JPH08501928A - 治療剤としての自己安定化オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヌクレオ分解に対し耐性である改善されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。この種のオリゴヌクレオチドは自己安定化オリゴヌクレオチドと呼ばれ、２つの領域で構成される：すなわちウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子からの核酸配列に対し相補性であるヌクレオチド配列を有する標的ハイブリダイズ領域、および自己安定化オリゴヌクレオチド内に存在する核酸配列に対し相補性のオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補性領域からなっている。

Description

【発明の詳細な説明】 治療剤としての自己安定化オリゴヌクレオチド 発明の背景 １． 発明の技術分野 本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療手段に使用される新規な治療 剤に関する。より詳細には本発明は、ヌクレアーゼに対し向上した耐性を有する 改善されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するものである。 ２． 関連技術の要約 アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療原理は、他の病原体および遺伝 子発現の障害から生ずる病気状態に対し抗ウィルス剤および化学療法剤を合理的 に設計するための魅力的な手法を与える。治療原理は、標的核酸配列と相補性オ リゴヌクレオチドとの間の特異的結合に依存する。数種の刊行物は、この種の特 異的結合による遺伝子発現の抑制における相補性オリゴヌクレオチドの効能を示 している。 ザメチニクおよびステフェンソン、プロシーディング・ナショナル・アカデミ ー ・サイエンス、ＵＳＡ、第７５巻、第２８５〜２８８頁（１９７８）は、ウ ィルスゲノムの部分に対し相補性である１３量体合成オリゴデオキシヌクレオチ ドによる感染ニワトリ繊維芽細胞におけ るルース・サルコーマ・ウィルス複製の特異的抑制につき開示している。 ザメチニク等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー ・サイエンス、 ＵＳＡ、第８３巻、第４１４３〜４１４６頁（１９８６）は、ウィルスＲＮＡに 対し相補性の合成オリゴヌクレオチドホスホジエステルによる培養細胞における ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ−１、後にＨＴＬＶ−ＩＩＩと呼ばれる）の複 製および発現の抑制につき開示している。 極く最近、ヌクレオ分解に対しオリゴヌクレオチドホスホジエステルよりも高 い耐性を持ったオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして一 層高い効果を有することが報告された。アグローワル、Tibtech、第１０巻、第 １５２〜１５８頁（１９９２）は、抗ウィルス剤としての改変オリゴヌクレオチ ドの使用を徹底的に検討している。 サリン等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ ）第８５巻、第７４４８〜７４５１頁（１９８８）は、オリゴデオキシヌクレオ シドメチルホスホネートがＨＩＶ−１の抑制剤として従来のオリゴデオキシヌク レオチドよりも高い活性を有することを教示している。 アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、 ＵＳＡ）第８５巻、第７０７９〜７０８３頁（１９８８）は、オリゴヌクレオチ ドホス ホロチオエートおよび各種のオリゴヌクレオチドホスホルアミデートがＨＩＶ− １の抑制に関し従来のオリゴデオキシヌクレオチドよりも効果的であることを教 示している。 アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、 ＵＳＡ、第８６巻、第７７９０〜７７９４頁（１９８９）は、早期かつ慢性的な 感染細胞におけるＨＩＶ−１の抑制に際しオリゴヌクレオチドホスホロチオエー トが有利であることを開示している。 オリゴヌクレオチドをアンチセンス剤として一層効果的にする他の特徴は、Ｒ ＮアーゼＨを活性化する能力である。たとえばヌクレオ分解（nucleolytic degr adation）に対し耐性であると共にＲＮアーゼＨの活性化剤でもあるオリゴヌク レオチドホスホロチオエートは、ＨＩＶ−１および他の数種のウィルスの抑制剤 として有効である。 ガオ等、アンチマイクロバイオロジカル・エイジェンツ・アンド・ケミストリ ー、第３４巻、第８０８頁（１９９０）は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエ ートによるＨＳＶの抑制につき開示している。 ストーレイ等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１９巻、第４１０９頁 （１９９１）は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによるＨＰＶの抑制に つき開示している。 ライター等、プロシーディング・ナショナル・アカデ ミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８７巻、第３４３０頁（１９９０）は、オリゴヌ クレオチドホスホロチオエートによるインフルエンザウィルスの抑制につき開示 している。 残念ながら、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートはヌクレオ分解に対する 耐性を増大させるが、インビボにて完全な耐性を与えない。 アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、 ＵＳＡ、第８８巻、第７５９５〜７５９９頁（１９９１）は、オリゴヌクレオチ ドホスホロチオエートがマウスにて３′末端から徹底的に分解されることを教示 している。 さらに、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは、オリゴヌクレオチドと標 的との間にてオリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルよりも安定性の低い デュープレックスを形成する。これら欠点を解消するため、３′末端にキャップ 構造を有するオリゴヌクレオチドが開発された。アグローワルおよびグッドチャ イルド、テトラヘドロン・レタース、第２８巻、第３５３９〜３５４２頁（１９ ８７）は、５′および３′キャッピング剤としてのオリゴデオキシヌクレオシド メチルホスホネートの使用を開示している。ショー等、ヌクレイック・アシッズ ・リサーチ、第１９巻、第７４７〜７５０頁（１９９１）は、３′末端に封鎖構 造を有するオリゴデオキシヌクレオチドホスホジエステルを開示している。 テムサマニ等、アンチセンス・ストラテジース、アナルス・オブ・ニューヨー ク・アカデミー・オブ・サイエンス（出版中）（１９９２）は、３′キャップさ れたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを開示している。 これらヌクレアーゼ耐性の３′キャップされたオリゴヌクレオチドでさえ、こ れらオリゴヌクレオチドの３′キャップド末端がエンドヌクレアーゼとエキソヌ クレアーゼとの活性の組合せにより徐々に切断されるので最終的に分解されるよ うになる。 したがって安定なデュープレックスを形成すると共にヌクレオ分解に対し耐性 であり、さらにＲＮアーゼＨを活性化させ、しかも当業界で知られたオリゴヌク レオチドの欠点を持たないようなオリゴヌクレオチドにつきニーズが存在する。 理想的には、この種のオリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレ アーゼとの組合せ作用にも耐性であり、生理学的温度にて標的配列に対し安定に 対を形成し、ＲＮアーゼＨを活性化させ、さらに分解生成物としてヌクレオシド のみを産生すべきである。 ヘアピン形成をもたらしうる自己相補性構造を持ったオリゴヌクレオチドが当 業界で知られている。 ゲルマン等、バイオケミストリー、第２４巻、第５６９８〜５７０２頁（１９ ８５）は、β−ＤＮＡからＺ−ＤＮＡへの移行を行う部分自己相補性の２４量体 オリゴヌクレオチドｄ（ＧＣ）₅Ｔ₄（ＣＧ）₅を開示してい る。 ヒルバース等、バイオヒミー、第６７巻、第６８５〜６９５頁（１９８５）は 、部分自己相補性オリゴヌクレオチドすなわちｄＡＴＣＣＴＡＴ_nＴＡＧＧＡＴ におけるヘアピン形成の動力学につき検討している。 これら生理的研究はいずれも、オリゴヌクレオチドの安定性またはオリゴヌク レオチドの治療用途に関するものでない。 すなわち従来技術はアンチセンスオリゴヌクレオチド治療手段における自己相 補性オリゴヌクレオチドの使用に関し教示も示唆もしておらず、またオリゴヌク レオチドをヌクレオ分解に対し耐性にする手段としてのヘアピン構成の使用につ いても検討していない。 発明の簡単な要点 本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療手段に使用する新規な治療剤 に関するものである。本発明は、ヌクレオ分解に対し耐性である向上したアンチ センスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明によるオリゴヌクレオチドは、エ ンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼとの組合せ作用を含むヌクレオ分解に対 し耐性である。本発明によるオリゴヌクレオチドは生理学的条件下で標的配列と の安定なハイブリッドを形成すると共にＲＮアーゼＨを活性化し、さらに分解生 成物としてヌクレオシドのみを産生する。 自己安定化オリゴヌクレオチド（self-stabilized ol igonucleotides）として知られる本発明によるオリゴヌクレオチドの利点は２種 の構造的特徴の存在から生ずる：すなわち標的ハイブリダイズ領域および自己相 補性領域である。標的ハイブリダイズ領域は植物もしくは動物ウィルス、病原性 生物もしくは細胞遺伝子または遺伝子転写物、病気状態をもたらす異常な遺伝子 発現もしくは生成物からの核酸配列に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列 を含む。自己相補性領域は、オリゴヌクレオチド内の核酸配列に対し相補性であ るオリゴヌクレオチド配列を含む。したがって、少なくともオリゴヌクレオチド が標的核酸配列にハイブリダイズしない場合、オリゴヌクレオチドはヌクレオ分 解に対し耐性である全体的もしくは部分的に二本鎖の構造を形成する。これら分 子の固有の構造はヌクレアーゼに対し耐性を付与するので、この種の耐性を付与 すべく改変ヌクレオチド間結合を使用する必要はないが、改変結合を使用しうる ことは勿論である。たとえば、両者ともインビボにて分解するオリゴヌクレオチ ドホスホジエステルまたはオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの使用が、本 発明によるオリゴヌクレオチドによって可能となる。これはＲＮアーゼＨを活性 化させるオリゴヌクレオチド、すなわちアンチセンス治療用化合物に対する重要 な特徴をもたらす。さらにオリゴヌクレオチドホスホジエステルの使用は、治療 用オリゴヌクレオチドと標的配列との間の一層安定なハイブッリド化を与える。 最後に、この種のオリゴヌクレ オチドの分解はヌクレオチド分解生成物のみをもたらし、したがって潜在的な毒 性を最小化させる。これら利点は優秀な治療用オリゴヌクレオチドをもたらす。 さらに本発明は、その自己相補性の概念をリボヌクレオチドについても便利に 使用しうるので、自己安定化リボザイムをも提供する。本発明によるこの種のリ ボザイムは一般に典型的なリボザイム構造を有するが、ただしこれらは５′もし くは３′末端に或いはその近くに自己相補性領域を有する。この領域はリボザイ ムに対しヌクレアーゼ耐性を付与して、当業界で知られたリボザイムよりも安定 にする。 図面の簡単な説明 第１図はヘアピン配置およびハイブリダイズ配置における本発明による自己安 定化オリゴヌクレオチドを示す。 第２図はハンマー状配置における本発明による自己安定化オリゴヌクレオチド を示す。 第３図はオリゴヌクレオチドもしくは自己安定化オリゴヌクレオチドと相補性 標的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズに関するデュープレックス安定 性試験の結果を示す。 第４図はオリゴヌクレオチドの３′−エキソヌクレアーゼ処理の結果を示す。 第５図は実施例１〜４に使用した自己安定化オリゴヌクレオチドの構造を示す 。 第６図は自己安定化オリゴヌクレオチドの治療作用の メカニズムを示す。 第７図は本発明による自己安定化リボザイムを示す。本発明による自己安定化 リボザイムのこの例はＨＩＶｇａｇ領域に対し相補的であると共に、ＨＩＶ ｇ ａｇ ｎＲＮＡの切断をもたらす。 好適具体例の詳細な説明 本発明は、ウィルス感染、病原性生物による感染および異常な遺伝子発現もし くは遺伝子産生物から生ずる病気の処置に有用である新規な治療剤に関するもの である。 一面において本発明は、ヌクレオ分解に対し当業界で知られたオリゴヌクレオ チドよりも一層高い耐性を有する治療用自己安定化オリゴヌクレオチドを提供す る。本発明の目的で、オリゴヌクレオチドと言う用語はリボヌクレオチド、デオ キシリボヌクレオチドもしくはその両者のポリマーを包含し、リボヌクレオチド および／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーはアンチセンスオリゴヌクレ オチド技術にて公知である任意の結合を包含する５′→３′結合を介し互いに結 合される。さらに、オリゴヌクレオチドと言う用語は改変核酸塩基および／また は糖を有するような分子、並びにたとえはジアミン、コレステリルもしくは他の 親油性基のような追加置換基を有する分子を包含する。モノマーおよびモノマー 間結合の或る種の好適組合せにつき以下一層詳細に説明する。 本発明によるオリゴヌクレオチドは一般に２つの領域を有することを特徴とす る：すなわち標的ハイブリダイ ズ領域および自己相補性領域。本発明による自己安定化オリゴヌクレオチドの第 １具体例を第１図に示す。この具体例において標的ハイブリダイズ領域は連結し た四角形として示され、自己相補性領域は連結した円として示される。標的ＲＮ Ａ分子における相補性核酸配列は連結したダイヤモンド形で示され、ヌクレオチ ド間の水素結合は点によって示される。オリゴヌクレオチドは安定化され、すな わち標的ハイブリダイズ領域と自己相補性領域との間の塩基対により、および／ または自己相補性領域内の相補性配列間における塩基対により５′もしくは３′ 末端からのヌクレオ分解に対し耐性にされる。オリゴヌクレオチドが相補性核酸 配列を有する核酸分子に遭遇すれば、オリゴヌクレオチドにおける標的ハイブリ ダイズ領域と自己相補性領域との間の塩基対が切断されて、オリゴヌクレオチド の標的ハイブリダイズ領域と標的核酸分子の相補性核酸配列との間の塩基対によ って置換される。標的核酸配列と標的ハイブリダイズ領域との間のハイブリッド により形成される分子間塩基対構造が自己相補性オリゴヌクレオチドにより形成 される分子内塩基対構造よりも熱力学的に安定であるため、前記塩基対の破壊お よび置換が生ずる。この現象を第３図に示し、実施例４にて一層詳細に説明する 。 本発明によるオリゴヌクレオチドの第２の具体例は第１具体例と同様に作用す るが、自己相補性塩基対に関し異なる構造を形成する。この代案具体例は、第２ 図に示 したようなハンマー状構造を形成する。この具体例において自己相補性領域は自 己相補性領域内の他のオリゴヌクレオチド配列に対し塩基対を形成しうるオリゴ ヌクレオチド配列を含有する。この自己相補性領域は、標的ハイブリダイズ領域 に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列を含有してもよい。 本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域はウィルス、病原 性生物もしくは細胞遺伝子または遺伝子転写物、病気状態をもたらす異常な遺伝 子発現もしくはその生成物の核酸配列に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配 列を有する。好ましくは標的ハイブリダイズ領域は長さ約８〜約５０個のヌクレ オチドである。本発明の目的で「核酸配列に対し相補性であるオリゴヌクレオチ ド配列」と言う表現は、生理学的条件下でたとえばワトソン・クリック塩基対（ オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間の相互作用）により或いはフーグステー ン塩基対（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸との間の相互作用）により或いは他 の任意の手段により核酸配列に対しハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列 （２〜約５０個のヌクレオチド）を意味することを意図する。生理学的条件下で のこの種のハイブリダイズは、核酸配列の機能に対する阻害を観察して実用的に 測定される。 本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が相補性である核 酸配列は、処置すべき病気状態に応じて変化する。多くの場合、核酸配列はウィ ルス核 酸配列である。種々のウィルスを抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチ ドの使用は周知されており、最近ではアグローワル、Tibtech、第１０巻、第１ ５２〜１５８頁（１９９２）に検討されている。有効なアンチセンスオリゴヌク レオチドに対し相補性であるウィルス核酸配列はヒト免疫不全症ウィルスタイプ １（米国特許第４，８０６，４６３号、その開示を参考のためここに引用する） 、単純疱疹ウィルス（米国特許第４，６８９，３２０号、その教示を参考のため ここに引用する）、インフルエンザウィルス（米国特許第５，ＸＸＸ，ＸＸＸ号 、出願第０７／５１６，２７５号、１９９２年６月３０日付け特許；その教示を 参考のためここに引用する）およびヒト乳頭腫ウィルス（ストーレイ等、ヌクレ イック・アシッズ・リサーチ、第１９巻、第４１０９〜４１１４頁（１９９１） ）を包含する多くのウィルスにつき記載されている。任意のこれら核酸配列に対 し相補性の配列を、本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域 につき使用することができ、同様に他の任意のウィルスからの核酸配列に対し相 補性であるオリゴヌクレオチド配列も使用することができる。アンチセンスオリ ゴヌクレオチドを作成しうる公知の核酸配列を持った他のウィルスは口蹄疫ウィ ルス（Foot and Mouth Disease virus）［ロバートソン等、ジャーナル・バイロ ロジー、第５４巻、第６５１頁（１９８５）；ハリス等、ジャーナル・バイロロ ジー、第３６巻、第６５９頁（１ ９８０）参照］、黄熱病ウィルス［ライス等、サイエンス、第２２９巻、第７２ ６頁（１９８５）参照］、水痘−帯状疱疹ウィルス（バリセラ・ゾスターウィル ス、Varicella-Zoster Virus）［ダビソンおよびスコット、ジャーナル・ジェネ ラル・バイロロジー、第６７巻、第２２７９頁（１９８６）参照］およびキュウ リモザイクウィルス［リチヤード等、バイロロジー、第８９巻、第３９５頁（１ ９７８）参照］を包含する。 或いは本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域は、病原性 生物の核酸配列に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列を有することもでき る。多くの病原性生物の核酸配列、たとえばマラリヤ生物、熱帯熱マラリア原虫 （プラスモジウム・ファルシパルム、Plasmodium falciparam）および多くの病 原性細菌などが記載されている。この種の病原性生物からの核酸配列に対し相補 性のオリゴヌクレオチド配列は、本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブ リダイズ領域を形成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成 させうる公知の核酸配列を持った病原性真核生物の例はトリパノソマ・ブルセイ ・ガンビエンス（Trypanosoma brucei gambiense）およびリーシュマニア（Leis hmania）［キャンベル等、ネイチャー、第３１１巻、第３５０頁（１９８４）参 照］、肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hepatica）［ズリタ等、プロシ ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ）第 ８４巻、第２３４０頁（１９８７）参照］を包含する。 抗真菌性オリゴヌクレオチドはたとえばキチンシンセターゼ遺伝子からの核酸配 列に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列を持った標的ハイブリダイズ領域 を用いて作製することができ、さらに抗細菌性オリゴヌクレオチドはたとえばア ラニンラセマーゼ遺伝子を用いて作成することができる。 さらに他の具体例において本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダ イズ領域は細胞遺伝子もしくは遺伝子転写物、病気状態をもたらす異常な発現も しくは生成物に対し相補的なオリゴヌクレオチド配列を有することもできる。こ の種の数種の細胞遺伝子における核酸配列、たとえばプリオン（prion）蛋白質 ［スタールおよびプルシナー、FASEBジャーナル、第５巻、第２７９９〜２８０ ７頁（１９９１）］、アルツハイマー氏病に関連するアミロイド様蛋白質［米国 特許第５，０１５，５７０号、その教示を参考のためここに引用する］および種 々の周知されたオンコジーンおよびプロトオンコジーン、たとえばｃ−ｍｙｂ、 ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ａｂｌおよびｎ−ｒａｓなどが記載されている。さらに、精子 発生、精子運動、卵子に対する精子の結合、または他の任意の精子生存性に影響 を与える過程に主として或いは専ら関与する構造蛋白質または酵素の合成を抑制 するオリゴヌクレオチドは男性用の避妊薬として使用することができる。同様に 女性用の避妊薬は排卵、妊娠、着床また はこれら過程に関するホルモンの生合成に関与する蛋白質もしくは酵素を抑制す るオリゴヌクレオチドとすることができる。 高血圧症は、レニン／アンギオテンシン系におけるアンギオテンシン変換酵素 もしくは関連酵素の合成を抑制するオリゴデオキシヌクレオチドによって抑制す ることができ、血小板凝集は心筋および脳循環障害、梗塞、動脈硬化症、塞栓症 および血栓症に使用するトロンボキサンＡ２の合成に必要な酵素の合成を抑制し て調節することができ、動脈壁におけるコレステロールの沈着は脂肪アクリル補 酵素Ａ）すなわち動脈硬化症におけるコレステロールアシルトランスフェラーゼ の合成を抑制して阻止することができ、コリンホスホトランスフェラーゼの合成 の抑制が低脂症に有用である。 ハイブリダイズ手段を用いて障害の悪作用を低下させ或いは除去する多くの神 経障害が存在する。たとえば、モノアミンオキシダーゼの合成の抑制をパーキン ソン氏病に使用することができ、カテコールｏ−メチルトランスフェラーゼの抑 制を用いて抑鬱症を処置することができ、さらにインドールＮ−メチルトランス フェラーゼの抑制を用いて精神分裂症を処置することができる。 プロスタグランジンおよびロイコトリエンをもたらすアラキドン酸カスケード での選択された酵素を抑制することが血小板凝集、アレルギー、炎症、疼痛およ び喘息の抑制に有用である。 各種の抗癌剤に対し耐性を発生させる原因となりかつ化学療法における主たる 手段であるマルチドラッグ耐性（ｍｄｒ）遺伝子により発現される蛋白質の抑制 は癌の処置に有益であることが証明される。これら任意の遺伝子からの核酸配列 に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列を、本発明によるオリゴヌクレオチ ドの標的ハイブリッド化領域につき使用することができ、同様に他の任意の細胞 遺伝子もしくは遺伝子転写物、病気状態をもたらす異常な発現もしくはその産生 物に対し相補性のオリゴヌクレオチド配列も使用することができる。 植物細胞における遺伝子発現のアンチセンス調整については、参考のためここ に引用する米国特許第５，１０７，０６５号の教示に記載されている。 第２面において本発明は、ＲＮアーゼＨを活性化させるヌクレアーゼ耐性のオ リゴヌクレオチドを提供する。本発明によるオリゴヌクレオチドの標的ハイブリ ダイズ領域はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオ チドもしくはデオキシリボヌクレオチドの任意の同族体を含有することができる 。１つの好適具体例において、この領域はリボヌクレオチドで構成される。他の 好適具体例において、この領域はデオキシリボヌクレオチドで構成される。さら に他の好適具体例において、この領域はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレ オチドとの混合物で構成される。さらに他の好適具体例は、オリゴヌクレオチド ホスホジエステル、ホスホ ロチオエートもしくはホスホロジチオエート、またはこれらとリボヌクレオチド もしくはデオキシリボヌクレオチドとの混合物からなる標的ハイブリダイズ領域 を有する。これら好適具体例は全て、４個もしくはそれ以上の隣接デオキシリボ ヌクレオチドホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエ ートが存在する限り、ＲＮアーゼＨの活性化をもたらす。勿論、ＲＮアーゼＨを 活性化させない標的ハイブリダイズ領域を用いる他の具体例も作成することがで きる。 これら各具体例の合成法は当業界にて周知されている。オリゴデオキシリボヌ クレオチドホスホジエステルとオリゴデオキシリボヌクレオチドホスホロチオエ ートとの両者、およびその同族体は米国特許第５，ＸＸＸ，ＸＸＸ号（出願Ｎｏ ．０７／３３４，６７９号、１９９２年３月１９日付け特許、その教示を参考の ためここに引用する）に記載されたＨ−ホスホネート手段によって合成すること ができる。さらにＨ−ホスホネート手段を用いて、アグローワルおよびタング、 テトラヘドロン・レタース、第３１巻、第７５４１〜７５４４頁（１９９０）に 記載されたオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド同族体を合成 することもできる。オリゴヌクレオチドホスホロジチオエートの合成も当業界で 知られている。 勿論、他の多くの具体例も可能であり、当業者は他の同族体または同族体の組 合せを本発明によるオリゴヌク レオチドの標的ハイブリダイズ領域に使用しうることを了解するであろう。この 種の同族体は、天然ホスホジエステル結合とは異なるヌクレオチド間結合を有す ることを特徴とする。この種の多くの同族体の合成は当業界で周知されており、 アルキルホスホネート［アグローワルおよびグッドチャイルド、テトラヘドロン ・レタース、第２８巻、第３５３９〜３５４２頁（１９８７）］またはホスホル アミデート［アグローワル等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ イエンス、ＵＳＡ、第８５巻、第７０７９〜７０８３頁（１９８８）］結合を有 する同族体を包含する。 本発明による自己安定化オリゴヌクレオチドの第２の重要な領域は自己相補性 領域である。この自己相補性領域は、オリゴヌクレオチド内の他のオリゴヌクレ オチド配列に対し相補性であるオリゴヌクレオチド配列を有する。これら他のオ リゴヌクレオチド配列は標的ハイブリダイズ領域内または自己相補性領域内とす ることができ、或いはこれらは両領域にまたがることもできる。これら相補性配 列は塩基対を形成して、第１図に示したヘアピン構造を形成し或いは第２図に示 したハンマー状構造を形成する。ヘアピン構造またはハンマー状構造は第１図に ヘアピン構造につき示した非塩基対ヌクレオチドから生ずるループを有すること ができ、或いはハンマー状構造につき第２図に示したようにこれらループを欠如 することもできる。自己相補性領域を含む分子内ハイブリッ ド化により形成される塩基対の個数は変化してもよいが、３′末端がエンドヌク レアーゼに到達しえないよう二本鎖構造を維持するのに充分とすべきである。一 般に、この種の二本鎖構造を維持するには約４個もしくはそれ以上の塩基対を必 要とする。好適具体例において、自己安定化オリゴヌクレオチドには約１０個の 分子内塩基対が形成され、１０個の塩基対が連続すると共に３′−最大のヌクレ オチドを含む。勿論、分子内塩基対は、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドを 含むよう広範囲とすることができる。好ましくは、これは約５０個もしくはそれ 以下のヌクレオチドの自己相補性領域を含む。 １つの好適具体例において、自己相補性領域は適する非核酸リンカーにより標 的ハイブリダイズ領域に結合することができる。この種のリンカーの例は置換も しくは非置換のアルキル基を包含する。特に好適な１具体例において、リンカー は（エチレングリコール）_1-6リンカーである。より大きい寸法のこのリンカー につき、合成は１端部にジメチルトリチル保護基を有すると共に他端部にシアノ エチルホスホルアミダイト基を有する市販のトリエチレングリコールを用いて便 利に行うことができる。 自己相補性領域はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工結合を 有するリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの同族体、またはこ れら任意の組合せを含むことができる。ＲＮアーゼＨを活性化 する能力は自己相補性領域では重要でなく、したがってＲＮアーゼＨを活性化さ せない人工結合を有するヌクレオチドもオリゴヌクレオチドの効果を減少させる ことなくこの領域に使用することができる。すなわち、ホスホジエステルおよび ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート結合の他に、この領域はさら に或いは代案としてホスホルアミデート（Ｎ−置換ホスホルアミデートを含む） 、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート結合、並びに、たとえば スルホン、サルフェートおよびケト結合など非ホスフェート含有結合を含むこと ができる。勿論、本発明による自己安定化オリゴヌクレオチドの非ＲＮアーゼＨ 活性化の具体例において、これら任意の結合を標的ハイブリダイズ領域にも使用 することができる。 １つの好適具体例において、自己安定化オリゴヌクレオチドは高安定化される 。これは、自己相補性領域に１個もしくはそれ以上のリボヌクレオチドもしくは ２′−Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオチド（ここで標的ハイブリダイズ領域の相補性部 分はＤＮＡである）を組み込んで達成することができる。或いは、標的ハイブリ ダイズ領域の相補性領域はリボヌクレオチドもしくは２′−Ｏ−Ｍｅ−リボヌク レオチドを含有することもでき、さらに自己相補性領域はＤＮＡを含有すること もできる。これらオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の相互作用がＤ ＮＡとＤＮＡとの間の相互作用よりも安定であるた め高安定化される。自己相補性領域（および／またはリンカー領域）を改変して 高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチドを生成させうる他の方法は、１個 もしくはそれ以上のインターカレート剤分子を組み込むことである。これらオリ ゴヌクレオチドは、インターカレート剤が自己相補性領域と標的ハイブリダイズ 領域との間で形成されるハイブリッドを安定させるので、高安定化される。この 目的には任意のインターカレート剤が可能である。好適インターカレート剤はア クリジンおよびエチジウムを包含する。アクリジンを含有するオリゴヌクレオチ ドは、市販のアクリジン−ＯＮホスホルアミダイトまたは３′−アクリジン−Ｏ Ｎ ＣＰＧ（クロンテク・ラボラトリース・インコーポレーション社）を用いて 容易に作製される。 第３の面において本発明は、当業界で知られたリボザイムよりも安定性の高い リボザイムを提供する。リボザイムはヌクレオチド間の結合を切断する触媒性Ｒ ＮＡ分子である。この種の本発明によるリボザイムの安定性は、リボザイム分子 の５′末端もしくは３′末端に或いはその近くに自己相補性領域を組み込んで与 えられる。この自己相補性領域はヘアピン構造もしくはハンマー状構造を形成さ せて分子の５′末端もしくは３′末端を二本鎖となし、リボザイム分子をヌクレ オ分解に対し耐性にする。リボザイムの構造および機能については一般に米国特 許第４，９８７，０７１号（その教示を参考のためこ こに引用する）に教示されている。 第４の面において本発明はウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺伝子 発現を抑制する方法を提供し、この方法は本発明による自己安定化オリゴヌクレ オチドもしくはリボザイムを、前者の２種の場合にはウィルスまたは病原性生物 で感染した細胞に或いは後者の場合には一般に細胞に施す工程からなっている。 第５面において本発明は、病気がウィルスもしくは病原性生物から或いは細胞 遺伝子の異常な発現もしくは生成物から生ずる発病した人間もしくは動物の処置 方法を提供する。この方法は、医薬上許容しうるキャリヤにおける本発明による 自己安定化オリゴヌクレオチドを発病した人間もしくは動物に投与することから なっている。好ましくは、この種の投与のルートは経口、鼻腔内、肛門内および 局所投与を包含する。本発明によるこの種の処置方法において、自己安定化オリ ゴヌクレオチドは他の治療剤、たとえばエイズの場合にはＡＺＴと組合せて投与 することができる。 たとえばエイズ、ＡＲＣ、口腔もしくは生殖器ヘルペス、乳頭腫イボ、インフ ルエンザ、口蹄疫、黄熱病、水痘、帯状疱疹、ＨＴＬＶ−白血病および肝炎を包 含する各種のウィルス病を本発明の処置法で処置することができる。本発明の処 置法により処置しうる真菌病にはカンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコッ カス症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、スポロトリクス症、 クロモミコーシス、デマトフィトーシス（dematophytosis）およびコクシジオイ デス症がある。さらに、この方法はリケッチャ症（たとえばチフス、ロッキー山 紅斑熱）、並びにトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）により引起 される性的感染症または性病性リンパ肉芽腫（リンフォグラヌローマ・ベネレウ ム、Lymphogranuloma venereum）を処置するにも使用することができる。たとえ ばアメーバ症、シャーガス病、トキソプラスマ症・ニューモシスティス症、ラム ブル鞭毛虫症、クリプトスポリジオシス（cryptosporidiosis）、トリコモナス 症およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carini）肺炎；さらに蠕虫 （蠕虫病）、たとえば回虫病、フィラリヤ症、施毛虫症、住血吸虫症および線虫 もしくは条虫感染などを含む各種の寄生虫病も本発明の方法により処置すること ができる。Ｐ．ファルシパルム（P．falciparum）、Ｐ．ビバックス（P．vivax ）、ｐ．オラレ（P．orale）もしくはＰ．マラリア（P．malariae）によって発 生したかどうかに拘らず、本発明の処置法によりマラリアも処置することができ る。 上記感染症は全てこれら病気の感染源が既知であるため本発明の処置方法によ り処置することができ、したがって感染源の増殖につき必須の核酸配列、たとえ ば必須の遺伝子である核酸配列に対し相補性のオリゴヌクレオチド配列を持った 標的ハイブリダイズ領域を有する本発明の自己安定化オリゴヌクレオチドを作製 することがで きる。 本発明の方法により処置しうる他の病気状態もしくは症状は、細胞遺伝子の異 常な発現もしくは産生物から生ずる。これら症状は本発明による自己安定化オリ ゴヌクレオチドの投与により処置することができ、これについては既に上記した 通りである。 本発明は、当業界で知られたオリゴヌクレオチドよりも多くの利点を有する。 第１に、本発明による自己安定化オリゴヌクレオチドは大抵の公知オリゴヌクレ オチドよりも長い半減期を有し、したがって治療効能に必要とされる投与量を減 少させる。オリゴヌクレオチドの１末端もしくは両末端におけるキャップ構造ま たはその近くのヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド間結合を用いて、ヌクレアーゼ 分解に対する一層高い耐性を得ることができる。第２に、自己相補性配列を含む 塩基対構造により与えられる酵素安定性は、急速に分解されるようなオリゴヌク レオチドホスホジエステルの使用を可能にする。これは、当業界で知られたヌク レアーゼ耐性オリゴヌクレオチドによっては得られないような増大したデュープ レックス安定性およびＲＮアーゼＨ活性化の利点を与える。ＲＮアーゼＨ活性化 の利点は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエー トを使用すれば保持される。第３の利点は、本発明によるオリゴヌクレオチドの 数種の具体例における唯一の分解生成物がヌクレオチド、たとえばヌクレオシド モノホスフェート および／またはヌクレオシドモノチオホスフェートであることにある。最後に、 本発明はデオキシリボヌクレオシドもしくはリボヌクレオシドの使用をも可能に する。後者を使用する能力は、本発明を酵素安定性が重要であるリボザイムに使 用することを容易に可能にする。 以下、本発明を限定するものでないが、実施例により本発明の或る種の好適具 体例につき説明する。 実施例１ オリゴヌクレオチドホスホジエステルのヌクレアーゼ耐性 試験に使用したオリゴヌクレオチドを第５図に示す。オリゴヌクレオチドＣＭ ＰＤ ＡはＨＩＶ−１のｇａｇ領域の１部に対し相補性である。オリゴヌクレオ チドＣＭＰＤ Ｂは標的ハイブリダイズ領域と同じ領域を使用するが、１０個の ヌクレオチドよりなる３′自己相補性領域を付加する。オリゴヌクレオチドＣＭ ＰＤ ＥおよびＣＭＰＤ ＦはＣＭＰＤ Ｂと同一であるが、ただしＣＭＰＤ ＥおよびＣＭＰＤ Ｆの自己相補性領域はそれぞれ６個および４個のヌクレオチ ドである。オリゴヌクレオチドＣＭＰＤ ＧはＣＭＰＤ Ａと同一であるが、た だしこれはその３′末端に付加された１０個のミスマッチのヌクレオチド（Ｔ₁₀ ）を有する。 これらオリゴヌクレオチドを３′エキソヌクレオ分解に対する相対的耐性につ き試験した。各オリゴヌクレオ チドにつき０．４Ａ₂₆₀単位のオリゴヌクレオチドを凍結乾燥させ、０．５ｍＬ の緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．５）に溶解させ、 ５μｌ（１．５ミリ単位）のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）と混合し た。この混合物を熱制御されたセル内で３７℃にてインキュベートし、Ａ₂₆₀を 時間に対しプロットした。オリゴヌクレオチド分解を濃色性（hyperchromicity ）の増加の関数として測定した。 これら実験の結果を下表Ｉに示す。これらの結果が示すように、本発明による 自己安定化オリゴヌクレオチドホスホジエステルはオリゴヌクレオチドホスホジ エステルもしくは非相補性テールを有するオリゴヌクレオチドホスホジエステル のいずれよりも３′エキソヌクレオ分解に対しずっと耐性が大である。 上記試験の他に、オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼＩ ３′−エキソ ヌクレアーゼ切断にかけた。第４図に示すように、非自己安定化オリゴヌクレオ チドＣＭＰＤ ＡおよびＧは３０分間で完全に切断されたのに対し、自己安定化 ＣＭＰＤ Ｂは３０分間で極く部分的にのみ切断された。 第Ｉ表 オリゴヌクレオチドの半減期 オリゴヌクレオチド ＳＶＰＤ切断に対するｔ_1/2 ＣＭＰＤ Ａ ７５秒 ＣＭＰＤ Ｇ ７５秒 ＣＭＰＤ Ｂ ９５０秒 実施例２ オリゴヌクレオチドホスホロチオエートのヌクレアーゼ耐性 自己安定化および非自己安定化オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの相対 的ヌクレアーゼ耐性を試験するためＤＮＡポリメラーゼＩ ３′−エキソヌクレ アーゼ活性分析を用いた。何故なら、ＳＶＰＤではオリゴヌクレオチドホスホロ チオエートがゆっくりと分解するからである。 全オリゴヌクレオチドを５′末端にてγ−³²Ｐ−ＡＴＰおよびキナーゼで標識 した。２０μｌの緩衝液（４０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂、５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ）にお ける４０ｐモルの５′−標識オリゴヌクレオチドの溶液に５単位のＤＮＡポリメ ラーゼＩを添加し、３７℃でインキュベートした。４μｌづつを０分間、３０分 間、６０分間および１２０分間で採取し、６ μＬの停止溶液（９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレン シアノール、０．１％ブロモフェノールブルー）と混合した。これら試料を１５ ％アクリルアミドゲル（尿素）および放射能写真によって分析した。 結果を第４図に示す。ＣＭＰＤ Ａのホスホロチオエート同族体は４時間以内 にほぼ５０％まで切断された。しかしながら、ＣＭＰＤ Ｂのホスホロチオエー ト同族体は４時間後にも未分解であった。ＣＭＰＤ ＥおよびＦ（これらはそれ ぞれ自己相補性配列の６および４塩基対を有する）のホスホロチオエート同族体 も安定であることが判明した。延長構造を有するが自己相補性領域を持たないＣ ＭＰＤ Ｇのホスホロチオエート同族体はＣＭＰＤ Ａと同じ速度で切断された 。これらの結果が示すように、自己安定化オリゴヌクレオチドホスホロチオエー トは非自己安定化オリゴヌクレオチドホスホロチオエートよりもヌクレオ分解に 対しずっと耐性が大である。 実施例３ オリゴヌクレオチドの抗−ＨＩＶ活性 自己安定化および非自己安定化オリゴヌクレオチドホスホジエステルを、組織 培養におけるＨＩＶ−１の抑制能力につき試験した。この試験に使用したオリゴ ヌクレオチドを第５図に示す。 Ｈ９リンパ球にＨＩＶ−１ビリオン（＝０．０１〜０．１ＴＣＩＤ₅₀／細胞） を３７℃にて１時間にわたり感染 させた。１時間の後、未吸着のビリオンを洗浄し、感染細胞を２４穴プレートの 各穴に分配した。感染細胞に、適する濃度（保存溶液から）のオリゴヌクレオチ ドを添加して２ｍｌ媒体における所要の濃度を得た。陽性対照実験においてはｄ ｄＣもしくはＡＺＴを添加した。これら細胞を次いで３日間培養した。３日間の 後、感染培養物からの上澄液を集め、ｐ２４発現につきＥＬＩＳＡで測定した。 ｐ２４の発現レベルを、オリゴヌクレオチド処理と未処理（薬物なし）との感染 細胞の間で比較した。 オリゴヌクレオチドの細胞毒性を、細胞を増加濃度のオリゴヌクレオチドと共 に培養し、トリパンブルー色素排除法によって試験した。 ２種の実験の結果を下表ＩＩＩに示す。 表ＩＩＩ表 オリゴヌクレオチドの抗−ＨＩＶ活性 全ての自己安定化オリゴヌクレオチドはＣＭＰＤ Ａ（すなわち非自己安定化 オリゴヌクレオチド）よりも高い抗−ＨＩＶ活性を示した。最大の活性が１０個 の自己相補性ヌクレオチドを有する自己安定化オリゴヌクレオチドにつき観察さ れ、これはオリゴヌクレオチドホスホジエステルの活性のほぼ１０倍を示した。 ポリＴテールを有するオリゴヌクレオチドＣＭＰＤ Ｇも或る程度の活性増加を 示したが、これは恐らくＨ９細胞におけるｍＲＮＡからのポリＡとのハイブリダ イズによる安定化の結果である。 ＣＭＰＤ Ｂオリゴヌクレオチドの作用の推定メカニズムを第６図に示す。オ リゴヌクレオチドは、自己相補性領域に関与する分子内塩基対の結果として部分 二本鎖型で細胞に入る。オリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドの標的 ハイブリダイズ領域におけるオリゴヌクレオチド配列に対し相補性の核酸配列を 有するＨＩＶ ＲＮＡ分子に遭遇すると際、ＨＩＶ ＲＮＡと標的ハイブリダイ ズ領域との間でハイブリッドが生ずる。このハイブリッドは自己相補性領域を含 む分子内ハイブリダイズを破壊する。次いでＲＮアーゼＨ活性はＨＩＶ ＲＮＡ を切断して、オリゴヌクレオチドを分子内塩基対により再び自己安定化させる。 追加オリゴヌクレオチド構造の相対的な抗−ＨＩＶ活性を試験するため、追加 オリゴヌクレオチド並びに実験１および２に記載したオリゴヌクレオチドを用い て上記 実験を反復した。追加オリゴヌクレオチドを第５図に示す。これら追加オリゴヌ クレオチドは自己相補性領域がその５′末端にわたりオリゴヌクレオチドに対し て相補性であるＣＭＰＤ Ｃ；８ヌクレオチドの自己相補性領域を有するＣＭＰ Ｄ Ｄ；およびＣＭＰＤ Ｈ、すなわちＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡに対し完全な相 補性を有するが自己相補性領域を持たない３５量体オリゴヌクレオチドとした。 この第３の実験の結果を下表ＩＶに示す。 これら結果が示すように、完全自己相補性の自己安定化オリゴヌクレオチドは 部分自己相補性の自己安定化オリゴヌクレオチドとほぼ均等な抗−ＨＩＶ活性を 有する。さらに、これら結果は４種の自己相補性ヌクレオチドが向上した効果を 付与するのに充分であることをも示す。 第ＩＶ表 オリゴヌクレチドの抗−ＨＩＶ活性 第ＩＶ表 （続き） オリゴヌクレチドの抗−ＨＩＶ活性 実施例４ 自己安定化オリゴヌクレオチドと相補性 オリゴスとの間のデュープレックスの安定性 自己安定化オリゴヌクレオチドと相補性核酸配列との間で形成されるデュープ レックスの安定性を試験するため、ハイブリダイズ試験を行った。第１の試験に て自己相補性配列を欠如するオリゴヌクレオチドＣＭＰＤ Ａを室温にて相補性 ２５量体オリゴヌクレオチドと混合した。次いで、この混合物を徐々に加熱し、 濃色性の増加を温度の上昇に対しプロットした。この試験（その結果を第３図に 点線で示す）にて、デュープレックスのメルト（融解）温度は約６５℃であると 判明した。 第２の試験において、ＣＭＰＤ Ａと同じ標的ハイブリダイズ領域と１０ヌク レオチドの自己相補性領域とを有するＣＭＰＤ Ｂを同じ２５量体オリゴヌクレ オチドと室温にて混合した。次いで混合物を徐々に加熱し、濃色性の増加を温度 の上昇に対しプロットした。その結果を第３図に実線で示す。今回は、約６５℃ で観察されるメルトの他に、濃色性の早期増加が約５８℃で観察され、これはヘ アピン構造の分子内水素結合のメルトに相当する。この結果は、自己相補性領域 を含む分子内塩基対が標的ハイブリダイズ領域と相補性オリゴヌクレオチドとの 間の分子間塩基対よりも熱力学的に低い安定性を有することを示す。 分子内塩基対に対する分子間塩基対の安定性増大をさ らに試験するため、ＣＭＰＤ Ｂを同じ相補性２５量体オリゴヌクレオチドと混 合し、８０℃まで加熱し、次いで室温まで冷却させた。次いで、この混合物を徐 々に加熱すると共に濃色性の増加を温度の上昇に対しプロットした。その結果を 第３図に破線で示す。約６５℃の単一のメルト温度のみが観察され、これはＣＭ ＰＤ Ｂと相補性２５量体オリゴヌクレオチドとの間の分子間塩基対が、自己相 補性領域を含む分子内塩基対と比較して好適であることを示す。 これらの結果は、自己安定化オリゴヌクレオチドが、標的ハイブリダイズ領域 に対し相補性であるオリゴヌクレオチド内のオリゴヌクレオチド配列の存在にも 拘らず、相補性核酸配列に対しハイブリダイズすることを示す。或る種のオリゴ ヌクレオチド構造は他の種類のオリゴヌクレオチド構造よりも安定的にハイブリ ダイズする（たとえばＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド＞ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッ ドおよびホスホジエステル含有するオリゴス＞ホスホロチオエートメチルホスホ ネートもしくはホスホルアミデート含有オリゴス）ことが周知されているので、 これらの結果は好適な標的ハイブリダイズ効果を、標的ハイブリダイズ領域と標 的配列との間のハイブリダイズが自己相補性領域を含むハイブリダイズよりも安 定な対形成オリゴヌクレオチド構造を含むよう自己安定化オリゴヌクレオチドを 設計して向上させうることを示す。 当業者は、自己相補性領域を上記の教示により作成し て広範な種類の標的ハイブリダイズ領域と組合せうることを了解するであろう。 実施例５ 高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチド 自己相補性領域と標的ハイブリダイズ領域との間の一層安定な相互作用を有す るオリゴヌクレオチドを得るため自己相補性領域に２−Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオ シドを有するオリゴデオキシヌクレオシドホスホジエステルもしくはオリゴデオ キシヌクレオシドホスホロチオエートを作製した。下表Ｖに示すように、この種 のオリゴヌクレオチドは自己相補性領域と標的ハイブリダイズ領域との間の高安 定化された相互作用を有する。しかしながら、これらオリゴヌクレオチドは、分 子内ハイブリッドを含有する分子と比較し、相補性ＤＮＡとの分子間ハイブリッ ドの形成に好適である。 第Ｖ表 自己相補性領域に２−Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオチド を有する自己安定化オリゴヌクレオチドの デュープレックス安定性 他の種類の高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチドを、アクリジン分子 を自己相補性領域の末端に共有結合させて作製した。これら分子は、標的ハイブ リダイズ領域と自己相補性領域との間の相互作用の高安定性をも示した。しかし ながら、これら分子は分子内ハイブリッドの成形と比較し相補性ＤＮＡとの分子 間ハイブリッドを優先的に形成した。 第ＶＩ表 自己相補性領域にインターカレート剤を有する自己安定化オリゴヌクレオチ ドのデュープレックス安定性 これらの結果は、自己相補性領域と標的ハイブリダイズ領域との間の極めて安 定な相互作用を有するが標的核酸との分子間ハイブリッドを形成するオリゴヌク レオチドの能力を阻害しない高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチドを作 製しうることを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年８月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １． 標的ハイブリダイズ領域と自己相補性領域とからなる自己安定化オリゴヌ クレオチドであって、標的ハイブリダイズ領域はウィルス、病原性生物もしくは 細胞遺伝子からの核酸配列に対し相補性の少なくとも８個のヌクレオチドのオリ ゴヌクレオチド配列を含み、自己相補性領域は自己安定化オリゴヌクレオチド内 に存在する核酸配列に対し相補性の６個、８個もしくは約１０個のヌクレオチド のオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする自己安定化オリゴヌクレオチ ド。 ２． 標的ハイブリダイズ領域が４個もしくはそれ以上の隣接するデオキシリボ ヌクレオチドホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエ ートを含む請求の範囲第１項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 ３． 自己相補性領域がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドホ スホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ ート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエー トおよびアルキルホスホノチオエートよりなる群から選択されるヌクレオチドで ある請求の範囲第１項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 ４． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウィ ルス、インフルエンザウィルス、 口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルスおよびキュウリモザ イクウィルスよりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の自己安定化オ リゴヌクレオチド。 ５． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、Pl asmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Tripanosoma brucei）、リ ーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hep atica）よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の自己安定化オリゴ ヌクレオチド。 ６． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質およ びオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の範 囲第１項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 ７． 自己相補性領域がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドホ スホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ ート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネートおよびアルキルホスホノチオ エートよりなる群から選択されるヌクレオチドである請求の範囲第２項に記載の 自己安定化オリゴヌクレオチド。 ８． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウィ ルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯状 疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選 択される請求の範囲第２項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 ９． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、Pl asmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Tripanosoma brucei）、リ ーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hep atica）よりなる群から選択される請求の範囲第２項に記載の自己安定化オリゴ ヌクレオチド。 １０． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第２項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １１． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第３項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １２． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypansoma brucei）、リ ーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hep atica）よりなる群から選択される請求の範囲第３項に記載の自己安定化オリゴ ヌクレオチド。 １３． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第３項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １４． 標的ハイブリダイズ領域が約８〜約５０個のヌクレオチドからなり、自 己相補性領域が６個、８個もしくは約１０個のヌクレオチドからなる請求の範囲 第１項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １５． 標的ハイブリダイズ領域が約８〜約５０個のヌクレオチドからなり、自 己相補性領域が６個、８個もしくは約１０個のヌクレオチドからなる請求の範囲 第２項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １６． 標的ハイブリダイズ領域が約８〜約５０個のヌクレオチドからなり、自 己相補性領域が６個、８個もしくは約１０個のヌクレオチドからなる請求の範囲 第３項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチド。 １７． 標的ハイブリダイズ領域が約８〜約５０個のヌクレオチドからなり、自 己相補性領域が約１０個のヌクレオチドからなる請求の範囲第２項に記載の自己 安定化オリゴヌクレオチド。 １８． 標的ハイブリダイズ領域が約８〜約５０個のヌクレオチドからなり、自 己相補性領域が約１０個のヌクレオチドからなる請求の範囲第３項に記載の自己 安定化オリゴヌクレオチド。 １９． ウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺 伝子発現の抑制方法であって、 自己安定化オリゴヌクレオチドをウィルス感染もしくは病原感染した細胞または 未感染細胞にそれぞれ施すことからなり、 自己安定化オリゴヌクレオチドは標的ハイブリダイズ領域と相補性領域とからな り、 標的ハイブリダイズ領域はそれぞれウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子か らの核酸配列に対し相補性の少なくとも８個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチ ド配列を含み、 自己相補性領域は自己安定化オリゴヌクレオチド内に存在する核酸配列に対し相 補性の６個、８個もしくは約１０個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列を 含むことを特徴とするウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺伝子発現の 抑制方法。 ２０． 自己相補性領域が、自己安定化オリゴヌクレオチド内に存在する核酸配 列に対し相補性の約１０個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド配列である請求 の範囲第１９項に記載の方法。 ２１． 標的ハイブリダイズ領域が４個もしくはそれ以上の隣接するデオキシリ ボヌクレオチドホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオ エートを含む請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２２． 標的ハイブリダイズ領域が４個もしくはそれ以上の隣接するデオキシリ ボヌクレオチドホスホジエステ ル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエートを含む請求の範囲第２０ 項に記載の方法。 ２３． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第１９項に記載の方法。 ２４． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第２０項に記載の方法。 ２５． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第２１項に記載の方法。 ２６． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第２２項に記載の方法。 ３４． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、 リーシ ュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hepatic a）よりなる群から選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。 ３５． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、 リーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola h epatica）よりなる群から選択される請求の範囲第２０項に記載の方法。 ３６． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、 リーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola h epatica）よりなる群から選択される請求の範囲第２１項に記載の方法。 ３７． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、 リーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola h epatica）よりなる群から選択される請求の範囲第２２項に記載の方法。 ３８． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第１９項に記載の方法。 ３９． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第２０項に記載の方法。 ４０． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第２１項に記載の方法。 ４１． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第２２項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，Ｊ Ｐ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ， ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 タン、 ジン−ヤン アメリカ合衆国 01604 マサチューセッ ツ州 ワーセスター ナンバー２エルウェ ルズ ストリート 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 標的ハイブリダイズ領域と自己相補性領域とからなる治療用自己安定化オ リゴヌクレオチドであって、標的ハイブリダイズ領域はウィルス、病原性生物も しくは細胞遺伝子からの核酸配列に対し相補性のオリゴヌクレオチド配列を含み 、 自己相補性領域は治療用自己安定化オリゴヌクレオチドの内部に存在する核酸配 列に対し相補性のオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする治療用自己安 定化オリゴヌクレオチド。 ２． 標的ハイブリダイズ領域が４個もしくはそれ以上の隣接するデオキシリボ ヌクレオチドホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエ ートである請求の範囲第１項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 ３． 自己相補性領域がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドホ スホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ ート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエー ト、ケトン、スルホンおよびサルフェートよりなる群から選択されるヌクレオチ ドである請求の範囲第１項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 ４． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウ ィルス、ヒト乳頭腫ウィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱 病ウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる 群から選択される請求の範囲第１項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチ ド。 ５． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（Plsdmodium falciparum）、トリパノ ソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、リーシュマニア（Leishmania）および 肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hepatica）よりなる群から選択される 請求の範囲第１項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 ６． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質およ びオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の範 囲第１項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 ７． 自己相補性領域がデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドホ スホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデ ート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホロモルホリ デート、ケトン、スルホンおよびサルフェートよりなる群から選択されるヌクレ オチドである請求の範囲第２項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 ８． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウィ ルス、インフルエンザウィルス、 口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯状疱疹ウィルスおよびキュウリモザ イクウィルスよりなる群から選択される請求の範囲第２項に記載の治療用自己安 定化オリゴヌクレオチド。 ９． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、Pl asmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma burcei）、リ ーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパチカ、Fasciola hep atica）よりなる群から選択される請求の範囲第２項に記載の治療用自己安定化 オリゴヌクレオチド。 １０． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第２項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 １１． ウィルスがヒト免疫不全症ウィルス、単純疱疹ウィルス、ヒト乳頭腫ウ ィルス、インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、黄熱病ウィルス、水痘−帯 状疱疹ウィルスおよびキュウリモザイクウィルスよりなる群から選択される請求 の範囲第３項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 １２． 病原性生物が熱帯熱マラリア原虫（プラスモジウム・ファルシパルム、 Plasmodium falciparum）、トリパノソマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、 リーシュマニア（Leishmania）および肝蛭（ファシオラ・ヘパ チカ、Fasciola hepatica）よりなる群から選択される請求の範囲第３項に記載 の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 １３． 細胞遺伝子がプリオン蛋白質、アルツハイマー氏アミロイド様蛋白質お よびオンコジーンもしくはプロトオンコジーンよりなる群から選択される請求の 範囲第３項に記載の治療用自己安定化オリゴヌクレオチド。 １４． ５′末端および３′末端のいずれか一方または両方に自己相補性領域を 有する自己安定化リボザイム。 １５． 請求の範囲第１項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチドを、ウィルス 感染もしくは病原感染した細胞または未感染細胞にそれぞれ施すことを特徴とす るウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺伝子発現の抑制方法。 １６． 請求の範囲第２項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチドを、ウィルス 感染もしくは病原感染した細胞または未感染細胞にそれぞれ施すことを特徴とす るウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺伝子発現の抑制方法。 １７． 請求の範囲第３項に記載の自己安定化オリゴヌクレオチドを、ウィルス 感染もしくは病原感染した細胞または未感染細胞にそれぞれ施すことを特徴とす るウィルス、病原性生物もしくは細胞遺伝子の遺伝子発現の抑制方法。 １８． 発病した人間もしくは動物に、医薬上許容しう るキャリヤにおける請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチドを投与するこ とを特徴とする、ウィルスもしくは病原性生物の感染または細胞遺伝子の異常な 発現もしくは生成物から生ずる病気を発病したヒトもしくは動物の処置方法。 １９． 発病した人間もしくは動物に、医薬上許容しうるキャリヤにおける請求 の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする、ウィル スもしくは病原性生物の感染または細胞遺伝子の異常な発現もしくは生成物から 生ずる病気を発病したヒトもしくは動物の処置方法。 ２０． 発病した人間もしくは動物に、医薬上許容しうるキャリヤにおける請求 の範囲第３項に記載のオリゴヌクレオチドを投与することを特徴とする、ウィル スもしくは病原性生物の感染または細胞遺伝子の異常な発現もしくは生成物から 生ずる病気を発病したヒトもしくは動物の処置方法。 ２１． 自己相補性領域または標的ハイブリッド化領域の相補性部分に１個もし くはそれ以上のリボヌクレオチドもしくは２′−Ｏ−Ｍｅ−リボヌクレオチドを 有する高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチド。 ２２． 自己相補性領域またはリンカー領域に１個もしくはそれ以上のインター カレート剤分子を有する高安定化された自己安定化オリゴヌクレオチド。