrostatické a dělení závisí ma iontové povaze složek.

Problém, se kterým se setkáváme u známých způsobů, může být vyřešen, jestliže protein, o který se zajímáme, lze eluovat z iontoměničové kolony elučním činidlem, které je schopno selektivně eluovat žádaný protein z iontoměničové kolony bez měnění pH a iontové síly v kterémkoliv podstatném stupni během eluce. Jestliže je to možné, eluuje se pouze protein, o který máme zájem, zamtímco nečistoty zůstanou na koloně.

Tento vynález je založen na skutečnosti, že překvapivě bylo ukázáno, že jistý typ aminokyselin, tak zvané ω-aminokyseliny mají žádoucí vlastnosti. Zvláště bylo ukázáno, že lys-plasminogen, derivát plasminogenu, se může selektivně eluovat z kolony s S-sepharosou e-aminokapronovou kyselinou (6-AHA) ve vysokých výtěžcích.

Podstata vynálezu

Ve svém nejširším aspektu se tento vynález týká způsobu čištění proteinů obsahujících kringl, které jsou schopny vázat se na ω-aminokyseliny ..z roztoku proteinů, které obsahují protein obsahující kringl. Tento způsob se vyznačuje tím, že zahrnuje následující stupně:

a) roztok proteinů se nanese na iontoměničovou kolonu za takových podmínek, aby se protein obsahující kringl navázal na materiál kolony,

b) protein obsahují kringl se selektivně eluuje působením ω-aminokyseliny bez toho, aby se podstatným způsobem změnilo pH nebo iontová síla a

c) protein obsahující kringl se isoluje z eluátu ze stupně b) dalšími vhodnými čistícími stupni.

V užším aspektu se tento vynález týká způsobu čištění plasminogenu nebo derivátu plasminogenu, jako je lys-plasminogen.

Tento vynález bude v další části spisu popsán pomocí následujících obrázků.

Obrázek 1 ukazuje eluční profil lys-plasminogenu z S-sepharosy elucí 0,514 NaCl.

Obrázek 2 ukazuje eluční profil lys-plasminogenu z S-sepharosy elucí 3ml4 6-AHA.

Obrázek 3 ukazuje ne-redukující SDS-PAGE eluovaných frakcí při elucí lys-plasminogenu působením 0,514 NaCl a 3mM 6-AHA.

Obrázek 4 ukazuje eluční profil z afinitní kolony (lysin-sepharosa) dialysovaného eluátu pži eluci lys-plasminogenu elucí 0,514 NaCl.

Obrázek 5 ukazuje eluční profil z afinitní kolony (lysin-sepharosa) dialysovaného eluátu při eluci lys-plasminogenu elucí 3mM 6-AHA.

Obrázek 6 ukazuje ne-redukující SDS-PAGE různých eluovaných frakci z eluce na kolonách s lysin-sepharosou uvedených na obrázku 4 a 5.

Obrázek 7 ukazuje výsledek analýzy plasminu lys-plasminogenu dále čištěného na koloně s lysin-sepharosou.

Před uvedením vynálezu by mohlo být pro porozumění užitečné uvést definice některých níže zde používaných pojmů.

Pojem plasminogen obvykle známená lidský glu-plasmino* gen.

Pojem deriváty plasminogenu zahrnuje různě degradované nebo mutované formy plasminogenu včetně lys-plasminogenu, které si zachovávají alespoň jednu z pěti kringlových domén, s výhodou více než tři a nejvýhodněji všech pět kringlových domén. Mutace zahrnuje náhradu jednoho nebo více zbytků aminokyselin z přírodní molekule nebo deleci či přidání aminokyselinového zbytku za účelem modifikace vlastností molekuly žádoucím způsobem.

Pojem ω-aminokyseliny znamená aminokyseliny s volnou aminokyselinou navázanou na nejvzdálenější atom uhlíku vzhledem ke karboxylové skupině.

Pojem proteiny, které obsahují kringl, znamená takové proteiny, které obsahují jednu nebo více tak zvaných kringlových struktur známých například u t-PA a plasminogenu.

Pojem selektivní eluce znamená eluci žádaného proteinu s nedetegovatelnými množstvími nežádoucích proteinů.

Pojem roztok proteinů znamená biologický roztok nebo vodný roztok, který obsahuje četné proteiny včetně žádaného proteinu.

Pojem biologické roztoky znamená plasmu, sérum nebo jejich frakce nebo roztoky získané extrakcí orgaánů lidského nebo zvířecích původu.

Pojem v podstatě konstantní pH bude znamenat proměny v rozmezí ± 1 jednotky pH, s výhodou ± 0,5 jednotky pH ve srovnání s pH v pufru před přidáním u-amino]<yseliny.

Pojem v podstatě konstantní iontová síla bude znamenat, že iontová síla se může měnit v rozmezí ± 20 %, s výhodou ± 10 % iontové síly v pufru před přidáním ω-aminokyseliny.

I když způsob čištění zde uvedený se může používat pro čištění proteinů obsahujících kringl z biologických roztoků, jako je plasma a sérum, může se s výhodou používat pro čištění těchto proteinů z kultivačního media nebo roztoku získaného rozbitím buněk, které intracelulárně produkují protein. Buňkami, které produkují protein obsahující kringl, mohou být přírodní buňky nebo transformované nebo transfektované buněčné linie, které jsou schopny exprimovat vloženou DNA sekvenci kódující protein obsahující kringl.

Iontoměničová kolona je dobře známa odborníkům. Mezi vhodné iontoměničové kolony patří S-sepharosa (S-Sepharose'^R)) a Fractogel S0₃.

ω-Aminokyselinami jsou s výhodou aminokyseliny s alespoň 4 atomy uhlíku v uhlíkatém řetězci mezi karboxylovou skupinou a ω-aminoskupinou. Uhlíkatý řetězec může být lineární nebo cyklický. Příklady vhodných lineárních ω-aminokyselin jsou 4-aminomáselná kyselina, 5-aminopentanová kyselina, 6-aminohexanová kyselina (e-aminokapronová kyselina (6-AHA)), 7-aminoheptanová kyselina, 8-aminooktanová kyselina, lysin a arginin. Mezi příklady cyklických ω-aminokyselin patří trans 4-aminomethylcyklohexankarboxylová kyselina (tranexamová kyselina) a para-aminomethylbenzoová kyselina.

Způsob podle tohoto vynálezu může být v principu použit pro čištění jakéhokoliv proteinu obsahujícího kringl, který se váže na ω-aminokyselinu a který je schopen být eluován z iontoměničové kolony bez jakékoliv podstatné změny pH a/nebo iontové síly během eluce. Velkým přínosem je to, že nečistoty ve formě jiných proteinů vázaných na kolonu spolu se žádaným proteinem zůstanou na koloně, protože pH nebo iontová síla se podstatným způsobem nemění. Selektivní eluční efekt ω-aminokyselin může vést k tomu, že jejich navázání na protein obsaující kringl, je tak silné, že může změnit pl proteinu nebo může způsobit některé konformační zrněný molekuly, což způsobí uvolnění z materiálu kolony.

Důležitou skupinou proteinů, které lze čistit způsoby podle tohoto vynálezu, jsou proteiny obsahující tak zvaný kringl [viz například L. Patthy, Blood Coagulation and Fibrinolysis 1, 153 (1990).). Tyto proteiny mohou obsahovat jednu nebo více kringlových struktur, z nichž mnohé se vážou na lysin nebo analogy lysinu, jako je trans-4-aminomethylcyklohexankarboxylová kyselina a e-aminokapronová kyselina. Mezi příklady proteinů obsahujících takové kringlové struktury patří t-PA a analogy t-PA s různými modifikacemi růstového faktoru a kringlových domén a okolní aktivační místa, jak je to popsáno v publikovaných evropských patentových přihláškách 191 843, 201 153, 207 589, 241 209, 233 013, 240 334, 293 936, 293 934 a 292 009. Dalšími příklady jsou plasminogen, lys-plasminogen, apo-lipoprotein a, hepatocytový růstový faktor, FXII, protrombin, uPA a nové objevený protein s předpokládanými vlastnostmi potlačovatele nádorů [Degen S.J.F.: abstrakt konference 20th Lindestróm Lang Conference, Vingstedt, Dánsko, 164 (1991).].

I když je tento způsob primárně zamýšlen pro použití v počátečních stupních čištění, kde je počet nečistot velký, může se používat také v pozdějších nebo v konečných čistících stupních, kde již některé nebo většina nečistot je odstraněna předcházejícím čistěním chromatografií na koloně s ionexem nebo afinitním nosičem nebo jinými vhodnými způsoby.

Eluát z kolony s iontoměničem se s výhodou dále čistí dalšími vhodnými čistícími stupni, jako je dialýza, gelová filtrace a afinitní chromatografie.

Tento vynález bude objasněn dále podrobněji s ohledem na čištění plasminogenu.

Lidský plasminogen je jednovláknový glykoprotein s molekulovou hmotností asi 90 000. Obíhá v plasmě v asi 2μΜ koncentraci. z lidské plasmy může být vyčištěn afinitní chromatografií na lysinu navázaném ná sepharosu (Sepharose'*'). Přírodní forma plasminogenu má na aminovém konci kyselinu glutamovou a nazývá se glu-plasminogen. Molekula plasminogenu sestává ze 791 aminokyseliny s 24 disulfidovými můstky, 5 trojsmyčkovými krin8 glovými oblastmi a doménou serinové proteinasy.

Jako důsledek proteolytického štěpení přírodní molekuly bylo získáno několik nízkomolekulárních forem lidského plasminogenu. Nomenklatura, která se pro tyto molekuly používá, je založena ma poloze aminokyseliny počítáno od aminového konce v sekvenci. Vystavení glu-plasminogenu účinku plasminu po velice krátkou dobu vede k odštěpení 77 zbytků na aminovém konci glu-plasminogenu za vzniku molekuly plasminogenu, lys-plasminogenu s molekulovou hmotností přibližně 83 000, který má obrovský význam pro některé vlastnosti fibrinolytického systému.

Konverse plasminogenu na aktivní proteinasu, plasmin, je katalyzována tak zvanými aktivátory plasminogenu, plasminogenovými aktivátory (PAs). Plasmin je považován za primární fibrinolytický enzym v oběhu vyšších obratlovců, ale může hrát také důležitou roli při jiných miroovaskulárních proteolytických událostech.

Plasminogen a lys-plasminogen se mohou používat jako trombolytické činidlo [viz K. Anderle a spol.: Haemostatis 18., 165 (1988). ] .

Lidský plasminogen se může z plasmy vyčistit několika způsoby. Všechny dosud známé způsoby čištění z lidské plasmy jsou založeny na afinitní chromatografii, jak to popisují D.G. Deutsch a E.T.Mertz: Fed. Proč. 29, 647 (1979) a Science 170, 1095 (1970). Afinitní matrice (lysin-Sepharose‘^R)) se připraví kovalentním navázáním α-aminoskupiny L-lysinu na sepharosu. Kolonou s lysin-sepharosou ekvilibrovanou fosforečnanovým pufrem (pH 7,4) se pak nechá za teploty místnosti procházet plasma zředěná vodou, při čemž kolona se promývá fosforečnanovým pufrem. Plasminogen se pak eluuje 0,2M e-aminokapronovou kyselinou (pH 7,4). e-Aminokapronová kyselina se odstraní od plasminogenu za studená gelovou filtrací na sephadexu ekvilibrovaném fosforečnanovým pufrem.

Aplikace lidských proteinů vyčištěných z plasmy vždy v sobě zahrnuje jisté riziko virové infekce. V případě lidských proteinů odvozených od plasmy se to týká zvláště rizika infekcí HIV a hepatitidou.

Aby bylo možné se tomuto riziku vyhnout, bylo by výhodné produkovat plasminogen technologií rekombinace DNA. Pokusy vyrábět plasminogen v transfektovaných buňkách však ukázaly, že aktivace intracelulárniho plasminogenu a následná degradace jsou překážkou pro výrobu neporušeného rekombinantního plasminogenu v přijatelných výtěžcích. Tento problém byl vyřešen koexpresí plasminogenu spolu s inhibitorem proteinasy, který je schopen inhibovat aktivaci plasminogenu, viz evropská publikovaná patentová přihláška č. 319 944.

Lys-plasmiongen nebo glu-plasminogen se mohou tedy vyrábět koexpresí lys- nebo glu-plasminogenu a α-2-plasminového inhibitoru, a₂-PI, v buňkách BHK. Glu-plasminogen nebo lys-plasminogen se mohou koexprimovat také s α-1-antitrypsinem (AAT) v transfektovaných BHK buňkách nebo jejich derivátech. Koexprese s AAT zajistuje, že urokinasa produkovaná BHK buňkami je inhibována AAT. Aktivace plasminogenu urokinasou a plasminem zprostředkované proteolytické štěpení se tak sníží a dosáhne se vysokých hladin neporušeného plasminogenu. Plasminogen se z kultivačního media vyčistí dvoustupňovým postupem zahrnujícím stupeň chromatograf ie na ionexu následovaný stupněm af initní chromatografie na lysin-sepharose. Podrobněji řečeno, kolona s ionexem (S-sepharosa) se promyje a potom se eluuje 0,5M NaCl. Eluát se nechá projít afinitní chromatografickou kolonou (lysin-sepharosa) a plasminogen se isoluje eluci 6-AHA.

Jak bylo shora uvedeno, transfektované BHK buňky budou expresí vedle plasminogenu poskytovat urokinasu. pí plasminogenu a urokinasy je 6,7 až 8,1 a 8,5. Z toho plyne, že jak plasminogen tak urokinasa jsou navázány na kolonu s ionexem, zatímco ko-expresí produkovaný inhibitor plasminogenového aktivátoru se objevuje v prázdném objemu.

I když se tímto způsobem získají vysoké výtěžky plasminogenu, bylo zjištěno, že během stupně afinitní chromatografie může v jistém rozsahu dojít k aktivaci plasminogenu. To je pravděpodobně způsobeno skutečností, že inhibitor plasminogenového aktivátoru se odstraní v předcházejícím stupni čištění na koloně ionexu. Jestliže se plasminogen a aktivátor plasminogenu eluují společně'z kolony s ionexem (S-sepharosou), dokonce malá množství aktivátoru plasminogenu (urokinasy) v eluátu mohou způsobit aktivaci plasminogenu na plasmin. Výsledkem pak je to, že plasminogenový produkt obsahuje malé množství plasminu.

Použití 6-AHA v prvním stupni čištění s ionexem překvapivě vedlo k tomu, že se selektivně eluuje lys-plasminogen bez současné eluce urokinasy. Tím se lze vyhnout nezamýšlené aktivaci plasminogenu na plasmin v eluátu urokinasou. Získá se tak čistší produkt ve srovnání s elucí způsobem solného gradientu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čištění lys-plasminogenu

Lys-plasminogen se vyrábí postupem, který je analogický k postupu popsanému v evropské patentové přihlášce č. 319 944.

Urokinasa (uk) vylučovaná buňkami BHK se inhibuje α-1-antitrypsinem, který se získává koexpresí spolu s plasminogenem. Přítomnost aktivátoru by mohla být demonstrována exponenciálním vývojem produktu při chromatogenní analýze plasminu. Přítomnost uk v kultivačním mediu byla prokázána technikou přelitím fibrinu [Granelli-Piperno a Reich: J. Exp. Med. 148. 233 (1978). ] .

Vzorek kultivačního media se rozdělí na dvě stejné frakce. Provede se srovnání eluce z kolony s iontoměničem, S-sepharosou, v prvním stupni buá pufrem 6-AHA nebo 0,5M NaCl. Každý e11 luát se dále dialyzuje a vyčistí na lysin-sepharose.

Pokus 1

S-sepharosa, eluce NaCl (test č. 910723)

Ekvilibrační pufr: 0,02M NaH₂P0₄, 0,04M NaCl, 0,02 % Tweenu 30, 3 mg/1 aprotininu, pH 5,0, promývací pufr 1: ekvilibrační pufr, promývací pufr 2: ekvilibrační pufr s 0,15M NaCl, pH 5,5, eluční pufr 3: ekvilibrační pufr s 0,50M NaCl a bez aprotininu, pH 5,5.

Ke každé frakci se přidá aprotinin po tom, co byl ve vzorku stanoven plasmin. Na kolonu (5 ml) se přivede 750 ml kultivačního media s průtokem 125 ml/h. Eluční profil je uveden na obrázku 1. Eluční profil je poněkud strmý. Lys-plasminogen se nachází v druhém maximu.

Na obrázku 1 čísla pod základní čarou (1, 2 a 3) ukazují, kdy se přidávají různé pufry (1. ekvilibrační pufr, 2. promývací pufr (0,15M NaCl, pH 5,5) a 3. eluční pufr (0,5M NaCl, pH 5,5). Čísla nad základní čarou (22,...30) jsou čísla frakci použitých v SDS PAGE (obrázek 3).

Pokus 2

S-sepharosa, eluce 6-AHA (test č. 910724)

Provede se stejný pokus jako shora uvedeno až na to, že se kolona eluuje ve dvou stupních: První eluce se provádí elučním pufrem, který obsahuje 0,02M NaH₂PO₄, 0,18M NaCl, 0,02 % Tweenu 80 a 3mM 6-AHA, pH .5,0. Druhá eluce se provede jako v pokusu 1.

Eluční profil je uveden na obrázku 2. Lys-plasminogen se nachází v druhém maximu. Třetí maximum představuje různé nečiš12 toty.

Na obrázku 2 čísla pod základní čarou (1, 2, 3 a 4) ukazují, kdy se přidávají různé pufry (1. ekvilibrační pufr, 2. promývqací pufr (0,5M NaCl, pH 5,5), 3. eluční pufr I (0,18M NaCl, 3mM 6-AHA, pH 5,5) a 4. eluční pufr II (0,5M NaCl,pH 5,5). Čísla nad základní čarou (16 až 42) jsou čísla frakcí použitých v SDS PAGE (obrázek 3).

Obrázek 3 ukazuje neredukovanou SDS-PAGE frakcí z eluce z obou pokusů. Spolu s aprotininem se eluuje velmi mnoho vysokomolekulárních komplexů.

Čísla pásů znamenají následující:

1. standard molekulové hmotnosti

2. plasmový lys-plasminogen (kontrola)

3. kultivační medium použité v testu 910723

4.	frakce	č.	23	na	obr.	1
5.	frakce	č.	24	na	obr.	1
6.	frakce	č.	25	na	obr.	1
7.	frakce	č.	26	na	obr.	1
(pokus 1)

8. kultivační medium použité v testu 910724

9.	frakce č.	16 na obr. 2
10.	frakce č.	22 na obr. 2
11.	frakce č.	23 na obr. 2
12.	frakce č.	26 na obr. 2
13 .	frakce č.	30 na obr. 2
14.	frakce č.	42 na obr. 2
15.	standard	molekulové hmotnosti

(pokus 2)

Je vidět, že eluce 3mM 6-AHA (pásy 10 až 13) vedou k čistému produktu (lys-plasminogen), který neobsahuje komplexy s vysokými molekulovými hmotnostmi, zatímco eluce NaCl (pásy 4 až 7) vedou k produktu znečištěnému některými nečistotami s vysokými molekulovými hmotnostmi.

Pro zjištění toho, jestli isolovaný lys-plasminogen obsahuje menší množství plasminu (díky aktivaci urokinasou v eluátu z kolony s ionexem), bylo provedeno další čištění lysin-sepharosou. Tímto čištěním se mimo jiné odstraní aprotinin.

Oba eluáty se dialyzují proti níže uvedenému ekvilibračnímu pufru a vyčistí se afinitní chromatografií na lysin-sepharose:

velikost kolony: 5 ml, průtok: 50 ml/h, ekvilibrační pufr: O,1M Na₂HP0_4/ 0,02 % Tweenu 80, 3 mg/1 apr., pH 7,4, promývaci pufr 1: ekvilibrační pufr, promývací pufr 2: ekvilibrační pufr s 0,15M NaCl, ale bez aprotininu.

Eluce se provádí gradientem 0,lM Na₂HP0₄ obsahujícím 0,02 % Tweenu 80 a od 0 do 5 mM 6-AHA, 50 ml každého. Obrázek 4 ukazuje eluční profil dialyzovaného eluátu z pokusu 12 (NaCl).

Čísla pod základní čarou (1, 2, 3 a 4) se týkají následujících stupňů:

1. aplikace vzorku

2. promývací pufr 1,

3. promývací pufr 2 a

4. počátek elučního gradientu.

Čísla nad horní čarou (8, 10, 12) označují čísla frakcí použitých v SDS-PAGE (obrázek 6).

Obrázek 5 ukazuje eluční profil dialyzovaného eluátu z pokusu 2 (6-AHA).

Čísla pod základní čarou (1, 2, 3 a 4) se týkají následujících stupňů:

1. aplikace vzorku

2. promývací pufr 1,

3. promývací pufr 2 a

4. počátek elučního gradientu.

V některých případech je na obrázku vidět sedlo. Z literatury je známo, že dvě glykosylační formy plasminogenu mají různou afinitu k lysin-sepharose.

Obrázek 6, který je SDS-PAGE elučních frakcí z kolony s lysin-sepharosou, ukazuje, že lys-plasminogen je dost čistý produkt, jestliže se vezme v úvahu to, že prošel pouze dvěma stupni čištění.

Čísla pásů znamenají následující:

1. standard molekulové hmotnosti

2. plasmový lys-plasminogen

3. vzorek aplikovaný na obr. 4 (z testu č. 910723 bez 6-AHA, obr. 1),

4. = 3,

5. frakce č. 7 na obr. 4

6. frakce č. 9 na obr. 4

7. frakce č. 11 na obr. 4

8. vzorek aplikovaný na obr. 5 (z testu č. 910724 s 6-AHA, obr. 2)

9. = 8

10. frakce č. 7 na obr. 5

11. frakce č. 8 na obr. 5

12. frakce č. 9 na obr. 5

13. frakce č. 10 na obr. 5

14. standard molekulové hmotnsoti

Obrázek 7 ukazuje výsledky analýzy plasminu vyčištěného lys-plasminogenu, který byl vyčištěn podle vynálezu (A), tj. elucí 6-AHA ve stupni čištění na S-sepharose a elucí NaCl (B). Analýzy byly prováděny pomocí chromogenního subsrrátu S2251. Test standardním postupem, kde p-NA neobsahuje S 2251^ÍR' (H-D-Val-Leu-Lys-pNA), enzymatickým působením plasminu, při čemž se vyvíjí žlutá barva měřená při 405 nm. Před testem se všechny vzorky zředí tak, aby měly stejnou koncentraci proteinu. Je zřetelně vidět, že plasmin není detegovatelný v produktu, který byl eluován z S-sepharosy 6-AHA (neobjevila se žádná barva). Jestliže se eluce provádí NaCl, produkt obsahuje plasmin, což ukazuje na to, že v eluátu došlo k jisté aktivaci lys-plasmino-

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ' !

   i ^L^' I

   1. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl, který “je schopen vázat se na ω-aminokyseliny z roztoku proteinů, který obsahuje takový protein obsahující kringl, vyznačující se tím, že obsahuje následující stupně:

   a) roztok proteinů obsahující kringl se nanese na ionexovou kolonu za takových podmínek, aby se protein obsahující kringl navázal na materiál kolony,

   b) protein obsahují kringl se eluuje působením ω-aminokyseliny bez toho, aby se podstatným způsobem změnilo pH a iontová síla a

   c) protein obsahující kringl se isoluje z eluátu ze stupně b) dalšími vhodnými čistícími stupni.
2. 2. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle nároku 1, vyznačující se tím, že ω-aminokyselina je vybrána ze skupiny sestávající ze 4-aminomáselné kyseliny, 5-aminopentanové kyseliny, 6-aminohexanové kyseliny, 7-aminopentanové kyseliny, 8-aminooktanové kyseliny, lysinu, argininu a terc.aminomethylcyklohexan-l-karboxylové kyseliny.
3. 3. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že proteinem obsahujícím kringl je t-PA nebo analog t-PA.
4. 4. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že proteinem je plasminogen nebo derivát plasminogenu.
5. 5. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle nároku 4, vyznačující se t í m, že derivátem plasminogenu je lys-plasminogen.
6. 6. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle kterého17 koliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se jako ω-aminokyselina používá 6-aminohexanová kyselina (6-AHA).
7. 7. Způsob čištění proteinu obsahujícího kringl podle kteréhokoliv z nároků laž6, vyznačující se tím, že se eluát ze stupně ad b) podrobí afinitní chromatografii. ·'