CZ369999A3 - Substituované fenylderiváty, jejich příprava a použití - Google Patents

Substituované fenylderiváty, jejich příprava a použití Download PDF

Info

Publication number
CZ369999A3
CZ369999A3 CZ19993699A CZ369999A CZ369999A3 CZ 369999 A3 CZ369999 A3 CZ 369999A3 CZ 19993699 A CZ19993699 A CZ 19993699A CZ 369999 A CZ369999 A CZ 369999A CZ 369999 A3 CZ369999 A3 CZ 369999A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
propargyl
pai
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
aminoindan
Prior art date
Application number
CZ19993699A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295822B6 (cs
Inventor
Palle Christophersen
Ove Pedersen
Original Assignee
Neurosearch A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neurosearch A/S filed Critical Neurosearch A/S
Publication of CZ369999A3 publication Critical patent/CZ369999A3/cs
Publication of CZ295822B6 publication Critical patent/CZ295822B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/28—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C275/42—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/45—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/53—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C233/55—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by a carbon atom of a six-membered aromatic ring having the carbon atom of the carboxamide group bound to a carbon atom of an unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/40—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C271/58—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C275/00—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C275/28—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C275/40—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C309/00—Sulfonic acids; Halides, esters, or anhydrides thereof
    • C07C309/01—Sulfonic acids
    • C07C309/28—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C309/45—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton
    • C07C309/51—Sulfonic acids having sulfo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton containing nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the carbon skeleton at least one of the nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/08—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/21—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/45—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the singly-bound nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. N-acylaminosulfonamides
    • C07C311/47—Y being a hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/50—Compounds containing any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom
    • C07C311/52—Y being a hetero atom
    • C07C311/54—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea
    • C07C311/57—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea having sulfur atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/60—Y being a hetero atom either X or Y, but not both, being nitrogen atoms, e.g. N-sulfonylurea having sulfur atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having nitrogen atoms of the sulfonylurea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C335/00—Thioureas, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C335/04—Derivatives of thiourea
    • C07C335/16—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C335/22—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká oblasti selektivních nevratných inhibitorů enzymu, známého jako monoaminoxidáza (dále jen MAO), a konkrétně se týká R( + ) enantiomeru N-propargyl-1aminoindanu (zde rovněž označovaného jako PAI), který je nevratným inhibitorem B-formy monoaminoxidázového enzymu (dále jen MAO-B). Vynález se rovněž týká farmaceutických kompozic obsahujících R( + )PAI, které jsou použitelné zejména při léčení Parkinsonovy choroby, poruch paměti, demence, deprese, hyperaktivniho syndromu, afekce, neurodegenerativních chorob, neurotoxických poranění, mrtvice, mozkové ischemie, traumatického poranění ' hlavy, traumatického poranění míchy, neurotraumatu, schizofrenie, poruchy pozornosti, sklerózy multiplex a abstinenčních příznaků.
Dosavadní stav techniky
Parkinsonova choroba je obecně' považována za následek degradace pre-synaptických dopaminergických neuronů v mozku s následným snížením uvolňovaného množství neurotransmiterového dopaminu. Neodpovídající uvolnění dopaminu tedy způsobuje poruchy kontroly svalů ovladatelné vůlí, které jsou příznačné pro Parkinsonovu chorobu.
01-2762-97 Če
V současnosti již existuje celá řada způsobů léčeni Parkinsonovy choroby jejichž použití je rozšířené, například včetně podávání L-DOPA společně s dekarboxylázovým inhibitorem, například L-carbidopou nebo benserazidem. Dekarboxylázový inhibitor chrání molekulu L-DOPA před periferní dekarboxylací a tak zajišťuje, že L-DOPA je spotřebován zbývajícími dopaminergickými neurony ve striatiu mozku. L-DOPA se konvertuje na dopamin, v důsledku čehož dojde ke zvýšení hladin dopaminu v těchto neuronech. V odezvě na fyziologické impulzy jsou tyto neurony schopny uvolňovat větší množství dopaminu při koncentracích, které odpovídají normálně potřebným hladinám. L-DOPA léčení tedy zmírňuje příznaky nemoci a přispívá ke zlepšení stavu pacienta.
Nicméně· L-DOPA léčení má své nedostatky. Hlavním nedostatkem je to, že jeho účinnost je optimální pouze během prvních několika let léčení. Po tomto období se klinická odezva snižuje a je doprovázena nežádoucími vedlejšími účinky, mezi které patří například dyskineze, fluktuace účinnosti v průběhu dne („on-off efekt) a psychiatrické příznaky, například konfúzní stavy, paranoia a halucinace. Toto snížení účinku L-DOPA léčení je ---------—--------připisováno- ce“lé—řadě—faktorů - včetně’—přirozené'‘progrese------nemoci, alterace dopaminových receptorů v důsledku dopaminové produkce nebo zvýšení hladin dopaminových metabolitů, a farmakokinetických problémů s L-DOPA absorpcí (přehled Youdim a kol., Progress in Medicinal Chemistry, 21, 138-167(1984)).
Pro překonání nedostatků L-DOPA léčení byla navržena celá řada léčení, u kterých se- L-DOPA kombinuje s MAO inhibitory, které pomáhají redukovat metabolický zlom nově
01-2762-97 Če vytvořeného dopaminu (viz například Chiese, P., patent
US 4,826,875, udělený 2. května 1989).
MAC existuje ve dvou formách známých jako MAO-A a MAO-B, které jsou selektivní pro různé substráty a inhibitory. Například MAO-B účinněji metabolizuje substráty, jakým je například 2-fenylethylamin, a je selektivně a nevratně inhibován (-)-deprenylem, který bude popsán níže.
Nicméně je třeba uvést, že léčení kombinující L-DOPA s inhibitorem jak MAO-A tak MAO-B je nežádoucí, protože způsobuje nežádoucí vedlejší účinky, týkající se zvýšené hladiny katecholaminů v průběhu neuraxie. Kromě toho je rovněž nežádoucí kompletní inhibice MAO,. protože zesiluje účinek sympatomimetických aminů, například tyraminu, což vede k tak zvanému „sýrovému efektu (přehled Youdim a kol., Handbook of Experimental Pharmacology, vyd. Trendelenburg a Weiner, Springer-Verlag, 90, kap. 3 (1988)). Jak se ukázalo, MAO-B představuje převládající formu MAO v mozku. Dá se tedy předpokládat, že selektivní inhibitory pro tuto formu budou představovat možné nástroje pro snižovaní dopaminového rozkladu na jedné straně a na druhé straně prostředek pro minimalizaci systemických ÚČihku~CěTkové ‘'MAO“inhibice; — - ,
Mnohé inhibitory MAO představují chirálni molekuly. I když jeden enantiomer často vykazuje, pokud jde o relativní potenci vůči MAO-A a MAO-B, určitou stereoselektivitu, není daná enantiomerní konfigurace, pokud jde o diskriminaci mezi MAO-A a MAO-B, vždy selektivnější než jeho zrcadlově převrácený isomer.
01-2762-97 Če
Tabulka I uvádí IC50 (mmol/1) enantiomerních párů propargylaminů při preparaci MAO v mozku krysy. Tyto výsledky ukazují na malé rozdíly v potenci při MAO-B inhibici mezi R a S enantiomery. (B. Hazelhoff a kol., Naunyn-Schmeideberg's Arch. Pharmacol., 330, 50 (1985). Oba enantiomery jsou selektivní pro MAO-B. Ve zprávě, kterou zveřejnil Magyar a kol. (1967), se uvádí, že R-(-)-deprenyl je 500krát účinnější než S-(+) enantiomer, pokud, jde o inhibici oxidační deaminace tyraminu homogenátem mozku krysy. (K. Magyar a kol., Act. Physiol. Acad. Sci., Hung., 32, 377 (1967)).
V homogenitu krysích jater je R-deprenyl pouze patnáctkrát účinnější než S enantiomer. Výsledky dalších testů farmakologické aktivity, například testu určujícího inhibici tyraminové spotřeby, ukázaly diferenční stereoselektivitu. S forma je v určitých případech účinnějším epimerem. (J. Knoll a K. Magyar, Advances in Biochemical Psychopharmacology, 5, 393 (1972)).
N-methyl-N-propargyl-l-aminotetralin (2-MPAT) je blízkým strukturním analogem deprenylu. Absolutní stereochemie 2-MPAT doposud nebyla určena. Nicméně (+) isomer je selektivní pro MAO-B a (-) isomer je selektivní pro' MAO-A. Rozdir’v-urcinnoStd-’mev * * menší než pětinásobek. (B. Hazelhoff a kol·., tamtéž). Enantiomery N-propargyl-l-aminotetralinu (1-PAT) mají rovněž podobnou aktivitu. Nedostatkem dat v tabulce I je to, že ukazují pouze poměr struktura-aktivita mezi izolovanými ( + ) nebo (-) -2-MPAT a tato data neumožňují předpovědět jeho absolutní stereochemii.
Na základě extenzívního počítačového modelingu Polymeropoulos nedávno předpověděl, že (R)-N-methyl-N01-2762-97 Če
propargyl-l-aminoindan (R-l-MPAI) bude jako MAO-B inhibitor účinnější než (S) forma. (E. Polymeroupoulos, Inhibitors of Monoamine Oxidase B, I. Szelenyi, vyd. Birkhauser Verlag, str. 110 (1993)). Nicméně popsané experimenty ukázaly, že R-l-MPAI je nejen o něco účinnějším inhibitorem MAO-B než S-l-MPAI, ale že je dokonce účinnějším inhibitorem MAO-A. Jak selektivita mezi MAO-A a -B tak relativní účinnost R a S epimerů jsou nízké. V rozporu s očekáváními, vyplývajícími ze známého stavu techniky, je 1-MPAI použitelný jako farmaceutické činidlo.
Níže uvedené údaje ukazují, že vysokou selektivitu pro
MAO jednoho enantiomeru oproti druhému enantiomeru nelze předpovědět. Struktura MAO aktivních míst není natolik známá, aby umožnila předpovědět relativní účinnost nebo selektivitu libovolné dané sloučeniny nebo páru jejích enantiomeru.
Mozková mrtvice zaujímá, pokud jde o počet úmrtí, v zemích s rozvinutou ekonomikou třetí'místo. Osoby, které mozkovou mrtvici přežijí, často trpí neurologickou a motorickou nezpůsobilostí. Většina CNS mrtvic je považována za lokalizovanou tkáňovou anemii, k níž dochází v důsledku neprůchodnosti arteriálního krevního řečiště, která je příčinou vzniku “ďěf ícltu kyslíku a'gluk&zy“.-·Okluze “střední cerebrální arterie u krys (MCAO) je běžným experimentálním postupem, kterým se simuluje mrtvice u lidí. Předpokládá se, že neurologická léze, způsobená proximální okluzí této arterie'u krysy, odpovídá fokálnímu cerebrálnímu infarktu u lidí (Yamori a kol., 1976). Tato shoda se zakládá na podobnostech mezi kraniálním oběhem těchto dvou druhů. Další zvířecí modely mrtvice popsal Stefanovich (1983).
01-2762-97 Ce
Histologické změny, -popsané Tamurou a kol. (1981), který první zavedl MCAO postup, byly zpravidla patrné v kůře frontální (100%), senzimotorické (75%) a sluchové (75%) oblasti a v menší míře v kůře okcipitálního laloku (25%). Kromě toho bylo poškození pozorováno v laterálním segmentu ocasatého jádra (100%) a pouze v proměnlivé míře v jeho mediální části (38%). U MCAO živočichů byla současně zaznamenána následující onemocnění: neurologické deficity (Menzies a kol·., 1992), poruchy vědomí (Yamamoto a kol., 1988), mozkový edém (Young a kol., 1993; Matsui a kol., 1993; Saur a kol., 1993), snížení cerebrálního proudění krve (Teasdale a kol., 1983) a fluktuace katecholaminu (Cechetto a kol·., 1989). Kterékoliv z těchto onemocnění by mohlo indikovat závažnost a rozsah poškození mozku, které následuje po MCAO u krys. Na základě výše uvedeného je možné účinnou látku, s potenciálem omezit nebo zcela zlikvidovat dané onemocnění, považovat za kandidáta pro léčení mrtvice u lidí.
01-2762-97 Če
Tabulka TA
IC50 (mmol/1) DATA PRO INHIBICI PROPARGYLAMINŮ MAO V MOZKU KRYSY
SLOUČENINA REF EPIMER INHIBICE RELATIVNÍ SCHOPNOST
A B A/B +/-
A B
+ 140 16 8, 8
2-MPAI a 3 0, 2
* 46 88 0,5
R/S
s 3600 16 120
DEPRENYL a 80 2, 6
R 450 6 75
Ξ 70 . 50 1/4
1-MPAI b 23 5
R 3 10 0,3 .
s 3800 50 76
1-PAT c 4 0,5
R 900 90 10
a. B. Hazelhoff a kol., Naunyn-Schmeideberg's Arch. Pharmacol., 330, 50 (1985)
b. Evropská patentová přihláška 436,492 A2, publikovaná 10. června 1991
c. autoři vynálezu
Selektivní MAO-B inhibitor, (-) deprenyl, byl podrobněji studován a použit jako MAO-B inhibitor pro posíleni L-DOPA léčení. Léčení pomocí (-)-deprenylu je zpravidla příznivé a nezpůsobuje při dávkách, které
01-2762-97 Ce : : i : · ’·: '· ,·· »; «· ··· ·· ·· způsobuji v podstatě úplnou inhibici MAO-B, tak zvaný „sýrový efekt. (Elsworth a kol., Psychopharmacology, 57, 33 (1978)). Kromě toho přidání (-)-deprenylu do kombinace L-DOPA a dekarboxylázového inhibitoru, podaného pacientům trpícím Parkinsonovou chorobou, vede k určitým zlepšením, pokud jde o akinezi a celkovou funkční kapacitu, a rovněž se tím eliminují fluktuace „on-off typu (přehled Birkmayer & Riederer v „Parkinson's Disease, Springer-Verlag, str. 138-149 (1983)). (-)-Deprenyl tedy (a) zvyšuje a prodlužuje účinek L-DOPA a (b) nezvyšuje nežádoucí účinky L-DOPA léčení.
Nicméně ani samotný (~)-deprenyl není bez vlastních nežádoucích vedlejších účinků. Mezi tyto nežádoucí vedlejší účinky patří například existující žaludeční vředy a případné hypertenzní příhody. Kromě toho je (-)-deprenyl amfetaminovým derivátem a je metabolizován na amfetamin a metamfetaminy, což jsou látky, které mohou způsobovat nežádoucí vedlejší účinky, například zvýšenou srdeční rychlost (Simpson, Biochemical Pharmacology, 27, 1951 (1978); Finberg a kol. v „Monoamine Oxidase Inhibitors The State of the Art, Youdim a Paykel, ed. Willey, str. 31-43 (1981)).
-” Byly popsány i~'dalši sloučeniny' které ’' představují selektivní nevratné inhibitory MAO-B ale které jsou prosté nežádoucích účinků spojovaných s (-)-deprenylem. Jedna taková sloučenina, konkrétně N-propagyl-1-aminoíndan.HCl (racemický PAI.HC1), je popsána v GB 1,003,686 a GB 1,037,014 a v patentu US 3,513,244, uděleném 19. května 1970. Racemický PAI.HCl· je účinným selektivním nevratným inhibitorem MAO-B, nemetabolizuje se na amfetaminy a nezvyšuje nežádoucí sympatomimetické účinky.
01-2762-97 Če
Při srovnávacích testech na zvířatech se ukázalo, že racemický PAI má mnoho výhod oproti (-)-deprenylu. Racemický PAI například nezpůsobuje podstatnější tachykardii, nezvyšuje krevní tlak (účinky, k nimž dochází při dávkách (-)-deprenylu 5 mg/kg) a při dávkách nižších nebo rovných 5 mg/kg nezpůsobuje kontrakci mžurky nebo zvýšeni srdeční rychlosti (což jsou vedlejší účinky (-)-deprenylu, podávaného v dávkách vyšších než 0,5 .mg/kg). Kromě toho racemický PAI.HC1 nezesiluje kardiovaskulární účinky tyraminu (Finberg a kol. v „Enzymes a Neurotransmitters in Mental Disease, str. 205-219 (1980), Usdin a koi., ed. Wiley, New York; Finberg a koi. (1981) v „Monoamine Oxidase Inhibitors - The State of the Art, tamtéž; Finberg and Youdim, British Journal Pharmacol., 85, 451 (1985)).
Jedním z cílů vynálezu bylo separovat racemické PAI sloučeniny a získat enantiomer s MAO-B inhibiční aktivitou, která by byla prostá veškerých nežádoucích vedlejších účinků, spojovaných s druhým enantiomerem.
Vzhledem k tomu, že deprenyl má podobnou strukturu jako PAI a vzhledem k tomu, že je známo, že (-)-enantiomer deprenylu, tj. (-)-deprenyl, je farmaceuticky podstatně “účinnější n é ž ”'(+) - éňánťio měr, ”'' da 1by ~ še o čekávat, ~žě (-)-enantiomer PAI bude účinnějším MAO-B inhibitorem.
Nicméně v rozporu s tímto očekáváním se po rezoluci enantiomerů ukázalo, že (+)-PAI enantiomer je ve skutečnosti aktivním MAO-B inhibitorem, zatímco (-)-enantiomer vykazuje extrémně nízkou MAO-B inhibiční aktivitu. Kromě toho má (+)-PAI enantiomer rovněž překvapivě vyšší stupeň selektivity pro MAO-B inhibici než jeho odpovídající racemická forma a při léčení označených chorob by tedy měl
01-2762-97 Če způsobovat méně nežádoucích vedlejších účinků než racemická směs. K těmto zjištěním se dospělo pomocí in vitro a in vivo experimentů, které budou podrobněji popsány níže.
Následně se ukázalo, že (+)-PAI má R absolutní konfiguraci. Vzhledem k očekávané strukturní podobnosti (+)-PAI analogie mezi deprenylem a amfetaminy bylo toto zjištění rovněž překvapivé.
Za povšimnutí rovněž stojí vysoký stupeň stereoselektivity farmakologické aktivity mezi R(+)-PAI a S(-) enantiomerem, který bude diskutován níže. R(+)-PAI je při MAO-B inhibici téměř o čtyři řády aktivnější než S(-) enantiomer. Tento poměr je podstatně vyšší než poměr pozorovaný mezi dvěma deprenylovými enantiomery (Knoll a Magyar, Adv. Biochem. Psychopharmacol., 5, 393 (1972); Magyar a kol., Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 32, 377 (1967)). Kromě toho při určitých fyziologických testech se zjistilo, že (+)-deprenyl má stejnou nebo vyšší aktivitu než (-) enantiomer (Tekes a kol., Pol. J. Pharmacol. Pharm., 40, 653 (1988)).
MPAI je schopnějším inhibitorem MAO aktivity, ale s nižší selektivitou pro MAO-B než MAO-A (Tipon' a kol., Biochem. Pharmacol·., _31,1250___(1982)) . To, že při. pozorováni MPAI byl překvapivě zjištěn nízký stupeň diference v relativních aktivitách dvou rozlišených enantiomerů, ještě dále zvýraznilo chování R(+)PAI (viz tabulka 1B).
Vynález rovněž poskytuje způsoby použití samotného farmaceuticky účinného PAI-enantiomerů (bez L-DOPA) při léčení Parkinsonovy choroby, poruch paměti, demence, deprese, hyperaktivního syndromu, afekce, neuro01-2762-97 Če
degenerativních chorob, neurotoxických poranění, mrtvice, mozkové ischemie, traumatického poraněni hlavy, traumatického poranění míchy, neurotraumatu, schizofrenie, poruch pozornosti, sklerózy multiplex a abstinenčních příznaků (viz přehled Youdim a kol., Handbook of Experimental Pharmacology, Trendelenburg a Weiner, Springer-Verlag, vyd. 90/1, kap. 3 (1988)).
Vynález dále poskytuje způsob použití samotného farmaceuticky účinného PAI-enantiomeru pro léčení Parkinsonovy choroby. Vynález rovněž poskytuje farmaceutické kompozice obsahující R( + )PAI a synergická činidla, například Levodopu. Použití těchto činidel se studovalo s ohledem na (-)-deprenyl, který, jak se ukázalo, byl účinný, pokud se podával samotný pacientům v raném stadiu Parkinsonovy choroby a měl synergický účinek u pacientů, pokud se podával společně s a-tokoferolem, derivátem vitaminu E (Parkinson's Study Group, New England J. Med., 321(20), 1364-1371 (1989)).
Kromě své využitelnosti při léčení Parkinsonovy choroby se rovněž ukázalo, že (-)-deprenyl je užitečný při léčení pacientů trpících demencí Alzheimerova typu (DAT) (Tariot a kol., Psychopharmacology, 91, 489-495 (1987)) a při ” lecenr deprese' (Mendelewicž a/'^Ydudim/ Brit 7'' J? Psychiat. 142, 508-511 (1983)). Ukázalo se, že R( + )PAI sloučenina podle vynálezu, a zejména její mesylátová sůl, obnovují paměť. R(+)PAI má tedy potenciál pro léčení poruch paměti, demence, zejména Alzheimerova typu, a hyperaktivního syndromu u dětí.
Cílem vynálezu je rovněž poskytnutí vysoce stabilních solí R(+)PAI s vynikajícími farmaceutickými vlastnostmi. Mesylátová sůl je zvláště stabilní, vykazuje neočekávaně
01-2762-97 Ce větší selektivitu a vykazuje podstatně méně vedlejších účinků než vykazují odpovídající racemické soli.
Podstata vynálezu
Vynález tady poskytuje R(+)-N-propargyl-l-aminoindan mající strukturu:
NH—CH~—C=CH
Vynález rovněž poskytuje farmaceuticky přijatelnou sůl R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
Vynález dále poskytuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje terapeuticky účinné množství R(+)-N-propargyl-1amínoíndanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu, trpícího Parkinsonovou chorobou, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení Parkinsonovy choroby, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále popisuje způsob léčení subjektu trpícího poruchou paměti, který spočívá v podání množství R(+)-N01-2762-97 Če propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení poruchy paměti subjektu, danému subj ektu.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího demencí, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-1aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení demence, subjektu trpícímu touto chorobou. U jednoho provedení se demencí rozumí demence Alzheimerova typu (DAT).
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího depresí, který zahrnuje podání množství R( + )-N-propargyl-1aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení deprese, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího hyperaktivním syndromem, který zahrnuje podání množství R( + ) -N-propargyl-1-aminoind.anu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení hyperaktivního syndromu, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího afektivní nemocí, který zahrnuje· podání množství R(+)-Npřopargyl-l-aminoinďanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení afektivní nemoci, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího neurodegenerativní nemocí, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení neurodegenerativní nemoci, subjektu trpícímu touto chorobou.
01-2762-97 Če
Vynález dále poskytuje způsob léčeni subjektu trpícího neurotoxickým poškozením, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení neurotoxického poškozeni, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího mozkovou ischemií, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení mozkové ischemie, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího traumatickým poškozením hlavy, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení traumatického poškození hlavy, subjektu trpícímu tímto poškozením.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího traumatickým poškozením míchy, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení traumatického poškození míchy, subjektu trpícímu tímto poškozením.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího schizofrenií, který zahrnuje podání množství r(+)-npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení schizofrenie, subjektu trpícímu t out o cho robou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího ochabnutím pozornosti, který zahrnuje podání množství R( + )01-2762-97 Če
N-propargyl 1 aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení ochabnuti pozornosti, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího sklerózou multiplex, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení sklerózy multiplex, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob prevence nervových poruch u subjektu, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro prevenci nervového poškození, subjektu..
Vynález dále poskytuje způsob léčení drogově závislého subjektu trpícího abstinenčními příznaky, který zahrnuje podání množství R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení abstinenčních příznaků, subjektu trpícímu těmito příznaky.
Vynález dále poskytuje způsob přípravy r(+)-npropargyl-l-aminoindanu, který zahrnuje uvedení R( —) — aminoindanu v přítomnosti organické nebo anorganické báze do kontaktu s propargylbromidem nebo propargylchloridem za vzniku Ř( + )-Ň-propargyl-í-aminoindanu a izolaci takto vzniklého R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy racemického N-propargyl-l-aminoindanu, který zahrnuje uvedeni racemického 1-aminoindanu v přítomnosti organické nebo anorganické báze do kontaktu s propargylbromidem nebo propargylchloridem za vzniku racemického N-propargyl-101-2762-97 Ce aminoindanu a izolaci takto vzniklého racemického N-propargyl-l-aminoindanu.
Cílem vynálezu je konečně způsob přípravy R(+)-Npropárgyl-l-aminoindanové soli, který zahrnuje uvedení racemického N-propargyl-l-aminoindanu do styku s opticky aktivní kyselinou za vzniku dvou diastereomerních N-propargyl-l-aminoindanových solí a izolaci R(+)-N~ propargyl-l-aminoindanové soli z takto vzniklých diastereomerních N-propargyl-l-aminoindanových solí.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 22, který se zaměřuje na stanovení MAO-A inhibiční aktivity in vitro.
Obr. 2 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 22, který se zaměřuje na stanovení MAO-B inhibiční aktivity in vitro.
Obr. 3 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 22, který se zaměřuje na stanovení MAO aktivity v lidské kortikální tkáni.
Obr. 4 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (i.p.) MAO-A v mozku.
Obr. 5 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (i.p.) MAO-B v mozku.
01-2762-97 če í Γ * ί i Ϊ ' ί *·« ♦ »« *·· ·· ··
Obr. 6 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v přikladu 23, který analyzuje akutní inhibici (i.p.) MAO-A v játrech.
Obr. 7 graficky znázorňuje.výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (i.p.) MAO-B v játrech.
Obr. 8 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (per os) MAO-A v mozku.
Obr. 9 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (per os) MAO-B v mozku.
Obr. 10 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 23, který analyzuje akutní inhibici (per os) MAO-A v játrech.
Obr. 11 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v přikladu 23, který analyzuje akutní inhibici (per os) MAO-B v játrech.
Obr. 12 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 24, který analyzuje chronickou inhibici MAO-A v 'mozku! — — - · —
Obr. 13 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 24, který analyzuje chronickou inhibici MAO-B v mozku.
Obr. 14 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 24, který analyzuje chronickou inhibici MAO-A v j átrech.
01-2762-97 Če
Obr. 15 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 24, který analyzuje chronickou inhibici MAO-B v játrech.
Obr. 16 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 25, který analyzuje MAO-B aktivitu v krysím mozku jako časovou funkci po i.p. podání R(+)PAI.
Obr. 17 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 32, které ukazují obnovu normokineze u myší, kterým byl podán haloperidol v dávce 6 mg/kg s.c. Všem myším byly podány testované účinné látky i.p. v naznačených dávkách. O 2 hodiny později jim byl aplikován haloperidol. Kinetické výsledky se odečetly 3 hodiny po podání haloperidolu. Tyto výsledky odpovídají schopnosti pohybovat se horizontálně podél tyče, schopnosti slézt vertikálně tyč obličejem dolů a zkrácení katalepsie. Při absenci haloperidolu bylo maximálně dosaženo výsledku 12, zatímco při použití samotného haloperidolu se dosáhlo výsledku 6,6 + 0,03. Statistická hodnota se vypočetla podle Studentova „t testu: * p < 0,05; ** < 0,01; *** p < 0,001, vztaženo k hodnotám získaným při aplikaci samotného haloperidolu. Výsledky (R)-PAI se značně liší od výsledků dosažených při aplikaci racemického PAI v dávce 5 mg/kg (p<0,05), 10 mg/kg ._._(.p.<0-,-01-)— -a~ 15—mg-/-k-g- (p<0-, 0-5j—(^=-5-6j-r—Uveden’á”dávka“j e~’ počítána pro volnou bázi PAI (a nikoliv pro mesylátovou sůl) .
Obr. 18 graficky znázorňuje výsledky testu prováděného v příkladu 32, které ukazují obnovu motorické aktivity u myší ošetřených α-methyl-p-tyrosinem při 100 mg/kg i.p. Krysám se aplikovala testovaná látka i.p. v naznačených dávkách. 0 dvě hodiny později jim byl aplikován α-Mpt a
01-2762-97 Če bezprostředně po jeho aplikaci se myši umístily do klecí. Celková motorická aktivita se zaznamenávala v průběhu deseti hodin. Kontrolní krysy, ošetřené fyziologickým roztokem, dosahovaly výsledku 15 862+1424. Při aplikaci samotného α-MpT dosahovaly myši výsledku 8 108+810. Statistická hodnota se vypočetla podle Studentova „t testu: * p < 0,05; ** < 0,01; *** p < 0,001, vztaženo k hodnotám získaným při aplikaci samotného α-MpT. Výsledky (R)-PAI se značně liší od výsledků dosažených při aplikaci racemického PAI v dávce 2 mg/kg (p<0,01) (n=6). Uvedená dávka je počítána pro volnou bázi PAI a nikoliv pro mesylátovou sůl.
Obr. 19 graficky znázorňuje NADH odezvu na dvouminutovou anoxii, měřenou 30 minut po úrazu a následně v půlhodinových intervalech.
Obr. 20 graficky znázorňuje hodnocení ischemické mozkové léze pomocí měřícího přístroje MRI T2-scan 48 hodin po ošetření krys MCA-0 a [R](+)PAI mesylátem. Střední cerebrální arterie se chirurgicky uzavřela způsobem popsaným v příkladu 38. [R](+)PAI mesylát se podával následujícím způsobem: 1,0 mg/kg ip bezprostředně po chirurgickém zákroku; 0,5 mg/kg ip dvě hodiny po *ch i r ur gí ckém— zákr o ku-;·· *1“ ,0 mg/’k g' i p 2'4' hodi ň~ p“o~ cKírú rgíc kém ~ zákroku. Rozsah infarktu (mm3) se určil pomocí MRI 48 hodin po zákroku.
Obr. 21 graficky znázorňuje neurologické hodnocení krys Wistar, které se podrobily léčení MCA-0 a [R](+)PAI mesylátem. Střední cerebrální arterie se chirurgicky uzavřela a [R](+)PAI mesylát se podával způsobem popsaným v souvislosti s obrázkem 20. 24 hodin po chirurgickém zákroku
01-2762-97 Če se způsobem popsaným v příkladu 38 získaly neurologické výsledky.
Vynález tedy poskytuje R(+)-N-propargyl-l-aminoindan obecného vzorce:
C=CH
Jak demonstrují níže uvedené experimentální příklady, R( + )PAI je téměř 7 OOOkrát účinnější v roli inhibitoru MAO-B než S(-)PAI. Z pohledu známých MAO-B inhibitorů, které vykazují nízkou seliktívitu mezi MAO-A a MAO-B a které nevykazují předpokládané trendy, pokud jde o účinnost jako funkci R a S konfigurace, je selektivita R(+)PAI neočekávaná.
R(+)PAI lze získat optickou rezolucí racemíckých směsí R- a '“Š^^ahtiomeřů ” PAÍ. Tuto ~řěžolučí lze ’řěal'ízovát libovolnou běžnou rezoluční metodou, která je odborníkům v daném oboru známa, například metodu, kterou popsal J. Jacques, A. Collet a S. Wilen v „Enantiomers, Racemates and Resolutions, Wiley, New York (1981). Rezoluci lze provádět například preparativní chromatografíí na chirální koloně. Dalším příkladem vhodné rezoluční metody je příprava diastereomerních solí s chirální kyselinou, například kyselinou vinnou, kyselinou maleinovou, kyselinou
01-2762-97 Ce mandlovou nebo N-acetylovými deriváty aminokyselin, například N-acetylleucinem, a následnou rekrystalizací, jejímž cílem je izolace diastereomerní soli požadovaného R enantiomeru.
Racemickou směs R a S enantiomeru PAI lze připravit například způsobem popsaným v GB 1,003,676 a GB 1,037,014. Racemickou směs PAI lze rovněž připravit uvedením 1-chloroindanu do reakce s propargylaminem. Alternativně lze tento racemát připravit uvedením propargylaminu do reakce s 1-indanonem za vzniku odpovídajícího iminu a následnou redukcí C=N dvojné vazby iminu vhodným činidlem, například borohydridem sodným.
R enantiomer PAI lze podle vynálezu rovněž připravit přímo z opticky aktivního R enantiomeru 1-aminoindanu reakcí s propargylbromidem nebo propargylchloridem v přítomnosti organické nebo anorganické báze a případně v přítomnosti vhodného rozpouštědla.
Vhodnou organickou nebo anorganickou bází pro výše zmíněnou reakci může být například triethylamin, pyridin, uhličitany alkalických kovů a hydrogenuhličitany. Pokud se reakce provádí v přítomnosti rozpouštědla, potom by se toto rozpouštědlo mělo zvolit například z toluenu, methylenu, chloridu a acetonitrilu. Jedním způsobem přípravy R(+)PAI je uvedení R-l-aminoindanu do reakce, s propargylchloridem za použití hydrogenuhličitanu draselného jako báze a acetonitrilu jako rozpouštědla.
Výše popsaná reakce 1-aminoindanu zpravidla poskytuje směs nezreagovaného primárního aminu, požadovaného sekundárního aminu a terciálního aminu Ν,Ν-bispropargylamino-produktu. Požadovaný sekundární amin, tj.
01-2762-97 Če
N-propargyl-l-aminoindan, lze ze získané směsi separovat běžnou separační metodou, například pomocí chromatografie, destilace a selektivní extrakce.
R-l-aminoindanový výchozí materiál lze připravit v oboru známými způsoby, které zahrnují například způsob popsaný Lawsonem a Raoem, Biochemistry, 19, 2133 (1980), způsoby citované v dokumentech, které jsou jmenovány v kapitole „Dosavadní stav techniky a způsob popsaný v Evropském patentu č. 234,590.
R-l-aminoindan lze rovněž připravit rezolucí racemické směsi R a S enantiomerů, která zahrnuje například přípravu diastereomerních solí s chirálními kyselinami nebo některou další známou metodou, například metodou, kterou popsal J. Jacques a kol., tamtéž. Alternativně lze R-l-aminoindan připravit uvedením 1-indanonu do reakce s opticky aktivním aminem a následnou redukcí dvojné vazby mezi uhlíkem a dusíkem ve výsledném iminu hydrogenací nad vhodným katalyzátorem, například nad paládiem na uhlíku, oxidem platiny nebo Raneyovým niklem. Vhodné opticky aktivní aminy zahrnují například jeden ze dvou antipodů fenethylaminu nebo ester aminokyseliny, například valinu nebo fenylalaninu. Benzylickou N-C vazbu lze následně rozštěpit —-hydrogenací za-·-nebou-řl-iv-ýeh-p©dmí-ne-k-.------------------——-----------.
Dalším způsobem přípravy R-l-aminoindanu je hydrogenace výše popsaných indan-l-onoximetherů, ve kterých alkylová část etheru obsahuje opticky čistý chirální střed. Alternativně lze nechirální deriváty indan-l-onu obsahující dvojnou vazbu mezi uhlíkem a dusíkem, například imin nebo oxim, redukovat chirálním redukčním činidlem, např. komplexem tetrahydridohlinitanu lithného a efedrinu.
01-2762-97 Če
Předmětem vynálezu je dále poskytnout farmaceuticky přijatelnou sůl R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu.
Farmaceuticky přijatelná sůl podle vynálezu například zahrnuje mesylát, maleinát, fumarát, vinan, hydrochlorid, hydrobromid, esylát, p-toluensulfonát, benzoát, acetát, fosfát a sulfátové soli.
U jednoho provedení se sůl zvolila ze skupiny .tvořené mesylátovou solí R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu, esylátovou solí R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu a sulfátovou sůl R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu.
Jak demonstrují níže uvedené experimentální příklady, mesylátová sůl je vysoce stabilní vůči tepelné degradaci a vykazuje oproti racemické směsi neočekávaně dobrou selektivitu pro MAO-B.
Pro přípravu farmaceuticky přijatelných kyselinových adičních solí sloučeniny R( + )PAI lze uvést volnou bázi konvenčními metodami do reakce s požadovanými kyselinami v přítomnosti vhodného rozpouštědla. Podobně lze kyselinovou adiční sůl převést známými postupy na volnou bazickou formu.
__________Výhodný_ způsob přípravy^_ mesylátové formy (R) -PAI zahrnuje: (a) adici vodného roztoku 15% hydroxidu sodného do roztoku propargylbenzensulfonátu (nebo tosylátu nebo mesylátu) v toluenu; (b) míchání po dobu 5 hodin; (c) přidání dalšího toluenu a vody; (d) separování a promytí organické fáze 10% hydroxidem sodným a následné naředění vodou; (e) nastavení pH hodnoty směsi ha 3,2 přidáním 10% vodného roztoku kyseliny sírové; (f) separování vodné fáze a nastavení pH na 7,3 10% vodným roztokem hydroxidu
01-2762-97 Če
sodného; (g) trojí extrahování toluenem za udržování konstantní pH hodnoty; (h) zahuštění sloučených organických vrstev ve vakuu za vzniku žlutého oleje; (i) rozpuštění oleje a kyseliny L-vinné v isopropanolu; (j) zahřátí na refluxní teplotu a udržování při této teplotě po dobu jedné hodiny; (k) ochlazení na pokojovou teplotu a izolace sraženiny filtrací; (1) rekrystalizace surového dipropargylaminoindanvinanu ze směsi methanolu a isopropanolu (1:1) za vzniku di(R(+)-N-propargyl-l-aminoindan)vinanu; (m) rozpuštění vinanu a methansulfonové kyseliny v isopropanolu - a třicetiminutové ohřívání při refluxní teplotě; a (n) ochlazení na pokojovou· teplotu a sebrání vysráženého R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu.
Vynález dále poskytuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje terapeuticky účinné množství R(+)-N-propargyl-1aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelný nosič. „Terapeuticky účinné množství R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli lze určit běžnými postupy,' které jsou odborníkům v daném oboru známy.
Pro uvedené kompozice lze například použít následující soli. Hydrochlorid, fosfát, maleinát, fumarát, vinan, - mesylát··,—es-ylát- a--sulfátové-soli—.----------------———.—-..........—Tyto kompozice lze připravit jako léčiva určená pro orální, parenterální, rektální nebo transdermální podání.
U jednoho provedení je farmaceuticky přijatelným nosičem pevná látka a farmaceutická kompozice má formu tablet. Terapeuticky účinným množstvím může být množství pohybující se přibližně od 0,1 mg do 100 mg. Farmaceuticky
01-2762-97 Če účinným množstvím může být rovněž přibližně 1 mg až 10 mg účinné látky.
Vhodnými formami pro orální podání jsou například tablety, lisované nebo potažené pilulky, dražé, oplatky, tvrdé a měkké želatinové kapsle, podjazykové tablety, sirupy a suspenze.
U alternativního provedení je farmaceuticky přijatelným nosičem kapalina a farmaceutická kompozice má formu injektovatelného roztoku. Terapeuticky účinným množstvím může být množství pohybující se přibližně od 0,1 mg/ml do 100 mg/ml. Terapeuticky účinným množstvím může být rovněž přibližně 1 mg/ml až 10 mg/ml mg účinné látky. U jednoho provedení je podanou dávkou množství pohybující se v rozmezí od 0,5 ml do 1,0 ml.
U dalšího alternativního provedení je nosičem gel a farmaceutická kompozice má formu čípku.
Pro parenterální podání vynález poskytuje ampule nebo lahvičky, které obsahují vodný nebo bezvodý roztok nebo emulzi. Farmaceutická kompozice podle vynálezu, určená pro rektální podání, má formu čípků s hydrofilním nebo hydrofobním vehikulem. Pro topickou aplikaci je určena ~fářmaceútická' formulace 'podle'' vynálezů, “ktéřa“ ’’má’'““formu mastí a transdermálni dopravu zajišťují vhodné dopravní systémy, které jsou v daném oboru známy.
U výhodného provedení je farmaceuticky přijatelnou solí mesylátová sůl.
Tyto kompozice lze pro léčení výše jmenovaných chorob použít samotné nebo alternativně, jako v případě
01-2762-97 Če i
Parkinsonovy choroby, mohou být použity například přídavný prostředek při konvenčních L-DOPA terapiích.
Výhodné dávky účinné zmíněných kompozicích leží složky,
R-PAI, ve v následujících rozmezích. V j ako3 výše
případě orálních formulací nebo čípků lze denně brát 0,1 do 100 mg účinné látky na dávkovou jednotku a výhodně 1 až 10 mg na dávkovou jednotku denně. V případě injektovatelných formulací 0,1 až 100 mg/ml na dávkovou jednotku denně a výhodně 1 až 10 mg/ml na dávkovou jednotku
denně.
U jednoho provedení farmaceutická kompozice dále zahrnuje terapeuticky účinné množství Levodopy. U dalšího provedení farmaceutická kompozice dále zahrnuje účinné * množství dekarboxylázového inhibitoru.
Množstvím dekarboxylázového inhibitoru, podaného v kombinaci s (R)-PAI nebo jeho farmaceuticky přijatelnou solí, je množství účinné pro zajištění spotřeby L-DOPA subjektem.
Dekarboxylovým inhibitorem může být L-Carbidopa. U jednoho provedení je terapeuticky účinným množstvím R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu přibližně 0,1 mg až 100 mg, těrapěut'íčky “úČiňlaým'''mňo žs tvím'' Lěvódopý ’ přibTi zne'~5 0~mg~až 250 mg a účinné množství L-Carbidopy je přibližně 10 mg až 25 mg.
Dekarboxylázovým inhibitorem může být rovněž benserazid. U jednoho provedení, je terapeuticky účinným množstvím R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu přibližně 0,1 mg až 100 mg, terapeuticky účinným množstvím Levodopy je
01-2762-97 Če ϊ/γ * :„· J.* ..· ..· přibližně 50 mg až 200 mg a účinným množstvím benserazidu je přibližně 12,5 mg až 50 mg.
Předmětem vynálezu je dále způsob léčení subjektu trpícího Parkinsonovou chorobou, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení Parkinsonovy choroby, subjektu trpícímu touto chorobou.
Způsoby léčení Parkinsonovy choroby, jejichž podstatou je kombinace použití (R)-PAI s dalšími účinnými látkami, například dopaminovými agonizujícími činidly, bromokryptinem, pergolidem, lisuridem, a do rozsahu vynálezu spadají rovněž katecholaminoxidázo.methyltransferázové inhibitory.
U výhodného provedeni je farmaceuticky přijatelnou solí mesylátová sůl.
Podání může zahrnovat orální podání, rektální podáni, transdermální podání nebo parenterální podání.
U jednoho provedení způsob podle vynálezu dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství Levodopy subjektu. U dalšího provedení způsob podle vynálezu dále . zahrnu j_e.____..podání^ ^.účinného_ _,.mnpžs„tví „_ de_karboxy_l_ázgvého_. inhibitoru subjektu.
Dekarboxylázovým inhibitorem může být L-Carbidopa. Alternativně může být dekarboxylázovým inhibitorem benserazid.
Vynález dále popisuje způsob léčení subjektu trpícího poruchou paměti, který spočívá v podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné
01-2762-97 Ce · t * ./ soli, účinného pro léčení poruchy paměti subjektu, danémúH^^^^^H subjektu.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího W demencí, který zahrnuje podání množství R( + )-N-propargyl-1-1· aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli,;
účinného pro léčení demence, subjektu trpícímu touto chorobou. U jednoho provedení se demencí rozumí demence Alzheimerova typu (DAT).J ' 'í
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího depresí, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-laminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení deprese, subjektu trpícímu touto :z.
chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího hyperaktivním syndromem, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení hyperaktivního syndromu, subjektu trpícímu touto chorobou.
Toto podání může zahrnovat orální podání, rektální podání nebo parenterální podání.
-.....—Vynález- dále poskytuje -způsob léčení-sub j-ektu -trpícího— -------------afektivní nemocí, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení afektivní nemoci, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího neurodegenerativní nemocí, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky •I s . · ; : .
01-2762-97 Ce * ‘T * : > ./ ·,* * ·· ··· *· přijatelné soli, účinného pro léčení neurodegenerativni nemoci, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího neurotoxickým poškozením, který zahrnuje podání množství R (+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení neurotoxického poškození, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího· mozkovou ischemií, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu.nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení mozkové ischemie, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález poskytuje způsob léčení mozkové ischemie nebo mrtvice u subjektu, který zahrnuje podání určitého množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení mozkové íscheníie nebo mrtvice, subjektu trpícímu touto chorobou.
U jednoho provedení způsobu léčení mozkové ischemie nebo mrtvice se farmaceuticky přijatelná sůl zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou solí; ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a hydrochloridovou solí. Výhodně je farmaceuticky přijatelnou solí mesylátová sůl' R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu.
‘Účinné množství lze určit za použití technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy, například titrace. U jednoho provedení vynálezu se účinné množství pohybuje přibližně v rozmezí od 0,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu do 2,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu. R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho
01-2762-97 Če
farmaceuticky přijatelná sůl se podává za použití technik známých odborníkům v daném oboru. Může být například podáván intravenózně, orálně, rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
Subjektem je výhodně savec, například pes, kočka, myš, krysa, králík, prase, kůň, koza, ovce, kráva nebo opice. U výhodného provedení je subjektem člověk.
U jednoho provedení podle' vynálezu se účinné množství pohybuje přibližně od 0,01 mg do 50,0 mg na den. U zvláště výhodného provedení se účinné množství pohybuje od 0,1 do
10,0 mg na den.
U jednoho provedení výše popsaného způsobu se rozsah mozkové ischemie redukuje přibližně o 35 %.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího traumatickým poškozením hlavy, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení traumatického poškození hlavy, subjektu trpícímu tímto poškozením.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího ' traumati ckým—p o š ko z ení m -míchy-,—který - - zahrnuj e..... •podáni množství R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení traumatického poškození míchy, subjektu trpícímu tímto poškozením.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího nervovým traumatem, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné
01-2762-97 Če ΐ Η* * : * ’? 1?
soli, účinného pro léčení nervového traumatu, subjektu trpícímu tímto poškozením.
Při léčení traumatického poškození hlavy, traumatického poškození míchy nebo nervového traumatu se farmaceuticky přijatelná sůl R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou solí;
ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a hydrochloridovou solí. Výhodně je farmaceuticky přijatelnou solí mesylátová sůl R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
Účinné množství lze určit za použití technik, které jsou odborníkům v daném oboru známy, například titrace. U jednoho provedení vynálezu se účinné množství pohybuje přibližně v rozmezí od 0,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu do 2,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu. R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se podává za použití technik známých odborníkům v daném oboru. Může být například podáván intravenózně, orálně, rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
Subjektem je výhodně savec, například pes, kočka, myš, krysa, králík, prase, kůň, koza, ovce, kráva nebo opice. U yýhodného_provedení.. je....s.ubj.ekt.em.,.člověk..______......______ __________
U jednoho provedení podle vynálezu se účinné množství pohybuje přibližně od 0,01 mg do 50,0 mg na den. U zvláště výhodného provedení se účinné množství pohybuje od 0,1 do 10,0 mg na den.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího schizofrenií, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné
01-2762-97 Ce t soli, účinného pro léčení schizofrenie, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího ochabnutím pozornosti, který zahrnuje podání množství R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení ochabnutí pozornosti, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále poskytuje způsob léčení subjektu trpícího sklerózou multiplex, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení sklerózy multiplex, subjektu trpícímu touto chorobou.
Vynález dále · poskytuje způsob prevence nervových poruch u subjektu, který zahrnuje podání množství R(+)-Npropargyl-l-amínoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro prevenci nervového poškození, subjektu..
U jednoho provedení je nervovým poškozením poškození struktury nervů. U dalšího provedení je poškozením struktury nervů poškození očních nervů.
Vynález dále poskytuje způsob léčení drogově závislého .subj.ekt.u._na_návykové...látce. trpícího abstinenčními příznaky, který zahrnuje podání množství R(+)-N-propargyl-laminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, účinného pro léčení abstinenčních příznaků, subjektu trpících těmito příznaky.
Výraz „abstinenční' příznaky, jak je zde použit, označuje fyzické a/nebo psychické příznaky včetně neodolatelné touhy po droze, deprese, podráždění, anergie,
01-2762-97 Če
amotivace, změny chuti, nespavosti, třesu a nepravidelného spánku.
Výraz „návyková látka, jak je zde použit, zahrnuje například (a) návykové opiáty, například opium, heroin a morfin, (b) psychostimulační látky, například kokain, amfetaminy a metamfetaminy, (c) alkohol, (d) nikotin, (e) barbituráty a (f) narkotika, například fentanyl, kodein, difenoxylát a thebain.
U jednoho provedení je návykovou látkou kokain, U dalšího provedení je návykovou látkou alkohol.
Vynález dále poskytuje způsob přípravy R(+)-Npropargyl-l-aminoindanu, který zahrnuje uvedení R(-)-aminoindanu v přítomnosti organické nebo anorganické báze do kontaktu s propargylbromidem nebo propargylchloridem za vzniku R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu a izolaci takto vzniklého R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy racemického N-propargyl-l-aminoindanu, který zahrnuje uvedení racemického 1-aminoindanu v přítomnosti organické nebo anorganické báze do kontaktu s propargylbromidem nebo propargylchloridem za vzniku racemického N-propargyl-laminoindanu a izolaci takto vzniklého racemického Npropargyl-l-aminoindanu.
Cílem vynálezu je konečně způsob přípravy R(+)-Npropargyl-l-aminoindanové soli, který zahrnuje uvedení racemického N-propargyl-l-aminoindanu do styku s opticky aktivní kyselinou za vzniku dvou diastereomerních N-propargyl-l-aminoindanových solí a izolaci R(+)-N01-2762-97 Če propargyl-l-aminoindanové soli takto diastereomerních N-propargyl-l-aminoindanových vzniklých solí.
U jednoho provedení izolace zahrnuje izolaci frakční krystalizací·
Následující příklady provedení vynálezu mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Racemický N-propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Do 75 ml acetonitrilu se přidalo 10,0 g racemického 1-aminoindanu a 10,4 g uhličitanu draselného. Výsledná suspenze se ohřála na 60°C a do takto ohřáté suspenze se po kapkách přidalo 4,5 g propargylchloridu.
Směs se míchala při 60eC 16 hodin, načež se většina těkavých podílů odstranila destilací ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi 10% vodný roztok hydroxidu sodného a methylenchlorid.
Organická fáze se vysušila a rozpouštědlo se odstranilo destilací. Zbytek se čistil mžikovou chromatografií na silikagelu, přičemž jako eluční činidlo se použila směs 40% etylacetátu a 60% hexanu. Frakce, obsahující titulní sloučeninu ve formě volné báze, se sloučily a eluční činidlo se nahradilo etherem. Etherický
01-2762-97 Če roztok se ošetřil plynným chlorovodíkem, vzniklá sraženina se izolovala vakuovou filtrací, rekrystalizovala z isopropanolu a poskytla výtěžek 7,3 g titulní sloučeniny, t.t. 182-4°C.
Následující chromatografická a spektroskopická data odpovídala datům uvedeným v patentu US 3,513,244, uděleném 19. května 1970, a autentickému vzorku: NMR δ (CDC13) : 2,45 (2H, m), 2,60 (1H, t), 2,90 (1H, m) , 3,45 (1H, m), 3,70 (2H, d), 4,95 (1H, t), 7,5 (4H, m) ppm.
Příklad 2
S-(-)-N-Propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Titulní sloučenina ve formě volné báze se izolovala štěpením racemické směsi volné báze z příkladu 1 na Chiracel OJ (celulóza tris [p-methylbenzoát]) preparativním HPLC sloupci eluováním pomocí eluční směsi 10% isopropanolu a 90% hexanu a odebráním frakce s prvním výrazným pikem. Výsledný olej se převedl na titulní sloučeninu (hydrochlorid) ošetřením 10% diethyletherového roztoku oleje plynným chlorovodíkem a izolováním vzniklé sraženiny — vakuovou-··'fi-1 ťrací-.—[-a-] ď“—29^2~Η1%—ethanol) , t. ť - 182-184 eC. Další chromatografické a spektroskopické vlastnosti byly identické s vlastnostmi hydrochloridové soli z příkladu 1.
01-2762-97 Če
Příklad 3
R-(+)-N-Propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Titulní sloučenina se připravila způsobem popsaným ve výše uvedeném příkladu 2 s tou výjimkou, že se z preparativní HPLC kolony odebrala frakce, vykazující druhý pík: [a]D+29,1°(0,8%, ethanol), t.t. 179-181°C. Další chromatografické a spektroskopické vlastnosti byly identické s vlastnostmi hydrochloridové soli z příkladu 1.
Příklad 4
R- (+)-N-Propargyl-1-aminoindan hydrochlorid
Do 95 ml acetonitrílu se přidalo 12,4 g R-(-)-laminoindanu a 12,9 g uhličitanu draselného. Výsledná suspenze se ohřála na 60°C a do takto ohřáté suspenze se po kapkách přidalo 5, 6 g propargylchloridu. Směs se 16 hodin míchala při 60 °C, načež se většina těkavých podílů odstranila destilací ve vakuu. Zbytek se rozdělil mezi 10% vodný roztok hydroxidu sodného a methylenchlorid.
__________Organic ká____fáze se vysuš i 1a ., a_ rozpoušt ědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek se čistil mžikovou chromatografií na silikagelu, přičemž jako eluční činidlo se použila směs· 40% etylacetátu a 60% hexanu. Frakce, obsahující titulní sloučeninu ve formě volné báze, se sloučily a eluční činidlo se nahradilo etherem. Etherický roztok se ošetřil plynným chlorovodíkem, vzniklá sraženina se izolovala vakuovou filtrací, rekrystalizovala z isopropanolu a poskytla výtěžek 6,8 g titulní sloučeniny,
01-2762-97 Če
t.t. 183-185°C, [a]D+30,90 (2% ethanol). Spektrální vlastnosti byly identické se spektrálními vlastnostmi zveřejněnými pro sloučeninu z příkladu 1.
Přiklad 5
S-(-)-N-Propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Titulní sloučenina se připravila způsobem popsaným ve výše uvedeném příkladu 4 s tou výjimkou, že jako výchozí materiál se použil S-(+)-1-aminoindan. Produkt vykazoval [a]D-30,3 (2%, ethanol), t.t. 183-5°C. Spektrální vlastnosti byly identické s vlastnostmi zveřejněnými pro sloučeninu z příkladu 1.
Přiklad 6A
Di(R-(+)-N-propargyl-l-aminoindan) L-vinan
Do roztoku kyseliny vinné (4,4 g) ve 48 ml vroucího methanolu se přidal roztok R-(+)-N-propargyl-1aminoindanové volné báze (5,0 g) v methanolu (48 ml). Roztok se ohříval pod zpětným chladičem a v průběhu dvaceti minut se přidalo 284 ml t-butylmethyleheru. Směs se ohřívala dalších 30 minut, ochladila, vzniklá sraženina se izolovala vakuovou filtrací a poskytla výtěžek 6,7 g titulní sloučeniny: t.t. 175-177°C;
[a]D (1/5, H2O) = +34,3;
analýza vypočtena pro CaeHazOgNa;
C Η N
68,26 6,56 5, 69
01-2762-97 Če
nalezeno: C Η N
68,76 6,57 5, 61
Přiklad 6B
R-(+)-N-Propargyl-l-aminoindan mesylát
a) Do roztoku propargylbenzensulfonátu (78,4 g) a racemického aminoindanu (63,2 g) v toluenu (240 ml) se při 20°C po kapkách přidal vodný roztok 15% hydroxidu sodného (108 ml) . Po pěti hodinách následného míchání se za stálého míchání přidal toluen (80 ml) a voda (200 ml) . Organická fáze se separovala a promyla 10% vodným roztokem hydroxidu sodného a naředila vodou. Hodnota pH směsi se pomocí 10% vodného roztoku kyseliny sírové nastavila na 3,2. Vodná fáze se separovala, její pH se nastavila na 7,3 pomocí 10% hydroxidu sodného a třikrát se extrahovala toluenem za udržování konstantního pH. Sloučené organické vrstvy se zahustily ve vakuu a poskytly 40,7 g žlutého oleje.
b) Výše uvedený surový racemický propargylaminoindan a kyselina L-vinná (10 g) se rozpustily v isopropanolu (1 1) a ohřívaly pod zpětným chladičem 1 hodinu. Reakční směs se následně, za stálého míchání, ochladila na pokojovou teplotu a sraženina se izolovala filtrací. Surový di(propargylaminoindan)vinan se rekrystalizoval z 11 1:1 methanolu a isopropanolu a poskytl di(R-(+)-N-propargyl-1aminoindan)-L-vinan s fyzikálními a spektrálními vlastnostmi, které byly identické s odpovídajícími vlastnostmi sloučeniny z příkladu 6A.
. . . . · * * · ,· 01-2762-97 Če ΐ ‘T * Í í I?
··· · · ♦ ··· · ·
c) Roztok di-(R-( + )-N-propargyl-l-aminoindan)vinanu (15 g) a kyseliny methansulfonové (6 g) v isopropanolu (150 ml) se ohřívala pod zpětným chladičem 30 minut. Reakce se následně ochladila na pokojovou teplotu a výsledná sraženina se izolovala vakuovou filtrací a poskytla titulní sloučeninu (11,1 g), t.t. 157°C a [a]D=22°.
Příklad 7
R-(+)-N-Methyl-N-propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Volná báze tvořená R-(+)-N-propargyl-l-aminoindanem z příkladu 4 (1,2 g), uhličitanem draselným (0,79 gj, (0,97 g) a methyl jodidem (1 g) se přidala do 15 ml acetonu a výsledná suspenze se ohřívala 8 hodin při refluxní teplotě pod dusíkovou atmosférou. Potom se za sníženého tlaku odstranily těkavé podíly a zbytek se rozdělil me,zi 10% vodný roztok hydroxidu sodného (30 ml) a methylenchlorid (30 ml). Organická fáze se vysušila a rozpouštědlo odstranilo ve vakuu. Zbytek se čistil mžikovou chromatografií na silikagelu, přičemž jako eluční činidlo se použila směs 40% ethylacetátu a 60% hexanu. Frakce, obsahujrící_titulní sloučeninu*_ve- “f ormě'_vciné“bá'ze~se“ sloučily a eluční činidlo se nahradilo diethyletherem. Etherický roztok se ošetřil plynným HC1. Těkavé podíly se odstranily ve vakuu a zbytek, po rekrystalizaci z isopropanolu, poskytl 400 mg titulní sloučeniny ve formě bílé krystalické pevné látky, t.t. 134-136°C, [a]D+31,40 (ethanol). NMR δ (CDC13) : 2,55 (2H, m) , 2,7 (1H, široké s), 2,8 (3H, 3), 3,0 (1H, m), 3,4 (1H, m), 3,9 (2H, široké s), 5,05 (1H, m), 7,7 (4H, m) ppm.
01-2762-97 Če
Příklad 8
S-(-)-N-Methyl-N-propargyl-l-aminoindan hydrochlorid
Jako výchozí materiál se použil S-(—)—N—propargyl-1aminoindan (volná báze) z příkladu 5 a titulní sloučenina z výše popsaného příkladu 7. Všechny fyzikální a spektrální vlastnosti titulní sloučeniny byly identické s odpovídajícími vlastnostmi sloučeniny z příkladu 7 s výjimkou [a]D-34,9°C (ethanol).
Příklad 9
Tabletová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid Předželatinovaný škrob NF
Vodný roztok laktózy NF
Mikrokrystalická celulóza NF
Škrobglykolát sodný NF
Mastek USP
Stearát hořecnatý NF
7,81 mg*
47,0 mg
66, 0 mg
20, 0 mg
2,99 mg • 1,5 mg
0,7 mg —*_.JSkvi valent ní_množs.tví—do~ 5,-0-mg--N--p-roparg-y-l·ami-no-inda-nové báze
01-2762-97 Če
Příklad 10
Tabletová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid 1,56 mg*
Vodný roztok laktózy 50,omg
Předželatinovaný škrob 36,0mg
Mikrokrystalická celulóza 14,0mg
Škrobglykolát sodný 2,14 mg
Mastek USPi
Stearát hořečnatý NE 0,5mg * Ekvivalent do.1,0 mg N-propargylaminoindanové báze
Příklad 11
Kapslová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid Předželatinovaný škrob Škrob 5, 0 mg 10,0 mg 44,0 mg
Mikrokrystalická celulóza Ethylcelulóza 25,0 mg 1,0 mg
Mas'te'k ~ ' r~ ' ΐ, 5 mg
Čištěná voda se přidala podle potřeb granulace.
01-2762-97 Če J 'T ’ Í · ί * ··· * ·· ·♦· ·· ··
Příklad 12
Injektovatelná kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid 5,0 mg
Vodný roztok dextrózy 44,0 mg
HCL, přidávaná do dosažení pH 5
Kompozice se doplnila do 1 ml čištěnou vodou.
Příklad 13
Injektovatelná kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid 1,0 mg
Chlorid sodný HCL, přidávaná 8, 9 mg do dosažení pH 5
Kompozice se doplnila do 1 ml čištěnou vodou.
Příklad 14
Injektovatelná kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid 2,0 mg
Chlorid sodný 8,9 mg
HCL, přidávaná do dosažení pH 5
Kompozice se doplnila do 1 ml čištěnou vodou.
01-2762-97 Če
Příklad 15
Sirupová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid 5,0 mg
Sacharóza 2 250,0 mg
Sacharin sodný 5/0mg
Methylparaben . 6/0 mg
Propylparaben 1,0mg
Ochucovadlo 20,0mg
Glycerin USP 500 mg
95%. Alkohol USP 200 mg
Kompozice se doplnila do 5,0 ml čištěnou vodou.
Příklad 16
Podjazykové tablety
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid
Mikrokrystalická celulóza
Vodný roztok laktózy
Předželatinovaný škrob Providon ’ · —. — Barvící činidlo
Ochucovadlo
Sladidlo
Mastek 2,5 mg
20,0 mg
5, 0 mg 3,0 mg ' 0, U mg dle potřeby dle potřeby dle potřeby 0,3 mg
Směs masťových základů a účinné látky a granulátu s ethanolovým roztokem Providonu, Po vysušení a zvážení se smísila s mastkem a lisovala.
01-2762-97 Če
Příklad 17
PAI podjazykové tablety
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid Mikrokrystalická celulóza Předželatinovaný škrob Ethylcelulóza 5,0 mg 15,0 mg 12, 0 mg 0,3 mg
Mastek 0,3 mg
Čištěná voda se přidá podle potřeby granulace.
Příklad 18
Tabletová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan hydrochlorid Levodopa Carbidopa 5,0 mg 100,0 mg 25,0 mg
Předželatinovaný škrob 24,0 mg
Škrob' 40,0 mg
Mikrokrystalická celulóza 4 9,5 mg
Barvivo Col. D .& C žluť No. 10 0,5 mg
Barvivo Col. D & C žluť No. 6 0,02 mg
Alkohol USP se přidal podle potřeby granulace.
01-2762-97 Če
Příklad 19
Tabletová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan mesylát 7,81 mg*
Předželatinovaný škrob NF 47,0mg
Vodný roztok laktózy NF 66,0
Mikrokrystalická celulóza NF 20,0mg
Škrobglykolát sodný NF 2,99 mg
Mastek USPi □ •l f my
Stearát hořečnatý NF 0,7 mg * Ekvivalent do 5,0 mg N-propargylaminoindanové báze
Příklad 2Ó
Tabletová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan mesylát 1,56 mg*
Vodný roztok laktózy 50,0mg
Předželatinovaný škrob 36,0mg
Mikrokrystalická celulóza 14,0mg
Škrobglykolát sodný 2,14 mg 'Ma'stek~USP -———— ------------ ’----------------‘„ — x f v my
Stearát hořečnatý NF 0,5 mg * Ekvivalent do 1,0 mg N-propargylaminoindanové báze mesylát 5,0 mg
10,0 mg 44,0 mg
25,0 mg 1,0 mg 1,5 mg podle potřeb granulace.
01-2762-97 Če
Přiklad 21
Kapslová kompozice
N-Propargyl-1-(R)-aminoindan Předželatinovaný škrob Škrob
Mikrokrystalická celulóza Ethylcelulóza Mastek
Čištěná voda se přidala
Následující příklady, doprovodné tabulky a obrázky se týkají biologických experimentů, prováděných podle vynálezu.
Příklad 22
Inhibice MAO aktivity in vitro .Experimentální protokol
Zdrojem MAO enzymu byl homogenát krysího mozku v 0,3M — s acharóz-y,—-který—se- odstřeďoval··· při“600’ g^po^dobu^lS’' miniitT’ Supernatant se naředil na přibližně 0,05M fosfátového pufru a pre-inkuboval postupnými zředěními sloučenin: R(+)-PAI, S(-)-PAI a racemické PAI; 20 minut při 37°C. Potom se přidaly “C-značené substráty (2-fenylethylamin, dále jen PEA; 5-hydroxytryptamin, dále jen 5-HT) a v inknihaří se pokračovalo dalších 20 minut (PEA) nebo 30 až 4 5 minut (5-HT). Použité koncentráty substrátů tvořily 50 μΜ (PEA) a 1 mM (5-HT). V případě PEA se koncentrace enzymu zvolila
01-2762-97 Če tak, aby se během reakce nespotřebovalo více než 10 % substrátu. Reakce se potom zastavila přidáním tranylcyprominu (do konečné koncentrace 1 mM) a inkubát se odfiltroval pres malou kolonu Amberlite CG—50, pufrovanou na pH 6,3. Kolona se promyla 1,5 ml vody, eluáty se odebraly a radioaktivní obsah se určil kapalinovou scintilační spektrometrií. Vzhledem k tomu, že aminové substráty zůstaly v plném rozsahu zachyceny v .koloně, radioaktivita v eluátu stanovila produkci neutrálních a kyselinových metabolitú vzniklých v důsledku MAC aktivity. Aktivita MAO ve vzorku se vyjádřila jako procento kontrolní aktivity za nepřítomnosti inhibitorů, po odečtení příslušných kontrolních hodnot. Aktivita, stanovená za použití PEA jako substrátu, se označila jako MAO-B a aktivita, stanovená za použití 5-HT jako substrátu, se označila jako MAO-A.
Výsledky
Inhibiční aktivita R(+)-PAI, S(-)-PAI a racemického PAI se stanovila odděleně in vitro a výsledky typických experimentálních běhů jsou znázorněny na obrázku 1 a 2. C e 1 .Ý _ ^Per^ent _ s θ zo p a kova 1 r „třikrát. Kon.c_ent.rac e. inhibitoru, produkující 50% inhibici metabolizmu substrátu (IC-50), které se vypočetly z inhibičních křivek, jsou uvedeny v tabulce 1B. Z těchto výsledků je patrné, že:
a) R(+)-PAI je dvakrát aktivnější než racemát v případ inhibice MAO-B;
b) aktivita R(+)-PAI pro MAO-B představuje pouze 1/6 800 aktivity pro MAO-A;
01-2762-97 Če ' ··;· * í j J ’ i · *·« ·· ··· ·· ··
c) aktivita S(-)-PAI představuje pouze 1/6 800 aktivity R(+)PAI v případě inhibice MAO-B, přičemž S(-)-PAI vykazuje malou nebo žádnou selektivitu mezi MAO-B a MAO-A.
Tabulka 1A
IC-50 (nM) HODNOTY PRO INHIBICI MAO-A A MAO-B RACEMICKÝM PAI A JEHO R(+) A S(-) ENANTIOMERY V HOMOGENÁTU KRYSÍHO MOZKU IN VITRO
IC-50 (NM)
MAO-A MAO-B
S(-)PAI R(+)PAI Rac S (-) PAI R( + ) PAI Rac
26000 73 ' 140 17000 2,5 5
Výsledky stejných experimentů, při kterých se však použil R( + ) a S(-)MPAI (N-methyl-N-propargyl-l-aminoindan) jsou zaznamenány v tabulce 1B. Každý z enantíomerů MPAI je méně selektivní pokud jde o MAO-A a MAO-B inhibicí než R( + )PAI. Kromě toho je R( + )-MPAI, na rozdíl od R( + )-PAI, ___..pou^„petjcrát, aktivněj..ší....n.ež__S (-).MPAL· při. MAO-B-íinh-ibici-.R(+)-MPAI je v tomto testu přibližně 7 OOOkrát aktivnější než S(-)-PAI.
01-2762-97 Če
Tabulka IB
IC-50 (nM) HODNOTY PRO INHIBICI MAO-A A MAO-B RACEMICKÝM PAI A JEHO R( + ) A S(-) ENANTIOMERY V HOMOGENÁTU KRYSÍHO
MOZKU IN VITRO
IC-50 (NM)
MAO-A
MAO-B
Sloučenina: S(-)MPAI R(+)MPAI S(-)MPAI R(+)MPAI
Některé experimenty se rovněž prováděly za použití humánních cerebrálních kortikálních tkání,· získaných 6 hodin po smrti a zpracovaných výše popsaným způsobem. Výsledky tohoto experimentu jsou znázorněny na obrázku 3, kde R(+)-PAI, S(-)-PAI a racemický PAI jsou definovány výše.
Příklad 23
Inhibice MAO aktivity in vivo: akutní ošetření
Experimentální protokol
Krysy (samečci odvození od Sprague Dawley) o hmotnosti 250+20 g se ošetřily jedním z enantiomerů nebo racemickou formou PAI intraperitoneálni injekcí (ip) nebo orálně pomocí žaludeční sondy (po) a o hodinu, resp. o dvě hodiny, později se dekapitovaly. Skupiny tří krys se použily pro
01-2762-97 Če
každou dávkovou hladinu inhibitoru a MAO aktivita se zjišťovala v mozku a v játrech za použití výše popsané techniky. Množství proteinu v každé inkubaci se určilo pomocí Folin-Lowryho metody a enzymatická aktivita se vypočetla jako nmol metabolizovaného substrátu za hodinu inkubace pro každý mg proteinu. Aktivita MAO ve tkáních zvířat ošetřených inhibitory se vyjádřila jako procento enzymatické aktivity ve skupině kontrolních zvířat, kterým bylo podáváno vehikulum (voda v případě orálního podání a 0,9% fyziologický roztok v případě ip injekce) a která byla utracena výše popsaným způsobem.
Výsledky'
Žádná z dávkových hladin, použitých společně s inhibitorem účinných látek, neprodukovala znatelnou změnu chování. Výsledky jsou znázorněny na obrázcích 4 až 11. Po i.p. podání způsobila sloučenina R( + )PAI, podaná v dávce 0,5 mg/kg, 90% inhibici mozkové MAO-B aktivity. Stejná dávka způsobila pouze 20% inhibici MAÓ-A aktivity. Při orálním podání způsobila stejná dávka R(+)PAI 80% inhibici MAO-B a nebyla detekována žádná inhibice MAO-A. V podstatě shodné výsledky _byly zjištěny^ v případě_ inhibice_ hepatické MAO, například mozkové MAO. Dávky, způsobující 50% inhibici MAO-A a MAO-B (IC-50), se vypočetly z inhibičních křivek a jsou uvedeny v tabulce 2. Tato data ukazují: (a) že MAO inhibiční aktivita R( + )PAI in vivo v těle krys zůstává zachována;, (b) že selektivita pro inhibici MAO-B, na rozdíl od MAO-A, je udržována R(+)PAI in vivo; (c) že je zachována mnohem větší aktivita (+)-enantiomeru, na rozdíl od (-)enantiomeru, in vivo; (d) že sloučeniny jsou po orálním
01-2762-97 Če
podáni účinně absorbovány; a (e) že sloučeniny účinně procházejí hematoencefalickou bariérou a účinně inhibují mozkovou MAO. Skutečnost, že R(+)-PAI byl přibližně dvakrát účinnější než racemická sloučenina v případě inhibice MAOB, je odrazem extrémně nízké aktivity S(-)-PAI v případě inhibice MAO-B.
Tabulka 2
IC-50 HODNOTY (mg/kg) PRO INHIBICI MAO-A a MAO-B R(+)-PAI, S(-)-PAI NEBO RACEMICKÝM-PAI V TĚLE KRYSY.PO INTRAPERITONEÁLNÍ INJEKCI (I.P.) NEBO ORÁLNÍM PODÁNÍ (P.O.)
IC-50 (mg/kg)
MAO-A MAO-B
Sloučenina: S (-) PAI R (+) PAI Rac S (-) PAI R( + ) PAI Rac
I.P. mozek >10 1,2· 2,5 >10 0,07 0,22
I.P. játra >10 5 5 >10 0,06 0,11
P.O. mozek >10 >5 >5 >10 0,17 0, 29
P.O. játra >10 >5 >5 >10 0, 05 0,09
(Rac = racemický PAI)
Příklad 24
Inhibice MAO aktivity in vivo: dlouhodobé léčení
Experimentální protokol
Krysy (specifikované v příkladu 23, 4 zvířata pro každou dávkovou hladinu) se ošetřily R(+)PAI nebo racemickou směsí, které jim byly podávány orálně jednou
01-2762-97 Ce denně po dobu 21 dní ve třech dávkových hladinách (0,05, 0,1 a 0,5 mg/kg) a dvě hodiny po poslední dávce se zvířata dekapitovala. Aktivity MAO typu A a B v mozku a v játrech se určily způsobem popsaným v příkladu 23.
Výsledky
Denní dávka 0,1 mg/kg sloučeniny R(+)PAI produkovala příznivý stupeň selektivní inhibice, přičemž inhibice mozkové MAO-B je vyšší než 80 % a inhibice mozkové MAO-A je 20% a nižší. Při vyšší dávce, tj. při dávce 0,5 mg/kg denně, byla MAO-A stále inhibována méně než z 50 % (obr. 12 a 13) . Hepatická MAO vykazuje podobný stupeň selektivní inhibice (obr. 14 a 15), Sloučenina R(+)PAI byla opět účinnější než racemická směs, a to přibližně dvakrát. V případě mozkové MAO měl R(+)PAI vyšší stupeň selektivity pro inhibici MAO-B než racemická směs.
Tyto výsledky ukazují, že selektivita MAO-B inhibice může zůstat zachována i v případě déle trvajícího léčení těmito sloučeninami. Pokud jde o další nevratné inhibitory, stupeň inhibice enzymu je v případě dlouhodobého léčení vyšší, . než v případě podání jediné dávky účinné látky. Sloučenina' R_(^'PAI ’ vykazujme lepší sťupéň ^seXěktívity prd inhibici MAO-B než racemická směs.
01-2762-97 Ce
Příklad 25
Nevratná povaha MAO inhibice
Experimentální protokol
Skupinám, které vždy tvořily čtyři krysy, byla podána i.p. injekcí jediná dávka sloučenina R( + )PAI (1 mg/kg) a zvířata se o 2, 6, 18, 24, 48 a 72 hodin později usmrtila. Aktivita MAO-B se určila výše popsaným způsobem v celých mozkových tkáních.
Výsledky
Výsledky jsou znázorněny na obr. 16. Maximální inhibice MAO-B se dosáhlo 6 hodin po injekci. 72 hodin po injekci se MAO aktivita vrátila pouze na 30 % kontrolní aktivity. Tento experiment ukazuje na nevratnou povahu MAO inhibice způsobené R(+)PAI.
Příklad 26 „Zesíleni účinku _ty_raminoy_ého presoru u_krysz_ které jj sou při_ vědomí
Experimentální protokol
Krysy se anestetikovaly směsí pentobarbitalu (30 mg/kg) a chloralhydrátu (120 mg/kg) intraperitoneální injekcí. Levá krční tepna a jugulární žíla se kanylovaly tenkou polytenovou trubicí (arterie) nebo tenkou silikonokaučukovou trubicí, spojenou s polyethylenovou trubicí a
01-2762-97 Če (žila), jejíž vzdálený konec se zavedl pod kůži v upínacím místě za krkem. Trubice se naplnila heparinizovaným fyziologickým roztokem a ucpala tenkou ocelovou tyčkou. Zvířata se ošetřila 20 mg chloramfenikolu intramuskulární injekcí a přes noc nechala zotavit po operaci. Následující den se krysy umístily do vysokostěnných beden, které jim umožnily volný pohyb. Arteriální katétr se připojil pomocí 100 cm dlouhé, fyziologickým roztokem naplněné, polyethylenové hadičky s malým průsvitem k tlakovému převodníku a venózní katétr se spojil s lml injekční jehlou pomoci podobně dlouhé hadičky, která stejně jako injekční jehla obsahovala roztok tyraminhydrochloridu ve fyziologickém roztoku (1 mg/ml). Potom následovala vyrovnávací 30 až 40minutová perioda, aplikace tyraminových injekcí (50 nebo 100 pg) a zaznamenal se krevní tlak. Mezi jednotlivými injekcemi se zachoval alespoň patnáctiminutový interval, po kterém se krevní tlak vrátil na kontrolní hodnoty. Stanovily se odezvy kontrolního presoru, načež se intraperitoneálně injektovala jedna z účinných látek a následující 4 hodiny se zaznamenával průběh tyraminových odezev. Určila se plocha pod získanou křivkou a poměr této plochy po ošetření ku ploše před ošetřením a ku ploše získané 1 až 3 hodiny po injekci se vypočetl za použití
-----------------------průměru-3-až-.4-hodno-t,--získaných-během- -kontrolní-, periody-________
Výsledky
Výsledky jsou znázorněny v tabulce 3. Sloučenina R(+)PAI při dávce 1 mg/kg (která způsobuje úplnou inhibici MAO-B v mozku á játrech a 40 až 50% inhibici MAO-A v těchto tkáních) nezpůsobila žádné významnější zesílení tyraminové
01-2762-97 Če odezvy. Při vyšší dávce, tj. 5 mg/kg R( + )PAI (která způsobila extenzivnější inhibici MAO-A v mozku a periferii), došlo k významnému zesílení tyraminové presorové odezvy, která měla podobný rozsah jako v případě použití stejné dávky deprenylu a menší rozsah než v případě použití clorgylinu (při dávce, která inhibuje hepatickou MAO-A aktivitu více než z 85%).
Tabulka 3
POSÍLENÍ TYRAMINOVÉHO PRESOROVÉHO ÚČINKU U KRYS PŘI
VĚDOMÍ, DOSAŽENÉ POMOCÍ MAO INHIBITORŮ
Inhibitor Dávka (mg/kg) Počet krys (n) Poměr plochy pod křivkou presorové odezvy po ošetření/před ošetřením SEM*
Fyziologický roztok 12 1, 25 0, 28
Clorgylin 2 6 10,39 2,13
(-) Deprenyl 1 2 1,15
( + ) Deprenyl 5 3 2,36 0,16
R (+) PAI 1 3 1, 38 0,7
R(-) PAI- ------------------ ----5 ... .. .. ..3------ .—------3-,-4 9--------- .. ... 0,98 .
*SEM = standardní odchylka
Z tohoto experimentu lze usuzovat, že sloučenina R(+)PAI nezpůsobuje žádné zesílení tyraminového presorového účinku při dávce, která účinně inhibuje MAO-B.
01-2762-97 Ce
Přiklad 27
Potlačení MPTP-indukované dopaminergické toxicity pomocí R( + )PAI
1-methylfenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)· je neurotoxin, který u několika savčích druhů .včetně myší poškozuje nigrostriatální dopaminergické neurony a u lidí a primátů způsobuje Parkinsonův syndrom. Důležitým krokem mechanizmu jeho neurotoxicity je konverze MPTP na toxický metabolit, l-methyl-4-fenylpyridiniový iont (MPP+). Tato reakce se katalýzuje enzymem MAO-B a pravděpodobně probíhá vně dopaminových neuronů, zejména v glii. Je známo, že MPTP představuje jak substrát, tak nevratný inhibitor MAO-B. Předošetření pokusných zvířat MAO-B inhibitory, například deprenylem nebo pargylinem je chrání před MPTP indukovaným poškozením nigrostriatálních neuronů, protože dochází ke blokaci oxidační konverze MPTP na MPP+. Progresivní nigrostriatální degenerace u Parkinsonovy choroby může být. způsobena vystavením působení exogenních MPTP podobných neurotoxinů, odvozeným z okolního prostředí. V těchto případech je další silnou indikací iniciace dlouhodobějšího léčení MAO-B inhibitory již ve velmi ranných stadií Parkinsonovy choroby v přesvědčení, že toto^ léčení bude neutralizovat škodlivé účinky těchto ještě domnělých MPTP toxinů a tak zastaví nebo zpomalí vývoj choroby. Za úspěšný MAO-B inhibitor účinné látky je v současné době považován inhibitor, který má schopnost blokovat MPTP-indukované poškození nigrostriatálních dopaminergických neuronů in vivo. (-) a ( + ) enantiomery PAI se tedy testovaly z hlediska jejich schopnosti bránit nebo tlumit MPTP-indukované striatál-dopaminové deplece u myší.
01-2762-97 Če
Expresní protokol
Samečci černé myši C57 (o hmotnosti 20 až 25 g) se (a) injektovali MPTP.HC1 (30 mg/kg rozpuštěný v destilované vodě, s.c.) nebo samotným vehikulem, nebo se jednu hodinu po předošetřeni injektovali (-) nebo (+)isomerem PAI (2,5 mg/kg, i.p.) nebo deprenylem (5 mg/kg i.p.) a (b) dekapitulují o pět dní později. Mozky se odstranily a corpora striata se rozřezala na ledem chlazené skleněné desce a zmrazila na suchém ledu. Striatální tkáně se homogenizovaly v 0,1 M kyselině perchlorové a deproteinizované alikvotní. podíly, obsahující dihydroxybenzylamin jako vnitřní standard, se použily pro analýzu dopaminu a jeho hlavního metabolitu, kyseliny 3,4-dihydroxyfenyloctové (DOPAC), za použití HPLC s elektrochemickou detekcí.
Výsledky
Tabulka 4 ukazuje výsledky tohoto experimentu. Při ošetření samotným MPTP došlo k produkci značných striatáldopaminových (DA) a DOPAC deplecí. Ošetřeni (-) a ( + ) -enant-iomer-y——PAL-—nebo- — (—deprenylem neovlivnilo.—DA—— koncentrace ve striatiu. Předošetřeni (-) isomerem PAI neovlivnilo MPTP-indukovanou DA a DOPAC hladinu produkovanou toxinem. Při dávce 2,5 mg/kg odpovídala účinnost (+)PAI účinnosti (-) deprenylu (5 mg/kg), pokud jde o jeho ochranný účinek.
01-2762-97 Če
Tabulka 4
VLIV PŘEDOŠETŘENÍ (-) A ( + ) ENANTIOMERY MAO-B INHIBITORU PAI NASTRIATÁLNÍ DA A DOPAC DEPLECE, INDUKOVANÉ MPTP U MYŠÍ IN VIVO
PA DOPAC (nm/mg proteinu)
Kontrolní 162,8 + 7,2 8,4 + 0,5
MPTP 53,1 + 6,2 3,2 + 0,3
(-)PAI 174,0 + 4,8 7,5 + 0,2
(-)PAI + MPTP 53,4 + 6,9 7,0 + 0, 6
( + ) PAI 185, 0 + 6,9 3,3 + 0,3
( + )PAI + MPTP 177 + 14,4 6,0 + 0,3
(-) Deprenyl 170, 6 + 7,1 5,6 +. 0,3
(-) Deprenyl + MPTP 197,0 + 8,0 6,4 + 0,5
Výše uvedené hodnoty pro DA a DOPAC jsou vyjádřeny jako průměr + standardní odchylka a počet krys n = 7 až 11 v každé skupině.
Tyto výsledky naznačují, že R(+)PAI je vynikajícím MAO-B inhibitorem in vivo a má zvláště velký potenciál pro léčení Parkinsonovy choroby.
Je třeba poznamenat, že i když byl vynález popsán s odkazem na výše zmíněné příklady, doprovodné tabulky a obrázky, neomezuje se pouze na tyto příklady. Rovněž jsou možné různé modifikace a aplikace vynálezu. (R)-PAI lze při
01-2762-97 Če léčeni Parkinsonovy choroby například zkombinovat synergickým způsobem s a-tokoferolem (derivát vitaminu E).
Přiklad 28
Vliv PAI enantiomerů na amfetaminem indukované stereotypní chování u stárnoucích krys
Je známo, že amfetamin indukuje stereotypní chování (Sulser F. a Sanders-Bush E., Ann. Rev. Pharmacol., 11, 209-230 (1971)) mobilizací endogenního dopaminu. Amfetamin není metabolizován MAO-B. Inhibice MAO-B účinným inhibitorem a podání amfetaminu způsobí uvolnění dopaminu,. který nepodlehne degradaci inhibovanou MAO-B. Takže po podáni amfetaminu a účinného MAO-B inhibitoru se očekává, že dojde ke zvýšení synaptického dopaminu, které povede ke zvýšení stereotypního chování a tedy k posílení amfetaminového účinku. Rozsah tohoto chování se hodnotí na základě počtu laterálních pohybů hlavy během jednominutové časové periody.
Experimentální protokol
Testovaná sloučenina se podávala v dávce 0,5 mg/kg/den v pitné vodě 24 hodin před tím, než došlo k hypoxii (92 % dusíku + 8 % kyslíku po dobu 6 hodin). Potom se injektoval s.c. amfetamin v dávce 0,5 mg/kg. 0 45 minut později se počítaly laterální pohyby hlavy.
01-2762-97 Če
Výsledky
Výsledky tohoto experimentu jsou shrnuty v tabulce 5.
Tabulka 5
VLIV PAI ISOMERŮ NA AMFETAMINEM-INDUKOVANÉ STEREOTYPNÍ CHOVÁNÍ U STÁRNOUCÍCH KRYS (KONTROLNÍCH A POŠKOZENÝCH
HYPOXIÍ)
Hodnoceni léčeni stereotypního chováni
Skupina ------—----------Kontrolní (6) -87+10
Kontrolní (5) ( + )PAI 126 + 16*
Kontrolní (4) (-)PAI94+18
Hypoxií poškozená (5) -93+12
Hypoxií poškozená (6) (+)PAI 143 + 6*
Číslo v závorkách označuje počet testovaných zvířat * p<0,001, vztaženo k neošetřené, hypoxií postižené, — -skupině- nebo-neošetřené-kontrolní-skupině— .—,—— ——
Výsledky v tabulce 5 naznačují, že (+)PAI způsobil podstatné zvýšení amfetaminem indukovaného stereotypního chování jak u krys poškozených hypoxií, tak u kontrolních krys. (-)PAI byl v tomto ohledu zcela inaktivní. Tyto in vivo výsledky potvrzují předchozí biochemická zjištění, že ( + )PAI je aktivním inhibitorem MAO-B v mozku, zatímco (-)PAI je v tomto ohledu inaktivní.
01-2762-97 Če
Přiklad 29
Vliv R(+)-PAI na zlepšení nebo obnovu paměti
Čerstvě narozená mláďata krys se podrobila krátké epizodě anoxie a potom se opět nechala normálně růst, čímž se u nich vyvinulo dlouhotrvající poškození paměti (Speiser a kol., Behav. Brain Res., 30 89-94 (1988)). Toto poškození paměti je vyjádřeno jako horší výkon v testu vyčkávání před vstupem do černé komory.
Účinek R(+)PAI a S(-)PAI na zlepšení nebo obnovu paměti se stanovil v testu vyčkávání před vstupem do černé komory. Pokud je účinná látka opravdu účinná, potom prodlouží latenci odezvy na vstup do tmavé komory, ve které utrpěly testované krysy před prováděním experimentu elektrošok. Latence maximální odezvy je 300 sekund.
Experimentální protokol
Mladé krysy se podrobily, způsobem popsaným v příkladu 27, postnatální anoxii. R(+)PAI nebo S(-)PAI se podával podle jednoho z následujících protokolů.
Protokol A
Kojícím matkám se podávala dávka jednoho z izomerů 1 až 1,5 mg/kg/den v pitné vodě, dokud nepřestaly kojit, tj . 21 dní. Potom' se odstavení potomci přímo ošetřovali, po dobu následujících 20 dní, stejnou dávkou účinné látky. Ošetření se ukončilo po čtyřiceti dnech a test se prováděl
01-2762-97 Če šedesátý den, tj. 20 dní po podání poslední dávky účinné látky.
Protokol B
Dávka, která se zredukovala na 0,5 mg/kg/den, se podávala kojícím matkám dokud nepřestaly kojit, tj . 21 dní a následně přímo mladým krysám a to až do šedesátého dne, kdy se provedl test.
Test vyčkávání před vstupem do černé komory
Pro tento test se použilo zařízení tvořené osvětlenou komorou, která je spojena s tmavou komorou a posuvnými dveřmi, oddělujícími tyto dvě komory. Při výcviku se krysa umístila na 30 sekund do osvětlené komory a potom se otevřely dveře oddělující obě komory. Krysa se pohybovala do tmavé komory s latencí, která se zaznamenala. Po vstupu krysy do černé komory se dveře zavřely a krysa prodělala třísekundový elektrošok 0,3 mA, vedený do nohou.
Retence (paměť) se stanovila opakováním, testu po 4’8 hodinách’ 'a—zaznamenáním.— latence, která—předcházela' pohybu ze světla do tmy, přičemž za maximální latenci se považovalo 300 sekund.
Výsledky
Výsledky těchto experimentů jsou shrnuty v tabulce 6.
01-2762-97 Če
Tabulka 6
ÚČINEK PAI ISOMERŮ NA DOBU VYČKÁVÁNÍ PŘED VSTUPEM DO ČERNÉ
KOMORY U MLADÝCH KRYS (60DENNÍ KRYSY)
Protokol A. Skupina Ošetření Před elektrošokem Po elektrošoku
Kontrolní - 49 ± 13 201 ± 111
Kontrolní ( + ) PAI 49 ± 19 220 ± 100 (+9%)*
Kontrolní (-)PAI 48 ± 13 192 ± 116
Poškozená anoxií - 45 ± 11 183 ± 109
Poškozená anoxií ( + ) PAI 49 ± 10 239 i ± 99 (19%)*
Poškozená anoxií (-)PAI 55 ± 27 179 ± 123
Protokol B Skupina Ošetření Před elektrošokem Po elektrošoku.
Kontrolní — 53 ± 20 104 ± 101
Kontrolní ( + ) PAI 48 ± 11 128 ± 119 (+23%)*
Poškozená anoxií - 45 ± 8 119 ± 105
_P.o.š.ko.zená-ano.xií._ ___C+_)_PAI_ _ 52—±—12-- —13-7- -±-126-(..+-15-%-)_*_.
.Poškozená anoxií (-)PAI 48 ± 19 112 ± 112
Obrázky reprezentují latenci pro vstup do tmavé komory (v sekundách), ve které krysy poprvé utrpěly elektrošok * Naznačená procentická zvýšení jsou vztažena k hodnotám odpovídající anoxické nebo kontrolní skupiny
01-2762-97 Če
Výsledky experimentů naznačují, že ( + )PAI je na rozdíl od (-)PAI účinný, pokud jde o zlepšení paměti ahoxií poškozených krys a kontrolních krys. Látky, účinné v tomto testu, jsou považovány za látky, které mohou být účinně použity při léčení různých poškození paměti, demence a zejména při léčení senilní demence Alzheimerova typu.
Příklad 30
Účinek R(+)PAI na anoxií indukovaný hyperaktivní syndrom u juvenilnich krys
Krysy, které se podrobily postnatální anoxii a. následně nechaly růst za normálních podmínek, vykazovaly ve věku 10 až 42 dní zvýšenou motorickou aktivitu na otevřeném poli (Hertshkowitz a kol., Dev. Brain Res., 7, 145-155 (1983)).
Úkolem tohoto testu bylo stanovit vliv R(+)PAI a S{-)PAI na tento hyperaktivní syndrom.
Experimentální protokol
Anoxie se provedla na mláďatech krys první postnatální den. Tyto krysy se umístily do skleněné komory a na 25 minut se vystavily 100% dusíku. Potom se resuscitovaly přerušovanou masáží, lehce aplikovanou na hrudník, a následně vrátily ke svým matkám. Kontrolním krysám bylo poskytováno stejné ošetření s tou výjimkou, že se namísto dusíku použil kyslík.
01-2762-97 Če
R(+)-PAI nebo S(-)-PAI (0,5 mg/kg/den) se podávaly kojícím matkám v pitné vodě, takže se přenesly na potomky prostřednictvím mléka.
Pohyb se měřil v šesti klecích, zcela sledovaných počítačem (28 x 28 cm), zaznamenáním počtu přeběhů v průběhu dané časové periody. Přeběhy .mřížky infračervených paprsků ve 4cm intervalech iniciovaly elektrické impulzy, které přijímal počítač. Záznamy pohybové aktivity se provedly ve věku 15 a 20 dní, a to při patnáctiminutové sledované periodě.
Výsledky
Výsledky experimentů jsou shrnuty v tabulce 7.
01-2762-97 Če
Tabulka 7
VLIV JEDNOTLIVÝCH ENANTIOMERŮ NA ANOXIÍ-INDUKOVANÝ HYPERAKTIVNÍ SYNDROM
Skupina Ošetření 15denní krysy 20denní krysy
Kontrolní - 414 ± 192(11) 808 ± 212(12)
Kontrolní (+) PAI 254 + 149(ll)c 719 ± 110(13)
Poškozená anoxii — 482 + 119 (7) 858 ± 96 (9)
Poškozená anoxii ( + )PAI 276 + 186(15)a 737 i 150(16)c
Poškozená anoxii (-)PAI 334 + 196 (5) 778 ± 232 (6)
Čísla v závorkách znamenají počet testovaných zvířat
Hodnoty znamenají počty přeběhů mřížky infračervených paprsků v kleci během 15 minut a p<0,001 vztaženo k anoxii podrobené skupině b p<0,05 vztaženo k anoxii podrobené skupině c p<0,05 vztaženo ke kontrolní skupině
Tyto výsledky naznačují, že dlouhodobější orální léčení R(+)-PAI při dávce 0,5 mg/kg, podávané kojícím matkám a při kojení prostřednictvím mléka potomkům, podstatně zlepšuje hyperaktivní syndrom. Z těchto zjištění vyplývá, že R(+)-PAI může být účinně použit jako účinná látka při léčení dětí trpících hyperaktivnim syndromem.
01-2762-97 Če
Příklad 31
Stabilita je důležitým faktorem při volbě optimální soli jako terapeutické účinné látky. Různé soli mohou ovlivňovat fyzikálně-chemické a biologické charakteristiky účinné látky a mohou mít značný vliv na její celkové vlastnosti (Berge S.M. a kol., J. Pharm. Sci. 66, 1 (1977); Gould P.L., Int. J. Pharmaceutics, 33, 201 (1986)).
Experiment
Syntéza PAI solí
Roztok příslušné kyseliny (1 mol-ekv.) ve 2-propanolu se přidal za stálého míchání do roztoku PAI (1 mol-ekv.) ve 2-propanolu (Ar, BHT). Vzniklá sůl se přefiltrovala, promyla 2-propanolem a etherem a vysušila za sníženého tlaku. Výtěžky se pohybovaly v rozmezí 70 až 90 %. Výjimka byla učiněna při přípravě PAI acetátu, kdy se jako rozpouštědlo použil ether.
Analytické metody
Chromatografické separace se prováděly za použití B 5 μ 125x4 mm kolony Lichrosphere 60 RP (Merck), HPLC (Jasco·BIP-1) vybavené L-4200 UV-Vis detektorem (MerckHitachi). nastaveným na 210 nm a D-2500 chromatointegrátorem (Merck-Hitachi). Eluční činidlo a ředidlo byly tvořeny z 80% destilovanou vodou a z 20% acetonitrilem (HPLC kvality) a 0,07 M kyselinou perchlorovou, nastavenou na pH 2,5 vodným roztokem amoniaku. Rychlost průtoku kolonou
01-2762-97 Če dosahovala 1 ml/min, roztok příslušné PAI soli měl koncentraci 250 gg/ml a do chromatografického systému se injektovalo 20 μΐ roztoku.
Rozmezí tavné teploty se měřilo pomocí automatického zařízení (Mettler FP 80) a termo-gravimetrická analýza se prováděla na přístroji Mettler TA 3000 při rychlosti 10°C/min v aplikovatelném rozmezí. Rozpustnost se určila příslušným naředěním supernatantu z vodného roztoku nasycené PAI soli a měřila na UV-Vis spektrofotometru UVIKON 941 (Kontron). Která solná forma (mono- nebo di-sůl) vznikla se zjistilo elementární analýzou za použití standardního vybavení pro stanovení C, H, N a S. Hodnota pH se měřila v 1% vodném roztoku PAI solí.
Výsledky
Vlastnosti různých solí jsou shrnuty v tabulce 8.
01-2762-97 Če
Tabulka 8
FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI PAI SOLÍ
PAI-sůl mol. hm. pH Rozpustnost mg/ml Tavné rozmezí (°C) ztráta Solná forma
vinan 492 5,5 33 176, 2-177,3 LT 0,1 di
mesylát 267 4,3 635 156,8-157,6 0,1 mono
maleinát 287 4,0 NLT 1000 87,2-87,8 0,1 mono
SUlfát 440 3, 9 485 159,4-161,1 3,2 di
chlorid 207 4,2 238 177,0-180,0 LT 0,5 mono
tosylát 343 4,4 60-70 129,3-129,9 LT 0,1 mono·
fumarát 287 3,5 95 125,4-126,2 0,2 mono
fosfát n.a. 7,0 NTL 720 109,5-110,4 n.a. n.a..
esylát 279 2,4 NTL 300 n.a. n.a. mono
octan 231 6,1 NTL 720 69,2-69,7 0,4 mono
n.a. = není dostupná
Studie, porovnávající stabilitu soli, se prováděly za urychlujících podmínek: I) ohříváním na 80°C po dobu 72, 96 nebo 144 hodin; a II) ohříváním na refluxní teplotu v isopropanolu po dobu 30 hodin. Vyvinuté degradanční produkty se měřily HPLC a potvrdily pomocí TLC. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9, přičemž relativní retenční doba (vztažená k PAI píku; RRT) je vyjádřena jako procento plochy, vztažené k celkové integrované píkové ploše.
01-2762-97 Če 70 * • · • ·· · • v« · · · ·· · ·
Tabulka 9
DEGRADAČNÍ Sůl PRODUKTY VYVINUTÉ V PAI SOLÍCH PODMÍNEK 80°C/72 hod 8O°C/144 hod ZA ZRYCHLENÝCH Reflux v iPrOH/30 hod
RRTa %b RRT % RRT %
sulfát NDC ND ND ND - 0, 47 0,22
0, 60 0, 72
fosfát 0, 60 0,22 0, 60 0, 57 0, 60 2, 62
0, 74 0, 21
1, 84 0,20
1, 98 0,73
chlorid ND ND ND ND 2, 23 0,71
nesylát ND ND ND ND 0, 60 0, 08
maleinát 0, 60 0, 41 n.a. 0, 60 2,17
1,27 0,50 0, 65 1,35
1, 48 0, 33 1,29 0, 59
1, 81 0,10 1, 42 1, 30
3, 07 1, 44 150 0, 16
4, 16 0, 10 1, 83 0, 18
4, 84 7,76 1, 98 0,23
4, 09 0, 65
octan 0, 44 0, 10 n.a. 0, 60 6,74
0, 60 2,56 0,74 0,35
0, 73 0/13- 1, 76 0,33
1,29 0,71 1, 84 0,16
1,55 1,06 1, 99 4,17
1,75 21, 85 3, 60 0,27
1, 96 3,33
2, 15 0, 08
2,32 0,15
2, 83 0,15
3,54 . 1,82
esylátd ND ND 0,85 0,26 ND ND
1, 96 0, 31
01-2762-97 Če omezení kvantifikace = 0,08%
n.a. = není dostupné a Relativní retenční čas (vztaženo k PAT píku) b Plošné procento vztažené k celkové integrované píkové ploše c Množství detekovaných nečistot d Ethylsulfátová sůl
Soli se předložily vizuální kontrole barvy a formy. Zjištění jsou shrnuta v tabulce 10.
Tabulka 10
VZHLED PAT SOLÍ ZA DESTRUKČNÍCH PODMÍNEK
Sůl 80eC/72 hod 80°C/96 hod 8O°C/144 hod Reflux v iPrOH/30 hod
sulfát Ne zcela bílý prášek n.a. Ne zcela bílý prášek Hnědý prášek
fosfát Hnědavý prášek n.a. Hnědý prášek Hnědý prášek
chlorid Bílý prášek n.a. Bílý prášek Ne zcela bílý prášek
mesylát Bílý prášek n.a. Bílý prášek Bílý prášek
maleinát Hnědá tavenina Hnědá n. a. Hnědá tavenina
esylát Hnědavá tavenina n.a. Tmavě hnědá tavenina Tmavě hnědá tavenina
n.a. = nedostupný
01-2762-97 Če
Tyto studie ukazují, že síran, esylát a mesylát vykazují oproti ostatním solím, díky své dobré rozpustnosti a chemické, stabilitě, značné výhody. Z těchto tří solí je díky své vynikající stabilitě, a to i za destrukčních podmínek, nejvýhodnější solí mesylát.
Příklad 32
Zvrat haloperidolem-indukované katalepsie u myší
Samečci ICR myší, o hmotnosti 25 až 30 g, se předošetřili některou z následujících účinných látek: fyziologickým roztokem, (R)-PAI mesylátem nebo recemickým PAI mesylátem. Všechny účinné látky se podávaly i.p., v objemu 0,2 ml. O dvě hodiny později se v dávce 6 mg/kg v objemu 0,1 až 0,2 ml injektoval s.c. haloperidol. Testy pohybové koordinace se prováděly 3 hodiny po podání haloperidolu, t j . 5 hodin po podání předpokládaných ochranných účinných látek.
Testy pohybové koordinace a rigidity se kvantifikovaly podle tří různých parametrů: (a) podle schopnosti přejít po délce horizontální tyč 80 cm dlouhou; (b) podle schopnosti sešplhat obličejem směrem dolů vertikální tyč 80 cm dlouhou; (c) podle setrvání bez pohybu v nepřirozeném sedu, při kterém je břicho myši tlačeno proti „zdi. Úplný výkon, jako v případě haloperidolem neošetřených myší, je dán čtyřmi body v každém testu, nebo dvanácti body ve všech testech. Za slabý výkon jsou považovány jeden až tři body. Klíč k hodnocení je uveden v tabulce 9A. Vlivy různých činidel při antagonizaci haloperidolem-indukované katalepsie jsou uvedeny v tabulce 11. Tři hodiny po podání
01-2762-97 Če haloperidolu dosáhla (R)-PAI mesylátem udělená ochrana proti haloperidolu, podanému v dávce 5 až 15 mg/kg, vrcholu při 7,5 až 10 mg/kg (hodnocení aktivity = 94 % kontrolního fyziologického roztoku). Racemický PAI mesylát uděloval příslušnou ochranu, pokud se podal v dávce 7,5 až 15 mg/kg a nebyl aktivní při dávce 5 mg/kg. Z obrázku 17 je patrné, že profil dávka-účinek (R)-PAI mesylátu nebo racemického PAI je takový, že při zvýšení nad hodnotu 10 mg/kg dojde ke snížení účinku, a že racemická směs má obecně nižší účinnost. To znamená, že racemický PAI mesylát v dávce dvakrát vyšší než (R)-PAI mesylát bude vždy méně účinný než uvedený (R) enantiomer.
Zvrat α-MpT-indukované hypokinese u krys
Předpokládá se, že účinná látka a-MpT inhibuje tvorbu L-DOPA z tyrosinu a tedy tvorbu samotného dopaminu. Nedostatek CNS dopaminu je vyjádřen jako hypoaktivita. Šestiměsíční samečci krys Wistar (Harlan Orkack, UK) se předošetřili solným roztokem, (R)-PAI mesylátem nebo Rac PAI mesylátem, které se podávaly v naznačených dávkách. 0 dvě hodiny později jim byl podán i.p. a-MpT v dávce - — -1-00 mg/kg ---v —0,-3—až- O-,-5--ml·.-- •Koatrolnim- -kr-ysám—b-yl- -podán— fyziologický roztok. Potom se po dobu deseti hodin zaznamenávala motorická aktivita v počítačem sledované kleci. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12 a znázorněny na obrázku 18. Při dávce 2 mg/kg (R)PAI mesylát obnovuje přibližně z 90 % hladinu aktivity, vztaženo k aktivitě krys ošetřených fyziologickým roztokem. Rac PAI mesylát nebyl v tomto ohledu aktivní. V druhém případe měl profil křivky, vyjadřující závislost účinku na dávce, zvoncovitý tvar, z
01-2762-97 Če čehož vyplývá sníženi účinku při zvýšení dávky nad 2 až 5 mg/kg. Při 5 mg/kg Rac PAI mesylát nemohl dosáhnout hladiny účinnosti srovnatelné s účinností. (R)-PAI mesylátu podaného v dávce 2 mg/kg.
Z těchto měření vyplývá, že (R)-PAI mesylát a Rac PAI mesylát nesdílí podobný vzor aktivity při obnově normokineze u myší ošetřených haloperidolem a u krys ošetřených α-ΜρΤ. V případě všech analyzovaných dávek byl (R)-PAI mesylát vždy účinnější než Rac PAI mesylát, podaný v odpovídající dávce. Rovněž maximální účinnost Rac PAI mesylátu byla vždy nižší než maximální účinnost (R)-PAI mesylátu. Takže Rac PAI mesylát je při dané dávce vždy méně účinnější než (R)-PAI mesylát při poloviční dávce. Zdvojením dávky Rac PAI mesylátu vzhledem k (R)-PAI mesylátu se nedosáhne účinku, který odpovídá účinku (R)-PAI mesylátu.
Farmakologicky nelze Rac PAI mesylát považovat za směs tvořenou z 50 % účinnou složkou, kterou je (R)-PAI mesylát, a z 50 % inertním materiálem, jakým je ředidlo. Přítomnost (S)-PAI v Rac PAI mesylátu má nežádoucí vliv na účinnost (R)-PAI, což vede k více jak dvojnásobnému snížení účinnosti. Snížení· může být přímo důsledkem nežádoucího vlivu ’(S)-PAI- na’ běhavídřalní' parametry. ’ '
01-2762-97 Če
Tabulka 11
ZVRAT HALOPERIDOLEM-INDUKOVANÉ KATALEPSIE U MYŠÍ, DOSAŽENÝ PŘI APLIKACI (R)-PAI MESYLÁTU A RACEMICKÉHO MESYLÁTU
Myším se podaly jednotlivé testované účinné látky i.p. v naznačených dávkách. O dvě hodiny později byl myším, způsobem popsaným v textu, podán haloperidol. Uvedené dávky jsou zamýšleny pro volnou bázi.
(R)-PAI mesylát Rac PAI mesylát
Dávka Hodnoceni n % kontroly Hodnocení n % kontroly
mg/kg + SEM + SEM
1,8 7,2+1 6 60 7,0±0,6 6 59
3,0 6,4±0,5 6 60 5,9±0,7 6 49
5,0 8,7±0,9* 6 73 6,4+0,4 6 53
7,5 ll,0±0,4*** 5 92 9, 4±0,8++ 6 78
10 11,3+0,3*** 6 94 9,2±0,6*** 6 77
15 10,8±0,5*** 5 90 8, 8+0,8*** 6 73
Kontrolní 12±O 12100 fyziologický roztok ______
Samotný 6,6+0,3 1659 haloperidol
Statistická hodnota vzhledem k samotnému haloperidolu:
*p<0,05; **p<0,01; **p<0,001 se určila pomocí
Studentova „t testu.
Hodnocení pro (R)-PAI se značně liší od hodnocení pro racemický PAI při dávce 5 mg/kg p<0,05; při dávce 10 mg/kg p<0,01; a při dávce 15 mg/kg p<0,05.
01-2762-97 Če
Tabulka 11A
KLÍČ PRO HODNOCENÍ HALOPERÍDOLEM-INDUKOVANÉ KATALEPSIE U MYŠÍ A JEJÍHO ZVRATU -DOSAŽENÉHO RŮZNÝMI ČINIDLY
Vertikální tyč:
Není schopna uchopit tyč nohama1
Je schopna uchopit tyč, ale sklouzne z tyče2
Je schopna uchopit tyč, částečně klouže, částečně slézá dolů3
Je schopna uchopit tyč, slézá dolů za použití všech čtyř nohou4
Horizontální tyč:
Není schopna uchopit tyč, padá dolů1
Je schopna uchopit tyč, ale není schopna udělat na tyči více než dva kroky2
Je schopna uchopit tyč a přejít půlku tyče3
Je schopna uchopit tyč a přejít celou tyč4
Výdrž v klidu, v sedě proti stěně:
Nehybnost delší než 5 minut1
Nehybnost 3 až 5 minut2
Nehybnost 1 až 3 minuty3
Nehybnost 0,1 minuty4
V případě, že se chování pohybovalo někde na rozhraní dvou kategorií, například na rozhraní kategorie 2 a 3, se kryse udělilo hodnocení 2,5.
01-2762-97 Če
Tabulka 12
OBNOVA POHYBOVÉ AKTIVITY U KRYS, OŠETŘENÝCH a-METHYL-p-TYROSINEM (a-MpT) PŘI DÁVCE 100 mg/kg i.p.
Krysám se podaly testované účinné látky i.p. v naznačených dávkách. Po dvou hodinách jim byl podán a-MpT a bezprostředně potom se umístily do klecí, ve kterých se určovala jejich celková pohybová aktivita, která se automaticky zaznamenávala po dobu deseti hodin, způsobem popsaným v textu.
(R)-PAI mesylát Rac PAI mesylát
Dávka Hodnocení n % kontroly Hodnocení n % kontroly
mg/kg + SEM + SEM
2 14 132**11457 7 89 9,035+829 6 57
5 12 893*ϋ 869 7 81 10 926*1820 8 69
7,5 6 6791414 4 42 9 6981557 4 61
Kontrolní fyziologický roztok 15 862+1 424 5 100
Samotný a-MpT 8 108***1810 6 51
Statistická hodnota podle Študentova „t tesťů: *p<0,01;
***p<0,001 pro testované účinné látky + a-MpT vs. a-MpT samotný a-MpT samotný vs. kontrolní fyziologický roztok
Hodnocení pro (R)-PAI se značně liší od hodnocení pro racemický PAI při dávce 2 mg/kg p<0,01.
01-2762-97 Če
Přiklad 33
Účinky (R)-PAI mesylátu na krysy při vnitřním úrazu hlavy
Metody
1. Indukce úrazu
Úraz hlavy se u samečků anestézie dobře kalibrovaným dopadlo na exponovanou část mozkovou hemisféru ležící 1 krys indukoval za etherové závažovým zařízením, které lebky, která pokrývá levou až 2 mm bočně od středové linie ve střední koronální rovině.
2. Hodnocení motorické funkce
Jednu hodinu po způsobení úrazu se krysy testovaly podle celé řady kritérií, která hodnotila jejich neurologické výsledky (kritéria popsal Shohami a kol. v j. Neurotrauma, 10, 113 (1993)). Tato kritéria, označovaná jako Neurological Severity Score (Skoré neurologické závažnosti (NSS)), sestávají z řady reflexů a motorických funkcí. Body jsou udělovány na základe nedostatků, pokud jde o tato kritéria, a hodnocení se opět provedla po dvaceti čtyřech hodinách.
3. Hodnocení mozkového edému
Po druhém hodnocení motorické funkce (24 hod) se mozky odstranily. Vzorek tkáně (-20 mg) se zvážil za účelem získání mokré, hmotnosti tkáně (wet weight (WW)) · Po 24hodinovém sušení v eksikační peci při 95°Cse vzorek
01-2762-97 Če
fr opět zvážil a získala se tak suchá hmotnost (dry weight (DW)). K výpočtu procenta vody ve tkáni se použil vzorec (WW-DW) x 100/WW.
4. Ošetření účinnou látkou (R)-PAI mesylát se rozpustil ve vodě. Krysám se intraperitoneálně 0, 4, 8 a 12 hodin po indukci úrazu hlavy aplikovala účinná látka v dávce 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti. Kontrolní krysy se ošetřily ve stejných časových okamžicích vodou.
Výsledky
NSS, které bylo mírou „klinického stavu krys, bylo většinou u ošetřených a neosetřených skupin jednu hodinu po poškození hlavy identické, ale při druhém hodnocení, tj. o dvacet čtyři hodin později, bylo u krys ošetřených (R)-PAI mesylátem podstatně nižší (tabulka 13). Tyto výsledky naznačují, že PAI mesylát je účinný při zlepšování obnovy motorických funkcí u krys, u kterých došlo k vnitřnímu poranění hlavy.
Dvacet čtyři hodin po úrazu byl nalezen v hemisféře hlavní edém (85,4 % vody v mozku kontrolních krys vs. 78,5 % v nepoškozené' mozkové tkáni). PAI mesylát byl účinný při redukci edému, jak vyplývá z jeho vlivu na procento vody ve tkáni.
Na základě shrnutí získaných výsledků lze tvrdit, že (R)-PAI mesylát má v případě modelu simulujícího humánní
01-2762-97 Ce nervové poškození a při indukci vnitřního úrazu hlavy neuroprotekční vlastnosti.
Tabulka 13
NSS Δ NSS (1 hod - 24 hod) % H2O v mozku
1 hod 24 hod
Kontrolní (n = 6) 15, 6 12,3 4,3 ± 0,5 85,4 ± 0,4
(R)-PAI Mesylát (n = 6) 16,7 10,2 6,5 ± 0,7* 82,1 ± 0,6**
* P < 0,05 (Mann Whitney U-test) ** P < 0,005 (t-test)
Příklad 34
Účinky PAT mesylátu na prevenci NMDA indukovanou buněčnou smrt buněčných kultur malého mozku
Výsledky in vitro testů ť
Postupy
Kultury mechanicky disociovaného malého mozku neonatální krysy
01-2762-97 Če
Malý mozek šestidenních nebo sedmidennich krysích mláďat se asepticky rozpitval a umístil do 15ml sterilní plastické kónické zkumavky obsahující 3 ml obohaceného média (média tvořeného Dulbecem modifikovaným Eagleovým médiem (DMEM) s vysokou koncentrací glukózy (1 g/1), 2 mM (obj./obj.) L-glutaminu, antibíotickou antimitotickou směsí a obohaceným 15 % (obj./obj.) tepelně ínaktivovaným fetálním telecím sérem). Po dvaceti až dvaceti pěti průchodech sterilní, 10 cm dlouhou, nerezovou ocelovou jehlou 13, nasazenou na 5ml injekční stříkačku, ve které bylo vloženo nylonové síto s velikostí pórů 45 gm se malý mozek disocioval. Disociované buňky se 5 minut odstředily při 200 g a po odstranění supernatantu se buňky resuspendovaly v obohaceném médiu. Přežívání buněk se určilo vylučovacím testem trypanové modři. Buňky se následně naočkovaly při hustotě 200/mm2 na povrchy potažené poly-L-lysinem (poly-L-lysinem potažená skleněná podložní sklíčka se připravila alespoň jednu hodinu před očkováním, ponořením sklíček do sterilního roztoku destilované vody obsahujícího 15 μg/ml poly-L-lysinu a bezprostředně před použitím se opláchla sterilní vodou a vysušila), překryly obohaceným médiem a inkubovaly se při 37°C v atmosféře obsahující 5 % CO2 ve vzduchu a při 100% vlhkosti. Po čtyřech/ dnech v kultuře ’sě médium nahradili médiem obsahujícím požadované testované sloučeniny. Experimenty se prováděly duplicitně a opakovaly dvakrát nebo třikrát. Po zjištění závislosti odezvy na toxické dávce testované sloučeniny se porovnávaly čtyři skupiny: (I) kontrolní (samotné obohacené médium); (II) testovaná sloučenina (jedna podskupina pro každou koncentraci (testované byly dvě koncentrace)); (III) N-methyl-D-aspartát (NMDA, expozice koncentrací 1 mM po dobu 3 hodin) , jako • b · b b | · · ·*
01-2762-97 Če ? Γ ‘ ! · * ’* ··· · ·♦ 4·· ···· cytotoxická výzva; (IV) testovaná sloučenina plus NMDA (jedna podskupina pro každou ze dvou koncentrací testovaných sloučenin); (V) kontrolní skupina pro testování vlivu rozpouštědla (ve kterém je testovaná sloučenina rozpuštěna); a (VI) další „pozitivní kontrolní” skupina sperminu (0,01 μΜ rozpuštěných v kulturním médiu) plus NMDA. Přežití nervových buněk se hodnotilo fázovou kontrastní mikroskopií a barvením tripanovou modří po 24 hodinách.
Výsledky
Zjistilo se, že kyselina glutamová (Glu) vykazuje neurotoxické vlastnosti, které se exprimují ve vážných neurologických onemocněních zahrnujících. epilepsii a mrtvici, a nejpravděpodobněji rovněž v mozkových neurodegenerativních nemocech, například v Parkinsonově chorobě, Alzheimerově chorobě a traumatickém poškození mozku. Neurotoxické účinky Glu jsou mediovány membránu vážícími Glu receptory, například N-methyl-D-asparátovými (NMDA) receptory.
Získané výsledky shrnuté v tabulce 14 ukazují, že - — p---— . . - · _ -- I , - —: -- — r— . ---.. — - ·---------Ί-----1' . . — - —, —-- - _ - . - —- — - — . - ---- . . ÍJ— --- . . - — - - - — .
μΜ (R)-PAI mesylát zvyšuje počet buněk malého mozku, které přežívají po expozici 1 μΜ NMDA o 27 procent. Tyto in vitro výsledky podporují in vivo účinky (R)-PAI mesylátu prezentované v příkladech 33 a 35, z čehož vyplývá, že tato účinná látka má neuroprotekční vlastnosti v případe neurotoxické koncentrace NMDA.
01-2762-97 Če
Tabulka 14
NEUROPROTEKČNÍ VLIV (R)-PAI MESYLÁTU NA PREVENCI
NMDA-INDUKOVANÉ BUNĚČNÉ SMRTI BUNĚK MALÉHO MOZKU
Pokusná skupina Přežívaj ící buňky Procentická ochrana
Cerebrální kultury
(Toxicita TD25 = 30 μΜ; TD5o = 85 μΜ; TD loo = 320 μΜ)
Kontrolní 100
Rozpouštědlo 97
NMDA 10
Rozpouštědlo + NMDA 10 - 0
Sloučenina + NMDA:
1) 0,01 μΜ + NMDA 12 2
2) 1,00 μΜ + NMDA 22 12
3) 10,00 μΜ + NMDA 37 27
Spermin + NMDA 75 65
Hodnoty, které jsou vyjádřeny jako procento ——neošeb-řen-ýeh—kont-roin-i-Gh—v-zo-rků,—rep-re-zen-tu-j-í—p-růměr^-dv-ouduplicitních běhů experimentů kultury a průměr + SEM čtyř zvířat pro ischemii· Hodnota procentické ochrany vyjadřuje účinek testované sloučeniny po odečtení vlivu rozpouštědla.
_ _ _ v · ··*· · · · · ♦ ··· ·♦·
01-2762-97 Ce j., : „*
Přiklad 35
Vliv (R)-PAI mesylátu po rozdrcení krysího zrakového nervu
Neuroprotekční účinky (R)-PAI mesylátu se určily bezprostředně po rozmačkání zrakového nervu u dospělé krysy. Krátkodobé účinky se měřily metabolicky a.dlouhodobé účinky se stanovily elektrofyziologicky.
Metody
1. Metabolická měření .a) Obecně
Použil se způsob, který popsal Yoles a kol. v Investigative Ophthalmology & Visual Science, 33, 358 691 (1992). Při metabolických měřeních . krátkodobých účinků se monitoroval poměr mitochondriální NADH/NAD, který závisí na aktivitě elektronového transportního systému a tak indikuje úrovně energetické produkce. Změny schopnosti nervu produkovat energii v důsledku poškození se určily porovnáním NADH úrovní v odezvě na umělý přechodný anoxický inzult před a po poškození._____,
b) Povrchová fluorometrie - reflektometrie
Monitorování intramitochondriálního NADH redoxního stavu se zakládá na skutečnosti, že NADH, na rozdíl od zoxidované formy NAD+, fluoreskuje, pokud je osvětleno světlem o vlnové délce 450 nm. Pro přenos světla ke zrakovému nervu a od něj se použil pružný
01-2762-97 Če
svazek optických vláken ve tvaru Y (světelný vodič). Světlo, které emitovalo od nervu, se měřilo při vlnových délkách: 366 nm (odražené světlo) a 450 nm (fluorescenční světlo). Změny v intenzitě odraženého světla korelovaly se změnami tkáňové absorpce, které byly způsobeny hemodynamickými efekty a s pohyby zrakového nervu, sekundárně pak se změnami arteriálního krevního tlaku a objemem nervu. Zjistilo se, že fluorescenční měření jsou adekvátně upravenapro měření NADH redoxního stavu odečtem odraženého světla (366 nm) od fluorescenčního světla (poměr 1:1), čímž se získá správný fluorescenční signál.
c) Příprava zvířat
Použití zvířat bylo v souladu s „Rezolucí ARVO o používání zvířat pro výzkumné účely. Samci krys Sprague-Dawley (SPD) o hmotnosti 300 až 400 g se anestetikovaly pentobarbitonem sodným (50 mg/kg . intraperitoneálně). Při držení hlavy zvířete na místě, pomocí držáku hlavy, se provedla pod binokulárním operačním mikroskopem laterální katotomie a ve spojivce, ... ..bočně., ,_od.. ..rohovky,—... .se ....provedl______řez ._,:_Po„^.separaci refraktorových bulbálních svalů se identifikoval zrakový nerv a jeho úsek, dlouhý 3 až 3,5 mm, se v blízkosti oční bulvy odkryl tupým rozpitváním. Tvrdá plena se ponechala celistvá a dbalo se na to, aby nedošlo k porušení nervu. Okolo zrakového nervu se implantoval držák světelného vodiče takovým způsobem, aby držel světelný vodič na povrchu zrakového nervu, v místě 1 mm vzdáleném od místa poškození. Zvířata, stále ještě
01-2762-97 Če ··’ 1 Λ ·· · anestetikovaná, se nechala . chirurgického zákroku podmínkám. Anoxického a následně vystavila anoxickým stavu se dosáhlo tak, že se krysy nechaly dýchat dvě minuty v atmosféře 100% dusíku, načež se opět vrátily ke kyslíku. Za účelem vyhodnocení minut zotavit
•*í metabolické aktivity zrakového .nervu se relativní změny intenzity odraženého a fluorescenčního'světla, v odezvě na anoxii, změřily před a po poškození způsobeném drcením.
d) Experimentální protokol pro poranění způsobené drcením a metabolická měření
Pomocí lékařských kleští s kalibrovaným průřezem . se na nervu mezi okem a držákem světelného vodiče drcením, při třicetisekundovém tlaku odpovídajícím 120g, r způsobilo poranění nervu. Bezprostředně po poranění se zvířatům podala intraperitoneálními injekcemi voda s (R)-PAI mesylátem (2 mg/kg) a samotná voda. Pro stanovení aktivity energetického produkčního systému se měřila NADH odezva na dvouminutovou anoxii u všech zvířat před poškozením, 30 minut po poškození a dále v —--—hod-inov-ých—intervalech,-·.--přičemž-—poslední—měření—_s.e_— ----.— provedlo 4 hodiny po poškození (viz obrázek 19).
2. Elektrofyziologická měření
Tento způsob popsal Assia· a kol. v Brain Res.,
476, 205-212 (1989). Při těchto měřeních byla preferována stejná příprava zvířete a poškození zrakového nervu jako v případě metabolických studií.
01-2762-97 Če
Bezprostředně po poškozeni přijala zvířata jednu injekci vody s (R)-PAI mesylátem (0,5 mg/kg) a jednu bez (R)-PAI mesylátu. Čtrnáct dní po poškození a ošetření se zrakové nervy vyjmuly a elektrofyziologicky měřily. Před odstraněním zrakových nervů pro účely elektrofyziologických měření se krysy hloubkově anestetikovaly 70 mg/kg pentobarbitpnu. Z lebky se odstranila kůže a zrakové nervy se oddělily od očních bulev. Provedla se subtotální dekapitace a lebka se otevřela pomocí štípacích kleští. Malý mozek se vyjmul bočně, čímž se odkryla intrakraniální část zrakového nervu. Provedla se pitva na úrovni nervu, který se následně přemístil do lahviček obsahujících čerstvý solný roztok obsahující NaCl (126 mM), KC1 (3 mM), NaH2PO4 (1,25 mM), NaHCO3 (26 mM), MgSO4 (2mM), CaCl2 (2 mM) a D-glukózu (10 mM), který byl při pokojové teplotě zavzdušněn 95 % 02 a 5 % CO2. Nervy se uchovávaly v tomto roztoku, ve kterém zůstane elektrická aktivita stabilní alespoň po dobu 3 až 4 hodin. Po půl hodině regenerace při pokojové teplotě se získaly z konce zrakového vlákna, vzdáleného od rozdrcené léze, elektrofyziologické záznamy. Konce nervu se následně připojily ke dvěma odsávacím Ag-AgCl elektrodám, ponořeným' vé^šmáčečím “roztoku/.....při 37°C. SLimuIa“ční“ pulz se aplikoval přes elektrodu na vzdáleném konci a akční potenciál se zaznamenával pomocí vzdálené elektrody. Pro supramaximální elektrickou stimulaci (0,5 pps) se použil stimulátor Grass SD9. Naměřený signál se přenesl do předzesilovače Medelec PA36 a následně do elektromyografu (Medelec MS7, AA7T zesilovače). Roztok, stimulátor a zesilovač měly společný podklad. Zaznamenala se a maximální amplituda osmi průměrných
01-2762-97 Če
akčních potenciálů sloučeniny (CAP), která se rovněž vyfotila pomocí polaroidu. Jako referenční hodnoty sloužily hodnoty CAP, naměřené u kontralaterálních nepoškozených nervů.
Výsledky
Výsledky ukazují, že (R)-PAI mesylát, aplikovaný bezprostředně po poškození zrakového nervu, blokoval poškozením indukovanou redukci energetické produkce. (R)-PAI mesylát má rovněž dlouhodobé účinky, jak zjistilo elektrofyziologické monitorování.
CAP (akční potenciály sloučeniny) amplituda přímo korelovala s počtem vodivých vláken v testovaném segmentu nervu.
(R)-PAI mesylát podstatně tlumí poškozením indukovanou ztrátu aktivity distálního segmentu poškozeného nervu, z čehož vyplývá, že (R)-PAI mesylát je neuroprotekčním činidlem nebo alespoň činidlem zpomalujícím degeneraci.
_______Tabulka 15
ELEKTROFYZIOLOGICKÁ MĚŘENÍ
Skupina CAP amplituda (μν) (Průměr + standardní odchylka)
Vehikulum N = 13 441 ± 95
(R)-PAI mesylát N = 7 2104 ± 313*
01-2762-97 Če
Příklad 36
Srovnání antikonvulzívních vlastností R-PAI a S-PAIsolí
Jak (R)-PAI tak (S)-PAI HC1 soli mají značné antikonvulzívní účinky. U myší (při i. p. podání), použitých v maximálním elektrošokovém testu (MES testu), má (S)-PAI HC1 vyšší antikonvulzívní účinnost (ED50=57 mg/kg) než (R)-PAI HC1 (ED5o=79 mg/kg). Analogické výsledky se získaly u krys (p.o. podání) . Čtyři krysy ze čtyř byly chráněny před záchvaty v MES testu, pokud· jim bylo podáno 50 mg/kg (S)-PAI HC1, zatímco po stejné dávce (R)-PAI HC1 byly chráněny tři ze čtyř myší. Pokud jde o účinnost v případě Parkinsonovy choroby, je zvyšování antikonvulzívní účinnosti škodlivým vedlejším účinkem. Stejný trend se objevuje v případě mesylátových solí. (S)-PAI mesylát má v MES testu vyšší antikonvulzívní účinnost než (R)-PAI mesylát. Při dávkách 100 mg/kg (S)-PAI mesylát chránil tři myši ze tří, zatímco (R)-PAI mesylát chránil při identické dávce pouze jednu myš ze tří. MES test je klasickým modelem pro indikaci účinnosti pro parciální a generalizované záchvaty u lidí. Mechanizmus účinnosti tohoto činidla spočívá v jeho schopnosti bránit šířeni záchvatů. Nicméně některé--látky,--které - brání -šíření- -záchvatu,--mají—vedlejší účinek, který spočívá ve snižování křečového prahu. Tato činidla mají tedy jak prokonvulzívni, tak antikonvulzívní vedlejší účinky.
Získané výsledky tedy ukazují, že (S)-PAI mesylát má prokonvulzívní účinnost. Při testu měřené intravenózní infuze Metrazolu redukuje 141 mg/kg (S)-PAI mesylátu dobu infuze a tedy množství Metrazolu, potřebného pro vyvolání jak prvního místního záchvatu tak pro počátek škubavě
01-2762-97 Če
křeče. Další činidla, která se zpravidla používají při parciálních a generalizovaných záchvatech, například fenytoin a karbamazepin, tento efekt nevykazují. (H.J. Kupferberg, Epilepsia, 30, s51-s56 (1989)). Stejně tak (S)-PAI mesylát vykazuje podstatně vyšší akutní neurotoxicitu než (R)-PAI mesylát. Při 300 mg/kg (R)-PAI mesylát nevykazuje u myší, při . testu zjišťujícím poruchu koordinace na rotující tyči, žádnou neurotoxicitu. Při použití (S)-PAI mesylátu vykazují čtyři myši ze čtyř neurotoxicitu a křečovitost.
Metody
TD50 (střední toxická dávka)
Tento test měří neurologické nedostatky ' pomocí testu poruchy koordinace na rotující tyči. Myš se umístí na tyč- s boulovitým povrchem, která se otáčí rychlostí 6 ot./min. Potom se v každém ze tří pokusů zjišťuje, zdali má myš schopnost udržet rovnováhu a udržet se na tyči· po dobu jedné minuty.
Test měřené intravenózní infuze Metrazolu
Tento test ' měří u každého zvířete minimální křečový .práh. Metrazol se aplikuje formou infuze, která se podává rychlostí 0,185 mg/ml do ocasní žíly myši. Potom se zaznamená čas (v sekundách), který uplyne od počátku infuze do okamžiku, kdy se objeví první záškub (první fokálni záchvat) a počátek škubavě křeče (škubavý záchvat). Prokonvulzívni činidla potřebují pro vyvolání těchto
01-2762-97 Če příznaků méně Metrazolu a vykazují tedy konečné body v kratší časové periodě.
Příklad 37
Periferní účinky (R)-PAI a (S)-PAI na stažitelnost preparátů intestinálního hladkého svalu
Periferní účinky hydrochloridových solí enantiomeru PAI se., určily v izolovaném tenkém střevě, králíka nebo morčete. Tato pozorování poskytují užitečné informace o příslušných periferních vedlejších účincích u lidí. Prvním bodem kontaktu subjektu s orálně podanou účinnou látkou je gastrointestinální trakt, ve kterém jsou koncentrace účinné látky mnohem vyšší než po absorpci a distribuci. V případě PAI hydrochloridu (MH = 208) by lOmg orální dávka, obsažená přibližně ve 100ml objemu kapaliny, odpovídala přibližně koncentraci 0,5 mM. Terapeutická koncentrace (R)-PAI hydrochloridu v plazmě se naopak pohybuje v nanomolárním rozsahu.
Zjištění účinků enantiómerů PAI v izolovaném králičím lačníku a kyčelníku morčete mělo zjistit, zda bude společný -p ř í jem— ( S j—PAT—a—(-Rj—PAT— (-jak—s e—na chá z e^-í—v—r ac emi-e-kémPAI) produkovat vedlejší účinky, které nebyly v případě podání samotného (R)-PAI zjištěny. (R)-PAI je díky své účinnosti a vysoké selektivitě k této formě enzymu výhodným enantiomerem pro inhibici. MAO-B v mozku. (S)-PAI je V tomto ohledu méně účinný než (R)-PAI a není rovněž selektivní k MAO-B. V zásadě' by bylo možné jeho přítomnost v PAI racemátu tolerovat nebo přehlédnout za předpokladu, že by byl (S)-PAI při doporučených dávkách (R)-PAI inertní.
01-2762-97 Če
Výsledky shrnuté v tabulkách 16 až 19 ukazují, že (S)-PAI není inertní látkou. V kyčelníku morčete se (S) enantiomer neprojevil jako účinnější relaxační látka než (R)-PAI. Díky jeho periferním účinkům ho nelze považovat za zanedbatelný. Tyto údaje ukazují, že při podání racemického PAI obsahujícího ekvivalentní dávku (R)-PAI by se mohlo vyskytovat více periferních vedlejších účinků než při podání čistého (R)-PAI.
Tabulka 16
TYRAMINOVÁ POTENCIACE KAŽDÝM ZE DVOU ENANTIOMERŮ PAI HC1 PŘI RYCHLOSTI PREPARACE LAČNÍKU
Napínání králičího lačníku, přichyceného v orgánové komoře, vykazuje rytmické kontrakce, které jsou inhibovány noradrenalinem, ale nikoliv tyraminem. Nicméně pokud se lačník předošetří inhibitorem monoaminoxidázy, například PAI, potom tyramin způsobí uvolnění spontánních kontrakcí. Rozsah uvolnění může korelovat s relativní účinností inhibitoru.
Účinná látka a koncentrace (μΜ) Procentické uvolněni
Samotný tyramin 40 0
Noradrenalin 0,002 100
Samotný (R)PAI 0,2-4,0 0
Samotný (S)PAI 0,2-4,0 0
Tyramin 40 .
po (R)PAI 0,2 67
01-2762-97 Če pokračováni
Účinná látka a koncentrace (μΜ) Procentické uvolnění
2 38
40 85-90
po (S)PAI 0,2 0
2 35
40 33-50
Výsledky (S)-PAI je jako inhibitor mozkové MAO-B mnohem méně účinný než (R)-PAI. Takže (S)-PAI není použitelným činidlem v případě prevence mozkové dopaminové degradace, ale může potenciovat tyraminem-evokované uvolnění noradrenalinu v tenkém střevě. Jeho účinnost v tenkém střevě je nežádoucím vedlejším účinkem, protože se dá očekávat, že bude zvyšovat absorpci a působení nežádoucího tyraminu. Takže (S)-PAI, pokud se použije společně s (R)-PAI ve formě racemického PAT, není inertní látkou.
Tabulka 17
ANTAGONISMUS BETHANECHOLEM-INDUKOVANÝCH KONTRAKCÍ KYČELNÍKU MORČETE V PŘÍTOMNOSTI 400 μΜ KAŽDÉHO ZE DVOU ENANTIOMERŮ PAI HC1
Napínání kyčelníku morčete, přichyceného ve fyziologickém roztoku v orgánové komoře, způsobí dávkově závislé kontrakce, pokud se ošetří bethanecholem, který je
01-2762-97 Če enzymaticky stabilním analogem přirozeného gastrointestinálního přenašeče neuronů, jakým je acetylcholin. Tyto kontrakce se v přítomnosti PAI zeslabily. Údaje jsou vyjádřeny v gram-napětí.
Bathenechol (μΜ) Gram-napětí
Kontrolní (R) PAI Kontrolní (S) PAI
0, 8 0,5 0,2 0, 6 0
2 1,5 0, 3 2,0 0
4 2,2 0,7 3,0 0
8 4,0 1,0 3,8 0, 6
20 5, 6 2,0 3,8 1,2
40 6,2 2,8 3,8 1,7
80 6,2 3,1 3, 8 2, 6
200 6,2 4,3 3, 8 2, 6
Výsledky (S)-PAI je většinou jako MAO-B inhibitor inaktivní, pokud jde o (R)-PAI, a není tedy účinný při prevenci degradace mozkového dopaminu. Nicméně při prevenci bethanecholem-indukované kontrakce tenkého střeva je účinnější než R(PAI). (S)-PAI, pokud se použije spolu s R(PAI) ve formě racemického PAI, tedy není inertní látkou.
01-2762-97 Če
Tabulka 18
ANTAGONISMUS HISTAMINEM-INDUKOVANÝCH KONTRAKCÍ KYČELNÍKU MORČETE KAŽDÝM ZE DVOU ENANTIOMERŮ PAI HC1
Pevně stanovená dávka histaminu (40 nM) způsobuje vytrvalou kontrakci napnutého kyčelníku morčete, uchyceného ve fyziologickém roztoku v orgánové komoře. Přírůstkové přidávání každého ze dvou enantiomerů PAI HC1 způsobuje dávkově dependentní uvolnění svalu. Výsledky jsou vyjádřeny jako procentické uvolnění, přičemž za 100% uvolnění je považován stav před přidáním histaminu.
Koncentrace PAI Procentické uvolnění
)1M (R) PAI (S) PAI
2 0 11
4 0 15
10 0 30
20 20
30 31 33
40—___.3-7——__—______-3.6 —
100 81 71
200 90
300 92
400 100 98
700 100
1000
100
01-2762-97 Če
Výsledky (S)-PAI je jako MAO-B inhibitor v mozku, v porovnání s (R)-PAI, inaktivní a tedy nepoužitelný při prevenci degradace mozkového dopaminu; ale pokud jde o uvolnění střevního hladkého svalu, potom je aktivnější než (R) isomer. Takže . (S)-PAI není inertní látkou, pokud je podán společně s (R) isomerem ve formě racemického PAI.
Tabulka 19
ANTAGONISMUS BETHANECHOLEM-INDUKOVANÝCH KONTRAKCÍ KYČELNÍKU MORČETE KAŽDÝM ZE DVOU ΕΝΑΝΤΙOMERŮ PAI HC1
Pevně stanovená dávka bethanecholu (0,8 μΜ) způsobuje vytrvalou kontrakci napnutého kyčelníku morčete, uchyceného ve fyziologickém roztoku v orgánové komoře. Přírůstkové přidávání každého ze dvou enantiomerů PAI HC1 způsobuje dávkově dependentní uvolnění svalu. Výsledky jsou vyjádřeny jako procentické uvolnění, přičemž za 100% uvolnění je považován stav před přidáním histaminu.
Koncentrace PAI Procentické uvolnění
(R) PAI (S)PAI
20 25 40-50
60 .25-50 60-70
100 50-70 100
300 100 100
01-2762-97 Če
Výsledky (S)-PAI je jako MAO-B inhibitor v mozku, v porovnání s (R)-PAI, inaktivní a tedy nepoužitelný při prevenci degradace mozkového dopaminu; ale pokud jde o uvolnění střevního hladkého svalu, potom je aktivnější než (R) isomer. Takže (S)-PAI není inertní látkou, pokud je podán společně s (R) isomerem ve formě racemického PAI.
Příklad 38
Určité účinky [R]( + )PAI mesylátu na okluzi střední cerebrální arterie u krys, jako na model mrtvice
Metody
1.1 Okluze střední cerebrální arterie (MCAO) u krys
Použila se modifikace postupu, který popsal Tamura a kol. (1981). Samečci krysy Wistar (Olac England-Jerusalem) o hmotnosti 300 až 400 g se neestetizovali roztokem equitesinu, podaného i.p. při dávce 3 ml/kg. Equitesin sestává z 13,5 ml roztoku .__qDentothalu... sodného .U.6O_.mg/ml).,___3_, 5„g. .chloralhydrátu, _ 1,75 g MgSCh, 33 ml' propylenglykolu, 8,3 ml bezvodého alkoholu, které byly doplněny do 83 ml destilovanou vodou. Chirurgický zákrok se provedl za použití operačního mikroskopu s vysokým rozlišením, model SMZ-2B, typ 102 (Nikon, Japan). Za účelem odkrytí levé střední cerebrální arterie se ve spánkovém svalu provedl řez. Špička koronoidního výběžku mandibuly se vyřízla a odstranila pomocí malých lékařských kleští.
01-2762-97 Če
Na spoji mezi střední příčkou a stropem inferotemporální jamky se provedla kraniektomie s vrtáním zubů. Tvrdá plena se opatrně otevřela za použití jehly 27. MCA se trvale ucpala mikrobipolárni koagulací při nastavení nízké energie, se začátkem 2 až 3 mm od čichového traktu, mezi její kortikální větví k nosní kůře a laterálními arteriemi striata.
Po koagulaci se MCA oddělila mikronůžkami a rozdělila tak, aby zajistila kompletní okluzi. Potom se sešil spánkový sval a položil přes místo kraniektomie. Kůže se uzavřela pomocí hedvábné sutury 3 až 0. Paralelní skupina myší se podrobila kraniektomické operaci bez kauterizace MCA. Během celé chirurgické operace (20 až 25 minut) se u obou skupin pomoci regulátoru tělesné teploty (Kyoristsu, Japan), sestávajícího ze samoregúlačního topného polštářku, který je připojen k rektálnímu termistoru, udržovala tělesná teplota 37 až 38 °C. Dvacet čtyři hodin po chirurgickém zákroku se stanovilo neurologické skóre, aby se stanovila závažnost poškození u krys ošetřených účinnou látkou v porovnání s neošetřenými kontrolními subjekty. Po 48 hodinách se zvířata anestetikovala equitesinem a závažnost poškození se vizualizovala pomocí MRI postupu. Dále se určil objem mozkové tkáně, poškozené v důsledku ischemie.
1.2. Podání účinné látky
[R](+)PAI mesylát se podával i.p. injekcí v 0,3 až 0,4 ml destilované vody podle následujícího rozvrhu: 1 mg/kg bezprostředně po chirurgickém zákroku;
01-2762-97 Če
0,5 mg/kg 2 hodiny po chirurgickém zákroku;
mg/kg 20 až 24 hodin po chirurgickém zákroku.
1.3. MRI-SCAN ischemické mozkové léze
Všechny experimenty se prováděly za použití systému 4,7T BIOSPEC (BRUKER) (viz T. Back a kol., „Diffusion Nuclear Magnetic Resonance Imaging in Experimental Stroke: Correlation with Cerebral Metabolites, Stroke (únor 1994) 25: 494-500). Čtyřicet osm hodin po MCAO nebo kraniektomii bez kauterizace se každé zvíře podrobilo rychlému víceřezému TI vyváženému zobrazení (TR/TE), (500/25), čímž se určila přesná poloha. Potom se získaly obrazy T2-vyvážené množiny řezů (300/80) (5 po sobě jdoucích řezů o tloušťce 3 mm) .
Ke stanovení velikosti a závažnosti rozsahu infarktu se použila hyperintenzita, pozorovaná v T2 vyváženém MRI 4 8 hodin po okluzi nebo po kvazi zákroku u kontrolních zvířat. U každé skupiny krys se určovaly následující MRI parametry:
——— -—e-r—I-s chemická- p-1 o cha --(- v-mm2 jy---------------------d. Plocha ischemické hemisféry (v mmz);
e. Plocha neovlivněné hemisféry (v mm2) .
Použití přilehlých řezů umožnilo převést plošné jednotky na objemové jednotky jednoduchým vynásobením plochy šířkou řezu.
01-2762-97 Ce
100
1.4. Neurologické skóre
Neurologické skóre sestává ze součtu celé řady hodnocení pro posuzování specifických motorických aktivit u dané krysy. Stupnice hodnocení začíná od 0 (úplně normální krysy) a končí u 13 (zcela neschopné krysy). U většiny parametrů se při hodnocení používají pouze hodnoty 0 (normální) nebo 1 (neschopná); u dalších parametrů se používá postupné hodnocení. V rámci studie se použily následující testy:
Obecné pozorovací testy hypoaktivita, zklidnění, piloerekce
Motorický reflex
Krysy se zavěsily za ocas přibližně 15 cm nad podlahu. Normální krysy zaujaly polohu, při které se obě jejich přední končetiny natáhly směrem k podlaze a zadní nohy visely po straně trapézovým způsobem. MCAO způsobilo konzistentní flexi protilehlých končetin.
Motorická schopnost
Motorická schopnost se hodnotila na základě schopnosti krys udržet se na tyči o průměru 1 cm pomocí protilehlých končetin po dobu 5 až 15 sekund, pokud je krysa zavěšena na tyči za ramenní jamky.
01-2762-97 Če
101
Motorická koordinace
Normální krysy jsou schopny vyběhnout a seběhnout 5 cm široký trám, umístěný na mírném svahu. Chyba při přecházení trámu v některém směru znamená určitou motorickou nekoordinaci, nedostatek rovnováhy a slabost končetin.
Chůze
Schopnost krysy opět zaujmout normální polohu obou zadních protilehlých končetin, pokud jsou úmyslně vysunuty ze své přirozené polohy při stoji na tenkém trámu.
Rovnováha
Schopnost krysy zachytit se a udržet rovnováhu na úzkém trámu, širokém 2 cm.
Pohybová aktivita
Celkový pohyb během patnácti minut v automatizované aktivní kleci.
Hodnocení pro každý z výše uvedených parametrů je naznačeno v tabulce 20.
01-2762-97 Če
102
Tabulka 20
NEUROLOGICKÉ SKÓRE NAVRŽENÉ PRO KAŽDÝ Z DESETI PARAMETRŮ POSTOJE A POHYBU
Parametr Skóre
a. Aktivita v domácí kleci normální=0 hypoaktivní=l
b. Zklidnění žádné=0 zaznamenané=l
c. Piloerekce žádná=0 zaznamenaná=l
d. Extenze protilehlých předních dobrá=0 končetin krys směrem k , . , , w .
J ohnuté koncetiny=l podlaze, pokud.jsou zavěšeny za ocas __________ e.,..... Roztažení, .zadních, prot i lehlých, dobré=0_____,_____________ končetin krys, pokud jsou , . , , v . . i J ť J ohnuté koncetiny=l zavěšeny za ocas (trapezoidní držení těla)
01-2762-97 Če
103 pokračování
Parametr
f. Uchopení tyče protilehlými končetinami na dobu 5 až 15 sekund, pokud jsou krysy zavěšeny za .ramenní jamku
Skóre dobré=0 slabé=l
g. Chůze po trámu dobrá=0 špatná=l širokém 5 cm
h. Zaujmutí původní polohy protilehlých zadních nebo předních končetin krys, pokud jsou z této pozice záměrně vychýleny dobré=0 špatné =1 (jedna končetina) =2 (dvě končetiny)
i. Uchopení trámu a udrže- dobré=0 špatné=l lil-rovnováhy-na trámu“ — 7 ' širokém 2 cm .
j . Motorická aktivita krys v porovnání s kontrolními subjekty (15 minut v automatizované aktivní kleci) <25 % kontrolní3
26-50 % kontrolní2
51-75% kontrolní1
76-100 % kontrolní0
104
01-2762-97 Če
Výsledky
2.1. Rozsah infarktu
Výsledky MRI studii jsou shrnuty v tabulce 21 a znázorněny na. obrázku 20. Rozsah infarktu byl podstatně menší u krys ošetřených [R]( + )PAI mesylátem (n=9), než u neošetřených krys (n=10). v prvním případě představovala velikost infarktu přibližně 60 % velikosti infarktu u neošetřených krys. *
Tabulka 21
HODNOCENÍ ISCHEMICKÉ MOZKOVÉ LEZE MRI T2.-SCANEM 48 HODIN PO MCA-OKLUZI A OŠETŘENÍ KRYS WISTAR [R](+)PAI MESYLÁTEM
MCA-0 MCA-0 + [R] ( + )PAI mesylát*'
Zvíře č. Rozsah infarktu (mm3) Zvíře č. Rozsah infarktu (mm3)
1 252 1 . 94,4
2 272 2 139
3 314 3 240
4 273 4 137
' 5 ' 201 5 137
6 221 . 6 174
7 358 7 164
8 265 8 171
9 341 9 215
10 236
průměr ± SEM 273,3 ± 50,9 průměr ± SEM 163,5 ± 43,9 |
01-2762-97 Če
105 t = 5,0475 f = 17 p < 0,001
[R](+)PAI mesylát redukuje velikost infarktu o.40 %.
* [R](+)PAI mesylát se podával:
Čas po okluzi MCA:
θ -1,0 mg/kg ip;
hodiny -0,5 mg/kg ip;
hodin -1,0 mg/kg ip.
2.2. Neurologické skóre
Neurologické skóre bylo u pěti krys ošetřených [R](+)PAI mesylátem a šesti neošetřených krys určeno náhodně zvoleným pozorovatelem. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 22, ve které se porovnávají rozsahy infarktu u každého zvířete, zjištěné pomocí MRI testu, a rovněž jsou znázorněny na obrázku-21. Z výsledků vyplývá, že zvířata s minimálním neurologickým skóre jsou zvířata, která byla ošetřena [R](+)PAI mesylátem. Neurologické skóre se u MCAO zvířat, která byla ošetřena [R](+)PAI mesylátem v porovnání s neošetřenými zvířaty, snížilo o 54 % a rozsah infarktu o 36 %.
01-2762-97 Če
106
Tabulka 22
NEUROLOGICKÉ SKÓRE KRYS, KTERÉ PODSTOUPILY MCA OKLUZI A OŠETŘENÍ [R](+)PAI MESYLÁTEM, VE VZTAHU K ROZSAHU ISCHEMICKÉHO INFARKTU, KTERÝ U NICH BYL ZJIŠTĚN
MCA-O MCA-0 + [R](+)PAI mesylát***
Zvíře č. Neurologické * skóre Rozsah infarktu ** (mm3) Zvíře č. Neurologické * skóre Rozsah infarktu ** (im3)
1 5, 0 201 1 1,0 137
2 5, 0 221 2 2,0 174
3 6,0 358 3 4,0 164
4 6,0 265 4 4,0 . 171
5 8,25 341 5 2, 88 215
6 5, 75 236
Průměr ± SEM 6,0±l,19 270±65 Průměr ± SEM 2,78±1,3 172±28
Neurologické skóre Rozsah infarktu t = 4,25 t =3,34 f = 9 f =9
P < p <0,01
[R](+)PAI mesylát redukuje neurologické skóre o 53,7 % a rozsah infarktu o 36,3 %,
Zjištěno 24 hodin po MCA-okluzi ** Vyhodnoceno MRI T2-SCANnem 48 hodin po MCA-okluzi
01-2762-97 Če
107 *** [R] ( + ) PAI mesylát byl podán:
Čas po MCA-okluzi: 7
-1,0 mg/kg ip;
hodiny -0,5 mg/kg ip;
hodin -1,0 mg/kg ip.
Reference k příkladu 38
Cechetto DF, Wilson JX, Smith KE, Wolski D, Silver MD, Hachinski VC (1989). Autonomie and myocardial changes in middle cerebral artery occlusion: stroke models in the rat. Brain Res 502:296-305.
Kolb B, Sutherland RJ, Whishaw IQ (1983). A comparison of the contributions of the frontal and parietal association cortex to spatial localizations in the rat. Behav. Neurosci. 97:13-27.
Menzies SA, Hoff JT, Betz AL (1992). Middle cerebral artery occlusion in rats: A neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery 31:100106.
Sauer D, Allegrini PR, Conseti A, Pataki A, Amaceker H, Fagg GE (1993) . Characterization of the cerebroprotective efficacy of the competitive NMDA receptor antagonist CGP40116 in a rat model of focal cerebral ischemia: An in vivo magnetic resonance imaging study. J. Cerebr. Blood Flow and Metabol. 13:595-602.
01-2762-97 Če
108
Stephanovich C, Editor, Stroke: Animal Models, Pergamon Press, 1983.
Tamura A, Graham DI, McCulloch J, Teasdale GH (1981). Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following MCA occlusion. J. Cereb. Blood Flow and Metab. 1:53-60.
Teasdale G, Tyson g, Tamura A, Graham DI, McCulloch J. Focal cerebral ischaemia in the rat: Neuropathology, local cerebral blood flow and cerebrovascular permeability. In Stroke: Animal Models, Stephanovic C, Editor, Pergamon Press 1983, str. 83-97.
Yamamoto M, Tamura A, Kirino T, Shimitzu M, Sano K, (1988). Behavioral changes'after focal cerebral ischemia by left middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Re. 452:323-328.
Yamori Y a koi. (1976). Pathogenic similarity of strokes.in stroke prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke 7:46-53.
Young W, DeCrescito V, Flamm ES, Hadani M, Rappaport ---Ht-Cornu_P_.(.1.98.6)_ .—Tissue-Na,.—Κ,-and-Ca— changes ·.in^regional— cerebral ischemia: Their measurement and interpretation. Central Nervous System Trauma, 3:215-234. '

Claims (41)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY ř
    1. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice určené pro lečem mozkové ischemie nebo mrtvice u subjektu.
  2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že se farmaceuticky přijatelná sůl R(+)-Npropargyl-1-aminoindanu zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou solí; ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a hydrochloridovou solí.
  3. 3. Použití podle nároku 2, vyznačené tím, že farmaceuticky přijatelnou solí je mesylátová sůl R (+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
  4. 4. Použití podle nároku _1,v y z n a č _e_ _n_ é tím, že účinným množstvím R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, které má být podáno, je přibližně 0,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu až 2,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu.
    01-2762-97
    110
  5. 5. Použiti podle nároku 1, vyznačené t i m , že se R( + ) -N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně, orálně, rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
  6. 6. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že subjektem je člověk a účinným množstvím je přibližně 0,01 mg až 50,0 mg na den.
  7. 7. Použití podle nároku 6, vyznačené tím, že účinným množstvím je 0,1 až 10,0 mg na den.
  8. 8. Použití podle nároku 6, vyznačené tím, že se R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně.
  9. 9. Použití podle nároku 1, vyznačené tím, že při léčení mozkové ischemie nebo mrtvice se plďČHa'mozkové~íšcherníF’ redukuje~přibližně 7Γ ů5 ”procent.
  10. 10. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice určené pro léčení traumatického poškození hlavy.
    01-2762-97
    111
  11. 11. Použiti podle nároku 10, vyznačené t i m , že farmaceuticky přijatelná sůl R(+)-N-propargyl/ 1-aminoindanu se zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou / / solí; ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a / hydrochloridovou solí.
  12. 12. Použití podle nároku 11, vyznačené tím, že farmaceuticky přijatelnou solí je mesylátová sůl R( + )-N-propargyl-l-aminoindanu.
  13. 13. Použití podle nároku 10, vyznačené tím, že účinným množstvím R(+)-N-propargyl-1aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, které má být podáno, je přibližně 0,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu -až 2,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu.
  14. 14. Použití podle nároku 10, vyznačené tím, že se R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho - farmaceuticky—přijatelná— sůl— podává— intravenózně;—orálně'— rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
  15. 15. Použití podle nároku 10, vyznačené tím, že subjektem je člověk a účinným množstvím je přibližně 0,01 mg až 50,0 mg na den.
    01-2762-97
    112
  16. 16. Použití podle nároku 15, vyznačen 'é tím, že účinným množstvím je 0,1 až 10,0 mg na den.
    '// Ϋ z
  17. 17. Použití podle nároku 15, vyznačené tím, že se R( + )-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně.
  18. 18. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice určené pro léčení traumatického poškození míchy.
  19. 19. Použiti podle nároku 18, vyznačené tím, že farmaceuticky přijatelná sůl R(+)-N-propargyll-aminoindanu se zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou solí; ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a hydrochloridovou solí.
  20. 20. Použití podle nároku 19, vyznačené ”ť~í~m’ , “žě“farmaceuticky při”jatalnou~soBT^^mesy látová ’ sůl R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
  21. 21. Použití podle nároku 18, vyznačené tím, že účinným' množstvím R(+)-N-propargyl-laminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, které má být podáno, je přibližně 0,5 miligramů na kilogram
    01-2762-97
    113
    tělesné hmotnosti subjektu až 2,5 tělesné hmotnosti subjektu.
    miligramů na kilogram
  22. 22. Použití podle nároku 18, vyznačené tím, že se R( + ) -N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně, orálně, rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
  23. 23. Použití podle nároku 18, vyznačené tím, že subjektem je člověk a účinným množstvím je přibližně 0,01 mg až 50,0 mg na den.
  24. 24. Použití podle nároku 23, vyznačené tím, že účinným množstvím je 0,1 až 10,0 mg na den.
  25. 25. Použití podle nároku 23, vyznačené tím, že se R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně.
  26. 26. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné - soli pro výrobu farmaceutické kompozice určené pro léčení neurotraumatu.
  27. 27. Použití podle nároku 26, vyznačené tím, že farmaceuticky přijatelná sůl R( + )-N-propargyl-
    01-2762-97
    114
    / 1-aminoindanu se zvolí ze skupiny tvořené: mesylátovou solí; ethylsulfonátovou solí; sulfátovou solí; a hydrochloridovou solí.
  28. 28. Použití podle nároku 27, vyznačené t i m , že farmaceuticky přijatelnou solí je mesylátová sůl R{+)-N-propargyl-l-aminoindanu.
  29. 29. Použití podle nároku 26, vyznačené tím, že účinným množstvím R(+)-N-propargyl-laminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, které má být podáno, je přibližně 0,5 miligramů na kilogram tělesné hmotnosti subjektu až 2,5 miligramů, na kilogram tělesné hmotnosti subjektu.
  30. 30. Použití podle nároku 26, vyznačené tím, že se R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně, orálně, rektálně, transdermálně nebo parenterálně.
  31. 31. Použití podle nároku 26, vyznačen· é tím, že subjektem je člověk a účinným množstvím je přibližně 0,01 mg až 50,0 mg na den.
  32. 32. Použití podle nároku 31, vyznačené tím, že účinným množstvím je 0,1 až 10,0 mg na den. ’
    01-2762-97 • ···· ί · · · · · · * · · ♦ ·· ····«· a·* · * * # ♦ · · · ·
    Φ a1 ·· ·· « «· «
    115
  33. 33. Použití podle nároku 31, vyznačené tím, že se R(+)-N-propargyl-l-aminoindan nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl podává intravenózně.
  34. 34. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice účinné pro léčení neurodegenerativní choroby.
  35. 35. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho .farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice účinné pro léčení neurotoxického poškození.
  36. 36. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice účinné pro léčení mozkové ischemie.
  37. 37. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické komp^zioTucTnhe’^o’Tecl^T’tTaum^'ffi
  38. 38. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice účinné pro léčení traumatického poškození míchy.
    01-2762-97
    116
  39. 39. Použití R(+)-N-propargyl-l-aminoindanu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutické kompozice účinné pro zabráněni nervovému poškození.
  40. 40. Použití podle nároku 39, vyznačené tím, že nervovým poškozením je poškození struktury zrakového nervu.
  41. 41. Použití podle nároku 39, vyznačené tím, že poškozením struktury nervu je poškození zrakového nervu.
CZ19993699A 1997-04-22 1998-04-21 Substituované fenylderiváty, způsob jejich přípravy a použití a farmaceutické přípravky s jejich obsahem CZ295822B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK45297 1997-04-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ369999A3 true CZ369999A3 (cs) 2000-02-16
CZ295822B6 CZ295822B6 (cs) 2005-11-16

Family

ID=8093724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19993699A CZ295822B6 (cs) 1997-04-22 1998-04-21 Substituované fenylderiváty, způsob jejich přípravy a použití a farmaceutické přípravky s jejich obsahem

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6297261B1 (cs)
EP (1) EP0977741B1 (cs)
JP (1) JP2001521532A (cs)
CN (1) CN1118462C (cs)
AT (1) ATE248824T1 (cs)
AU (1) AU728520B2 (cs)
BR (1) BR9808938A (cs)
CA (1) CA2285424A1 (cs)
CZ (1) CZ295822B6 (cs)
DE (1) DE69817802T2 (cs)
DK (1) DK0977741T3 (cs)
ES (1) ES2205472T3 (cs)
IL (1) IL132107A (cs)
NZ (1) NZ337976A (cs)
PT (1) PT977741E (cs)
RU (1) RU2197482C2 (cs)
SK (1) SK282818B6 (cs)
TR (1) TR199902593T2 (cs)
WO (1) WO1998047879A1 (cs)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6696475B2 (en) 1997-04-22 2004-02-24 Neurosearch A/S Substituted phenyl derivatives, their preparation and use
ATE291011T1 (de) * 1997-12-22 2005-04-15 Bayer Pharmaceuticals Corp Hemmung der raf-kinase unter verwendung von symmetrisch und unsymmetrisch substituierten harnstoffen
EP1514867A3 (en) * 1998-10-22 2005-03-23 NeuroSearch A/S Substituted phenyl derivatives, their preparation and use
US20050080112A1 (en) * 2001-06-22 2005-04-14 Madsen Lars Siim Compounds for use in disorders associated with mast cell or basophil acitvity
US7087631B2 (en) * 2002-07-18 2006-08-08 Inotek Pharmaceuticals Corporation Aryltetrazole compounds, and compositions thereof
US7078423B2 (en) * 2002-07-18 2006-07-18 Inotek Pharmaceuticals Corporation 5-Aryltetrazole compounds, compositions thereof, and uses therefor
CA2493253A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-12 Neurosearch A/S Compounds useful for the treatment of diseases responsive to antiangiogenetic therapy
CA2495284A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Neurosearch A/S Diarylurea derivatives and their use as chloride channel blockers
AU2003258491A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-29 Neurosearch A/S Amide derivatives and their use as chloride channel blockers
WO2004033632A2 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Hydantoin derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases and/or tnf-alpha converting enzyme (tace)
US7521480B2 (en) 2002-11-21 2009-04-21 Neurosearch Aryl ureido benzoic acid derivatives and their use
WO2004058722A1 (en) * 2002-12-24 2004-07-15 Arena Pharmaceuticals, Inc. Diarylamine and arylheteroarylamine pyrazole derivatives as modulators of 5ht2a
CN1805942B (zh) * 2003-06-17 2010-06-02 神经研究公司 二苯基脲衍生物及其作为氯离子通道阻断剂的用途
NZ544331A (en) 2003-07-22 2010-03-26 Arena Pharm Inc Diaryl and arylheteroaryl urea derivatives as modulators of the 5-HT2A serotonin receptor useful for the prophylaxis and treatment of disorders related thereto
US7202363B2 (en) 2003-07-24 2007-04-10 Abbott Laboratories Thienopyridine and furopyridine kinase inhibitors
CN1845726A (zh) * 2003-09-04 2006-10-11 波塞东医药公司 用于治疗心脏心律失常的erg通道开放剂
WO2005023238A1 (en) * 2003-09-04 2005-03-17 Poseidon Pharmaceuticals A/S Erg channel openers for the treatment of hyperexcitability-related neuronal diseases
EP1678123A1 (en) * 2003-10-15 2006-07-12 Bayer HealthCare AG Tetrahydro-naphthalene and urea derivatives
WO2005087236A1 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 Glaxo Group Limited Novel m3 muscarinic acetylcholine receptor antagonists
CN1926114B (zh) * 2004-03-23 2011-08-24 艾尼纳制药公司 用于制备经取代n-芳基-n′-′3-(1h-吡唑-5-基)苯基脲及其中间体的方法
PE20061130A1 (es) * 2004-11-19 2007-01-05 Arena Pharm Inc Derivados de 3-fenil-pirazol como moduladores del receptor de serotonina 5-ht2a
CA2592118C (en) * 2004-12-23 2015-11-17 Deciphera Pharmaceuticals, Llc Urea derivatives as enzyme modulators
EP2027119A2 (en) * 2006-05-18 2009-02-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Ethers, secondary amines and derivatives thereof as modulators of the 5-ht2a serotonin receptor useful for the treatment of disorders related thereto
US8148417B2 (en) * 2006-05-18 2012-04-03 Arena Pharmaceuticals, Inc. Primary amines and derivatives thereof as modulators of the 5-HT2A serotonin receptor useful for the treatment of disorders related thereto
NZ571829A (en) 2006-05-18 2011-10-28 Arena Pharm Inc Crystalline forms and processes for the preparation of phenyl-pyrazoles useful as modulators of the 5-HT2A serotonin receptor
TWI415845B (zh) 2006-10-03 2013-11-21 Arena Pharm Inc 用於治療與５-ｈｔ2ａ血清素受體相關聯病症之作為５-ｈｔ2ａ血清素受體之調節劑的吡唑衍生物
US7790756B2 (en) * 2006-10-11 2010-09-07 Deciphera Pharmaceuticals, Llc Kinase inhibitors useful for the treatment of myleoproliferative diseases and other proliferative diseases
EP2152677A1 (en) 2007-05-03 2010-02-17 NeuroSearch A/S Acetamide derivatives as potassium channel modulators
ES2421237T7 (es) 2007-08-15 2013-09-30 Arena Pharmaceuticals, Inc. Derivados de imidazo[1,2-a]piridin como moduladores del receptor serotoninérgico 5ht2a en el tratamiento de trastornos relacionados con el mismo
WO2009123714A2 (en) * 2008-04-02 2009-10-08 Arena Pharmaceuticals, Inc. Processes for the preparation of pyrazole derivatives useful as modulators of the 5-ht2a serotonin receptor
US9126946B2 (en) 2008-10-28 2015-09-08 Arena Pharmaceuticals, Inc. Processes useful for the preparation of 1-[3-(4-bromo-2-methyl-2H-pyrazol-3-yl)-4-methoxy-phenyl]-3-(2,4-difluoro-phenyl)urea and crystalline forms related thereto
TR201805216T4 (en) 2008-10-28 2018-06-21 Arena Pharm Inc COMPOSITIONS OF A USEFUL 5-HT2A SEROTONINE RECEPTOR MODULATOR FOR THE TREATMENT OF RELATED DISORDERS
KR101639642B1 (ko) 2008-12-05 2016-07-14 애브비 바하마스 리미티드 암 치료에 사용하기 위한 키나제 억제제로서의 티에노［3,2-ｃ］피리딘 유도체
US8980891B2 (en) 2009-12-18 2015-03-17 Arena Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of certain 3-phenyl-pyrazole derivatives as modulators of the 5-HT2A serotonin receptor useful for the treatment of disorders related thereto
US8436179B2 (en) 2011-07-20 2013-05-07 Abbvie Inc. Kinase inhibitor with improved solubility profile
CN103709185A (zh) * 2013-12-30 2014-04-09 大连联化医药技术有限公司 一种4-(n-甲基甲酰氨)苯基硼酸的制备方法
JP2018516992A (ja) 2015-06-12 2018-06-28 アクソファント サイエンシーズ ゲーエムベーハーＡｘｏｖａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇｍｂｈ レム睡眠行動障害の予防および処置のために有用なジアリールおよびアリールヘテロアリール尿素誘導体
CN108472285A (zh) 2015-07-15 2018-08-31 阿速万科学有限责任公司 用于预防和治疗与神经退行性疾病相关联的幻觉的二芳基和芳基杂芳基脲衍生物
ES2770374T3 (es) 2016-05-17 2020-07-01 Scandion Oncology As Tratamiento combinado de cáncer
AU2018300150A1 (en) 2017-07-11 2020-01-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carboxamides as modulators of sodium channels
WO2020146612A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Esters and carbamates as modulators of sodium channels
WO2020146682A1 (en) 2019-01-10 2020-07-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carboxamides as modulators of sodium channels
CN117229258B (zh) * 2022-06-07 2024-07-19 杭州壹瑞医药科技有限公司 N-四唑基芳基脲类衍生物及其制备方法和应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3682136D1 (de) 1985-07-31 1991-11-28 Hoechst Ag N-substituierte 5-nitroanthranilsaeuren, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung sowie pharmazeutische praeparate auf basis dieser verbindungen.
US4889612A (en) 1987-05-22 1989-12-26 Abbott Laboratories Ion-selective electrode having a non-metal sensing element
US5489612A (en) 1991-08-23 1996-02-06 The University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Calixarene chloride-channel blockers
US5273992A (en) 1992-11-02 1993-12-28 Beth Israel Hospital Assoc. Inc. Method for reducing sickle erythrocyte dehydration and delaying the occurrence of erythrocyte sickling in-situ
DK41193D0 (da) 1993-04-07 1993-04-07 Neurosearch As Ionkanalaabnere
US5362744A (en) * 1993-11-22 1994-11-08 Warner-Lambert Company Tetrazole-substituted urea acat inhibitors
US5559151A (en) 1994-11-30 1996-09-24 Allergan Method for reducing intraocular pressure in the mammalian eye by administration of chloride channel blockers
WO1997045111A1 (en) 1996-05-24 1997-12-04 Neurosearch A/S Phenyl derivatives useful as blockers of chloride channels
EP0906273B1 (en) 1996-05-24 2002-10-16 Neurosearch A/S Phenyl derivatives containing an acidic group, their preparation and their use as chloride channel blockers

Also Published As

Publication number Publication date
NZ337976A (en) 2001-05-25
CA2285424A1 (en) 1998-10-29
CN1118462C (zh) 2003-08-20
EP0977741A1 (en) 2000-02-09
CZ295822B6 (cs) 2005-11-16
DE69817802T2 (de) 2004-04-08
TR199902593T2 (xx) 2000-03-21
BR9808938A (pt) 2000-08-01
DE69817802D1 (de) 2003-10-09
CN1253553A (zh) 2000-05-17
ATE248824T1 (de) 2003-09-15
RU2197482C2 (ru) 2003-01-27
US6297261B1 (en) 2001-10-02
JP2001521532A (ja) 2001-11-06
HK1026909A1 (en) 2000-12-29
SK282818B6 (sk) 2002-12-03
WO1998047879A1 (en) 1998-10-29
PT977741E (pt) 2004-01-30
IL132107A (en) 2004-09-27
EP0977741B1 (en) 2003-09-03
SK144799A3 (en) 2000-05-16
ES2205472T3 (es) 2004-05-01
IL132107A0 (en) 2001-03-19
AU6919698A (en) 1998-11-13
AU728520B2 (en) 2001-01-11
DK0977741T3 (da) 2003-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6297261B1 (en) Substituted phenyl derivatives, their preparation and use
JP3960754B2 (ja) 置換されたフェニル誘導体、その製造方法及びその使用方法
US6696475B2 (en) Substituted phenyl derivatives, their preparation and use
JP4073489B2 (ja) 酸性基を有するフエニル誘導体、その製造方法及びそれをクロライドチャンネル遮断剤として使用する方法
JP3040485B2 (ja) ベンズイミダゾール化合物、およびｇａｂａａレセプター複合体モジュレーターとしてのその使用
KR100283363B1 (ko) 벤즈이미다졸 화합물 및 감마-아미노부틸산 수용체 복합체의 조절인자로 그들의 용도
WO1997045111A1 (en) Phenyl derivatives useful as blockers of chloride channels
EP1117633B1 (en) Diaminocyclobutene-3,4-dione derivatives, their preparation and use
CZ20011020A3 (cs) Substituované fenylové deriváty, způsob jejich přípravy a jejich použití

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090421