CZ333294A3 - Self-stabilized oligonucleotide and inhibition method of virus gene or pathogenic organism or cellular gene expression - Google Patents

Self-stabilized oligonucleotide and inhibition method of virus gene or pathogenic organism or cellular gene expression Download PDF

Info

Publication number
CZ333294A3
CZ333294A3 CZ943332A CZ333294A CZ333294A3 CZ 333294 A3 CZ333294 A3 CZ 333294A3 CZ 943332 A CZ943332 A CZ 943332A CZ 333294 A CZ333294 A CZ 333294A CZ 333294 A3 CZ333294 A3 CZ 333294A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
virus
oligonucleotide
autostabilized
group
complementary
Prior art date
Application number
CZ943332A
Other languages
English (en)
Inventor
Sudhir Agrawal
Jin-Yan Tang
Original Assignee
Hybridon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon filed Critical Hybridon
Publication of CZ333294A3 publication Critical patent/CZ333294A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3511—Conjugate intercalating or cleaving agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká autostabilizovaného oligonukleotidu a způsobu inhibice exprese genu viru nebo patogenního organismu nebo buněčného genu. Zejména se vynález týká nových terapeutických činidel, kterých je možno používat při léčbě založené na použití kódujících (pozitivních) nukleotidů a zvláště pak zlepšených kódujících nukleotidů, které mají zvýšenou odolnost proti nukleasám.
Dosavadní stav techniky
Terapetický princip založený na použití kódujících oligonukleotidů představuje atraktivní strategii pro racionální vývoj protivirových léčiv a chemoterapeutických činidel proti jiným patogenům a proti chorobám, které jsou výsledkem poruch exprese genu. Tento terapeutický princip je založen na specifické vazbě mezi cílovou sekvencí nukleových kyselin a komplementárním oligonukleotidem. Účinnost komplementárních oligonukleotidů při inhibici exprese genu prostřednictvím této specifické vazby byla demonstrována v několika publikacích.
Zamecnik a Stephenson, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 285 až 288 (1978) popsali specifickou inhibici replikace viru Rousova sarkomu ve fibroblastech infikovaných kuřat prostřednictvím 13-měrového syntetického oligodeoxynukleotidu, který je komplementární k části virového genomu.
Zamecnik et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 4143 až 4146 (1986) popsali inhibici replikace a exprese viru humánní imunodeficience (HIV-1, později označované2 ho HTLV-III) v kultivovaných buňkách prostřednictvím syntetických oligonukleotidových fosfodiesterů, které jsou komplementární k virové RNA.
Později bylo oznámeno, že oligonukleotidy, které mají vyšší odolnost proti nukleolytické degradaci než oligonukleotidové fosfodiestery, jsou účinnější jako kódující oligonukleotidy. Rozsáhlý přehled použití modifikovaných oligonukleotidů jako protivirových činidel je uveden v publikaci Agrawal, Tibtech 10: 152 až 158 (1992).
Sarin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7448 až 7451 (1988) uvádějí, že oligodeoxynukleosidmethylfosfonáty jsou účinnější jako inhibitory HIV-1 než konvenční oligodeoxynukleotidy.
Agrawal et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7079 až 7083 (1988) uvádějí, že oligonukleotidfosforothioáty a různé oligonukleotidfosforoamidáty jsou účinnější při inhibici HIV-1 než konvenční oligodeoxynukleotidy.
Agrawal et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 7790 až 7794 (1989) popisují výhodnost oligonukleotidfosforothioátů při inhibici HIV-1 v časně nebo chronicky infikovaných buňkách.
Přídavnou vlastností, která činí oligonukleotidy účinnějšími kódujícími činidly, je jejich schopnost aktivovat RNasu H. Oligonukleotidfosforothioáty, které jsou jednak resistentní vůči nukleolytické degradaci a jednak aktivují RNasu H, jsou tedy účinnými inhibitory HIV-1 a některých dalších virů.
Gao at al., Antimicrob. Agents and Chem. 34: 808 (1990) popsali inhibici HSV prostřednictvím oligonukleotidfosforothioátů.
Storey et al., Nucleic Acids Res. 19: 4109 (1991) popsali inhibici HPV prostřednictvím oligonukleotidfosforothioátů.
Leiter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3430 (1990) popsali inhibici chřipkového viru prostřednictvím oligonukleotidfosforothioátů.
Oligonukleotidfosforothioáty mají sice zvýšenou odolnost vůči nukleolytické degradaci, ale bohužel nejsou úplně odolné in vivo.
Agrawal et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7595 až 7599 (1991) uvádějí, že oligonukleotidfosforothioáty jsou v myších v rozsáhlé míře degradovány od 3' konce.
Kromě toho, oligonukleotidfosforothioáty tvoří méně stabilní duplexy mezi oligonukleotidem a cílovou sekvencí než oligodeoxynukleotidfosfodiestery. Pro překonání těchto nedostatků byly vyvinuty oligonukleotidy, které na 3' konci obsahují blokovací strukturu. Agrawal a Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539 až 3542 (1987) popsali použití oligodeoxynukleosidmethylfosfonátů jako 5’ a 3' blokovacích činidel. Shaw et al., Nucleic Acids Res. 19: 747 až 75 (1991) publikovali oligodeoxynukleotidfosfodiestery s blokujícími strukturami na 3' konci.
Temsamani et al., Antisense Strategies, Annals of New York Academy of Sciences (v tisku) (1992) popsali 3’ blokované oligonukleotidfosforothioáty.
I tyto 3’ blokované oligonukleotidy, které jsou odolné vůči nuklease, mohou být nakonec degradovány, poněvadž 3' blokovaný konec těchto oligonukleotidů je pomalu štěpen kombinovaným způsobením endonukleasy a exonukleasy.
Existuje proto potřeba vyvinout oligonukleotidy, které by vytvářely stabilní duplexy, byly resistentní vůči nukleolytické degradaci a aktivovaly RNasu H, přičemž by nevykazovaly nevýhody oligonukleotidů, které jsou až dosud známy. Za ideálních podmínek by měly tyto oligonukleotidy vzdorovat i kombinovanému působení endonukleas a exonukleas, měly by vytvářet stabilní bázové páry s cílovými sekvencemi za fyziologických teplot, měly by aktivovat RNasu H a při jejich degradaci by měly vznikat pouze nukleosidy.
Oligonukleotidy s autokomplementární strukturou, která má podobu vlásenky, jsou v tomto oboru známy.
Germann et al., Biochemistry 24: 5698 až 5702 (1985), popsali z části autokomplementární 24-merový oligonukleotid d(GC)5T4(CG)5, který podléhá přechodu z β-DNA na Z-DNA.
' Hilbers et al., Biochimie 67: 685 až 695 (1985) probírá dynamiku tvorby vlásenkové struktury u částečně autokomplementárního oligonukleotidů dAT2CTATnTAGGAT.
Žádná z těchto fyzikálních studií se nevztahuje ke stabilitě oligonukleotidů ani k jejich terapeutickému využi ti.
Dosavadní stav techniky tedy neobsahuje žádné údaje ani jejich náznaky, že by bylo možno použít autokomplementárních oligonukleotidů při terapeutickém přístupu zahrnujícím používání kódujících oligonukleotidů, ani se nezmiňuje o používání vlásenkové struktury, jakožto prostředku kterým lze dodat oligonukleotidům resistenci vůči nukleolytické degradaci .
Podstata vvnálezu
Jak již bylo uvedeno výše, týká se vynález nových terapeutických činidel, kterých lze používat při typu léčby založeném na kódujících oligonukleotidech. Předmětem vynálezu jsou zlepšené kódující oligonukleotidy, které jsou resistentní vůči nukleolytické degradaci. Oligonukleotidy podle vynálezu vzdorují nukleolytické degradaci, včetně kombinovaného účinku endonukleas a exonukleas. Oligonukleotidy podle vynálezu vytvářejí za fyziologických podmínek stabilní hybridy s cílovými sekvencemi, aktivují RNasu H a poskytují jako degradační produkty pouze nukleosidy.
Výhody oligonukleotidů podle vynálezu, které jsou označovány názvem autostabilizované oligonukleotidy, vyplývají z přítomnosti dvou strukturních znaků, kterými jsou cílová hybridizační oblast a autokomplementární oblast. Cílová hybridizační oblast obsahuje oligonukleotidovou sekvenci, která je komplementární vůči sekvenci nukleových kyselin, tj . vůči sekvenci obsažené v rostlinném nebo zvířecím viru, patogenním organismu nebo v buněčném genu nebo genovému transkriptu, v důsledku jehož abnormální exprese nebo působením produktů této exprese vzniká chorobný stav. Autokomplementární oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci, která je komplementární vzhledem k sekvenci nukleové kyseliny v oligonukleotidu. Tento oligonukleotid vytváří úplně nebo částečně dvouřetězcovou strukturu, která je resistentní vůči nukleolytické degradaci přinejmenším v tom případě, když není hybridizován k cílové sekvenci nukleové kyseliny. Jelikož resistence vůči nukleasám vyplývá z vlastní struktury těchto molekul, není nutno tuto resistenci dodávat za použití modifikovaných internukleotidových vazeb, přestože je samozřejmě možno takových modifikovaných vazeb použít. Oligonukleotidy podle vynálezu tedy umožňují používat oligonukleotidfosfodiesterů nebo oligonukleotidfosforothioátů, z nichž oba se degradují in vivo. Výsledkem toho jsou oligonukleotidy, které aktivují RNasu H, což je důležitý znak kódujících terapeutických sloučenin. Za použití oligonukleotidfosfodiesterů dochází ke vzniku stabilní hybridizace mezi terapeutickým oligonukleotidem a cílovu sekvencí. Navíc degradací takových oligonukleotidů vznikají pouze nukleotidové štěpné produkty, takže je minimalizována potenciální toxicita. Všechny tyto výhody mají za následek vznik lepších terapeuticky účinných oligonukleotidů.
Předmětem vynálezu jsou dále autostabilizované ribozymy, poněvadž autokomplementárního znaku podle vynálezu lze účelné používat i u ribonukleotidů. Takové ribozymy podle vynálezu mají obecně typickou ribozymovou strukturu s výjimkou toho, že obsahují autokomplementární oblast na, nebo u 5' nebo 3' konce. Tato oblast uděluje ribozymům resistenci vůči nukleasám a činí je stabilnějšími ve srovnání s ribozymy podle dosavadního stavu techniky.
Přehled obr, na výkresech
Na obr. 1 je ilustrován autostabilizovaný oligonukleotid podle vynálezu ve vlásenkové a hybridizované konfiguraci.
Na obr. 2 je ilustrován autostabilizovaný oligonukleotid podle vynálezu v kladívkové konfiguraci.
Na obr. 3 jsou uvedeny výsledky studie stability duplexu v případě hybridizace mezi oligonukleotidem nebo autostabilizovaným oligonukleotidem a komplementárním cílovým oligonukleotidem.
Na obr. 4 jsou uvedeny výsledky zpracování oligonukleotidů 3'-exonukleasou.
Na obr. 5 je znázorněna struktura autostabilizovaných oligonukleotidů použitých v příkladech 1 až 4.
Na obr. 6 je znázorněn mechanismus terapeutického působení autostabilizovaných oligonukleotidů. Na obr. 7 je znázorněn autostabilizovaný ribozym podle vynálezu. V tomto příkladu je autostabilizovaný ribozym podle vynálezu komplementární vzhledem k oblasti gag HIV a má za následek štěpení gag mRNA HIV.
Následuje podrobnější popis přednostních provedení tohoto vynálezu.
Jak již bylo uvedeno výše, týká se vynález nových terapeutických činidel, která jsou užitečná při léčbě virových infekcí, infekcí způsobených patogenními organismy a chorob, které jsou vyvolány abnormální expresí genu nebo genovými produkty.
Podle prvního aspektu jsou předmětem vynálezu terapeuticky účinné autostabilizované oligonukleotidy, které jsou resistentnější vůči nukleolytické degradaci než oligonukleotidy známé z dosavadního stavu techniky. Pro účely tohoto vynálezu se pod pojmem oligonukleotidy zahrnují polymery ribonukleotidů, deoxyribonukleotidů nebo obou typů těchto nukleotidů, přičemž ribonukleotidové a/nebo deoxyribonukleotidové monomery jsou spolu spojeny vazbami 5'-3', které mohou zahrnovat kterékoliv z vazeb známých z oboru kódujících oligonukleotidů. Do rozsahu pojmu oligonukleotidy spadají též molekuly obsahující modifikované báze nukleových kyselin a/nebo cukry, jakož i molekuly s přídavnými substituenty, jako jsou skupiny diaminů, cholesterylové nebo jiné lipofilní skupiny. Některé přednostní kombinace monomerů a intermonomerových vazeb jsou podrobněji popsány dále.
Oligonukleotidy podle vynálezu se obvykle vyznačují tím, že obsahují následující dvě oblasti: cílovou hybridizační oblast a autokomplementární oblast. První provedení autostabilizovaného oligonukleotidu podle vynálezu je znázorněno na obr. 1. V tomto provedení je cílová hybridizační oblast znázorněna spojenými obdélníčky a autokomplementární oblast je znázorněna spojenými kroužky. Komplementární sekvence nukleové kyseliny v cílové molekule RNA je znázorněna spojenými kosočtverci. Vodíkové vazby mezi nukleotidy jsou znázorněny tečkami. Oligonukleotid je stabilizován, tj. je mu dodána resistence vůči nukleólytické degradaci od 5' nebo 3' konce párováním bází mezi cílovou hybridizační oblastí a autokomplementární oblastí a/nebo párováním bází mezi komplementární sekvencí a autokomplementární oblastí. Když se oligonukleotid dostane do styku s molekulou nukleové kyseliny, která má komplementární sekvenci, poruší se párování bází mezi cílovou hybridizační oblastí a autokomplementární oblasti oligonukleotidu a nahradí se párováním bází mezi cílovou hybridizační oblastí oligonukleotidu a komplementární sekvencí cílové molekuly nukleové kyseliny. K tomuto narušení a zrněné párování bází dochází z toho důvodu, poněvadž intermolekulárni párová struktura bází, která je tvořena hybridem mezi cílovou sekvencí nukleové kyseliny a cílovou hybridizační oblastí, je termodynamicky stálejší než intramolekulární párová struktura bází, která je tvořena autokomplementárním oligonukleotidem. Tento jev je ilustrován na obr. 3 a podrobněji prodiskutován v příkladu 4.
Druhé provedení oligonukleotidu podle vynálezu se uplatňuje podobným způsobem jako první provedení, ale vytváří odlišnou strukturu při autokomplementárním párování bází. Při tomto alternativním provedení vzniká kladívková struktura znázorněná na obr. 2. V tomto provedení obsahuje autokomplementární oblast oligonukleotidové sekvence, které se mohou párovat s bázemi jiné oligonukleotidové sekvence v rámci autokomplementární oblasti. Autokomplementární oblast může také obsahovat oligonukleotidové sekvence, které jsou komplementární k cílové hybridizační oblasti.
Cílová hybridizační oblast oligonukleotidu podle vynálezu má sekvenci oligonukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny viru nebo patogenního organismu, nebo genu nebo jeho transkriptu, kde chorobný stav je důsledkem exprese tohoto genu nebo vzniká působením jeho produktu. Cílová hybridizační oblast přednostně obsahuje asi 8 až asi 50 nukleotidů. Pod označením oligonukleotidová sekvence, která je komplementární vůči sekvenci nukleové kyseliny, se pro účely tohoto vynálezu rozumí oligonukleotidová sekvence (2 až asi 50 nukleotidů), která se za fyziologických podmínek hybridizuje se sekvencí nukleové kyseliny, například mechanismem Watson-Crickova párování bází (interakcí mezi oligonukleotidem a jednořetězcovou nuleovou kyselinou nebo mechanismem Hoogsteenova párování bází (interakcí mezi oligonukleotidem a dvouřetězcovou nukleovou kyselinou nebo jinými mechanismy. Taková hybridizace za fyziologických podmínek se měří prakticky sledováním interference s funkcí sekvence nukleové kyseliny.
Sekvence nukleové kyseliny, s níž je cílová hybridizační oblast oligonukleotidu podle vynálezu komplementární, se bude měnit v závislosti na chorobě, která má být léčena. V mnoha případech bude sekvencí nukleové kyseliny sekvence nukleové kyseliny viru. Použití kódujících oligo10 nuleotidů pro inhibici různých virů je dobře známo, a jeho přehled je uveden v publikacei Agrawal, Tibtech 10: 152 až 158 (1992). Sekvence virové nukleové kyseliny, které jsou komplementární k účinným kódujícím oligonukleotidům byly popsány u mnoha virů, včetně viru humánní imunodeficience typu 1 (US patent č. 4 806 463), viru Herpes simplex (US patent č. 4 689 320), chřipkového viru (US patent č.
..... SN 07/516 275, udělený 30. 6. 1992) a humánního papilloma viru (Storey et al., Nucleic Acids Res. 19: 4109 až 4114 (1991)): U oligonukleotidů podle tohoto vynálezu je možno použít sekvencí, které jsou komplementární ke kterými koliv z těchto sekvencí nukleové kyseliny. Stejně tak lze použít oligonukleotidových sekvencí, které jsou komplementární ke Sekvencím nukleové kyseliny libovolného jiného viru. Jako další viry se známou sekvencí nukleové kyseliny, proti kterým je možno vyrobit kódující oligonukleotidy, lze uvést virus kulhavky a slintavky (viz Robertson et al., J. Virology 54: 651 (1985); Harris et al., J. Virology 36: 659 (1980)), virus žluté zimnice (viz Rice et al. , Science 229: 726 (1985)). Virus pásového oparu (Varicella-Zoster) (viz Davison a Scott, J. Gen. Virology 67: 2279 (1986) a virus mozaiky na okurkách (viz Richards et al., Virology 89: 395 (1978)).
Alternativně může cílová hybridizační oblast oligonukleotidu podle vynálezu obsahovat oligonukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny patogenního organismu. Byly popsány nukleotidové sekvence nukleových kyselin mnoha patogenních organismů, včetně organismu způsobujícího malarii, Plasmodium falciparum, a mnoha patogenních bakterií. Cílovou hybridizační oblast oligonukleotidů podle vynálezu může tvořit oligonukleotidová sekvence komplementární k sekvenci nukleové kyseliny jakéholikov takového patogenního organismu. Jako příklady patogenních eukaryotú se známými sekvencemi nuleových kyselin, proti kterým je možno vyrobit kódující oligonukleotidy, je možno uvést Trypanosoma brucei gambiense a Leishmania (viz Campbell et al., Nátuře 311: 350 (1984)), Fasciola hepatica (viz Zurita et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 2340 (1987)). Také je možno vyrobit antifungální oligonukleotidy za použití cílové hybridizační oblasti, jejíž oligonukleotidová sekvence je komplementární k sekvenci nukíeové kyseliny, například chitin synthe tasového genu, a antibakteriální oligonukleotidy za použití například alanin racemasového genu.
Ještě v dalším provedení může cílová hybridizační oblast oligonukleotidu podle vynálezu obsahovat oligonukleo tidovou sekvenci, která je komplementární k buněčnému genu nebo genovému transkriptu, jehož abnormální exprese nebo produkt této exprese má za následek chorobný stav. Byly popsány sekvence nukleové kyseliny různých takových buněčných genů. Jako jejich příklady je možno uvést protein prion (Stáhl a Prusiner, FASEB J. 5: 2799 až 2807 (1991)), protein typu amyloidu, který je spojován s Alzheimerovou chorobou (US patent č. 5 015 570) a různé dobře známé onkogeny a protoonkogeny, jako je c-myb, c-myc, c-abl a n-ras. Oligo nukleotidů, které ihibují syntézu strukturálních proteinů nebo enzymů, které se převážně nebo výlučně uplatňují při spermatogenesi, motilité spermií, vazbě spermií k vajíčku nebo při kterémkoliv jiném stupni ovlivňujícím životaschopnost spermií, se může použít jako kontraceptivních látek u mužů. Podobně lze jako ženských kontraceptiv použít oligonukleotidů inhibujících proteiny, nebo enzymy, které se podílejí na ovulaci, oplodnění nebo implantaci nebo při biosyntéze hormonů, které se při těchto procesech zúčastňuj í.
Hypertensi je možno léčit pomocí oligodeoxynukleotidů, které potlačují syntézu enzymu konvertujícího antio12 gensin nebo podobných enzymů v systému renin/angiotensin. Agregaci krevních destiček je možno potlačovat potlačením syntézy enzymů potřebných pro syntézu thromboxanu A2. Posledně uvedeného účinku je možné využít při léčbě poruch myokardiálního a cerebrálního oběhu, infarktu, arteriosklerosy, embolií a thrombosy. Ukládání cholesterolu na stěnách tepen je možno inhibovat potlačením syntézy mastného akrylového ko-enzymu :'A7 Artěriosklérosu je možno léčit potlačením tvorby cholesterol acyltransferasy. Inhibice syntézy cholin fosfotransferasy může být užitečná při léčbě hypolipidemie.
Existují četné nervové poruchy, při nichž je možno použít hybridizačního zablokování pro snížení nebo eliminaci nepříznivých účinků poruchy. Tak například potlačení syntézy monoamin oxidasy se může použít při Parkinsonově chorobě; potlačení katechol o-methyltransferasy se může použít při léčbě depresí a potlačení indol n-methyltransferasy se může použít při léčbě schizofrenie.
Potlačování zvolených enzymů v kaskádě kyseliny arachidonové, která vede k prostaglandinům a leukotrienům, může být užitečné při regulaci agregace krevních destiček a při léčbě alergií, zánětů, bolesti a asthma.
Potlačování proteinu exprimováného genem resistence proti více léčivům (multidrug resistance - mdr), který je zodpovědný za vývoj resistence vůči různým protirakovinovým léčivům a který je hlavní překážkou chemoterapie, může být prospěšné při léčbě rakoviny.
Pro cílovou hybridizační oblast oligonukleotidu podle vynálezu se může používat oligonukleotidové sekvence, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny z kterýchkoliv z těchto genů a stejně tak je možno použít oligo13 nukleotidové sekvence komplementární k libovolnému jinému buněčnému genu nebo genovému transkriptu, v případě že abnormální exprese tohoto genu nebo produkt této exprese způsobuje chorobný stav.
Regulace exprese genu v rostlinných buňkách pomocí kódujících oligonukleotidů byla popsána v US patentu č. 5 107 065.
Podle druhého aspektu jsou předmětem vynálezu oligonukleotidy aktivující RNasu H, které jsou resistentní vůči nuklease. Cílová hybridizační oblast oligonukleotidů podle vynálezu může obsahovat ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy nebo jakékoliv jiné analogy ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů. V jednom přednostním provedení se tato oblast skládá z ribonukleotidů. V jiném přednostním provedení se tato oblast skládá z deoxyribonukleotidů. Ještě v dalším přednostním provedení je tato oblast tvořena směsí ribonukleotidů a deoxyribonukleotidů. V dalším přednostním provedení obsahuje cílová hybridizační oblast oligonukleotidové fosfodiestery, fosforothioáty nebo fosforodithioáty nebo jejich směsi s ribonukleotidy nebo deoxyribonukleotidy. Všechna tato přednostní provedení zajišťují aktivaci RNasy H, za předpokladu, že jsou přítomny 4 nebo více sousedních deoxyribonukleotidfosfodiesterů, fosforothioátů nebo fosforodithioátů. Do rozsahu vynálezu samozřejmě spadají i provedení, při nichž se používá cílových hybridizačních oblastí, které neaktivují RNasu H.
Syntetické postupy pro všechna tato provedení jsou dobře známé v tomto oboru. Oligodeoxyribonukleotidfosfodiestery a oligodeoxyribonukleotidfosforothioáty a jejich analogy je možno syntetizovat H-fosfonátovým postupem) který je popsán v US patentu č.....(přihláška SN 07/334 679, akceptovaná 19. března 1992). H-fosfonátového postupu je také možno použít pro syntézu oligoribonukleotidů a oligoribonukleotidových analogů způsobem popsaným v Agrawal a Tang, Tetrahedron Lett. 31: 7451 až 7544 (1990). Také syntéza oligonukleotidfosforodithioátů je dobře známa v tomto oboru.
Samozřejmě jsou možná i mnohá jiná provedení a odborníkům v tomto'oboru je zřejmé, že v cílové hybridizační oblasti oligonukleotidů podle vynálezu je možno používat jiných analogů nebo jejich kombinací. Takové analogy se vyznačují tím, že obsahují jiná internukleotidová spojení než spojení pomocí přirozených fosfodiesterových ve sb. Syntéza mnoha takových analogů je v tomto oboru dobře známa, včetně analogů obsahujících alkylfosfonátové (Agrawal a Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539 až 3542 (1987)) nebo fosforamidátové vazby (Agrawal et al., Proč. Nati. Acad.
Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)).
Druhou významnou oblastí autostabilizovaných oligonukleotidů je autokomplementární oblast. Autokomplementární oblast obsahuje oligonukleotidové sekvence, které jsou komplementární k jiným oligonukleotidovým sekvencím v rámci stejného oligonukleotidu. Tyto jiné oligonukleotidové sekvence mohou být obsaženy v cílové hybridizační oblasti nebo v autokomplementární oblasti, nebo mohou zasahovat do obou těchto oblastí..Komplementární sekvence vytvářejí bázové páry, což má za následek vznik vlásenkové struktury znázorněné na obr. 1 nebo kladívkové struktury znázorněné na obr. 2. Jak vlásenková, tak kladívková struktura může obsahovat smyčku obsahující nukleotidy, jejich báze nejsou spárovány (pro případ vlásenkové struktury viz obr. 1) nebo takovou smyčku neobsahuje (pro případě kladívkové struktury viz obr. 2). Počet bázových párů, které se vytvoří intramolekulární hybridizací, na níž se podílí autokomplementární oblast, se může měnit, ale měl by být vhodný pro udržení dvouřetězcové sturuktury, aby nebyl 3' konec dosažitelný pro endonukleasy. Pro udržení takové dvouřetězcové struktury je obvykle zapotřebí asi 4 nebo více bázových párů. V přednostním provedení obsahuje autostabilizovaný oligonukleotid přibližné asi 10 intramolekulárních bázových párů, přičemž těchto 10 bázových párů následuje po sobě a zahrnuje nukleotidy nejbližší 3’ konci. Samozřejmě že intramolekulární párování bází může být i tak rozsáhlé, že se na něm podílejí všechny nukleotidy oligonukleotidu.
V takovém případě bude autokomplementární oblast přednostně obsahovat asi 50 nebo méně nukleotidů.
V jednom přednostním provedení je autokomplementární oblast připojena k cílové hybridizační oblast pomocí vhodného spojovníku (linkeru), který nemá charakter nukleové kyseliny. Jako příklady vhodných linkerů je možno uvést substituované nebo nesubstituované alkylové skupiny. Jedním z linkerů, kterému se dává největší přednost, je polyethylenglykolový linker obsahující 1 až 6 ethylenglykolových zbytků. Za použití tohoto linkeru s větší velikostí je možno syntézu provádět s využitím obchodně dostupného triethylenglykolu, který obsahuje na jednom konci dimethyltritylovou skupinu a na druhém konci kyanoethylfosforamiditovou skupinu.
Autokomplementární oblast může obsahovat ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy, analogy ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů s umělými vazbami nebo jejich libovolné kombinace. Schopnost aktivovat RNasu H není pro autokomplementární oblast důležitá, takže lze v této oblasti používat nukleotidů s umělými spojovacími vazbami, které neaktivují RNasu H, aniž by se snížila účinnost oligonukleotidu. Kromě fosfodiesterových a fosforothioátových nebo fosforodithioátových vazeb může tato oblast také nebo alternativně obsahovat fosforamidátové vazby (včetně N-substituo16 váných fosforamidátových vazeb), alkylfosfonátové vazby, alkylfosfonothioátové vazby a nefosfátové vazby, jako jsou sulfonové vazby, sulfátové vazby a ketovazby. V provedeních, při kterých autokomplementární oblast autostabilizovaných oligonukleotidů podle vynálezu neaktivuje RNasu H, se také v cílové hybridizační oblasti může používat kterýchkoliv z výše uvedených vazeb.
V jednom z přednostních provedení je autostabilizovaný oligonukleotid hyperstabilizován. Toho se může dosáhnout tím, že se do autokomplementární oblasti zavede jeden nebo více ribonukleotidů nebo 2 ’-O-Me-ribonukleotidů, v nichž komplementární část cílové hybridizační oblasti tvoří DNA. Alternativně může komplementární oblast cílové hybridizační oblasti obsahovat ribonukleotidy nebo 2'O-Me-ribonukleotidy a autokomplementární oblast může obsahovat DNA. Tyto oligonukleotidy budou hyperstabilizovány díky interakci mezi DNA a RNA, která je stabilnější než interakce mezi DNA a DNA. Ještě dalším způsobem jak modifikovat autokomplementární oblast (a/nebo oblast linkeru) za účelem hyperstabilizace autostabilizovaného oligonukleotidů je zavedení jednoho nebo více interkalačních činidel do molekuly. V tomto případě jsou oligonukleotidy hyperstabilizovány díky stabilizaci hybridu vytvořeného mezi autokomplementární oblasti a cílovou hybridizační oblastí prostřednictvím interkalačního činidla. K tomuto účelu se může použít jakéhokoliv interkalačního činidla. Přednostní interkalační činidla zahrnují akridin a ethidium. Oligonukleotidy obsahující akridin se snadno vyrábějí za použití obchodně dostupného akridin-ON-fosforamiditu nebo 3'-akridin-ON CPG (Clontech Laboratories, lne.).
Podle třetího aspektu jsoii předmětem vynálezu ribozymy, které jsou stabilnější než ribozymy známé z dosavadního stavu techniky. Ribozymy jsou katalytické mole17 kuly RNA, které štěpí internukleotidové vazby. Stabilitu takových ribozymů podle vynálezu zajišťuje zavedení autokomplementární oblasti na konci nebo u konce 5' nebo 3' ribozymové molekuly. Tato autokomplementární oblast má za následek tvorbu vlásenkové nebo kladívkové struktury, která dodává 5' nebo 3' konci molekuly dvouřetězcový charakter zajištující odolnost molekuly ribozymů vůči nukleolytické degradaci. Struktura a funkce ribozymů je popsána v US patentu č. 4 987 071. Všechny výše a dále uvedené citace jsou zde uváděny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do tohoto popisu.
Podle čtvrtého aspektu je předmětem vynálezu způsob inhibice exprese genu viru, patogenního organismu nebo buněčného genu, kterýžto způsob zahrnuje stupeň, při němž se buňkám infikovaným virem nebo patogenním organismem, v prvních dvou případech, nebo buňkám obecně, v posledním případě, dodává autostabilizovaný oligonukleotid nebo ribozom podle vynálezu.
Podle pátého aspektu je předmětem vynálezu způsob léčení nemocných lidí nebo zvířat, jejichž choroba je výsledkem infekce virem nebo patogenním organismem nebo důsledkem abnormální exprese buněčného genu nebo produktu této exprese, jehož podstata spočívá v tom, že se těmto lidem nebo zvířatům podá autostabilizovaný oligonukleotid podle vynálezu v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem. Přednostním způsobem podávání je orální, intranasální, rektální a topikální podávání. Při způsobech léčby podle vynálezu se mohou autostabilizované oligonukleotidy podávat v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, jako například AZT v případě AIDS..
Způsobem podle vynálezu je možno léčit řadu virových chorob včetně AIDS, ARC, orálního nebo genitálního herpes, papilomů, chřipky, slintavky a kulhavky, žluté zimnice, planých neštovin, pásového oparu, HTLV-leukemie a hepatitis. Z houbových chorob, které lze léčiv způsobem podle vynálezu je možno uvést kandidózu, histoplasmózu, kryptokokózu, blastomykózu, aspergilózu, sporotrichózu, chromomykosu, dematofytózu a kokcidiodomykózu. Způsobu podle vynálezu lze také použít pro léčbu rickettsiálních chorob (například tyfu, horečky Skalistých hor), jakož i sexuálně přenosných chorob způsovených Chlamydia trachomatis nebo Lymphogranuloroa venerum. Způsobem podle vynálezu je také možno léčit různé parasitické choroby, jako je amébiáza, Chegasova choroba, toxoplasmóza, pneumocystóza, giardóza, kryptosporidióza, trichomoniáza a zánět plic vyvolaný Pneumocystis carini. Také jím lze léčiv choroby způsobené helminty, jako je askariasa, filariáza, trichinóza, schistosomióza, a infekce způsobené nematody nebo tasemnicemi. Způsobem podle vynálezu je dále také možno léčit malarii bez ohledu na to, zda je vyvolána P. falciparum, P. vivax, P. orale nebo P. malariae.
Všechny tyto infekční choroby je možno léčit způsobem podle vynálezu, poněvadž infekční činidla tyto choroby vyvolávající jsou známá, a proto je možno vyrobit autostabilizované oligonukleotidy podle vynálezu, obsahující cílovou hybridizační oblast zahrnující oligonukleotidovou sekvenci, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny, jež má rozhodující význam pro propagaci infekčního činidla, například k esenciálnímu genu.
Jiné choroby nebo chorobné stavy, které lze léčit způsobem podle vynálezu, jsou důsledkem abnormální exprese buněčného genu nebo důsledkem produktu této exprese. Tyto choroby je možno léčit podáváním autostabilizovaných oligonukleotidů podle vynálezu, což bylo již podrobněji popsáno výše.
Vynález poskytuje četné výhody oproti oligonukleotidům, které jsou známé z dosavadního stavu techniky. Autostabilizované oligonukleotidy podle vynálezu mají především delší poločas rozkladu než většina známých oligonuleotidů, takže lze za jejich použití snížit dávkování, kterého je zapotřebí pro dosažení terapeutického účinku. Ještě větší odolnosti proti degradaci nukleasou je možno dosáhnout za použití internukleotidových vazeb odolných proti nuklease nebo blokovacích struktur na jednom nebo obou koncích oligonukleotidu. Enzymatická stabilita, které se dosahuje tím, že strutura, na níž se podílejí autokomplementární sekvence zahrnující párované báze, umožňuje navíc používat oligonukleotidfosfodiesterů, které se jinak rychle degradují. Výhodné přitom je, že duplexy mají zvýšenou stabilitu a aktivují RNasu H, kteréžto dvě vlastnosti se současně nevyskytují u žádného oligonukleotidu resistentního vůči nuklease, který byl až dosud znám z dosavadního stavu techniky. Výhoda spočívající v aktivaci RNasy H je zachována i za použití oligonukleotidfosforothioátů nebo fosforodithioátů. Třetí výhodou je, že různá provedení oligonukleotidů podle vynálezu poskytují jako jediné degradační produkty nukleotidy, například nukleosidmonofosfáty a/nebo nukleosidmonothiofosfáty. Vynález konečně umožňuje používat deoxyribonukleosidu nebo ribonukleosidú. Možnost používat posledně uvedených látek činí vynález snadno přizpůsobitelným pro použití s ribozymy, kde je enzymatická stálost kritickou vlastností.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkla dech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Odolnost oligonukleotidfosfodiesterů proti nuklease
Oligonukleotidy použité při této studii jsou znázorněny na obr. 5. Oligonukleotid CMPD A je komplementární k části oblasti gag HIV-1. Oligonukleotid CMPD B obsahuje stejnou oblast jako cílovou hybridizační oblast, ale navíc obsahuje 3’ autokomplementární oblast 10 nukleotidů. Oligonukleotidy CMPD E a CMPD F jsou totočné s oligonukleotidem CMPD B s výjimkou toho, že CMPD E obsahuje autokomplementární oblast ze 6 nukleotidů a CMPD F autokomplementární oblast ze 4 nukleotidů. Oligonukleotid CMPD G je totožný s oligonukleotidem CMPD A s výjimkou toho, že obsahuje 10 chybně párovaných nukleotidů (T10) přidaných na konci 3'.
Oligonukleotidy se zkoušejí na svou relativní resistenci vůči 3’ exonukleolytické degradaci. Při každé zkoušce se vždy 0,4 A260 jednotek oligonukleotidu .lyofilizuje, rozpustí v 0,5 ml pufru (lOmM Tris, 10mM chlorid hořečnatý, pH 0,5) a roztok se smíchá s 5 μΐ (1,5 milí jednotky) fosfodiesterasy z hadího jedu (SVPD). Směs se inkubuje při 37’C v termálně regulované cele a do grafu se vynáší hodnota A260 proti času. Degradace oligonukleotidu se měří jako funkce nárůstu hyperchromicity.
Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce I. Z těchto výsledků je zřejmé, že autostabilizované oligonukleotidfosfodiestery podle tohoto vynálezu jsou mnohem odolnější proti 3' exonukleolytické degradaci než normální oligonukleotidfosfodiestery nebo oligonukleotidfosfodiestery obsahující nekomplementární koncový řetězec (ocas).
Kromě výše popsaného zkoušení se oligonukleotidy také podrobí štěpení 3'-exonukleasou, DNA polymerasou I. Jak je zřejmé z obr. 4, oligonukleotidy, které nejsou autostabilizovány, CMPD A a CHPD G, se úplně rozštěpí za 30 minut, zatímco autostabilizovaný oligonukleotid CMPD B je za 30 minut rozštěpen jen částečně.
Tabulka I
Poločas rozkladu oligonukleotidů
Oligonukleotid Poločas rozkladu (ti) za použití SVPD
CMPD A 75 sekund
CMPD G 75 sekund
CMPD B 950 sekund
Příklad 2
Odolnost oligonukleotidfosforothioátů proti nuklease
Pro zkoušení relativní odolnosti autostabilizovaných a neautostabilizovaných oligonukleotidfosforothioátů proti nuklease se použije zkoušky s aktivitou 3’-exonukleasy, DNA polymerasy I, poněvadž degradace oligonukleotidfosforothioátů pomocí SVPD je pomalá.
Všechny oligonukleotidy se na 5' konci označí gamma-32P-ATP a kinasou. K roztoku 45 pmol 5'-značeného oligo nukleotidu ve 20 μΐ pufru (40mM Tris HCl, pH 8,0, lOmM chlorid hořečnatý, 5mM DTT, 5mM chlorid draselný, 50 μg/ml BSA) se přidá 5 jednotek DNA polymerasy I a směs se inkubuje při 37’C. V čase 0, 30, 60 a 120 minut se ze směsi odeberou 4μ1 alikvotní vzorky. Každý vzorek se smíchá s 6 μΐ zastavovacího roztoku (98% formamid, lOmM EDTA, 0,1% xylenkyanol, 0,1% bromfenolová modř). Vzorky se analyzují na 15% akrylamidovém gelu (močovina) a autoradiografií.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 4. Fosforothioátový analog CMPD A se za 4 hodiny rozštěpí téměř z 50 %. Fosforothioátový analog CMPD B se však nerozštěpí ani za 4 hodiny. Také fosforothioátové analogy CMPD E a CMPD F, které obsahují 6 (CMPD E) nebo 4 (CMPD F) bázových párů autokomplementární sekvence, jsou stabilní. Fosforothioátový analog CMPD G, který má protaženou strukturu, ale neobsahuje autokomplementární oblast, se štěpí stejnou rychlostí jako CMPD A.
Tyto výsledky ukazují, že autostabilizované oligonukleotidfosforothioáty jsou mnohem odolnější vůči nukleolytické degradaci než neautostabilizované oligonuleotidfosforothioáty.
Příklad 3
Účinnost oligonukleotidů proti HIV
Autostabilizované a neautostabilizované oligonukleotidfosfodiestery se zkoušejí na svou schopnost inhibovat HIV-l ve tkáňové kultuře. Oligonukleotidy použité při této studii jsou znázorněny na obr. 5.
Lymfocyty H9 se infikují viriony HIV-l (=0,01 až 0,1 TCID50/buňka) po dobu jedné hodiny při 37’C. Po této době se neadsorbované viriony odstraní promytím a infikované buňky se rozdělí do jamek 24-jamkové misky. K infikovaným buňkám se přidá zásobní roztok oligonukleotidu tak, aby se dosáhlo vhodné koncentrace ve 2 ml média. Při pozitivním kontrolním pokusu se použije ddC nebo AZT. Potom se buňky kultivují 3 dny. Po této době se supernatant infikované kul23 tury oddělí a měří se p24 pomocí zkoušky ELISA. Porovnává se úroveň exprese p24 v buňkách ošetřených oligonukleotidem a v buňkách, které nebyly ošetřeny žádným léčivem.
Cytotoxicita oligonukleotidů se studuje pomocí kultivace buněk za přítomnosti zvyšující se koncentrace oligonukleotidu a pomocí metody vylučování trypanové modři.
Výsledky těchto dvou pokusů jsou uvedeny v tabulce
IH.
Tabulka III
Účinnost Oligonukleotidů proti HIV Pokus 1
| Koncentrace ( s/nl) Inhibice P24 (%) Přežití buněk % ICM ( í/n»l)
1 CMPD A 25 90 93 2
| 5 89 103
| 1 15 94
| 0,2 26 97
| CMPD B 25 90 95 0,25
5 85 92
1 84 94
0,2 46' 103
CMPD G 25 86 106 0,5 I
5 86 105
1 81 106
0,2 0 109
AZT 0,2 90 95 Ο,Ο37μΜ |
0,04 73 98
0,08 44 104
0,0016 6 108
Pokus 2
| Koncentrace ( í/ml) Inhibice p24 (%) Přežití buněk % ICM ( í/nl)
1 CMPD A 5 66 93 2,8
| 1 20 101
I 0,2 21 107
I 0,04 0 102
| CMPD B 5 93 89 0,35
1 81 99
0,2 . 33 103
0,04 0 104
1 CMPDE 5 89 93 0,45
1 41 100
0,2 19 99
0,04 0 102
CMPD F 5 89 93 1,5
1 41 100
0,2 19 99
0,04 0 102
AZT 0,2 89 93 0,1 Mm
0,04 65 98
0,008 5 101
0,0016 6 103
Všechny autostabilizované oligonukleotidy vykazují vyšší účinnosti proti HIV než CMPD A, což je neautostabilizovaný oligonukleotid. Nejvyšší účinnost je pozorována u autostabilizovaného oligonukleotidů obsahujícího 10 autokomplementárních nukleotidů, který je téměř desetkrát účinnější než oligonukleotidfosfodiester. Oligonukleotid CMPD G, který má koncový řetězec (ocas) póly T, také vykazuje určité zvýšení účinnosti, pravděpodobné díky hybridizační stabilizaci s polyA z mRNA buněk H9.
Pravděpodobný mechanismus působení oligonukleotidů CMPD B je znázorněn na obr. 6. Oligonukleotid vstupuje do buňky ve zčásti dvouřetězcové formě v důsledku intramolekulárního párování bází, na němž se podílí autokomplementární oblast. Když se oligonukleotid setká s molekulou RNA HIV, která obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, jež je komplementární k oligonukleotidová sekvenci cílové hybridizační oblasti oligonukleotidů, dojde k hybridizaci mezi HIV RNA a cílovou hybridizační oblastí. Tato hybridizace rozbije intramolekulární hybridizaci, na níž se podílí autokomplementární oblast. Působením RNasy H potom dojde k rozštěpení HIV RNA, což umožní oligonukleotidů znovu se autostabilizovat intramolekulárním párováním bází.
Za účelem zkoušení relativní účinnosti proti HIV dalších oligonukleotidových struktur, se shora uvedený experiment zopakuje za použití přídavných oligonukleotidů, jakož i oligonukleotidů popsaných v pokusech 1 a 2. Přídavné oligonukleotidy jsou posány na obr. 5. Těmito přídavnými oligonukleotidy jsou oligonukleotid CMPD C, v němž je autokomplementární oblast komplementární k části oligonukleotidů u konce 5'; oligonukleotid CMPC D, který obsahuje osminuleotidovou autokomplementární oblast; a oligonukleotid CMPD H, což je 35-merový oligonukleotid s dokonalou kompelementaritou k gag RNA HIV, který však neobsahuje autokomplementární oblast. Výsledky tohoto třetího pokusu jsou uvedeny v tabulce IV.
Tyto výsledky ukazují, že plně autokomplementární autostabilizované oligonukleotidy mají zhruba stejnou účinnosti proti HIV, jako částečné autokomplementární autostabilizované oligonukleotidy. Tyto výsledky také ukazují, že čtyři autokomplementární nukleotidy postačí pro dodání zvýšené účinnosti.
Tabulka IV
Účinnost oligonukleotidů proti HIV Pokus 3
Koncentrace ( í/mf) Inhibice p24(%) Přežití buněk % IC» ( l/ml)
1 CMPD A 5,0 92 97 1,7
I 1,0 36 103
| 0,2 23 102
0,04 0 109
CMPD B 5,0 95 (97)* 98 (97)· 0,5 (0,2)·
1,0 61 (74)· 101 (102)·
0,2 33 (49)* 104 (103)·
0,04 0(19)* 11 (106)·
CMPD G 5,0 94 97 0,6
1,0 65 104
0,2 11 109
0,04 12 110
CMPD E 5,0 92 98 0,8
1,0 55 101
0,2 13 103
0,04 0 107
CMPD F 5,0 95 99 0,25
1,0 64 102
0,2 . 48 104
0,04 22 109
CMPD C 5,0 94 96 0,3 1
1,0 76 101 1
0,2 39 103
0,04 17 106
Výsledky druhého nezávislého zkoušení
Koncentrace (Mg/ml) Inhibice p24 (%) Přežití buněk % (pg/ml)
CMPD H 5 · 92 93 0,26
1 88 101
0,2 43 98
0,04 0 102
CMPDD 5 80 93 03
1 76 100
0^ 30 108
0,04 3 109
Příklad 4
Stabilita duplexů mezi autostabilizovanými oligonukleotidy a komplementárními oligonukleotidy
Pro zkoušení stability duplexů vytvořených mezi autostabilizovanými nukleotidy a komplementárními sekvencemi nukleové kyseliny se provedou hybridizační studie. Při první studii se oligonukleotid CMPD A, který neobsahuje autokomplementární sekvence, smíchá při teplotě místnosti s komplementárním 25-merovým oligonukleotidem. Vzniklá směs se postupně zahřívá a do grafu se vynáší přírůstek hyperchromicity proti zvyšující se teplotě. Při této studii, jejíž výsledky jsou uvedeny tečkovanou čarou na obr. 3, se zjistí, že poloviční teplota denaturace duplexu je přibližně 65C.
Při druhé studii se CMPD B, což je oligonukleotid obsahující stejnou cílovou hybridizační oblast, jako má oligonukleotid CMPD A, a 10-nukleotidovou a autokomplementární oblast, smíchá při teplotě místnosti se stejným 25merovým oligonukleotidem. Vzniklá směs se postupně zahřívá a do grafu se vynáší přírůstek hyperchromicity proti zvyšující se teplotě. Výsledky jsou uvedeny plnou čarou na obr. 3. Kromě poloviční teploty denaturace, která je v tomto případě asi 65”C se v tomto případě pozoruje vzrůst hyperchromicity při teplotě asi 58’C, což odpovídá denaturaci intramolekulárních vodíkových vazeb vlásenkové struktury. Tento výsledek ukazuje, že intramolekulární párování bází, na němž se podílí autokomplementární oblast je termodynamicky méně stálé než intermolekulární párování bází mezi cílovou hybřidizační oblastí a komplementárním oligonukleotidem.
Za účelem dalšího zkoušení vyšší stálosti intermolekulárního párování bází ve srovnání s intramolekulárním párováním bází se CMPD B smíchá se stejným komplementárním 25-merovým oligonukleotidem a vzniklá směs se zahřeje na 80°c a potom nechá zchladnout na teplotu místosti. Vzniklá směs se postupně zahřívá a do grafu se vynáší přírůstek hyperchromicity proti zvyšující se teplotě. Výsledky jsou uvedeny přerušovanou, čarou na obr. 3. V tomto případě je pozorována pouze jedna hodnota poloviční teploty denaturace, asi 65‘C, což ukazuje, že intermolekulární párování bází mezi CMPD B a komplementárním 25-merovým oligonukleotidem vítězí v soutěži s intramolekulárním párováním bází, na němž se podílí autokomplementární oblast.
Tyto výsledky ukazují, že bude docházet k hybridizaci mezi autostabilizovanými oligonukleotidy a komplementárními sekvencemi nukleové kyseliny bez ohledu na přítomnost oligonukleotidových sekvencí v oligonukleotidů, které jsou komplementární k cílové hybřidizační oblasti. Jelikož je dobře známo, že určité typy oligonukleotidových struktur se hybridizují stabilněji než určité jiné typy oligonukleotidových struktur (například RNA:DNA hybridy > DNA:DNA hybridy a oligonukleotidfosfodiester > oligonukleo29 tidfosforothioát, -methylfosfonát nebo -fosforamidát), tyto výsledky také ukazují, že přednostní cílový hybridizační účinek je možno zvýšit takovou konstrukcí autostabilizovaného oligonukleotidu, při níž hybridizace mezi cílovou hybridizační oblastí a cílovou sekvencí zahrnuje stabilněji se párující oligonukleotidové struktury, než jsou struktury, které se podílejí na hybridizaci autokomplementární oblasti.
Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že na základě výše uvedených poznatků je možno zhotovit autokomplementární oblasti a kombinovat je s celou řadou cílových hybridizačních oblastí.
Příklad 5
Hyperstabilizované autostabilizované oligonukleotidy
Pro získání oligonukleotidů se stabilnější interakcí mezi autokomplementární oblastí a cílovou hybridizační oblastí se vyrobí oligodeoxynukleosidfosfodiestery nebo oligodeoxynukleosidfosforothioáty obsahující v autokomplementární oblasti 2-0-Me ribonukleosidy. Jak je zřejmé z tabulky V, uvedené dále, tyto oligonukleotidy vykazují hyperstabilizovanou interakci mezi autokomplementární oblastí a cílovou hybridizační oblastí. Nicméně tyto oligonukleotidy nadále favorizují tvorbu intermolekulárních hybridů s komplementární DNA ve srovnání s molekulami obsahujícími intramolekulární hybridy.
Tabulka V
Stabilita duplexů autostabilizovaných oligonukleotidů obsahujících v autokomplementární oblasti 2-O-Me-ribonukleotidy
Poloviční teplota den. Komplement. 1 k DNA (25 mer)
5 ’-CTCICSCACCCATCTCTCTCCTTCTCGAGA-3 ’ 59eC 64,8°C
5'-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAG-3' 66’C 64,5eC
5' -CTCTCCCACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGAG3' 71’C 65°C i
Další třída hyperstabilizovaných autostabilizovaných oligonukleotidů se vyrobí kovalentním připojením molekuly akridinu ke konci autokomplementární oblasti. Také tyto molekuly vykazují hyperstabilitu interakce mezi cílovou hybridizační oblastí a autokomplementární oblastí. Přesto tyto molekuly stále ještě přednostně vytvářejí intermolekulární hybridy s komplementární DNA před tvorbou intramolekulárních hybridů.
Tabulka VI
Stabilita duplexů autostabilizovaných oligonukleotidů obsahujících v autokomplementární oblasti interkalační činidla
I ?olovíční teplota denat. Komplement. k DNA (25 mer)
I 5'-CTCTCCCACCCATCTCTCTCCnCTX N/A 67,5’C |
| 5 ’ -CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCTGGS- 3' N/A 66,7’C |
I 5 ' -CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTC7GGAG7-3 ' 6 5’C 66,3’C
| 5 ' - CTCTCGGACCCATCTCTCTCCTTCTGGAGAGX · 3 ’ 66,8’c 66,7’C
Tyto výsledky ukazují, že je možné zkonstruovat hyperstabilizované autostabilizované oligonukleotidy vykazující velmi stabilní interakce mezi autokomplementární oblastí a cílovou hybridizační oblastí, aniž by byla narušena schopnost těchto oligonukleotidů vytvářet intermoleku lární hybridy s cílovou nukleovou kyselinou.

Claims (34)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Autostabilizovaný oligonukleotid obsahující cílovou hybridizační oblast a autokomplementární oblast, přičemž cílová hybridizační oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci alespoň 8 nukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny z viru, patogenního organismu nebo buněčného genu a autokomplementární oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci 6, 8 nebo asi 10 nukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny obsažené v autostabilizovaném oligonukleotidu.
  2. 2. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 1, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje 4 nebo více sousedních deoxyribonukleotid fosfodiesterů, fosforothioátů nebo fosforodithioátů.
  3. 3. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 1, v němž autokomplementární oblast zahrnuje nukleotidy zvolené ze souboru zahrnujícího deoxyribonukleotid nebo ribonukleotidfosfodiestery, fosfotriestery, fosforothioáty, fosforodithioáty, fosforamidáty, alkylfosfonáty, alkylfosfonothioáty a alkylfosfonothioáty.
  4. 4. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 1, kde virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma virus, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  5. 5. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 1, kde patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  6. 6. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 1, kde buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  7. 7. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 2, v němž autokomplementární oblast zahrnuje nukleotidy zvolené ze souboru zahrnujícího deoxyribonukleotid nebo ribonukleotidfosfodiestery, fosfotriestery, fosforothioáty, fosforodithioáty, fosforamidáty, alkylfosfonáty a alkylfosfonothioáty.
  8. 8. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 2, kde virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma viris, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  9. 9. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 2, kde patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  10. 10. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 2, kde buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  11. 11. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 3, kde virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma viris, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  12. 12. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 3, kde patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  13. 13. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 3, kde buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  14. 14. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku
    1, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje asi 8 až asi 50 nukleotidů a autokomplementární oblast zahrnuje 6, 8 nebo asi 10 nukleotidů.
  15. 15. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku
    2, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje asi 8 až asi 50 nukleotidů a autokomplementární oblast zahrnuje 6, 8 nebo asi 10 nukleotidů.
  16. 16. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku
    3, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje asi 8 až asi 50 nukleotidů a autokomplementární oblast zahrnuje 6, 8 nebo asi 10 nukleotidů.
  17. 17. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 2, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje asi 8 až asi 50 nukleotidů a autokomplementární oblast zahrnuje asi 10 nukleotidů.
  18. 18. Autostabilizovaný oligonukleotid podle nároku 3, v němž cílová hybridizační oblast zahrnuje asi 8 až asi 50 nukleotidů a autokomplementární oblast zahrnuje asi 10 nukleotidů.
  19. 19. Způsob inhibice exprese genu viru nebo patogenního organismu nebo buněčného genu, vyznačující se tím, že se buňkám infikovaným virem nebo patogenem nebo neinfikovaným buňkám dodá autostabilizovaný oligonukleotid obsahující cílovou hybridizační oblast a autokomplementární oblast, přičemž cílová hybridizační oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci alespoň 8 nukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny z viru, patogenního organismu nebo buněčného genu a autokomplementární oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci 6, 8 nebo asi 10 nukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny obsažené v autostabilizovaném oligonukleotidu.
  20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující s e t i m , že autokomplementární oblast zahrnuje oligonukleotidovou sekvenci asi 10 nukleotidů, která je komplementární k sekvenci nukleové kyseliny obsažené v autostabilizovaném oligonukleotidu.
  21. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t i m , že cílová hybridizační oblast zahrnuje 4 nebo více sousedních deoxyribonukleotid fosfodiesterů, fosforothioátů nebo fosforodithioátů.
  22. 22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že cílová hybridizační oblast zahrnuje 4 nebo více sousedních deoxyribonukleotid fosfodiesterů, fosforothioátů nebo fosforodithioátů.
  23. 23. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t i m , že virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma virus, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  24. 24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma virus, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  25. 25. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t i m , že virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma virus, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  26. 26. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t i m , že virus je zvolen ze souboru zahrnujícího virus humánní imunodeficience, virus herpes simplex, humánní papilloma virus, chřipkový virus, virus kulhavky a slintavky, virus žluté zimnice, virus pásového oparu a virus mozaiky okurek.
  27. 27. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t i m , že patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  28. 28. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t i m , že patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  29. 29. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t i m , že patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  30. 30. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t i m , že patogenní organismus je zvolen ze souboru zahrnujícího Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Leishmania a Fasciola hepatica.
  31. 31. Způsob podle nároku 19, vyznačující s e tím, že buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  32. 32. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t i m , že buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  33. 33. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t i m , že buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
  34. 34. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t i m , že buněčný gen je zvolen ze souboru zahrnujícího protein prion, Alzheimerův protein typu amyloidu, onkogeny a protoonkogeny.
CZ943332A 1992-07-02 1993-07-02 Self-stabilized oligonucleotide and inhibition method of virus gene or pathogenic organism or cellular gene expression CZ333294A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90906992A 1992-07-02 1992-07-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ333294A3 true CZ333294A3 (en) 1995-07-12

Family

ID=25426596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ943332A CZ333294A3 (en) 1992-07-02 1993-07-02 Self-stabilized oligonucleotide and inhibition method of virus gene or pathogenic organism or cellular gene expression

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0649467B1 (cs)
JP (1) JPH08501928A (cs)
KR (1) KR950702626A (cs)
AT (1) ATE171210T1 (cs)
AU (1) AU4770093A (cs)
CA (1) CA2139319A1 (cs)
CZ (1) CZ333294A3 (cs)
DE (1) DE69321122D1 (cs)
FI (1) FI946201A0 (cs)
HU (1) HUT69981A (cs)
NZ (1) NZ255028A (cs)
PL (1) PL172710B1 (cs)
RU (1) RU94046425A (cs)
WO (1) WO1994001550A1 (cs)

Families Citing this family (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2703053B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-16 Genset Sa Oligonucleotides agrafes et semi-agrafes, procede de preparation et applications .
WO1995024477A1 (en) * 1994-03-08 1995-09-14 City Of Hope Human papillomavirus targeted ribozymes
US5631148A (en) * 1994-04-22 1997-05-20 Chiron Corporation Ribozymes with product ejection by strand displacement
WO2000022114A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
US20030044941A1 (en) 1996-06-06 2003-03-06 Crooke Stanley T. Human RNase III and compositions and uses thereof
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050032067A1 (en) * 2002-11-05 2005-02-10 Prakash Thazha P. Non-phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US6776986B1 (en) 1996-06-06 2004-08-17 Novartis Ag Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression
US7070925B1 (en) * 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
WO1998003646A1 (en) * 1996-07-22 1998-01-29 Hybridon, Inc. Compositions and methods for treating specific gene expression-related diseases and disorders in humans
DE19631919C2 (de) * 1996-08-07 1998-07-16 Deutsches Krebsforsch Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
US5886165A (en) * 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
BRPI9908967B1 (pt) 1998-03-20 2017-05-30 Benitec Australia Ltd processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta
AUPP249298A0 (en) * 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US8598332B1 (en) * 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
AU760041B2 (en) * 1998-04-08 2003-05-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
AU766499B2 (en) * 1998-06-23 2003-10-16 Medical Research Council Structured antisense nucleic acid molecules
JP4646404B2 (ja) 1998-07-02 2011-03-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 分子トーチ（ｔｏｒｃｈ）
BR9914772A (pt) * 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
US20060172925A1 (en) * 1998-10-26 2006-08-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
JP2002532388A (ja) * 1998-12-02 2002-10-02 イ・デ・エム・イミュノ−デジネ・モレキュル 生物学的分子を細胞中へ移入させやすくする新規なオリゴマーコンジュゲート
WO2000044914A1 (en) 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
AU2008202208C1 (en) * 1999-01-30 2014-04-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a defined gene
FR2790757B1 (fr) * 1999-03-09 2003-08-01 Bioalliance Pharma Oligonucleotides contenant une sequence antisens stabilises par une structure secondaire et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO2000058330A2 (en) * 1999-03-31 2000-10-05 Hybridon, Inc. Pseudo-cyclic oligonucleobases
DE19925073C2 (de) * 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US7419964B2 (en) 1999-09-16 2008-09-02 Cytogenix, Inc. Treatment of HSV-related pathologies using ssDNA
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
US8017742B2 (en) * 1999-11-10 2011-09-13 Japan Science And Technology Agency Gene carrier
DE10160151A1 (de) * 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
DE10100586C1 (de) * 2001-01-09 2002-04-11 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Ziegens
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
WO2001068836A2 (en) 2000-03-16 2001-09-20 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
US8202846B2 (en) 2000-03-16 2012-06-19 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and compositions for RNA interference
ATE450621T2 (de) 2000-03-30 2009-12-15 Whitehead Biomedical Inst Mediatoren von rns-interferenz, die rns- sequenzspezifisch sind
CA2408326A1 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 E.I. Dupont De Nemours And Company Recombinant constructs and their use in reducing gene expression
US20030190635A1 (en) * 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
US20080032942A1 (en) 2000-08-30 2008-02-07 Mcswiggen James RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
KR100872437B1 (ko) 2000-12-01 2008-12-05 막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우. Ｒｎａ 간섭을 매개하는 작은 ｒｎａ 분자
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
CA2369944A1 (en) 2001-01-31 2002-07-31 Nucleonics Inc. Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US20050159378A1 (en) 2001-05-18 2005-07-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050148530A1 (en) 2002-02-20 2005-07-07 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050256068A1 (en) 2001-05-18 2005-11-17 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7517864B2 (en) 2001-05-18 2009-04-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003070887A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF POLYCOMB GROUP PROTEIN EZH2 GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003070884A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MDR P-GLYCOPROTEIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
WO2003072590A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US20050014172A1 (en) 2002-02-20 2005-01-20 Ivan Richards RNA interference mediated inhibition of muscarinic cholinergic receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9994853B2 (en) 2001-05-18 2018-06-12 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8008472B2 (en) 2001-05-29 2011-08-30 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2609014T3 (es) 2001-07-12 2017-04-18 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
DE10133858A1 (de) * 2001-07-12 2003-02-06 Aventis Pharma Gmbh Synthetische doppelsträngige Oligonucleotide zur gezielten Hemmung der Genexpression
US7612194B2 (en) 2001-07-24 2009-11-03 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences from Diabrotica virgifera virgifera LeConte and uses thereof
ES2314099T3 (es) 2001-08-17 2009-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Oligonucleotidos inmunoestimulantes con motivos combinados con actividad mejorada.
DE10163098B4 (de) * 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
EP3415625A1 (en) 2002-02-01 2018-12-19 Life Technologies Corporation Double-stranded oligonucleotides
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US7897757B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8013143B2 (en) 2002-02-20 2011-09-06 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of CXCR4 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20090099117A1 (en) 2002-02-20 2009-04-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MYOSTATIN GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7928220B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8067575B2 (en) 2002-02-20 2011-11-29 Merck, Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of cyclin D1 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1448590A4 (en) * 2002-02-20 2004-12-15 Sirna Therapeutics Inc Inhibition of the myc and myb genes mediated by RNA interference mediated or genes of the corresponding synthetic pathways
US7662952B2 (en) 2002-02-20 2010-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of GRB2 associated binding protein (GAB2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7683166B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003207708A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
US7935812B2 (en) 2002-02-20 2011-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of hepatitis C virus (HCV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7700760B2 (en) 2002-02-20 2010-04-20 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of vascular cell adhesion molecule (VCAM) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7691999B2 (en) 2002-02-20 2010-04-06 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of NOGO and NOGO receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003213057A1 (en) * 2002-02-20 2003-09-09 Ribozyme Pharmaceuticals, Incoporated Rna interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (chk-1) gene expression using short interfering nucleic acid
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1476459A4 (en) * 2002-02-20 2005-05-25 Sirna Therapeutics Inc INHIBITION OF RNA INTERFERENCE-INDUCED CHROMOSOME TRANSLOCATION GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US20090253774A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR (PDGF) AND PLATELET DERIVED GROWTH FACTOR RECEPTOR (PDGFR) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7928219B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of placental growth factor gene expression using short interfering nucleic acid (SINA)
US7678897B2 (en) 2002-02-20 2010-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of platelet-derived endothelial cell growth factor (ECGF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP1432725A4 (en) * 2002-02-20 2005-03-30 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF TELOMERASEGENEXPRESSION WITH SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (SINA)
US20090253773A1 (en) 2002-02-20 2009-10-08 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF TNF AND TNF RECEPTOR GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7910724B2 (en) 2002-02-20 2011-03-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Fos gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667029B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of checkpoint kinase-1 (CHK-1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7897752B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of telomerase gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US7683165B2 (en) 2002-02-20 2010-03-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of interleukin and interleukin receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US9181551B2 (en) 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20090192105A1 (en) 2002-02-20 2009-07-30 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE (ICAM) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCELIC ACID (siNA)
US7893248B2 (en) 2002-02-20 2011-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of Myc and/or Myb gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7928218B2 (en) 2002-02-20 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of polycomb group protein EZH2 gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7795422B2 (en) 2002-02-20 2010-09-14 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of hypoxia inducible factor 1 (HIF1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7667030B2 (en) 2002-02-20 2010-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of matrix metalloproteinase 13 (MMP13) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
GB2397062B (en) 2002-02-20 2005-06-15 Sirna Therapeutics Inc RNA interference mediated inhibition of hepatitis c virus (HCV) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
JP2005517433A (ja) * 2002-02-20 2005-06-16 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 短干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いるＴＮＦおよびＴＮＦレセプタースーパーファミリー遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
AU2003228667A1 (en) * 2002-04-22 2003-12-19 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US20050042646A1 (en) 2002-08-05 2005-02-24 Davidson Beverly L. RNA interference suppresion of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
AU2012216354B2 (en) * 2002-08-05 2016-01-14 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
ES2280826T5 (es) 2002-08-05 2017-08-03 Silence Therapeutics Gmbh Nuevas formas adicionales de moléculas de ARN de interferencia
WO2004014933A1 (en) 2002-08-07 2004-02-19 University Of Massachusetts Compositions for rna interference and methods of use thereof
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
EP1556402B1 (en) 2002-09-25 2011-06-22 University of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
AU2003278957A1 (en) * 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
CA2749227A1 (en) 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US9150606B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
WO2004043979A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
FR2850971B1 (fr) * 2003-02-10 2006-08-11 Aventis Pharma Sa Oligonucleotide antisens inhibant l'expression de la proteine ob-rgrp et procede de detection de composes modifiant l'interaction entre la famille de la proteine ob-rgrp et le recepteur de la leptine
BRPI0408896A (pt) 2003-03-28 2006-04-25 Monsanto Technology Llc promotores de planta para uso no desenvolvimento precoce de sementes
CA2526690C (en) 2003-05-23 2014-01-14 Board Of Regents The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting ap-1 transcription factors
EP1526177A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut Curie Nucleic acids useful for triggering tumor cell lethality
US7476729B2 (en) 2003-10-24 2009-01-13 Institut Curie Dbait and uses thereof
CN101454451A (zh) 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
DE112004002170T5 (de) * 2003-11-10 2007-03-08 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen für RNA Interferenz
EP1793674B1 (en) 2003-11-26 2018-05-30 University of Massachusetts Sequence-specific inhibtion of small rna function
US7468431B2 (en) * 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
US20060075515A1 (en) * 2004-08-11 2006-04-06 Luethy Michael H Enhanced zein reduction in transgenic corn seed
JP2007523649A (ja) 2004-02-10 2007-08-23 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 多機能短鎖干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）を用い、ＲＮＡ干渉を介した遺伝子発現の阻害
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
DE602005023426D1 (de) 2004-03-25 2010-10-21 California Inst Of Techn Hybridisierungskettenreaktion
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
BRPI0509743A (pt) 2004-04-09 2007-09-25 Monsanto Technology Llc composições e métodos para controle de infestações de inseto em plantas
WO2005112636A2 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Kamel Khalili COMPOSITIONS AND METHODS FOR siRNA INHIBITION OF PRIMATE POLYOMAVIRUS GENES
US10508277B2 (en) 2004-05-24 2019-12-17 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified multifunctional short interfering nucleic acid molecules that mediate RNA interference
CA2568013C (en) 2004-05-27 2015-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant double-stranded ribonucleic acid
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
TWI386225B (zh) 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
MX2007008065A (es) * 2004-12-30 2008-03-04 Todd M Hauser Composiciones y metodos para modular la expresion genica usando oligonucleotidos autoprotegidos.
WO2006076423A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
US7727721B2 (en) 2005-03-08 2010-06-01 California Institute Of Technology Hybridization chain reaction amplification for in situ imaging
US8034994B2 (en) 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
CA2614295A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Anges Mg, Inc. Transcription factor decoy
US9297036B2 (en) 2005-07-01 2016-03-29 Agilent Technologies, Inc Nucleic acid probes for analysis of small RNAs and other polynucleotides
ES2614943T3 (es) 2005-09-16 2017-06-02 Monsanto Technology Llc Procedimientos para el control genético de infestaciones de insectos en plantas y composiciones de los mismos
MX348513B (es) 2005-09-16 2017-06-16 Devgen Nv Metodos para controlar plagas utilizando arni.
PT2275562E (pt) 2005-09-16 2016-01-26 Devgen Nv Métodos com base em plantas transgénicas para infestações em plantas utilizando arn de interferência¿
US7960357B2 (en) 2005-10-07 2011-06-14 California Institute Of Technology PKR activation via hybridization chain reaction
JPWO2007072909A1 (ja) 2005-12-22 2009-06-04 アンジェスＭｇ株式会社 新規オリゴヌクレオチド及びそれから成るＮＦ−κＢデコイ
ES2395842T3 (es) 2006-01-17 2013-02-15 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Composiciones y métodos para la humanización y optimización de N-glicanos en plantas
US7754475B2 (en) * 2006-01-25 2010-07-13 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid probes and microarrays for analysis of polynucleotides
US8129515B2 (en) 2006-01-27 2012-03-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of microRNAs
AR059433A1 (es) 2006-02-10 2008-04-09 Monsanto Technology Llc Identificacion y uso de genes blanco para el control de nematodos parasitos de plantas
CN105385679B (zh) 2006-02-13 2020-05-26 孟山都技术有限公司 选择和稳定dsRNA构建体
US20100184209A1 (en) 2006-02-17 2010-07-22 Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
EP2023936A4 (en) * 2006-05-05 2010-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND THEIR USES ASSOCIATED WITH THE ALPHA PTPR RECEPTOR
CN101195821A (zh) 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
US20100093836A1 (en) 2007-01-29 2010-04-15 Isis Pharmaceuticals, Inc Compounds and methods for modulating protein expression
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2008106658A2 (en) 2007-03-01 2008-09-04 California Institute Of Technology TRIGGERED RNAi
US9217151B2 (en) 2007-05-16 2015-12-22 California Institute Of Technology Versatile nucleic acid hairpin motif for programming biomolecular self-assembly pathways
MX2010001785A (es) * 2007-08-15 2010-03-10 Idera Pharmaceuticals Inc Moduladores de receptores tipo larga distancia.
US8497364B2 (en) 2008-02-27 2013-07-30 California Institute Of Technology Triggered RNAi
US8241854B2 (en) 2008-05-22 2012-08-14 California Institute Of Technology Triggered RNAi
EP2304031A2 (en) * 2008-06-11 2011-04-06 Bionucleon S.r.l. Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
JP2012523850A (ja) 2009-04-20 2012-10-11 モンサント テクノロジー エルエルシー 植物中の複数ウイルス抵抗性
EP2558578B1 (en) 2010-04-13 2015-10-28 Life Technologies Corporation Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function
US8658780B2 (en) 2010-05-18 2014-02-25 California Institute Of Technology Triggered covalent probes for imaging and silencing genetic expression
US8962241B2 (en) 2010-07-20 2015-02-24 California Institute Of Technology Triggered molecular geometry based bioimaging probes
US8877438B2 (en) 2010-07-20 2014-11-04 California Institute Of Technology Self-assembled polynucleotide structure
US9834439B2 (en) 2010-07-20 2017-12-05 California Institute Of Technology Biomolecular self-assembly
WO2012027206A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
EP3766975A1 (en) 2010-10-29 2021-01-20 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
AP2013007016A0 (en) 2010-12-30 2013-07-31 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to colepteran pests
BRPI1107329A2 (pt) 2010-12-30 2019-11-19 Dow Agrosciences Llc moléculas de ácido nucléico que direcionadas à subunidade h de atpase vacuolar que conferem resistência a pragas de coleópteros, vetor de transformação de planta, célula transformada, bem como métodos para controlar uma população de praga de coleóptero, controlar uma infestação pela dita praga, melhorar o rendimento de uma safra e para produzir uma célula transgênica
UY33854A (es) 2010-12-30 2012-07-31 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico que se dirigen a la subunidad c de la atpasa vacuolar y confieren resistencia a las plagas de coleópteros
EP2658976A4 (en) 2010-12-30 2014-10-22 Dow Agrosciences Llc NUCLEIC ACID MOLECULES THAT TARGET THE SMALL RHO1 PROTEIN BINDING THE GTP AND CONFERENCE RESISTANCE TO HARMFUL COLEOPTERS
WO2013090457A2 (en) 2011-12-12 2013-06-20 Oncoimmunin Inc. In vivo delivery of oligonucleotides
US9688983B2 (en) 2012-12-20 2017-06-27 Dow Agrosciences Llc Nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
EP2810952A1 (en) 2013-06-03 2014-12-10 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel pest control methods
US9856472B2 (en) 2013-07-01 2018-01-02 California Institute Of Technology Small conditional RNAs
US20150050738A1 (en) * 2013-08-16 2015-02-19 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating rna
WO2015095750A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Dow Agrosciences Llc Rnapii-140 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
BR102014031844A2 (pt) 2013-12-20 2015-10-06 Dow Agrosciences Llc ras oposto (rop) e moléculas de ácido nucleico relacionadas que conferem resistência a pragas de coleópteros e hemípteros
RU2016139492A (ru) 2014-03-12 2018-04-12 Дзе Юниверсити Оф Сидней Продукция рнк у высших растений
UY36113A (es) 2014-05-07 2015-10-30 Dow Agrosciences Llc Moléculas de ácido nucleico dre4 que confieren resistencia a plagas de coleópteros
CN105087554B (zh) * 2014-05-14 2017-09-22 武汉大学 Dna磷硫酰化修饰基因簇
EP3164113B1 (en) 2014-06-04 2019-03-27 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
WO2016028940A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Northwestern University Protein/oligonucleotide core-shell nanoparticle therapeutics
ES2811279T3 (es) 2014-12-22 2021-03-11 Fraunhofer Ges Forschung Moléculas de ácido nucleico de Nucampholin para controlar plagas de insectos coleópteros
WO2016130943A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Rana Therapeutics, Inc. Hybrid oligonucleotides and uses thereof
EP3067424A1 (en) 2015-03-13 2016-09-14 Dow AgroSciences LLC Rna polymerase i1 nucleic acid molecules to control insect pests
WO2016165729A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Novel aflatoxin and fungal infection control methods
BR102016012010A2 (pt) 2015-05-29 2020-03-24 Dow Agrosciences Llc Molécula de ácido nucleico, de ácido ribonucleico (rna) e de ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), usos de célula, planta e semente, produto primário, bem como métodos para controlar uma população de pragas coleópteras e/ou hemípteras, para melhorar o rendimento de uma cultura, e para produzir uma célula vegetal transgênica e uma planta transgênica
CN108431207A (zh) 2015-10-12 2018-08-21 美国陶氏益农公司 赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的wupa核酸分子
US12318489B2 (en) 2015-10-26 2025-06-03 Translate Bio Ma, Inc. Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
AU2016371636A1 (en) 2015-12-18 2018-06-21 Dow Agrosciences Llc Ribosomal protein L40 (RPL40) nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
WO2018009463A2 (en) 2016-07-05 2018-01-11 California Institute Of Technology Fractional initiator hybridization chain reaction
WO2018044939A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 California Institute Of Technology Immunohistochemistry via hybridization chain reaction
US10392620B2 (en) 2016-11-10 2019-08-27 Dow Agrosciences Llc Cytochrome B (CYTB) nucleic acid molecules that control pathogens
EP3342780A1 (en) 2016-12-30 2018-07-04 Dow AgroSciences LLC Pre-mrna processing factor 8 (prp8) nucleic acid molecules to control insect pests
US11696954B2 (en) * 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
EP3825408A1 (en) 2019-11-19 2021-05-26 FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Methods of multi-species insect pest control
US11873485B2 (en) 2021-01-26 2024-01-16 California Institute Of Technology Allosteric conditional guide RNAs for cell-selective regulation of CRISPR/Cas

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0547142A1 (en) * 1990-08-28 1993-06-23 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Solid support synthesis of 3'-tailed oligonucleotides via a linking molecule

Also Published As

Publication number Publication date
FI946201L (fi) 1994-12-30
HUT69981A (en) 1995-09-28
RU94046425A (ru) 1997-03-20
NZ255028A (en) 1997-03-24
CA2139319A1 (en) 1994-01-20
FI946201A7 (fi) 1994-12-30
AU4770093A (en) 1994-01-31
WO1994001550A1 (en) 1994-01-20
DE69321122D1 (de) 1998-10-22
FI946201A0 (fi) 1994-12-30
PL172710B1 (pl) 1997-11-28
EP0649467B1 (en) 1998-09-16
EP0649467A1 (en) 1995-04-26
HU9403788D0 (en) 1995-02-28
KR950702626A (ko) 1995-07-29
PL307025A1 (en) 1995-05-02
JPH08501928A (ja) 1996-03-05
ATE171210T1 (de) 1998-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6346614B1 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0649467B1 (en) Self-stabilized oligonucleotides as therapeutic agents
US5652355A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6143881A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0677056B1 (en) Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
US5929226A (en) Antisense oligonucleotide alkylphosphonothioates and arylphospohonothioates
WO1994002498A9 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5739308A (en) Integrated oligonucleotides
US6489464B1 (en) Branched oligonucleotides as pathogen-inhibitory agents
JP2001501614A (ja) 三つの構成成分からなるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
FR2703053A1 (fr) Oligonucléotides agrafes et semi-agrafes, procédé de préparation et applications .
Cohen History of research on antisense oligonucleotide analogs
CA2490644A1 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
Toulmé Oligonucleotides as Antiparasite Compounds