CZ3497A3 - Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme - Google Patents

Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme Download PDF

Info

Publication number
CZ3497A3
CZ3497A3 CZ9734A CZ3497A CZ3497A3 CZ 3497 A3 CZ3497 A3 CZ 3497A3 CZ 9734 A CZ9734 A CZ 9734A CZ 3497 A CZ3497 A CZ 3497A CZ 3497 A3 CZ3497 A3 CZ 3497A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
telomerase
rna component
sequence
rna
human
Prior art date
Application number
CZ9734A
Other languages
English (en)
Inventor
Bryant Villeponteau
Junli Feng
Walter Funk
William H Andrews
Original Assignee
Geron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/330,123 external-priority patent/US5583016A/en
Priority claimed from US08/482,115 external-priority patent/US5776679A/en
Priority claimed from US08/472,802 external-priority patent/US5958680A/en
Application filed by Geron Corp filed Critical Geron Corp
Publication of CZ3497A3 publication Critical patent/CZ3497A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C59/00—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor
    • B29C59/02—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing
    • B29C59/04—Surface shaping of articles, e.g. embossing; Apparatus therefor by mechanical means, e.g. pressing using rollers or endless belts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Extrusion Moulding Of Plastics Or The Like (AREA)
  • Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

RNA složka savčí teloaerasy, oligonukleotid, rekoabinantni expresní plasmid obsahující oligonukleotld, způsob výroby eukaryotické hostitelské buňky, způsob výroby rekoabinantniho te1omerasového enzyau, prostředek, který obsahuje lidskou telomerasovou RNA složku, způsob identifikování polynukleotidů rautantni savčí teloaerasové RNA složky, způsob identifikováni kandidátů na teloaerasová modulační činidla, způsob inhibování teloaerasové aktivity v lidských buňkách in vitro, polynukleotid pro genovou terapii onenocněni člověka, riboaya, který Štěpí lidskou telomerasovou RNA složku, způsob detegování přítomnosti stavu pacienta souvisejícího s teloaerasou, způsob detegování přítomnosti neoplastického stavu u pacienta a prostředek, který obsahuje pár polynukleotidových PCR primerů savčí teloaerasové s1ožky
Oblast techniky
Předložený vynález se týká RNA složky savčí teloaerasy, oligonukleotidu, rekombinantního expresního plasmidu obsahujícího oligonukleotid, způsob výroby eukaryotické hostitelské buňky, způsobu výroby rekoabinantniho telomerasového enzyau, prostředku.
který obsahuje lidskou telomerasovou RNA identifikováni po1ynuk1eotidů mutantni savčí složku, způsobu teloaerasové RNA na te1oaerasová složky, způsobu modulační činidla, v 1 i dských buňkách onemocněni člověka, identifikování kandidátů způsobu inhibování teloaerasové aktivity in vitro, polynukleotidu pro genovou terapii ribozymu, který Štěpí lidskou telomerasovou
RNA složku, způsobu detegování přítomnosti stavu pacienta souvisejícího s teloaerasou, způsobu detegování přítomnosti neoplastického stavu u pacienta a prostředku, který obsahuje pár polynukleotidových PCR primerů savčí teloaerasové složky
Předložený vynález se tedy týká lidské teloaerasy, ribonukleotidového enzyau zahrnutého v syntéze lidské teloaerové DNA. Tento vynález poskytuje způsoby a prostředky týkající se oblastí molekulární biologie, chemie, farmakologie a lékářské a diagnostické technologie.
— ;
<
r— 73
C3>
ω G
__I Xk
09 ΐ>
O CS O
—i <2 rn\
< X
—\ o
o to tO'
Γ3
O co*
Dosavadní stav techniky
DNA na koncích nebo telomery chromosomů eukaryotů obvykle sestávají z tandemově opakovaných jednoduchých sekvencí. Telomemerasa je ribonukleoproteinový enzym, který syntetizuje jedno vlákno telomerní DNA používající jako matrici sekvenci obsaženou v RNA složce enzymu. Viz Blackburn: Annu. Rev. Biochem. 61, 113 (1992), zahrnuté zde jako odkaz.
RNA složka lidské telomerasy nebyla dosud ve vědecké literatuře popsána, i když je známo, že lidská telomerasa syntetizuje telomerní jednotky repetice se sekvencí 5z-TTAGGG-3'. Viz Morin: Cell 59, 521 (1989) a Morin: Nátuře 353. 454 (1991), zahrnuté sem jako odkazy. Tato znalost není dostatečná k tomu, aby umožnila isolaci a identifikaci zbytku nukleotidové sekvence RNA složky lidské telomerasy. RNA složka telomerasových enzymů Saccharomyces cerevisiae, jistých druhů Tetrahymena, stejně jako jiných řas, jako je Euplotes a Glaucoma, byla sekvenována a je popsána v oblasti techniky. Viz Singer a Gottschling; Science 266. 404 (21. října 1994), Lingner a spol.: Genes and Development 8, 1984 (1994), Greider a Blackburn: Nátuře 337, 331 (1989), Romero a Blackburn: Cell 67, 343 (1991) a Shippen-Lentz a Blackburn: Science 247. 546 (1990), všechny zde zahrnuté jako odkazy. Telomerasové enzymy těchto řas syntetizují telomerní jednotky repetice odlišné od jednotek člověka.
Existuje velká potřeba získat více informací o lidské telomerase. Přes zdánlivě jednoduchou povahu jednotek repetice telomerní DNA vědci dlouho vědí, že telomery mají důležitou biologickou roli při zachování struktury a funkce chromosomů. Nedávo se objevily vědecké spekulace o tom, že ztráta telomerní DNA může působit jako podnět buněčného stárnutí a že regulace telomerasy může mít důležité biologické důsledky. Viz Harley: Mutation Research 256. 271 (1991), zahrnutá zde jako odkaz.
Jsou popsány také způsoby detegování telomerasové aktivity a způsoby identifikování sloučenin, které regulují nebo ovliv3 ňují telomerasovou aktivitu spolu se způsoby léčení a diagnostikování buněčného stárnutí a nesmrtelnosti regulováním délky telomeru a aktivity telomerasy. Viz PCT patentový spis č. 95/ /13381, publikovaný 18. května 1995, č. 95/13382, publikovaný
18. května 1995, a č. 93/23572, publikovaný 25. listopadu 1993, a USA patentová přihláška bez č. (vynálezci: C. Harley, N. Kim a S. Weinrich), podaná 7. června 1995, č. 08/315214, podaná 28. září 1994, Č. 08/315216, podaná 28. září 1994, Č. 08/288501, podaná 10. srpna 1994, č. 08/014838, podaná 8. února 1993, č. 08/153051 a 08/151477, obě podané 12. listopadu 1993, číslo 08/060952, podaná 13. května 1993, č. 08/038766, podaná 24. března 1993, a č. 07/882438, podaná 13. května 1992, všechny jsou zde uvedeny jako odkazy.
Mohly být uskutečněna významná zlepšení a nové příležitosti telomerasou zprostředkovaných léčení a telomerasové analýzy a vyhledávací způsoby, kdyby byla nukleová kyselina obsahující RNA složku a/nebo kódující proteinové složky telomerasy získatelná v čisté nebo isolovatelné formě a kdyby byly známy nukleotidové sekvence těchto nukleových kyselin. Předložený vynález vyhovuje těmto a dalším potřebám a poskytuje taková zlepšení a možnosti.
Podstata vynálezu
Podle prvního aspektu předložený vynález poskytuje RNA složku a také gen pro RNA složku lidské telomerasy v v podstatě čisté formě, a rovněž nukleové kyseliny obsahující celou nebo alespoň užitečnou část nukleotidové sekvence RNA složky lidské telomerasy. Předložený vynález poskytuje také nukleové kyseliny RNA složky z jiných druhů, jejichž nukleové kyseliny sdílejí podstatnou homologii s RNA složkou lidské telomerasy, včetně, ale bez omezení na ně, RNA složek savců, jako jsou primáti. Mezi další užitečné nukleové kyseliny podle vynálezu patří nukleové kyseliny se sekvencemi doplňkovými k RNA složce, nukleové kyseliny se sekvencemi podobnými, ale při tom odlišnými, nukleotidovým sekvencím RNA složky a které užitečným způsobem inter4 agu jí s RNA složkou nebo genem RNA složky nebo proteinových složek lidské telomerasy, a nukleové kyseliny, které nesdílejí významnou homologii sekvence nebo doplňkovost s RNA složkou nebo genem RNA složky, ale které působí na RNA složku žádoucím a užitečným způsobem. Jak je podrobněji popsáno níže, nukleové kysleiny podle vynálezu zahrnují jak DNA tak RNA molekuly a jejich modifikované analogy a slouží k mnoha různým účelům.
Jedním typem užitečné nukleové kyseliny podle vynálezu je antimediátorový oligonukleotid, oligonukleotid tvořící trojitý helix, nebo jiný oligonukleotid nebo oligonukleotidové napodobení (např. antimediátorová PNA - peptidová nukleová kyselina/ /polyamidová nukleová kyselina), které mohou být užitečné in vivo nebo in vitro při inhibici aktivity lidské telomerasy. Tyto oligonukleotidy mohou blokovat telomerasovou aktivitu četnými způsoby, včetně zabránění transkripce telomerasového genu (například vytvořením trojitého helixu) nebo navázání na RNA složku telomerasy tak, Že brání uspořádání funkční ribonukleoproteinové telomerasy nebo zabraňují RNA složce, která je již jednou uspořádána jako telomerasový enzymový komplex, sloužit jako matrice pro syntézu telomerní DNA. Typicky, a podle způsobu působení, tyto oligonukleotidy podle vynálezu obsahují specifickou sekvenci s od 10 do 25 až 200 nebo více nukleotidů, která je identická nebo doplňková ke specifické sekvenci nukleotidů v RNA složce telomerasy nebo genu RNA složky telomerasy.
V jednom provedení tento vynález poskytuje antimediátorové polynukleotidy doplňkové k polynukleotidovým sekvencím telomerasové RNA složky, typicky doplňkové k polynukleotidovým sekvencím, které jsou v podstatě identické s přirozeně se vyskytující sekvencí genu savčí telomerasové RNA složky. Tyto antimediátorové polynukleotidy se používají pro inhibici transkripce a/nebo stability a/nebo funkčnosti telomerasové RNA složky různých druhů a způsobuji tedy snížení případné telomerasové aktivity v buňce (např. neoplastické buňce pacienta). Tyto antimediátorové polynukleotidy mohou fungovat jako činidla modulující telomerasu inhibováním tvorby funkčního (katalyticky aktivního s vysokou věrností) telomerasového holoenzymu vyžadovaného pro přesnou replikaci telomeru a opravu v buňce. Antimediátorové polynukleotidy se mohou kombinovat s jinými antineoplastickými terapeutickými možnostmi, jako je ionizační záření nebo chemoterapie (např. s činidlem, které poškozuje DNA, jako je bleomycin, cisplatina, dusíková hořčice, doxyrubicin, analoga nukleotidů a podobná činidla). Antimediátorové polynukleotidy mohou podporovat smrt buněk ucitlivých buněk (např. replikujících buněk vyžadujících telomerasovou aktivitu pro DNA opravu nebo replikaci). Antimediátorové polynukleotidy jsou v podstatě identické s alespoň 25 přilehlými nukleotidy zde popsané doplňkové sekvence savčí telomerasové RNA sekvence. Těmito antimediátorovými polynukleotidy jsou typicky ssDA, ssRNA, polynukleotidy s methylfosfonátovou základní částí, polynukleotidy s fosforthiolátovou základní částí, polynukleotidy se smíšenou základní částí, polyamidové nukleové kyseliny a podobné antimediátorové struktury známé v oblasti techniky. Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se antimediátorový polynukleotid podává pro inhibici transkripce a/nebo aktivity telomerasové RNA složky a telomerasové aktivity v buňce, jako je replikovatelná lidská buňka.
V jednom provedení tento vynález poskytuje polynukleotid s chybným párováním matrice. Tento polynukleotid má sekvenci v podstatě identickou se savčí RNA složkou telomerasy a obsahující sekvenci telomerní repetiční matrice s alespoň jedním chybným párováním báze vzhledem k sekvenci lidské telomerasové repetice 5'-TTAGGG-3', ale jinak doplňkové k této sekvenci. Polynukleotid s chybným párováním matrice typicky obsahuje jediné chybné párování nukleotidu v přirozeně se vyskytující sekvenci matrice, může obshaovat dvě chybná párování nukleotidů v sekvenci matrice, bučí jako přilehlé nukleotidy s chybným párováním nebo takové, v nichž chybně párované nukleotidy jsou odděleny jedním nebo více párovanými (doplňkovými) nukleotidy. Matricové polynukleotidy s chybným párováním podle vynálezu jsou obvykle schopny vykazovat telomerasovou aktivitu ve spojitosti s lid6 skou telomerasovou polypeptidovou složkou a tedy produkovat chybná zařazení do vybraných (chybně párovaných) nukleotidových poloh v sekvenci lidské telomerasové repetici následující po replikaci telomerní repetice, opravě a/nebo přidání, čímž se generují telomery, které se spoléhají na kontinuální přítomnost mutované negativní telomerasové RNA složky pro podstatnou replikaci a zachování telomerní délky.
Jiným typem užitečné nukleové kyseliny podle vynálezu je ribozym, který je schopný specificky štěpit RNA složku lidské telomerasy, což způsobuje neaktivitu enzymu. Ještě jiným typem užitečné nukleové kyseliny podle vynálezu je sonda nebo primer, který se váže specificky na RNA složku lidské telomerasy a může tak být použit např. pro detekci přítomnosti telomerasy ve vzorku. Konečně, mezi užitečné nukleové kyseliny podle vynálezu patří rekombinantní expresní plasmidy pro produkci nukleových kyselin podle vynálezu. Jedním zvláště užitečným typem takového plasmidu je plasmid použitý pro léčení lidského genu. Užitečné plasmidy podle vynálezu pro genovou terapii člověka existují v rozmanitých typech, včetně nejen těch, které kódují antimediátorové oligonukleotidy nebo ribozymy, ale také těch, které řídí expresi RNA složky lidské telomerasy nebo vynechané nebo jinak upravené (mutované) verse RNA složky lidské (nebo jiného druhu se sekvencemi RNA složky v podstatě homologními s lidskou RNA složkou) telomerasy nebo genu pro ni.
V jednom provedení je polynukleotid, který má část doplňkovou k savčí telomerasové RNA složce dostatečnou pro specifickou hybridizaci za fysiologických podmínek, derivatizován kovalentní vazbou dalším chemickým substituentem, bučí během nebo po syntéze polynukleotidu, čímž se vytvoří derivatizovaný polynukleotid schopný specifické hybrídizace na telomerasovou RNA složku. Derivatizovaný polynukleotid může být umístěn na endogenním telomerasovém enzymu, který má uvedenou RNA složku, při čemž uvedený derivatizovaný polynukleotid poskytuje změnu nebo chemickou modifikaci RNA složky a/nebo proteinové složky telomerasy a tak modifikuje, typicky snižuje, telomerasovou enzymo7 vou aktivitu.
V jednom provedení tento vynález poskytuje polynukleotidy, které jsou vhodné pro diagnostikování onemocnění souvisejících s výskytem a/nebo strukturou aberantní telomerasové RNA složky. Polynukleotidové sondy, obsahující sekvence, které jsou v podstatě identické nebo v podstatě doplňkové s nukleotidovou sekvencí savčí telomerasové RNA složky, které se mohou použít pro stanovení diagnosy stavu onemocnění (např. neoplazie nebo preneoplazie) detekcí výskytu telomerasové RNA složky a/nebo strukturních změn telomerasové RNA složky (např. zkomolení, změny sekvence, delece nebo inserce a podobné) a/nebo přesmyky nebo amplifikace genu telomerasové RNA složky v buňkách explantovaných z pacienta, nebo detekci pathognomomické alely savčí telomerasové RNA složky (např. RFLP nebo na alelu specifickou PCR analýzou). Detekce se často provádí in šitu hybridizací použitím značeného (např. 32P, 3SS, 14C, 3H, fluorescenčního, biotinylovaného, digoxigeninylovaného) antimediátorového polynukleotidu doplňkového k savčí telomerasové RNA složce, i když lze použít Nothernovo blotování, tečkovací blotování nebo hybridizaci roztokem na objemnou RNA nebo póly A+ RNA isolovanou z buněčného vzorku, stejně jako PCR nebo LCR amplifikace použitím primerů specifických pro telomerasovou RNA složku. Buňky, které obsahují změněné množství (typicky významné zvýšení) telomerasové RNA složky při srovnání s ne-neoplastickými buňkami stejného typu buněk, jsou identifikovány jako kandidáti na nemocné buňky, jako jsou preneoplastické nebo otevřeně neoplastické buňky, a mohou být identifikovány jako buňky, které mají metastatický potenciál. Podobně detekce pathognomomických přesmyků nebo amplifikace místa genu telomerasové RNA složky nebo blízce navázaných míst v buněčném vzorku bude identifikovat přítomnost pathologického stavu nebo predisposici k vyvinutí takového pathologického stavu (např. rakoviny, genetického onemocnění). Polynukleotidové sondy telomerasové RNA složky se používají také pro identifikaci jednotlivců v soudním lékařství, jako je testování rodičovství nebo identifikaci kriminálních podezření nebo neznámých zemřelých osob.
Podle druhého aspektu tento vynález poskytuje způsoby léčení stavu souvisejícího s telomerasovou aktivitou v buňce nebo ve skupině buněk uvedením buňky (buněk) do kontaktu s terapeuticky efektivním množstvím činidla, které mění telomerasovou aktivitu v této buňce. Mezi taková činidla patří nukleové kyseliny kódující telomerasovou RNA složku, oligonukleotidy tvořící trojitý helix, antimediátorové oligonukleotidy, ribozymy a plasmidy a další vektory genové terapie (např. adenovirové vektory, adeno-asociované virové vektory atd.) pro lidskou genovou terapii expresí telomerasové RNA složky, antimediátorové RNA k telomerasové RNA složce nebo telomerasové RNA složky s chybným párováním, jak shora popsáno. V příbuzném aspektu tento vynález poskytuje farmaceutické prostředky, které obsahují terapeutická činidla společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo solí, které mohou zahrnovat přípravu prostředku ve formě komplexu lipofekce, liposomů nebo imunoliposomu pro cílené dodávání terapeutického činidla. Tento vynález poskytuje také kombinace těchto telomerasou zprostředkovaných terapeutických činidel s jinými farmaceutickými činidly, jako jsou antineoplastická činidla a další cytotoxická nebo cytostatická činidla, protihoubová činidla (např. pro léčení pacientů s AIDS), nukleotidy, nukleosidy a jejich analoga a další farmaceutická činidla vhodná pro léčení takových stavů onemocnění, jako je neoplazie, hyperplazie, HIV-infekce/AIDS a související pathologické stavy, a dalších onemocnění charakterizovaných abnormálním telomerním metabolismem. Tyto způsoby mohou obsahovat použití derivatizovaného polynukleotidu schopného specificky hybridizovat na telomerasovou RNA složku v savčí telomerase, při čemž derivatizovaný polynukleotid je dodáván do savčích buněk, které mají telomerasovou aktivitu a inhibují telomerasovou aktivitu lokalizováním na telomerasovou RNA složku a inaktivováním nebo inhibováním telomerasové aktivity.
Tento vynález poskytuje také terapeutická činidla, která inhibují neoplazii nebo apoptosu modulací telomerasové funkce inhibováním nebo zvýšením tvorby telomerasové RNA složky. Tato činidla se mohou používat jako farmaceutická činidla. Tato far9 maceutická činidla se budou používat pro léčení rozmanitých lidských a veterinárních onemocnění, jako je neoplazie, hyperplazie, neurodegenerativní onemocnění, stárnutí, AIDS, houbová infekce a podobné. V jednom provedení toto činidlo sestává z vektoru genové terapie schopného přepsat sekvenci telomerasové RNA složky nebo jejího doplňku nebo také enzymaticky neaktivní telomerasové RNA složky, která může kompetitivně inhibovat tvorbu funkčního telomerasového holoenzymu.
Ve třetím aspektu tento vynález poskytuje diagnostické způsoby stanovení hladiny, množství nebo přítomnosti RNA složky lidské telomerasy, telomerasy nebo telomerasové aktivity v buňce, buněčné populaci, tkáňovém vzorku nebo extraktu kteréhokoliv z předcházejících. V příbuzném aspektu předložený vynález poskytuje užitečná reakční činidla pro tyto způsoby (včetně shora uvedených primerů a sond), popřípadě ve formě sestavy spolu s instrukcemi pro praktické použití takové sestavy jako způsobu diagnosy.
Předložený vynález poskytuje způsob stanovení diagnosy onemocnění (např. neoplazie) u lidského pacienta, při čemž diagnostický test (např. in šitu polynukleotidová hybridizace fixovaných buněk značenou sondou telomerasové RNA složky, která specificky váže sekvenci lidské telomerasové RNA složky nebo genu) se používá pro stanovení toho, jestli předem stanovená pathognomomická koncentrace telomerasové RNA složky je v biologickém vzorku lidského pacienta přítomna. Jestliže tento test ukazuje na přítomnost telomerasové RNA složky mimo normální rozmezí (např. za předem stanovenou pathognomomickou koncentraci) , diagnosou pacienta je stav onemocnění nebo predisposice k tomuto onemocnění.
V tomto provedení se polynukleotidy podle vynálezu používají pro diagnostikování pathologických stavů nebo genetických onemocnění, která zahrnují neoplazii, hyperplazii, prematurované nebo abnormální stárnutí buněk nebo jiné lékařské stavy související s telomerasovou funkcí, specifičtější stavy a one10 mocnění, která zahrnují změny ve struktuře nebo výskytu sekvence telomerasové RNA složky nebo genu nebo které jsou navázány na pathognomomickou alelu telomerasové RNA složky, která může být detegována RFLP a/nebo aleově specifickou PCR nebo jiným vhodným způsobem detekce. Typicky je tímto způsobem způsob stanovení diagnosy onemocnění (např. neoplazie) lidského pacienta, při čemž diagnostický test (např. stanovení množství a/nebo struktury telomerasové RNA složky) se používá pro stanovení, jestli předem stanovená pathognomomická koncentrace nebo struktura telomerasové RNA složky je v buňkách v biologickém vzorku z lidského pacienta přítomna. Jestliže tento test ukazuje na přítomnost pathognomomického množství telomerasové RNA složky mimo normální rozmezí (např. mimo předem stanovenou pathognomomickou koncentraci), diagnosou pacienta je stav onemocnění nebo predisposice k onemocnění.
Ve čtvrtém aspektu předložený vynález poskytuje rekombinantní telomerasové prostředky a způsoby pro výrobu těchto prostředků. Předložený vynález tedy poskytuje rekombinantní lidskou telomerasu, která obsahuje proteinové složky lidské telomerasy stejně jako proteinové složky telomerasy ze savců s RNA složkou v podstatě homologní s RNA složkou lidské telomerasy v souvislosti s rekombinantní RNA složkou podle vynálezu. Tyto molekuly rekombinantní RNA složky podle vynálezu zahrnují ty molekuly, které se liší od přirozeně se vyskytujících molekul RNA složky jednou nebo více substitucemi, delecemi, adicemi na konci a/nebo insercemi, stejně jako molekuly RNA složky identické s přirozeně se vyskytující molekulou RNA složky, která je produkována v rekombinantních hostitelských buňkách. Způsob výroby těchto rekombinantních telomerasových molekul zahrnuje transformování eukaryotické hostitelské buňky, která exprimuje proteinové složky telomerasy, rekombinantním expresním vektorem, který kóduje molekulu RNA složky podle vynálezu, kultivaci těchto hostitelských buněk transformovaných uvedeným vektorem za takových podmínek, že dochází k expresi telomerasové proteinové složky a telomerasové RNA složky a k takovému uspořádání, že se vytvoří aktivní telomerasové molekula schopná přidávat sekvence (nikoliv nutně stejné sekvence přidané přírodní telomerasou) k telomerům chromosomové DNA.
V pátém aspektu tento vynález poskytuje způsoby čištění proteinových složek lidské telomerasy stejně jako proteinových složek telomerasy ze savců s RNA složkou v podstatě homologní s RNA složkou lidské telomerasy. Předložený vynález poskytuje také způsoby isolování a identifikování nukleových kyselin kódujících tyto proteinové složky. V příbuzných aspektech předložený vynález poskytuje vyčištěnou lidskou telomerasu a vyčištěnou telomerasu ze savců s RNA složkou v podstatě homologní s RNA složkou lidské telomerasy stejně jako vyčištěné nukleové kyseliny, které kódují jednu nebo více složek těchto telomerasových prostředků. Předložený vynález poskytuje také farmaceutické prostředky, které jako aktivní složku obsahují proteinové složky telomerasy nebo nukleovou kyselinu, která kóduje nebo interaguje s nukleovou kyselinou, která kóduje proteinovou složku telomerasy.
V šestém aspektu tento vynález poskytuje způsoby identifikování činidel, která modulují (tj. inhibují, zvyšují nebo mění specifičnost) savčí telomerasové aktivity. Tato telomerasu modulující činidla jsou často malé molekuly (např. s molekulovou hmotností menší než asi 3000), mohou se používat k modifikování telomerasové aktivity in vitro a in vivo, často pro terapeutický účinek, a jsou používána jako laboratorní reakční činidla a/nebo farmaceutická činidla.
V jiném provedení tento vynález poskytuje způsoby identifikování, z banky nebo knihovny činidel, činidel, která jsou kandidáty pro modulování telomerasové aktivity modulováním nekovalentního navázání savčí telomerasové RNA složky s telomerasovou proteinovou složkou. Telomerasové RNA složka se může vyrábět z rekombinantní matrice v hostitelské buňce nebo se může, jestliže je to žádoucí, syntetizovat chemicky. Typicky se savčí telomerasové proteinová složka, jako je vyčištěná složka z buněk, které exprimují telomerasovu, a která může mít odstraněnu přirozeně se vyskytující telomerasovou RNA složku (např. působením RNAsy), uvede do kontaktu se savčí telomerasovou RNA složkou za vhodných vodných vazebných podmínek, které umožňují nekovalentní navázání mezi RNA a proteinovými složkami v nepřítomnosti přidaného činidla (tj. v reakci regulující navázání). Velikost nekovalentní interakce mezi telomerasovou RNA složkou a proteinovou složkou v přítomnosti jednoho nebo více činidel vybraných z knihovny nebo banky činidel se srovná s velikostí nekovalentní interakce při reakci regulující navázání zahrnující telomerasovou RNA a proteinovou složku a chybějící činidlo (činidla); činidla, která produkují statisticky významné zvýšení nekovalentního navázání mezi telomerasovou RNA a proteinovou složkou jsou tedy určena jako kandidáti na činido modulující telomerasu. Relativní velikost nekovalentního navázání lze stanovit jakýmkoliv vhodným způsobem, včetně stanovení specifické vazebné aktivity, jako je test kompetitivní vazby, stanovení telomerasové katalytické aktivity na vhodnou telomerní repetiční matrici nebo jiným vhodným testem funkční nekovalentní interakce mezi RNA dložkou a proteinovou složkou savčí telomerasy, jako je posun na gelu nebo EMSA (test posunu při elektroforetickém pohybu).
Při testu nekovalentního navázání při stanovování kandidátů na činidla modulující telomerasu se buá telomerasová RNA složka nebo proteinová složka a nebo obě označí vhodnou detegovatelnou značkou. Nekovalentní navázání se odděleně stanoví v přítomnosti a v nepřítomnosti činidla vybraného z knihovny nebo banky činidel. Stanovení nekovalentního navázání zahrnuje měření rozsahu, ve kterém je označená telomerasová složka (RNA složka nebo proteinová složka) navázána na její příbuznou telomerasovou složku (proteinová složka nebo RNA složka), jestli je příbuzná telomerasová složka odděleně označena nebo není označena, jako je zachycení (např. imobilizování) vazebného komplexu obsahujícího označenou telomerasovou složku a příbuznou telomerasovou složku a oddělení (např. promytim) nenavázané označené telomerasové složky od navázaných komplexů, čímž se získá oddělená navázaná frakce a azebný komplex se deteguje v oddělené vazebné frakci stanovením přítomnosti detegovatelného označení. Činidla, která produkují stastisticky významné snížení nebo zvýšení nekoválentniho navázání telomerasové RNA a proteinové složky jsou tak identifikována jako kandidáti telomerasu modifikujících činidel. Činidla, která snižují nekovalentní navázání, jsou kandidáty inhibitorů (nebo antagonistů) telomerasy, zatímco činidla, která zvyšují nekovalentní navázání telomerasových složek, jsou kandidáty telomerasových agonistů.
V jednom provedení se kandidáti činidel modulujících telomerasu identifikují jejich schopností produkovat statisticky významné zvýšení nebo snížení enzymatické aktivity savčí telomerasy obsahující vyčištěnou telomerasovou proteinovou složku a telomerasovou RNA složku.
V jednom provedení se kandidáti činidel modulujících telomerasu identifikují jejich schopností produkovat statisticky významné snížení nebo zvýšení transkripce reportérové polynukleotidové sekvence (např. B-galaktosidasového genu, luciferasového genu, HPRT genu) odštěpitelně napojeného na transkripční regulační sekvenci genu savčí telomerasové RNA složky, s výhodou genu lidské telomerasové RNA složky, v metabolicky aktivní savčí buňce. V jiném provedení je gen endogenní telomerasové RNA složky v savčí buňce zacílen homologní cílovou konstrukcí tak, aby se reporterová polynukleotidová sekvence umístila odštěpitelným napojením proti směru vlákna transkripční regulační sekvence (např. promotoru) genu endogenní telomerasové RNA složky v místě chromosomu endogenního genu. V jiném provedení je exogenní polynukleotid obsahující reporterový polynukleotid odštěpitelně napojen na transkripční regulační oblast genu savčí telomerasové RNA složky (např. promotor a místa vázající traskripční faktor proti směru vlákna), exogenní polynukleotid je přenesen do savčí buňky, při čemž může integrovat nehomologně do chromosomového místa a/nebo se zachovat nebo replikovat jako episomální polynukleotid. Činidla, která produkují statisticky významnou modulaci reporterového polynukleotidu v buňkách zpracovaných s tímto činidlem, jsou tedy identifikována jako kandidáti činidel modulujících savčí telomerasu.
Prostředky pro identifikování kandidátů činidla modulujícího telomerasu typicky obsahují: 1) savčí telomerasovou proteinovou složku, která může být vyčištěna ze savčích buněk exprimujících telomerasu, s výhodou buněk primátů (např. lidských), a která je typicky zbavena asociované RNA složky, pokud nějaká existuje, zpracováním s RNAsou nebo jiným zpracováním, které je slučitelné s odstraněním RNA složky, a zachováním kapacity proteinu rekonstituovat telomerasovou aktivitu v přítomnosti příbuzné telomerasové RNA složky za vhodných vazebných podmínek, 2) savčí telomerasovou RNA složku, s výhodou lidskou RNA složku, která je produkována transkripcí rekombinantního polynukleotidu v buňce, 3) podmínky pro vodné navázání (např. fysiologické podmínky, podmínky testování telomerasy), popřípadě 4) reporterový polynukleotid obsahující alespoň jednu replikovatelnou nebo rozšiřitelnou sekvenci savčí telomerasové repetice, typicky doplňkové k sekvenci části doplňkové matrice telomerní repetice uvedené RNA složky, a popřípadě 5) nukleotidy vhodné pro replikaci a/nebo rozšíření sekvence (sekvencí) uvedené telomerní repetice reporterového polynukleotidu za podmínek testování telomeru; činidlo se k tomuto prostředku typicky přidává pro vyhodnocení nekovalentní vazby a/nebo telomerasové aktivity při srovnání s kontrolním prostředkem, v němž chybí uvedené činidlo.
V sedmém aspektu tento vynález poskytuje takové nulové alely genů savčí telomerasové RNA složky, které jsou produkovány zacílením homologního genu heterologního polynukleotidu do genu savčí telomerasové RNA složky, aby funkčně inaktivovaly gen telomerasové RNA složky. Tento vynález také poskytuje knockoutované živočichy (ne člověka) obsahující nulovou alelu telomerasové RNA složky a v jiném provedení poskytuje knockoutované živočichy (ne člověka) homozygotní pro nulové alely telomerasové RNA složky. V podstatě chybějící endogenní telomerasové aktivita je důsledkem chybějící endogenní telomerasové RNA složky. Tato knockoutovaná zvířata se používají jako komerční reak15 ční činidla pro toxikologické testy, pro prodej do farmaceutických výzkumných laboratoří nebo k identifikaci činidel modulujících telomerasu, jako domácí mazlíčkové a jako zemědělský dobytek, mimo jiná použití.
V osmém aspektu tento vynález poskytuje způsob znesmrtelnění savčích buněk, jako jsou žádané fermentační buňky v bioreaktoru nebo žádaný buněčný kmen, který má výhodné vlastnosti jako komerční výzkumné činidlo. Tento způsob zahrnuje zavedení polynukleotidu, který exprimuje funkční telomerasovou RNA složku, která je schopna tvořit funkční telomerasový enzym v přítomnosti telomerasové proteinové složky, do savčí buňky.
Další vlastnosti a výhody vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu výkresů, výhodných provedení vynálezu, příkladů a nároků.
V následující části spisu jsou uvedeny definice používaných pojmů.
Pojem polynukleotid telomerasové RNA složky” tak, jak se zde používá, znamená polynukleotid s alespoň 20 nukleotidy, při čemž polynukleotid obsahuje segment alespoň 20 nukleotidů, které jsou alespoň z 85 % identické se sekvencí přirozeně se vyskytující savčí telomerasové RNA složky, typicky telomerasové RNA složky primáta, jako je lidská nebo opičí telomerasové RNA složka. Některé polynukleotidy telomerasové RNA složky, které mají v sekvenci variace při srovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí telomerasové RNA složky nebo jejím doplňkem, mohou být vhodné jako hybridizační sondy, PCR primery, LCR amplimery, RNA složky s chybným párováním a podobné.
Pojem odpovídá (něčemu) tak, jak se zde používá, znamená, že polynukleotidová sekvence je homologní (tj. je identická, nikoliv striktně evolučně příbuzná) s celou nebo s částí příslušné polynukleotidové sekvence nebo že polypeptidová sekvence je identická s referenční polypeptidovou sekvencí. Napro16 ti tomu pojem doplňkový k tak, jak je zde používán, znamená, že doplňková sekvence je homologní s celou nebo s částí referenční polynukleotidové sekvence. Pro ilustraci - sekvence nukleotidů TATAC odpovídá referenční sekvenci TATAC a je doplňková k refereční sekvenci GTATA.
Pro popis vzájmeného vztahu sekvencí mezi dvěma nebo více polynukleotidy se používají následující pojmy: referenční sekvence, srovnávací okénko, identita sekvence, procento identity sekvence a podstatná identita. Pojem referečnní sekvence je defuinován jako taková sekvence, která se používá jako základ pro srovnávání sekvencí. Referenční sekvence může být podřada větší sekvence, například segment sekvence genu telomerasové RNA složky o plné délce. Obecně má referenční sekvence délku alespoň 20 nukleotidů, často alespoň 25 nukleotidů, často alespoň 50 nukleotidů. Jelikož dva polynukleotidy 1) mohou obsahovat sekvence (tj. část úplné sekvence polynukleotidu), které jsou v obou polynukleotidech podobné, a 2) dále mohou obsahovat sekvence, které jsou v obou polynukleotidech odchylné, sekvence pro srovnání těchto dvou (nebo více) polynukleotidů jsou typicky tvořeny srovnáním sekvencí těchto dvou polynukleotidů přes srovnávací okénko, čímž se identifikují a srovnají místní oblasti sekvenční podobnosti.
Pojem srovnávací okénko tak, jak se zde používá, se týká pojmového segmentu alespoň 25 přilehlých nukleotidových poloh, v nichž může být polynukleotidová sekvence srovnána s referenční sekvencí alespoň 25 přilehlých nukleotidů a v němž část této polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okénku může obsahovat přidání nebo delece (tj. mezery) z 20 nebo méně procent při srovnání s refereční sekvencí (která neobsahuje adice nebo delece) pro optimální seřazení těchto dvou sekvencí. Optimální seřazení sekvencí pro seřazování srovnávacím okénkem se může provádět algoritmem lokální homologie podle Smitha a Watermana: Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981), algoritmem homologního seřazení podle Needlemana a Wunsche: J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), vyhledáváním podobnosti způsobem podle Pearsona a Lipmana: Proč.
Nati. Acad. Sci. (USA) 85, 2444 (1988), počítačovým zpracováním těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTAS ve Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wi., USA) nebo vyhledáváním a nejlepším seřazením (tj. takovým, které vede k nejvyššímu procentu homologie při srovnání okénkem) různými vybranými způsoby.
Pojem identita sekvence znamená, že dvě polynukleotidové sekvence jsou identické (tj. na základě nukleotid za nukleotidem) při srovnání v okénku. Pojem procento identity sekvence se vypočte srovnáním dvou sekvencí optimálně seřazených srovnávacím okénkem, stanovením počtu poloh, v nichž se v obou sekvencích vyskytují identické báze nukleové kyseliny (např. A, T, C, G, U nebo I), čímž se získá počet rovnajících se poloh. Počet rovnajících se poloh se vydělí celkovým počtem poloh ve srovnávacím okénku (tj. velikostí okénka), výsledek se vynásobí 100 a získá se tak procento identity sekvence. Pojem podstatná identita tak, jak se zde používá, znamená takovou polynukleotidovou sekvenci, která má alespoň 80% identitu sekvence, s výhodou alespoň 85% identitu sekvence a často 89 až 95% identitu sekvence, obvykleji alespoň 99% identitu sekvence při srovnání srovnávacím okénkem s referenční sekvencí alespoň 20 poloh nukleotidů, často alespoň 30 až 50 nukleotidů, při čemž procento identity sekvence se vypočte srovnáním referenčí sekvence s polynukleotidovou sekvencí, která může zahrnovat delece nebo přidání celkem z 20 nebo méně % v referenční sekvenci ve srovnávacím okénku. Referenční sekvence může být podřadou větší sekvence, například segmentem sekvence genu telomerasové RNA složky plné délky, jak zde popsáno.
Specifická hybrídizace je zde definována jako vytvoření hybridů mezi polynukleotidovou sondou (např. polynukleotidem podle vynálezu, který může obsahovat substituce, deleci a/nebo adice) a specifickým cílovým polynukleotidem, (např. telomerasovou RNA složkou nebo sekvencí genomového genu), při čemž sonda preferečně hybridizuje se specifickým cílem takže například jediný pás odpovídající jednomu nebo více RNA druhům genu telomerasové RNA složky (nebo specificky štěpeným nebo opracovaným druhům telomerasové RNA složky) může být identifikován Northernovým blotem RNA připravené z vhodného buněčného zdroje (např. somatické buňky exprimující telomerasovou RNA složku). Polynukleotidy podle vynálezu, které specificky hybridizují se savčí telomerasovou RNA složkou nebo lidskými telomerními sekvencemi, se mohou připravovat na základě sekvenčních dat získaných podle jiných způsobů a termodynamických principů známých v oblasti techniky a popsaných Maniatisem a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 a Bergerem a Kimmelem: Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academie Press, lne., San Diego, Ka. (1987), které jsou zde zahrnuty jako odkazy.
Pojem vhodné vazebné podmínky tak, jak je zde používán, se týká vodných podmínek, při nichž savčí telomerasové RNA složka asociuje s příbuznou proteinovou složkou a tvoří enzymaticky aktivní telomerasový holoenzym schopný katalytické replikace, opravy a/nebo přidání telomerních repeticí z vhodné matrice obsahující telomerní repetice. Tato matrice s telomerní repeticí může nebo nemusí být přítomna. Vhodnými vazebnými podmínkami mohou být také fysiologické podmínky. Fysiologické podmínky tak, jak se zde tento pojem používá, se týkají teploty, pH, iontové síly, viskozity a podobných biochemických parametrů, které jsou slučitelné s životaschopným organismem a/ /nebo typicky existují intracelelulárně v životaschopné kultivované savčí buňce, zvláště takové podmínky, které existují v jádru uvedené savčí buňky. Například intracelulární nebo cytoplasmové podmínky v savčí buňce vyrostlé za typických podmínek laboratorní kultivace jsou fysiologické podmínky. Vhodné in vitro reakční podmínky pro in vitro transkripční směsi jsou obecné fysiologické podmínky. Příklady mohou být rozmanité jaderné extrakty známé z oblasti techniky. Obecně, in vitro fysiologické podmínky mohou zahrnovat 50 až 200mM NaCl nebo KC1, pH 6,5 až 8,5, 20 až 45 °C a 0,001 až lOmM dvojmocný kation (např. hořečnatý, vápenatý), s výhodou 150mM NaCl nebo KC1, pH 7,2 až
7,6, a 5xnM dvojmocný kation, a často obsahují 0,01 až 1,0 % (hmotn.) nespecifického proteinu (např. BSA). Často může být přítomno neiontové detergentní činidlo (Tween, NP-40, Triton X-100), obvykle v množství 0,001 až 2, typicky 0,05 až 0,2 % (obj.). Příslušné vodné podmínky se mohou zvolit praktickým způsobem podle konvenčních způsobů. Obecně lze uvést, že jsou použitelné následující pufrovací vodné podmínky: 10 až 250mM NaCl, 5 až 50mM Tris HC1, pH 5 až 8, s případným přidáním dvojmocného kovu (kovů) a/nebo chelátů kovů a/nebo neiontových detergentních činidel a/nebo membránových frakcí a/nebo protipěnivých činidel a/nebo scintilačních činidel.
Pojem označení nebo označený znamená zahrnutí detegovatelného markéru (značky), např. zahrnutím radioaktivně označené aminokyseliny nebo připojení biotinylových zbytků, které mohou být detegovány označeným avidinem (např. streptavidin obsahující fluorescenční markér nebo enzymatická aktivita, která může být detegována optickými nebo kalorimetrickými způsoby), na polypeptid. Mohou se používat a odborníkům z oblasti techniky jsou známy různé způsoby označování polypeptidů a glykoproteinů. Mezi příklady označení polypeptidů patří, ale nejsou na ně omezena, následující označení: radioisotopy (např. 3H, 14C, 35S, 125I, 131I), fluorescenční označení (např. FITC, rhodamin, lanthanidové fosfory), enzymatická označení (např. křenová peroxidasa, β-galaktosidasa, luciferasa, alkalická fosfatasa), biotinylové skupiny, předem určené polypeptidové epitopy rozpoznávané sekundárním reportérem (např. leucinové zipové párové sekvence, vazebná místa pro sekundární protilátky, traskripční aktivátorový polypeptid, kovové vazebné domény, epitopové značky). V některých provedeních jsou označení připojena raménky různé délky, aby se snížila potenciální sterická zábrana.
Pojem statisticky významný tak, jak se zde používá, znamená výsledek (tj. vyhodnocení testu), který je obecně alespoň dvě standardní odchylky nad a pod středem alespoň tří oddělených stanovení kontrolního vyhodnocení testu a/nebo který je statisticky významný podle Studentova testu nebo jiné v oblasti techniky přijatelné míry statistické významnosti.
Pojmy pathognomomická koncentrace”, pathognomomické množství” a pathognomomický hybridizační systém” se týkají koncentrace, množství nebo systému umístění telomerasové RNA složky ve vzorku, což ukazuje na přítomnost pathologického (např. neoplastického, stárnoucího, imunodeficitního, neurodegenerativního, zánětlivého atd.) stavu nebo predisposice k rozvinutí neoplastického onemocnění, jako je karcinom, sarkom nebo leukemie. Pathognomomické množství je takové množství telomerasové RNA složky v buňce nebo v buněčném vzorku, které je mimo rozsah normálních klinických hodnot, které jsou dány příslušnými statistickými klinickými studiemi. Obecně - jednotlivec, který má neoplastické onemocnění (např. karcinom, sarkom nebo leukémii), vykazuje takové množství telomerasové RNA složky v buňce nebo ve vzorku tkáně, které je mimo rozsah koncentrací, které charakterizují normální, neonemocnělé jednotlivce. Pathognomomickou koncentraci je typicky taková koncentrace, která je alespoň jednu standardní odchylku mimo střední normální hodnotu, obvykleji alespoň dvě nebo více standardních odchylek nad střední normální hodnotou. V podstatě všechny klinické diagnostické testy však poskytují něco procent falešných positivních a falešných negativních výsledků. Citlivost a selektivita diagnostického testu musí být dostatečná k tomu, aby uspokojila diagnostický předmět a jakékoliv příslušné regulační pořadavky. Diagnostické způsoby podle vynálezu se obecně používají pro identifikaci jednotlivců jako kandidátů onemocnění a poskytují tak další parametr v diferenční diagnose onemocnění, kterou provádí příslušný zdravý profesionál.
Pojem ”alela onemocnění” tak, jak se zde používá, znamená takovou alelu genu, která je schopna produkovat rozpoznatelné onemocnění. Alela onemocněni může být dominantní nebo recesivní a může vést k onemocnění přímo nebo tehdy, jestliže je přítomna v kombinaci se specifickým genetickým pozadím nebo předem existujícím pathologickým stavem. Alela onemocnění může být příto21 mna v sestavě genů nebo může být generována de novo v jednotlivci somatickou mutací.
Pojem antineoplastické činidlo je zde používán k označení činidel, která mají funkční vlastnost vykazovat rozvinutí nebo progresi neoplazmu u člověka, často včetně inhibice metastaze nebo metastatického potenciálu.
Pojem odštěpitelně napojený tak, jak se zde používá, se týká vazby polynukleotidových prvků ve vzájemném funkčním vztahu. Nukleová kyselina je odštěpitelně napojena tehdy, jestliže je umístěna ve funkčním vzájemném vztahu se sekvencí jiné nukleové kyseliny. Například promotor nebo zesilovač je odštěpitelně napojen na kódující sekvenci tehdy, jestliže ovlivňuje transkripci kódující sekvence. Odštěpitelně napojený znamená, že DNA sekvence je napojena typicky přilehlým způsobem a, jestliže je to nutné, spojuje dvě oblasti kódující protein, přilehlou a ve čtecí formě. Avšak jelikož zesilovače obecně fungují, když jsou odděleny od promotoru několika tisíci nukleotidů a intronové sekvence mohou být různé délky, některé polynukleotidové prvky mohou být odštěpitelně napojeny, ale nejsou přilehlé. Strukturní gen (např. HSV tk gen), který je odštěpitelně napojen na polynukleotidovou sekvenci odpovídající transkripční regulační sekvenci endogenního genu, je obvykle exprimován v podstatě stejně temporální a pro typ buněk specifické sestavě, jako v přirozeně se vyskytujícím genu.
Pojem transkripční jednotka nebo transkripční komplex tak, jak se používá zde, znamená polynukleotidovou sekvenci, která obsahuje strukturní gen (exony), cis-působící vazebný promotor a další cis-působící sekvence nutné pro účinnou transkripci strukturních sekvencí, vzdálené regulační prvky nutné pro příslušnou tkáňově specifickou a vývojovou transkripci strukturních sekvencí a další cis sekvence důležité pro účinnou transkripci a translaci (např. polyadenylační místo, sekvence regulující stabilitu mRNA).
Pojem transkripční modulace (úprava)” se zde používá k označení kapacity buď zvýšit transkripci nebo inhibovat transkripci strukturní sekvence navázané cis. Toto zvýšení nebo inhibice může být náhodné vzhledem k výskytu specifické události, jako je stimulace indukčním čindidlem, a/nebo se může projevit v některých buněčných typech.
Pojem transkripční regulační oblast tak, jak se zde používá, se týká DNA sekvence obsahující funkční promotor a jakékoliv související transkripční prvky (např. zesilovač, box CCAAT, box TATA, místo SPI atd.), které jsou podstatné pro transkripci polynukleotidové sekvence, která je odštěpitelně napojena na transkripční regulační oblast.
Pojem nulová alela tak, jak se zde tento pojem používá, znamená, že místo genu obsahuje alespoň jednu mutaci nebo strukturní změnu tak, že nulová alela je v podstatě neschopna řídit účinnou expresi funkčního genového produktu. Knockoutovaná buňka znamená takovou buňku, která má alespoň jednu nulovou alelu endogenního genu, typicky je homozygotní pro nulovou alelu. Například knockoutovaná buňka může být tedy homozygotní pro nulové alely na místě telomerasové RNA složky, takže knockoutovaná buňka je v podstatě neschopna exprimovat funkční telomerasovou RNA složku.
V následující části spisu budou stručně popsány připojené obrázky.
Obrázek 1: Telomerasová aktivita z buněk exprimujících extrakty matricí mutované TRC3 frakcionované na DEAE sepharose ze stabilních transformantů exprimujících mutant TRC3 byly testovány na telomerasovou aktivitu konvenčními testy za různých reakčnich podmínek. Extrakty z buněk exprimujících MuC+17 TRC3 (pásy 1, 4, 7, 10, 13, 16 označené C*), MuC TRC-3 (pásy 2, 5, 8, 11, 14, 17 označené C) nebo MuA TRC3 (pásy 3, 6, 9, 12, 15, 18 označené A) byly testovány za normálních reakčnich podmínek (pásy 1 až 6), normální plus 0,5mM ddCTP (pásy 7 až 9), normál23 ní minus dTTP plus 0,5mM ddTTP (pásy 10 až 12) nebo normální minus dATP plus 0,5mM ddATP (pásy 13 až 18). Testovací reakce v pásech 1 až 9 obsahovaly 8μΜ celkový dGTP, z čehož 1 μΜ byl 32P-dGTP (800 Ci/mmol). Pro usnadnění detekce mutantu telomerasy testovací reakce v pásech 10 až 18 obsahovaly 8μΜ celkový dGTP, z čehož 2 μΜ byl 32P-dGTP (800 Ci/mmol). Extrakty byly nechány zreagovat s RNasou bez DNasy (25 μg/ml, 10 minut při 30 °C) před telomerasovými testy (pásy 1 až 3, 16 až 18). Obklopující pásy obsahují DNA markéry s uvedeným počtem párů nukleotidů (p.n.).
Obr. 2: Hladina telomerasové RNA složky (hTR) a GAPDH RNA v ustáleném stavu byla stanovena kvantitativní PT-PCR. Kontroly ukazují, že všechny PCR kvantifikace byly v lineárním rozmezí až do 25 cyklů. RT-PCR byla analyzována pro pět normálních buněčných linií negativních na telomerasu (1 až 5) a pět buněčných linií positivních na nádorovou telomerasu (6 až 10): 1) primární plodové plíce, 2) primární plodová kůže ruky, 3) primární prostata dospělého, 4) primární synoviální fibroblasty, 5) fibroblasty předkožky, 6) melanom LOX, 7) leukemie U251, 8) plicní karcinom NCIH23, 9) nádor žaludku SW620, 10) nádor prsu MCF7. PCR produkty byly označeny 32P, rozděleny na 6% (hmotn.) PAGE a kvantitativně vyhodnoceny zařízením Phosphorlmager. Relativní transkripce je vyjádřena v dohodnutých jednotkách.
Obr. 3: Střední TRF délka v telomerasové RNA složky antimediátorových a vektorových kontrolních buněk. HeTe7 buňky, které stabilně exprimují 10-3-hTR antimediátorovou nebo vektorovou kontrolu, byly vybrány na hygromycinovém a puromycinovém mediu a isolovány při 23 PDL po transfekci. Jaderná DNA byla vyčištěna, rozštěpena Hinfl a Rsal a nanesena na 0,5% (hmotn.) agarosový gel. DNA byla sondována v gelu oligonukleotidem (TTAGGG)3 pro označeni telomerních terminálnich restrikčních fragmentů (TRF). Gel byl skanován zařízením Molecular Dynamiczs Phosphorlmager a střední TRF byla kvantitativně vyhodnocena jak popsáno v oblasti techniky [Allsopp a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 89 f 10114 (1992).]. Čárkované čáry ukazují průměrný střední TRF pro antimediátořovou a kontrolní skupinu.
Obr. 4: Schematické znázornění PCR způsobu in sítu.
V následující části spisu je uveden popis výhodných provedení .
Předložený vynález poskytuje způsoby, reakční činidla, geneticky modifikované živočichy a buňky a farmaceutické prostředky týkající se ribonukleoproteinové lidské telomerasy.
Zde použitá nomenklatura a níže popsané laboratorní postupy v buněčné kultuře, molekulární genetice a chemii a hybridizaci nukleových kyselin mohou zahrnovat dobře známé a obvykle používané postupy v oblasti techniky. Při způsobech rekombinantní nukleové kyseliny, syntéze polynukleotidů a mikrobiální kultivaci a transformaci se používají standardní způsoby (např. elektroporace, lipofekce). Tyto způsoby a postupy se obvykle provádějí podle konvenčních způsobů z oblasti techniky a různých obecných odkazů (viz obecně: Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, zařazené sem jako odkaz), které jsou uvedeny v tomto spisu.
Oligonukleotidy se mohou syntetizovat na syntetizátoru oligonukleotidů Applied Bio Systems podle pokynů poskytnutých výrobcem.
Způsoby PCR amplifikace jsou popsány v oblasti techniky (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, red. H.A. Erlich, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Apllications, red. Innis, Gelfland, Snisky a White, Academie Press, San Diego, Ka. (1990); Mattila a spol.; Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991), Eckert K.A. a Kunkel T.A.: PCR Methods and Applicaions 1, 17 (1991), PCR, red. McPherson, Quirkes a Taylor, IRL Press, Oxford a USA patent 4 683 202; všechny jsou zde uvedeny jako od25 kazy).
Tento vynález zčásti vychází z klonování a isolace RNA složky lidské telomerasy a genu pro tuto RNA složku, včetně asociovaných transkripčních kontrolních prvků. Nukleotidová sekvence RNA složky lidské telomerasy je uvedena níže. Z důvodů výhodnosti je sekvence uvedena použitím standardních zkratek pro ribonukleotidy (A znamená riboadenin, G znamená riboguanin, C znamená ribocytidin a U znamená uridin). Zručný odborník z oblasti techniky rozpozná, že níže uvedená sekvence ukazuje také sekvenci cDNA, v niž jsou ribonukleotidy nahrazeny deoxyribonukleotidy (při čemž uridin je nahrazen thymidinem):
GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC
100
UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC
150
UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU
200
UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC
250
GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC
300
UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC
350
GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU
400
UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC
450
GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC
500
AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC
550
CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC
559
CAGUGUGCU.
Shora uvedená sekvence je uvedena ve směru 57-37 a pro odkazy je očíslována. Předpokládá se, že sekvence matrice RNA složky je umístěna v oblasti definované nukleotidy 50 až 60 (57-CUAAC. .CCUAAC-37), která je doplňková k telomerní sekvenci sestavené z asi jedné a dvou třetin jednotek telomernich repeticí.
Tato sekvence byla odvozena od cDNA klonů a od genomového klonu RNA složky. Jestliže se nejdříve přepíše RNA složka z odpovídajícího genu, alespoň některé produkované RNA transkripty jsou mnohem delší než shora uvedená sekvence asi 560 nukleotidů a ve skutečnosti mohou obsahovat více než 1000 nukleotidů. Plně funkční telomerasová molekula se však může sestavit z transkriptů obsahujících shora uvedenou sekvenci asi 560 nukleotidů. Předpokládá se, že 3*-konec RNA složky v přírodní telomerase leží v oblasti definované nukleotidy 514 až 559 shora uvedené sekvence. Jedna analýza ukazuje, že 37-konec může znamenat zbytek U na nukleotidu 538. Pro přípravu aktivní telomerasy se také mohou použít molekuly rekombinantní RNA složky obsahující méně než nukleotidy 1 až 559 shora uvedené sekvence.
Z genomové knihovny lidské DNA vložené do lambda vektoru FIXU byl identifikován a isolován genomový klon. Genomový klon obsahující sekvence genu RNA složky obsahoval insert s asi 15 000 páry nukleotidů a byl označen klon 28-1. Gen je umístěn na vzdáleném konci q ramene chromosomu 3. Informaci o sekvenci získané od místa rozpoznávajícího restrikční enzym SauIIIAl na konci insertu o asi 15000 párech nukleotidů k vnitřnímu místu rozpoznávajícího restrikční enzym HindlII, která obsahuje celou sekvenci maturované RNA složky a také transkripční kontrolní prvky genu RNA složky, lambda klonu 28-1 je uvedena níže s použitím standardních deoxyribonukleotidových zkratek a to ve směru 57-37 :
GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT
100
CAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA
150
AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAAT
200
GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT
250
TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA
300
CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT
350
GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG
400
GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC
450
GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT
500
TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG
550
TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT
600
GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA
650
CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG
700
CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC
750
CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA
800
GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAAT
850
TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT
900
TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG
950
ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT
1000
CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG
1050
GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG
1100
TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT
1150
GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT
1200
GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA
1250
GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA
1300
AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC
1350
GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC
1400
CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG
1450
CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC
1500
AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT
1550
TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC
1600
CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC
1650
TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG
1700
GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA
1750
ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT
1800
GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG
1850
GGCGAGGTTCACCCTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG
1900
CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC
1950
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA
2000
TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT
2050
GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA
2100
AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC
2150
TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT
2200
ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA
2250
AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT
2300
TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA
2350
AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA
2400
GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC
2425
AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT.
Sekvence RNA složky začíná u nukleotidu 1459. V sekvenci jsou identifikovány různé transkripční kontrolní prvky. A/T box souhlasné sekvence byl nalezen u nukleotidů 1431 až 1436, PSE souhlasné sekvence byly nalezeny u nukleotidů 1406 až 1414 a také 1508 až 1526, CAAT box souhlasné sekvence je u nukleotidů 1399 až 1406, SPI souhlasná sekvence byla nalezena u nukleotidů 1354 až 1359 a souhlasná sekvence β/γ-intereferonového prvku byla nalezena u nukleotidů 1234 až 1245. Transkripce genu lidské telomerasové RNA složky v lidských buňkách v ustáleném stavu, jako je HT1080 (exprimující telomerasu), je v podstatě nezměněna, jestliže jsou ve vektorech, které jsou stabilně transfektovány do buněk, deletovány sekvence proti směru vlákna od nukleotidu 1159.
DNA z veverčí opice, o které se předpokládá, že patří mezi primáty, kteří se nejvíce geneticky odlišují od člověka, obsa30 huje gen telomerasové RNA složky, který je amplifikovatelný PCR primery sestávajícími ze sekvencí, které odpovídají nebo jsou doplňkové k objevené polynukleotidové sekvenci lidské telomerasové RNA složky. 0 jiných primátech (nikoliv člověk) se předpokládá, že vlastní geny telomerasové RNA složky, které jsou také amplifikovatelné PCR primery odvozenými od sekvence genu lidské telomerasové RNA složky.
V další části jsou popsány polynukleotidy telomerasové RNA složky.
Objev sekvencí savčí telomerasové RNA složky a jejího genu, jak uvedeno shora pro lidskou telomerasu a na obr. 5 pro telomerasu veverčí opice, umožnil konstrukci isolovaných polynukleotidů, které obsahují sekvenci alespoň 15 přilehlých nukleotidů, typicky alespoň 20 až 25 přilehlých nukleotidů, které jsou v podstatě identické se sekvencí savčí telomerasové RNA složky nebo sekvencí genu savčí telomerasové RNA složky. A dále, sekvence (a gen) savčí telomerasové RNA složky umožňuje konstrukci hybridizačních sond nukleové kyseliny a PCR primerů, které se mohou používat pro detekci RNA a DNA sekvencí příbuzné telomerasové RNA složky a/nebo genu v buňce, buněčném vzorku, části tkáně, reakční nádobě, hybridizační membráně nebo podobně.
Polynukleotidy obsahující sekvence savčí telomerasové RNA složky mohou zahrnovat sekvence, které usnadňují transkripci (expresní sekvence), sekvence stabilizující RNA a podobné. 0becné principy konstrukcí takových polynukleotidů z hlediska zde popsané informace o sekvenci, průběhu a směru vynálezu, jsou dobře známy v oblasti techniky a jsou popsány dále v knize Maniatise a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989. Například, ale nikoliv jako omezení, mohou tyto polynukleotidy zahrnovat promotor a popřípadě zesilovač transkripce pro použití v eukaryotických expresních hostitelích a popřípadě sekvence nutné pro replikaci vektoru. Typická eukaryotická expresní kazeta bude obsahovat polynukleotidovou sekvenci, která, jestliže je transkribována, produkuje transkript savčí telomerasové RNA složky. Taková polynukleotidová sekvence je navázána po směru vlákna (tj. při orientaci traskripce od 5' ke 3' vhodného promotoru, jako je HSV tk promotor nebo pgk (fosfoglycerátkinásový) promotor, popřípadě napojena na zesilovač transkripce.
Jestliže není žádoucí exprese funkční telomerasové složky, polynukleotidy podle tohoto vynálezu nepotřebují transkribovat funkční transkript telomerasové RNA složky. Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou sloužit jako hybridizační sondy a/ /nebo PCR primery (amplimery) a/nebo LCR oligomery pro detegování RNA nebo DNA sekvencí telomerasové RNA složky.
Nebo mohou polynukleotidy podle tohoto vynálezu sloužit jako hybridizační sondy nebo primery pro detegování RNA nebo DNA sekvencí příbuzných genů nebo genu telomerasové RNA složky u příbuzných druhů, typicky savčích druhů. Pro takovou hydridizaci a PCR aplikace nepotřebují polynukleotidy podle vynálezu transkribovat funkční telomerasovou RNA složku. Polynukleotidy podle vynálezu mohou tedy obsahovat podstatné delece, adice, substituce a/nebo přemístění nukleotidů, pokud je zachována specifická hybridizace nebo specifická amplifikace na sekvenci savčí telomerasové RNA složky.
Genomové nebo cDNA klony savčí telomerasové složky a odpovídající genové sekvence se mohou isolovat z knihoven klonů (např. dostupných od Clontech, Palo Alto, Ka.) pomocí hybridizačních sond navržených na bázi nukleotidových sekvencí zde popsaných konvenčními hybridi začni mi vyhledávacími způsoby [např. Benton W.D. a Davis R.W.: Science 196. 180 (1977), Goodspeed a spol.: Gene 76. 1 (1989).]. Jelikož je žádoucí cDNA klon, výhodné jsou knihovny klonů obsahující cDNA odvozené od RNA somatických buněk nebo jiné RNA buňky exprimující telomerasovou RNA složku. Syntetické polynukleotidové sekvence odpovídající celé nebo části zde popsaných sekvencí se mohou zkonstruovat také chemickou syntézou oligonukleotidů. Polymerní řetězová reakce (PCR) používající primery na bázi zde popsaných dat sekvencí se mohou použít pro amplifikování DNA fragmentů z genomové DNA, RNA sestav nebo z knihoven cDNA klonů. USA patenty č. 4 683 195 a 4 683 202 popisují PCR způsob.
Tyto polynukleotidy mají rozmanitá použití, mezi něž patří použití jako sondy telomerasové RNA složky, jako matrice pro výrobu funkční nebo nefunkční telomerasové RNA složky v buňkách, jako komerční diagnostická činidla pro standardizování detekčních testů telomerasové RNA složky a jako genová terapie polynukleotidy pro podávání živočichům. Tyto polynukleotidy se mohou mimo jiné použít také jako potraviny, spalovatelné zdroje energie, činidla pro sluneční filtry absorbující UF světlo a rozpuštěné látky zvyšující viskozitu.
Zde popsané plasmidy, které byly zkonstruovány během klonování RNA složky lidské telomerasy a genu pro RNA složku, jsou důležitými aspekty předloženého vynálezu. Tyto plasmidy se mohou použít pro produkci RNA složky lidské telomerasy stejně jako genu lidské telomerasy v v podstatě čisté formě, což je ještě další důležitý aspekt tohoto vynálezu. Vedle toho zruční odborníci z oblasti techniky rozpoznají, že jako materiály získané podle předloženého vynálezu jsou užitečné různé jiné plasmidy i neplasmidové nukleové kyseliny v v podstatě čisté formě, které obsahují celou nebo alespoň část užitečné části sekvence nukleotidů RNA složky lidské telomerasy.
Jako obecný bod týkající se nukleových kyselin a jejich přípravků, které obsahují nukleové kyseliny podle vynálezu, rozpoznají odborníci z oblasti techniky, že nukleové kyseliny podle vynálezu zahrnují jak DNA tak RNA molekuly stejně jako jejich syntetické, ne-přirozeně se vyskytující analogy a heteropolymery deoxyribonukleotidů, ribonukleotidů a/nebo jejich analogy. Příslušný prostředek nukleové kyseliny nebo analogu nukleové kyseliny podle vynálezu bude záviset na účelu, pro který se tento materiál používá a na prostředí, do kterého se tento materiál umístí. Modifikované nebo syntetické, ne-přiro33 ženě se vyskytující nukleotidy byly navrženy tak, aby sloužily různým účelům a aby zůstaly stabilní v rozmanitých prostředích, jako jsou ty, v nichž jsou nukleasy přítomny, jak je dobře známo z oblasti techniky. Modifikované nebo syntetické ne-přirozeně se vyskytující nukleotidy se při srovnání s přirozeně se vyskytujícími ribo- nebo deoxyribonuleotidy mohou lišit v cukru, fosfátové vazbě nebo podílu nukleotidů v nukleotidu nebo mohou v některých případech dokonce obsahovat ne-nukleotidové báze (nebo vůbec žádnou bázi). Viz např. Arnold a spol.: PCT patentový spis č. WO 89/02439, nazvaný Ne-nukleotidová činidla pro nukleotidové sondy”, který je zde zahrnut jako odkaz. Právě jako mohou nukleové kyseliny podle vynálezu obsahovat rozmanité nukleotidy, tak mohou tyto nukleové kyseliny sloužit rozmanitým užitečným funkcím.
V další části je popsána isolace příbuzných genů.
Jak bylo uvedeno v předcházejícím popisu, přístup k vyčištěným nukleovým kyselinám obsahujícím sekvenci RNA složky lidské telomerasy poskytuje cenné diagnostické a terapeutické způsoby a činidla stejně jako jiné důležité příznivé přínosy. Jeden důležitý přínos podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že způsoby a činidla podle vynálezu se mohou používat pro isolaci RNA složky a genů pro RNA složku telomerasy z jakéhokoliv druhu savce, který má RNA složku v podstatě homologní s lidskou RNA složkou podle předloženého vynálezu. Pojem v podstatě homologní znamená stupeň homologie potřebný pro specifickou hybridizaci oligonukleotidů nebo sekvence nukleové kyseliny lidské RNA složky na sekvenci nukleové kyseliny sekvence RNA složky jiných druhů savců. Jestliže je tato podstatná homologie dána, odborníci z oblasti techniky mohou použít nukleové kyseliny a oligonukleotidové primery a sondy podle vynálezu pro identifikování a isolování v podstatě homologních sekvencí.
Například lze sondovat genomovou nebo cDNA knihovnu pro detekci honmologních sekvencí. Lze používat také primery odpovídající oblastem sekvence RNA složky a PCR amplifikaci za podmínek nízké nebo mírné selektivity pro amplifikování sekvence specifické homologní nukleové kyseliny z přípravků RNA nebo DNA z různých druhů savců. Použitím těchto a dalších podobných způsobů mohou zruční odborníci z oblasti techniky snadno isolovat nejen pouze varianty nukleových kyselin RNA složky z lidských buněk, ale také homologní nukleové kyseliny RNA složky z jiných savčích buněk, jako jsou buňky z primátů, ze savců veterinárního zájmu, tj. dobytka, ovcí, koní, psů a koček, a z hlodavců, tj. krys, myší a křečků. A naopak, tyto nukleové kyseliny se mohou používat pro přípravu transgenních zvířat velké hodnoty pro vyhledávání a testování farmaceutických přípravků, které regulují telomerasovou aktivitu. Například použitím plasmidu podle vynálezu lze knockoutovat gen RNA složky nebo nahradit gen přírodní RNA složky rekombinantním indukovatelným genem v mus spretus embryonální kmenové buňce a potom generovat transgenní myši, které budou užitečné jako model nebo testovací systém pro studie onemocnění souvisejících s věkem a stárnutím. Níže uvedený příklad 9 ilustruje, jak lze takovou metodologii použít pro identifikaci a isolaci sekvencí RNA složky z primátů.
Vyhledáváním vhodných nelidských savčích genomových nebo cDNA klonových knihoven, jako jsou ty, které jsou odvozeny od myší, krys, králíků, morčat, křečků, koz, krav, ovcí a prasat, nebo jiných genomových nebo cDNA knihoven ve vhodném vektoru, jako jsou kvasinkové umělé chromosomy, kosmidy nebo bakteriofág λ (např. λ Charon 35), lze identifikovat a isolovat další savčí homology lidských a opičích telomerasových RNA složek a/nebo příbuzných genů polynukleotidovou sondou obsahující sekvenci alespoň 20 přilehlých nukleotidů (nebo jejich doplněk) sekvence lidské nebo opičí telomerasové RNA složky nebo polynukleotidu genu. Typicky se hybridizace a promývání provádí za podmínek vysoké selektivity podle konvenčních hybridizačních postupů. Positivní klony se isolují a sekvenují. Pro ilustraci a nikoliv pro omezení - polynukleotid plné délky odpovídající sekvenci 559 nukleotidů lidské telomerasové RNA složky se může označit a používat jako hybridizační sonda pro isolaci genomových klonů z nelidské genomové klonové knihovny v ÁEMBL4 nebo AGEMll (Promega Corporation, Madison, Wi.); typické hybridizační podmínky pro testování plaků [Benton a Davis: Science 196, 180 (1978), Dunn a spol.: J. Biol. Chem. 264. 13057 (1989).] mohou být: 50% (hmotn.) formamid, 5x SSC nebo SSPE, 1 až 5x Denhardtův roztok, 0,1 až 1% (hmotn.) SDS, 100 až 200 Mg střihové heterologní DNA nebo tRNA, 0 až 10 % (hmotn.) dextransulfátu, 1.105 až 1.107 impulsů za minutu/ml denaturované sondy se specifickou aktivitou 1.10® cpm/gg a inkubace 6 až 36 h při 42 až 37 °C. Prehybridizační podmínky jsou v podstatě identické až na to, že není obsažena sonda a doba inkubace je typicky snížena. Podmínky promývání jsou typicky 1 až 3x SSC, 0,1 až 1% (hmotn.) SDS, 45 až 70 °C s výměnou promývacího roztoku 5 až 30 minut. Při isolování ne-lidských polynukleotidů telomerasové RNA složky polynukleotidovou sondou lidské telomerasové RNA složky je často výhodné hybridizovat za nízké selektivity, jako je přibližně 39 °C a promývat postupně při následujících stupních teplot: teplota místnosti, 37 °C, 39 °C, 42 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C a 70 °C. Po každém stupni se promývání zastaví a sleduje se signál pozadí sondy (a popřípadě se signál deteguje autoradiogramem a/nebo fosforovým zobrazením, jestliže se použije radioaktivně označená sonda). Promývací stupně končí, jestliže se dosáhne vhodného empiricky stanoveného poměru signál/pozadí.
Polynukleotidy obsahující sekvence přibližně alespoň 30 až 50 nukleotidů, s výhodou alespoň 100 nukleotidů, odpovídající nukleotidovým sekvencím uvedeným zde pro sekvence lidské a opičí telomerasové RNA složky nebo sekvence k nim doplňkové, mohou sloužit jako PCR primery a/nebo hybridizační sondy pro identifikování a isolování genů zárodečné linie odpovídajících sekvencím popsaného genu a RNA složky. Tyto geny zárodečné linie se mohou isolovat různými způsoby konvenčními v oblasti techniky, včetně, ale bez omezení na ně, hybridizačním prohledáváním genomových knihoven v knihovnách bakteriofágu λ nebo kosmidů nebo PCR amplifikací genomových sekvencí s použitím primerů odvozených od zde popsaných sekvencí. Lidské genomové knihovny jsou veřejně přístupné a mohou být zkonstruovány de novo z lidské DNA.
Odborníkovi z oblasti techniky je zřejmé, že do polynukleotidů podle vynálezu lze zahrnout nukleotidové substituce, delece a adice. Obměny nukleotidové sekvence mohou být důsledkem sekvenční polymorfie nebo různých alel a podobně. Tyto nukleotidové substituce, delece a adice by však neměly v podstatě ničit schopnost polynukleotidu hybridizovat se zde uvedenýmim sekvencemi polynukleotidu lidské nebo opičí telomerasové RNA složky plné délky za takových hybridizačních podmínek, které jsou dostatenčě selektivní, aby vedly ke specifické hybridizaci .
Polynukleotidy savčí telomerasové RNA složky mohou znamenat krátké oligonukleotidy (např. o délce 20 až 100 nukleotidů), jako jsou ty, které se používají jako hybridizační sondy a PCR (nebo LCR) primery. Polynukleotidové sekvence mohou také obsahovat část většího polynukleotidu (např. klonovací vektor obsahující klon telomerasové RNA složky) a mohou být napojeny polynukleotidovou vazbou na jinou polynukleotidovou sekvenci. Polynukleotidy telomerasové RNA složky typicky obsahují alespoň 25 po sobě jdoucích nukleotidů, které jsou v podstatě identické s přirozeně se vyskytující sekvencí telomerasové RNA složky nebo sekvencí genu, obvykleji polynukleotidy telomerasové RNA složky obsahují alespoň 50 až 100 po sobě jdoucích nukleotidů, které jsou v podstatě identické s přirozeně se vyskytující sekvencí savčí telomerasové RNA složky. Odborníci z oblasti techniky si však uvědomí, že minimální délka polynukleotidu telomerasové RNA složky potřebná pro specifickou hybridizaci na cílovou sekvenci telomerasové RNA složky bude mimo jiné záviset na několika faktorech: na obsahu G/C, na polohách nukleotidů (pokud nějaké existují) s chybným párováním, na stupni jedinečnosti sekvence při srovnání s populací cílových polynukleotidů a na chemické povaze polynukleotidu (např. methy lf osf onátový základní skelet, polyamidová nukleová kyselina, fosforthiolát atd.).
Jestliže je to žádoucí, PCR amplimery pro amplifikování cDNA kopií v v podstatě plné délce mohou být vybrány podle rozhodnutí odborníka z praxe. Podobně lze vybrat amplimery pro amplifikaci částí genu telomerasové RNA složky (opičí nebo lidské) .
Každá z těchto sekvencí se může použít jako hybridizační sonda nebo PCR amplimer pro detekci přítomnnosti telomerasové RNA složky, například při stanovení diagnosy neoplastického onemocnění vyznačujícího se přítomností zvýšené nebo snížené hladiny telomerasové RNA složky v buňkách, nebo pro označení tkáně (tj. identifikování tkání vyznačujících se expresí telomerasové RNA složky) a podobně. Tyto sekvence se mohou použít také pro detegování sekvencí genu genomové telomerasové RNA složky v DNA vzorku, jako je DNA analýza v soudním lékařství (např. RFLP analýzou, distribucí délek produktů PCR atd.) nebo pro diagnosu onemocnění, vyznačujících se amplifikaci a/nebo přesmyky genu telomerasové RNA složky.
Například a nikoliv jako omezení, pro amplifikování sekvenci polynukleotidů telomerasové RNA složky (např. cDNA) nebo jako hybridizační sondy (např. jako biotinylované nebo na konci označené oligonukleotidové sondy) se může používat následující pár oligonukleotidových primerů:
'-AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3' a
5·-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3'.
Odborníkům z oblasti techniky jsou na základě zde popsaných a a podle toho získatelných sekvencí telomerasové RNA složky zřejmé další vhodné PCR primery, LCR primery, hybridizační sondy a primery. Polynukleotidy lidské telomerasové RNA složky a jejich doplňky mohou sloužit jako hybridizační sondy nebo primery pro detekci RNA nebo DNA sekvencí savčí telomerasové RNA složky. Pro tuto hybridizaci a PCR aplikace mohou obsahovat podstatné delece, přidání, substituce a/nebo přemístění nukleotidů, pokud je zachována specifická hybridizace nebo specifická amplifikace sekvence lidské telomerasové RNA složky. Avšak tyto substituce, delece a přidání nukleotidů by však v podstatě neměly zrušit schopnost polynukleotidu hybridizovat se sekvencí telomerasové RNA složky nebo sekvencí genu za hybridizačních podmínek, které jsou v podstatě vysokoselektivní. Dochází tak ke specifické hybridizaci.
Například a bez omezeni může polynukleotid lidské telomerasové RNA složky obsahovat sekvenci od nukleotidu 48 do nukleotidu 209, o které se předpokládá, že je dostatečná pro rekonstituování lidského telomerasového holoenyzmu v přítomnosti telomerasové proteinové složky:
'—UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCAC CGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-3' nebo jako DNA:
5'-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGC TGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCAC CGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3·.
Polynukleotid lidské telomerasové RNA složky může také obsahovat nebo může sestávat z nukleotidů 1 až 559 a může zahrnovat přidání jiných nukleotidů nebo nukleotidových sekvencí na konci. Matricová varianta sestávající z nukleotidů 48 až 209, ale v níž je sekvence telomerní repetiční matrice změněna, je schopna soutěžit s upravenou RNA složkou sestávající ze sekvence 48 až 209 přírodního typu pro navázání na telomerasovou proteinovou složku a rekonstituováni telomerasového holoenzymu.
Strukturní analýza lidské telomerasové RNA složky ukazuje oblasti, které mají tendenci tvořit sekundární struktury, jako jsou vlásenkové smyčky. Například oblast od přibližně nukleotidu 200 do nukleotidu 350 lidské telomerasové RNA složky má podstatný charakter vlásenkové smyčky. Rovněž další části telomerasové vlásenkové smyčky mají významnou sekundární strukturu. Z hlediska této sekundární struktury mohou být zručnými odbor39 niky nahrazeny další nukleotidové sekvence, o nichž je počítačovou analýzou předpovězeno, že zaujímají podobné sekundární struktury. I když jsou pro stanovení nukleotidových sekvencí, které zaujímají v podstatě ekvivalentní sekundární struktury, vhodné různé počítačové programy, mohou se použít programy FOLD, SQUIGGLES, CIRCLES, DOMES, NOUNTAINS a STEMLOOP a podobné z UWGCG Sequence Analysis Software Package. Podobně mohou být programy molekulárního modelování navrženy nenukleotidové strukturní napodobeniny, jako jsou peptidové nukleové kyseliny a podobné, jako zpodobnění charakteristické sekundární struktury oblasti (oblastí) lidské telomerasové RNA složky, která (které) mají být napodobněny. Tato strukturní zpodobnění se mohou používat terapeuticky pro různá použití (např. kompetitivní antagonista atd.).
Jedním zvláště užitečným typem nukleové kyseliny podle vynálezu je antimediátorový oligonukleotid, který může být používán in vivo nebo in vitro pro inhibici aktivity lidské telomerasy. Antimediátorové oligonukleotidy obsahují specifickou sekvenci s od 10 do 25 až 200 nebo více (tj. dostatečně velké, aby vytvořily stabilní duplex, ale dostatečně malé, podle způsobu podávání, aby se podávaly in vivo, jestliže je to žádoucí) nukleotidy doplňkovou ke specifické sekvenci nukleotidů v RNA složce lidské telomerasy. Mechanismus působení takových oligonukleotidů může zahrnovat navázání RNA složky bučí pro prevenci sestavení funkční ribonukleoproteinové telomerasy, pro prevenci RNA složky proti tomu, aby sloužila jako matrice pro syntézu telomerní DNA, pro destabilizaci telomerasové RNA složky a pro snížení jejího poločasu a/nebo inhibici transkripce genu telomerasové RNA složky.
Mezi ilustrativní antimediátorové oligonukleotidy podle vynálezu, které slouží pro inhibici telomerasové aktivity in vivo a/nebo in vitro, patří oligonukleotidy shora uvedené v souvislosti s testy, při kterých se stanovuje, jestli klon pGRN7 obsahuje cDNA pro RNA složku lidské telomerasy. Tři takové oligonukleotidy, jak shora uvedeno, byly použity pro de40 monstrování inhibice telomerasové aktivity in vitro. Sekvence každého z těchto oligonukleotidů je uvedena níže:
T3 5'-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3',
P3 5'-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3' a
TA3 5 '-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3·.
Tyto oligonukleotidy se mohou používat také pro inhibici telomerasové aktivity v lidských buňkách.
Odborníci z oblasti techniky si uvědomí, že předložený vynález poskytuje rozmanité antimediátorové oligonukleotidy schopné inhibovat telomerasovou aktivitu. Jinými užitečnými antimediátorovými olgonukleotidy podle vynálezu je oligonukleotid Tel-AU, který má sekvenci 5'-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3', které, podobně jako jakékoliv antimediátorové oligonukleotidy podle vynálezu, mohou být syntetizovány pomocí fosforthioátových nukleotidů, chirálních methylfosfonátů, přirozeně se vyskytujících nukleotidů nebo jejich směsi, aby byly stabilní a měly žádanou Tm. Zručný odborník z oblasti techniky rozpozná, že se pro výrobu nukleových kyselin podle vynálezu se žádoucnějšími vlastnostmi (tj. resistence proti nukleasám, těsnější navázání atd.) než mají ty, které jsou vyráběny pomocí přirozeně se vyskytujících nukleotidů, mohou používat rozmanité modifikované nukleotidové analogy, jako jsou O-methyl-ribonukleotidy, fosforthioátové nukleotidy a methylfosfonátové nukleotidy. Mezi další způsoby, které způsobí, že oligonukleotidy jsou resistentní proti nukleasam, patří ty, které jsou popsány v PCT patentovém spisu č. 94/12633.
Mezi další provedení namířená k modulaci telomerasové aktivity patří ty způsoby, které používají specifické antimediátorové polynukleotidy doplňkové k celé sekvenci nebo k části sekvencí lidské telomerasové RNA složky (hTR), jako jsou antimediátorové polynukleotidy genu lidské telomerasové RNA složky nebo jeho transkribované RNA, včetně upravených forem, které mohou být asociovány s telomerasovým holoenzymem. Mezi takové doplňkové antimediátorové polynukleotidy patří nukleotidové substituce, adice, delece nebo transposice, pokud je zachována specifická vazba na příslušnou cílovou sekvenci, odpovídající telomerasové RNA složce nebo jejímu genu, jako funkční vlastnost polynukleotidu. Mezi doplňkové antimediátorové polynukleotidy patří rozpustné antimediátorové RNA nebo DNA oligonukleotidy, které mohou hybridizovat specificky na telomerasové RNA složky různých druhů a které mohou zabraňovat transkripci genu telomerasové RNA složky [Ching a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10006 (1989), Broder a spol.: Ann. Int. Med. 113. 604 (1990), Loreau a spol.: FEBS Letters 274, 53 (1990), Holcenberg a spol.: spis WO 91/11535, USA patentová přihláška 07/530 165, spisy WO 91/09865, WO 91/04753 a WO 90/ /13641 a evropský patent 386563, všechny jsou zde zahrnuty jako odkazy]. Tyto antimediátorové polynukleotidy tedy inhibují produkci funkční telomerasové RNA složky. Jelikož exprese telomerasové RNA složky (transkripční rychlost a/nebo stabilita RNA) souvisí s aktivací a enzymatickou aktivitou telomerasového holoenzymu, antimediátorové polynukleotidy, které brání transkripci RNA odpovídající telomerasové RNA složce a/nebo interakci telomerasové RNA složky s proteinovou složkou lidské telomerasy a/ /nebo interakci telomerasové RNA složky s telomerními sekvencemi, může inhibovat telomerasovou aktivitu a/nebo převracet fenotyp, jako je znesmrtelnění nebo neoplastická transformace, buněk exprimujících telomerasovou aktivitu v nepřítomnosti antimediátorových polynukleotidů. Prostředky, které obsahují terapeuticky účinnou dávku antimediátorových polynukleotidů telomerasové RNA složky, mohou být podávány pro léčení takových onemocnění, která vyžadují telomerasovou aktivitu pro buněčnou pathogenesi (např. neoplazii) nebo pro inhibici produkce nebo zachování gamet (tj. jako antikoncepční činidla), jestliže je to žádoucí. Mohou se produkovat antimediátorové polynukleotidy různé délky, i když tyto antimediátorové polynukleotidy typicky obsahují sekvenci alespoň 25 po sobě následujících nukleotidů, které jsou v podstatě doplňkové k polynukleotidové sekvenci přirozeně se vyskytující telomerasové RNA složky a které jsou typicky dokonale doplňkové k sekvenci lidské telomerasové RNA složky, často doplňkové k sekvenci telomerasové RNA složky, která je doplňková k sekvenci telomerní repetice, nebo doplňkové k části telomerasové RNA složky, která je v kontaktu s podjednotkou telomerasového polypeptidu.
Antimediátorové polynukleotidy se mohou vyrábět z heterologní expresní kazety v transfektované buňce nebo transgenní buňce. Heterologní expresní kazeta může být částí vektoru genové terapie, jako je adenovirový nebo s adeno-související virový vektor, nebo jiný vektor genové terapie. Heterologní kazeta může být na polynukleotidu, který není schopen nezávislé replikace a který je transformován do buněk kterýmkoliv z rozmanitých vhodných způsobů známých odborníkům z oblasti techniky (např. lipofekce, biolistika, liposomy, imunoliposomy, elektroporace atd.). Antimediátorové polynukleotidy mohou zahrnovat také rozpustné oligonukleotidy, které se podávají do vnějšího prostředí, buá do kultivačního media in vitro nebo do intersticiálního prostoru a tělesných tekutin (např. krve, CSF) pro aplikaci in vivo. Bylo ukázáno, že rozpustné antimediátorové polynukleotidy přítomné ve vnějším prostředí získávají přístup do cytoplasmy a inhibují specifické druhy RNA. V některých provedeních antimediátorové polynukleotidy obsahují methy1fosfonátové částice, C-5 propenylové částice, 2'-fluorribosové cukry nebo polyamidové nukleové kyseliny (PNA) [Egholm a spol.: J. Amer. Chem. Soc. 114. 1895 (1992), Wittung a spol.: Nátuře 368, 561 (1994), Egholm a spol.: Nátuře 365. 566 (1993), Hanvey a spol.: Science 258. 1481 (1992), zahrnuté zde jako odkazy]. Pro obecné způsoby týkající se antimediátorových polynukleotidů viz Antisense RNA and DNA, (red.) D.A.Melton, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988.
Vedle antimediátorových oligonukleotidů podle vynálezu lze zkonstruovat oligonukleotidy, které se budou vázat na duplexovou nukleovou kyselinu buá ve skládané RNA složce nebo v genu této složky. Vytvoří se tak nukleová kyselina obsahující trojitý helix nebo triplexová nukleová kyselina. Dochází tak k inhibici telomerasové aktivity. Tyto oligonukleotidy podle vynálezu se zkonstruují pomoci pravidel o párování nukleotidů při tvorbě trojitého helixu a nukleotidové sekvence RNA složky [Cheng a spol.: J. Biol. Chem. 263. 15110 (1988), Ferrin a Camerini-Oter. Science 354. 1494 (1991), Ramdas a spol.: J. Biol. Chem. 264. 17395 (1989), Strobel a spol.: Science 254. 1639 (1991), Hsieh a spol.: viz shora (1990), Rigas a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 83., 9591 (1986), všechny zde zahrnuté jako odkazy. ]. Tyto oligonukleotidy mohou blokovat telomerasovou aktivitu četnými způsoby, včetně bránění transkripce telomerasového genu nebo navázáním duplexové oblasti RNA složky telomerasy takovým způsobem, který zabraňuje, aby RNA složka vytvořila funkční ribonukleoproteinovou telomerasu nebo aby sloužila jako matrice pro syntézu telomerní DNA. Typicky a v závislosti na způsobu působení obsahují oligonukleotidy tvořící triplex podle vynálezu specifickou sekvenci s od 10 do 25 až 200 nebo více (tj. natolik velký počet, aby vytvořil stabilní trojitý helix, ale dostatečně malý na to, aby podle způsobu podáváni byl podáván in vivo, jestliže je to žádoucí) nukleotidy doplňkovými (doplňkový v této souvislosti znamená schopný vytvořit stabilní trojitý helix) ke spefické sekvenci v RNA složce telomerasy nebo genu pro RNA složku telomerasy.
Vedle antimediátorových a trojitý helix tvořících oligonukleotidů podle vynálezu se mohou pro inhibování telomerasové aktivity používat také mediátorové oligonukleotidy se sekvencí identickou s alespoň částí RNA složky lidské telomerasy. Oligonukleotidy podle vynálezu tohoto typu se vyznačují tím, že obsahují buď 1) méně než úplnou sekvenci RNA složky potřebné pro vytvoření funkčního telomerasového enzymu nebo 2) úplnou sekvenci RNA složky potřebnou pro vytvoření funkčního telomerasového enzymu, stejně jako substituce nebo inserce jednoho nebo více nukleotidů, které způsobí, že výsledná RNA není funkční. V obou případech je inhibice aktivity telomerasové složky pozorována díky mutantní RNA složce vázající proteinové složky lidské teleomerasy za vzniku neaktivní telomerasové molekuly. Mechanismus působení těchto oligonukleotidů tedy zahrnuje sestavu nefunkční ribonukleproteinové telomerasy nebo zabránění sestavení funkční ribonukleoproteinové telomerasy. Příkladem může být matricí daná varianta sestávající z nukleotidů 48 až
209, v níž je však změněna sekvence matrice telomerní repetice. Takové matricí dané varianty jsou schopny soutěžit o navázání na telomerasovou proteinovou složku. Mediátorové oligonukleotidy podle vynálezu tohoto typu typicky obsahují specifickou sekvenci s od 20, 50, 100, 200, 400, 500 nebo více nukleotidy identickou se specifickou sekvencí nukleotidů v RNA složce lidské telomerasy.
Antimediátorové polynukleotidy mohou také obsahovat derivatizovaný substituent, který v podstatě neinterferuje s hybridizací na RNA složku savčí telomerasy. Antimediátorové polynukleotidy, které jsou modifikovny připojenými chemickými substituenty, mohou být zavedeny do metabolicky aktivní eukaryotické buňky, aby hybridizovaly s telomerasovou složkou telomerasy v buňce. Tyto antimediátorové polynukleotiody jsou typicky derivatizovány a další chemické substituenty jsou připojeny buď během nebo po syntéze polynukleotidu a jsou tedy lokalizovány na doplňkové sekvenci v telomerasové RNA složce, kde produkují změnu nebo chemickou modifikaci na místní DNA sekvenci a/nebo na telomerasové proteinové složce. Mezi výhodné připojené chemické substituenty patři: texaphyrin europitý, zesítovací činidla, psoralen, cheláty kovů (např. chelát železo/EDTA u železem katalyzovaného štěpení), topoisomerasy, endonukleasy, exonukleasy, ligasy, fosfodiesterasy, fotodynamické porfyriny, chemoterapeutická léčivá činidla (např. adriamycin, doxirubicin), interkalační činidla, bází modifikovaná činidla, imunoglobulinové řetězce a oligonukleotidy. Cheláty železo/EDTA jsou zvláště výhodnými chemickými substituenty, jestliže je žádoucí lokální štěpení polynukleotidové sekvence [Hertzberg a spol.:
J. Amer. Chem. Soc. 104, 313 (1982), Hertzberg a Dervan: Biochemistry 23, 3934 (1984), Taylor a spol.: Tetrahedron 40, 457 (1984), Dervan P.B.: Science 232. 464 (1986).]. Mezi výhodná chemická připojení patří: přímá vazba, např. připojenou reaktivní aminovou skupinou [Corey a Schultz: Science 238. 1401 (1988), která je zde zahrnuta jako odkaz], a další přímé chemické vazby, i když lze použít také vazebné způsoby streptavidin/biotin a digoxigenin/anti-digoxigeninová protilátka. Způso45 by pro navázání chemických substituentů jsou popsány v USA patentech 5 135 720, 5 093 245 a 5 093 556, které jsou zde zahrnuty jako odkazy. Mohou se použít jiné způsoby podle úvahy odborníka. Pro reakci se sekvenci telomerních repeticí v genomu a pro přípravu aduktů nebo pro jiné modifikace chemického okolí telomerních oblastí chromosomů mohou být také derivatizovány a používány polynukleotidy, které odpovídají celé nebo podstatné části savčí telomerasové RNA složky (tj. mediátorové nukleotidy) .
V další části spisu budou popsány matrice s chybným párováním.
Další užitečný oligonukleotid podle vynálezu tedy zahrnuje změněnou nebo mutovanou sekvenci RNA složky lidské telomerasy. Yu a spol.: Nátuře 344. 126 (1990) ukazuje, že mutovaná forma RNA složky Tetrahymena telomerasy může být zahrnuta do telomerasy buněk Tetrahymena a že tato inkorporace má na tyto buňky škodlivý účinek. Zahrnutí mutovaných forem RNA složky lidské telomerasy může mít podobné účinky na lidské buňky, které jinak mají telomerasovou aktivitu, aniž by ovlivňovaly normální lidské buňky, které nemají telomerasovou aktivitu. Mezi tyto mutované formy patří ty formy, v nichž sekvence 5Z-CTAACCCTA-3Z je mutována na 5Z-CAAACCCAA-3Z, 5Z-CCAACCCCAA-3Z nebo 5Z-CTCACCC. .TCA-3Z. Každá z těchto změněných sekvencí RNA složky mění jednotky telomerni repetice zahrnuté do chromosové DNA a tedy ovlivňuje chromosomovou strukturu a funkci. Tyto oligonukleotidy lze navrhnout tak, že obsahují místa pro rozpoznávání restrikčního enzymu užitečná při diagnostických způsobech přítomnosti změněné RNA složky štěpením restrikčním enzymem telomerni DNA nebo zvětšeného telomerasového substrátu.
Pro ilustraci tohoto aspektu vynálezu byla provedena místně specifická mutagenese použitím plasmidu (označený pGRN33, dostupný z Americké sbírky typů kultur pod č. ATCC 75926), který obsahuje HindlII-SacX fragment s asi 2500 páry nukleotidů z lambda klonu 28-1 (viz příklad 7 níže) a také počátku repli46 kace (ale nikoliv promotorové aktivity) SV40. Výsledné plasmidy, označené pGRN34 (obsahující Sf-CAAACCCAA-S'), pGRN36 (obsahující 5z-CCAACCCCAA-3z) a plasmid pGRN37 (obsahující 5'-CTC. .ACCCTCA-3z), byly transformovány do buněk eukaryotického hostitele (od 293 odvozené buněčné linie exprimující SV40 velký T antigen). Telomerasové testy byly provedeny s použitím buněčných extraktů z těchto transformantů.
Tyto analýzy ukázaly, že telomerasová aktivita buněk vede k tvorbě nukleových kyselin, které obsahují změněné sekvence, což ukazuje, že genomový klon obsahoval funkční gen RNA složky a že plasmidy obsahovaly změněný, ale funkční gen RNA složky. Tyto výsledky ilustrují, jak předložený vynález poskytuje rekombinantní telomerasové prostředky a způsoby pro výrobu těchto prostředků. Předložený vynález poskytuje rekombinantní lidskou telomerasu, která obsahuje proteinové složky lidské telomerasy ve funkční asociaci s rekombinantní RNA složkou podle vynálezu. Mezi tyto molekuly rekombiantní RNA složky podle vynálezu patří takové molekuly, které se liší od přirozeně se vyskytujících molekul RNA složky jednou nebo více substitucemi, delecemi nebo insercemi nukleotidů, a také ty molekuly RNA složky, které jsou identické s přirozeně se vyskytují molekulou RNA složky, která je produkována v rekombinantních hostitelských buňkách. Způsob přípravy těchto molekul rekombinantní telomerasy zahrnuje transformování buňky eukaryotického hostitele, která exprimuje proteinové složky telomerasy s rekombinantním expresním vektorem, který kóduje molekulu RNA složky podle vynálezu, a kultivování těchto hostitelských buněk transformovaných uvedeným vektorem za takových podmínek, že proteinové složky a RNA složka jsou exprimovány a sestaveny tak, že vytvoří molekulu aktivní telomerasy schopnou přidávat další sekvence (nikoliv nutně stejné sekvence přidané přírodní telomerasou) k telomerům chromosomové DNA. Mezi další užitečná provedení těchto expresních vektorů (nebo plasmidů) rekombinantní DNA patří plasmidy, které obsahuji gen pro RNA složku lidské telomerasy s deleci, inserci nebo jinou modifikací, která způsobuje, že gen je nefunkční. Tyto plasmidy jsou zvláště užitečné pro genovou tera47 pii člověka, kdy dochází k knock-outování endogenního genu RNA složky, ačkoliv je požadována vysoce efektivní transformace a rekombinantní systém, aby došlo k tomu, že zpracované buňky jsou irreversibilně smrtelné.
Další část spisu popisuje ribozymová provedení.
Pro inhibici telomerasové aktivity se mohou používat také jiné oligonukleotidy podle vynálezu, nazývané ribozymy. Na rozdíl od shora popsaných antimediátorových a dalších oligonukleotidů, které se vážou na RNA, DNA nebo telomerasovou proteinovou složku, ribozym se nejenom váže, ale také specificky štěpí a tedy potenciálně deaktivuje cílovou RNA, jako je RNA složka lidské telomerasy. Takový ribozym může obsahovat 5'- a 3'-koncové sekvence doplňkové k telomerasové RNA. Podle místa štěpení může ribozym způsobit, že telomerasový enzym je neaktivní. Viz shora spis PCT č. 93/23572. V oblasti techniky týkající se přehledu RNA sekvence lidské telomerasové RNA složky se uvádí, že existuje několik užitečných ribozymových cílových míst, které jsou citlivé na štěpení, například ribozymem s hammerhead motifem. Mezi ilustrativní ribozymy podle vynálezu tohoto typu patří níže uvedené ribozymy, jejichž RNA molekuly mají následující sekvence:
1: 5'-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3',
2: 5'-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3',
3: 5'-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3' a
4: 5'-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3'.
Lze určit další optimální cílová místa pro ribozymem zprostředkovanou inhibici telomerasové aktivity, jak popisují Sullivan a spol.: PCT patentový spis č. 94/02595 a Draper a spol.: PCT patentový spis č. 93/23569, oba jsou zde zahrnuty jako odkazy. Jak je popsáno Huem a spol.: PCT patentový spis č. 94/03596, který je zde zahrnut jako odkaz, antimediátorové a ribozymová funkce se mohou zkombinovat do jediného oligonukleotidů. Navíc mohou ribozymy obsahovat jeden nebo více modifikovaných nukleo48 tidů nebo modifikovaných vazeb mezi nukleotidy, jak je shora popsáno v souvislosti s popisem ilustrativních antimediátorových oligonukleotidů podle vynálezu. V jednom aspektu je modifikována [viz Altman S.: Biotechnology 13. 327 (1995)] katalytická podjednotka RNasy P (lidská nebo E. coli), takže se generuje vůdčí sekvence, která odpovídá části savčí telomérasové RNA složky, která se páruje se sekvencí telomerní repetice. Tyto RNasové P varianty mohou štěpit telomerní sekvence. V jednom aspektu je katalytická pod jednotka RNasy P (lidská nebo E.coli) modifikována tak, aby generovala vůdčí sekvenci, která je doplňková k části telomerasové RNA složky, takže RNasová P varianta může štěpit telomerasovou RNA složku. Takto sestavené ribozymy mohou být exprimovány v buňkách nebo mohou být přenášeny různými způsoby (např. liposomy, imunoliposomy, biolistiky, přímo přijaty do buněk atd.). Na základě popsané informace o sekvenci telomerasové RNA složky pro katalyzování štěpení lidské telomerasové RNA složky a/nebo lidských sekvencí telomerní repetice mohou být geneticky sestaveny další formy ribozymů (intronové ribozymy skupiny I, (Cech T.: Biotechnology 13., 323 (1995).), hammerhead ribozymy (Edginton S.M.: Biotechnology 10, 256 (1992).).
Pro inhibici telomerasové aktivity tento vynález tedy poskytuje rozmanité oligonukleotidy. Tyto oligonukleotidy se mohou používat při terapeutických způsobech podle vynálezu pro léčení onemocnění. Tyto způsoby zahrnují podávání terapeuticky efektivní dávky telomerasového inhibitoru nebo aktivátoru podle vynálezu pacientovi. Telomerasové inhibice nebo aktivace se může měřit, aby se stanovilo množství činidla, které by mělo být dodáno v terapeuticky účinné dávce s použitím postupů testování popsaných v doprovázejících shora uvedených USA patentových přihláškách a PCT patentovém spisu č. 93/23572. Jak je v těchto přihláškách uvedeno a jak je shora diskutováno, inhibice telomerasové aktivity způsobuje smrtelnost nesmrtelných buněk, zatímco aktivace telomerasové aktivity může zvýšit replikační životnost buňky. Telomerasové inhibiční terapie je efektivním léčením rakovin zahrnujících nekontrolovaný řůst nesmrtelných buněk. Telomerasové aktivace je efektivním léčením, které zabraňuje stárnutí buněk. Dodávání činidel, která inhibují nebo blokují telomerasovou aktivitu, jako je antimediátorový oligonukleotid, oligonukleotid tvořící trojitý helix, ribozym nebo plasmid, který řídí expresi mutované RNA složky telomerasy, může zabránit působení telomerasy a jako důsledek může vést ke stárnutí buněk a smrti ošetřených buněk.
Tato část spisu popisuje terapeutické a profylaktické aspekty .
Předložený vynález poskytuje také terapeutické způsoby, které zajišťují, že normální buňky zůstávají smrtelné. Například RNA složka může být modifikována standardními postupy genetického inženýrství, takže se deletuje celý nebo část přírodního genu, který kóduje tuto složku (např. in vitro mutagenesí) genetickou rekombinací. Tyto buňky pak budou irreversibilně smrtelné. Tento postup je užitečný v genové terapii, když se normální buňky modifikované tak, aby obsahovaly expresní plasmidy, zavedou do pacienta a chce se dosáhnout toho, že rakovinové buňky se do pacienta nedostanou, nebo jestliže takové buňky jsou v pacientovi přítomny, potom tyto buňky způsobí, že jsou irreversibilně smrtelné.
Jelikož telomerasa je aktivní pouze v nádoru, zárodečné linii a některých kmenových buňkách hematopoietního systému, ostatní normální buňky nejsou ovlivněny léčením inhibici telomerasy. Mohou se použít také stupně, které způsobí, že se telomerasový inhibitor vyhne kontaktu se zárodečnou linií nebo kmenovými buňkami, i když to nemusí být podstatné. Například jelikož buňky zárodečné linie exprimují telomerasovou aktivitu, inhibice telomerasy může mít negativní dopad na spermatogenesi a na životaschopnost spermií. To přímo ukazuje na to, že telomerasové inhibitory mohou být účinnými antikoncepčními činidly nebo sterilizačními činidly. Tento antikoncepční účinek však nemusí být žádoucí u takového pacienta, který dostává telomerasový inhibitor podle vynálezu pro léčení rakoviny. V těchto případech lze dodávat telomerasový inhibitor podle vynálezu takovým způsobem, který zajišťuje, že inhibitor bude produkován pouze během doby léčení, takže negativní dopad na buňky zárodečné linie je pouze přechodný.
Jiné terapeutické způsoby podle vynálezu používají telomerasovou RNA nukleovou kyselinu podle vynálezu pro stimulaci telomerasové aktivity a pro rozšíření replikační životnosti buněk. Tyto způsoby se mohou provádět tak, že se buňce dodává funkční rekombinantní telomerasový ribonukleoprotein podle vynálezu. Například se může ribonukleoprotein dodávat do buňky v liposomu nebo se může gen pro RNA složku lidské telomerasy (nebo rekombinantní gen s různými regulačními prvky) použít v eukaryotickém expresním plasmidu (s nebo bez sekvencí kódujících expresi proteinových složek telomerasy) pro aktivaci telomerasové aktivity v různých normálních lidských buňkách, kterým jinak chybí detegovatelná telomerasové aktivita díky nízkým hladinám exprese RNA složky nebo proteinové složky telomerasy. Jestliže telomerasové RNA složka není dostatečná pro stimulování telomerasové aktivity, potom se může RNA složka transfektovat podél genů exprimujících proteinové složky telomerasy pro stimulaci telomerasové aktivity. Tento vynález tedy poskytuje způsoby léčení stavu souvisejícího s telomerasovou aktivitou v buňce nebo ve skupině buněk tak, že se buňka (buňky) uvede (uvedou) do kontaktu s terapeuticky efektivním množstvím činidla, které mění telomerasovou aktivitu v této buňce.
Buňky, které inkorporují další kopie genu telomerasové RNA, mohou vykazovat zvýšení telomerasové aktivity a související zvýšení replikační životnosti. Tato terapie se může provádět ex vivo na buňkách pro následné zavedení do hostitele nebo se může provádět in vivo. Výhoda stabilizování nebo zvýšení telomerní délky přidáním exogenních telomerasových genů ex vivo k normálním diploidním buňkám zahrnuje: a) telomerní stabilizace může uzavřít buněčné stárnutí a dovolit potenciálně neomezenou amplifikaci buněk a b) normální diploidní buňky s prodlouženou životností lze kultivovat in vitro pro testování léčiva, výrobu viru nebo pro jiné užitečné účely. Navíc, ex vivo amplifikované kmenové buňky různých typů se mohou používat v buněčné terapii příslušných onemocnění, jak shora uvedeno.
Telomerní stabilizace může také potlačit výskyt rakoviny v replikujících buňkách zabráněním toho, aby telomery byly kriticky krátké, když se buňky blíží krizi. Během krize dochází k masové genomové nestabilitě, jak se ztrácí ochranný účinek telomerního uzávěru. Tento genetický kryt je přeskupen a téměř všechny buňky umírají. Vzácné buňky, které pocházejí z tohoto procesu, jsou typicky neploidní s mnoha přesmyky genů a znovu se objevující stabilitou v jejich telomerech exprimováním telomerasy. Jestliže lze krizi zabránit tím, že se telomery udrží dlouhé, potom lze předejít také genomové nestabilitě související s krizi. Omezí se tak změny, které jednotlivé buňky utrpí potřebným počtem genetických mutací nutných ke vzniku metastatické rakoviny.
Buňky, které mohou být cílovými pro léčení telomerasovým genem (léčení zahrnující zvýšeni telomerasové aktivity cílové buňky) zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, hematopoietní kmenové buňky (AIDS a po chemoterapii), vaskulární endotheliální buňky (kardiatické a cerebrální vaskulární onemocnění), kožní fibroblasty a bazální kožní keratinocyty (poranění a popáleniny), chondrocyty (artritida), mozkové astrocyty a mikrogliální buňky (Alzheimerova choroba), osteoblasty (osteoporosa), retinální buňky (onemocnění oka) a buňky pankreatických ostrůvků (diabetes I typu).
Způsoby léčení podle vynálezu typicky zahrnují podávání oligonukleotidu, který funguje tak, že inhibuje nebo stimuluje telomerasovou aktivitu za in vivo fysiologických podmínek a za těchto podmínek bude stabilní. Jak bylo shora uvedeno, modifikované nukleové kyseliny mohou být užitečné při vyvolání této stability a také pro zajištění dodání oligonukleotidu do žádané tkáně, orgánu nebo buňky. Způsoby užitečné pro dodávání oligonukleotidů pro terapeutické účely jsou popsány Inouyem a spol.:
USA patent 5 272 065, který je zde zahrnut jako odkaz.
I když oligonukleotidy mohou být dodávány přímo jako léčivé přípravky ve vhodném farmaceutickém prostředku, oligonukleotidy lze dodávat také pomocí genové terapie a rekombinantních DNA expresních plasmidů podle vynálezu. Jeden takový ilustrativní plasmid je popsán níže v příkladu 8. Obecně - takové plasmidy budou obsahovat promotor a popřípadě zesilovač transkripce (vedle jakéhokoliv obsaženého v promotorových sekvencích), který slouží k řízení transkripce oligoribonukleotidu, stejně jako další regulační prvky, které zajištují episomální zachování nebo chromosomovou integraci a vysokou úroveň transkripce, jestliže je to žádoucí. Vektory na bázi adenoviru jsou často používány pro genovou terapii a jsou vhodné pro použití v souvislosti s činidly a způsoby podle předloženého vynálezu. Viz PCT patentové spisy č. 94/12650, 94/12649 a 94/12629. Mezi užitečné promotory pro tyto účely patří metallothioneinový promotor, konstitutivní adenovirový hlavní pozdní promotor, MMTV promotor indukovatelný dexamethasonem, promotor SV40, promotor MRP polili, konstitutivní MPSV promotor, CMV promotor indukovatelný tetracyklinem (jako je lidský bezprostředně časný CMV promotor) a konstitutivní CMV promotor. Plasmid užitečný pro genovou terapii může obsahovat další funkční prvky, jako jsou selektovatelné markéry, identifikační oblasti a další geny. Rekombinantní DNA expresní plasmidy se mohou používat také pro přípravu oligonukleotidů podle vynálezu pro dodávání jinými způsoby než genovou terapií, i když může být ekonomičtější vyrobit krátké oligonukleotidy in vivo chemickou syntézou.
V příbuzných aspektech se tento vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících terapeuticky účinné množství telomerasového inhibitoru nebo telomerasového aktivátoru podle vynálezu. Mezi farmaceutické prostředky telomerasových inhibitorů podle vynálezu patří mutantní RNA složka lidské telomerasy, antimediátorový oligonukleotid, oligonukleotid tvoříc! trojitý helix, který váže RNA složku nebo gen na stejnou lidskou telomerasu, ribozym schopný štěpit RNA složku lidské telomerasy ne53 bo kombinace stejných nebo jiných farmaceuticky přijatelných činidel ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo soli. Další farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují telomerasový aktivátorový přípravek, jako je vyčištěná lidská telomerasa nebo mRNA pro proteinové složky telomerasy a RNA složka telomerasy a jsou používány pro léčení onemocnění souvisejících se stárnutím. V jiném aspektu se mutovaná mediátorová savčí telomerasová RNA složka podává populaci buněk; tato mutovaná mediátorová telomerasová RNA složka obsahuje alespoň jeden nukleotid chybně párovaný vzhledem k sekvenci lidské telomerasové repetice, ale je schopna vykazovat telomerasovou aktivitu ve spojení s lidskou telomerasovou polypeptidovou složkou produkující chybnou inkorporaci ve zvolených polohách nukleotidů v lidské telomerasové repetici, čímž se generují telomery, které se spoléhají na neustálou přítomnost mutované mediátorové telomerasové RNA složky pro postatnou replikaci. Získá se tak terapeutický způsob, podle něhož se mutovaná mediátorová telomerasová RNA složka podává populaci buněk po dobu dostatečnou pro zavedení telomerových sekvencí, které jsou v podstatě nefunkční jako matrice pro přirozeně se vyskytující telomerasovou RNA složku, následuje stažení mutované mediátorové telomerasové RNA složky, což vede k rychlé ztrátě průměrné délky telomeru v populaci buněk a zvýšenému stárnutí nebo úmrtnosti buněk.
Terapeutické činidlo lze získat ve formě prostředku, který je vhodný pro parenterální, nosní, orální nebo jiný způsob podávání. Viz PCT patentový spis č. 93/23572.
Předložený vynález vedle shora popsaných farmaceutických prostředků a terapeutických způsobů poskytuje diagnostické způsoby a činidla. Vynález poskytuje diagnostické způsoby pro stanovení hladiny, množství nebo přítomnosti RNA složky lidské telomerasy, telomerasy nebo telomerasové aktivity v buňce, v populaci buněk nebo ve vzorku tkáně. V příbuzném aspektu předložený vynález poskytuje užitečná činidla pro tyto způsoby, popřípadě připravená ve formě sestavy spolu s instrukcemi pro použití této sestavy pro stanovení diagnosy. Jak bylo shora uvedeno v souvislosti s testy prováděnými při stanovení, že klon pGRN7 obsahuje cDNA pro RNA složku lidské telomerasy, hladiny RNA složky jsou v nádorových buňkách zvýšeny. Detekce RNA složky je užitečná pro diagnostikování nádorových buněk.
Sondy nebo primery, které se specificky vážou na RNA složku lidské telomerasy (nebo kterékoliv vlákno genu uvedené složky), se také mohou používat v diagnostických způsobech pro detegování přítomnosti telomerasové nukleové kyseliny ve vzorku. Primery a sondy jsou oligonukleotidy, které jsou doplňkové a tak se budou vázat na cílovou nukleovou kyselinu. I když se primery a sondy mohou lišit v délce sekvence, primárním rozlišujícím faktorem je funkce: primery slouží k iniciaci DNA syntézy, jako při PCR amplifikaci, zatímco sondy se typicky používají pouze pro navázání na cílovou nukleovou kyselinu. Typickými délkami primeru nebo sondy je délka od 8 až 20 do 30 nebo více nukleotidů. Primer nebo sonda může být také označena pro usnadnění detekce (tj. pro tyto účely se typicky používají radioaktivní nebo fluorescenční molekuly) nebo čištěni/děleni (tj. pro tento účel se často používá biotin nebo avidin).
Zvláště výhodný diagnostický způsob podle vynálezu zahrnuje detekci sekvencí telomerasové RNA složky v buňce nebo ve vzorcích tkáně pacienta, u kterého je podezření na riziko rakoviny. Tyto způsoby budou typicky zahrnovat navázání označené sondy nebo primeru na sekvenci RNA složky za takových podmínek, že se na sebe navážou (hybridizují) pouze prefektně zpárované (doplňkové) sekvence. Detekce označeného materiálu navázaného na RNA ve vzorku bude korelovat s přítomností telomerasové aktivity a přítomností rakovinových buněk. Některé buňky mohou exprimovat RNA složku telomerasy, ale zůstávají telomerasově negativní díky nedostatku exprese proteinových složek telomerasy. Jestliže je vyžadována detekce přítomnosti telomerasové aktivity v těchto buňkách, potom lze nejdříve izolovat protein a potom stanovit, jestli proteinová frakce obsahuje telomerasovou RNA složku, což by signalizovalo přítomnost telomerasové aktivity. Diagnostické způsoby podle vynálezu mohou být zvláště užitečné při detegování přítomnosti telomerasové aktivity u tkáňových biopsií a histologických sekcí, při nichž se tento způsob provádí in šitu, typicky po amplifikaci telomerasové RNA složky použitím specifických PCR primerů podle vynálezu.
Tento vynález také poskytuje polynukleotidové sondy telomerasové RNA složky pro diagnosu stavu onemocnění (např. neoplazie nebo preneoplazie) detekcí telomerasové RNA složky nebo přesmyky nebo amplifikaci genu telomerasové RNA složky v buňkách explantovaných z pacienta nebo detekcí pathognomomické alely telomerasové RNA složky (např. RFLP nebo alelově specifickou PCR analýzou). Detekce se typicky provádí in šitu hybridi žací použitím značeného (např. 32P, 35S, 14C, 3H, fluorescenčního, biotinylovaného, digoxigeninylovaného) polynukleotidu telomerasové RNA složky, i když se může použít Northernovo blotování, tečkové blotování nebo hybridizace roztokem na velkou RNA nebo póly A+ RNA isolovanou ze vzorku buňky, stejně jako PCR amplifikace použitím primerů specifických pro telomerasovou RNA složku. Buňky, které obsahují změněné množství telomerasové RNA složky při srovnání s ne-neoplastickými buňkami stejného buněčného typu (typů), budou identifikovány jako kandidáti na nemocné buňky. Podobně detekce pathognomomických přesmyků nebo amplifikace místa genu telomerasové RNA složky nebo těsně navázaného místa ve vzorku buňky bude identifikovat přítomnost pathologického stavu nebo predisposice k vyvinutí pathologického stavu (např. rakoviny, genetického onemocnění). Polynukleotidové sondy se používají také pro identifikace jednotlivců v soudním lékařství, jako je testování otcovství nebo identifikace kriminálních podezřelých osob nebo neznámých zemřelých.
V lidské populaci mohou existovat menší rozdíly v základní primární sekvenci telomerasové RNA složky, včetně alelických variant, polymorfií restrikčních míst a kongenitálních alel onemocnění telomerasové RNA složky souvisejících s genetickým onemocněním.
Jestliže je to žádoucí, PCR amplimery pro amplifikaci ko56 pií telomerasové RNA složky v podstatě plné délky mohou být zvoleny podle praktického použivatele. Podobně lze zvolit amplimery pro amplifikaci částí genu nebo RNA telomerasové RNA složky.
V této části spisu bude popsána exprese telomerasové RNA složky. V závislosti na délce nebo zamýšlené funkci primerů, sondy nebo jiné nukleové kyseliny obsahující sekvence z RNA složky lidské telomerasy může být užitečná exprese plasmidů podle vynálezu. Například rekombinantní produkce RNA složky podle vynálezu plné délky se může provádět použitím rekombinantního DNA expresního plasmidů podle vynálezu, který obsahuje nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci RNA složky umístěné pro transkripci pod kontrolu vhodného promotoru. Hostitelskými buňkami pro tyto plasmidy mohou být buá prokaryotické nebo eukaryotické buňky a promotor stejně jako jiné regulační prvky a selektovatelné markéry vybrané pro inkorporaci do expresního plasmidů budou záviset na hostitelské buňce, která se pro produkci používá.
Neporušený gen RNA složky, tj. promotor, který obsahuje jakékoliv regulační sekvence v 5'-oblasti genu a oblast kódující RNA složku, může být použit pro expresi RNA složky v lidských buňkách, včetně lidských buněk, které byly znesmrtelněný virovou transformací nebo rakovinou. Promotor genu RNA složky může být regulován, avšak, kvůli tomuto a kvůli dalším důvodům, lze očekávat expresi RNA složky pod kontrolou odlišného promotoru. Na druhé straně se může promotor genu RNA složky používat nezávisle na sekvenci kódující RNA složku pro expresi jiných kódujících sekvencí, o které se zajímáme. Například lze studovat transkripční regulaci genu RNA složky napojením promotoru genu RNA složky na kódující sekvenci pro sekvenci kódující reportér, jako je kódující sekvence pro beta-galaktosidasu nebo jiný enzym nebo protein, jehož expresi lze snadno sledovat. Promotor a další regulační prvky genu RNA složky lidské telomerasy se tedy mohou používat nejen pro expresi RNA složky, ale také proteinových složek lidské telomerasy, antimediátorových nebo jiných oligonukleotidů, stejně jako dalších genových produktů, o které se zajímáme, v lidských buňkách. Expresní plasmidy obsahující neporušený gen pro RNA složku lidské telomerasy může být zvláště užitečný pro různé účely, včetně genové terapie. Zruční odborníci z oblasti techniky rozpoznají, že se pro výrobu nukleových kyselin podle vynálezu mohou používat rozmanité expresní plasmidy a že pojem plasmid” tak, jak se zde používá, znamená jakýkoliv typ nukleové kyseliny (z fágu, viru, chromosomu atd.), který lze použít pro vnesení specifické genetické informace do hostitelské buňky a zachování této informace po nějaký čas.
V následujících odstavcích je popsána isolace telomerasové proteinové složky.
Reakční činidla podle předloženého vynálezu umožňují také klonování a isolaci nukleových kyselin kódujících proteinové složky lidských a také jiných savčích telomerasových enzymů, které nebyly dříve dostupné. Dostupnost těchto nukleových kyselin poskytuje doplňkové výhody vedle těch, které jsou dány nukleovými kyselinami obsahujícími sekvence nukleových kyselin RNA složky lidské telomerasy. Například, jak bylo shora uvedeno, terapeutické příznivé výhody předloženého vynálezu lze v některých případech zvýšit použitím vyčištěných prostředků proteinových složek lidské telomerasy a dostupností nukleových kyselin, které je kódují. Nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují RNA složku lidské telomerasy, se mohou používat pro isolaci nukleové kyseliny kódující proteinové složky lidské telomerasy, což umožňuje dostupnost těchto výhodných účinků. Tento vynález tedy poskytuje způsoby isolování a čištění proteinových složek lidské telomerasy a také identifikování a isolování nukleových kyselin kódujících proteinové složky lidské telomerasy. V příbuzných aspektech předložený vynález poskytuje vyčištěnou lidskou telomerasu, vyčištěné nukleové kyseliny, které kódují proteinové složky lidské telomerasy, a rekombinantní expresní plasmidy pro proteinové složky lidské telomerasy. Tento vynález také poskytuje farmaceutické prostředky obsahující jako účinnou složku buď proteinové složky lidské telomerasy nebo nukleovou kyselinu, která buá kóduje tyto proteinové složky nebo interaguje s nukleovými kyselinami, které kódují tyto proteinové složky, jako jsou antimediátorové oligonukleotidy, oligonukleotidy tvořící trojitý helix, ribozymy nebo rekombinantní DNA expresní plasmidy kterýchkoliv z předcházejících.
Klonovaná RNA složka lidské telomerasy se může použít pro identifikaci a klonování nukleových kyselin kódujících proteinové složky ribonukleoproteinového telomerasového enzymu. Pro identifikaci a klonování proteinových složek se může použít několik různých způsobů. Například lze použít afinitní zachycení enzymu nebo částečně denaturovaného enzymu tím, že se jako afinitní ligand použijí buď 1) nukieotidové sekvence doplňkové k RNA složce pro navázání RNA složky neporušeného enzymu nebo 2) RNA složka pro navázání proteinových složek částečně nebo zcela denaturovaného enzymu. Ligand může být připevněn na pevný nosič nebo může být chemicky upraven (např. biotinylován) pro následnou imobilizaci na nosiči. Aplikace buněčných extraktů obsahujících lidskou telomerasu, následující promytí a eluce telomerasového enzymu navázaného na nosič poskytuje vysoce vyčištěný přípravek telomerasového enzymu. Proteinové složky mohou být potom popřípadě dále vyčištěny nebo přímo analyzovány sekvenováním proteinu. Zjištěná proteinová sekvence se může použít pro přípravu primerů a sond pro klonování cDNA nebo pro identifikováni klonu v genomové bance obsahující nukleové kyseliny, které kódují proteinovou složku telomerasy.
Afinitní zachycení telomerasy využívající RNA složku, která byla sestavena způsobem genetického inženýrství, lze provádět také in vitro transkribovanou telomerasovou RNA a systémem pro rekonstituci telomerasové enzymové aktivity. Viz Autexier a Greider: Genes and Development 8, 563 (1994), zahrnuté sem jako odkaz. RNA se sestaví tak, aby obsahovala čepičku, podobnou epitopovému ukončení proteinů. Touto čepičkou může být RNA sekvence, na které je dostupný těsně navázaný ligand, např. protilátka specifická pro RNA sekvenci, protein vázající nuk59 leovou sekvenci se specifickou sekvencí nebo organické barvivo, které se těsně váže na specifickou RNA sekvenci. Snášenlivost telomerasy na čepičkovou sekvenci a poloha se mohou testovat standardními způsoby. Syntéza změněné RNA složky a rekonstituční stupeň tohoto způsobu se také mohou provádět in vivo. Pro isolaci enzymu se pak může použít afinitní zachycení využívající imobilizovaného ligandu pro RNA čepičku.
Pro isolaci proteinových složek telomerasového enzymu lze použít také testování exprese. Podle tohoto způsobu se cDNA expresní knihovny mohou testovat označenou telomerasovou RNA. Identifikují se cDNA kódující proteiny, které se specificky vážou na telomerasovou RNA. Pro isolaci nukleových kyslein kódujících proteinové složky telomerasového enzymu lze použít molekulárně genetický přístup používající inhibici translace. Podle tohoto způsobu se telomerasové RNA sekvence napojí proti směru vlákna selektovatelného markéru. Jestliže se exprimují ve vhodném systému, selektovatelný markér bude funkční. Jestliže dochází k exprimaci cDNA kódující telomerasový RNA vazebný protein, protein se naváže na rozpoznávací sekvenci a tím blokuje translaci selektovatelného markéru. To umožňuje identifikaci klonu kódujícího protein. V jiných provedeních tohoto způsobu blokovaná translace selektovatelného markéru umožní růst transformovaných buněk. Mezi další systémy, které se mohou použít, patří systém zachycení interakcí popsaný v PCT patentovém spisu č. WO 94/ /10300, jedno-hybridový systém popsaný Liem a Herskowitzem: Science 262. 1870 (17. prosince 1993) a Zervosem a spol.: Cell 72, 223 (29. ledna 1993) a dvou-hybridový systém komerčně dostupný od Clontech.
Testy vazebnosti telomerasové RNA nebo telomerasové aktivity pro detekci specificky se vázajících proteinů a pro detekci aktivity se mohou používat pro usnadnění čištění telomerasového enzymu a pro identifikaci nukleových kyselin, které kódují proteinové složky tohoto enzymu. Například nukleové kyseliny, které obsahují sekvence RNA složky, se mohou použít jako afinitní činidla pro isolaci, identifikaci a čištění peptidů, pro60 teinů nebo jiných sloučenin, které se specificky vážou na sekvenci obsaženou v RNA složce, jako jsou proteinové složky lidské telomerasy. Existuje několik různých formátů, včetně posunu na gelu, navázání na filtr, footprinting, Northwesternovo blotování (RNA sonda proteinového blotu) a fotozesítování, pro detegování takového navázání a pro isolování složek, které se specificky vážou na RNA složku. Tyto testy lze použít pro identifikaci navázání proteinů, pro sledování čištění navázaných proteinů, pro charakterizaci RNA vazebných míst, pro stanovení molekulární velikosti navázaných proteinů, pro označení proteinů při preparativní isolaci a pro následnou imunizaci zvířat při generaci protilátek, aby se získaly protilátky pro použití při isolaci proteinu nebo při identifikování nukleové kyseliny kódující protein v systému transkripce/translace.
Savčí telomerasové proteinová složka se může vyčistit z buněk exprimujících telomerasu, jako jsou buňky HT1080, buňky 293 a další vhodné nesmrtelné buněčné linie konvenčními biochemickými způsoby. Například, a nikoliv jako omezení, se lidská telomerasa může z buněčných extraktů vyčistit v podstatě podle způsobu popsaného v USA patentové přihlášce 08/288501, podané 10. srpna 1994, která je zde zahrnuta jako odkaz. Savčí telomerasové extrakty lze od telomerasové RNA složky odstranit působením RNAsové aktivity nebo jinými vhodnými prostředky, které oddělí a/nebo degradují telomerasovou RNA složku, zatímco telomerasové proteinová složka zůstane v podstatě neporušena a schopna rekonstituce po přidání exogenní telomerasové RNA složky, která může být připravena rekombinantně nebo podobným způsobemištěná telomerasové proteinová složka, a popřípadě zbavená endogenní telomerasové RNA složky, se může používat ve zde popsaném činidle pro testování vyhledáváním a v dalších použitích.
Přenos exogenního genetického materiálu do buněk (tj. DNA zprostředkovaná transfekce) je podstatným způsobem základního výzkumu v buněčné biologii a molekulární genetice a také základem pro vyvíjení efektivních způsobů lidské genové terapie. Až dosud většina pokusů prokázaných genových přenosů ve Spojených státech spoléhala na retrovirové vektory defektní na replikaci, které nesou terapeutickou polynukleotidovou sekvenci jako část retrovirového genomu [Miller a spol.: Mol. Cell. Biol. 10, 4239 (1990), Kolberg R. : J. NIH Res. 4, 43 (1992), Cornetta a spol.: Hum. Gene Ther. 2, 215 (1991).]. Bylo také popsáno použití adenovirových vektorů pro potenciální použití v lidské genové terapii [Rosenfeld a spol.: Cell 68, 143 (1992).].
Jiným způsobem přenosu genů, který byl schválen pro použití u lidí, je fyzikální přenos plasmidové DNA v liposomech přímo do nádorových buněk in šitu. Na rozdíl od virových vektorů, které musí být namnoženy v kultivovaných buňkách, může být plasmidová DNA vyčištěna do homogenity a tedy snižuje potenciál pathogenního znečištění. V některých případech (např. nádorové buňky) nemusí být nutné stabilně integrovat exogenní DNA do transdukované buňky, protože přechodná exprese může postačovat k zabití nádorových buněk. Liposomem zprostředovaný přenos DNA byl popsán různými vynálezci [Wang a Huang: Biochem. Biophys. Res. Commun. 147. 980 (1987), Wang a Huang: Biochemistry 28. 9508 (1989), Litzinger a Huang: Biochem. Biophys. Acta 1113. 201 (1992), Gao a Huang: Biochem. Biophys. Res. Commun. 179. 280 (1991), Felgner: spis WO 91/17424 a spis WO 91/16024.].
Imunoliposomy byly popsány také jako nosiše exogenních polynukleotidů [Wang a Huang: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 84. 7851 (1987) a Trubetskoy a spol.: Biochem. Biophys. Acta 1131. 311 (1992).]. U imunoliposomů lze hypoteticky očekávat, že mají zlepšenou specifičnost na typ buňky při srovnání s liposomy díky zahrnutí specifických protilátek, o kterých se předpokládá, že se vážou na povrch antigenů na specifických typech buněk. Behr a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86, 6982 (1989) popisují použití lipopolyaminu jako činidla pro zprostředkování vlastní transfekce bez nutnosti, aby nějaký další fosfolid vytvořil liposomy.
Polynukleotid v podstatě identický s alespoň 25 nukleoti62 dy, s výhodou 50 až 100 nebo více nukleotidy, sekvence telomerasové RNA složky nebo jejího doplňku je odštěpitelně napojen na heterologní promotor. Vznikne tak transkripční jednotka, která je schopna exprimovat telomerasovou RNA složku nebo antimediátorový polynukleotid telomerasové RNA složky v lidské buňce. Tato transkripční jednotka může být obsažena v transgenu, adenovirovém vektoru nebo jiné modalitě genové terapie pro dodávání do lidských buněk, jako je tomu při terapii onemocnění souvisejícího s telomerasou (např. neoplazie). Vhodný způsob dodávání antikódující nebo antimediární expresní konstrukce telomerasové RNA složky bude zvolen odborníkem na základě přijatelných praktických možností a regulačních požadavků.
Genomové klony savčí telomerasové RNA složky, zvláště geny telomerasové RNA složky, které jsou v podstatě identické s myší telomerasovou RNA složkou, se mohou použit pro zkonstruování homologních cílových konstrukcí pro generování buněk a transgenní ch živočichů (vyjma člověka), které mají alespoň funkčně zničenou alelu telomerasové RNA složky. Návod pro konstrukci homologních cílových konstrukcí lze nalézt v oblasti techniky. Například: Rahemtulla a spol.: Nátuře 353, 180 (1991), Jasin a spol.: Genes Devel. 4, 157 (1990), Koh a spol.: Science 256, 1210 (1992), Molina a spol.: Nátuře 357. 161 (1992), Grusby a spol.: Science 253. 1417 (1991), Bradley a spol.: Bio/Technology 10, 534 (1992), zahrnuté zde jako odkazy. Homologního zacílení se může použít pro generaci tak zvaných knock-outových myší, které jsou heterozygotní nebo homozygotní pro deaktivovanou alelu telomerasové RNA složky. Takové myši se mohou prodávat komerčně jako výzkumná zvířata pro sledování vývoje imunitního systému, neoplazie, spermatogeneze, mohou být použita jako domácí zvířátka, mohou být používána jako zvířecí protein (potraviny) a pro další použití.
Chimérní cílové myši jsou odvozeny podle Hogana a spol.: Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) a Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson (red.),
IRL Press, Washington, D.C. (1987), které jsou zde zahrnuty jako odkazy. S embryonálními kmenovými buňkami se pracuje podle publikovaných postupů (Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach'·, E.J. Robertson (red.), IRL Press, Washington, D.C. (1987)? Zjilstra a spol.: Nátuře 342. 435 (1989) a Schwartzberg a spol.: Science 246, 799 (1989), všechny jsou zde uvedeny jako odkazy).
Kopie cDNA nebo genomového genu telomerasové RNA složky se může použít pro konstrukci transgenů pro expresi telomerasové RNA složky ve vysokých hladinách a/nebo za transkripční kontroly sekvencí transkripční kontroly, které se přirozeně nevyskytují přilehlé ke genu telomerasové RNA složky. Například, ale bez omezení, konstitutivní promotor (např. HSV-tk nebo pgk promotor) nebo specifická transkripční regulační sekvence vázaná na buňku (např. CD4 nebo CD8 genový promotor/zesilovač) může být odštěpitelně napojen (a) na polynukleotidovou sekvenci telomerasové RNA složky za vzniku transgenů (typicky v kombinaci se selektovatelným markérem, jako je neo genová expresní kazeta ). Tyto transgeny mohou být zavedeny do buněk (např. ES buněk, hematopoézních kmenových buněk) a konvenčními způsoby lze získat transgenní buňky a transgenní živočichy (nikoliv člověka) . Transgenní buňky a/nebo transgenní živočichové (ne člověk) mohou být použity pro vyhledávání antineoplastických činidel a/nebo potenciálních karcinogenů, jelikož nadexprese telomerasové RNA složky nebo nepřiměřená exprese telomerasové RNA složky může vést k preneoplastickému nebo neoplastickému stavu.
Polynukleotidy telomerasové RNA složky, prostředky telomerasové proteinové složky, matrice telomerních repeticí, vazebné reakce a podobné se mohou připravovat/provádět podle příkladů uvedených v části příklady provedení vynálezu. Obecně se telomerasové proteinové složky získávají konvenčním čištěním ze savčích buněk exprimujících telomerasu. Před jejich použitím v testech, jak zde popsáno, se zbaví asociované RNA složky. Pro praktické použití podle konvenčních způsobů se vybírají příslušné vodné podmínky. Jako obecný návod lze používat následu64 jící pufrované vodné podmínky: 10 až 250mM NaCl, 5 až 50mM Tris HC1, pH 5 až 8, s případným přidáním dvojmocného kationtu (kationtů) a/nebo kovových chelatačních činidel a/nebo neiontových detergentních činidel a/nebo membránových frakcí. Odborníci z oblasti techniky ocení, že za těchto bazických podmínek lze provést adice, delece, modifikace (jako je úprava pH) a substituce (jako je substituce KC1 za NaCl nebo substituce pufru). Lze udělat úpravy podmínek bazické vazebné reakce, pokud ke tvorbě specifického telomerasového holoenzymu a/nebo telomerasové aktivity dochází v kontrolní reakci (reakcích). Podmínky, které neumožňují specifické navázání a štěpení v kontrolních reakcích (bez činidla), nejsou vhodné pro použití ve vazebných testech.
Pro stanovení navázáni telomerasové RNA složky na imobilizovanou telomerasovou proteinovou složku se různé druhy telomerasové RNA složky s výhodou označují detegovatelným markérem, typicky biotinylovou skupinou, fluorescenční částí nebo radioaktivně označeným zahrnutým nukleotidem. Mezi vhodné označeni telomerasové proteinové složky patří, ale bez omezení na zde uvedené, radioaktivní označení zahrnutím radioaktivně označené aminokyseliny (např. leucin označený 14C, glycin označený 3H, methionin označený 35S), radioaktivním označením posttranslační rádiojodací působením 125I nebo 131I (např. Bolton-Hunterovou reakcí a chloraminem T), označením posttranslační fosforylací pomocí 32P (např. fosforylasou a anorganickým radioaktivně označeným fosforečnanem), fluorescenčním označením zahrnutím fluorescenčního značení (např. fluorescein nebo rhodamin) nebo označením jinými konvenčními způsoby známými v oblasti techniky. V takových provedeních, v nichž je jeden z polypeptidú různých druhů imobilizován vazbou na substrát, se druhá složka obvykle označuje detegovatelným markérem.
Označená telomerasová RNA nebo proteinová složka se uvede do kontaktu s imobilizovaným telomerasovým proteinem nebo RNA složkou a takovým množstvím činidla, které změní množství označené složky, které se imobilizuje (tj. která se váže na příbuz65 nou telomerasovou složku a které se zachytí). Doba a teplota inkubace vazebné reakce může být různá, pokud zvolené podmínky umožní, aby v kontrolní reakci, kde není přítomno žádné činidlo, došlo ke specifickému navázání. Při výhodném provedení se používá reakční teplota alespoň 15 °C, výhodněji 35 až 42 °C, doba inkubace přibližně alespoň 15 sekund, i když delší inkubační doby jsou také výhodné, takže se v některých provedeních dosáhne vazebné rovnováhy. Vazebné kinetiky a termodynamická stabilita vazebných komplexů určují podmínky, pokud jde o čas, teplotu, sůl, pH a další podmínky reakce. Pro jakékoliv příslušné provedení však lze podle praktických zkušeností odborníka používajícího konvenční způsoby z oblasti techniky, které zahrnují vazebnou analýzu pomocí Scatchardovy analýzy, Hillovy analýzy a dalších způsobů [Proteins, Structures and Molecular Priciples, Creighton (red.), W.H.Freeman and Company, New York (1984).], stanovit žádané vazebné reakční podmínky.
Specifická vazba označené telomerasové proteinové složky na imobilizovanou telomerasovou RNA složku se stanoví neznačeným kompetičním proteinem (např. albumin) a/nebo neznačenou RNA. Po ukončení vazebné reakce se stanoví množství označených částic, které jsou specificky vázány na imobilizované částice. Například, ale bez omezení, po vhodné inkubační době navázáni se vodná fáze obsahující neimobilizovanou označenou telomerasovou proteinovou složku odstraní, substrát obsahující imobilizované navázané telomerasové holoenzymové částice a jakoukoliv označenou telomerasovou proteinovou složku na ně navázanou se promyje vhodným pufrem, popřípadě obsahujícím neznačené blokující činidlo (činidla) a promývací pufr(y) se odstraní. Po promytí se stanoví (např. opticky, enzymaticky, autoradiograficky nebo jinými radiochemickými způsoby) množství detegovatelné značky zbývající specificky navázané na imobilizovanou značenou složku.
V některých provedeních je zahrnuto přidání neznačených blokujících činidel, která inhibují nespecifickou vazbu. Mezi příklady těchto blokujících činidel patří, ale nejsou tímto omezeny, následující činidla: DNA telecího brzlíku, lososová spermální DNA, kvasinková RNA, směsná sekvence (náhodná nebo pseudonáhodná sekvence) oligonukleotidů různých délek, hovězí sérový albumin, neiontová detergentní činidla (NP-40, Tween, Triton X-100 atd.), proteiny netučného sušeného mléka, Denhardtovo činidlo, pólyvinylpyrrolidon, Ficoll a další blokující činidla. Odborník z praxe může zvolit blokující činidla ve vhodných koncentracích, která budou zahrnuta v testech vazebnosti .
V těch provedeních, v nichž je telomerasová RNA složka nebo telomerasová proteinová složka imobilizována, se může použít kovalentní nebo nekovalentní vazba na substrát. Mezi chemii kovalentní vazby patří, ale nejsou na ně omezeny, dobře známé způsoby v oblasti techniky [Kadonaga a Tijan: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 83., 5889 (1986).]. Jedním příkladem, nikoliv jako omezení, je kovalentní vazba na substrát derivatizovaný bromkyanem (jako je CNBr-derivatizovaná sepharosa 4B). Může být žádoucí použít spacer pro snížení potenciální sterické zábrany substrátem. Mezi nekovalentní vazby proteinů na substrát patří, ale nejsou na ně omezeny, vazby proteinu na nabitý povrch a navázání na specifické protilátky.
V jednom provedení jsou kandidáti terapeutických činidel identifikováni jejich schopností blokovat navázání telomerasové proteinové složky na telomerasovou RNA složku.
Telomerasová RNA složka použitá v těchto způsobech typicky obsahuje sekvenci přirozeně se vyskytující savčí telomerasové RNA složky (např. lidské RNA složky), i když se někdy, jestliže se mutovaná telomerasová složka váže na telomerasovou proteinovou složku za kontroly testovacích podmínek (např. fysiologické podmínky) používají mutované sekvence telomerasové RNA složky.
V jednom provedení jsou kadidáti činidel modulujících telomerasu identifikováni jejich schopností produktovat statisticky významné snížení nebo zvýšení transkripce reportérové polynukleotidové sekvence (např. b-galaktosidasového genu, luciferasového genu, HPRT genu) odštěpitelně napojené na transkripční regulační sekvenci genu savčí telomerasové RNA složky, s výhodou genu lidské telomerasové RNA složky, v metabolicky aktivní savčí buňce. Reporterový gen (např. HPRT) může být vložen do restrikčního místa nebo místa se zarovnanými konci dvojvláknové cDNA savčí telomerasové RNA složky tak, že generuje homologní cílovou konstrukci nebo transgen, v němž je v životaschopné savčí buňce reporterový gen umístěn pod transkripční kontrolu promotoru genu endogenní telomerasové RNA složky a příbuzných transkripčních kontrolních prvků. Činidla, která produkují transkripční modulaci reporterového genu závislou na dávce, jsou tedy identifikována jako kandidáti činidel modulujících telomerasu.
V jiném provedení je gen endogenní telomerasové RNA složky v savčí buňce zacílen homologní cílovou konstrukcí, která umístí reportérovou polynukleotidovou sekvenci do odštěpitelně napojené vazby proti směru vlákna transkripční regulační sekvence (např. protomoru) genu endogenní telomerasové RNA složky v chromosomovém místě endogenního genu. V jiném provedení je exogenní polynukleotid obsahující reporterový polynukleotid odštěpitelně napojen na transkripční regulační oblast genu savčí telomerasové RNA složky (např. promotor a vazebná místa proti směru vlákna transkripčního faktoru). Exogenni polynukleotid se přenese do savčí buňky, v níž může integrovat nehomologně do chromosového místa a/nebo se uchová nebo replikuje jako episomální polynukleotid. Činidla, která produkují statisticky významnou transkripční modulaci reporterového polynukleotidu v buňkách zpracovaných s tímto činidlem, jsou tedy identifikována jako kandidáti modulačních činidel savčí telomerasy.
Telomerasu modulující činidla, která snižuji kapacitu buňky pro opravu telomerního poškození nebo pro inhibování replikace telomeru (např. kompetitivně inhibující endogenní přirozeně se vyskytující telomerasa) jsou kandidáty antineoplastických činidel nebo sensitizujících činidel, která sensitizují buňky (např. neoplastické buňky) na činidla poškozující telomer (například alkylační činidla a ionizační záření).
Kandidáti antineoplastických činidel se pak dále testují na antineoplastickou aktivitu v testech, které jsou běžně používány pro předpovídání vhodnosti pro použití jako lidská antineoplastická léčiva. Mezi příklady těchto testů, ale bez omezení na tyto, patři: 1) schopnost činidla, které je kandidátem, inhibovat schopnost transformovaných buněk nezávislých na ukotvení růst na měkkém agaru, 2) schopnost snižovat tumorogenicitu transformovaných buněk transplantovaných do nu/nu myší, 3) schopnost obracet morfologickou transformaci transformovaných buněk, 4) schopnost snižovat růst transplantovaných nádorů v nu/nu myších, 5) schopnost inhibovat tvorbu nádorů nebo preneoplastických buněk ve zvířecích modelech spontánně nebo chemicky indukované karcinogeneze a 6) schopnost indukovat diferenciovanější fenotyp v transformovaných buňkách, na které se činidlo aplikuje.
Testy detegování schopnosti činidel inhibovat nebo zvyšovat vazbu telomerasová proteinová složka:telomerasová RNA složka a/nebo enzymatickou aktivitu telomerasy poskytují snadné prohledávání bank činidel (např. knihovny sloučenin, peptidové knihovny a podobné) s vysokým výtěžkem, takže jsou identifikováni telomerasoví antagonisté nebo agonisté. Tito antagonisté nebo agonisté mohou upravovat telomerasovou aktivitu a tedy upravovat schopnost opravy telomeru a replikativní potenciál.
Podávání účinné dávky činidla schopného specificky inhibovat telomerasovou aktivitu u pacienta lze používat jako terapeutický nebo profylaktický způsob léčení pathologických stavů (např. rakoviny, zánětu, lymfoproliferačních onemocnění, autoimunních onemocnění, neurodegenerativních onemocnění a podobných) , které jsou efektivně léčeny upravením telomerasové aktivity a opravou a replikací DNA.
Jak bude odborníkům z oblasti techniky po přečtení tohoto spisu zřejmé, předložený vynález poskytuje cenná činidla týkající se lidské telomerasy stejně jako rozmanité užitečné terapeutické a diagnostické způsoby. Shora uvedený popis nutnosti poskytuje omezený vzorek těchto způsobů, které by neměly být zkonstruovány jako omezující rozsah tohoto vynálezu. Další vlastnosti a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujících příkladů a nároků.
Následující příklady popisují specifické aspekty vynálezu pro ilustrování vynálezu a poskytují popis způsobů používaných pro isolování a identifikováni RNA složky lidské telomerasy pro odborníky z oblasti techniky. Tyto příklady by neměly být konstruovány jako omezení vynálezu, protože pouze poskytují specifickou metodologii užitečnou pro porozumění a praktické používání vynálezu.
Příklady provedeni vynálezu
Celkový přehled
Klonování RNA složky lidské telomerasy vyžaduje nový způsob, který zahrnuje negativní selekci a cykly positivní selekce popsané níže. Původně byl však udělán pokus klonovat RNA složku použitím reversní transkripce a způsobu klonování konců cDNA nazvaný '5-RACE PCR amplifikace. Reversní transkripční reakce byla iniciována primerem identickým s jednotkou repetice v jednovláknové části lidské telomerní DNA a tedy doplňkové k sekvenci, o které se předpokládá, že je přítomna v RNA složce lidské telomerasy. Primer také obsahuje na svém 5'-konci sekvenci odpovídající místu rozpoznávání restrikčním enzymem. Jestliže však byla cDNA produkovaná reversní transkripční reakcí a PCR amplifikaci zkoumána gelovou elektroforezou a analýzou nukleotidové sekvence pásů nukleové kyseliny přítomných v gelu, byly detegovány pouze ribosomové RNA sekvence. S podobnými problémy se setkáváme, jestliže se zkouší variace tohoto 5'-RACE přístupu s uhnízděnými primery.
Úspěšné úsilí klonování začalo přípravou cDNA z vyčištěných přípravků lidské telomerasy a také z buněčných linií, které mají lidskou telomerasovou aktivitu a z buněčných linií, které nemají detegovatelnou lidskou telomerasovou aktivitu. Způsob použitý pro přípravu cDNA je podrobně popsán níže v příkladu 1. Byly použity dva negativní selekční stupně a postupné stupně positivní selekce spolu s cDNA přípravky ze dvou lidských buněčných linií pro snížení koncentrace nechtěných sekvencí a pro zvýšení koncentrace sekvencí žádoucích RNA složek.
Mezi negativní selekční stupně patří příprava biotinylovaného PCR produktu z cDNA připravené z lidské buněčné linie, která nemá detegovatelnou telomerasovou aktivitu. Biotinylovaný PCR produkt byl denaturován a potom rehybridizován v roztoku obsahujícím mnohem nižší koncentraci nebiotinylovaného produktu (poměr biotinylovaného k nebiotinylovanému produktu 100 : 1) z cDNA připravené z lidské buněčné linie, která nemá telomerasovou aktivitu. Kvůli možnosti, že telomerasové negativní buněčná linie může obsahovat něco málo RNA složky, byl proveden hybridizační stupeň, aby se diskriminovala nebo vybrala proti pouze RNA exprimované hojně v obou buněčných liniích. Po hybridizaci na Cot vybrané tak, aby byla umožněna hybridizace nejhojněji exprimované RNA, byl nechtěný materiál odstraněn navázáním na streptavidinylované magnetické částice. Supernatant zbývající po sebrání částic obsahoval žádanou cDNA pro RNA složku lidské telomerasy. Způsob PCR amplifikace cDNA je popsán níže v příkladu 2.
Tento materiál byl dále obohacen o žádanou cDNA postupnými cykly positivní selekce. V tomto positivním selekčním stupni byla biotinylovaná sonda doplňková k předpovězené sekvenci matrice v RNA složce lidské telomerasy hybridizována na PCR produkt z obohaceného vzorku (negativní selekcí) PCR-amplifikované cDNA z lidské buněčné linie, která má telomerasovou aktivitu. Po hybridizaci byly sonda/cílové komplexy navázány na avidinylované magnetické perličky, které pak byly použity v dalších cyklech positivní selekce jako zdroj nukleové kyseliny obohace71 né o sekvence RNA složky. Postup positivní selekce je popsán podrobněji níže v příkladech 3 a 4.
Po třetím cyklu positivní selekce se amplifikované produkty rozdělily gelovou elektroforesou. Sekce gelu odpovídající nukleovým kyselinám o velikosti kolem 200 párů nukleotidů byly odstraněny. Nukleové kyseliny byly pak eluovány z gelových sekcí a amplifikovány PCR. PCR amplifikační produkty byly rozštěpeny restrikčním enzymem Notl a vloženy ligací do Notl místa plasmidu pBluescriptIISK+, komerčně dostupného od Stratagene. Výsledné plasmidy byly transformovány do hostitelských buněk E. coli. Jednotlivé klony byly isolovány a použity jako zdroj nukleové kyseliny pro další analýzu a DNA sekvenování. četné klony positivní podle tohoto testu byly pak analyzovány DNA sekvenováním a různými dalšími testy.
Mezi tyto další testy patří následující: 1) stanovení, jestli antimediátorové oligonukleotidy doplňkové k domnělé RNA složce inhibují telomerasovou aktivitu v extraktech lidských buněk, o nichž je známo, že obsahují telomerasu, 2) stanovení, jestli PCR primery specifické pro sekvenci klonu domnělé RNA složky by mohly být použity pro amplifiklaci nukleové kyseliny přítomné v telomerasovém vzorku a jestli pozorovaný produkt, pokud nějaký existuje, by měl stopovou telomerasovou aktivitu během čištění telomerasy, a 3) stanovení, jestli PCR primery specifické pro domnělou sekvenci klonu RNA složky by mohly být použity pro amplifikaci nukleové kyseliny přítomné ve větším množství v buněčných extraktech z buněk, o nichž je známo, že je v nich telomerasová aktivita vysoká (tj. nádorové buňky) než v buněčných extraktech z buněk, o nichž je známo, že neprodukují žádnou telomerasovou aktivitu nebo produkují pouze malá množství telomerasové aktivity. Jeden klon, označený plasmid pGRN7, poskytl v těchto testech výsledky, které jsou v souladu se stanovením, že tento plasmid obsahoval cDNA odpovídající RNA složce lidské telomerasy.
Antimediátorové oligonukleotidy odpovídající sekvencím do72 mnělé sekvence RNA složky plasmidu pGRN7 tedy vykazovaly inhibici telomerasové aktivity in vitro. Podobně - jestliže byla telomerasa vyčištěna z buněčných extraktů způsobem zahrnujícím 1) DEAE chromátografii, 2) chromatografii na Sephadexu S300 a 3) buá glcerolový gradient na SP sepharose nebo dělení na fenylsepharose a sebrání frakcí, PCR primery specifické pro domnělou sekvenci RNA složky plasmidu pGRN7 amplifikovaly nukleovou kyselinu příslušné velikosti. Množství amplifikovaného produktu dobře odpovídalo množství telomerasové aktivity pozorované v sebraných frakcích. Konečně, buněčné extrakty z normálních (žádná detegovatelná telomerasová aktivita), rakovinových (telomerasové aktivita přítomna) a varlatových (telomerasová aktivita přítomna) buněk ukazovaly odpovídající množství PCR produktu při reversní transkripci a PCR amplifikaci (RT-PCR) s primery specifickými pro domnělou RNA složku obsaženou v pGRN7. Postup pro RT-PCR je popsán níže v příkladech 5 a 6.
Shora uvedené výsledky poskytly přesvědčující důkaz, že RNA složka lidské telomerasy byla klonována, takže plasmid pGRN7 byl pak použit pro isolaci genomového klonu pro RNA složku z lidské buněčné linie, jak je níže popsáno v příkladu 7. Genomový klon byl identifikován a isolován z genomové knihovny lidské DNA vložené do lambda vektoru FIXU získaného od Stratagene. Žádaný klon obsahující sekvence genu RNA složky obsahoval insert o velikosti kolem 15 000 párů nukleotidů a byl označen klon 28-1. Tento klon byl uložen v Americké sbírce typů kultur a je dostupný pod označením ATTC č. 75925. Z tohoto fágu byly subklonovány a sekvenovány různé restrikční fragmenty. Gen byl také lokalizován na vzdáleném konci q raménka chromosomu 34. Informace získané o této sekvenci od místa rozpoznávajícího restrikční enzym SauIIIAl na jednom konci insertu o velikosti kolem 15 000 párů nukleotidů do vnitřního místa rozpoznávajícího restrikční enzym HindlII, který obsahuje celou maturovanou sekvenci RNA složky a také transkripční kontrolní prvky genu RNA složky lambda klonu 28-1, je uveden níže.
Příklad 1
Příprava PCR amplilikovatelné cDNA
RNA byla získána z buněk 293 a IMR-90 guanidin-thiokyanatovou extrakcí nebo z vyčištěných telomerasových frakcí extrakcí směsí fenol/chloroform. Celková RNA z buněk 239 byla frakcionována podle velikosti na 2% (hmotn.) agarosovém gelu. Isoluje se RNA o velikosti menší než 500 párů nukleotidů.
Syntéza prvního vlákna cDNA se provede s reversní transkriptasou Superscript™ II získanou od Bethesda Research Laboratories (RRL). Asi 0,5 až 1,0 pg RNA se smíchá se 40 ng náhodného primerů (6-mer, pdN6) ve vodě v celkovém objemu 11 μΐ. Roztok se zahřívá 10 minut na 95 °C, potom se chladí v ledu 5 až 10 minut. Denaturovaná nukleová kyselina se isoluje odstřeáováním. Směs denaturované RNA a primerů se resuspenduje přidáním v následujícím pořadí: 4 μΐ 5x pufru pro syntézu prvního vlákna, 2 μΐ 0,1Μ dithiothreitolu (DTT), 1 μΐ RNAsinu (Pharmacia) a 1 μΐ dNTP (2,5mM pro každý zásobní roztok). Reakční směs se inkubuje 1 minutu při 42 °C. Potom se přidá a vmíchá do reakce 1 μΐ (200 jednotek) Superscritp™ II RTasy (BRL) a směs se nechá inkubovat 60 minut při 42 °C. Výsledná reakční směs, která obsahuje nově syntetizovanou cDNA, se umístí do ledu, dokud neproběhne syntéza druhého vlákna.
Syntéza druhého vlákna se provádí následujícím postupem. Asi 20 μΐ reakční směsi ze syntézy prvého vlákna cDNA (ze shora uvedeného odstavce) se smíchá v uvedeném pořadí s následujícími složkami: 111,1 μΐ vody, 16 μΐ lOx E.coli DNA ligasového pufru, 3 μΐ dNTP (2mM pro každý zásobní roztok), 1,5 μΐ E.coli DNA ligasy (15 podjednotek od BRL), 7,7 μΐ E.coli DNA polymerasy (40 jednotek od Pharmacia) a 0,7 μΐ E.coli RNasy H (BRL). Výsledný roztok se mírně míchá a inkubuje se 2 h při 16 °C. Během této doby se do reakční zkumavky přidá 1 μΐ (10 jednotek) T4 DNA polymerasy a v inkubaci se pokračuje 5 minut za stejné teploty (16 °C). Reakce se zastaví. Nukleová kyselina se isoluje dvojím extrahováním reakční směsi fenolem s chloroformem, vysrážením nukleové kyseliny ethanolem a odstřelováním reakční směsi. Získá se tak peleta nukleové kyseliny.
cDNA peleta získaná odstřeáováním se resuspenduje ve 20 μΐ TE pufru a liguje se k dvoj vláknovému oligonukleotidu nazvanému NotAB’’, který sestává ze dvou oligonukleotidů (NH2 znamená aminovou blokující skupinu):
NotA: 5'-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2 NotB: 5·-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3·.
Tento dvouvláknový oligonukleotid se vyrobí smícháním 50 μΐ oligonukletidu NotA (100 pmolů) s 50 μΐ oligonukleotidu NotB (100 pmolů) ve 46,25 μΐ vody, zahřátím výsledného roztoku 5 minut na 95 °C a přidáním 3,75 μΐ 20x SSC pufru, zatímco roztok je stále ještě horký. Zkumavka, která obsahuje směs, se pak dá do kádinky s horkou vodou (o teplotě 70 až 75 °C), teplota se nechá pomalu klesnout pod 15 °C, takže tyto dva oligonukleotidy mohou hybridizovat za vzniku dvouvláknového oligonukleotidu NotAB. Výsledná nukleová kyselina se isoluje vysrážením a odstřeďováním.
Dvouvláknový NotAB oligonukleotid se resupenduje ve 30 μΐ TE pufru a pak se liguje s cDNA v reakční směsi, která obsahuje 10 μΐ shora popsaného cDNA přípravku, 50 pmolů (vypočteno podle OD260) NotAB, 2 μΐ lOx pufru T4 DNA ligasy, 1,2 μΐ T4 DNA ligasy, 0,2 μΐ lOmM ATP a vodu do celkového objemu 20 μΐ. Reakční směs se inkubuje přes noc při 16 °c. Reakční směs se pak deaktivuje teplem zahřátím na 65 °C na dobu 10 minut. Pro PCR amplifikaci se typicky použije asi 1 až 2 μΐ výsledné směsi. Ligační směs lze amplifikovat v 10 až 15 cyklech (94 °C, 45 vteřin; 60 °C, 45 vteřin; 72 °C, 1,5 minuty). Potom se uloží jako zásobní směs, jak popsáno v příkladu 2.
Příklad 2
PCR amplifikace cDNA cDNA se rutinně amplifikuje připravením amplifikační reakční směsi složené z 5 μΐ lOx PCR pufru (500mM KC1, lOOmM Tris, pH 8,3, 20mM MgCl2, 5 až 8 μΐ dNTP (každý 2,5mM), 1 μΐ Taq polymerasy (Boehringer-Mannheim), 0,1 μΐ proteinu genu 32 (Boehringer-Mannheim), 6 μΐ primeru NotB (20μΜ zásobní roztok), 2 μΐ cDNA (připravena jak popsáno v příkladu 1) a vody do 50 μΐ. Tato směs se pak převrství 50 až 100 μΐ minerálního oleje. PCR amplifikace se provede v 10 až 15 cyklech (94 °C, 45 vteřin; 60 °C, 45 vteřin; 72 °C, 1,5 minuty). Po amplifikaci se reakční směs extrahuje směsí fenol/chloroform. Amplifikovaná nukleová kyselina se vysráží ethanolem a isoluje se odstřelováním. Sraženina se pak rozpustí ve 100 μΐ TE pufru. Připraví se tak zásobní roztok.
Příklad 3
PCR amplifikace pro subtraktivní hybridizaci a cyklickou selekci
Při výrobě PCR produktu jak pro subtraktivní hybridizaci tak pro cyklickou selekci se 1 μΐ zásobního roztoku připraveného podle přikladu 2 amplifikuje v 50 μΐ PCR reakční směsi připravené jak popsáno v příkladu 2 s tou výjimkou, že se provede 21 až 24 cyklů anelace primeru, rozšíření a denaturace produktu. Po amplifikaci se reakční směsi extrahují směsí fenol/chloroform, vysrážejí se ethanolem a isolují se odstřeďováním. Výtěžek produktu byl vyhodnocen obarvením ethidiumbromidem po elektroforese malého podílu reakční směsi na agarosovém gelu. Pro subtraktivní hybridizaci se cDNA knihovna z buněk negativních na telomerassu (IMR-90) amplifikuje v přítomnosti biotinylovaného dUTP. Pro subtraktivní hybridizaci se použije poměr přibližně 100 ku 1 cDNA z buběk negativních na telomerasu (IMR-90) k cDNA z buněk positivních na telomerasu (293). Použí76 vají se stadardní podmínky: 65 °C a 48 až 72 h. Typicky se pro alespoň dvě kola cyklické selekce použijí 2 /zg produktu nukleové kyseliny z částečně vyčištěné cDNA a negativně vybraný materiál .
Po cyklické selekci popsané v příkladu 4 se 1 až 2 μΐ vybraných stažených” produktů (z celkového objemu 20 μΐ) PCR amplifikují, jak popsáno v příkladu 2, ve 22 cyklech, vysrážejí se ethanolem a isolují se odstřeďováním při přípravě pro další cyklickou selekci.
Příklad 4
Positivní selekce PCR amplifikované cDNA
Pro positivní selekční stupeň cyklické selekce použité pro klonování RNA složky lidské telomerasy se 2 pg PCR amplifikované cDNA zředí 25 μΐ TE pufru a potom se smíchají s 1,25 μΐ 20x SSC. Výsledný roztok se zahřívá 3 minuty na 95 °C. Teplota se pak sníží na 60 °C na dobu 5 minut a přidá se 1 μΐ (0,1 μg/μl) R2 nebo R4 biotinylované sondy. Sekvence těchto sond jsou uvedeny níže:
R2: 5'-UUAGGGUUAGII-biotin
R4: 5'-AUUGGGUUAUII-bÍotin.
Sondami jsou O-methyl-RNA sondy, U znamená O-methyl-uridin, A znamená O-methyl-riboadenin, G znamená O-methyl-riboguanidin a I znamená inosin. R2 sonda je specifická pro telomerní repetici a R4 sonda je specifická pro RNasu P, která byla použita pro sledování efektivity a účinnosti postupů cyklické selekce. Provedením cyklické selekce současně, ale odděleně pro RNA RNasy P, molekulu známé sekvence, lze dosáhnout větší věrnosti než v případě, kdy postup cyklické selekce funguje příslušně vzhledem k molekule, o kterou se zajímáme, v tomto případě RNA složky lidské telomerasy.
Po přidání buď R2 nebo R4 sondy ke směsi při 65 °C se teplota hybridizační reakční směsi sníží na 30 °C inkubací směsi minut při stejné teplotě. Potom se teplota reakční směsi dále sníží na 14 °C a směs se při této teplotě inkubuje 60 minut. A konečně se směs inkubuje 2 až 12 h při 4 °C.
Celá hybridizační reakční směs pro každý vzorek (R2 nebo R4) se přidá ke 400 μΐ 0,5x SSC při 4 °C. Potom se přidá do zkumavky s ledem ochlazenými magnetickými perličkami, které byly získány od Promega a které byly před použitím čtyřikrát promyty 0,5x SSC. Výsledná směs se inkubuje 30 minut při 4 °C, aby se zajistilo úplné navázání na magnetické perličky. Každá reakční zkumavka se pak krátce inkubuje za teploty místnosti na magnetické desce (Promega), aby se perličky stáhly. Perličky se resuspendují ve studeném 0,5x SSC (600 μΐ) a umístí se (ve zkumavce) do ledu. Vzorky se ještě třikrát promyjí tímto způsobem 0,5x SSC. Nukleová kyselina se z perliček eluuje resupendováním perliček ve 100 μΐ vody a inkubováním 2 minuty při 65 °C před tím, než se umístí na magnetickou desku, kde se isolují. Tento postup se opakuje tři nebo vícekrát. Při posledním opakování se resuspendované perličky inkubují 5 minut při 65 °C před umístěním na magnetickou desku pro isolaci. Všechny 100μ1 supernatanty (pro každý vzorek) se spojí a vysuší na 20 μΐ v odstředivce SpeedVac™. Isolovaná DNA se pak PCR amplifikuje pro další kolo amplifikace a selekce. Po každé amplifikaci se PCR produkty dvakrát extrahují směsí fenol/chloroform, vysrážejí ethanolem a resuspendují ve 20 ml TE pufru.
PCR amplifikace se typicky ověřuje elektroforesou na agarosovém gelu. Vedle toho se pro sledování postupu cyklické selekce používají rozmanité kontroly. Jako jedna z kontrol - PCR raménka (oligonukleotidy definované sekvence, které slouží jako primerní hybridizační místa) se umístí na nukleovou kyselinu, která obsahuje gen udělující resistenci na neomycin. Výsledná nukleová kyselina se smíchá s PCR amplifikovanou cDNA a sleduje se při každé selekci kvantitativní PCR. Jako jiná kontrola - RNasa P byla sledována jak v RNase P vybrané knihovně tak v knihovně vybrané telomerasovou RNA složkou.
Příklad 5
RT-PCR postup
První vlákno cDNA se vyrobí v podstatě podle postupu popsaného v příkladu 1. V podstatě se to provede tak, že se RNA vyčistí z každé telomerasové frakce obsahující 0,1 až 1 /zg RNA. Typicky se použije 1/3 až 1/5 RNA vyrobené z 300μ1 frakce. RNA se smíchá se 40 až 80 ng náhodného hexameru v 10 μΐ, denaturuje se 10 minut při 95 °C (použitím termálního cyklického zařízení) a ochladí se v ledu. K reakční směsi obsahující 4 μΐ 5x pufru pro syntézu prvního vlákna, doplněného výrobcem o reversní transkriptasu (RTasa, dodaná BRL), 2 μΐ 0,1Μ DTT, Ιμΐ lOmM dNTP každého), 1 μΐ RNasového inhibitoru (Pharmacia) a vodou na celkový objem 9 μΐ, se přidá denaturovaná RNA a 6-mer. Spojená směs se umístí do vodní lázně o teplotě 42 °c. Po 1 až 2 minutách inkubace se ke směsi přidá 1 μΐ Superscripť™ II RTasy (BRL). V inkubaci se pokračuje 60 minut při 42 °C. Reakce se zastaví zahřátím zkumavky na 85 až 98 °C po dobu 10 minut. První vlákno cDNA se isoluje krátkým odstřelováním, rozdělí se do nových zkumavek, rychle se nechá zrmznout v suchém ledu a skladuje se při - 80 °C nebo se ihned použije.
Příklad 6
PCR amplifikace cDNA specifickou primerovou sadou
Pro 20μ1 PCR reakci s radioaktivně označenými nukleotidy se 1 μΐ cDNA, připravené podle postupu uvedeného v příkladu 5, smíchá s 20 pmoly primeru 1, 20 pmoly primeru 2, 2,5 μΐ 2,5mM dNTP, 5μΰΐ alfa-32P-dATP, 2 jednotkami Taq polymerasy (Boehringer-Mannheim), 0,2 μg proteinu T4 genu 32 (Boehringer-Mannheim), 2 μΐ lOx pufru (500mM KC1, lOOmM Tris-HCl, pH 8,3, a 20mM MgCl2) a vodou na celkový objem 20 pl. Do zkumavky se přidá 1 kapka minerálního oleje.
Podmínky pro PCR amplifikaci klonu telomerasové RNA složky byly: 45 vteřin při 94 °C, 45 vteřin při 60 °C, 1,5 minuty při 72 °C. Počet cyklů se lišil podle typu čištěných materiálů použitých pro přípravu RNA, ale typicky byl v rozmezí od 18 do 25 cyklů. Pokud jde o všechny kvantitativní RT-PCR, pro každý vzorek bylo provedeno několik reakcí s různým počtem cyklů, aby se stanovilo, jestli PCR amplifikace je nasycená a nelineární.
Pro RNasu P použitou jako kontrola byly podmínky PCR amplif ikace: 45 vteřin při 94 °C, 45 vteřin při 50 °C, 1,5 minuty při 72 °C. Počet cyklů byl opět mezi 15 a 22, podle povahy vzorků. Sekvence primerů, které byly použity pro amplifikací RNasy P, byly následující:
P3: 5'-GGAAGGTCTGAGACTAG-3'
P4: 5'-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3 7.
PCR produkt získaný s těmito dvěma primery má velikost kolem 110 párů nukleotidů.
Po PCR byly produkty (5 až 10 μΐ reakční směsi) naneseny na 6% (hmotn.) přírodní polyakrylamidový gel a elektroforesovány. Po elektroforese byl gel vysušen a exponován na kazetu Phosphorlmager™ nebo autoradiografický film pro analýzu.
Příklad 7
Klonování genu pro RNA složku lidské telomerasy
Postupy použité pro klonování genu pro RNA složku lidské telomerasy byly prováděny podle Maniatise a spol.: Laboratory Molecular Cloning Manual. Genomová DNA knihovna DNA z fibroblastových buněčných linií WI-38 z lidských plic vložených do vektoru fágu lambda FIXU byla získána od Stratagene. Fág byl vyset v koncentraci 25 000 plaků na desku na tři řady desek o 15 (150mm) deskách. Desky byly vyrobeny z NZY agaru a NZY vrchní agarosy. Buňky použité pro transformaci fágu byly buňky XLlBlueMRAP2. Transformanty byly pěstovány přes noc 16 h při 37 °C. Desky byly chlazeny 1 h na 4 °C, potom byly plaky přeneseny na C/P nylonová kolečka (filtrační papír od BioRad).
Tento postup byl zopakován, aby se získala duplikátní řada přenesených filtrů. Filtry (v duplikátu) byly denaturovány, neutralizovány, ekvilibrovány v 6x SSC pufru, vystaveny působení UF záření, aby se zesilovala nukleová kyselina na filtr, a potom byly vysušeny na blotovacím papíru.
Předhybridizace byla prováděna 1 h při 37 °C v 50% (hmotn.) formamidovém pufru. Filtry byly sondovány radioaktivně označeným Notl fragmentem o velikosti kolem 218 párů nukleotidů z klonu pGRN7, který byl isolován elektroelucí z 5% (hmotn.) polyakrylamidového gelu po oddělení elektroforesou a zářezovou translací alfa-32P-dCTP použitím sestavy pro zářezovou translaci od Boehringer-Mannheim Biochemicals podle pokynů výrobce. Na filtr bylo použito asi 25 ng (10 MCi značky) sondy. Hybridizace byla prováděna přes noc při 37 °C v 50% (hmotn.) formamidovém hybridizačním pufru. Po hybridíazci byly filtry promyty šestkrát za teploty místnosti. První tři promytí byla provedena 6x SSC obsahujícím 0,1% (hmotn.) SDS, poslední tři promytí 6x SSC samotným. Po původním kontrole několika duplikátních filtrů kazetou Phosphorlmager™ pro kontrolu účinnosti hybridizace a síly signálu byly filtry promyty při 65 °C v 0,5x SSC. Filtry byly pak umístěny pod Kodak XAR5 film použitím dvou zesilovacích folií a film byl exponován asi 100 h při -70 °C.
Jeden silný signál emanoval z filtru, který obsahoval fág, později označený 28-1, obsahující gen pro RNA složku lidské telomerasy. Plak odpovídající signálu pozorovanému na filtru byl použit pro výrobu sekundárních desek, takže isolovaný plak (potvrzený sondováním značenou pGRN7 nukleovou kyselinou) mohl být kultivován pro isolaci fágové DNA ve velkém měřítku. Fág 28-1, dostupný z Americké sbírky typů kultur pod č. 75925 obsahuje insert o 15 000 nukleotidů a dále obsahuje několik restrikčních fragmentů, které obsahují sekvence, které hybridizují se sekvencemi RNA složky na pGRN7: fragment reskrikčního enzymu EcoRI o 4200 nukleotidech, fragment restrikčního enzymu Clal o 4200 nukleotidech a fragment restrikčních enzymů HindlII-SacI o 2500 nukleotidech. Poslední fragment obsahuje úplnou nukleotidovou sekvenci o 560 nukleotidech shora uvedené RNA složky. Předpokládá se, že obsahuje kompletní gen RNA složky. Plasmid obsahující HindlII-SacI restrikční fragment o 2500 nukleotidech ve vektoru pBluescript byl označen pGRN33 a je dostupný z Americké sbírky typů kultur pod ATCC č. . Lidský gen může obsahovat jiné sekvence než jsou ty, které jsou na fragmentu o 2500 nukleotidech. Tyto sekvence mohou být isolovány z fága 28-1 nebo z jiných fágových klonů identifikovaných sondováním fragmentem o 2500 nukleotidech (nebo jinou sondou podle vynálezu). Shora uvedené restrikční fragmenty byly připraveny v oddělených štěpeních restrikčními enzymy. Produkty těchto štěpů byly rozděleny elektroforesou na 0,7% (hmotn.) agarosovém gelu nebo (pouze pro fragment o 2500 nukleotidech) na 3% (hmotn.) polyakrylamidovém gelu. Žádané pásy byly z gelu vyříznuty a připraveny pro subklonování buá použitím sestavy GeneClean™ Kit II (od BiolOl, lne.) nebo elektroelucí do Spectropor #2 dialyzační zkumavky v 0,lx TBE při 100 V 2 h (pouze pro fragment o 2500 nukleotidech).
Tyto restrikční fragmenty byly subklonovány do E.coli expresních/mutagenesních plasmidů odvozených od plasmidů na bázi pUC nebo od pBluescriptlI plasmidů, které také obsahují počátek replikace SV40 (ale nikoliv SV40 promotorovou aktivitu). Výsledné plasmidy mohou být použity pro přípravu nukleových kyselin změněné (mutované) RNA složky pro zavedení do lidských nebo jiných eukaryotických buněk pro různé účely, jako je shora popsáno v popisu výhodných provedeních.
Příklad 8
Antimediátorové plasmidy pro RNA složku lidské telomerasy
Antimediátorové expresní plasmidy byly připraveny PCR amplif ikaci cDNA RNA složky použitím následujících řad primerů: 1) NotB a Gl, které produkují antimediátorovou nukleovou kyselinu, která je menší než cDNA insert v plasmidů, a 2) notB a R3C, které produkují antimediátorovou nukleovou kyseliny plné délky (vzhledem k insertu v plasmidu). Nukleotidové sekvence
NotB je uvedena shora v příkladu 1, nukleotidové sekvence Gl a R3C primerů jsou uvedeny níže:
Gl: 5 7-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3 7
R3 C: 57-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-37.
Po PCR amplifikaci byly amplifikované framgmenty klonovány do expresního plasmidu o 10 000 párech nukleotidů v místě PmlI. Tento plasmid jako selektovatelné markéry obsahuje geny udělující resistenci na puromycin, DHFR a resistenci na hygromycin B, počátek replikace SV40, indukovatelný promotor genu lidského metallothioneinu umístěný pro expresi antimediátorového vlákna genu pro RNA složku lidské telomerasy (pro získání vyšších hladin exprese lze použít silnější promotor) a SV40 pozdní póly A adiční místo.
Výsledné plasmidy (označené pGRN42 pro NotB/Gl produkt a pGRN45 pro NotB/R3C produkt) byly transfektovány postupem s fosforečnanem vápenatým (viz shora Maniatis a spol.) do fibrosarkomové buněčné linie HT1080. HT1080 buňky jsou normálně nesmrtelné. Exprese antimediátorové RNA pro RNA složku lidské telomerasy by měla zabránit RNA složce lidské telomerasy asociovat s proteinovými složkami, blokovat tvorbu aktivní telomerasy a způsobit, že tyto buňky budou smrtelné.
Příklad 9
Identifikace a isolace nukleových kyselin RNA složky ze savců vyjma člověka
Pro ilustraci toho, jak mohou být použita činidla podle vynálezu k identifikování a isolování v podstatě homologních nukleových kyselin z jiných druhů savců, byly PCR primery doplňkové k sekvencím lidské RNA složky použity pro amplifikování homologních sekvencí v PCR. Ilustrační pár primeru použitý pro demonstrování tohoto aspektu vynálezu je složen z primeru +10, který má sekvenci 57-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-37, a primeru R7, který má sekvenci 57-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-37. Genomová DNA byla připravena z tkáně šimpanze, veverčí opice, opice rhezus a tkáně paviána a rozpuštěna v TE pufru na koncentraci 0,5 až 4 mg/ml.
Pro každý typ tkáně byla připravena PCR směs, která obsahovala: 1 μΐ genomové DNA, 48 μΐ směsi Master Mix (Master Mix je složena z lx TagExtender™ pufru od Stratagene, 200μΜ dNTP (každého) a 0,5μΜ kažého primerů) a 0,5 μΐ směsi (1:1 (obj.)) Tag polymerasy (5 jednotek/μΐ, Boehringer Mannheim) a Tth polymerasy (TaqExtender™ polymerasa od Stratagene). Reakční zkumavky byly dány do termálního cyklovače, který byl naprogramován tak, že nejdříve zahříval reakční směs 5 minut na 94 °C a potom provedl 27 cyklů inkubace, z nichž každý sestával z 30 vteřin při 94 °C, 10 vteřin při 63 °C a 45 vteřin při 72 °C. Po ukončení amplifikační reakce se 10 μΐ každé reakční směsi nanese na 2% (hmotn.) agarosový gel pro elektroforesu. Po elektroforese, obarvení gelu a UF ozáření lze pozorovat, že každá reakční směs obsahuje pás předpověděné velikosti (kolem 200 párů nukleotidů). Nukleové kyseliny z těchto pásů lze klonovat a sekvenovat. Zbytky genů RNA složek každého druhu savce mohou být klonovány jak shora popsáno pro gen RNA složky lidské telomerasy. Přiklad 14 níže popisuje specifický příklad sekvenování genu telomerasové RNA složky veverčí opice.
Příklad 10
Mutované mediátorové sekvence lidské telomerasové RNA složky
Tento příklad demonstruje, že změněním sekvence telomerasové RNA složky v oblasti matrice se změní sekvence syntetizovaná lidskou telomerasou, což vede ke změnám v chromosomových telomerasových repeticích.
Pro stanovení toho, jestli by přeprogramování oblasti matrice TRC3 vedlo k odpovídajícím změnám telomerní repetice syntetizované v lidské telomerasové aktivitě, byl klonován a mutagenizován genový fragment, který exprimuje sekvenci genu úplné telomerasové RNA složky (TRC3). Southernova blotová analýza ukázala, že TRC3 hybridizovala na gen o jediné kopii v lidském genomu. Genomová kopie TRC3 byla isolována z knihovny lambda fágu a bylo ukázáno, že má stejnou restrikční mapu, jako genomové Southernovy bloty sondované TRC3, Byl isolován HindlII-Sacl fragment o 2600 párech nukleotidů. Tento fragment byl subklonován do modifikované verse pBluescript, generující genomový TRC3 plasmid pGRN33. 5Z a 3' konce této RNA byly mapovány rozšířením primerů RACE PCR a RT-PCR. Velikost RNA transkriptu byla kolem 550 nukleotidů, což souhlasí s jeho migrací na Northernových blotech. Transkribovaná oblast pro TRC3 byla středová ke genomovému klonu s 1400 nukleotidy proti směru sekvence.
RNA byla extrahována z vyčištěných telomerasových přípravků a byla pak použita v následujících pokusech. 5' RACE: cDNA prvního vlákna byla připravena použitím antimediátorových TRC3 primerů (R3B: 5'-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT) v přítomnosti 32P-dATP. Rozšířené produkty byly rozděleny na PAGE, identifikovány autoradiograficky, vystřiženy a extrahovány. Oligonukleotid (NotA: 5'-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NHJ byl ligován do těchto produktů prvního vlákna použitím T4 RNA ligasy. PCR byla provedena použitím hnízdového primerů R3c (5z-GTTTGCTCTAGAATGA. .ACGGTGGAAG) a oligonukleotidů (NotB: 5Z-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT) doplňkového k oligonukeotidu NotA. PCR produkty byly rozděleny na agarosovém gelu, pásy byly vystřiženy a sekvenovány přímo pomocí oligonukleotidů Gl (5Z-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA) jako primerů. Mapování z 3*-konce: Pokusy provést 3Z RACE nebyly úspěšné. Byla tedy použita strategie RT-PCR, při níž byla serie antimediátorových primerů doplňkových k sekvenci genomové DNA použita pro iniciaci syntézy cDNA prvního vlákna. Primery v této sérii byly umístěny přibližně 150 párů nukleotidů od 5Z konce transkriptu směrem k 3Z konci. PCR byla pak provedena pomocí primerů prvního vlákna a primerů, jehož sekvence byla vnitřní ke známému TRC3 transkriptu (F3b: 5·-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCG.
.TAG). PCR pásy o předpověděné velikosti citlivé na reversní transkriptasu byly vidět, když se používá cDNA připravená se všemi primery navrženými pro interval +100 až +450 (číslování vzhledem k 5' konci), ale nikoliv s jakýmikoliv primery od +568 do +950. To umistuje domnělý 3' konec maturovaného TRC3 transkriptu mezi polohu +450 a +558. Následná kola návrhu primerů a RT-PCR zúžila tento interval mezi polohy +545 a +558.
Předpovězená sekvence matrice TRC3 byla změněna ze sekvence CUAACCCUA na CCAACCCCA (MuC) nebo CAAACCCAA (MuA) in vitro mutagenesí (provedenou v podstatě podle Pereze a spol.: J. Biol. Chem. 269. 22485 (1994).) genomového plasmidu pGRN33. Jestliže jsou zahrnuty do funkční telomerasy, tyto mutované RNA by byly matricemi syntézy TTGGGG (MuC) nebo TTTGGG (MuA) spíše než přírodní repetice TTAGGG. Tyto mutované telomerasové aktivity by mohly být snadno odlišeny od přírodní aktivity, protože by již nevyžadovaly dATP pro aktivitu a pouze přírodní aktivita by byla citlivá na zakončení ddATP. Byl připraven také dvojitý mutant (MuC+17), v němž byl v +180 p.n. k MuC matrici přítomen insert o 17 párech nukleotidů (p.n.). Tento mutant umožňoval specifickou detekci změněné RNA sondou na insert 17 párů nukleotidů nebo podle velikosti.
Genomová sekvence o 2600 párech nukleotidů byla dostatečná pro expresi TRC3 in vivo. Buňky byly přechodně transfektovány MuC+17 plasmidem, RNA exprimovaná z transfektované DNA byla detegována RT PCR sekvencí insertu 17 párů nukleotidů jako primeru ve stupni reversní transkripce. RNA byla detegována v buňkách transfektovaných MuC+17, ale nikoliv v simulované transfektovaných buňkách. To ukazuje, že genomový klon o 2600 párech nukleotidů byl postačující pro TRC3 expresi. Stabilní transformanty byly pak odvozeny od každého z těchto tří mutovaných plasmidů transfekcí fosforečnanem vápenatým buněk HT1080 spolu s pCMVneo. Resistentní klony byly vybrány v G418 a exprese MuC+17 RNA byla ověřena RT-PCR (Irving a spol.: Exp. Cell Res. 202. 161 (1992).).
Při testování telomerasové aktivity mutantu byly analyzovány extrakty z netransfektovaných buněk a ze tří stabilních transformantů integrovaným MuC*, MuC nebo MuA vektorem (C*, C nebo A na obr. 1). Jelikož bylo očekáváno, že mutované extrakty budou obsahovat jak přírodní tak mutované telomerasové aktivity, byly pro jejich rozlišení použity různé testovací podmínky. Za normálních reakčních podmínek (dTTP, 32P-dGTP a dATP) všechny tři extrakty ze serie konstrukcí mutantů vykazovaly přírodní telomerasovou aktivitu, která byla citlivá na RNasu (obr. 1, pásy 1 až 6). Jak bylo očekáváno, tato aktivita nebyla ovlivněna, jestliže byl do reakcí zahrnut ddCTP (obr. 1, pásy 7 až 9) a byla zničena ddTTP (pásy 10 až 12). Naproti tomu, jestliže ddATP byl nahrazen dATP, C (pás 14) a A (pás 15) extrakty ještě vykazovaly telomerasovou aktivitu citlivou na RNasu (pásy 17 a 18), zatímco C* (pás 13) a kontrolní extrakt nikoliv. Tyto výsledky ukazují, že telomerasa představující aktivity resistentní na ddATP byla přeprogramována MuC nebo MuA TRC3 RNA. Naproti tomu inserce 17 párů nukleotidů do C* inhibuje rekonstituci, což ukazuje, že rekonstituce telomerasy je velice specifická pro TRC3 sekvenci.
Pro potvrzeni toho, že sekvence syntetizovaná mutantem MuA byla (GGGTTT)n, modifikovali jsme existující PCR metodologii pro amplif ikování telomerasových repeticí přidaných na jedinečný telomerasový primer (Kim a spol.: Science 266, 2011 (1994).). Použitím syntetických primerů jsem identifikovali reakční podmínky, při nichž 3' primer se sekvencí d(CCCAAACCCAAA. .CCCCAA) by amplifikoval pouze (TTTGGG)n repetice a neamplifikoval by repetice obsahující (TTAGGG)n.
Pro rozlišení mezi telomerními repeticemi přidanými přírodní nebo mutovanou telomerasou byl dvoustupňový test zkombinován se strategií omezení dostupnosti nukleotidů pro telomerasovou reakci. Jelikož MuA a MuC by generovaly sekvence telomerní repetice (TTTGGG)n a (TTGGGG)n, buněčné extrakty byly nejdříve inkubovány TS substrátem v přítomnosti pouze dTTP a dGTP 10 minut za teploty místnosti, aby se umožnila adice telomerních repeticí. Výsledná telomerasová aktivita byla pak zničena pětiminutovým vařením extraktů. Telomerasové produkty se specifickou DNA sekvencí pak byly detegovány PCR amplifikaci příslušnými reversními primery a v přítomnosti všech čtyř dNTP a stopových množství 32P-dCTP, jak je popsáno v oblasti techniky (Kim a spol.: viz shora 1994.). Při detekci MuA produktů byl reversním primerem (ACCCAA)4 a podmínky pro PCR byly: 10 vteřin při 94 °C, 30 vteřin při 60 °C a 30 vteřin při 72 °C, celkem 20 cyklů. Pro detekci MuC produktů byly použity tři reversní primery: (CCCCAA)3, (CCAACC)3 a (CCAACC)3, které poskytly PCR produkty s odpovídajícími posuny pohyblivosti v souladu s očekávanou polohou anelace na telomerasové produkty. PCR podmínky byly stejné jak shora uvedeno až na anelační teplotu 50 °C. Za stejných podmínek nebyly z extraktů rodičovských buněk nebo z buněk transfektovaných přírodním TRC-3 genem získány žádné telomerasové produkty. V testech specifičnosti našich podmínek PCR amplifikace syntetické oligonukleotidy obsahující (TTTGGG)n a (TTGGGG)n generovaly příslušné žebříkovité PCR produkty o 6 nukleotidech a reversním primeru (ACCCAA)„ nebo (CCCCAA)3, zatímco oligonukleotidy (TTAGGG)„ neprodukovaly žádné PCR produkty s (ACCCAA)„ nebo (CCCCAA)3 reversním primerem.
Pomoci těchto podmínek extrakty z MuA, ale nikoliv z MuC nebo přírodních buněk generovaly produkty v modifikovaném telomerasovém testu, což ukazuje na to, že telomerasa z buněk obsahujících MuA generovala (TTTGGG)„ repetice. Podobné způsoby byly použity pro analyzování MuC mutantu, který syntetizoval (TTGGGG)n repetice. Shora uvedená data souhrnně znamenají silný důkaz toho, že TRC3 gen kóduje RNA složku lidské telomerasy a proto jsme TRC3 přejmenovali na hTR (lidská (v angličtině human) Telomerasová RNA).
Příklad 11
Telomerasová RNA složka ve smrtelných a v nesmrtelných buňkách
Většina rakovinových buněk exprimuje vysoké hladiny telomerasové aktivity, zatímco ve většině normálních somatických lidských buněk není telomerasa detegována (Kim a spol.: viz shora 1994.). Pro stanoveni toho, jestli úroveň telomerasové RNA složky je v nesmrtelných rakovinových buněčných liniích zvýšena, se množství telomerasové RNA složky a GAPDH transkriptu analyzují RT-PCR v pěti smrtelných primárních buněčných kmenech, kterým chybí detegovatelná telomerasové aktivita, a pěti liniích nesmrtelných rakovinových buněk s vysokými hladinami telomerasové aktivity. Úrovně (ve stabilnímn stavu) transkriptů telomerasové RNA složky byly 3 až 12krát vyšši v liniích nádorových buněk než u primárních buněk, jestliže se srovnávají hladiny GADPH (obr. 2A). Zatímco množství telomerasové RNA složky byla zvýšena u nesmrtelných rakovinových buněk exprimujících vysoké hladiny telomerasy, je zajímavé, že nízké, ale snadno detegovatelné hladiny telomerasové RNA složky byly přítomny také ve smrtelných primárních buňkách s žádnou detegovatelnou telomerasovou aktivitou (pásy 1 až 5).
Množství telomerasové RNA složky byla zkoumána také v různých normálních lidských tkáních Northernovou blotovací analýzou. Varlata a vaječníky měly nejvyšší hladiny telomerasové RNA složky, což bylo očekáváno, protože tyto tkáně exprimují vysoké hladiny telomerasové aktivity. Četné další tkáně také exprimovaly telomerasovou RNA složku (obr. 2B a 2C). Patří sera normální ledviny, prostata a játra dospělých, všechny, kterým chybí detegovatelné množství telomerasové aktivity. Tyto výsledky potvrzují data z buněčných linií (obr. 2A). Předpokládá se, že telomerasové RNA může být přítomna, ale neaktivní, v četných lidských tkáních. Podobné tkáňově specifické rozdíly v expresi RNA lze vidět v myších tkáních. Mnoho normálních myších tkání je však na telomerasovou aktivitu positivní. Zřetelné zvýšení represe telomerasové aktivity v lidských buňkách může pomoci vysvětlit to, proč se myší buňky v kultuře spontánně znesmrtelní, zatímco lidské buňky nikoliv.
Příklad 12
Exprese antimediátorových hTR (lidská telomerasová RNA složka) transkriptů v HeLa buňkách vede ke krizi buněk a ke smrti buněk
Pro zkoumání funkce telomerasy v nesmrtelných buňkách byly antimediátorové hTR expresní konstrukce zavedeny do HeLa buněk. EcoRI DNA fragment o 200 párech nukleotidů obsahující 1 až 193 párů nukleotidů cDNA klonu lidské telomerasové RNA složky, TRC3, se vloží do místa EcoRI pl0-3 a pBBS212. Získají se tak plasmidy plO-3-hTR a pBBBhTR. Plasmid pl0-3-hTR exprimuje antimediátor telomerasové RNA složky za transkripční kontroly tetracyklinem regulovaného CMV minimálního promotoru vzhledem k pěti Tet-operátorům proti směru vlákna ve dvou různých orientacích, jak popsáno v odborné literatuře (Gossen a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 89, 5547 (1992).). Plasmid pBBS-hTR exprimu je antimediátor hTR pod kontrolou MPSV promotoru (Lin a spol.: Gene 147. 287 (1994).). Současně byly do HeLa buněk elektroporovány kontrolní expresní vektory, kterým chybí sekvence kódující antimediátorovou hTR. Klony obsahující antimediátorové nebo kontrolní plasmidy byly vybrány ve třech oddělených pokusech. Nejdříve se 41 kultur exprimujících antimediátorovou hTR nechalo růst identicky jako buňky s kontrolním vektorem. Při 23 až 26 populacích zdvojující hladiny (PDL) posttranfekce však 33 z 41 antimediátor exprimujících kultur podlehlo krizi (Tabulka I). Krize buněk těchto kultur se vyznačovala významnou inhibici růstu buněk od 20 do 26 PD, následovalo zkruhovatění a odchlípení buněk z desky během týdne. Ve 28 ze 33 případů, v nichž buňky podlehly krizi, byly pozorovány vzácné (< 1 %) revertované kolonie během tří týdnů po tom, co většina buněk odumřela. Revertované buňky mohou představovat varianty, které unikly před inhibujícím účinkem konstrukce antimediátorové hTR. Na rozdíl od antimediátorových klonů žádná z vektorových kontrolních buněčných linií neměla změny v růstu nebo smrtelnosti při 50 opakováních.
Tabulka I
Antimediátorová hTR vede ke kratší střední TRG a krizi buněk
Byly provedeny tři nezávislé pokusy, při nichž byly HeTe7 buňky (HeLa buňky, které exprimují vysoké hladiny tetracykllnového represorového VP16 chimerního proteinu) transfektovány elektroporací buď plasmidem pl0-3-hTR, který exprimuje antimediátorovou hTR pod kontrolou tetracyklinem VP16 indukovaného CMV minimálního protoru, nebo pBBS-hTR exprimujícím antimediátorovou hTR pod kontrolovou MPSV promotorou (54) [Při těchto pokusech nebyla pozorována žádná regulace tetracyklinem. Pokusy s plO-3-tHR byly typicky prováděny v nepřítomnosti tetracyklinu, protože kontrolní pokusy s luciferasou nebo antimediátorovou hTR pod kontrolou tetracyklinem VP16 indukovaného CMV minimálního protoru ukázaly, že přítomnost nebo nepřítomnost tetracyklinu měla malý vliv na luciferasovou nebo antimediátorovou hTR expresi v HeTe7 buňkách. V časných pokusech s antimediátorovými hTR konstrukcemi v HeTe7 buňkách skutečně tyto buňky ještě podléhaly krizi při 23 až 26 PDL v přítomnosti tetracyklinu.]. Jako kontrola byly buňky HeTe7 transfektovány také rodičovským vektorem za stejných podmínek. Z každé transfektované serie bylo isolováno 11 až 18 stabilních klonů. Klony ze všech isolátů vykazovaly identickou morfologii a růstové profily při 20 PDL, v této době se růst většiny antimediátor exprimu jících klonů značně zpomalil (pl0-3-hTR a pBBS-hTR). Při DL 23 až 26 tyto buňky podlehly krizi, která se vyznačovala prodlouženými a zakulacenými buňkami. Žádný z těchto klonů generovaný z pBBS-hTR transfektovaných HeTe7 buněk však nepodlehl krizi. Osm klonů exprimujících antimediátorovou hTR pokračovalo v růstu podobně jako kontrolní kultury. Buňky ze všech klonů byly isolovány při PDL 23 a byly stanoveny střední TRF délky. Hodnoty P byly vypočteny způsobem nepárového t-testu. V každé sérii je uveden podíl klonů, které podlehly krizi.
plasmid krize buněk střední TRF hodnota P krize/celkem
1 plO-3 ne ND 0/7
pl0-3-hTR ano ND 18/18
2 pl0-3 ne 3,27±0,10 0/12
plO-3-hTR ano 2,72±0,07 0,0003 11/11
3 pBBS ne 3,22±0,ll 0/13
pBBS-hTRa ano 2,39±0,10 0,0008 4/4
pBBS-hTRb ne 3,03±0,20 0,3551 0/8
HeTe7 buňky ne 3,15±0,09 rodičovské
buňky
Pro zjištění toho, jestli telomerní délka a telomerasová inhibice korelují s krizí buněk u klonů exprimujících antimediátor, byla telomerní délka atelomerasová aktivita u několika předkrizových kontrolních a u experimentálních kolonií testována při 23 PDL. Všechny kolonie obsahující kontrolní vektor měly střední TRF délky (3220 a 3270 párů nukleotidů) podobné rodičovské buněčné linii (3150 párů nukleotidů), zatímco klony obsahující antimediátorové vektorové konstrukce, které podlehly krizi, měly střední TRF délky mezi 2390 a 2720 p.n. nebo byly o 17 až 26 % kratší než rodičovské linie (obr. 3). Tato data jsou v souladu s telomerními repeticemi, které byly ztraceny v klonech obsahujících antimediátor díky inhibici telomerasové aktivity. Při přímém testování byla telomerasová aktivita vyhodnocena ve 14 klonech. Telomerasová aktivita byla obecně nízká, ale detegovatelná v mnoha antimediátorových klonech, i když zkrácené telomery ukazovaly, že hladina nebyla dostatečná pro zachování telomerní délky, jelikož střední TRF byla od 3220 do 2390 p.n. (P = 0,0008). V osmi klonech obsahujících antimediátorový vektor (pBBS-hTRb), které nepodlehly krizi, nebyla telomerní délka významně změněna (3030 proti 3330, P = 0,355) a telomerasové aktivita byla podobná jako u kontrol. Shrnuto, tyto výsledky jsou důkazem, že telomerní ztráta vede ke krizi a smrti buněk, jakmile telomery dosáhnou kritické délky.
Indukce krize buněk u buněk HeLa exprimu jících antimediátorovou telomerasovou RNA složku poskytuje další podporu názoru, že telomerní inhibice může poskytovat specifický a efektivní léčivý prostředek proti rakovině u člověka.
Příklad 13
In šitu amplifikace a detekce
In šitu detekce telomerasové RNA
A. Fluorescenční in šitu hybridizace (FISH)
Identifikace na telomerasu positivních buněk ve smíšené populaci buněk nebo tkání se může provádět in šitu hybridizaci značené sondy cílené na RNA složku telomerasy. Tkáň buněčných vzorků upevněná na mikroskopické podložní sklo a dostatečně permabilizovaná se použije pro in šitu hybridizaci. Příklad in šitu hybridizace lidské telomerasové RNA (hTR) spočívá nejdříve v denaturaci nukleových kyselin ponořením sklíček do 70% (hmotn.) deionizovaného formamidu/2x SSC roztoku předem ohřátého na 2 až 3 minuty na 70 až 74 °C. Tato skla se pak přenesou do ledem ochlazeného 70% (hmotn.) ethanolu, potom do 95% a nakonec do 100% ethanolu (4 minuty v každém z těchto roztoků). 100 až 200 ng (na sklíčko) označené htRNA sondy (DNA sonda o kolem 500 p.n. označená biotinem, digoxigeninem, radioisotopem, fluorescenční značkou) se vysuší, resuspenduje v 10 μΐ 100% (hmotn.) deionizovaného formamidu, denaturuje inkubací 8 minut při 75 °C a ihned se ochladí v ledu. Přidá se 10 μΐ 2x hybridizačního pufru (4x SSC, 4x Denhardtův roztok, 20% (hmotn.) dextransulfát, lOOmM Tris, pH 7,5) k 10 μΐ resuspendované sondy. K fixovanému vzorku se přidá sonda/hybridizačni směs (20 μΐ), přeleje se krycí vrstvou a krycí vrstva se uzavře kaučukovým cementem nebo lakem na nehty. Vzorek se inkubuje 8 až 48 h při °C. Po hybridizaci se odstraní krycí vrstva, vzorek se dvakrát promyje 2x SSC/50% (hmotn.) deionizovaným formamidem při °C a potom dvakrát 2x SSC při 37 °C (každé promytí 5 minut).
Vzorek se vizuálně vyhodnotí pod mikroskopem.
B. In šitu označení primární imunizací (PRINS)
Jiným způsobem tradičního způsobu in šitu hybridizační detekce je PRINS. Detekce hTR pomocí PRINS sestává z cDNA syntézy hTR reversní transkriptasou (RT) s následující PRINS detekcí použitím hTR specifické oligonukleotidové sondy a prodloužením řetězce zahrnutím značených nukleotidů. RT reakce hTR se může provést různými způsoby. Jedním příkladem RT reakce je použití sestavy GeneAmp Termostable rTth Reverse Transcriptase RNA PCR kit (Perkin Elmer). Podle tohoto způsobu se 10 μΐ RT směsi (lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 90mM KC1, lmM MnCl2, 200μΜ dNTP, 2,5 jednotek rTth DNA polymerasy, 0,4μΜ zpětný primer [například R7G: 5'-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3']) umístí na fixovaný a permeabilizovaný vzorek, uzavře se krycí vrstvou, zakotví se lakem na nehty, převrství se minerálním olejem a inkubuje se při 70 °C 30 minut. Potom se minerální olej odstraní pětiminutovým promytím v xylenu a pětiminutovým promytím ve 100% ethanolu. Krycí vrstva se odstraní, promyje se krátce DepC vodou, potom 100% ethanolem a suší se 5 minut na vzduchu. Potom se na vzorek umístí 10 μΐ PRINS směsi (5% (obj.) glycerol, lOmM Tris-HCl, pH 0,3, lOOmM KC1, 0,05% (obj.) Tween 20, 0,75mM EGTA, 2,5mM MgCl2, 0,4μΜ ppůvodní primer [např. U3b; 5*-GCCTGGGAGGGGTGG.
.TGGCTATTTTTTG-3'], 200μΜ dA, dG, dCTP, ΙΙΟμΜ dTTP, 90μΜ značený dUTP). Vzorek se potáhne krycí vrstvou, zakotví se lakem na nehty, převrství se minerálním olejem a inkubuje 30 minut až 3 h při 70 °. Vzorek se pak třikrát promyje promývacím pufrem (4x SSC, 0,05% (hmotn.) Tween 20) zahřátým na 70 °C po dobu 2 minut. Potom se pozoruje signál.
C. RT-PCR in šitu
RT-PCR detekce hTR sestává z cDNA syntézy cílové RNA reakcí s reversní transkriptasou (virová reversní transkriptasa nebo vnitřní RT aktivita termostabilních DNA polymeras), následuje in šitu PCR amplifikace cílové cDNA. V této cDNA syntéze hTR lze použít různé RT reakce včetně RT postupu diskutovaného v části 11.B. Stejné pufrovací podmínky a stejné primery použité ve způsobu detekce PRINS lze použít také pro RT-PCR, ale místo konečné inkubace 30 minut až 3 h při 70 °C se vzorek amplifikuje v termocyklovači 30 až 40 cyklů po dobu 40 vteřin při 94 °C a 90 vteřin při 55 °C (viz sekce 11B). Po PCR se vzorek třikrát promyje promývacím pufrem (4x SSC, 0,05% (hmotn.) Tween 20) a zahřeje se 2 minuty na 70 °C. Potom se pozoruje signál.
Jinou možností je amplifikovat cDNA generovanou z původní RT reakce použitím GeneAmp in šitu PCR systém 1000 a sestavy GeneAmp in šitu PCR core kit (Perkin Elmer).
Jeden stupeň in šitu RT-PCT na fixovaném a permeabilizovaném vzorku lze provést postupem GeneAmp EX rTth RNA PCR protocol v kombinaci se systémem GeneAmp in šitu PCR systém 1000 (Perkin Elmer). Tento způsob spočívá v umístění 40 až 50 μΐ EZ RNA PCR pufrovací směsi (50mM Bicine, 115mM octan draselný, 8% (obj.) glycerol, pH 8,2, 300 μΜ dA, dG, dCTP, 165μΜ dTTP, 135μΜ značený dUTP, 5 až 10 j. rTth DNA polymerasy, 2,5mM octan manganatý, 0,45 až ΙμΜ htRNA specifických primerů, např. R7 a U3b) na fixovaný a permeablizovaný vzorek na mikroskopickém podložním sklíčku a uzavření silikonovým těsněním a svorkou podle pokynu výrobce (GeneAmp in šitu PCR systém 1000, Perkin Elmer). Vzorek se pak umístí do zařízení GeneAmp in sítu PCR a zahřívá se 120 vteřin na 94 °C, amplifikuje se 30 až 40 cyklů 45 vteřin/94 °C a 45 vteřin/60 °C. Po amplifikaci se vzorek promyje a zviditelní se jak shora uvedeno.
Pro snížení signálů pozadí, které mohou pocházet z přímého zahrnuti fluorescenčních značek během PCR amplifikace, se může použít nepřímá detekce, která sestává z PCR amplifikace použitím neznačených dNTP následované in šitu hybridizaci použitím značené hybridizační sondy specifické pro amplifikovaný produkt. Takto se signál amplifikuje kterýmkoliv shora popsaným RT-PCR způsobem bez označených dNTP nebo primerů. Amplifikovaný produkt se deteguje in šitu hybridizaci.
D. Amplifikace produktu rozšířeného primerů in šitu PCR
Úspěch in sítu PCR závisí na zabránění odštěpení amplifikovaných produktů v celulárni matrici mimo buňku. Je tedy obvykle pravdou, že PCR produkty menší než 500 p.n. nejsou žádoucí pro in šitu PCR. Aby se zabránilo odštěpení PCR produktů menších než 500 p.n. z buněčné matrice, obvykle se používá inkorporace objemných dNTP (např. biotinem, fluorescenčním označením, digoxigeninem označený dUTP) do PCR produktu. Jiným způsobem, jak předcházet odštěpení malého produktu in šitu PCR, by bylo zahrnutí primerů zvětšujícího produkt do in šitu PCR postupu.
Tento způsob zahrnuje primer, který obsahuje 3 až 4 sekvence repetice o 6 p.n. (např. [57-TTTCCC-37 ]3.4) na 57 konci, následované sekvencí, která je specifická pro cíl (viz obr. 4, primer 1) v kombinaci s příslušným zpětným primerem (primer 2) a třetí primer, který obsahuje pouze sekvencí repetice (primer 3, např. [57-TTTCCC-37]4) pro amplifikování specifického cíle in sítu PCR. Přítomnost primerů 3 prodlouží PCR produkt díky navázání primerů 3 na 37-konec cílového PCR produktu. Prodloužení PCR produktů se může indukovat snížením teploty anelace počátečních PCR podmínek.
Například jestliže teplota anelace cílové sekvence v primeru 1 je 60 °C, vzorek bude nejdříve amplifikován v 15 až 20 cyklech 94 °C/45 °C a 60 °C/45 °C, potom bude amplifikován v 15 až 20 cyklech 94 °C/45 °C a 50 °C/45 °C. Nižší anelační teplota v druhém PCR stupni upřednostní vznik prodloužených PCR produktů zvýšením šance navázání primerů 3 na sekvence repeticí. Vý96 sledně prodloužené PCR produkty budou méně náchylné k odštěpení od celulární matrice, což má za důsledek lepší zachování signálu při in šitu PCR analýze.
Přiklad 14
Telomerasová RNA složka z primátů (nikoliv z člověka)
Pro demonstraci toho, že lze použitím primerů na bázi sekvence lidské RNA složky získat sekvence jiné savčí telomerasové RNA složky, byly primery lidské sekvence PCR použity pro amplif ikování sekvencí telomerasové RNA složky z genomové DNA veverčí opice, druhu, o kterém se předpokládá, že je jedním z druhů primátů (vyjma člověka), který je evolučně nejrozdílnější při srovnání s člověkem.
Genomová DNA z veverčích opic se amplifikuje primery F3b (57-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-37) a H3+20 (57-CTCAAGGTCATCG. .CCAAGGT-37) jak shora popsáno. Byl pozorován jediný DNA pás, který se pak klonuje do vektoru pBluescriptlI SK (Stratagene, San Diego, Ka., USA). Výsledné klony se částečně sekvenují způsobem PCR s reversním universálním primerem (57-AACAGCTATGACC.
.ATG-37), primerem 210-37 (5 7-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-37) nebo primerem H3+20. Částečné sekvence získané telomerasové RNA složky veverčí opice byly:
57-GCCGCGCTTCCCTGAGCTGTGGACGTGCACCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCG CTTTCCTGCTGGTGGGGGGACGCCGATCGTGGCCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGG GGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACTGA-3 7 a
7-TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTAAACGAAAATT CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAAGGTTACAAATTTCTTCTTTGAA AAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA-37.
Jestliže se srovná se sekvencí genu lidské telomerasové RNA složky, použitím konvenčního očíslování genu lidské telomerasové RNA složky (pomlčky znamenají díry zavedené pro optimalizování seřazení sekvence), získá se následující seřazení:
1900
1idská CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC opičí GGCGCGCTTCCCTGAGCTGT-GGACGTGCACC-AGGACTCGGCTC
1950
1idská ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATGGTGCGCA
ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGT-GGGGGGACGCCGATCGTGGCCA
2000
1idská TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT opičí TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACT
2050 lidská GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA opičí GA a
2300
1idská TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA opičí TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTA
2350 lidská AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA opičí AACGAAAATT-CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAA
2400 idksá GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACC-TTGGCGATGA-CCTTGAGC opičí GGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA
Předcházející příklady popisují různé aspekty vynálezu a způsoby přípravy některých nukleových kyselin podle vynálezu. Tyto příklady nejsou zamýšleny jako vyčerpávající popis mnoha různých provedení vynálezu uvedených v následujících nárocích.

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ Ν ο
    ο c/x
    Λ ζ
    1. RNA složka savčí telomerasy v v podstatě čisté formě.
    2. RNA složka savčí teleomerasy, která obsahuje polynukleotid v podstatě identický se sekvencí:
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU
    UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC
    CAGUGUGCU.
    3. RNA složka savčí telomerasy podle nároku 1 se sekvencí
    GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC
    UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC
    UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU
    UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC
    GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC
    UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC
    GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU
    UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC
    GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC
    AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC
    CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC
    CAGUGUGCU.
    4. Oligonukleotid v v podstatě čisté formě obsahující sekvenci identickou nebo přesně doplňkovou s přilehlou sekvencí o délce 10 až 500 nukleotidů RNA složky podle nároku 3.
    5. Oligonukleotid podle nároku 4, kterým je oligodeoxyribonukleotid.
    6. Oligonukleotid podle nároku 4, kterým je oligoribonukleotid.
    7. Oligonukleotid podle nároku 5, který, jestliže je vázán na RNA složku lidské telomerasy, inhibuje nebo blokuje aktivitu telomerasy.
    8. Oligonukleotid podle nároku 5, kterým je plasmid pGRN33.
    9. Oligonukleotid podle nároku 5, kterým je lambda klon 28-1.
    10. Rekombinantní expresní plasmid obsahující oligonukleotid podle nároku 5 a dále obsahující promotor umístěný tak, aby řídil transkripci RNA doplňkové nebo identické sekvence k uvedenému oligonukleotidu.
    11. Rekombinantní expresní plasmid podle nároku 10, který funguje tak, že produkuje oligonukleotid v eukaryotických hostitelských buňkách.
    12. Rekombinantní expresní plasmid podle nároku 11, který funguje tak, že produkuje oligonukleotid v prokaryotických hostitelských buňkách.
    13. Rekombinantní expresní plasmid podle nároku 11, který obsahuje lidský gen RNA složky lidské telomerasy.
    14. Rekombinantní expresní plasmid podle nároku 13, v němž gen obsahuje tuto nukleotidovou sekvenci:
    5'-GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGT ACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTG
    100
    GCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTG ACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTC CAAAGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGT TCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGT ATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTC CCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCA TTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGAT CTAAATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCC AGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACGTTGGCGATGACCTTG AGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT- 3’ .
    7.Způsob výroby vyznačuj 1 rekomb i nantnί m expresni » RNA molekulu, která může eukaryotické hostitelské buňky, c i se t i m, že je transformována plasmidem podle nároku 4, který kóduje asociovat s proteinovými složkami savčí telomerasy, takže se získá telomerasová aktivita schopná přidávat sekvence opakujících se jednotek nukleotidů k telomerům.
    8.Způsob výroby rekombinantního telomerasového enzymu, vyznačující se tím, že zahrnuje transformování buňky eukaryotického hostitele, která exprimuje proteinové složky telomerasy, rekombinantním expresním vektorem, který kóduje RNA složku podle nároku 7, a kultivování host ite1ských buněk transformovaných tímto vektorem za takových podmínek, že tyto proteinové složky a RNA složka jsou exprimovány a sestaveny tak, aby tvořily aktivní telomerasovou molekulu schopnou přidávat sekvence k telomerům chromosomové DNA.
    9.Způsob identifikování kandidátů na telomerasová modulační činidla, vyznačující se tím, že zahrnuje·' provedení heterodimerizace nebo analýzy telomerasové aktivity zahrnující: 1) polynukleotid obsahující polynukleotid v podstatě identický s lidskou telomerasovou RNA složkou a schopný navázání na lidský telomerasový protein,
  2. 2) v podstatě vyčištěný lidský telomerasový protein a 3) činidlo,
    101 stanovení, jestli činidlo inhibuje heterodinerizaci nebo telomerasovou aktivitu lidské telomerasové RNA a lidského telomerasového proteinu, identifikováni činidel, která inhibují heterodineri začni nebo telomerasovou aktivitu jako kandidátů činidel modulujících telomerasu, která Inhibují telomerasovou aktivitu.
    10. Způsob inhibování telomerasové aktivity v lidských buňkách in vitro, vyz načujíc 1 s e t i m, žé se do buněk přenáší exogenni polynukleotid obsahující transkripční jednotku, která má polynukleotidovou sekvenci alespoň 25 po sobě jdoucích nukleotidů a která je v podstatě identická nebo v podstatě doplňková k sekvenci lidské telomerasové RNA odštěpitelně napojené na heterologní transkripční regulační sekvenci, která podporuje transkripci odštěpitelně napojených polynukleotidů v buňkách.
    11. Způsob detegováni přítomnosti neoplastického stavu u pacienta, vyznačující se tím, še obsahuje stupně:
    isolování buněčného vzorku z pacienta, detegování lidské telomerasové RNA složky v buněčném vzorku pro stanovení diagnostické hodnoty, srovnání diagnostické hodnoty se standardní hodnotou exprese 1idské telomerasové RNA složky v ne-neoplastických buňkách stejného typu jako je buněčný vzorek, stanovení diagnosy podle přítomnosti neoplastického stavu a podle diagnostické hodnoty, která je dostatečně větší než standardní hodnota, takže ukazují na přítomnost neoplast i ckého stavu.
    12. Způsob stanovení přítomnosti savčí telomerasové RNA složky v buňce nebo v buněčném vzorku, vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje provedení amplifikace nebo hybridizace s polynukleotidem telomerasové RNA složky, primerem telomerasové RNA složky nebo doplňkovou sekvencí k póly
    102 nukleotidu telomerasové RNA složky nebo primerů telomera sové RNA složky.
CZ9734A 1994-07-07 1995-07-06 Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme CZ3497A3 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27210294A 1994-07-07 1994-07-07
US08/330,123 US5583016A (en) 1994-07-07 1994-10-27 Mammalian telomerase
US08/482,115 US5776679A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Assays for the DNA component of human telomerase
US08/472,802 US5958680A (en) 1994-07-07 1995-06-07 Mammalian telomerase
PCT/US1995/008530 WO1996001835A1 (en) 1994-07-07 1995-07-06 Mammalian telomerase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ3497A3 true CZ3497A3 (en) 1997-10-15

Family

ID=27501040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ9734A CZ3497A3 (en) 1994-07-07 1995-07-06 Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme

Country Status (22)

Country Link
EP (2) EP1293565A3 (cs)
JP (2) JPH10505488A (cs)
KR (1) KR100789741B1 (cs)
CN (1) CN1231491C (cs)
AT (1) ATE308554T1 (cs)
AU (1) AU696702B2 (cs)
BG (1) BG63573B1 (cs)
BR (1) BR9508254A (cs)
CA (1) CA2194393C (cs)
CZ (1) CZ3497A3 (cs)
DE (1) DE69534568T2 (cs)
DK (1) DK0778842T3 (cs)
ES (1) ES2251720T3 (cs)
FI (1) FI970026A7 (cs)
HU (1) HUT78054A (cs)
IS (1) IS4408A (cs)
NO (1) NO970041L (cs)
NZ (1) NZ289720A (cs)
PL (1) PL181019B1 (cs)
RO (1) RO117328B1 (cs)
UA (1) UA47407C2 (cs)
WO (1) WO1996001835A1 (cs)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067497B2 (en) 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US5972605A (en) * 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US6517834B1 (en) 1995-08-04 2003-02-11 Geron Corporation Purified telomerase
US6545133B1 (en) 1995-08-04 2003-04-08 Geron Corporation Methods for purifying telomerase
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5858777A (en) 1995-09-08 1999-01-12 Geron Corporation Methods and reagents for regulating telomere length and telomerase activity
ATE219151T1 (de) 1995-11-16 2002-06-15 Michael W Dahm Verfahren zur quantifizierung von tumorzellen in einer körperflüssigkeit und dazu geeignete testkits
WO1997035967A2 (en) * 1996-03-28 1997-10-02 Cold Spring Harbor Laboratory Transgenic organisms with altered telomerase activity
US6015710A (en) 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
JPH1052300A (ja) * 1996-06-03 1998-02-24 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 細胞内テロメラーゼ活性の測定法
JPH1028600A (ja) * 1996-07-17 1998-02-03 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd テロメラーゼ活性の測定法
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
EP0841396B2 (en) 1996-10-01 2012-04-11 Geron Corporation Human telomerase catalytic subunit
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US5919656A (en) * 1996-11-15 1999-07-06 Amgen Canada Inc. Genes encoding telomerase protein 1
US7390891B1 (en) 1996-11-15 2008-06-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a telomerase component TP2
US5846723A (en) * 1996-12-20 1998-12-08 Geron Corporation Methods for detecting the RNA component of telomerase
JP2001507229A (ja) * 1996-12-20 2001-06-05 ジェロン コーポレイション テロメラーゼのｒｎａ成分を検出および阻害するための方法
WO1998037181A2 (en) * 1997-02-20 1998-08-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Telomerase catalytic subunit gene and encoded protein
WO1998045450A1 (en) * 1997-04-04 1998-10-15 Geron Corporation Purified telomerase
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
CA2294646A1 (en) * 1997-06-20 1998-12-30 Bayer Aktiengesellschaft Human catalytic telomerase sub-unit and its diagnostic and therapeutic use
EP1571215A3 (en) * 1997-07-01 2007-10-31 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
EP0917579A1 (en) 1997-07-01 1999-05-26 Cambia Biosystems LLC Vertebrate telomerase genes and proteins and uses thereof
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
DE19757300A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe
GB9801902D0 (en) 1998-01-29 1998-03-25 Cancer Res Campaign Tech A gene promoter
DE19804372A1 (de) * 1998-02-04 1999-08-05 Michael W Dr Dr Dahm Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit und dazu geeignete Testkits
US7402307B2 (en) 1998-03-31 2008-07-22 Geron Corporation Method for identifying and killing cancer cells
US6358739B1 (en) * 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
AU5466500A (en) * 1999-06-04 2000-12-28 Jessie L.S. Au Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
US6995145B1 (en) 1999-06-04 2006-02-07 Au Jessie L-S Methods and compositions for modulating drug activity through telomere damage
DK1210357T3 (da) 1999-09-10 2008-07-21 Geron Corp Oligonukleotid-N3' -P5' -thiophosphoramidater: syntese og anvendelse deraf
WO2001036971A1 (en) * 1999-11-16 2001-05-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of searching for substance inhibiting binding between telomerase subunits
CA2528483C (en) * 2003-06-23 2012-04-10 Geron Corporation Compositions and methods for increasing telomerase activity
KR101298493B1 (ko) 2003-09-09 2013-08-21 제론 코포레이션 텔로머라제 억제를 위한 변형 올리고뉴클레오티드
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
US8785409B2 (en) 2007-01-30 2014-07-22 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
EP2421955A4 (en) 2009-04-21 2012-10-10 Genetic Technologies Ltd METHODS OF OBTAINING F TAL GENETIC MATERIAL
JP6021018B2 (ja) * 2011-05-30 2016-11-02 国立大学法人豊橋技術科学大学 改良されたオリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物
US20150125438A1 (en) * 2012-07-20 2015-05-07 Sang Jae Kim Anti-Inflammatory Peptides and Composition Comprising the Same
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
ES2657988T3 (es) * 2013-09-13 2018-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Aplicación de moléculas de oligo-dT para evitar la generación de productos de PCR de alta masa molecular inducida por transportador poliA
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
KR101628890B1 (ko) * 2015-09-03 2016-06-09 주식회사 학표벽지 엠보싱 벽지 제조 장치
CN115678904B (zh) * 2021-07-22 2025-12-09 刘小川 一种突变的人端粒酶rna基因及其在预防和治疗泛癌种中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4312686A (en) * 1980-02-11 1982-01-26 American Biltrite Inc. Printed and embossed floor covering and method and apparatus for its manufacture
JPH02179729A (ja) * 1988-12-30 1990-07-12 Shinetsu Kogyo Kk ゲートル巻きするラッピングフィルムの製造法
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
EP0666313A3 (en) * 1994-01-27 1996-03-06 Univ Iowa State Res Found Inc Telomerase as a target in cancer gene therapy.
US5876979A (en) * 1994-07-07 1999-03-02 Cold Spring Harbor Laboratory RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
JPH08294966A (ja) * 1995-04-26 1996-11-12 Nippon Shokubai Co Ltd 樹脂成形品の連続成形方法
JPH10119130A (ja) 1996-10-22 1998-05-12 Japan Steel Works Ltd:The 連続発泡体の製造方法及び装置
KR100815605B1 (ko) * 2002-02-18 2008-03-20 바프렉스 주식회사 공압출 다층필름의 제조방법 및 장치

Also Published As

Publication number Publication date
ATE308554T1 (de) 2005-11-15
HK1011691A1 (en) 1999-07-16
EP0778842B1 (en) 2005-11-02
NO970041D0 (no) 1997-01-06
CN1158617A (zh) 1997-09-03
AU696702B2 (en) 1998-09-17
EP0778842A4 (en) 1999-08-11
KR20050058527A (ko) 2005-06-17
FI970026A0 (fi) 1997-01-03
RO117328B1 (ro) 2002-01-30
AU2964795A (en) 1996-02-09
IS4408A (is) 1997-01-03
NO970041L (no) 1997-03-06
DE69534568T2 (de) 2006-07-27
EP1293565A3 (en) 2004-05-12
PL181019B1 (pl) 2001-05-31
EP0778842A1 (en) 1997-06-18
FI970026L (fi) 1997-03-03
BR9508254A (pt) 1997-12-23
KR100789741B1 (ko) 2008-01-02
JPH10505488A (ja) 1998-06-02
JP4068861B2 (ja) 2008-03-26
JP2002272489A (ja) 2002-09-24
FI970026A7 (fi) 1997-03-03
EP1293565A2 (en) 2003-03-19
BG101103A (bg) 1997-10-31
BG63573B1 (bg) 2002-05-31
DE69534568D1 (de) 2005-12-08
CN1231491C (zh) 2005-12-14
WO1996001835A1 (en) 1996-01-25
CA2194393A1 (en) 1996-01-25
PL318169A1 (en) 1997-05-26
HUT78054A (hu) 1999-07-28
ES2251720T3 (es) 2006-05-01
UA47407C2 (uk) 2002-07-15
NZ289720A (en) 1999-03-29
CA2194393C (en) 2002-06-25
DK0778842T3 (da) 2006-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0778842B1 (en) Mammalian telomerase
US7732402B2 (en) Mammalian telomerase
US6258535B1 (en) Mammalian telomerase
US5876979A (en) RNA component of mouse, rat, Chinese hamster and bovine telomerase
KR100530483B1 (ko) 인간의 텔로머라제 촉매성 서브유닛
JP2002508937A (ja) Ａｕｒ１および／またはａｕｒ２関連疾患の診断および治療
US5776679A (en) Assays for the DNA component of human telomerase
AU714540B2 (en) Mammalian telomerase
US6013468A (en) RNA component of telomerase
KR100566766B1 (ko) 포유류텔로머라제
HK1011691B (en) Mammalian telomerase

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic