ES2327208T3 - Separacion de fibrinogeno de proteasas de plasma. - Google Patents

Separacion de fibrinogeno de proteasas de plasma. Download PDF

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Abstract

Un método para purificar fibrinógeno a partir de una solución que contiene fibrinógeno, el método comprende: (a) aplicar la solución a una matriz de intercambio de ión, bajo condiciones tales que el fibrinógeno se une a la matriz; (b) lavar la matriz de intercambio de ión con una solución de amortiguador que comprende por lo menos un aminoácido Omega; (c) eluir el fibrinógeno de la matriz; y (d) recuperar opcionalmente el fibrinógeno de eluato.

Description

Separación de fibrinógeno de proteasas de plasma.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con métodos para purificar fibrinógeno a partir de una solución que contiene fibrinógeno utilizando cromatografía de intercambio de iones.
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Antecedentes de la invención
El aislamiento del fibrinógeno humano se ha llevado a cabo tradicionalmente mediante métodos de fraccionamiento de plasma clásicos. El fibrinógeno se precipita del plasma ya sea con etanol (Blomback and Blomback, 1956), sulfato de amonio (Takeda, 1996), \beta alanina/glicina (Jakobsen and Kieruif, 1976), polímeros (polietilenglicol) y soluciones de baja resistencia iónica (Holm, 1985) con relativa homogeneidad y alto rendimiento.
La purificación adicional de precipitados de fibrinógeno se puede lograr mediante condiciones de cromatografía de intercambio de iones (Stathakis et al, 1978) y cromatografía de afinidad (Kuyas et al, 1990). Los contaminantes específicos se pueden absorber por ejemplo fibronectina o gelatina inmovilizada y plasminógeno una lisina inmovilizada (Vuento et al, 1979).
Los métodos de precipitación se utilizan ampliamente para la fabricación de fibrinógeno comercial. Se han estado explorando métodos cromatográficos ahora como una alternativa o para mejorar la pureza de los concentrados de fibrinógeno.
La WO 99/37680 describe un método para la separación de fibrinógeno a gran escala de otras proteínas sanguíneas en el plasma sanguíneo humano. El proceso involucra el uso de una pasta precipitada de heparina como un material de partida para la purificación de fibrinógeno. La pasta precipitada de heparina es un sub-producto del proceso de fabricación del factor VIII (Antihaemophilic Factor, AHF).
Se han publicado ampliamente en la literatura intentos para producir fibrinógeno libre de plasminógeno o para purificar el plasminógeno en sí mismo. El método más común es utilizar la capacidad de la lisina para unirse a uno de dos "kringles" en la molécula plasminógeno. El uso de la etapa de cromatografía de afinidad se describe primero en un documento publicado por Deutsch y Mertz en 1970. Baxter International Inc. utiliza esa tecnología, que incorpora el uso de material de lisina-sefarosa en una etapa dedicada para remover plasminógeno de su fibrinógeno como se describe en la patente WO 95/25 748 Para la fabricación a gran escala de un concentrado de fibrinógeno libres de niveles desestabilizantes de producto de plasminógeno. Otras técnicas publicadas en la literatura científica utilizan de Nuevo la unión de lisina o ácido \varepsilon-amino caproico. Sin embargo, ellos se emplean para alterar la solubilidad de la molécula de plasminógeno. Luego de la adición de lisina a una solución de fibrinógeno, la posterior solución se precipita luego en la presencia de 7% etanol. La remoción de plasminógeno se establece en más del 90% con una repetición de la etapa que conduce a una remoción total del contaminante (Mosesson, 1962). Los métodos de precipitación se utilizan ampliamente para la fabricación de fibrinógeno comercial, sin embargo, el trabajo publicado por Mosesson (1962) se basa en una solución diluida de fibrinógeno que no es un proceso práctico para la implementación en una producción a escala.
El uso de la cromatografía de intercambio de iones y el ácido \varepsilon-amino caproico para unir y eluir plasminógeno independiente de pH o resistencia iónica se describe en una patente (WO 94/00483) publicado en 1994 por Novo Nordisk A/S describe la purificación de proteínas que contienen kringle. Este método selecciona la S-sefarosa como la resina de elección. También, se ha utilizado una combinación de gel de filtración y cromatografía de intercambio de iones para purificar plasminógeno. (Robbins et al, 1965).
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Resumen de la invención
En un primer aspecto de la presente invención hay un método para purificar fibrinógeno a partir de una solución que contiene fibrinógeno, el método comprende:
(a) aplicar la solución a una matriz de intercambio de iones, bajo condiciones tales como que el fibrinógeno se une a la matriz.
(b) lavar la matriz de intercambio de ión con una solución que comprende por lo menos un aminoácido \omega-amino;
(c) eluir el fibrinógeno de la matriz; y
(d) recuperar opcionalmente el fibrinógeno del eluato.
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En una modalidad preferida de la invención, el método comprende adicionalmente agregar por lo menos un aminoácido \omega la solución antes de aplicar la matriz de intercambio de iones.
La solución que contiene fibrinógeno puede contener cualquier material derivado de plasma que incluye fibrinógeno. Ejemplos de tales soluciones incluyen, pero no se limitan a, plasma (que incluyen plasma anti-coagulado), o fracciones de plasma. En una modalidad preferida, el material es una pasta precipitada de heparina, que es un subproducto en el proceso de fabricación del Factor VIII. La pasta precipitada de heparina se puede solubilizar con una solución de sal para proporcionar una preparación de fibrinógeno de alta actividad específica. Un proceso para precipitar fibrinógeno de un extracto crioprecipitado utilizando heparina como se describe en Winkelman et al. 1989, de los cuales se incorporan aquí los contenidos completos como referencia. Alternativamente, el fibrinógeno contiene material que se extrae del precipitado de Fracción 1.
Cuando se utiliza aquí, la frase "precipitado de Fracción I" se refiere a plasma congelado que se ha descongelado y el crioprecipitado removido por centrifugación. El criosupernadante resultante se mezcla luego con etanol para precipitar la Fracción I.
En una modalidad preferida adicional de la invención, el aminoácido \omega está presente en el amortiguador de extracción en una concentración de entre 5-500 mM, más preferiblemente entre 50-500 mM, y más preferiblemente alrededor 100 mM.
En una modalidad preferida adicional de la invención, la solución que contiene fibrinógeno (que comprende preferiblemente el aminoácido \omega) se diluye de tal manera que la conductividad está por debajo de 10.5 mS/cm antes que se aplique a la matriz de intercambio de iones.
En una modalidad preferida adicional de la invención, el amortiguador utilizado para lavar a matriz de intercambio de ión comprende (i) tris en una concentración de aproximadamente 50 mM, (ii) un amino ácido \omega en una concentración de aproximadamente 20 mM, y NaCl en una concentración de aproximadamente 90 mM. Preferiblemente, el amortiguador tiene un pH de aproximadamente 8.0. Preferiblemente, el amortiguador tiene una conductividad de aproximadamente 11.1 mS/cm.
En una modalidad preferida adicional de la invención, el fibrinógeno se eluye de la matriz en un amortiguador que comprende aproximadamente 10 mM Tris, 10 mM de citrato, 45 mM de sucrosa; y NaCl en una concentración de entre 200 mM a 1.0M, más preferiblemente aproximadamente 400-500 mM. Preferiblemente, el amortiguador tiene un pH de aproximadamente 7.0.
En una modalidad preferida adicional de la invención, el aminoácido \omega contiene por lo menos 4 de carbono en la cadena carbono entre el ácido carboxílico y el grupo amino \omega. La cadena de carbono puede ser lineal o cíclica. Ejemplos de aminoácidos \omega lineales adecuados son ácido 4-aminobutorico, ácido 5-aminopentoico, ácido 6-aminohexanoico (ácido \varepsilon-amino caproico (EACA)), ácido 7-aminoheptanoico, ácido 8-aminooctanoico, y arginina. Ejemplos de aminoácidos cíclicos \omega son ácidos trans-4-aminometol ciclohexano carboxílico (ácido tranexamico) y ácidos para-aminometil benzoico. En una modalidad particularmente preferida, el aminoácido \omega es EACA.
Las matrices de intercambio de ión se conocen en la técnica y se puede utilizar cualquier matriz adecuada en la presente invención. Una matriz preferida es la Resina MacroPrep HQ (BioRad, catálogo no. 156-0041). En una modalidad preferida adicional, la matriz de intercambio de ión se carga en una columna.
Se apreciara por aquellos expertos en la técnica que el método de la presente invención tiene el potencial de proporcionar una alternativa a la cromatografía de afinidad para la producción a gran escala de fibrinógeno libre de niveles desestabilizantes de plasminógeno y otras proteasas. El método solo requiere una única etapa de procesamiento que utiliza cromatografía de intercambio de iones para el aislamiento del fibrinógeno libre de niveles desestabilizantes de plasminógeno y otras proteasas de fluidos biológicos con una alta tasa de recuperación (aproximadamente 75%). El uso de este método novedoso para la purificación de fibrinógeno de proteínas sanguíneas tiene el potencial de permitir un método de fabricación más simple que conduce a un producto que es superior en pureza y
estabilidad.
La tecnología de la actual invención ofrece muchas ventajas con respecto a la fabricación del fibrinógeno y el uso del fibrinógeno en un producto sellante de fibrina.
Los costos de producción de una resina de intercambio y de iones son bastante más económicos que el costo de lisina-sefarosa o lisina inmovilizada que se utilizan en los procedimientos de cromatografía de afinidad.
A lo largo de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tal como "comprenden" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento establecido, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o
etapas.
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Abreviaturas utilizadas aquí:
TP
Proteína Total
CP
proteína Coagulable
FXIII
Factor XIII
FII
Factor II
Plasm.
Plasminógeno
FN
Fibronectina
ATIII
Antitrombina III
F1P
Fracción 1 pasta
SFP
Pasta fracción 1 Solubilizada
ASFP
Pasta fracción 1 solubilizada absorbida por Alhidrogel
GASFP
Pasta fracción 1 solubilizada precipitada Gly/NaCl Resolubilizada
SDS-PAGE
Electroforesis de gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de Sodio
Gly/NaCl
Glicina/Salina
SD
Disolvente/detergente
\varepsilonACA
Ácido épsilon aminocaproico
TNBP
Tri -N-butil fosfato
Al(OH)3
Hidróxido Aluminio
RT
Temperatura ambiente
PET
Tecnología de ingeniería de Plasma
IEX
Intercambio de Ión
SHP
Sobrenadante de pasta de heparina solubilizada
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Breve descripción de la figura
Figura 1: diagrama de flujo que describe un proceso de purificación de fibrinógeno preferido que incorpora el método de cromatografía de intercambio de iones de la presente invención.
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Ejemplo 1
Separación de fibrinógeno del plasminógeno utilizando cromatografía de intercambio de iones 1.1 Materiales y Métodos 1.1.1 Preparación de muestra
Se obtiene un precipitado Gly/NaCl del crioprecipitado utilizando una modificación de los métodos descritos en Winkleman et al., 1989. Inicialmente, el precipitado Gly/NaCl resolubilizado congelado (-80ºC) se descongela en un baño de agua caliente a 30ºC. A 40 g de precipitado Gly/NaCl resolubilizado se agrega a 2.19 g de solución de detergente en bruto y 132 mg de TNBP. La muestra se diluye luego utilizando un amortiguador de dilución de muestra (25 mM Tris, pH 8.0) hasta que la conductividad está por debajo de 10.5 mS/cm. Finalmente, la muestra se filtra a través de un filtro de membrana de 0.8 \mum. cada muestra se prepara inmediatamente antes de empezar cada serie. La falla para diluir la muestra resulta frecuentemente en un pico grande no unido es decir se eluye algún fibrinógeno en el no unido.
1.1.2 Purificación MacroPrep HQ
Se utilizan las siguientes condiciones cromatográficas para purificar la pasta gly/NaCl resolubilizada.
Altura de lecho - aproximadamente 20 cm
Volumen de columna - aproximadamente 100 ml
Velocidad de flujo - 10 ml/min (\sim 113 cm/hr)
Detención - UV @ 280 nm
Método cromatográfico
Equilibrio: \geq 1.5 CV de amortiguador MQ y cuando hay conductividad (post-columna) es 90-1109% del amortiguador preparado.
Muestra de carga
Lavado: 6 CV de amortiguador MQ.
Elusión: amortiguador ME - Amortiguador D & 200 mM NaCl, pH7.0
Regeneración: 2 CV de NaCl 1 M.
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1.2 Resultados 1.2.1 Purificación Utilizando Amortiguador de Lavado (MQ-25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0)
Se desarrollan series por duplicada utilizando 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 como el amortiguador de lavado (MQ). Las muestras se cargan en una columna MacroPrep y las fracciones recolectadas se analizan. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
La recuperación de fibrinógeno promedio es 82% y la de plasminógeno es 10%. Estas figures se utilizan como una marca para juzgar el éxito de cualquier modificación adicional al proceso.
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1.2.2 Adición de EACA a la Muestra de Carga
Con la producción a gran escala, no todas las muestras se pueden procesar en una única serie de intercambio de ión y por lo tanto algunas muestras diluidas se dejan a temperatura ambiente mientras las otras muestras se purifican. Se describió que las muestras se desintegran durante este periodo.
La adición de 100 mM de ácido \varepsilon-amino caproico, EACA (con respecto al volumen de pasta Gly/NaCl resolubilizada no diluida) a la muestra incrementa la estabilidad de la muestra de entre 0-15 hr a 15-23 hr. No hubo cambios significativos en el perfil cromatográfico y la recuperación del fibrinógeno es del 93%.
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1.2.3 Adición de EACA y Lisina al Amortiguador de lavado [MQ]
Se utilizan los siguientes motivadores de lavado en el protocolo de purificación: (i) 50 mM Tris, 20 mM Lisina, 100 mM NaCl, pH 8.0 y (ii) 50 mM Tris, 20 mM EACA, 100 mM NaCl, pH 8.0. Las muestras se purifican utilizando la columna MacroPrep y se compara las fracciones recolectadas. Los resultados se muestran en la Tabla 2
adelante.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 
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2
3
NB: En estos ensayos no se agrega EACA a la muestra.
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Con la adición de 20 mM EACA y 25 mM Tris al amortiguador MQ, la estabilidad de las fracciones recolectadas se incrementa entre 71-91 horas y la recuperación de proteínas coagulables es 71.3%. La mayor estabilidad puede ser atribuida posiblemente a la remoción del plasminógeno. La región no unida del cromatograma muestra una absorbancia UV pequeña.
La recuperación de proteína coagulable promedio se reduce al 51.3% cuando 20 mM de lisina y 25 mM Tris se agregan al amortiguador MQ. En el perfil cromatográfico, la absorbancia durante la etapa de lavado es mayor que la obtenida utilizando MQ. Por lo tanto se puede asumir que la adición de lisina y tris al MQ originan que el fibrinógeno eluya en el pico no unido. La estabilidad de las fracciones recolectadas está entre 48-71 horas.
Estos resultados muestran que la adición de EACA y un incremento de la concentración tris en MQ incrementan la recuperación de la proteína coagulable y la estabilidad del eluato de columna.
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1.2.4 Variación de la Composición de Amortiguador MQ
El objetivo de este experimento es investigar la efectividad de la adición de lisina y EACA al amortiguador MQ y examinar el efecto de la adición del EACA a la muestra. La Tabla 3 resume los resultados de Fracción 1.
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4
Estos resultados muestran que cuando no se agrega EACA a la muestra, y se utiliza MQ (25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0) como el amortiguador de lavado, la recuperación de proteína promedio de la fracción 1 para HPPC04 & HPPC06 es 77% & 78% respectivamente. La estabilidad es aproximadamente 24 horas para HPPC04 y <47 horas para HPPC06.
Cuando se agrega 25 mM Tris al amortiguador MQ, la recuperación de proteína es similar a aquella obtenida utilizando MQ pero la estabilidad de la fracción recolectada se incrementa a 66 horas.
Con la adición de lisina al amortiguador MQ (50 mM Tris, 20 mM Lisina 100 mM NaCl, pH 8.0), la recuperación de proteína promedio de la fracción 1 para HPPC06 es 48% y la estabilidad es < 47 horas. La recuperación de plasminógeno se reduce dramáticamente de 10.2% a menos de 0.5%.
Cuando se agrega EACA a la muestra antes de cárgala en la columna Macroprep, y el amortiguador de lavado es MQ con lisina, la recuperación de proteína y plasminógeno es aproximadamente la misma como aquella obtenida cuando no se agrega EACA a la muestra. La estabilidad del eluato, sin embargo, se incrementa de <47 horas a entre 68-93 horas para HPPC06 y 41 horas para HPPC04.
Cuando se agrega EACA a las muestras y el amortiguador de lavado es 50 mM Tris, 20 mM EACA 100 mM NaCl, pH 8.0, la recuperación de proteína es similar a aquellas obtenidas cuando se utiliza MQ es decir 68% para HPPC04 y 79% para HPPC06. La diferencia significativa es la estabilidad de las fracciones recolectadas. La estabilidad está en exceso de 113 horas según se compara con aproximadamente 24 horas cuando se utiliza amortiguador MQ.
Estos resultados muestran que el amortiguador de lavado que contiene 50 mM Tris, 20 mM EACA 100 mM NaCl, pH 8.0 da buenos resultados. En particular, la fracción recolectada tiene alta recuperación de proteína, baja recuperación de plasminógeno y larga estabilidad.
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1.2.5 Estabilidad de Fracciones MacroPrep, Individualmente y Agrupadas
Previamente, se recolectan cuatro fracciones del eluato MacroPrep. El siguiente experimento se diseña para determinar si las fracciones se pueden agrupar en orden para incrementar la recuperación. Las fracciones recolectadas se colocan en estabilidad individualmente y agrupadas en la proporción como si se recolectara una fracción.
El método de purificación involucra el uso de 50 mM Tris, 20 mM EACA 100 mM NaCl como el amortiguador de lavado y EACA se agrega a las muestras antes de cargarlas en la columna MacroPrep. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
En general, Tabla 4 muestra que la primera fracción es generalmente más estable que las últimas fracciones. Esto se debe más probablemente a que las últimas fracciones son considerablemente menos concentradas que la fracción 1 y no se debe a la composición de las fracciones. Esto se examina adicionalmente al agrupara las fracciones en la misma proporción ya que ellas se eluyen de la columna.
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(Tabla pasa a página siguiente)
5
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7
Cuando se agrupan cuatro fracciones la estabilidad es equivalente a aquella de la fracción 1. Al agrupara todas las cuatros fracciones, la recuperación de la proteína se incrementa en aproximadamente 25%.
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1.2.6 Modificación del Amortiguador de Elusión
Los resultados descritos en 1.2.5 muestran que las fracciones que eluyen de la columna MacroPrep se pueden agrupar. El perfil de fracción unida muestra un pico grande con cola y luego un segundo pico con la columna se lava con NaCl 1M. El segundo pico es la compresión de la cola debido a la mayor fuerza iónica del NaCl 1M. Se decide incrementar la resistencia iónica del amortiguador de elusión para eluir el fibrinógeno como un único pico. La concentración de NaCl en el amortiguador ME se incrementa por lo tanto de 300 mM a 500 mM, 750 mM y
1M.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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La adición de 200 mM extra de NaCl al amortiguador de elusión, ME, es suficiente para eluir el fibrinógeno en un único pico, con muy poca cola. No existe diferencia significativa en los resultados de caracterización de la fracción recolectad. Aunque, el amortiguador ME con 750 mM y NaCl 1 M también trabaja, se prefiere que el ME con 500 mM se utilice debido a los requerimientos de las siguiente etapas en el proceso de purificación.
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1.2.7 Efecto de EACA en la Muestra en Recuperación y Estabilidad del Eluato de Columna
El objetivo de este experimento es comparar las fracciones unidas eluidas de la columna MacroPrep de las muestras (precipitado Gly/NaCl resolubilizada) que contiene 100 o 200 mM EACA.
Los resultados muestran que la recuperación de proteína (93.7%, 95.4%), proteína coagulable (96.0%,99.2%), plasminógeno (ambos son <0.2 ug/ml) y los resultados de estabilidad (ambos son > 7 días) son equivalente para las fracciones recolectadas de ambas muestras. En otras palabras, se obtiene resultados similares para muestras Gly/NaCl resolubilizada que contienen 100 o 200 mM \varepsilon ACA.
Un proceso de purificación de fibrinógeno preferido que incorpora el método de cromatografía de intercambio de ion descrito anteriormente se muestra en la figura 1.
Se apreciara por las personas expertas en la técnica que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestran en las modalidades específicas sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se describió ampliamente. Las actuales modalidades son, por lo tanto, consideradas en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.
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Referencias
Blomback and Blomback (1956). Ark Kemi. 10:415-43.
Deutsch and Mertz. (1970). Science, 170:1095-6.
Holm et al (1985). Thrombosis Research, 37:165-176.
Jakobsen and Kieruif, (1973). Thrombosis Research, 3:145-159.
Kuyas, Haeberli, Walder and Straub, (1990). Thrombosis & Haemostasis, 64(3):439-444.
Mosesson. (1962). Biochim. Biophys. Acta, 57:204-213.
Robbins, Summaria, Elwyn and Barlow. (1965). J. Biol. Chem, 240:541.
Stathakis et al (1978). Thorombosis Research, 13:467-475.
Takeda, (1966). J. Clin. Investigation, 45:103-111.
Vuento et al (1979), Biochemistry J, 183:331-337.

Claims (17)

1. Un método para purificar fibrinógeno a partir de una solución que contiene fibrinógeno, el método comprende:
(a)
aplicar la solución a una matriz de intercambio de ión, bajo condiciones tales que el fibrinógeno se une a la matriz;
(b)
lavar la matriz de intercambio de ión con una solución de amortiguador que comprende por lo menos un aminoácido \omega;
(c)
eluir el fibrinógeno de la matriz; y
(d)
recuperar opcionalmente el fibrinógeno de eluato.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente agregar por lo menos un aminoácido \omega a la solución que contiene fibrinógeno antes de aplicarla a la columna de intercambio de ión.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la cual el aminoácido \omega contiene por lo menos 4 átomos de carbono en la cadena de carbono entre el ácido carboxílico y el grupo de aminoácido \omega.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la cadena es lineal o cíclica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el aminoácido \omega es un aminoácido \omega lineal de ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminopentoico, ácido 6-aminohexanoico (ácido \varepsilon-amino caproico (EACA)), ácido 7-aminoheptanoico, ácido 8-aminooctanoico y arginina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el aminoácido \omega es un aminoácido \omega seleccionado del grupo de ácido trans-4-aminometil ciclohexano carboxílico (ácido tranexamico) y ácido para-aminometil benzoico.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el aminoácido \omega es ácido \varepsilon-amino caproico (EACA).
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en la que el aminoácido \omega está presente en el amortiguador de extracción o solución que contiene fibrinógeno en una concentración de entre 5-500 mM.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el aminoácido \omega está presente en la solución que contiene fibrinógeno en una concentración de entre 50-500 mM.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el aminoácido \omega está presente en la solución que contiene fibrinógeno en una concentración de aproximadamente 100 mM.
11. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la solución que contiene fibrinógeno se diluye de tal manera que la conductividad está por debajo de 10.5 mS/cm antes que se aplique a la matriz de intercambio de ión.
12. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el amortiguador se utiliza para lavar la matriz de intercambio de ión comprende (i) tris en una concentraron de aproximadamente 50 mM, (ii) un aminoácido \omega en una concentración de aproximadamente 20 mM, y NaCl en una concentración de aproximadamente 90 mM.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el amortiguador utilizado para lavar la matriz de intercambio de ión tiene un pH de aproximadamente 8.0.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en la que el amortiguador utilizado para lavar la matriz de intercambio de ión tiene una conductividad de aproximadamente 11.1 mS/cm.
15. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el fibrinógeno se eluye de la matriz en un amortiguador de elusión que comprende aproximadamente 10 mM Tris, 10 mM citrato, 45 mM sacarosa y NaCl en una concentración de entre 200 mM a 1.0M.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en la que el NaCl está en una concentración de aproximadamente 400-500 mM.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 16, en la que el amortiguador de elusión tiene un pH de aproximadamente 7.0.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005505581A (ja) * 2001-10-03 2005-02-24 クリストファー ジェイ ウールヴァートン 貯蔵安定なヒトフィブリノーゲン溶液
DE10261126A1 (de) 2002-08-13 2004-03-04 Aventis Behring Gmbh Lagerungsstabile, flüssige Fibrinogen-Formulierung
DE102004009400A1 (de) 2004-02-24 2005-09-08 Zlb Behring Gmbh Fibrinogen Reinigung
FR2887883B1 (fr) * 2005-06-29 2007-08-31 Lab Francais Du Fractionnement Procede de separation des proteines fibrinogene, facteur xiii et colle biologique d'une fraction plasmatique solubilisee et de preparation de concentres lyophilises desdites proteines
FR2952641B1 (fr) * 2009-11-18 2012-01-13 Lfb Biomedicaments Procede de traitement du plasma sanguin comprenant une etape de lavage par dispersion
WO2012038410A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Octapharma Ag Process for production of fibrinogen
MX351340B (es) * 2012-03-13 2017-10-11 Octapharma Ag Proceso mejorado para la produccion de fibrinogeno y fibrinogeno producido por este.
WO2014016829A1 (en) * 2012-07-22 2014-01-30 Mx Biotech Ltd. Insoluble fibrinogen particles (ifp) and coatings : composition, fabrication methods, and applications for harvesting and culturing mammalian cells
US20140154233A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-05 Csl Limited Method of purifying therapeutic proteins
US10188965B2 (en) 2012-12-05 2019-01-29 Csl Behring Gmbh Hydrophobic charge induction chromatographic depletion of a protein from a solution
US9932388B2 (en) 2014-11-13 2018-04-03 Hemarus Therapeutics Limited Chromatographic process for producing high purity fibrinogen and thrombin
CN106800583A (zh) * 2015-11-26 2017-06-06 上海洲跃生物科技有限公司 一种速溶无析出的冻干人纤维蛋白原制备工艺
AU2017205364B2 (en) * 2016-01-07 2021-03-04 Eio Biomedical Ltd Methods, compositions and kits for reducing tissue adhesions
KR101841587B1 (ko) 2016-01-12 2018-05-14 주식회사 녹십자홀딩스 피브리노겐의 정제방법
CN107540743A (zh) * 2017-10-11 2018-01-05 南岳生物制药有限公司 一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法
IL310285A (en) 2021-08-13 2024-03-01 Biotest Ag Fibrinogen preparations and preparation methods

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT359653B (de) 1979-02-15 1980-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes
AT359652B (de) 1979-02-15 1980-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes
US4341764A (en) 1980-03-05 1982-07-27 Cutter Laboratories, Inc. Method of preparing fibronectin and antihemophilic factor
AT369990B (de) 1981-07-28 1983-02-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebeklebstoffes
DE3203775A1 (de) 1982-02-04 1983-08-11 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Fibrinogenzubereitung, verfahen zu ihrer herstellungund ihre verwendung
DE3230849A1 (de) 1982-08-19 1984-02-23 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Pasteurisiertes human-fibrinogen (hf) und verfahren zu dessen herstellung
GB8505882D0 (en) * 1985-03-07 1985-04-11 Central Blood Lab Authority Purification of blood coagulation factor viii
WO1992013495A1 (en) * 1991-02-07 1992-08-20 Fibratek, Inc. Fibrinogen based adhesive
US5278289A (en) * 1991-11-12 1994-01-11 Johnson Alan J Antihemophilic factor stabilization
DE4202667C1 (es) 1992-01-29 1993-05-13 Behringwerke Ag, 3550 Marburg, De
DK82592D0 (da) * 1992-06-23 1992-06-23 Novo Nordisk As Fremstilling af proteiner
US5395923A (en) 1993-02-23 1995-03-07 Haemacure-Biotech, Inc. Process for the obtention of a biological adhesive made of concentrated coagulation factors by "salting-out"
US5330974A (en) * 1993-03-01 1994-07-19 Fibratek, Inc. Therapeutic fibrinogen compositions
AU695266B2 (en) * 1994-03-18 1998-08-13 Baxter International Inc. Topical fibrinogen complex
ES2139227T5 (es) * 1994-07-14 2011-05-04 Caf-Dcf Département Central De Fractionnement De La Croix Rouge S.C.R.L. Concentrado de fibrinógeno obtenido de plasma sanguíneo, procedimiento e instalación para su preparación.
US5981254A (en) * 1997-10-30 1999-11-09 Haemacure Corporation Process for producing thrombin from plasma
KR100589082B1 (ko) 1998-01-23 2006-06-13 씨에스엘 리미티드 피브리노겐 정제
ATE328007T1 (de) * 1998-09-24 2006-06-15 Pharming Intellectual Pty Bv Reinigung von fibrinogen aus flüssigkeiten mittels ausfällung und hydrophobischer- interaktion-chromatographie
US6451978B2 (en) * 2000-01-21 2002-09-17 Biovitrum Ab Purification of antithrombin-III-α and β

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