CZ372297A3

CZ372297A3 - Přepínání genové exprese využívající receptoru pro ekdyson

Info

Publication number: CZ372297A3
Application number: CZ973722A
Authority: CZ
Inventors: Ian Jepson; Alberto Martinez; Andrew James Greenland
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-20
Publication date: 1998-03-18
Also published as: NO975419D0; TR199701436T1; JPH11506319A; AR006513A1; NZ308162A; RU97121687A; AU5771696A; PL323587A1; HUP9802225A2; BG102124A; CN1191568A; US6379945B1; MX9709156A; AU711391B2; EP0828829A1; TR200003861T2; HUP9802225A3; CA2219121A1; NO975419L; WO1996037609A1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká identifikace a charakterizace hmyzích steroidních receptoru z motýlů druhu Heliothis virescens a nukleových kyselin, které je kódují. Vynález také popisuje použití těchto receptoru a těchto nukleových kyselin pro způsoby selekce a přepínaní genové exprese.

Výrazem přepínač genové exprese (gene switch) míníme sekvenci genu citlivou na aplikaci exogenního induktoru umožňující externí kontrolu exprese genu, který je touto genovou sekvencí řízen (kontrolován).

Dosavadní stav techniky

Lipofilní hormony, jako jsou steroidy, indukují změny v genové expresi a tak zásadně ovlivňují růst, buněčnou diferenciaci a homeostázu. Tyto hormony rozpoznávají intracelulární receptory, které mají společnou modulární strukturu sestávající ze tří hlavních funkčních domén: variabilní aminokoncové oblasti, která obsahuje transaktivační doménu, dále vazebné domény pro DNA a vazebné domény pro ligand na karboxylovém konci řetězce molekuly. DNA vazná doména obsahuje devět invariantních cysteinů z nichž osm je koordinovaných se zinkem a vytvářejí two-finger strukturu. V jádře se hormon-receptorový komplex váže na specifický zesilovač, takovéto sekvence jsou zvané responzivní elementy pro hormony (hormon response elements, HREs) a tak moduluje transkripci cílových genů.

Oblast výzkumu hmyzích steroidních hormonů prodělala v uplynulých třech letech revoluci, jejímž výsledkem je klonování a předběžná chrakterizace prvního steroidního receptoru těchto genů. Tyto pokroky naznačují, že nadešel • · • ·

čas využiti těchto znalostí ke zlepšení našich prostředků v neustálém boji proti hmyzím škůdcům. Většina výzkumu v této oblasti se provádí pomocí metod molekulární biologie na nadrodině steroidních receptorů pocházejících z octomilky (Drosophila melanogaster, Dvoukřídlí), viz Patentová Publikace č. WO91/13167,kde je proveden obdobný výzkum u lyšaje (Manduca) a zaviječe (Galleria) (Motýli).

Uplynulo již třicet izolován 20-hydroxyekdyson let od doby, kdy byl poprvé a kdy bylo prokázáno, že je zapojen do regulace mnoho práce pro hydrofobní molekuly sedmdesátých let, j asné,

Drosophily, vede aktivaci více než vývoje hmyzu. Od té doby bylo provedeno obj asnění reguluj í bylo ze že alespoň ve slinných aplikace stovky dvou skupin genů:

tyto malé Na počátku Ashburnera zapojen do regulace cesty, kterou velký počet dějů.

studií Clevera a žlázách třetího instaru larvy ekdysonu k reproducibilní genů. Ekdyzonový receptor je malé skupiny (časné geny), které jsou indukovány ekdyzonovým receptorem a velké třídy (pozdní geny), které jsou represovány ekdyzonovým receptorem. Předpokládá se, že skupina časných genů má dvě reciproční funkce k ekdyzonovému receptoru, represi časných transkriptů a indukci transkripce pozdních genů. Zdá se, že členové skupiny časných genů patří do skupiny molekul s charakteristikami podobnými známým transkripčním faktorům.

Předpokládá se, že se chovají tak, jak se očekává u modelu působení ekdyzonu (Ashburner, 1991). Dříve bylo ukázáno, že časné geny E74 a E75 vážou oba typy genů indukovaných ekdyzonem (Thummel a další, 1992,Segraves a Hogness, 1991), což podporuje jejich navrhovanou dvojí aktivitu. Avšak mělo by se poznamenat, že aktivace posloupnosti genů není omezena na slinné žlázy ve třetím larválním stadiu, ale že odpověď na ekdyzonový vrchol na konci larválního stadia lze sledovat v mnoha dalších pletivech, jako jsou imaginální terčíky (to znamená ta pletiva, která se přeměňují do dospělých struktur) a u dalších larválních pletiv, která histolysují na konci larválního života (například larvální • · • · tukové těleso). Model pro působení ekdyzonu, tak jak je odvozen ze studia chromozomového puffingu třetího larválního instaru, není možno aplikovat na aktivaci genů regulovaných ekdyzonem v dospělosti. Jinými slovy, pro správnou vývojovou expresi musí být splněn další požadavek na další dodatečné faktory nutné pro aktivaci ekdyzonového receptoru (například genová exprese žloutkoveho proteinu u dospělců Drosophily je pod kontrolou genu doublesex, posledním genem v genové posloupnosti sexuální determinace).

Ekdyzonový receptor a časný gen E75 patří do nadrodiny steroidních receptorů. Dalšími členy této rodiny jsou u Drosophily, například geny ultraspiracle, tailess, sevenup a FTZ-F1. Ze všech těchto genů jen u ekdyzonového receptoru je známo, že má ligand, ostatní jsou známy jako takzvané sirotčí receptory. Je zajímavé, že navzdory tomu, že vazebná oblast proligand proteinu ultraspiracle vykazuje 49% identity s vazebnou oblastí X receptoru pro kyselinu retinovou obratlovců (RXR) (Oro a další, 1990), nesdílejí stejný ligand (ligandem RXR je 9-cis retinová kyselina, Heymann a další, 1992 a Mangelsdorf a další, 1992). Všechny zmíněné geny Drosophily jsou zapojeny do vývoje, například ultraspiracle je nutný pro embryonální a larvální abdominální vývoj. Všechny bílkovinné produkty těchto genů splňují hlavní rysy nadrodiny steroidních receptorů (Evans, 1988,Green a Chambon, 1988,Beato, 1989), to znamená, že mají proměnnou N-koncovou oblast účastnící se transaktivace nezávisle na ligandu (domény A a B) , vysoce konzervovanou oblast 66 až 68 aminokyselin, která je odpovědná za vazbu DNA na specifická místa (doména C) , pantovou oblast, o které se předpokládá, že obsahuje signál jaderné translokace (doména D) a dobře konzervovanou oblast obsahující vazebnou oblast pro ligand, transaktivační sekvence a dimerizační fázi • · • · • · · · • · ·

F, je také byla objasněna jak na buněčné, velmi velmi tak na

-4• (doména Ε). Poslední oblast, domt variabilní a její funkce není známa.

Funkce steroidních receptorů podrobně pro systém obratlovců, a tc molekulární úrovni. Za nepřítomnosti ligandů je receptorová molekula situována v cytoplasmě, kde se váže na Hsp90 a p59,a tam vytváří neaktivní komplex (Evans, 1988). Po vazbě molekuly ligandu na receptor se uskuteční konformační změny, které uvolní molekuly Hsp92,Hsp70 a p59,a tak se vytvoří jaderný translokační signál na receptorů. Ligandově závislé konformační změny je možno vidět ve vazebné doméně pro ligand jak receptorů pro progesteron tak i u receptorů pro retinovou kyselinu (Allan a další, 1992a). Tyto konformační změny byly dále charakterizovány v progesteronovém receptorů a byly shledány nepostradatelnými pro genovou transaktivaci (Allan a další, 1992b). Uvnitř jádra se receptorový dimer váže k responzivním elementům pro daný repceptor na specifické místo DNA, výsledkem čehož je aktivace či represe cílového genu. Responzivní elementy se obvykle skládají z degenerovaných přímých repeticí se spojením mezi l.a 5. nukleotidem, které jsou vázány receptorovým dimerem přes vazebnou doménu pro DNA (doména C) .

Zatímco některé receptory pro steroidní hormony jsou aktivní jako homodimery, ostatní jsou účinné jako heterodimery. Například, u obratlovců, receptor pro kyselinu retinovou (RAR) tvoří heterodimer s X receptorem pro kyselinu retinovou (RXR) . RXR muže také tvořit heterodimery s thyroidním receptorem, receptorem pro vitamin D (Yu a další, 1991,Leid a další, 1992) a aktivátorovým receptorem pro peroxizomy (Kliewer a další, 1992) . Funkčně je hlavní rozdíl mezi homodimery a heterodimery ve zvýšení specificity vazby ke specifickým citlivým elementům. Toto indikuje možné propojení různých cest, které mohou být koordinovány a modulovány, a co více,

-5a · · · · • · β · tato pozorování začínají vysvětlovat molekulární základy pleotropní aktivity kyseliny retinové ve vývoji obratlovců (Leid a další, 1992b). Podobně bylo dříve dokázáno, že ultraspiracle genový produkt u Drosophily je schopen tvořit heterodimery s kyselinou retinovou, thyroidem, vitamínem D a receptory peroxisomového aktivátoru a stimulovat vazbu těchto receptoru na jejich citlivé cílové elementy (Yao a další, 1993) .

Ještě průkazněji bylo dokázáno, ultraspiracle tvoří heterodimery že produkt genu s ekdyzonovým receptorem, ústící v kooperetivní vazbu na ekdyzonový responzivní element a je schopný učinit savčí buňky citlivé k ekdyzonu (Yao a další, 1992). To je velmi důležité, protože transaktivace ekdyzonového genu samotného nevede v savčích buňkách k vyvolání citlivosti na ekdyzon (Koelle a další, 1991), a proto se zdá, že ultraspiráklový genový produkt je integrální součástí funkčního receptoru pro ekdyzon (Yao a další, 1992) . Je možné, že ultraspiráklový produkt soutěží s dalšími steroidními receptory a faktory o vytvoření heterodimeru s ekdyzonovým receptorem. Na další objasnění ale čeká, zda se protein ultraspiracle exprimuje ve ve všech pletivech larev octomilek Drosophila. Navzdory tomu, že protein ultraspiracle je nutný pro tvorbu funkčního ekdyzonového receptoru, mechanismus této aktivace je doposud neznámý.

Byl vyizolován a charakterizován steroidní receptor pro ekdyzon z motýlů druhu Heliothis virescens (dále HEcR). Bylo nalezeno, že na rozdíl od steroidního receptoru pro ekdyzon u Drosophily (dále DEcR), jak bylo míněno doposud, HEcR muže být indukován známými nesteroidními induktory. To poskytuje tomuto systému mnohé výhody.

Výroba steroidů je obtížná a nákladná. Použití nesteroidních induktorů dovoluje využít tento systém pro agrochemické a farmaceutické aplikace, a tím se vyhnout aplikaci steroidů, které jsou již u hmyzu nebo u savců

-6přítomny. Například, nelze používat přepínač genové exprese u savčích buněk, který by byl indukován přirozeně se vyskytujícím steroidním induktorem. Z důvodu ochrany životního prostředí je rovněž výhodné vyhnout se použití steroidů jako induktoru.

Vynález se týká DNA obsahující sekvenci uvedenou v Sekvenci id.č.: 2, která kóduje vazebnou doménu pro ligand pro HEcR.

Dále vynález popisuje DNA obsahující část sekvence podle Sekvence id.č.: 2, která kóduje transaktivační doménu pro HEcR.

Vynález dále popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 2, která kóduje HEcR pantovou doménu.

Vynález dále popisuje DNA obsahující část sekvence uvedenou v Sekvenci id.č.: 2, která kóduje HEcR C-koncovou oblast.

Vynález se také týká DNA obsahující sekvenci uvedenou v Sekvenci id. č.:3,kde Sekvence id.č.:3 udává sekvenci HEcR.

Vynález popisuje DNA obsahující část sekvence ukázané v Sekvenci id.č.: 3,která kóduje HEcR vazebnou doménu pro ligand.

Vynález dále popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvence id.č.: 3,která kóduje HEcR DNA vazebnou doménu.

Dále vynález popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 3,která kóduje HEcR transaktivační doménu.

• ·

Dále vynález popisuje DNA obsahující část sekvence ukázané v Sekvenci id.č.: 3,která kóduje pantovou oblast

HEcR.

Vynález se týká DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 3,která kóduje C-koncovou oblast HEcR.

Vynález rovněž popisuje DNA obsahující sekveci uvedenou v Sekvenci id. č.: . 4,kde Sekvence id.č.: 4 udává sekvenci HEcR.

Vynález se dále týká DNA obsahující část sekvence uká-zané v Sekvenci id.č.: 4, která kóduje HEcR vazebnou doménu pro ligand.

Vynález rovněž popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvence id.č.: 4,která kóduje HEcR vazebnou doménu pro DNA

Dále vynález popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 4,která kóduje transaktivační doménu HEcR.

Vynález rovněž popisuje DNA obsahující část sekvence ukázané v Sekvenci id. č.: 4,která kóduje pantovou oblast HEcR

Vynález rovněž popisuje DNA obsahující část sekvence uvedené v Sekvenci id. č.: 4,která kóduje C-koncovou oblast HEcR.

Jak je uvedeno výše, steroidní receptory jsou eukaryotické transkripční regulátorové faktory, které jsou citlivé na vazbu steroidních hormonů, uvažuje se, že vážou specifické elementy DNA a aktivují transkripci. Steroidní receptor může být rozdělen na šest oblastí, označovaných A až F, a to pomocí srovnávacích technik založených na sdílené homologii s dalšími členy nadrodiny steroidních hormonových receptorů. Kruest a další identifikovali dvě hlavní oblasti receptorů, C a E. Oblast C je hydrofilní a

-8a argininu. To zmiňované jako lysinu někdy má neobvykle vysoký obsah cysteinu, odpovídá vazebné doméně pro DNA, zinkový prst. Je to vazebná oblast, která se váže na DNA proti směru transkripce od citlivého genu.

Takováto sekvence nacházející se proti směru transkripce DNA od počátku genu je známa jako responzivní element hormonu, nebo zkráceně HRE.

Oblast E je hydrofobní a je identifikována jako vazebná doména pro hormon (nebo ligand). Oblast E může být dále rozdělena do oblastí E1,E2 a E3.

Oblast D, která odděluje oblasti C a E je vysoce hydrofobní a ohebná. Uvažuje se, že komunikace mezi oblastmi E a C se děje jejich přímým kontaktem přes oblast D, která tvoří pant mezi těmito dvěma doménami. Oblast D je proto nazývána jako pantová oblast.

Je zřejmé, že funkce receptoru vyžaduje spojení s některým elementem (elementy) transkripčního mechanismu a pomocí těchto interakcí dochází k reakci s hormonem a příslušným responzivním elementem. N-koncové části A a B splňují tyto funkce a jsou společně známy jako transaktivační doména. C koncová část je označena F.

Hranice domén HEcR mohou být definovány následovně:

Doména	Intervaly
v párech baží	v aminokyselinách
transaktivační (A/B)	114-600	1-162
DNA vazebná (C)	601-798	163-228
pantová (D)	799-1091	229-326
ligand vazebná (E)	1092-1757	327-545
C-koncová (F)	1758-1844	546-577

DNA vazebná doména je velmi dobře definovaná, je 66 aminokyselinových zbytků dlouhá a poskytuje tudíž dobré ohraničení. Výše zmíněné intervaly byly definovány použitím • · • · ·

metody mnohonásobného srovnání různých receptoru pro ekdyzon (Obrázek 5).

Vynález také popisuje DNA, která je homologní se sekvencemi ve vynálezu uvedenými. Za typickou považujeme homologii, kdy 60 % nebo více nukleotidů je společných, typičtější homologie je při 65%, výhodná při 70%, výhodnější při 75 %, ještě výhodnější při 80% nebo 85%, zvláště výhodné jsou při 90%, 95%, 98% nebo 99% nebo ještě více homologní.

Vynález též popisuje DNA, která hybridizuje s DNA podle vynálezu a která kóduje přinejmenším část transaktivační receptorové domény pro ekdyzon u Heliothis, DNA vazebnou doménu, pantovou doménu, ligand vazebnou doménu a nebo C koncovou oblast.

Tato hybridizace muže probíhat v rozmezí více či méně specifických podmínek. Obecně řečeno, málo specifické podmínky mohou být definovány jako 3 x SCC v teplotním rozmezí od pokojové teploty až po 65°C, vysoce specifické podmínky jako 0,1 x SSC okolo teploty 65°C. SSC je pufr o složení 0,15 M NaCl, 0,015 M citrát trojsodný. 3 x SSC je třikrát koncentrovanější než SSC a tak dále.

Vynález dále popisuje DNA, která je vlivem genetického kódu degenerovaná a je ekvivalentní DNA uvedené ve vynálezu a která kóduje polypeptid, jež je přinejmenším částí transaktivační domény receptoru pro ekdyzon motýlů rodu Heliothis, vazebné domény pro DNA, pantové domény, vazebné domény pro ligand a/ nebo C koncové oblasti.

DNA podle vynálezu může být i cDNA nebo DNA v některé své izolační formě.

Vynález se dále týká polypeptidu zahrnujícího receptor pro ekdyzon u Heliothis nebo jeho část, přičemž je tento polypeptid v podstatě zbaven dalších proteinů, se • ·

-10···· · · · · · ··· · · • · · · » · · «·· · · · ··· · · · · kterými je obvykle asociován a který je kódován jakoukoli

DNA podle vynálezu.

Vynález popisuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v Sekvenci id.č.: 4 nebo jakoukoli alelickou variantu nebo její odvozenou sekvenci, kde Sekvence id.č.: 4 udává aminokyselinovou sekvenci pro HEcR polypeptid.

Vynález také popisuje polypeptid, který má část aminokyselinové sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 4 nebo její alelickou variantu či z ní odvozenou sekvenci, jejichž sekvence odpovídá vazebné doméně pro ligand HEcR.

Vynález také popisuje polypeptid, který má část aminokyselinové sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 4 nebo každou její alelickou variantu či z ní odvozenou sekvenci, jejichž sekvence odpovídá HEcR DNA vazebné doméně.

Vynález se týká i polypeptidu, který má část aminokyselinové sekvence uvedené v Sekvenci id.č.: 4 a každé její alelické varianty nebo její odvozené sekvence, jejichž sekvence odpovídá transaktivační doméně pro HEcR.

Dále se vynález týká polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci části Sekvence id.č.: 4 nebo každé její alelické varianty nebo z ní odvozené sekvence, jejichž sekvence odpovídá pantové doméně HEcR.

Vynález dále popisuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci části Sekvence id.č.: 4 nebo každé její alelické varianty či z ní odvozené sekvence, jejichž sekvence odpovídá C koncové oblasti HEcR.

Ve snaze vyhnout se všem pochybnostem, jsou odvozené sekvence variant aminokyselinových sekvencí podle vynálezu zahrnuty.

Výše zmíněná odvozená sekvence je homologní varianta, která má konzervované změny aminokyselin. Konzervovanými • · _i i _ ··· · · · ····

-L -L ······· · · · ···· · • · · · · · · · ··· · ·· ··· ·· ·· aminokyselinovými změnami míníme náhradu jedné aminokyseliny z určité skupiny aminokyselin, jmenovitě hydrofobní, polární, kyselé nebo bazické, za aminokyselinu ze stejné skupiny. Jako příklad takové záměny lze uvést nahrazení valinu za methionin a opačně.

Vynález se dále týká fúzního polypeptidu, zahrnujícího alespoň jeden z polypeptidu uvedených ve vynálezu, funkčně spojeného s příslušnou doménou Či doménami non-Heliothis receptoru pro ekdyzon.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je HEcR vazebná doména pro ligand popsaná ve vynálezu spojena fúzí s DNA vazebnou doménou a transaktivační doménou.

V dalším výhodném provedení vynálezu je vazebná doména pro DNA zfúzována s vazebnou doménou pro ligand a transaktivační doménou.

V dalším provedení vynálezu je transaktivační doména zfúzována s vazebnou doménou pro ligand a vazebnou doménou pro DNA.

Předkládaný vynález také popisuje rekombinantní DNA kódující tyto fúzní polypeptidy.

Zvláště výhodné provedení vynálezu se týká rekombinantní nukleové kyseliny obsahující DNA sekvenci kódující HEcR vazebnou doménu pro ligand funkčně spojenou s DNA kódující vazebnou doménu pro DNA a transaktivační doménu z receptoru pro glukokortikoid.

Vynález se týká také rekombinantní nukleové kyseliny obsahující sekvenci DNA, zahrnující reportérovy gen operativně spojený se sekvencí promotoru a rezponzivní element hormonu, ve kterém je tento element regulovaný vazebnou doménou pro DNA kódovanou DNA podle vynálezu.

Vynález popisuje konstrukt transformovaný nukleovou kyselinou, rekombinantní DNA, polypeptidem nebo fúzním • ·

-12polypeptidem podle vynálezu. Takovéto konstrukty obsahují plazmidy nebo fágy, které jsou vhodné pro transformování buněk, které nás zajímají. Takovéto konstrukty jsou velmi dobře známy odborníkům.

Vynález dále popisuje buňky transformované nukleovou kyselinou, rekombinantní DNA, polypeptidem nebo fúzním polypeptidem podle vynálezu. Buňka může být rostlinná, savčí nebo může jít o buňku houby.

Abychom se vyhnuli pochybnostem, houby zahrnují i kvasinky.

Vynález popisuje přepínač genové exprese, který je funkčně spojen s cizím genem nebo sérií cizích genů, čímž exprese tohoto cizího genu nebo této serie cizích genů může být kontrolována aplikací účinného exogenního induktoru.

Analogy ekdyzonu, jako jsou Muristerone A, byly nalezeny v rostlinách a jsou schopny přerušit vývoj hmyzu. Bylo proto navrženo, že receptor popsasný v tomto vynálezu může být použit pro transformaci rostlin a sloužit jako kontrolní mechanismus u hmyzu. Produkce látky, která ničí hmyz, je kontrolována exogenním induktorem. Látkou ničící hmyz může být ekdyzon, či jiný vhodný protein.

První nesteroidní agonisté streroidů ze skupiny ekdysonu, dibenzoil hydraziny, specifikované v RH-5849 (1,2-dibenzoil, 1-tert-butyl hydrazid), který je komerčně dostupný jako insekticid (Rohm a Haas), byly popsány v roce 1988. Další komerčně dostupnou sloučeninou této série je RH-5992 (tebufenozid, 3,5-dimetylbenzoová kyselina, 1,1-dimetyl 2,4-etylbenzoylhydrazid). Tyto sloučeniny mimikují 20-hydroxyekdyzon (20E) jak u Manduca sexta tak i u Drosophila melanogaster. Tyto sloučeniny mají tu výhodu, že je lze potenciálně použít jako nesteroidní agonisty steroidních hormonů ze skupiny ekdyzonu ke kontrole hmyzu. Další příklady takovýchto dibenzoil-hydrazinů jsou dány v US Patentu č. 5,117,057,Rohm a Haas, a v Oikawa a další, • · · • ·

Pestic. Sci., 41, strana 139 až 148 (1994) . Při tom lze použít každého induktoru přepínače genové exprese podle vynálezu, aú steroidního či nesteroidního, který je běžně dostupný či se dostupným stane.

Přepínač genové exprese podle vynálezu, aú již spojený s exogenním či s cizím genem a transformací zavedený do rostliny, se stává prostředkem pro externí regulaci exprese tohoto cizího genu. Metoda použitá pro transformaci rostlinných buněk není přímo předmětem tohoto vynálezu a může proto být použita každá metoda vhodná pro cílovou rostlinu. Transgenní rostliny jsou získávány regenerací z transformovaných buněk. Z literatury je známo mnoho způsobů transformace, ale zde uvedeme jen několik, jako jsou agroinfekce pomocí Agrobacterium tumefaciens nebo jeho Ti plazmidem, rostlinných buněk transformace. Odkazy nalézt v literatuře.

na elektroporace, protoplastů, detailní popis mikroinjekce do mikroproj ektilová těchto metod lze

Ani rostlinné druhy, do kterých je možno vložit chemicky indukované sekvence, nejsou předmětem vynálezu. Mohou být transformovány jak dvouděložné tak i jednoděložné rostliny

Vynález může být použit pro všechny rostliny, pro které jsou nebo se stávají dostupnými transformační techniky. Předkládaný vynález může být proto použit ke kontrole genové exprese u různých geneticky modifikovaných rostlin, včetně polních plodin jako jsou řepka olejka, slunečnice, tabák, cukrová řepa a bavlník, obilniny jako je pšenice, ječmen, rýže, kukuřice a čirok, ovoce jako jsou rajská jablka, mango, broskve, jablka, meruňky, jahody, banány a melouny, zelenina jako je mrkev, salát, zelí a cibule. Přepínač genové exprese je také možno použít v různých pletivech, včetně kořenů, listů, stonků a reprodukčních pletiv.

-14Ve zvláště výhodném užití vynálezu je přepínač genové exprese podle vynálezu použit pro kontrolu exprese genů, které propůjčují rezistenci k herbicidům a nebo toleranci hmyzu k rostlinám.

Poslední pokroky v rostlinné biotechnologii vyústily v generaci transgenních rostlin rezistentních k aplikaci herbicidů a transgenních rostlin rezistentních ke hmyzu. Tolerance k herbicidům bylo dosaženo použitím mnoha různých transgenních strategií. Velmi dobře doloženým příkladem z oblasti herbicidů je použití bakteriálního xenobiotického detoxifikačního genu pro phoshinothricin acetyl transferázu (PAT) ze Streptomyces hydroscopicus. Mutované geny rostlinného původu, například se změněným cílovým místem genu kódujícího acetolaktát syntázu (ALS) z Arabidopsis, byly úspěšně rezistentních exprimovány promotorů. Na příkladem užití užity k vypěstování k aplikaci herbicidů, pod kontrolou poli insekticidů,

Bt genu.

transgenních rostlin PAT a ALS geny byly silných konstitutivních je dodnes nejběžnějším

Vynález popisuje systém, kde gen propůjčující toleranci k herbicidu nebo hmyzu může být regulován indukcí závislou na aplikaci specifické aktivující chemikálie. Tento přístup má řadu výhod pro farmáře, jsou to především:

1.

Indukovaná kontrola tolerance k herbicidům a hmyzu by mohla zmírnit riziko ztráty výnosu spoj ené s vysokými hladinami zmiňované exprese genu pro rezistenci k herbicidům a hmyzu. To může být problémem zvláště v časných stadiích růstu, kde vysoké hladiny transgenního produktu mohou přímo interferovat s normálním vývojem. Vysoká úroveň exprese genů pro rezistenci k hmyzu a herbicidům může způsobovat odčerpání živin.

Exprese genů pro rezistenci k herbicidům nebo hmyzu vyvolaná indukčním způsobem dovoluje užití .

-15řečených herbicidů ke kontrole složení rostlinné populace, jestliže se během ošetřování porostu vynechá aktivující chemikálie.

Užití indukovatelného promotoru řídícího geny rezistence k herbicidům nebo hmyzu snižuje riziko přenosu této rezistence, která se stává velkým problémem. Jestliže by byly přeneseny geny rezistence z obilí na příbuzné plodiny, kontrola by byla možná užitím herbicidu při absenci indukující chemikálie. Například, můžeme si představit, že k herbicidu rezistentní obilniny, jako je pšenice, případě zkřížení s plevelným divokým ovsem propůj čily herbicidu.

indukovaná tomuto obtížnému plevelu Jako další příklad lze rezistence k herbicidu u rezistenci by k

ze zredukuj e cukrové řepy.

uvést to, cukrové řepy riziko stávajícího problému divoké Podobně, v oblasti kontroly hmyzu, rezistence hmyzu by se mohla stát snadno problémem, kdyby gen tolerance podléhal konstitutivní (neustálé) expresi. Užití indukovatelného promotoru dovolí, aby byl zaveden mechanismus kontroly rezistence ke hmyzu ve větším rozsahu.

Této strategie indukované exprese rezistence k herbicidům může být dosaženo prvotním postřikem chemického aktivátoru nebo v případě pomalu působících herbicidů, například N-fosfonometyl-glycinu (obvykle známého jako glyfosfát), chemický induktor může být přidán do postřikové směsi současně s herbicidem. Podobná strategie může být zavedena pro kontrolu hmyzu.

Tato strategie může být přijata pro jakoukoli kombinaci rezistenci propůjčujícího genu a odpovídajícího herbicidu, která je, nebo se stane dostupnou. Například, přepínač genové exprese podle vynálezu může být použit pro:

9 · < · 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9 η < · ♦ · · · · 9 9 99

-±O“ · ···· 9 9 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

1.	gen pro glutathion S-transferázu u kukuřice (GST-27) (viz Mezinárodní patentová publikace číslo W090/08826), který přináší rezistenci k chloroacetylanilidovým herbicidům, jako jsou acetochlor, metolachlor a alachlor.
2 .	Fosfinotricin acetyl transferáza (PAT), která přináší rezistenci k herbicidu běžně známého jako glufosinát.
3 .	Mutanty genu acetolaktát syntázy z kukuřice (viz Mezinárodní patentová publikace č. W090/14000) a další geny, které přinášejí rezistenci k sulfomočovině a imadazolinonům.
4 .	Geny, které přinášejí rezistenci k glyfosfátu. Takovéto geny zahrnují glyfosfát oxidoreduktázový gen (GOX) (viz Mezinárodní patentová publikace č. W092/00377), geny, které kódují 5-enolpyruvyl-3-syntázu kyseliny šikimové (EPSPS), včetně třídy I a třídy II EPSPS, geny které kódují mutantu EPSPS a geny které kódují EPSPS fúzní peptidy včetně tranzitního peptidu chloroplastu a EPSPS (příklady viz EP 218 571,EP293 358,WO91/04323,WO92/04449 a W092/06201) a genů, které se účastní exprese CPLyázy.

Podobně, strategie indukované exprese rezistence ke

hmyzu

může být přijata pro jakýkoli gen přinášející

toleranci, který je, nebo se stává dostupným.

Přepínač genové exprese podle podle vynálezu může být užíván také ke kontrole exprese cizích proteinů v kvasinkách a savčích buňkách. Mnoho heterologních proteinů užívaných pro různé aplikace je připravováno expresí metodami genetického inženýrství v bakteriích, kvasinkových buňkách a dalších eukaryotních buňkách, jako jsou savčí buňky.

-17• ♦ *’ · ·· ·· ·· · * · ·· ···· • · · · · · ···· • ···» « · · · · ··· · · • · · · · ··· • · · · ·· · · · ·« ··

Provádění kontroly exprese cizích genů v takovýchto buňkách pomocí přepínače genové exprese podle vynálezu poskytuje další výhodu pro kvasničné a savčí buňky, kde akumulace velkých množství heterologního proteinu může zničit buňky, nebo tam, kde heterologní protein je škodlivý pro buňky tak, že se vyžaduje exprese po krátký čas vzhledem k udržení životaschopnosti buněk.

Takovýto indukční systém lze rovněž aplikovat při genové terapii dovolující načasování exprese kontrolovaného terapeutického genu. Vynález lze proto aplikovat nejen na transformované savčí buňky, ale i na savce jako takové.

Další výhodou užití tohoto indukovatelného systému podle vynálezu v savčích buňkách je, že protože je odvozený z hmyzu, existuje menší šance, že bude ovlivněn induktory, které ovlivňují přirozené savčí steroidní receptory.

V dalším užití podle vynálezu lze přepínač genové exprese použít u genů, které produkují potenciálně nebezpečné nebo smrtící proteiny. Zmíněný systém můžeme zapojit do léčení rakoviny, kde buňky jsou transformovány geny, které exprimují proteiny, které jsou letální pro rakovinné buňky. Načasování akceschopnosti těchto proteinů v rakovinných buňkách lze kontrolovat užitím přepínače genové exprese podle vynálezu.

Přepínač genové exprese podle vynálezu může být použit jak pro zapnutí, tak vypnutí přepínaných genů. To je užitečné pro výzkum modelů nemocí. V takovémto modelu se buňky nechají růst a potom jsou pomocí přepínače genové exprese dle vynálezu geny vypnuty. Takovéto modely usnadňují studium vlivu specifických genů.

Metoda přípravy takovýchto transgenních buněk není nosným tématem tohoto vynálezu a lze použít všechny metody vhodné pro cílovou buňku, jsou to metody běžné v daném oboru, včetně buněčně specifické transformace.

-18• · · ···· Λ ·

Jak již bylo uvedeno, v závislosti na vazbě ekdyzonového receptoru HEcR na specifický kontrolní nebo regulační element DNA dochází k modulaci genové exprese. Schematické znázornění přepínání genové exprese pomocí HEcR je na obrázku 6. Kvůli zjednodušení jsou zde znázorněny pouze tři hlavní domény HEcR, totiž transaktivační doména, DNA vazebná doména a ligand-vazebná doména. Vazba ligandu na vazebnou doménu pro ligand umožní DNA-vazebné doméně vazbu na na responzivní element hormonu (HRE) což vede k expresi (nebo ve skutečnosti k represi) cílového genu.

Přepínač genové exprese podle vynálezu může tedy být považován za dvousložkový. První složka sestává z receptoru HEcR a druhá složka z vhodného responzivního elementu pro hormon (HRE) a cílového genu. V praxi pak může mít přepínač obyčejně formu jedné nebo dvou sekvencí DNA. Alespoň část jedné sekvence nebo jedna sekvence z páru pak kóduje protein receptoru pro ekdyzon (HEcR). Popřípadě může být nukleová kyselina kódující HEcR nahrazena přímo proteinem respektive polypeptidem.

Přepínač genové exprese podle vynálezu může sestávat ze dvou složek, přičemž jedna nebo více domén receptoru může být pozměněna tak, aby vznikl chimérický přepínač genové exprese. Přepínač podle vynálezu je tedy velmi flexibilní a různé kombinace lze použít ke změně výsledku nebo k optimalizaci systému. Jediným požadavkem v takovém chimérickém systému je, aby se vazebná doména pro DNA vázala na responzivní element pro hormon, jinak by nedošlo k požadovanému účinku.

Steroidní receptor pro glukokortikoidy je dobře popsán a velmi dobře funguje v rostlinách. Další výhodou tohoto receptoru je, že jde o homodimer. To znamená, že není potřeba exprimovat další protein jako je protein ultraspiracle aby mohlo dojít ke vzniku funkčního receptoru. Problémem použití receptoru pro steroidní

-19glukokortikoidy je, že ligandy používané k jeho aktivaci nejsou kompatibilní s agronomickou praxí.

Ve výhodném provedení vynálezu receptor sestává z vazebné domény pro DNA a transaktivační domény z receptorú pro glukokortikoidy spolu s vazebnou doménou pro ligand z motýlů druhu Heliothis podle vynálezu. Responzivní jednotka ve výhodném provedení vynálezu obsahuje responzivní element pro glukokortikoidní hormony a gen s požadovaným účinkem. V příkladech je pro jednoduchost místo účinného genu v konstruktu gen reportérový. Nicméně v podmínkách kde nedochází k testování (screeningu) je na tomto místě účinný gen, například gen produkující požadovaný protein, přičemž múze jít o přirozený nebo exogenní protein. Tento chimérický přepínač genové exprese kombinuje nej lepší rysy systému využívajícího receptorú pro glukokortikoidy, zatímco překonává nevýhody spojené s nutností indukce pomocí steroidů.

V dalším výhodném provedení vynálezu je změněna vazebná doména pro ligand z motýlů druhu Heliothis a je výhodně nahrazena vazebnou doménou pro ligand z receptorú pro ekdyzon nepocházející z motýlů Heliothis. Například, přihlašovateli se podařilo vyizolovat vhodné sekvence ze Spodoptera exigua.

Vynález dále popisuje DNA podle Sekvence id. č.: 6.

Vynález dále popisuje DNA obsahující část sekvence podle Sekvence id. č.: 6,která kóduje vazebnou doménu pro ligand z receptorú pro ekdyzon ze Spodoptera exigua.

Vynález dále popisuje DNA obsahující část sekvence podle Sekvence id. č.: 6,která kóduje pantovou doménu z receptorú pro ekdyzon ze Spodoptera exigua.

Vynález rovněž popisuje peptidy, které jsou kódovány výše uvedenými DNA podle Sekvence id. č.: 6.

• · ··· · ·· ··· ·· ··

Další výhodou těchto chimérických systémů je, že umožňují výběr promotoru použitého k řízení účinného genu podle zamýšleného konečného výsledku. Například umístění cizího genu pod řízení buněčně specifického promotoru může být obzvlášť, výhodné v případě, kdy je potřeba ovládat nejen načasování exprese, ale také které buňky budou tento protein expresimovat. Tato dvojnásobná regulace může být obzvlášť důležitá při genové terapii a při použití cytotoxických proteinů.

Změnou promotoru lze rovněž zvýšit nebo snížit hladinu požadované genové exprese.

Podle vynálezu lze využít libovolný vhodný promotor, z nichž mnohé jsou dobře známé ze stavu techniky.

Dále lze podle vynálezu použít libovolnou vhodnou transaktivační doménu. Například transaktivační doména VP16 je silným aktivátorem firmy Genentech lne. a je běžně používána při expresi receptorů pro glukokortikoidy v rostlinách. Dále mohou být použity jiné transaktivační domény odvozené například z rostlin nebo kvasinek.

Ve výhodném provedení vynálezu je DNA-vazebnou doménou DNA vazebná doména z receptorů glukokortikoidú. Tato doména je obyčejně DNA vazebná doména z lidského receptorů pro glukokortikoidy. Nicméně tato doména může být získána z libovolného jiného vhodného zdroje, například z krys.

Vynález dále popisuje způsob selekce sloučenin schopných vazby k některému zástupci nadrodiny hmyzích steroidních receptorů, přičemž tento způsob zahrnuje testování sloučenin ve vazbě na polypeptid nebo fúzní polypeptid podle vynálezu a selekci sloučenin, které jsou této vazby schopny.

Vynález dále popisuje sloučeninu vybranou za použití způsobu podle vynálezu.

	-21- · · · · · · · · • · • · · ·	• · · · · ·· · · · ··· • · · · • · · · · · ·	• · • · • · • ·
Vynález	rovněž	popisuj e	zemědělskou	nebo
farmaceutickou	kompozici	obsahuj ící	sloučeninu	podle
vynálezu.
Vynález	dále popisuje použití	sloučeniny	podle
vynálezu jako	pesticidu,	farmaceutické látky	a/nebo

induktoru přepínače genové exprese. Takové induktory mohou být velmi užitečné jakožto insekticidy samy o sobě.

Vynález dále popisuje způsob výroby proteinu nebo peptidu či polypeptidu zahrnující krok vložení sloučeniny, která se váže na vazebnou doménu pro ligand v buňce podle vynálezu, do této buňky.

V následujících příkladech budou popsány některé výhodné rysy a provedení vynálezu. Uvedené příklady a obrázky jsou pouze ilustrativní a rozsah vynálezu nikterak neomezuj í.

Popis obrázků

Obrázek 1 (Sekvence id.č.: 1) znázorňuje DNA amplifikovanou z prvního vlákna cDNA připravené podle mRNA vyizolované z larvy čtvrtého instaru motýlů Heliothis virescens. Podtržené sekvence odkázují na pozici degenerovaných oligonukleotidů. Na 5' konci se sekvence shoduje s oligonukleotidem zatímco na 3' konci lze najít 12 původních nukleotidů.

Obrázek 2 (Sekvence id.č.: 2) znázorňuje DNA obsaženou v klonu pSK19R vyizolovaném z cDNA knihovny motýla Heliothis virescens pomocí náhodných primerú. Sekvence je ohraničena restrikčními místy pro enzym EcoRI. Celkový počet baží je 1934;

Obrázek 3 (Sekvence id.č.: 3) znázorňuje DNA obsaženou v klonu pSK16.1 vyizolovaném z cDNA knihovny motýla Heliothis virescens pomocí náhodných primerú.

• «

-22···· · · · · · ··· · · • · · · · · · • · · e ··· ·· · ·

Obrázek 4 (Sekvence id. č.: 4) znázorňuje DNA sekvenci produktů 5' RACE (tučně) spojenou se sekvencí klonu pSK16.1. ORF (otevřený čtecí rámec) ze kterého vzniká receptor pro ekdyzon motýla Heliothis virescens je vyznačen pod odpovídající částí DNA.

Obrázek 5 (Sekvence id. č.: 5) znázorňuje srovnání proteinových sekvencí receptorů pro ekdyzon DmEcR (Drosophila melanogaster), CCEcR (Chironomus tentants), BmEcR (Bombyx moři), MsEcR (Manduca sextant), AaEcR (Aedes aegipti) a HvEcR (Heliothis virescens). Symbol indikuje konzervovaný aminokyselinový zbytek, zatímco . značí záměnu jinak konzervativních aminokyselin.

Obrázek 6 ukazuje modelové provedení chimérického receptorů pro glukokortikoidy spojeného s receptorem pro ekdyzon z motýla Heliothis, který je použitelný jako přepínač genové exprese podle vynálezu; Význam symbolů: EcR hmyzí vazebnou doménu pro ligand z ekdyzonového receptorů, DNA-BD je vazebná doména pro ligand z receptorů pro glukokortikoidy a TD je transaktivační doména rovněž z receptorů pro glukokortikoidy, HRE je responzivní element pro hormon, M je minimální 3 5S CaMV pormotor a GUS je reportérový gen GUS;

Obrázek 7 ukazuje mapu plazmidu klonu pcDNA319R. Podobným způsobem byly zkonstruovány tři další savčí expresivní vektory, které jsou až na velikost inzertu velmi podobné;

Obrázek 8 ukazuje mapu plazmidu s reportérovým konstruktem použitým pro analýzu aktivity receptorů pro ekdyzon motýlů Heliothis virescens;

Obrázek 9 je graf znázorňující účinek přípravků Muristerone A (ΙΟμΜ, sloupce B) a RH5992 (20μΜ, sloupce C) na aktivitu reportérového genu v buňkách HEK293 « ·

-23ko-transfikovaných samotnou pcDNA3H3KHEcR (vyplněné sloupce) nebo aRXR (šrafováné sloupce) ve srovnání s kontrolou (žádný ligand, sloupce A) ; na svislé ose je vyznačena optická denzita při vlnové délce

570 nm;

Obrázek 10 ukazuje mapu plazmidu kukuřičného expresivního vektoru obsahujícího receptor pro glukokortikoidy (HG1 nebo pMF6HGlPAT);

Obrázek 11 ukazuje mapu plazmidu kukuřičného expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy a z části pro ekdyzon (Drosophila) pMF6GREcRS;

Obrázek 12 ukazuje mapu plazmidu kukuřičného expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy a z části pro ekdyzon (Heliothis) pMF6GRHEcR;

Obrázek 13 ukazuje mapu plazmidu rostlinného reportérového plazmidu obsahujícího responzivní elementy pro glukokortikoidy sfúzované na pozici -60 s promotorem S3SCaMV, který byl spojen s genem GUS, p221.9GRE6;

Obrázek 14 ukazuje mapu plazmidu rostlinného reportérového plazmidu obsahujícího responzivní elementy pro glukokortikoidy sfúzované na pozici -46 s promotorem S3SCaMV, který byl spojen s genem GUS, p221.10GRE6;

Obrázek 15 je graf znázorňující účinek přípravků: 0, lmM

Muristerone A (sloupec C) a 0,lmM Dexamethasone (sloupec D) na kukuřičné protoplasty AXB transformované plazmidem pMF6HGlPAT (GR) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid); sloupec A odpovídá transformaci pouze plazmidem p221.9GRE6 a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve ·· • · sloupcích A a B je měřena před účinkem přípravků;

sloupec E je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

Obrázek 16 je graf znázorňující účinek přípravků: 0,lmM

Muristerone A (sloupec D) transformované (sloupec C) a 0,lmM Dexamethasone na kukuřičné protoplasty AXB plazmidem pMF6GREcRS (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérovy· plazmid);

sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve sloupcích A a B je měřena jako kontrola po indukci DMSO ; sloupec E je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

Obrázek 17 je graf znázorňující účinek přípravků: 0, lmM

Muristerone A (sloupec D) transformované (sloupec C) a 0,lmM Dexamethasone na kukuřičné protoplasty AXB plazmidem pMF6GRHEcR (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid);

Obrázek 18 je graf znázorňující účinek O,lmM (sloupec C) a lOOnM (sloupec D) RH5849 na kukuřičné protoplasty AXB transformované plazmidem pMF6GREcRS (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid); sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve sloupcích A a B je měřena jako kontrola bez použití indukční látky; sloupec E je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

• · « ·

Obrázek

Obrázek je graf znázorňující účinek 0,ImM (sloupec C) a 0,01mM (sloupec D) RH5992 na kukuřičné protoplasty ΆΧΒ transformované plazmidem pMF6GREcRS (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérovy· plazmid); sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve sloupcích A a B je měřena jako kontrola po indukci DMSO; sloupec E je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

je graf znázorňující účinek RH5992 (sloupec C) na kukuřičné protoplasty AXB transformované plazmidem pMF6GRHEcR (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid); sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve sloupcích A a B je měřena jako kontrola bez induktoru, sloupec D je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

je graf znázorňující závislost účinku na dávce RH5992 (sloupec C odpovídá 100 μΜ, D odpovídá 10 μΜ, E odpovídá 1 μΜ, F pak 0,1 μΜ a konečně G odpovídá 0,01 μΜ) podané kukuřičným protoplastům AXB transformovaným plazmidy pMF6GRHEcR (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid); sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B transformaci oběma DNA, aktivita ve sloupcích A a B je měřena jako kontrola bez induktoru, sloupec H je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

ukazuje mapu plazmidu tabákového expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy a z části pro ekdyzon (Drosophila), pMF7GREcRS;

-26• · ·· • · ·· ······ · • ··

Obrázek ukazuje mapu tabákového expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z ekdyzon části pro glukokortikoidy a z části pro (Heliothis), pMF7GRHEcR;

Obrázek tabákového pMF6GRHEcR (reportérovy (sloupec mezofylu (efektorový plazmid);

je graf znázorňující účinek ΙΟμΜ RH5992

C) na protoplasty z transformované plazmidem plazmid) a p221.9GRE6 sloupec A odpovídá transformaci pouze reportérovým plazmidem a sloupec B aktivita ve sloupcích A a s indukcí DMSO, sloupec D bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

transformaci oběma DNA, B je měřena jako kontrola je kontrolní transformace

Obrázek ukazuje mapu savčího expresivní vektor obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy a z části pro ekdyzon (Heliothis), pcDNA3GRHEcR;

Obrázek ukazuje mapu reportérového plazmidu pSWGRE4;

Obrázek je graf znázorňující závislost účinku na dávce RH5992 v buňkách CHO transfikovaných pcDNA3GRHEcR a pSWGRE4; na svislé ose je uvedena O.D délce 570 nm a na ose vodorovné je induktoru v μΜ;

při vlnové koncentrace

Obrázek je graf znázorňující účinek (sloupec B) a 20μΜ (sloupec C) IEK293 ko-transfikované pomocí ve sloupci A nebylo použito ligandu; je uvedena O.D

Muristerone na buňky pcDNA3GRHEcR a

ΙΟμΜ

RH5992 pSWGRE4, svislé ose na při vlnové délce 570 nm;

Obrázek	29	ukazuj e	mapu	binárního	vektoru	ES1;
Obrázek	30	ukazuj e	mapu	binárního	vektoru	ES2;
Obrázek	31	ukazuje	mapu	binárního	vektoru	ES3;

Obrázek 32 ukazuje mapu binárního vektoru ES4;

-27Obrázek

Obrázek

Obrázek ukazuje mapu efektorového konstruktu TEV-B 112 připraveného pro expresi HEcR vazebné domény pro ligand v kvasinkách;

ukazuje mapu efektorového konstruktu TEV8 připraveného pro expresi HEcR vazebné domény pro ligand v kvasinkách;

ukazuje mapu efektorového konstruktu TEWP16-3 připraveného pro expresi HEcR vazebné domény pro ligand v kvasinkách;

ukazuje mapu savčího expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy VP16 a z části pro ekdyzon (Heliothis), pcDNA3GRVP16HEcR;

ukazuje mapu kukuřičného expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy VP16 a z části pro ekdyzon (Heliothis), pMF6GRVP16HEcR;

ukazuje mapu kukuřičného expresivního vektoru obsahujícího chimérický receptor skládající se z části pro glukokortikoidy VP16 a z části pro ekdyzon (Heliothis), pMF7GRVP16HEcR;

je graf znázorňující účinek různých koncentrací RH5992 (ΙΟΟμΜ odpovídá D; 10μ odpovídá sloupci E; sloupec F vyznačuje ΙμΜ; sloupec G vyznačuje Ο,ΙμΜ; sloupec H vyznačuje Ο,ΟΙμΜ) na kukuřičné protoplasty AXB transformované plazmidy pMF6GRVP16HEcR (efektorový plazmid) a p221.9GRE6 (reportérový plazmid); ve sloupci A je pro srovnání použit plazmid p35SPAC, ve slopuci B je použit jen reportérový plazmid, ve sloupci C je použito reportérového plazmidů a GRHEcR, sloupec I je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS;

-28Obrázek (Sekvence id. č.: 6) pantové a ligand-vazebné ekdyzon Spodoptera exigua; 948;

ukazuj e domény celkový

DNA sekvenci receptorů pro počet baží je

Obrázek (Sekvence id. proteinových sekvencí pantové domény receptorů pro ekdyzon v ukazuje srovnání a ligand-vazebné klonech Heliothis

19R a Spodoptera SEcR Taq. Symbol indikuje konzervovaný aminokyselinový zbytek, zatímco . značí záměnu jinak konzervativních aminokyselin.

Obrázek je graf tabákového pMF7GRHEcR (vodorovné účinek RH5992 na p221.10GRE6 reportérovým použit

DMSO, znázorňuj ící mezofylu (efektorový proužky, (svislé použky, plazmidem; ve efektorový plazmid ve sloupcích B, E jsou buď

B,

D, protoplast plazmidy p221.9GRE6 C)

E, F) nebo j ako není transformovaného plazmid) a sloupce A, sloupce sloupcích A a D a místo induktoru je použity oba plazmidy a místo induktoru je DMSO, ve sloupcích C, F jsou použity oba plazmidy a ΙΟμΜ RH5992, sloupec G je kontrolní transformace bez DNA; na svislé ose jsou uvedeny jednotky GUS; poznámka: výtěžek při použití plazmidu p35PAC činil 2600 jednotek GUS;

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1- klonování receptorů pro ekdyzon motýlů Heliothis

A. Příprava sondy pro izolaci homologů členů receptorové nadrodiny pro Heliothis byla regulovanách steroidní/thyroidní hormony z motýlů založena na porovnání sekvencí vývojově členů receptorové nadrodiny pro steroidní/thyroidní hormony. Dostupné sekvence vykazovaly « ·

dobře zahovaný motiv v DNA vazebných doménách receptorú RAR a THR (thyroidní). Tento motiv byl použit pro návrh degenerovaných oligonukleotidú pro PCR amplifikaci sekvencí z templátu cDNA pocházející z tkáně, ve které kde se předpokládá exprese vývojově regulovaných členů receptorové nadrodiny pro steroidní/thyroidní hormony (to znamená například tkáně larev).

Antikódující oligonukleotid (sense) je založen na peptidové sekvence CEGCKGFF, která dává na úrovni DNA 32 degenerovaných oligonukleotidú viz níže:

ZnFA5' 5' TGC GAG GGI TGC AAG GAI TTC TT 3'

TA TA T

Kódující oligonukleotid (antisense) je založen reverzní komplementární nukleotidové sekvenci odvozené z peptidu: CQECRLKK

S R která dává čtyři sady degenerovaných oligonukleotidú:

ZnFA3¹	5'	TTC T	TTI	AGI	CGG A	CAC T	TCT C	TGG A	CA	3
ZnFB3'	5'	TTC	TTI	AAI	CGG	CAC	TCT	TGG	CA	3
		T			A	T	C	A
ZnFC3'	5'	TTC	TTI	AGI	CTG	CAC	TCT	TGG	CA	3
		T			A	T	C	A
ZnFD3'	5'	TTC	TTI	AAI	CTG	CAC	TCT	TGG	CA	3
		T			A	T	c	A

PCR ampifikace byla provedena z cDNA knihovny připravené pomocí náhodných primerů z mRNA vyizolované z čtvrtého a pátého instar stádia larvy Heliothis virescens. Amplifikace

-30byla provedena za použití 10⁸ pfu (plak formující jednotka) v 50mM KC1, 2 0mM Tris-HCl o pH 8. 4,s přídavkem 15 mM MgCl₂, 200mM dNTPs (ekvimolární směs dCTP, dATP, dGTP a dTTP) a směsi 100 ng ZnFAS' a ZnF3 ' . Rekační podmínky odpovídaly protokolu s teplým startem, přičemž reakčni směs byla zahřívána 5 minut na 94 °C a poté k ní bylo přidáno 15 U Taq polymerázy a reakce pokračovala dalších 35 cyklů po 50 sekundách při 93°C, 1 minutě při 40°C a 1 minutě a 30 sekundách při 73°C. PCR produkty byly elektroforeticky rozděleny na 2%(w/v) agarózovém gelu a fragmenty o velikosti mezi 100 a 200 bp byly izolovány a překlonovány do vektoru pCRII (Invitrogen). Sekvence inzertu byla určená za použití Sequenase (USB).

Výsledná sekvence byla přeložena a poté byla prohledána databáze. Byly nalezeny sekvece odpovídající DNA vazebné doméně receptoru pro ekdyzon mušek Drosophila, receptoru pro kyselinu retinovou a thyroidní hormon. Z toho vyplývá, že sekvence inzertu v tomto plazmidu, označeném jako pCRIIZnf, je příbuzná sekvence receptoru pro ekdyzon z motýlů Heliothis (viz obrázek 1) . Tento plazmid byl poté použit k selekci a porhledávání cDNA knihoven pro izolaci kompletního otevřeného čtecího rámce.

B. Prohledávání cDNA knihovny

Knihovna cDNA získaná pomocí náhodných primerů ze čtvrtého a pátého instar stadia motýlů Heliothis virescens byla vyseta na plotny a z ploten byly pořízeny otisky na filtr. Počet vysetých plaků byl 500,000.Vložený fragment pCRIIZnf byl amplifikován a 50 ng tohoto fragmentu bylo označeno na konci pomocí T4 polynukleotid kinázy (viz Sambrook a další, 1990).

Filtr byl poté předběžně hybridizován za použití pufru obsahujícího 0,25%(w/v) Marvel, 5 X SSPE a 0,1%(w/v) SDS. Hybridizace probíhala 4 hodiny při teplotě 42°C. Pak • · byl roztok nahrazen čerstvým a byly přidány denaturované hybridizační sondy. Hybridizace probíhala přes noc při teplotě 42°C a poté byl filtr promyt v pufru obsahujícím 6 X SSC, 0,1% (w/v) SDS při teplotě 42°C. Po tomto promytí následovalo další při teplotě 55°C. Filtr byl poté exponován s filmem pro rentgenové záření (Kodak) po dobu 48 hodin.

Vyvolaný film indikoval přítomnost jednoho silného pozitivního signálu. Odpovídající plak byl vyizolován a dále charakterizován.

Fág lambda ZAP II phage byl in vivo vyjmut (viz manuál Stratagene) a poté byla stanovena sekvence výsledného DNA plazmidu. Klon označený jako pSK19R (nebo 19R) obsahoval 1,933 kb dlouhý cDNA fragment s otevřeným čtecím rámcem o 467 aminokyselinových zbytcích (viz obrázek 2) . pSK19R byl uložen u NCIMB 20. června 1995 a a bylo mu přiděleno registrační číslo NCIMB 40743.

Dálší analýza plazmidu pSK19R odhalila, že 340 bp dlouhý EcoRI fragment na 5' konci pSK19R má silnou a významnou homologii s cDNA kódující Drosophila glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu. Za účelem izolovat správnou 5' koncovou sekvenci patřící motýlům Heliothis, byla cDNA knihovna připravená pomocí náhodných primerů znovu prohledána za použití sondy obsahující 5'konec pSK19R odpovídající receptorú pro ekdyzon z motýlů Heliothis. Sonda byla připravena pomocí PCR za použití antikódujícího (sense) oligonukleotidu HecRH3C (5' aattaagctt ccaccatgcc gttaccaatg ccaccgaca 3') a kódujícího (antisense) oligonukleotidu HecrNdel (5' cttcaaccga cactcctgac 3'). PCR byla provedena tak jak je popsáno v publikaci Hirst a další, (1992) přičemž množství radioaktivního izotopu použité pro označení bylo 50 /xCi ³²P-dCTP a PCR byla opakována v cyklech po 1 minutě při teplotě 94°C, 1 minutě při teplotě 60°C a 1 minutě při teplotě 72°C a to po 19 cyklů. Výsledný 353 bp dlouhý radioaktivně značený DNA

-32před-hybridizovaným k

otisky knihovny byly obsahovala 50000 Dfu.

fragment byl denaturován a přidán filtrům, viz izolace pSK19R. Tyto pořízeny z 15 ploten, z nichž každá

Filtry byly hybridizovány při 65°C a dvakrát po 30 minut promývány pufrem 3 X SSPE s přídavkem 0,1 % SDS při teplotě 65 °C. Filtry byly dále promyty pufrem 1 X SSPE s přídavkem 0,1 % SDS po dalších 30 minut a přes noc exponovány s citlivým rentgenovým filmem (Kodak). Film byl vyvolán a bylo vybráno 16 pravděpodobných pozitivních plaků. Plaky byly znovu vysety na plotny a hybridizovány za přesně stejných podmínek jako při prvotní selekci. Nakonec byl vybrán jeden silně pozitivní klon. Silně pozitivní klon byl opakovaně rozpoznán hybridizační sondou a poté byl přečištěn a nammnožen in vivo. Výsledný plazmid pSK16. 1 byl sekvenován (Seq 1D3). Sekvenování odhalilo, že 5' konec klonu má přesah 205 bp a 3¹ konec pak 653 bp, z čehož vyplývá, že celková délka inzertu činí 2, 5 kb. Peptidová sekvence odpovídající 205 bp dlouhému fragmentu o délce 73 aminokyselin má vysokou homologii se sekvencí BI isoformy receptorů pro ekdyzon Drosophila, Aedes aegipti, Manduca a Bombyx. Nicméně tato sekvence naní na 5' konci úplná vzhledem k tomu, že nebyl nalezen kódón pro methionin, který by byl ve správném čtecím rámci 5' se stop kódónem. Za účelem izolovat zbytek 5' konce sekvence byl použit protokol 5¹RACE (rychlá amplifikace cDNA konců, souprava 5'RACE, BRL-GIBCO). Byly syntetizovány dvě cDNA, přičemž pro první byl použit specifický oligonukleotid:

16PCR2A 5' cagctccagg ccgccgatct cg 3' a pro přípravu druhé byly použity náhodné hexamery (oligonukleotidy obsahující 6 náhodných nukleotidů). Každá cDNA byla amplifikována pomocí PCR za použití kotvících (anchor) oligonukleotidových primeru:

BRL-GIBCO 5' cuacuacuac uaggccacgc gtcgactagt acgggiiggg iigggiig 3' • 4 • · ··· ··· • 4 4 · ·· 999 99 99 a 16PCR2A. Cyklus PCR byl opakován 35-krát: 1 minuta při teplotě 94 °C, 1 minuta při teplotě 60°C a 1 minuta při teplotě 72°C. Složení reakčního pufru bylo následující: 20mM Tris-HCl (pH 8,4), 50mM KC1, 1, 5 mM MgCl₂, 400 nM každého z primerů (kotevní a 16PCR2) , 200 mM směsi dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) a 0.02 U/ml Taq DNA polymerázy. Produkt první amplifikace byl naředěn 1: 50 a 1 ml této nové směsi byl použit v druhé PCR reakci s oligonukleotidy UAP (univerzální amplifikační primer):

5¹ caucaucaucauggccacgcgtcgactagtac 3') a 16RACE2:

(5' acgtcacctcagacgagctctccattc 3')

Podmínky a teplotní složení cyklů byly stejné jako pro první PCR. Vzorky pro každou PCR byly rozděleny elektroforeticky a poté byl proveden Southernův blot za použití specifické hybridizační sondy:

16PCR1 5' cgctggtataacaacggaccattc 3')

Tento primer je specifický pro sekvence na 5' pSK16.

a byl hybridizován při teplotě 55°C za použití standardního hybridizačního pufru. Filtr byl třikrát promyt při teplotě 55°C v pufru 3 X SSPE s přídavkem 0,1 % SDS a 6 hodin exponován s citlivým rentgenovým filmem. Vyvolaný film odhalil pásy, které hybridizaovaly s oligonukleotidem putujícím mezi markéry 100 bp a 500 bp. Vzorky PCR reakcí (celkem 4) byly nakloňovány do vektoru pCRII za použití klonovací soupravy TA (Invitrogen). Analýza 15 klonů ze 4 nezávislých PCR reakcí poskytla sekvenci po směru exprese pSK16. 1 (viz obrázek 4).

Překlad ORF dává vzniknout 575 aminokyselin dlouhému proteinu s vysokou homologií v oblasti Dna-vazebné a ligand-vazebné domény receptoru pro ekdyzon Drosophila,

Aedes aegypti, Chironomus tentans, Manduca sextant a Bombyx moři (obrázek 5). Zajímavé je, že N-terminální oblast sekvence motýlů Heliothis obsahuje ve správném čtecím rámci • · • ·

-34• · ··· · · · ·· · · ·· · · · ·· · · počáteční methinonin a následujících 20 aminokyselin, které jsou v sekvenci navíc oproti receptoru Drosophila, Aedes aegypti a Manduca sextant. Nicméně tento prodloužený N-konec motýlů Heliothis je nepodobný prodlouženému konci EcR Bombyx moři. C-koncové oblasti jednotlivých BI izoforem receptoru se navzájem liší a nevykazují významnější podobnosti.

C. Analýza pomocí northern blotu

Předpokládá se, že sekvence identifikovaná prohledáním cDNA knihovny je exprimována v tkáních, ve kterých dochází k vývojovým změnám. Byla proto izolována mRNA z rozdílných vývojových stadií Heliothis virescens a tato mRNA byla podrobena northern blotu. mRNA byla izolována z vajíček, prvního, druhého, třetího, čtvrtého a pátého instar stadia larvy a dospělců. Nothern blot byl hybridizován s Ndel/Xhol DNA fragmentem zahrnujícím 3 ligand-vazebné teplotě 65°C

X SSPE, 0,1 'konec DNA-vazebné domény.

v pufru % (w/v) SDS a trvala

Hybridizace obsahuj ícím domény byla 1 % až 24 plazmidu pSK19R až po konec provedena při (w/v) Marvelu, hodin.

Filtry byly promyty v pufru obsahujícím 3 X SSPE s přídavkem 0,1 % (w/v) SDS a 1 X SSPE s přídavkem 0,1 % (w/v) SDS při tepltě 65°C. Filtr byl poté vysušen a exponován jeden až sedm dnů. Byly rozeznány dva transkripty (6,0 a 6,5 kb), které jsou pravděpodobně exprimovány ve všech testovaných stádiích, úrovně exprese se v rozdílných stádiích liší. Je zajímavé, že stejné dva transkripty jsou rozeznávány sondami specifickými pro DNA-vazebnou doména a pro ligand-vazebná doména. To naznačuje, že oba transkripty vznikají ze stejného genu buď alternativním sestřihem nebo alternativním použitím polyadenylačních míst.

• *

-35Souhrně lze konstatovat, že dospělý a pátý instar larvy mají nižší úrovně exprese zatímco všechna ostatní stádia tkáně mají podstatně vyšší úroveň exprese.

Příklad 2: Exprese receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis v savčích buňkách

Aby se prokázalo zda cDNA kóduje funkční receptor pro ekdyzon, byly vytvořeny účinné (efektorové) genové konstrukty obsahující HEcR pod kontrolou promotoru CMV (cy-tomegalovirus) a tato DNA byla exprimována v savčích buňkách.

Účinné genové konstrukty

První savčí expresívní plazmid byl vytvořen tak, že do vektoru pcDNA3 rozštěpeného restrikčními enzymy HindlII/Notl byl umístěn fragment pSK19R rozštěpený restrikčními enzymy HindlII/Notl, čímž byl vytvořen plazmid pcDNA319R (Obrázek 7).

Ve druhém účinném plazmidu byla z cDNA 19R odstraněna nekódující oblast a zavedena Kozákova sekvence. Tato mutageneze byla provedena amplifikací fragmentu DNA pomocí PCR za využití oligonukleotidu HecRH3C:

5'aattaagctt ccaccatgcc gttaccaatg ccaccgaca 3' obsahujícího jedinečné restrikční místo HindlII následované konvenční Kozákovou sekvencí pro savčí buňky, a oligonukleotidu HecRNdel:

5'cttcaaccga cactcctgac 3'.

Získaný PCR fragment o velikosti 353 kb byl rozštěpen restrikčními enzymy HindlII a Ndel, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu a spolu s fragmentem 19R rozštěpeným restrikčními enzymy Ndel/Notl zaligován do

-36φ Φ ·· φ ·· ·· ··· φ · · φ · · · φφφ · · φ φφφ» • φφφφ φφφ » · φφφ · · • φ · · · · · · φφφ φ φφ φφφ φφ φφ vektoru pcDNA3 rozštěpeného restrikčními enzymy HindlII/Notl. Výsledkem této ligace je plazmid pcDNA3HecR.

Třetí účinný genový konstrukt byl vytvořen pomocí PCR s využitím 5' koncových sekvencí plazmidu pSK16. 1.Pomocí PCR bylo za použití oligonukleotidu ohraničujícího 5' konec kódujícího vlákna přidáno na 5' konec amplifikovaného fragmentu restrikční místo pro HindlII, Kozákova konvenční sekvenci následovaná nukleotidovou sekvencí kódující startovní methionin a dva argininy. Sekvence oligonukleotidu ohraničujícího 5' konec kódujícího vlákna byla:

16H3K 5'attaagcttg ccgccatgcg ccgacgctgg tataacaacg gaccattc 3' a jako oligonukleotid ohraničující 3' konec kódujícího vlákna byl použit HecrNdel. Získaný fragment byl rozštěpen restrikčními enzymy, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu a spolu s fragmentem 19R rozštěpeným restrikčními enzymy Ndel/Notl zaligován do vektoru pcDNA3 rozštěpeného restrikčními ezymy HindlII/Notl. Získaný plazmid byl označen pcDNA3H3KHEcR.

Čtvrtý účinný genový konstrukt obsahuje prodlouženou N-koncovou sekvenci získanou z experimentu 5' RACE. Za účelem zavedení nových sekvencí na 5' konci (navíc ke Kozákově konvenční sekvenci a jedinečnému restrikčnímu místu HindlII) byla tudíž využita metoda PCR. Jako PCR primer komplementární ke kódujícímu vláknu byl použit RACEH3K:

5' attaagcttg ccgccatgtc cctcggcgct cgtggatac 3', zatímco primer komplementární k antikódujícímu vláknu byl stejný jako v předchozím případu (HecrNdel). Postup klonování použitý k vytvoření plazmidu pcDNA3RACEH3KHEcR byl obdobný jako při konstrukci plazmidu pcDNA3H3KHEcR.

-37• · · ···· 4 ·

Mutagenze pomocí PCR byla pro všechny konstrukty prováděna za stejných podmínek. Podmínky použité při PCR reakcích byly následující: 1 minuta při 94°C, 1 minuta při 60°C a 1 minuta při 72°C, celkem 15 cyklů, 50mM Tris-HCl (pH8,4), 25mM KC1, 200mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) ,

200nM roztok každého oligonukleotidu a 2,5 jednotky/reakce

DNA polymerázy Taq. Pro vytvoření jednotlivého konstruktu bylo provedeno alespoň 5 nezávislých PCR reakcí a bylo sekvenováno několik klonů, aby bylo zajištěno, že alespoň jeden klon neobsahuje nežádoucí mutace.

Reportérový konstrukt

Reportérový plazmid, kterým byly spolu s expresívním vektorem transfikovány savčí buňky, obsahoval 4 kopie responzivního elementu Hsp27 pro receptor pro ekdyzon (Riddihough a Pelham, 1987) připojené k promotoru β-globinu a genu kódujícímu β-galaktosidázu. Tandemové repetice responzivního elementu pro receptor pro ekdyzon byly syntetizovány jako dva komplementární oligonukleotidy, které byly následně hybridizovány za vzniku dvojvláknové molekuly DNA ohraničené na 5'konci restrikčním místem Spěl a na 3' konci restrikčním místěn Clal:

Recr3 A

5'ctagtagaca agggttcaat gcacttgtcc aataagctta gacaagggtt caatgcactt gtccaatgaa ttcagacaag ggttcaatgc acttgtccaa tctgcagaga caagggttca atgcacttgt ccaatat 3'

Recr3B

5'cgatattgga caagtgcatt gaacccttgt ctctgcagat tggacaagtg cattgaaccc ttgtctgaat tcattggaca agtgcattaa cccttgtcta agcttattgg acaagtgcat tgaacccttg teta 3'.

Výsledný fragment DNA o velikosti 135 bp byl zaligován do vektoru pSWBGAL rozštěpeného restrikčními enzymy Spel/Clal a výsledkem této ligační reakce byl • ·

-38plazmid pSWREcR4 (Obrázek 8) . Kotransfekce oběma plazmidy by měla být za přítomnosti ligandu indikována aktivitou B-galaktosidázy. Tento experiment využívá k vytvoření aktivního receptoru pro ekdyzon přítomnosti RXR (homolog ultraspiráklu) v savčích buňkách.

Metody transfekce savčích bubgk

Transfekce savčí buněčné linie CHO-K1 (Chinese hamster ovary-buňky křečcích ovárií)-(ATCC kód CCL61) nebo savčí buněčné linie cos-1 (buněčná linie získaná z opic) byla provedena pomocí metody využívající koprecipitaci DNA s fosforečnanem vápennatým (Gorman, Kapitola 6 v publikaci DNA cloning: a practical approach, svazek 2 D. M. Glover ed., IRL Press, Oxford 1985) nebo pomocí LipofectAMINE (Gibco BRL Kat. číslo 18324-012, postupem podle výrobce). Lidské epitheliální ledvinné buňky 293 byly transfikovány pomocí analogických metod.

Výsledky: Nativní HEcR řídí přechodnou expresi reportérového genu v savčích buňkách

Kontransfekce lidských epiteliálních ledvinných buněk 293 (HEK293) plazmidem pcDNA3H3KHEcR (účinný konstrukt) a reportérovým konstruktem měla za přítomnosti Muristeronu A nebo RH5992 za následek 2 až 3 násobné zvýšení reportérové aktivity vzhledem ke kontrolním experimentům, v nichž nebyly použity ani Muristeron A ani RH5992 (Obázek 9) . Buňky HEK293 byly použity vzhledem ke skutečnosti, že konstitutivně exprimují aRXR. U octomilek Drosophila bylo totiž prokázáno, že aRXR je nezbytný k aktivaci EcR pomocí Muristeronu A (Yao a další, 1993) . Za účelem dalšího zkoumání nezbytnosti interakcí RXR, byly buňky HEK293 kotransfekovány aRXR spolu s účinným genovým konstruktem a reportérovým genovým konstruktem. Tato kotransfekce měla za následek 9-ti násobné zvýšení reportérové aktivity ve srovnání s aktivitou v kontrolních buňkách (Obrázek 9) . Kotransfekce aRXR spolu s účinným genovým konstruktem a reportérovým genovým konstruktem zvýšila čtyřnásobně reportérovou aktivitu ve srovnání s buňkami transfikovanými pouze účinným genovým konstruktem a reportérovým genovým konstruktem. Indukce byla pozorována jak v přítomnosti Muristeronu A tak v přítomnosti RH5992. Tato data zřetelně ukazují, že cDNA HEcR kóduje funkční receptor pro ekdyzon. Navíc schopnost HEcR vytvářet komplex s aRXR a vázat Muristeron A nebo RH5992 poskytuje důkaz pro využití celého HEcR jako komponenty přepínače genové exprese v savčích buňkách. Tato skutečnost navíc poskytuje výhodu snížení neindukované exprese cílového genu, protože receptor pro ekdyzon a responzivní elementy pro receptor pro ekdyzon nejsou v savčích buňkách přítomné.

Příklad 3 Ověření funkčnosti chimérických konstruktů a ligandů v protoplastech kukuřice

Aby bylo možné využít receptor pro ekdyzon jako inducibilní systém, bylo nezbytné zjednodušit požadavky na tento systém tak, aby pro získání aktivního komplexu neexistovala nutnost tvorby heterodimerů. Je známo, že receptory pro glukokortikoidy vytvářejí homodimery, a chimérické konstrukty transaktivačních a DNA vazebných domén receptoru pro glukokortikoidy připojené k pantové oblasti receptoru pro ekdyzon a doméně receptoru pro ekdyzon odpovědné za vazbu ligandu jsou za přítomnosti Muristeronu A (agonista ekdyzonu) v savčích buňkách aktivní jako homodimery (Christopherson a další, 1992). Tyto chimérické receptory nereagují nicméně na přítomnost 20-hydroxyekdyzonu (Christopherson a další, 1992) .

Výsledkem analýzy aktivace chimérických receptoru pro ekdyzon složených z části odvozené od receptoru pro glukokortikoidy a části odvozené od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis bylo vytvoření dvou dalších účinných

-40• · ·· · ·♦ · · ··· · · · · * · · · • · · ·« · ·«*·· • ······ · · · ···· · « “ ··· ··· • · · 4 ·· v·· ·· ·· konstruktů. První konstrukt byl tvořen intaktním receptorem pro glukokortikoidy, zatímco druhým konstruktem je chimérický receptor pro ekdyzon složený z části odvozené od receptorů pro glukokortikoidy a části odvozené od receptorů pro ekdyzon z octomilky Drosophila.

Účinné konstrukty (i) Expresívní konstrukt receptorů pro glukokortikoidy použitý pro expresi v kukuřici

DNA konstrukt použitý pro přechodnou expresi v kukuřici kódující receptor pro glukokortikoidy byl vytvořen z cDNA knihovny z lidského fibrosarkomu (buněčná linie HT1080,ATCC kód CC1121)(Clontech)(viz. Hollenberg a další, 1985) prostřednictvím polymerázové řetězcové reakce (PCR). Fragment o velikosti 2, 7 kb kódující receptor pro glukokortikoidy byl pomocí PCR přístupu vytvořen ve formě dvou segmentů. Prvním fragmentem je N-konec a tento zahrnuje DNA vážící doménu, zatímco druhý fragmnet začíná sekvencí kódující pantovou oblast (aminokyselina číslo 500) a končí s koncem čtecího rámce. PCR primer použitý k amplifikaci segmentu kódujícího N-konec byl tudíž navržen tak, aby obsahoval restriční místo EcoRI a Kozákovu konvenční sekvenci pro iniciaci translace:

GREcoRI 5¹attgaattcc accatggact ccaaagaatc attaactc 3'.

Primer ohraničující 3' konec kódujícího vlákna obsahoval v místě kódujícím aminokyselinu číslo 500 (podle publikované sekvence) v odpovídajícím otevřeném čtecím rámci restrikční místo Xhol:

GRXhol 5' gagactcctg tagtggcctc gagcattcct tttatttttt tc3¹

Druhý fragment receptorů pro glukokortikoidy byl vytvořen za použití oligonukleotidů ohraničujícího 5' konec kódujícího vlákna, který na počátku sekvence kódující pantovou oblast (aminokyselina číslo 500) obsahoval v odpovídajícím otevřeném čtecím rámci restrikční místo Xhol:

-41GRHinge 5¹ attctcgaga ttcagcaggc cactacagga g 3', zatímco oligonukleotid ohraničující 3' konec kódujícího vlákna obsahoval ve vzdálenosti 400 bp po stop kodónu restrikční místo EcoRI:

GRStop 5¹ attaaattca atgctatcgt aactatacag gg 3'.

PCR receptorů pro glukokortikoidy byla prováděna za použití polymerázy Vent (Biolabs) v podmínkách horkého startu, po němž následovalo 15 cyklů denaturace (94°C po dobu 1 minuty), renaturace (66°C po dobu 1 minuty) a syntézy DNA (72°C po dobu 1 minuty) . Templát byl vytvořen tak, že byl nejprve, jak je popsáno v návodu u klonovací supravy TA (Invitrogen) , syntetizován první řetězec DNA a poté byla provedena reakce PCR v roztoku lOmM KC1, lOmM (NH₄) ₂SO₄,20mM TRIS-HC1 pH 8,8 , 2 mM MgSO₄,0,l% (v/v) Triton X-102,200 mM dNTP, 100 ng každého primeru a 2 jednotky polymerázy Vent. Produkty PCR reakce byly rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a Xhol a zaklonovány do vektoru pBluescript SK (pSK) předem rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI a Xhol. Získaný plazmid pSKHGI byl sekvenován a bylo zjištěno, že sekvence neobsahuje vzhledem k publikovaným sekvencím žádné mutace (mimo mutací zavedených pomocí primerů pro PCR) (Hollenberg a další, 1985).

Fragment o velikosti 2,7 kb rozštěpený restrikčním enzymem EcoRI byl nakloňován do vektoru pMF6PAT (předem rozštěpeného restrikčním enzymem EcoRI) a výsledkem této operace byl vznik plazmidu pMF6HGIPAT (Obrázek 10).

(ii) Expresívní konstrukt určený k expresi v kukuřici obsahující chimérický receptor pro ekdyzon složený z části odvozené od receptorů pro glukokortikoidy a části odvozené od receptorů pro ekdyzon z octomilky Drosophila.

• ·

-42Část chimérického receptorů odvozená od receptorů pro glukokortikoidy byla izolována z plazmidu pSKHGI. Výsledkem této izolace byl restrikční fragment BamHl/Xhol o velikosti

1.5 kb obsahující N-konec a zahrnující doménu odpovědnou za vazbu DNA.

Část chimérického receptorů odvozená od receptorů pro ekdyzon z octomilky Drosophila byla izolována z prvního řetězce cDNA připravené z mRNA (Drosophila) prostřednictvím metody PCR. PCR byla prováděna s využitím oligonukleotidu ohraničujícího 5' konec kódujícího vlákna a obsahujícího restrikční místo Sáli (tj., receptor pro ekdyzon z octomilky Drosophila obsahuje na konci sekvence kódující doménu odpovědnou za vazbu ligandu restrikční místo Xhol), které začíná na počátku pantové oblasti:

aminokyselina 332,EcrB attgtcgaca acggccggaa tggctcgtcc cggag 3'

Oligonukleotid ohraničující 3' konec kódujícího vlákna obsahuje restrikční místo BamHI přiléhající ke stop kodónu:

EcRstop 5' tcgggctttg ttaggatcct aagccgtggt cgaatgctcc gacttaac 3'

Reakce PCR byla prováděna za podmínek popsaných pro amplifikaci receptorů pro glukokortikoidy, a jejím výsledkem byl fragment o velikosti 1,6 kb. Tento fragment byl zaklonován do plazmidu pSK (rozštěpeného restrikčnímí enzymy Sall/BamHI) a byla stanovena jeho sekvence a tato byla poté srovnána s publikovanou sekvencí (Koelle a další, 1991).

Expresívní plazmid určený k přechodné expresi v kukuřici byl vytvořen zaklonováním fragmentu receptorů pro glukokortikoidy o velikosti 1,5 kb (rozštěpeného restrikčnímí enzymy BamHl/Xhol) a fragmentem o velikosti

1.6 kb kódujícím část odvozené od receptorů z octomilky Drosophila (rozštěpeného restrikčnímí enzymy Sall/BamHI) do • · vektoru pMF6 (rozštěpeného restrikčním enzymem BamHI). Výsledkem tohoto klonování je chimérický plazmid pMF6GREcRS (Obrázek 9).

(iii) Konstrukce expresivního plazmidu určeného k přechodné expresi v kukuřici obsahujícího chimérický receptor pro ekdyzon složený z části odvozené od receptoru pro glukokortikoidy a části odvozené od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis.

Část chimérického receptoru odvozená od receptoru pro glukokortikoidy byla zkonstruována postupem popsaným v Příkladu II(ii). Tvorba části chimérického receptoru pro ekdyzon odvozené od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis zahrnuje zavedení restrikčního místa Sáli ve styčné oblasti DNA vážící domény a pantové domény (aminokyslina číslo 229). Zavedení restrikčního místa Sáli:

Hecsal 5' attgtcgaca aaggcccgag tgcgtggtgc cggag 3' bylo dosaženo mutagenezí provedenou pomocí PCR za využití jedinečného restrikčního místa AccI nacházejícího se ve vzdálenosti 107 bp proti směru transkripce od styčné oblasti (nebo 1007 bp vzhledem k Sek. ID. Č: 4):

Hecracc 5' tcacattgca tgatgggagg catg 3'.

PCR reakce byla provedena za použití polymerázy Taq (2,5 jednotky) v reakčním pufru obsahujícím 100 ng templátové DNA (pSK19R), 100 ng Hecrsal a Hecracc, 20mM

TRIS-HC1 pH 8,4, 50mM KC1, lOmM MgCl₂, 200mM dNTP. Reakce byla zahájena denaturací po dobu 3 minut a dále následovalo 15 cyklů denaturace (1 minuta při 94°C), renaturace (1 minuta při 60°C) a syntéza DNA (1 minuta při 72°C). Získaná DNA byla rozštěpena restrikčními enzymy a spolu 3' koncem fragmentu HecR o velikosti 1,2 kb rozštěpeným restrikčnímy enzymy AccI/SacI zaklonována do pSK (rozštěpeného restrikčními enzymy Sall/SacI). Výsledkem tohoto klonování je plazmid pSKHeCRDEF (obsahující pantovou doménu a doménu receptoru pro ekdyzon z motýla rodu Heliothis odpovědnou za «-»

-44vazbu ligandu). Konstrukce expresívního plazmidu určeného k přechodné expresi v kukuřici obsahujícího chimérický receptor pro ekdyzon složený z části odvozené od receptoru pro glukokortikoidy a části odvozené od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis v sobě zahrnuje ligaci plazmidu pMF6 (rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI/SacI) s fragmentem kódujícím N-konec receptoru pro glukokortikoidy o velikosti 1,5 kb (rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI/Xhol) a s fragmentem o velikosti

1,2 kb vyštěpeným z plazmidu pSKHEcRDEF restrikčními enzymy Sall/Sacl. Výsledkem této ligace je plazmid pMF6GRHEcR (Obrázek 10).

Reportérové plazmidy

Dva reportérové plazmidy byly připraveny vložením dvou párů oligonukleotidů obsahujících šest kopií responzivních elementů pro receptor pro glukokortikoidy (GRE-glucocorticoid response element) do vektoru p221.9 nebo vektoru 221.10 (rozštěpených restrikčními enzymy BamHI/HindlII). Aby byly zmíněné dva páry vloženy ve správné orientaci, byly připraveny dvě sady oligonukleotidů s místy rozpoznávanými restrikčními enzymy. První oligonukleotidový pár GRE1A/B je dlouhý 82 nukleotidů a výsledkem jeho renaturace je fragment DNA ohraničený na 5' konci restrikčním místem HindlII a na 3' konci restrikčním místem Sáli:

GRE 1 A

5'agcttcgact gtacaggatg ttctagctac tcgagtagct agaacatcct gtacagtcga gtagctagaa catcctgtac ag 3'

GRE 1 B

5'tcgactgtac aggatgttct agctactcga ctgtacagga tgttctagct actcgagtcg ctagaacatc ctgtacagtc ga 3'.

Druhý oligonukleotidový pár je na

5' konci ohraničený

-45restrikčním místem Sáli a na 3' konci restrikčním místem

BamHI:

GRE2A 5¹tcgactagct agaacatcct gtacabcgag tagctagaac atcctgtaca gtcgagtagc tagaacatcc tgtacag 3¹

GRE2B 5'gatcctatac aggatgttct agctactcga ctgtacagga tbtctagcta ctcgactgta caggatgttc tagctag 3'.

Získané plazmidy byly pojmenovány p221.9GRE6 (Obrázek 13) a p221.10GRE6 (Obrázek 14) (použity v dalších příkladech). Rozdíl mezi plazmidy p221.9 a p221.10 je ten, že plazmid p221.9 obsahuje minimální promotor -60 35SCaMV, zatímco plazmid p221.10 (p221.10GRE6) obsahuje minimální promotor -46 35SCaMV.

Metoda

Protoplasty byly izolovány ze suspenzní kultury kukuřice odvozené od embryogenního kalusového materiálu BE70 x A188,který byl udržován pasážováním s frekvencí pasáží dvakrát týdně v MS0,5mod. (médium MS doplněné na hodnoty: 3% sacharóza, prolin 690 mg/ml, myo-inozitol g/l, kyselý hydrolyzát kaseinu 0,2 g/l, 2,4-D 0,5 mg/ml, pH 5,6) . Buňky získané ze suspenze dva dny po pasážování byly lyžovány směsí enzymů (2, 0% Celuláza RS, 0,2% Pektolyáza Y23, 0,5M manitol, 5 mM CaCl₂. 2H₂0, 0,5% MES, pH5,6, cca 660mmol/kg) za použití cca lOml/g buněk při 25°C v šeru za stálého míchání po dobu 2 hodin. Buněčný lyzát byl přefiltrován přes síto o velikosti pórů 250 μτη a následně pak přes síto o velikosti pórů 38 μτη, a filtrát byl po dobu 3,5 minut centrifugován při 700 otáčkách za minutu. Získaný supernatant byl odstraněn. Protoplasty byly resuspendovány v promývacím pufru (0,358M KC1, l,0mM NH₄NO₃, 5,0mM CaCl₂.2H₂0, 0,5mM KH₂PO₄, pH 4,8, cca 670 mmol/kg) a centifugovány stejně jako předtím. Tento promývací krok byl opakován ještě jednou. Získaná peleta • ·

-46byla resuspendována v promývacím pufru a protoplasty byly spočteny. Transformace byla provedena metodou využívající polyethyleglykol, popsanou v publikaci Negrutiu a další. Protoplasty byly resuspendovány v médiu MaMg (0,4M manitol, 1, 5 mM MgCl₂, 0,1 % MES, pH 5,6, cca 450mmol/kg) na koncentraci 2 x 10^s buněk/ml a rozděleny do alikvotů o objemu 0,5 ml/pokus (tj., 1 x 10⁶ protoplastů/pokus). Vzorky byly vystaveny tepelnému šoku při 45°C po dobu 5 minut a poté ochlazeny na pokojovou teplotu. Do každého alikvotů bylo přidáno 10 ng jak p221.9GRE6,tak pMF6HRlPAT (GR) (1 mg/ml), alikvoty byly jemně promíchány a okamžitě k nim bylo přidáno 0,5 ml teplého (cca 45°C) roztoku PEG (40% PEG 3350 MW v roztoku 0,4M manitol, 0,1M Ca(N0₃)₂, pH 8,0) . Celá směs byla důkladně, ale šetrně promíchána. Jednotlivé alikvoty byly inkubovány při pokojové teplotě po dobu 20 až 25 minut, a poté bylo ke každému alikvotů postupně (po 1 ml, vždy zamíchat) přidáno celkem 5 ml KC1 (pH 5,6, cca 530mmol/kg). Před centrifugací protoplastů provedenou stejně jak je zmíněno výše, byly jednotlivé alikvoty inkubovány dalších 10 až 15 minut. Každý alikvot byl resuspendován v 1,5 ml kultivačního média, (médium MS, 2% sacharóza, 2 mg/ml 2,4-D, 9% manitol, pH 5,6,cca 700mmol/kg) +/- 0,0001M dexamethazon (glukokortikoid). Vzorky byly před sklizením inkubovány ve miskách s průměrem 3 cm při 25°C, ve tmě po dobu 24 až 48 hodin. S využitím fluorometru Perkin-Elmer LS-35 bylo v jednotlivých miskách provedeno fluorometrické stanovení aktivity GUS s využitím substrátu 4-methylumbelliferyl-D-glukuronid (Jefferson a další, 1987). Koncentrace proteinů v tkáňových homogenátech byla určena stanovením proteinů soupravou firmy Bio-Rad (Bradford, 1976). Tento postup byl zopakován pro každý účinný konstrukt.

-4Ί-

Výsledky: Stanovení reportérových genů

Byl vytvořen reportétový genový konstrukt (p221.9GRE6) obsahující reportérový gen GUS pod kontrolou promotoru -60 CaMV 35S s 6 kopiemi responzivních elementů pro receptor pro glukokortikoidy. Aby bylo možné otestovat, je-li tento konstrukt funkční v kukuřičných protoplastech, bylo provedeno stanovení, při kterém byly kukuřičné protoplasty kotransformovány reportérovým konstruktem p221.9GRE6 a účinným konstruktem pMF6HRlPAT (GR) obsahujícím celý receptor pro glukokortikoidy.

Obrázek 15 ukazuje, že samotný reportérový konstrukt p221.9GRE6 nebo reportérový konstrukt spolu s efektorem pMF6HRlPAT (GR) nevykazují v nepřítomnosti aktivačního činidla význačnou hladinu exprese. Jestliže ovšem byl reportérový konstrukt spolu s účinným konstruktem kotransformován do kukuřičných protoplastů, pak za přítomnosti 0,0001 M dexamethasonu (glukokortikoid), bylo pozorováno významné zvýšení aktivity reportérového genu (Obrázek 15). Tato odpověď je specifická vzhledem ke glukokortikoidu, protože přítomnost steroidu Muristeronu A nemá za následek zvýšenou hladinu exprese. Tyto studie zřetelně ukazují, že reportérový genový konstrukt p221.9GRE6 je schopen monitorovat genovou expresi zprostředkovanou dvojicí efektor/ligand.

Účinný konstrukt chimérického receptoru pro ekdyzon zprostředkovává inducibilní expresi při pokusech v přechodně transformovaných kukuřičných protoplastech

Byl zkonstruován chimérický obsahující doménu odvozenou od octomilky Drosophila odpovědnou a transaktivační doménu vážící doménu účinný plazmid pMF6GREcRS pro ekdyzon z ligandu a DNA odvozenou od receptoru za vazbu receptoru pro glukokortikoidy. Byly provedeny série kotransformací kukuřičných protoplastů, aby bylo možné potvrdit, že reportérový genový konstrukt p221.9GRE6 může

reagovat na účinný konstrukt chimérického receptoru pro ekdyzon.

Obrázek 16 ukazuje, že samotný reportérový konstrukt p221.9GRE6 nebo reportérový konstrukt spolu s efektorem (pMF6GREcRS) nevykazují v nepřítomnosti aktivačního činidla význačnou hladinu exprese. Jestliže ovšem byl reportérový konstrukt spolu s účinným konstruktem kotransformován do kukuřičných protoplastů, pak za přítomnosti 100 μΜ Muristeronu A, bylo pozorováno významné zvýšení aktivity reportérového genu. Tato odpověď je specifická vzhledem k Mur-isteronu A, protože přítomnost glukokort ikoidu dexamethasonu nemá za následek zvýšenou hladinu exprese. Tyto studie zřetelně ukazují, že reportérový genový konstrukt p221.9GRE6 je schopen monitorovat genovou expresi zprostředkovanou dvojicí účinný konstrukt chimérického receptoru pro ekdyzon/ligand.

Byl vytvořen druhý chimérický účinný konstrukt pMF6GRHEcR obsahující doménu odvozenou od receptoru pro ekdyzon z motýla rodu Heliothis odpovědnou za vazbu ligandu. Jestliže byl tento plazmid kotransformován spolu s reportérovým plazmidem p221.9GRE6 do kukuřičných protoplastů, nebyla za přítomnosti 100 μΜ Muristeronu ani za přítomnosti 100 μΜ dexamethasonu pozorována žádná odpověď (Obrázek 17). Tato data zřetelně naznačují, že domény odpovědné za vazbu ligandu z octomilky Drosophila a z motýla rodu Heliothis mají rozdílné vlastnosti.

Když byl účinný plazmid pMF6GREcRS obsahující doménu odpovědnou za vazbu ligandu (z octomilky Drosophila) testován spolu s reportérovým plazmidem p221.9GRE6 za přítomnosti nesteroidních agonistů ekdyzonu RH5849 a RH5992 (mimikují přítomnost ekdyzonu), nebyla pozorována žádná aktivita reportérového genu indukovaná těmito chemickými činidly (Obrázky 18 a 19).

-49Když byl účinný plazmid pMF6GRHEcR obsahující doménu odpovědnou za vazbu ligandu (z motýla druhu Heliothis) testován spolu s reportérovým plazmidem p221.9GRE6 za přítomnosti nesteroidního agonisty ekdyzonu a RH5992 (mimikuje přítomnost ekdyzonu), byla pozorována významná aktivita reportérového genu indukovaná těmito chemickými činidly (Obrázek 20). Tato data ukazují, že doména odpovědná za vazbu ligandu z motýla druhu Heliothis má odlišné vlastnosti od receptoru z octomilky Drosophila v tom smyslu, že receptor pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis reaguje na přítomnost nesteroidního agonisty ekdysteroidu RH5992. Obrázek 21 ukazuje, že účinný plazmid pMF6GRHEcR přispívá k indukovatelnosti reportéru p221.9GRE6,které je dosaženo prostřednictvím RH5992 (tato je závislá na dávce). Indukce byla pozorována v rozmezí koncentrací 1 μΜ až 100 μΜ RH5992.

Příklad 4 Testování účinných vektorů v protoplastech tabáku

Prováděné experimenty popsané v předchozím příkladě demonstrovaly specifické účinky RH5992 na pMF6GRHEcR v protoplastech kukuřice. Cílem tohoto příkladu je ukázat možnost obecné aplikace systému sloužícího jako přepínač genové exprese využívajícího chimérický receptor pro ekdyzon složený z části odvozené od receptoru pro glukokortikoidy a části odvozené od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis. Jako zdroj pro produkci protoplastů byly použity kultury výhonků tabáku Samsun pěstované na tuhém médiu SM + 3% sacharóza v místnosti s definovaným mikroklimatem (16 hodin den/8 hodin noc, 25°C, relativní vlhkost 55%) . Listy byly rozřezány rovnoběžně s hlavním cévním svazkem, z materiálu byly odstraněny všechny větší cévy a nařezané plátky byly na jednu hodinu umístěny do roztoku CPW13M 13% manitol, pH5,6,cca 860 mmol/kg). Poté byl tento roztok nahrazen směsí enzymů (0,2% celuláza,

-50• · · · · ···· ······ · · · ···♦ · • · · · · · · « ·· · · · · · · ·

0,05% Macerozym R10 v CPW9M (CPW13M, ale s 9% manitolem), pH5,6,cca 600 mmol/kg) a inkubace probíhala ve tmě při 25°C přes noc (cca 16 hodin) . Po štěpení byla tkáň pinzetou rozcupována a všechny větší nerozštěpené kousky byly odstraněny. Celá směs byla přefiltrována přes síto o velikosti pórů 75 pm a filtrát byl centrifugován po dobu 3,5 minuty při 600 otáčkách/minuta. Získaný supernatant byl odstraněn. Peleta byla rozsuspendována v roztoku 0,6M sacharózy a centrifugována po dobu 10 minut při 600 otáčkách/minuta. Plovoucí vrstva protoplastů byla odebrána pomocí Pasteurovy pipety a zředěna CPW9M (pH 5,6,cca 560 mmol/kg). Protoplasty byly opět centrifugovány po dobu 3,5 minuty při 600 otáčkách/minuta, peleta resuspendována v CPW9M a stanoven počet protoplastů. Byla provedena transformace využívající PEG postupem zmíněným výše, ovšem lehce modifikovaná. Protoplasty byly rozsuspendovány v MaMg na koncentraci 2xl0⁶/ml a rozděleny na alikvoty o objemu 200 μΐ/pokus (tj . 4xl0⁵ protoplastů/pokus) . K alikvotům bylo přidáno 20 pg jak pMF6GRHEcR tak p221.9GRE6 (1 mg/ml) a poté následoval přídavek 200 pl roztoku PEG a celá směs byla mírně promíchána. Před přídavkem 5 ml média MSP19M (médium MS, 3% sacharóza, 9% manitol, 2 mg/ml NAA, 0,5 mg/ml ΒΆΡ, pH 5,6, cca 700 mmol/kg) +/- 10 μΜ RH5992 byly protoplasty inkubovány 10 minut při pokojové teplotě. Po opatrném zamíchání byly protoplasty kultivovány v horizontálně umístěných zkumavkách na světle při 25°C. Po cca 24 hodinách byly protoplasty sklizeny a byla u nich stanovena aktivita GUS.

Účinný konstrukt (i) Tvorba expresivního vektoru pro expresi ve dvouděložných rostlinách

Vytvořený vektor je odvozený od vektoru pMF6. Plazmid pMF6GREcRS byl rozštěpen restrikčním enzymem Pstl za vzniku tří fragmentů, jmenovitě fragmentů o velikosti 3,4 kb

-51·· • · (pMF6,Adh bez intronú) , 3,2 kb (GREcRS) a 0,5 kb (Adh intron I) . Výsledkem izolace a zpětné ligace fragmentů o velikostech 3,2 a 3,4 kb byl vznik plazmidu pMF7GREcRS. Plazmid pMF7GREcRS byl rozštěpen restrikčními enzymy EcoRl/SacI a výsledkem tohoto štěpení byl vznik vektoru pMF7 (EcoRI/SacI) o velikosti 3,4 kb, který byl následně Tento purifikovaný vektor byl s DNA kódující N-konec receptoru velikosti izolován a purifikován. použit k ligační reakci pro glukokortikoidy o restrikčními enzymy EcoRl/Xhol) a s receptoru 1,2 kb Výsledkem (Obrázek 23).

pro ekdyzon z (rozštěpené této ligace motýla druhu restrikčními byl vznik

1,5 kb (rozštěpené

DNA kódující C-konec

Heliothis enzymy plazmidu o velikosti

Sall/SacI).

pMF7GRHEcR

Reportérový plazmid za účelem přechodné byly bez jakýchkoliv při kterých byly tyto protoplastech z listů

Reportérové plazmidy vytvořené transformace protoplastů kukuřice úprav použity v experimentech, plazmidy přechodně exprimovány v tabáku.

Výsledky: Účinné konstrukty chimérického receptoru pro ekdyzon zprostředkovávají při stanoveních prováděných v protoplastech tabáku inducibilní expresi

Tyto experimenty byly provedeny za účelem prokázání, že účinný plazmid pMF6GRHEcR může v protoplastech buněk mezofylu z tabáku přispívat k expresi reportérového plazmidu p221.9GRE6 indukované chemickými látkami.

Obrázek 24 ukazuje, že samotný reportérový konstrukt s efektorem v protoplastech tabáku v chemického činidla význačnou nebo reportérový konstrukt spolu nevykazuj í aktivačního p221.9GRE6 (pMF7GRHEcR) nepřítomnosti hladinu exprese. Jestliže byl ovšem reportérovy- konstrukt spolu s účinným konstruktem kotransformován do protoplastů • · _ςο _ ··· ··· ···· ······· · · * · · · · · • · ··· ··· ··· · ·· ··· ·· ·· tabáku, pak za přítomnosti 10 μΜ RH5992 bylo pozorováno významné zvýšení aktivity reportérového genu. Tato data ukazují, že účinný genový konstrukt chimérického receptorů pro ekdyzon obsahující doménu z motýla druhu Heliothis odpovědnou za vazbu ligandu může jak v jednoděložných, tak ve dvouděložných rostlinách přispívat k expresi reportérového genového konstruktu indukované nesteroidním ekdysteroidem.

Příklad 5 Chimérická aktivita v savčích buňkách

Účinné konstrukty (i) Konstrukce chimérického receptorů pro ekdyzon složeného z části odvozené od receptorů pro glukokortikoidy a části odvozené od receptorů pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis.

Savčím expresívním vektorem použitým v tomto experimentu byl pcDNA3 (Invitrogen). Do vektoru pcDNA3 rozštěpeného restrikčním enzymem BamHI byl zaveden fragment DNA GRHERcR o velikosti 2, 7 kb (izolovaný z pMF6GRHEcR štěpením pomocí restrikčního enzymu BamHI). Správná orientace inzertu byla stanovena mapováním restrikčních míst. Za účelem zjištění správné orientace a inzerce byla v místech připojení stanovena sekvence DNA (pcDNA3GRHEcR, Obrázek 25).

Reportérový konstrukt

Reportérový plazmid použitý v systému savčích buněk byl vytvořen nahrazením fragmentu CRESW, vyštěpeného z plazmidu pSWBGAL restrikčními enzymy Spel/Clal, syntetickým fragmentem DNA o velikosti 105 bp obsahujícím 4 kopie responzivního elementu pro receptor pro glukokortikoidy • ·

(GRE) a ohraničeným na 5' konci restrikčním místem Spěl a na 3' konci restrikčním místem AflII.

Oligonukleotidy byly syntetizovány za použití sekvencí:

GREspel

agctactcga

catcctgtac agtagctaga atcgagtagc tagaacatcc cac ' tgtacagtcg acatcctgta

GREafl2

agctactcga

tgttctagct actcgactgt

aacatcctgt acaa 3'.

Tyto dva oligonikleotidy byly purifikovány, renaturovány a zaligovány do pSWBGAL rozštěpeného restrikčními enzymy Spel/Clal. Výsledkem je vznik plazmidu pSWGRE4 (Obrázek 26).

Výsledky - Chimérický HEcR řídí přechodnou expresi reportérového genu v savčích buňkách

Jestliže byl reportérový genový konstrukt pSWGRE4,nesoucí promotor β-globinu o minimální velikosti obsahující čtyři kopie responzivních elementů pro receptor pro glukokortikoidy a připojený k reportérovému genu kódujícímu β-galaktosidázu, zaveden do CHO buněk, nebyla detekována žádná exprese reportérového genu. Obdobně nebyla detekována žádná exprese reportérového genu v případě, kdy byly buňky CH0-K1 a HEK293 kotransformovány plazmidem pSWGRE4 a účinným plazmidem pcDNA3GRHEcR obsahujícím transaktivační doménu a doménu vážící DNA odvozené od receptoru pro glukokortikoidy a doménu odpovědnou za vazbu ligandu odvozenou od receptoru pro ekdyzon z motýla druhu Heliothis, které jsou pod kontrolou promotoru CMV. Jestliže byly kotransformované buňky CHO (Obrázek 27) a HEK293 (Obrázek 28) inkubovány v přítomnosti nesteroidního

-54agonisty ekdyzonu RH5992 (mimikuje přítomnost ekdyzonu), byla pozorována zvýšená aktivita reportérového genu indukovaná přídavkem zmíněné chemické látky. Indukce aktivity reportérového genu byla rovněž pozorována v případě, kdy byly buňky HEK293 transfekovány pcDNA3GRHEcR spolu s reportérem a vystaveny působení Muristeronu A (Obrázek 28) .

Příklad 6 Testovací (screeningový) systém umožňuje, aby byly v savčích buňkách testovány nové chemické aktivátory a modifikované domény odpovědné za vazbu ligandu

Tento testovací systém je založen na zjištění, že chmérický receptor byl aktivován v přítomnosti RH5992. Testování (screening) bylo prováděno za použití buněk CHO přechodně transformovaných společně konstrukty pSWGRE4 (reportérový gen) a pcDNA3GRHEcR (účinný konstrukt). V prvním případě bylo testováno 20 sloučenin odvozených od RH5992. U 7 z 20 testovaných sloučenin bylo pozorováno, že buňky vystavené působení těchto sloučenin vykazují ve srovnání s buňkami, které nebyly vystaveny působení testované látky, zvýšenou aktivitu reportérového genu. Ve druhém testu byly přechodně transformované buňky CHO vystaveny působení 1000 náhodně vybraných sloučenin. Bylo zjištěno, že dvě sloučeniny aktivují reportérový gen ve větší míře, než je tomu u kontrolního pokusu (bez přídavku aktivátoru). Výsledek druhého testu naznačuje, že toto stanovení využívající živých buněk je robustním a rychlým přístupem k testování malých knihoven sloučenin, při němž mohou být týdně otestovány tisíce sloučenin.

Příklad 7 Stabilně transformované rostliny tabáku

Vektory pro stabilní transformaci rostlin tabáku • · • ·

-55Před přenesením do binárního vektoru byly komponenty vektorů použitých pro stabilní transformaci tabáku složeny v plazmidu pBluescript. Tvorba stabilně transformovaných rostlin zahrnuje vytvoření vektoru, ve kterém jsou obě složky systému k použitého jako přepínač genové exprese (tj . efektor a reportér) umístěny na stejném konstruktu, a následné zavedení tohoto vektoru do rostlinz.

K vytvoření čtyř vektorů použitých ke stabilní transformaci rostlin tabáku byl použit postup popsaný níže. Tento postup se skládá ze tří kroků:

1. _ Vektor pBluescript SK rozštěpený restrikčními enzymy Hindi II/EcoRI byl ligován bud' s GRE6-4635SCaMVGUSNOS rozštěpeným restrikčními enzymy HindIR/EcoRI (z p221. 1 0GRE6) nebo s GRE6-6035SCaMVGUSNOS rozštěpeným restrikčními enzymy HindlII/EcoRI (z p221.9GRE6). Výsledkem těchto ligačních reakcí jsou plazmidy pSK-46 a pSK-60.

2. Tento krok obsahuje připojení chimérického receptoru (35SGRHEcRNOS nebo 35SGRVP16HEcRNOS) k pSK-60 nebo k pSK-46. Plazmid pSK-60 (nebo pSK-46) rozštěpený restrikčním enzymem Xbal byl ligován buď s fragmentem DNA 35SGRHEcRNOS o velikosti 3,4kb rozštěpeným restrikčním enzymem Xbal nebo s fragmentem DNA 3 5SGRVP16HEcRNOS o velikosti 3, Okb

Výsledkem pSKESl pSKES2 pSKES3 pSKES4 rozštěpeným restrikčním enzymem Xbal. těchto ligačních reakcí jsou plazmidy (pSKGRE 6-35 603 5 SCaMVGUSNOS-3 5 SGRHE cRNOS) (pSKGRE6 -4 6 3 5 SCaMVGUSNOS-3 5 SGRHEcRNOS) , (pSKGRE 6 - 6 0 3 5 S CaMVGUSNOS-3 5 SGRVP16HEcRNOS) (pSKGRE6 -4 63 5SCaMVGUSNOS-3 5SGRVP16HEcRNOS) . Přenos z vektorů odvozených od vektoru pBluescript do binárních vektorů. Přenos fragmentů DNA ES1(Obrázek 29), ES2 (Obrázek 30), ES3 (Obrázek 31)

-56• ♦ ·· · «··· ·· · ···· ···· • · · · 9 9 9 9 99 • 9999 999 99 999 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 99 9 9 nebo ES4 (Obrázek 32) do binárního vektoru JR1 se skládá z pěti kroků:

(i) Štěpení vektorů pSKESl (ES2, ES3 a ES4) restrikčnímí enzymy Apal a Notl za účelem uvolnění inzertů z vektoru pBluescript.

(ii) Dva fragmenty DNA byly po dobu 2 hodin při 3 7°C v roztoku Tris-HCl, MgCl, 80 μΜ SAM (S-adenosylmethionin) methylovány v sekvencích odpovídajících sekvenci restrikčního místa BamHI působením 20 jednotek methylázy BamHI.

(iii) Ligace linkeru Apal/Notl na fragment. Linker byl navržen tak, aby uvnitř obsahoval restrikční místo BamHI:

ApaBNotl 5' cattggatccttagc 3' a

ApaBNot2 5¹ggccgctaaggatccaatgggcc 3'.

(iv) Restrikční štěpení chráněného fragmentu s připojenými linkery enzymem BamHI a rozdělení produktů štěpení na 1% (w/v) agarózovém gelu. Chráněný fragment DNA (o velikosti 5,5 kb) byl z gelu vyříznut a purifikován.

(v) Ligace vektoru JRI rozštěpeného restrikčním enzymem BamHI a chráněného purifikovaného fragmentu dala vzniku plazmidu JRIESI (JRIES2, JRIES3 nebo JRIES4). Vzniklá rekombinatní DNA byla charakterizována restrikčním mapováním a byla u ní rovněž stanovena sekvence styčných oblastí.

Konstrukt pESl určený k transformaci rostlin obsahující kazetu s chimérickým receptorem pro ekdyzon a reportérovým genem, byl za použití metody zamražování/rozmražování popsané v publikaci Holsters a další (1978) přenesen do mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Transformované rostliny tabáku (Nicotiana tabacum Samsun) byly vytvořeny s využitím metody listových kruhů (Bevan, 1984). Výhonky byly regenerovány na médiu obsahujícím kanamycin o koncentraci 100 mg/ml. Po zakořenění byly rostlinky přeneseny do skleníku a pěstovány v podmínkách 16 hodin světla/8 hodin tmy.

-57Výsledky Účinné konstrukty chimérického receptoru pro ekdyzon zprostředkovávají při stanoveních prováděných ve stabilně transformovaných rostlinách tabáku inducibilní expresi

Transgenní rostliny tabáku médiu vystaveny působení semenáčky transgenních hydroponicky v přítomnosti byly v buněčné kultuře v MS 100 μΜ RH5992. Navíc byly rostlin tabáku pěstovány nebo nepřítomnosti RH5992. V aplikován roztok o mM. Ve všech třech dalších experimentech byl na listoví 8-týdenních rostlin tabáku pěstovaných ve skleníku koncentraci RH5992 odpovídající 5 popsaných typech experimentů byly aktivity GUS srovnatelné s hladinami aktivity kontrolních rostlinách divokého typu, zatímco aktivity GUS neindukované hladiny

GUS v indukované pomocí RH5992 byly výrazně zvýšené.

Modulace a optimalizace přepínače genové exprese využívajícího receptor pro ekdyzon

Příklad 8 Kmeny kvasinek použitelné k primárnímu testování (screeningu) chemických knihoven

Za účelem nalezení chemických látek, které mohou být použity jako přepínače genové exprese, byla vytvořena sada kmenů kvasinek sloužící jako primární testovací systém. Jednou z požadovaných vlastností zmíněných chemických látek by měla být vysoká afinita, která má za následek vysoký stupeň aktivace, ale zároveň by tyto chemické látky měly mít rozdílné fyzikálně-chemické charakteristiky, aby bylo možné rozšířit oblast použití této technologie. Navíc

-58• · ··♦· vytvoření tohoto kmene rovněž ukazuje obecné znaky takového přepínače genové exprese.

Účinný vektor

Pro použití v kvasinkách byl vytvořen základní vektor YCpl5Gal-TEV-112, který se skádá ze:

základní kostry - modifikovaná verze plazmidu pRS315 (Sikorski a Hieter (1989), Genetics 122, 19 až 27) kyvadlový vektor pro použití v kvasinkách se selekčním markérem LEU2;

promotoru ADH1 (fragment BamHI- HindlII) a terminátoru ADH1 (fragment Notl- BamHI) z pADNS (Colicelli a další, PNAS 86,3599 až 3603) ;

DNA vážící domény GAL4 (aminokyseliny 1 až 147; sekvence GAL4 je popsána v Laughon a Gesteland (1984), Mol. Cell Biol. 4,260 až 267) z pSG424 (Sadowski a Ptashne (1989) Nuc. Acids Res. 17,7539);

aktivační domény - kyselá aktivační oblast odpovídá aminokyselinám 1 až 107 aktivační oblasti B112 získané z plazmidu pB112 (Ruden a další (1991), Nátuře 350,250 až 252) .

Tento plazmid obsahuje mezi DNA vážící doménou a aktivační doménou jedinečná restrikční místa EeoRI, Ncol a Xbal.

Do tohoto vektoru byl vložen fragment DNA kódující receptor pro ekdyzon z moýla druhu Heliothis (vytvořený pomocí PCR) obsahující pantovou doménu, doménu odpovědnou za vazbu ligandu a C-konec. Oligonukleotid ohraničující 5' konec kódujícího vlákna je ohraničen restrikčním místem Ncol a začíná na pozici aminokyseliny 259:

HecrNcoI 5¹ aattccatggtacgacgacagtagacgatcac 3'.

-59Oligonukleotid ohraničující 3' konec kódujícího vlákna je ohraničen restrikčním místem Ncol a kóduje sekvenci končící aminokyselinou 571:

polymerázy Vent Získaný fragment byl purifikován a rozštěpeného této ligační (Obrázek 34). YGALHeCRB112,

HecRXbal 5' ctgaggtctagagacggtggcgggcggcc 3 Reakce PCR byla prováděna za použití za podmínek popsaných v Příkladu IA.

rozštěpen restrikčními enzymy Ncol a Xbal, zaligován do vektoru Ycpl5GALTEV112 restrikčními enzymy Ncol/Xbal. Výsledkem reakce byl plazmid YGALHeCRB112 nebo TEV-B112 Kvůli snížení konstitutivní aktivity plazmidu byl vytvořen plazmid YGALHeCR, ve kterém byl aktivátor B112 odstraněn štěpením plazmidu YGALHeCRB112 restrikčními enzymy Xbal/Spel a následnou ligací vzniklého vektoru (tj. rozštěpení restrikčních míst Spěl a Xbal poskytuje navzájem komplementární konce)(TEV-8,Obrázek 33). Účinný plazmid byl vytvořen tak, že transaktivační doména B112 byla z plazmidu YGalHecRBl 12 odstraněna restrikčním štěpením enzymem Xbal a nahrazena fragmentem DNA kódujícím transaktivační doménu VP16 (kódující aminokyseliny číslo 441 až 490 včetně stop kodónu). Výsledný vektor byl pojmenován YGalHecRVP16 nebo

TEWP16-3 (Obrázek 35) .

Reportérový konstrukt pro použití v kvasinkách

Jak kmen S. cerevisiae GGY1: : 171 (Gill a Ptashne (1987) Cell 51,121 až 126), tak kmen S. cerevisiae YT6: :

171 (Himmelfarb a další (1990), Cell 63,1299 až 1309) obsahují reportérové plazmidy skládající se z genu pro β-galaktosidázu z E. coli řízeného promotorem GAL1 reagujícího na přítomnost GAL4. Tyto plazmidu jsou integrovány v loku URA3. Reportérový kmen YT6: : 185 obsahuje reportérový plazmid pJP185 (dvě uměle připravená místa GAL4 řídící gen pro β-galaktosidázu) integrovaný v YT6 do loku URA3 (Himmelfarb a další). (Poznámka rodičovské kmeny YT6 a GGY+ mají v genech GAL4 a GAL8 0

zavedeny mutace, takže reportérové geny jsou za nepřítomnosti plazmidu exprimujícího GAL4 neaktivní).

Stanovení v kvasinkách

Byl použit standardní transformační protokol (postup s využitím octanu lithného) a selekce kolonií vysetím buněk na selekční médium (v případě plazmidu YCplSGal-TEV-112 se jedná o médium bez leucinu) - jak jsou popsány v Guthrie a Fink (1991) , Guide to Yeast Genetics a Molecular Biology: Methods in Enzymology, svazek 194,Academie Press). Stanovení reportérové aktivity je modifikací stanovení popsaného v Ausabel a další (1993), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley), kapitola 13.

Výsledky

Automatický testovací (sereeningový) systém umožňuje testování nových chemických aktivátorů a modifikovaných domén odpovědných za vazbu ligandu v kvasinkách

Byl vytvořen účinný vektor pYGALHEcRB112 obsahující DNA vážící doménu GAL4,aktivační doménu B112 a doménu z motýla Heliothis virescens odpovědnou za vazbu ligandu. V kombinaci s reportérovým vektorem GAL vytváří pYGALHEcRB112 základ rychlého a účinného (vzhledem k objemu testovaných sloučenin) stanovení, které je z finačního hlediska velmi nenáročné. Toto stanovení v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae) bude použito k testování nových nesteroidních agonistů ekdyzonu, které mohou být komerčně využity jako nové insekticidy nebo účinné aktivátory přepínače genové exprese využívající receptor pro ekdyzon. Skutečnost, že je možné vytvořit účinný systém použitelný ke kontrole genové exprese, které je dosaženo pomocí chemických látek, vytváří základ inducibilního systému pro produkci peptidů v kvasinkách.

Kvasinkový testovací systém vytváří základ pro testování zesílené vazby ligandu za použití reportérového genového vektoru lacZ, s jehož pomocí je možné kvantitativně stanovovat příspěvky jednotlivých mutací v doméně odpovědné za vazbu ligandu. Jinou možností je testování schopnosti silnější vazby ligandu s využitím selekční kazety, ve které je reportér lacZ nahrazen nějakým selekčním markérem jako například selekčním markérem pro uráčil (URA3), tryptofan (Trpí) nebo leucin (Leu2), a histidin (His). Buňky nesoucí konstrukty založené na pYGALHEcRB112 se změnami v doméně odpovědné za vazbu ligandu jsou pěstovány v selekčním podmínkách, které potlačují růst kvasinek obsahujících doménu odpovědnou za vazbu ligandu divokého typu. Buňky, které přežijí za přítomnosti induktoru, jsou znovu testovány a poté je jejich DNA sekvenována za účelem určení mutací, které přispívají k vytvoření rezistence.

Příklad 9

Konstrukce

Optimalizace chimérického receptorů za použití silného transaktivátoru savčího expresívního plazmidu s chimérickým receptorem obsahujícího proteinové sekvence VP16 z viru

Herpes Simplex

Konstrukce tohoto chimérického receptorů je založena na náhradě sekvencí kódujících transaktivační doménu z receptorů pro glukokortikoidy sekvencemi kódujícími protein VP16 viru Herpes Simplex. K vytvoření tří fragmentů, jejichž sestavením vznikl chimérický receptor, byla tudíž použita PCR. Tato PCR byla provedena postupem popsaným v Příkladu II, iii. První fragment obsahuje Kozákovu konvenční sekvenci a aminokyseliny 1 (startovní methionin) až 152 z receptorů pro glukokortikoidy. Oligonukleotidy použité k vytvoření tohoto fragmentu obsahují v

• ·

-62oligonukletidu ohraničujícímu 5' konec kódujícího vlákna restrikční místo EcoRI:

GR1A 5' atataaattccaccatggactccaaagaatc 3' a v oligonukletidu ohraničujícímu 3' konec kódujícího vlákna restrikční místo Nhel:

GRIB 5' atatgctagctgtgggggcagcagacacagcagtgg 3¹.

Druhý fragmnet rovněž náleží k receptoru pro glukokortikoidy a začíná restrikčním místem Nhel nacházejícím se ve stejném čtecím rámci jako aminokyselina číslo 406:

GR2A 5'atatoctagctccagctcctcaacagcaacaac 3' a končí restrikčním místem Xhol v místě kódujícím aminokyselinu číslo 500:

GR2B 5'atatctcgagcaattccttttatttttttc 3'.

Tyto dva fragmnety byly zaligovány do vektoru pSK rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRI/SacI. Ligační reakce obsahovala GR1A/B EcoRI/Nhel, GR2A/B Nhel/Xhol a HEcR Sall/SacI (z pSKHEcRDEF). Výsledkem této ligace byl vznik plazmidu pSKGRDHEcR. Bylo ukázáno, že sekvence GR a místa spojení fragmentů neobsahují žádné nežádoucí mutace.

Třetím amplifikovaným fragmentem byla sekvence kódující aminokyseliny 411 až 490 proteinu VP16 z viru Herpes Simplex. Amplifikovaný fragment byl ohraničen restrikčními místy Spěl. Tato restrikční místa vytvářejí po rozštěpení restrikčním enzymem Spěl sekvenci komplementární k místu Nhel. Použitím oligonukleotidů:

VP16C 5¹ attactagttctgcggcccccccgaccgat 3¹ a

VP16E 5' aattactagtcccaccgtactcgtcaattcc 3' byl vytvořen fragment o velikosti 180 bp, který byl rozštěpen restrikčním enzymem Spěl a zaligován do vektoru pSKGRAHEcR rozštěpeného restrikčním enzymem Nhel. Výsledkem • «

-63této ligace byl vznik vektoru pSKGRVP16HEcR. Vektor pSKGRVP16HEcR byl sekvenován a bylo zjištěno, že neobsahuje žádné mutace, a že místa spojení jednotlivých fragmentů jsou rovněž ve stejném čtecím rámci jako sekvence kódující receptor pro glukokortikoidy.

Fragment GRVP16HEcR o velikosti 2, 2 kb rozštěpený restrikčními enzymy EcoRV/Notl byl zaligován do vektoru pcDNA3 rozštěpeného restrikčními enzymy EcoRV/Notl. Výsledkem této ligace byl vznik vektoru pcDNA3GRVP16HEcR (Obrázek 36).

Konstrukce expresívních účinných plazmidu obsahujících chimérický receptor se sekvencemi VP16 použitých k přechodné expresi v rostlinách

Ke klonování fragmentu GRVP16HeCR do expresívního vektoru tabáku (pMF7b) a expresívního vektoru kukuřice (pMF6) byl použit stejný postup. Fragment DNA o velikosti 2, 2 kb byl izolován z pcDNA3GRVP16HeCR restrikčním štěpením pomocí BamHI a zaligován do plazmidu pMF6 rozštěpeného restrikčním enzymem BamHI (nebo plazmidu pMF7b rozštěpeného restrikčním enzymem BamHI). Výsledkem těchto ligačních reakcí jsou vektory pMF6GRVP16HeCR (Obrázek 37) (nebo pMF7GRVP16HeCR) (Obrázek 38).

Výsledky Přidání silných aktivačních domén zesiluje přepínač genové exprese využívající receptor pro ekdyzon

K vektoru pMF6GRHEcR použitého k transformaci protoplastů kukuřice byla přidána transaktivační doména VP16 z viru Herpes Simplex, čímž byl vytvořen vektor pMF6GRVP16HEcR. Když byly protoplasty kukuřice kotransformovány reportérovým konstruktem p221.9GRE6 spolu s plazmidem pMF6GRHEcR, pak byly za přítomnosti 100 μΜ RH5992 naměřeny zvýšené hladiny exprese. Obrázek 39 ukazuje, že RH5992 je schopná indukovat hladinu GUS na hodnoty srovnatelné s • ·

hodnotami pozorovanými u pozitivních kontrol (p3SSCaMVGUS) a navíc, že tento účinek je úměrný použitému množství RH5992.

Za účelem stabilní transformace rostlin tabáku byly vytvořeny vektory obsahující VP16 (pES3 a pES4). U transgenních rostlin nesoucích pES3 a pES4 byly po transformaci, ve srovnání s transgenními rostlinami nesoucími pESl a pES2 (bez VP16) , naměřeny, poté co byly tyto rostliny vystaveny působení RH5992, zvýšené hladiny GUS.

Pro přechodnou transfekci savčích buněčných linií byl zkonstruován savčí vektor s posilovačem transkripce VP16. Vzhledem k experimentům, při kterých byl použit účinný konstrukt (pCDNA3GRHEcR) bez přidání VP16,byly u experimentů s pcDNA3GRVP16HEcR naměřeny zvýšené aktivity reportérového genu.

Kyselé aktivační domény jsou zřejmě univerzálními aktivátory v eukaryotických buňkách (Ptashne (1988), Nátuře 335,683 až 689). Jinými vhodnými kyselými aktivačními doménami, které mohou být použity při konstrukci fúzních proteinů, jsou aktivační oblasti samotného GAL4 (oblast I a oblast II; Ma a Ptashne(1987), Cell 48,847 až 853), aktivátor GCN4 u kvasinek (Hope a Struhl (1986), Cell 46,885 až 894) a protein VP16 z viru Herpes Simplex (Triezenberg a další (1988), Genes Dev., 2, 718 až 729 a 730 až 742) .

Za účelem zesílení genové exprese mohou být k chimérickému receptoru pro ekdyzon přidány jiné kyselé a nekyselé sekvence zesilovačů transkripce například z rostlinných nebo živočišných druhů nebo z hub.

Za účelem zesílení genové exprese mohou být rovněž vytvořeny chimérické nebo syntetické aktivační domény.

• ·

-65Příklad 10 Optimalizace chimérického účinného konstruktu, které je dosaženo nahrazením domény z motýla druhu Heliothis odpovědné za vazbu ligandu doménou odpovědnou za vazbu ligandu (ekdyzonu) z j iných druhů

Výsledkem mutgeneze domény odpovědné za vazbu ligandu-ekdyzonu je zvýšená citlivost chimérického receptoru k chemické sloučenině použité k aktivaci. Této mutageneze může být dosaženo zavedením delecí v doméně odpovědné za vazbu ligandu za použití error prone PCR (Caldwell a další, PCR Meth. Applic 2, 28 až 33,1992), a

PCR DNA shuffling prováděné in vitro(Stemmer, Nátuře 370,389 až 391,1994). Za účelem zvýšení účinnosti zmíněných technik jsme vyvinuli testovací systém pro testování zvýšených hladin indukované exprese (viz. níže).

Alternativní strategií ke strategii zavádění mutací do známých domén odpovědných za vazbu ligandu je strategie využívající identifikace těch druhů hmyzu, které jsou zvláště citlivé na agonisty ekdyzonu. Například Spodoptera exigua je zvláště citlivá na RH5992. Za účelem zjištění, jaká je role domény odpovědné za vazbu ligandu receptoru pro ekdyzon ve zvýšené citlivosti na RH5992, jsme izolovali odpovídající sekvence DNA z S. exigua (Obrázek 40,Sekvence ID.Č.6). Obrázek 41,Sekvence ID.Č.7,ukazuje odpovídající si proteinové sekvence pantové oblasti a domény odpovědné za vazbu ligandu receptoru pro ekdyzon z Heliothis virescens a Spodoptera exigua. Tato proteinová sekvence je mezi těmito dvěma druhy konzervována.

Výsledky

Manipulace s doménou odpovědnou za vazbu ligandu vede ke zvýšené hladině exprese.

Za použití degenerovaných oligonukleotidů a pomocí

PCR prvního řetězce cDNA (souprava pro syntézu cDNA, • ·

Perkin-Elmer) byla u vybraných druhů náležejících k řádu Lepidoptera (Šupinokřídlí) izolována doména receptoru pro ekdyzon odpovědná za vazbu ligandu. Degenerovanými oligonukleotidy ohraničujícími 5' konec kódujícího vlákna byly HingxhoA a B a oligonukleotidy ohraničujícími 3' konec kódujícího vlákna byly oligonukleotidy ligandxA/B:

HingxhoA	5 ¹	attgctcgagaaagiccigagtgcgtigticc 3' a t
HingxhoB	5 '	attgctcgagaacgiccigagtgtgtigticc 3' a c
LigandxA	5 '	ttactcgagiacgtcccaiatc tet tciaggaa 3 a t c a
LigandxB	5 '	ttactcgagiacgtcccaiatc tcctciaagaa 3 a t t a

RNA byla extrahována ze čtvrtého instaru larvy Spodoptera exigua, vzhledem k tomu, že Spodoptera exigua se zdá citlivějším k RH5992 než Heliothis (Smagghe a Degheele, 1994). První vlákno cDNA bylo použito jako matrice pro PCR reakce za následujících podmínek 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 200 mM dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) a 0,02 U/ml Taq DNA polymerázy v přítomnosti 1 obou nukleotidů Hinge (5' 3¹) and Ligand (5' 3'). Podmínky jednotlivých cyklů PCR byly následující 1 minuta při teplotě 94°C, 2 minuty při teplotě 60°C a 1 minuta při teplotě 72°C. Celkem bylo provedeno 35 cyklů. Vzorek po ukončené reakci byl rozdělen na 1% agaróze v lxTBE pufru. Fragment o délce 900 bp byl nakloňován do vektoru pCRII (Invitrogen). Výsledný plazmid pSKSEcRl-10 byl podrobněji charakterizován a sekvenován.

• · promotorových oblastí modulovat chemicky

Příklad 11: Modifikace

genu může expresi reportérového indukovanou

Okolí responzivního reportérového gen lze indukované úrovně genové elementu zodpovědného za spojeno se sekvencí 60 bp. Při použití vykazoval konstrukt CaMV 35S promotoru exprese GUS ve srovnání s konstruktem obsahujícím tohoto promotoru, viz obrázek 42.

konstrukty určené pro transformaci za účelem demonstrovat velikost elementu efektoru použít exprese. citlivost promotoru bazálni a k modulaci

Šest kopií responzivního ke glukokortikoidům bylo promotoru CaMV 3 5S dlouhou 4 6 bp nebo s efektorovým konstruktem pMF7GRHEcRS reportérového genu obsahující nižší bazálni a indukované

6 bp z úrovně bp z

Byly připraveny rostlin (pESl a ES2) minimálního promotoru indukované úrovně genové exprese v rostlinách.

použitelného k modulaci bazálni a

Počet a rozestup responzivních elementů v promotoru reportérového genu může být upraven tak, aby se zvýšila úroveň indukované exprese transgenu.

Použití dvousložkového systému (genové kazety pro efektor a reportér) dovoluje prostorové řízení indukované exprese. Exprese transgenu může být regulována tkáňově specificky, orgánově specificky nebo v závislosti na vývojové fázi. Toho lze dosáhnout tehdy, je-li efektorový konstrukt řízen prostorově nebo časově regulovaným promotorem.

Vynález bude nyní být popsán v následujících bodech za účelem usnadnit interpretaci nároků.

1.	DNA	obsahuj ící	sekvenci	podle	Sekvence	id.	v c.
2 .	DNA	obsahuj ící	sekvenci	podle	Sekvence	id.	č.
3 .	DNA	obsahuj ící	sekvenci	podle	Sekvence	id.	č.

: 2.

: 3 .

: 4.

• · _ ΖΓ Q _ · · ♦ 9 · · ·♦·· °° 9 9··· 9 9 9 9 « ··«· · • · · · · ··· ·4· 9 99 999 99 99

4. DNA obsahující sekvenci vykazující 60%! nebo větší homologii se Sekvencí id.č.1,2 nebo 3.

5. DNA podle bodu 4,přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65% až 99%.

6. DNA hybridizující se Sekvencí id.č.2, 3 nebo 4 a kódující alespoň část ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

7. DNA degenerovaná následkem genetického kódu a ekvivalentní DNA podle libovolného z bodů 1 až 6 a _kódující polypeptid, který je alespoň částí ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

8. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 2, a kódující alespoň část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

9. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 3, a kódující alespoň část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

10. DNA obsahující část Sekvence id. č.. 4, a kódující alespoň část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

11. DNA obsahující sekvenci vykazující 60% nebo větší homologii se sekvencí podle bodů 8,9 nebo 10.

12. DNA podle bodu 11 přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

13. DNA hybridizuj ící s DNA podle libovolného z bodů 8 až 12 a kódující alespoň část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

14. DNA degenerovaná následkem genetického kódu a ekvivalentní DNA podle libovolného z bodů 8 až 12 a kódující polypeptid, který je alespoň částí vazebné

domény pro ligand ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

15. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 2 a kódující alespoň část DNA-vazebné domény ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

16. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 3 a kódující alespoň část DNA-vazebné domény ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

17. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 4 a kódující _ alespoň část DNA-vazebné domény ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

18. DNA obsahující sekvence se 60% nebo větší homologii se sekvencemi podle bodů 15,16 nebo 17.

19. DNA podle bodu 18 přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

20. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 15 až 19 a kódující alespoň část DNA-vazebné domény ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

21. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 15 až 19 a kódující polypeptid, který je alespoň částí DNA-vazebné domény ekdyzonového receptoru motýlů Heliothis.

22 .	DNA obsahující	část Sekvence	id. č . :	2 a	kóduj ící
	alespoň	část	transaktivační	domény	ekdyzonového
	receptoru motýlů	Heliothis.
23 .	DNA obsahující	část Sekvence	id. č . :	3 a	kóduj ící
	alespoň	část	transaktivační	domény	ekdyzonového
	receptoru motýlů	Heliothis.
24 .	DNA obsahující	část Sekvence	id. č . :	4 a	kóduj ící
	alespoň	část	transaktivační	domény	ekdyzonového
	receptoru motýlů	Heliothis.

25. DNA obsahující sekvence se 60% nebo větší homologií se sekvencemi podle bodů 22, 23 nebo 24.

26. DNA podle bodu 25 přičemž tato homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

27. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 22 26 a kódující alespoň část transaktivační domény ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

28. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 22 až 26 a .kódující polypeptid, který je alespoň částí transaktivační domény ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

29 .	DNA obsahující část alespoň část pantové motýlů Heliothis.	Sekvence domény	id. ekd}	Č . : zzonc	2 a jvého	kóduj ící receptorů
30 .	DNA obsahující část	Sekvence	id.	Č . :	3 a	kóduj ící
	alespoň část pantové motýlů Heliothis.	domény	ekdyzonového	receptorů
31.	DNA obsahující část	Sekvence	id.	Č . :	4 a	kóduj ící
	alespoň část pantové	domény	ekdyzonového	receptorů

motýlů Heliothis.

32. DNA obsahující sekvence vykazující 60% nebo větší sekvenční homologie se sekvencemi podle bodů 29,30 nebo 31.

33. DNA podle bodu 32, přičemž uvedená homologie jsou v rozsahu 65 % až 99 %.

34. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 29 až 33 a kódující alespoň část pantové domény ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

35. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 29 až 33 a

kódující polypeptid, který je alespoň částí pantové domény ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

36. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 2 a kódující alespoň část C-koncové oblasti ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

37. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 3 a kódující alespoň část C-koncové oblasti ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

38. DNA obsahující část Sekvence id. č.: 4 a kódující .alespoň část C-koncové oblasti ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

39. DNA obsahující sekvenci vykazující 60% nebo větší homologii se sekvencemi podle bodů 36,37 nebo 38.

40. DNA podle bodu 39 přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

41. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 36 až 40 a kódující alespoň část C-koncové oblasti ekdyzonového receptorů motýlů Heliothis.

42. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 36 až 40 a kódující polypeptid, který je alespoň částí C-koncové oblasti

43. Polypeptid obsahující ekdyzonový receptor motýlů Heliothis. Heliothis nebo jeho fragment, přičemž uvedený polypeptid je v podstatě zbavený dalších proteinů, se kterými je obyčejně asociovaný, a který je kódovaný DNA podle předchozích bodů.

44. Polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci podle

Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolnou alelickou variantu nebo sekvenci odvozenou.

45. Polypeptid obsahující část aminokyselinové sekvenci podle Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty nebo sekvence odvozené, přičemž tato sekvence kóduje vazebnou doménu pro ligand pocházející z ekdyzonového receptorú motýlů Heliothis.

46. Polypeptid obsahující část aminokyselinové sekvenci podle Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty nebo sekvence odvozené, přičemž tato sekvence kóduje DNA-vazebnou doménu ekdyzonového receptorú motýlů Heliothis.

47. Polypeptid obsahující část aminokyselinové sekvenci podle Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty nebo sekvence odvozené, přičemž tato sekvence kóduje transaktivační doménu ekdyzonového receptorú motýlů Heliothis.

48. Polypeptid obsahující část aminokyselinové sekvenci podle Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty nebo sekvence odvozené, přičemž tato sekvence kóduje pantovou oblast ekdyzonového receptorú motýlů Heliothis.

49. Polypeptid obsahující část aminokyselinové sekvenci podle Sekvence id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty nebo sekvence odvozené, přičemž tato sekvence kóduje C-koncovou oblast ekdyzonového receptorú motýlů Heliothis.

50. Polypeptid podle libovolného z bodů 44 až 49,přičemž uvedená odvozená sekvence je homologní varianta, která obsahuje změny v konzervovaných aminokyselinách.

51. DNA obsahující sekvence podle Sekvence id.č.6.

52. DNA obsahující sekvence vykazující 60% nebo větší homologii se Sekvencí id. č.: 6.

53. DNA podle bodu 52 přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

54. DNA hybridizuj ící s DNA podle Sekvence id. č. : 6 a kódující alespoň část ekdyzonového receptorů Spodoptera

55. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, a která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 51 až 54 .

56. DNA obsahující část Sekvence id. č. . 6 a kódující alespoň část vazebné domény pro ligand ekdyzonového _ receptorů Spodoptera.

57. DNA vykazující 60% nebo větší homologii se sekvence podle bodu 56.

58. DNA podle bodu 57,přičemž uvedená homologie je v rozsahu 65 % až 99 %.

59. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 56 až 58 a kódující alespoň část část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptorů Spodoptera.

60. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, a která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 56 až 58 a kódující alespoň část část vazebné domény pro ligand ekdyzonového receptorů Spodoptera.

61. DNA obsahující část Sekvence id. č.. 6 a kódující alespoň část pantové domény ekdyzonového receptorů Spodoptera.

62. DNA vykazující 60% nebo větší sekvenční homologii se sekvencí podle bodu 61.

63. DNA podle bodu 62 přičemž uvedená homologie jsou v rozsahu 65 % až 99 %.

-74• · ·· · · · · · ····*· · · · ···· · • · · · · · · • · · ··· · · · ·

64. DNA hybridizující s DNA podle libovolného z bodů 61 až 63 a kódující alespoň část pantové domény ekdyzonového receptoru Spodoptera.

65. DNA degenerovaná v důsledku genetického kódu, a která je ekvivalentní s DNA podle libovolného z bodů 61 až 63 a kódující alespoň část pantové domény ekdyzonového receptoru Spodoptera.

66. Polypeptid kódovaný DNA podle libovolného z bodů 51 až 65 .

67. _Fúzní polypeptid obsahující polypeptid podle bodu 45 nebo 50 (v závislosti na bodu 45) , který je funkčně spojený s DNA-vazebnou doménou a transaktivační doménou.

68. Rekombinantní DNA obsahující DNA podle libovolného z bodů 8 až 14 funkčně k spojenou s DNA kódující DNA-vazebnou doménu a transaktivační doménu.

69. Fúzní polypeptid podle bodu 67 nebo rekombinantní DNA podle bodu 68 přičemž DNA-vazebná doména a/nebo transaktivační doména je bakteriálního, rostlinného, houbového nebo savčího původu.

70. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 69 přičemž DNA-vazebnou doménou je GAL4 nebo A1CR/A.

71. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 69 nebo 70 přičemž transaktivační doménou je VP16.

72. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 69 přičemž DNA-vazebnou doménou a/nebo transaktivační doménou je člen nadrodiny receptorú pro steroidy.

73. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 72 přičemž DNA-vazebnou doménou a/nebo transaktivační doménou je receptor pro glukokortikoidy nebo ekdyzonový receptor Spodoptera.

• *

74. Rekombinantní DNA konstrukt obsahující rekombinantní DNA podle libovolného z bodů 6 8 až 73; a DNA kódující gen funkčně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem pro hormon, který je regulován právě DNA-vazebnou doménou peptidu kódovaného uvedenou rekombinantní DNA.

75. Fúzní polypeptid obsahující polypeptid podle bodů 46 nebo 50 (v závislosti na bodu 46) a funkčně spojený s vazebnou doménou pro ligand a s transaktivační doménou.

76. Rekombinantní DNA obsahující DNA podle libovolného z bodů 15 až 21 funkčně spojená s vazebnou doménou pro ligand a s transaktivační doménou.

77. Fúzní polypeptid podle bodu 75 nebo rekombinantní DNA podle bodu 76 přičemž vazebná doména pro ligand a/nebo transaktivační doména je bakteriálního, rostlinného, houbového nebo savčího původu.

78. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 77 přičemž transaktivační doménou je VP16.

79. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 77 přičemž vazebnou doménou pro ligand a/nebo transaktivační doménou je člen nadrodiny receptorů pro steroidy.

80. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 79 přičemž vazebnou doménou pro ligand a/nebo transaktivační doménou je receptor pro glukokortikoidy nebo ekdyzonový receptor Spodoptera.

81. Rekombinantní DNA konstrukt obsahující rekombinantní DNA podle libovolného z bodů 76 až 80; a DNA kódující gen funkčně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem hormonu, který je regulován právě DNA-vazebnou doménou peptidu kódovaného uvedenou rekombinantní DNA.

-76• ·

82. Fúzní polypeptid obsahující polypeptid podle bodu 47 nebo 50 (v závislosti na bodu 47) a funkčně spojený s vazebnou doménou pro ligand a s vazebnou doménou pro DNA.

83. Rekombinantní DNA obsahující DNA podle libovolného z bodů 22 až 28 funkčně spojená s vazebnou doménou pro ligand a s vazebnou doménou pro DNA.

84. Fúzní polypeptid podle bodu 82 nebo rekombinantní DNA podle bodu 83 přičemž vazebná doména pro ligand a/nebo DNA vazebná doména je bakteriálního, rostlinného, houbového nebo savčího původu.

85. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 84 přičemž DNA-vazebná doména je GAL4 nebo A1CR/A.

86. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 84 přičemž vazebná doména pro ligand a/nebo DNA-vazebná doména je členem nadrodiny receptoru pro steroidy.

87. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle bodu 86 přičemž vazebnou doménou pro ligand a/nebo DNA vazebnou doménou receptor pro glukokortikoidy nebo ekdyzonový receptor Spodoptera.

88. Rekombinantní DNA konstrukt obsahující rekombinantní DNA podle libovolného z bodů 82 až 87; a DNA kódující gen funkčně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem hormonu, který je regulován právě DNA-vazebnou doménou peptidu kódovaného uvedenou rekombinantní DNA.

89. Rekombinantní DNA konstrukt obsahující DNA podle libovolného z bodů 1 až 7; a DNA obsahující sekvenci kódující gen funkčně spojený s promotorovou sekvencí a alespoň jedním hormonovým responzivním elementem, který je regulován právě DNA-vazebnou doménou kódovanou uvedenou DNA podle bodů 1 až 7.

• « • · · ···· · · · ·· • · · ·

90. Rekombinantní DNA konstrukt podle libovolného z bodů

74, 81, 88 a 89 přičemž uvedená promotorová sekvence kóduje konstitutivně, prostorově nebo časově regulovaný promotor.

91. Rekombinantní DNA konstrukt podle libovolného z bodů

74,81,88 a 89,ve kterém je více než jedna kopie hormonového responzivního elementu .

92. Buňka transformovaná DNA podle libovolného z bodů 1 až 42, a 51 až 65; polypeptid podle libovolného z bodů 43 až 50; fúzní polypeptid podle libovolného z bodů 67,70 až 73,75,77 až 80,82 a 84 až 87; rekombinantní nukleová kyselina podle libovolného z bodů 68 až 73,76 až 80 a 85 až 87; nebo rekombinantní DNA konstrukt podle libovolného z bodů 74,81,88 a 89.

93. Buňka podle bodu 92 přičemž jde o buňku rostlinou, savčí nebo buňku houby.

94. Rostlina, houba nebo savec obsahující rekombinantní DNA konstrukt podle libovolného z bodů 74,81,88 a 89.

95. Způsob selekce sloučeniny schopné vazby k receptoru z nadrodiny hmyzích steroidních receptoru zahrnující vyhledávání sloučenin, které se vážou na uvedené polypeptidy podle libovolného z bodů 43 až 50 nebo fúzní polypeptid podle libovolného z bodů 67,70 až 73,75,77 až 80,82 a 84 až 87,a selekci těch sloučenin, které jsou takové vazby schopny. 96. Sloučenina vybraná pomocí způsobu podle bodu 95.

97. Zemědělská nebo farmaceutická kompozice obsahující sloučeninu podle bodu 96.

98. Použití sloučeniny podle bodu 96 jako agrochemikálie nebo léčiva.

99. Způsob výroby proteinu, peptidu nebo polypeptidu zahrnující vložení sloučeniny, která se váže na vazebnou doménu pro ligand, do buňky podle bodu 92.

-79Reference

Allan, G. F., Tsai, S. Y., Tsai, M. J. a 0'Malley, B. W.

(1992a) P. N. A. S. 89, strana 11750 až 11754.

Allan, G. F., Leng, X., Tsai, S. Y., Weigel, N. L., Edwards, D. P., Tsai, M. J. a 0'Malley, B. W. (1992b) J. Biol. Chem. 267, strana 19513 až 19520.

Ashburner, M. (1990) Cell 61, strana 1 až 3.

Beato, M. (1989) Cell 56, strana 335 až 344.

Carlber, C., Bendik I., Wyss, A., Meier, E., Sturzenbecker,

L. J., Grippo J. F. a Hunziker, Christopherson, K. S., Mark., M. R. , Bajaj, V. a Godowski, P. J. (1992) P. N. A.

S. 89, strana 6314 až 6318.

Evans, R. M., (1988) Science 240, strana 889 až 895.

Green, S. a Chambon, P. (1988) TIGs 11, strana 309 až 314.

Heyman, R. A., Mangelsdorf, D. J. , Dyck, J. A., Stein, R. B., Eichele, G., Evans, R. M. a Thaller, C. (1992) Cell 68, strana 397 až 406.

Hirst, M. C., Bassett, J. H. D. , Roche, A. a Davies, K. E. (1992), Trends in Genetics 8, strana 6 až 7.

Hogness, D. S., Talbot, W. S., Bender, Μ. T. a Koelle, M. (1992), abstrakt ze sympozia o X Ekdyzonu, Liverpool.

Hollenberg, S. M., Weinberger, C,, Ong, E. S., Cerelli, G., Oro, A., Lebo, R. , Thompson, E. B., Rosenfeld, M. G. a Evans, R. M. (1985) Nátuře 318, strana 635 až 641.

Kliewer, S. A., Umesono, K. , Mangeldorf, D. J. a Evans, R.

M. (1992) Nátuře 355, strana 446 až 449.

Koelle, M. R., Talbot, W. S., Segraves, W. A., Bender, M.

T. , Cherbas, P. a Hogness, D. S. (1991) Cell 67, strana 59 až 77.

Krust a další, (1986) The EMBO Journal 5, strana 891 až 897.

• · • · • ·

-80Leid, M., Kastner, P., Lyons, R. , Nakshatri, Η. , Saunders, M., Zacharewski, T., Chen, J. Y., Staud, A., Garnier, J. -Μ., Maděr, S. a Chambon, P. (1992a) Cell 68, strana 377 až 395 .

Leid, M., Kastner, P and Chambon, P. (1992b) TIBs 17, strana 427 až 433.

Mangelsdorf, D. J. , Borgmeyer, V., Heymann, R. A., Zhou, J. Y. , Ong, E. S., Oro, A. E., Kakizuka, A. a Evans, R. M. (1992) Genes and Development 6, strana 329 až 344.

Oro, A. E., Mckeown, M. a Evans, R. M. (1990) Nátuře 347, strana 298 až 301.

Riddihough,	G.	a Pelham, H. R. B. (1987) EMBO	Journal 6,
strana 3729	až	3734 .
Segraves, W	. A	. (1991) Cell 67, strana 225 až 228.
Segraves,	W.	A. a Hogness, D. S. (1990)	Genes and
Development	4,	strana 204 až 219.
Smagghe, G.	a	Degheele, D. (1994) Pěstíc. Sci.	42, strana
85 až 92.
Stemmer, W.	P.	(1994) Nátuře 370, strana 389 až	391.
Thumme 1, C.	S.	, Burtis, K. S. a Hogness, D. S.	(1990) Cell

61, strana 101 až 111.

Vegeta, E., Allan, G. F., Schrader, W. T., Tsai, M. -J. ,

McDonnell, D. P. a 0'Male B. W. (1992) Cell 69, strana 703 až 713.

Yao, T. P.	, Segraves,	W. A. , Oro, A	. E., Mckeown,	M. a
Evans,	R. M	. (1992) Cell	. 71,63 až 72.
Yao, T	• P.,	Forman, B.	Μ. , Jlang, Z.	, Cherbas,	L. ,	Chen,
J-Don.,	Mckeown, M., Cherbas, P. a	Evans, R.	M.	(1993)
Nátuře	366,	strana 476	až 479.
Yu, V.	c.,	Delsert, C.,	Andersen, B.,	Holowgy, J	. M.	, Kim,
S. Y. ,	Boutin, J. -Μ.,	Glass, C. K.	a Rosenfeld,	M. G.
(1991)	Cell	67, strana	1251 až 1266.

• · « ·

-81Seznam sekvencí

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č.l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 116 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA komplementární k mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Heliothis virescens (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č.:1

TGCGAGGGGT GCAAGGAGTT CTTCAGGCGG AGTGTAACCA AAAATGCAGT GTACATATGC60

AAATTCGGCC ATGCTTGCGA AATC-GATATG TATATGCGGA GAAAATGCCA AGAGTA116

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č.2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1934 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Heliothis virescens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(A) KLON: pSK19R (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č: 2

TCCACTGGTG	TTTTCACCAC	CACAGAAAAG	GCCTCTGCTC	ATTTAGAGGG	TGGTGCTAAG	60
AAGGTCATCA	TCTCCTGCTG	CCCAC-CGCTG	ACCCATGTTC	GTCGTTGGTG	TCAACCTTGA	120
AGCAGTATGA	CCCCTCTTAC	AAGGTCATCT	CCAACGCCTC	CTGCACAACC	AACTGCCTCG	180
CTCCTCTCGC	TAAGGTCATC	CATGACAACT	TCGAGATCAT	TGAAGGTCTG	ATGACCACTG	240
TACACGCCAC	CACTGCCACC	CAGAAGACAG	TGGATGGACC	CTCTGGTAAA	CTGTGGCGTG	300
ATGGCCGTGG	TGCTCAGCAG	AATATCATTC	CCGCGGAATT	CCCCAGCCGC	AGCTAGCTAA	360
CCTGCAGCAG	ACACAACCCC	TACCTTCCAT	GCCGTTACCA	ATGCCACCGA	CAACACCCAA	420
ATCAGAAAAC	GAGTCAATGT	CATCAGGTCG	TGAGGAACTG	TCTCCAGCTT	CGAGTGTAAA	480
CGGCTGCAGC	ACAGATGGCG	AGGCC-AGGCG	GCAGAAGAAA	GGCCCAGCGC	CGAGGCAGCA	540
AGAAGAGCTA	TGTCTTGTCT	GCGGCGACAG	AGCCTCCGGA	TATCACTACA	ACGCGCTCAC	600
ATGTC-AAGGG	TGTAAAGGTT	TCTTCAGGCG	GAGTGTAACC	AAAAATGCAG	TGTACATATG	660
CAAATTCGGC	CATGCTTGCG	AAATGGATAT	CTATATGCGG	AGAAAATGTC	AC-C-AGTGTCG	720

GTTGAAGAAA	TGTCTTGCGG	TGGGCATGAG	GCCCGAGTGC	GTGGTGCCGG	AGAACCAGTG	780
TGCAATGAAA	CGGAAAGAGA	AAAAGGCGCA	GAGGGAAAAA	GACAAATTGC	CCGTCAGTAC	840
GACGACAGTA	GACGATCACA	TGCCTCCCAT	CATGCAATGT	GACCCTCCGC	CCCCAGAGGC	900
CGCTAGAATT	CTGGAATGTG	TGCAGCACGA	GGTGGTGCCA	CGATTCCTGA	ATGAGAAGCT	960
AATGGAACAG	AACAGATTGA	AGAACGTGCC	CCCCCTCACT	GCCAATCAGA	AGTCGTTGAT	1020
CGCAAGGCTC	GTGTGGTACC	AGGAAGGCTA	TGAACAACCT	TCCGAGGAAG	ACCTGAAGAG	1080
GGTTACACAG	TCGGACGAGG	ACGACGAAGA	CTCGGATATG	CCGTTCCGTC	AGATTACCGA	1140
GATGACGATT	CTCACAGTGC	AGCTCATCGT	AGAATTCGCT	AAGGGCCTCC	CGGGCTTCGC	1200
CAAGATCTCG	CAGTCGGACC	AGATCACGTT	ATTAAAGGCG	TGCTCAAGTG	AGGTGATGAT	1260
GCTCCGAGTG	GCTCGGCGGT	ATGACGCGGC	CACCGACAGC	GTACTGTTCG	CGAACAACCA	1320
GGCGTACACT	CGCGACAACT	ACCC-CAAGGC	AGGCATGGCG	TACGTCATCG	AGGACCTGCT	1380
GCACTTCTGT	CGGTGCATGT	ACTCCATGAT	GATGGATAAC	GTGCATTATG	CGCTGCTTAC	1440
AGCCATTGTC	ATCTTCTCAG	ACCGGCCCGG	GCTTGAGCAA	CCCCTGTTGG	TC-GAGGACAT	1500
CCAGAGATAT	TACCTGAACA	CGCTACGGGT	GTACATCCTG	AACCAGAACA	GCGCGTCGCC	1560
CCGCGGCGCC	GTCATCTTCG	GCGAGATCCT	GGGCATACTG	ACGGAGATCC	GCACGCTGGG	1620
CATGCAGAAC	TCCAACATGT	GCATCTCCCT	CAAGCTGAAG	AACAGGAAGC	TGCCGCCGTT	1680
CCTCGAGGAG	ATCTGGGACG	TGGCGGACGT	C-GCGACGACG	GCGACGCCGG	TGGCGGCGGA	1740
GGCGCCGGCG	CCTCTAGCCC	CCGCCCCC-CC	CGCCCGC-CCG	CCCGCCACCG	TCTAGCGCGC	1800
CTCAGGAGAG	AACGCTCATA	GACTGGCTAG	TTTTAGTGAA	GTGCACGGAC	ACTGACGTCG	1860
ACGTGATCAA	CCTATTTATA	AGGACTGCGA	ATTTTACCAC	TTAAGAGGGC	ACACCCGTAC	1920
CCGATTTCGT	ACGG					1934

INFORMACE O SEKVENCI ID. Č.: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2464 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: cirkulární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Heliothis virescens (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:

(A) KLON: pSK16. 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č: 3

CGCTGGTATA	ACAACGGACC	ATTCCAGACG	CTGCC-AATGC	TCGAGGAC-AG	CTCGTCTGAG	60
GTGACGTCGT	CTTCAGCACT	GGGCCTGCCG	CCGGCTATGG	TC-.ATGTCCCC	GGAATCGCTC	120
GCGTCGCCCG	AGATCGGCGG	CCTGGAGCTG	TGGGGCTACG	ACGATGGCAT	CACTTACAGC	180
ATGGCACAGT	CGCTGGGCAC	CTGC.ACCATG	GAGCAGCAGC	AGCCCCAGCC	GCAGCAGCAG	240
CCGCAGCAGA	CACAACCCCT	ACCTTCCATG	CCGTTACCAA	TGCCACCC-AC	AACACCCAAA	300
TCAGAAAACG	AGTCAATGTC	ATCAGGTCGT	GAGGAACTGT	CTCCAGCTTC	C-AGTGTAAAC	360
GGCTGCAGCA	CAGATGGCGA	GGCGAGGCGG	CAGAAGAAAG	C-CCCAGCGCC	G.AGGCAGCAA	420
C-AAGAGCTAT	GTCTTGTCTG	CC-GCGACAGA	GCCTCCGG.AT	ATCACTACAA	CGCGCTCACA	480
TGTGAAGGGT	GT.AAAGGTTT	CTCCAGGCGG	AGTGTAACCA	.A.AAATC-CAGT	GTACATATGC	540
AAATTCGGCC	ATGCTTGCGA	AATGGATATC	TATATGCGG.A	GAAAATGTCA	GGAGTGTCC-G	600
TTGAAGAAAT	GTCTTGCGGT	GGGCATC-AGG	CCCGAGTGCG	TGGTGCCGGA	GAACCAGTGT	660
GCAATGAAAC	GG.-_AAGAG.AA	A.A.A GG C G C .A G	A GGG .A.A.A.AA G	AC.A.A.ATTGCC	CGTC.AGT.ACG	720
ACGACAGTAG	ACGATCACAT	GCCTCCC.ATC	ATGCAATGTG	ACCCTCCGCC	CCCAGAGGCC	780
GCTAGAATTC	TGGAATGTGT	GC.AGCACGAG	GTC-GTGCCAC	C-.ATTCCTGAA	TGAGAAGCTA	840
ATGGAACAG.A	ACAGATTGAA	G.AACGTGCCC	CCCCTCACTG	CCAATCAGAA	GTCGTTGATC	500
GCAAGGCTCG	TGTC-GTACCA	GGAAC-GCTAT	GAACAACCTT	CCGAGGAAGA	CCTGAAGAC-G	960
GTTACACAGT	CGGACGAGC-A	CGACGAAG.AC	TCGGATATGC	CGTTCCGTCA	GATTACCGAG	1020
ATGACGATTC	TCACAGTGC.A	GCTCATCGTA	G.AATTCGCTA	AGGGCCTCCC	GGGCTTCGCC	1080
AAGATCTCGC	AGTCGGACCA	GATCACGTTA	TTAAAGGCGT	GCTCAAGTGA	GGTGATGATG	1140
CTCCGAGTGG i	CTCC-GCGGT.A	TGACGCGGCC .	ACCGACAGCG	TACTGTTCGC	GAACAACCAG	1200

GCGTACACTC	GCGACAACTA	CCGCAAGGCA	GGCATGGCGT	ACGTCATCGA	GGACCTGCTG	1260
CACTTCTGTC	GGTGCATGTA	CTCCATGATG	ATGGATAACG	TGCATTATGC	GCTGCTTACA	1320
GCCATTGTCA	TCTTCTCAGA	CCGGCCCGGG	CTTGAGCAAC	CCCTGTTGGT	GGAGGACATC	138C
CAGAGATATT	ACCTGAACAC	GCTACGGGTG	TACATCCTGA	ACCAGAACAG	CGCGTCGCCC	1440
CGCGGCGCCG	TCATCTTCGG	CGAGATCCTG	GGCATACTGA	CGGAGATCCG	CACGCTGGC-C	1500
ATGCAGAACT	CCAACATGTG	CATCTCCCTC	AAGCTGAAGA	ACAGGAAGCT	GCCGCCGTTC	1560
CTCGAGGAGA	TCTGGGACGT	GGCGGACGTG	GCGACGACGG	CGACGCCGC-T	GGCGGCGC-AG	1620
GCGCCGGCGC	CTCTAGCCCC	CGCCCCGCCC	GCCCGGCCGC	CCGCCACCGT	CTAGCGCGCC	1680
TCAGGAGAGA	ACGCTCATAG	ACTGGCTAGT	TTTAGTGAAG	TGCACGGACA	CTGACGTCGA	1740
CGTGATCAAC	CTATTTATAA	GGACTGCGAA	TTTTACCACT	TAAGAGGGCA	CACCCGTACC	1800
CGATTTCGTA	CGTATTCGGT	GACCGACGAC	GATGCAGAGC	GTGTGTAATG	TGAATATATG	1860
TGTTGTTGAA	CGATTTGGAG	AATATATATT	GGTGTTGCTG	TTCGGGCCCG	CACGCCGTCG	1920
CCGGTCGGCG	GCGATCGCGG	CGCCCGCGGC	TTCAGTTTTA	TTTCGTTTAC	GACTGAGTTG	1980
GTCACTCGGA	TACGACTGTA	TGATAAGACT	TCGTTCGATA	AGTACACCTA	CTAAATTACA	2040
CATACGTACG	TAGCTTACGA	GAGTTATTAG	AGACAAAGAA	TATAAGAAGA	AGATGTTTCT	2100
ATTGGGTGAA	AAGTTGATAG	TTATGTTTAT	TTACCAAAAT	TAACAATAAT	ACGTTGATTA	2160
ACCTTTCGAG	TATAATATTG	TGATGAGTCG	TCCGCTGTCC	ACGTCGCCGT	CACATGTTTG	2220
TTTCTGATGC	ACACGTGAGG	NGCGTTATCG	TGTTTCATGG	TTCCATCGTC	CTGTGCCCGC	2280
GACCCTCGAC	TAAATGAGTA	ATTTAATTTA	TTGCTGTGAT	TACATTTTAA	TGTGTTGATT	2340
ATCTACCATA	GGGTGATATA	AGTGTGTCTT	ATTACAATAC	AAAGTGTGTG	TCGTCGATAG	2400
CTTCCACACG	AGCAAGCCTT	TTGTTTAAGT	GATTTACTGA	CATGGACACT	CGACCCGGAA	2460
CTTC						2464

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č.4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2745 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA komplementární k mRNA (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Heliothis virescens (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 225.. 1955 (D) DALŠÍ INFORMACE: /start_kódon= 225 /produkt= receptor pro ekdyzon Heliothis (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č: 4

ACTCGGGTC-C	TCTTCTCACC	TGTTGCTCGG	ATTGTGTTGT	ACTAGAAAAA	AGTTGTCGCC	60
GCTCC-AACC-A	C-ACTTCCGAG	TCCTATTC-GA	TTGCACGAAA	GTCGAGACAG	TGGATAGCGA	120
TTCGGTTTCG	TTTGAACGTT	GCGTAGACGA	GTGGTGCATG	TCCATGAGTC	C-CGTTTAGAT	1S0
AGTTTAGTC-C	GAGGAAAAAG	TGAAGTGAAA	C-CCTTCCTCG	GAC-GATGTCC	CTCC-GCGCTC	240
GTGGATACCG	GAGGTGTC-AC	ACC-CTCGCCG	ACATGAGACG	CCC-CTGGTAT	AACAACGGAC	300
CATTCCAC-AC	GCTGCGAATG	CTCGAC-GAGA	GCTCGTCTC-A	GGTGACGTCG	TCTTCAGCAC	360
TC-GGCCTGCC	GCCC-GCTATG	GTGATGTCCC	CGGAATCGCT	CGCGTCC-CCC	GAGATCGGCG	420
GCCTGGAGCT	GTGGGGCTAC	C-ACGATGGCA	TCACTTACAG	CATGGCACAG	TCGCTGGGCA	480
CCTGCACCAT	GGAGCAGCAG	CAC-CCCCAGC	CC-CAGCAGCA	GCCGCAGCAG	ACACAACCCC	540
TACCTTCCAT	GCCGTTACCA	ATC-CCACCGA	CAACACCCAA	ATCAGAAAAC	C-AGTCAATGT	600
CATCAGGTCG	TGAGC-AACTG	TCTCCAGCTT	CGAGTGTAAA	CGGCTGCAGC	ACAGATGGCG	660
AGGCGAC-GCG	GCAGAAGAAA	GGCCC.-.C-CGC	CC-AGGCAGCA	AGAAGAGCTA	TGTCTTGTCT	720
GCGGCGACAG	AGCCTCCGGA	TATCACTACA	ACGCGCTCAC	ATGTGAAGGG	TGTAAAGGTT	780
TCTTCAGGCG	GAGTGTAACC	AAAAATGCAG	TGTACATATG	CAAATTCGGC	CATGCTTGCG	840
AAATGGATAT	CTATATGCGG	AGAAAATGTC	AGC-AGTGTCG	GTTGAAGAAA	TGTCTTGCGG	900
TGGGCATGAG	GCCCGAGTGC	C-TGGTGCCGG	AC-AACCAGTG	TGCAATGAAA	CGGAAAGAGA	960
AAAAGGCGCA	GAGGGAAAAÁ	GACAAATTGC	CCGTCAGTAC	GACGACAGTA	GACGATCACA	1020
TGCCTCCCAT	CATGCAATGT	GACCCTCCGC	CCCCAGAGC-C	CGCTAGAATT	CTGGAATGTG	1080
TGCAGCACGA	GGTGGTGCCA	CGATTCCTGA	ATGAGAAGCT	AATGGAACAG	AACAGATTGA	1140
AGAACGTGCC	CCCCCTCACT	GCCAATCAGA	AGTCGTTGAT	CGCAAGGCTC	GTGTGGTACC	1200
AGGAAGGCTA	TGAACAACCT	TCCGAGGAAG	ACCTGAAGAG	GGTTACACAG	TCGGACGAGG	1260
ACGACGAAGA	CTCGGATATG	CCGTTCCGTC	AGATTACCGA	GATGACGATT	CTCACAGTGC	1320

« ·

-86AGCTCATCGT

AGAATTCGCT

AAGGGCCTCC

CGGGCTTCGC

CAAGATCTCG

CAGTCGGACC

1380

AGATCACGTT

ATTAAAGGCG

TGC7CAAGTG

AGG7GATGAT

GCTCCGAGTG

1440

ATGACGCGGC

CACCGACAGC

GTAC7GTTCG

CGAACAACCA

GGCGTACACT

CGCGACAACT

1500

TACG7CATCG

CGGTGCATGT

1560

ACCGCAAGGC

AGGCATGGCG

ACTCCATGAT	GATGGATAAC	GTGCATTATG	CGCTGCTTAC AGCCATTGTC	ATCTTCTCAG	1620
ACCGGCCCC-G	GCTTGAGCAA	CCCCTGTTGG	TGGAC-GAGAT CCAGAGATAT	TACCTGAACA	1680
CGCTACGGGT	GTACATCCTG	AACCAGAACA	GCGCGTCGCC CCGCGGCGCC	GTCATCTTCG	1740
GCGAGATCCT	GGGCATACTG	ACGC-AGATCC	GCACC-CTGGG CATGCAGAAC	TCCAACA7G7	1800
GCATCTCCCT	CAAGCTGAAG	AACAGGAAGC	TGCCGCCGTT CCTCGAGGAG	ATC7GGGACG	1860
TGGCGGACC-T	GC-CGACGACG	GCGACGCCGG	TGGCGGCGGA C-GCGCCGGCG	CC7C7AGCCC	1920
CCGCCCCGCC	CGCCCGC-CCG	CCCC-CCACCG	7C7AGCGCGC CTCAC-GAGAG	AACGCTCATA	1980
GACTGC-CTAG	TTTTAGTGAA	GTGCACGGAC	ACTGACGTCG ACGTGATCAA	CCTATTTATA	2 04 0
AGGACTGCC-A	ATTTTACCAC	TTAAGAGGGC	ACACCCGTAC CCGATTTCC-T	ACG7A77CGG	2100
TGACCGACGA	CGA7GCAGAG	CGTG7G7A-A7	G7C-AA7A7A7 GTG7TGT7GA	ACGAT77GGA	2160
GAATATATAT	7GG7G77GCT	C-TTCGGGCCC	GCACGCCGTC GCCC-GTCC-GC	C-GCGATCGCG	2220
GCGCCCGCC-G	CTTCAGTTTT	ATTTCGTTTA	CC-AC7GAG7T C-G7CAC7CGG	ATACGACTGT	2280
ATGATAAGAC	77CG77CGAT	AAG7ACACCT	AC 7AAA77AC ACA7ACG7AC	GTAGCTTACG	2340
AGAGTTATTA	GAGACAAAGA	ATATAAGAAG	AAGA7G777C 7A77GGG7C-A	AAAGTTGA7A	2400
GTTATGTTTA	TTTACCAAAA	ry y rn > > 1 1Αλ(.λΛ1λλ	7ACC-7TC-A7T AACC7T7CGA	G7ATAATATT	24 60
GTGATGAGTC	GTCCC-CTGTC	CACG7CGCCG	G^^CTG-^G	CACACG7GAG	2520
GNGCGTTATC	GTGTTTCATG	GTTCCATCGT	CC7G7GCCCG CGACCCTCGA	CTAAATGAG7	2580
AATTTAATTT	ATTGCTGTGA	TTACATTTTA	ATG7GT7C-AT TATCTACCAT	AC-GGTGATAT	2640
AAGTGTGTCT	TATTACAATA	CAAAC-TGTGT	GTCGTCC-ATA GCTTCCACAC	GAGCAAGCCT	2700
TTTGTTTAAG	TGATTTACTG	ACATGGACAC	TCGACCCGGA ACTTC		2745

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č.5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 575 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. C: 5 «

Met

Ser

Leu

Gly

• Ala

Arg

Gly

• Tyr

Arg

Cys

Asp

Thr

Leu

Ala

Asp

1

5

10

15

Met

Arg

Trp

Tyr

¹ Asn

. Asn

Gly

• Gly

Phe

Gin

Thr

Leu

Arg

Met

20

25

30

Leu

Glu

Ser

Glu

Val

Thr

Ser

Ala

Leu

Gly

Leu

35

40

45

Pro

Ala

Met

Val

Met

Ser

Pro

Glu

Ser

Leu

Ala

Ser

Pro

Glu

Ile

50

55

60

Gly

Leu

Glu

Leu

Tm

Gly

Tyr

Asp

Gly

Ile

Thr

Tyr

Ser

Met

65

70*

75

80

Ala

Gin

Ser

Leu

Gly

Thr

Cys

Thr

Met

Glu

Gin

Pro

Gin

Pro

85

90

95

Gin

Pro

Gin

Thr

Gin

Pro

Leu

Pro

Ser

Met

Pro

Leu

Pro

100

105

110

Met

Pro

Thr

Pro

Lys

Ser

Glu

Asn

Glu

Ser

Met

Ser

Gly

115

120

125

Arg

Glu

Leu

Ser

Pro

Ala

Ser

Val

Asn

Gly

Cys

Ser

Thr

Asp

130

135

140

Gly

Glu

Ala

Arg

Gin

Lys

Gly

Pro

Ala

Pro

Arg

Gin

Glu

145

150

155

160

Glu

Leu

Cys

Leu

Val

Cys

Gly

Asp

Arg

Ala

Ser

Gly

Tyr

His

Tyr

Asn

165

170

175

Ala

Leu

Thr

Cys

Glu

Gly

Cys

Lys

Gly

Phe

Arg

Ser

Val

Thr

180

185

190

Lys

Asn

Ala

Val

Tyr

Ile

Cys

Lys

Phe

Gly

His

Ala

Cys

Glu

Met

Asp

195

200

205

Ile

Tyr

Met

Arg

Lys

Cys

Gin

Glu

Cys

Arg

Leu

Lys

Cys

Leu

210

215

220

Ala

Val

Gly

Met

Arg

Pro

Glu

Cys

Val

Pro

Glu

Asn

Gin

Cys

Ala

225

230

235

240

Met

Lys

Arg

Lys

Glu

Lys

Ala

Gin

Arg

Glu

Lys

Asp

Lys

Leu

Pro

245

250

255

Val

Ser

Thr

Val

Asp

His

Met

Pro

Ile

Met

Gin

Cys

260

265

270

Asp

Pro

Glu

Ala

Arg

Ile

Leu

Glu

Cys

Val

Gin

His

275

280

285

Glu

Val

Pro

Arg

Phe

Leu

Asn

Glu

Lys

Leu

Met

Glu

Gin

Asn

Arg

290

295

300

Leu

Lys .

Asn '

Val

Pro

Leu

Thr

Al a

Asn

Gin

Lys

Ser

Leu

Ile

Ala

305

310

315

320

Arg :

Leu '

Val '

Trp ‘

Tyr

Gin

Glu

Gly

Tyr

Glu

Gin

Pro

Ser

Glu

Glu .

Asp

325

330

335

Leu

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Ser

Asp

Met

340

345

350

Pro

Phe

Arg

Gin

Ile

Thr

Glu

Met

Thr

Ile

Leu

Thr

Val

Gin

Leu

Ile

355

360

365

Val

Glu

Phe

Ala

Lys

Gly

Leu

Pro

Gly

Phe

Ala

Lys

Ile

Ser

Gin

Ser

370

375

380

Asp

Gin

Ile

Thr

Leu

Lys

Ala

Cys

Ser

Glu

Val

Met

Leu

385

390

395

400

Arg

Val

Ala

Arg

Tyr

Asp

Ala

Thr

Asp

Ser

Val

Leu

Phe

Ala

405

410

415

Asn

Gin

Ala

Tyr

Thr

Arg

Asp

Asn

Tyr

Arg

Lys

Ala

Gly

Met

Ala

-

420

425

430

Tyr

Val

Ile

Glu

Asp

Leu

His

Phe

Cys

Arg

Cys

Met

Tyr

Ser

Met

435

440

445

Met

Asp

Asn

Val

His

Tyr

Ala

Leu

Thr

Ala

Ile

Val

Ile

Phs

450

455

460

Ser

Asp

Arg

Pro

Gly

Leu

Glu

Gin

Pro

Leu

Val

Glu

Asp

Ile

Gin

465

470

475

480

Arg

Tyr

Leu

Asn

Thr

Leu

Arg

Val

Tyr

Ile

Leu

Asn

Gin

Asn

Ser

485

490

495

Ala

Ser

Pro

Arg

Gly

Ala

Val

Ile

Phe

Gly

Glu

Ile

Leu

Gly

Ile

Leu

500

505

510

Thr

Glu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Met

Gin

Asn

Ser

Asn

Met

Cys

Ile

Ser

515

520

525

Leu

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Leu

Pro

Phe

Leu

Glu

Ile

Trp

530

535

540

Asp

Val

Ala

Asp

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Pro

Val

Ala

Glu

Ala

545

550

555

560

Pro

Ala

Pro

Leu

Ala

Pro

Ala

Pro

Ala

Arg

Pro

Ala

Thr

Val

565 570 575

INFORMACE O SEKVENCI ID.Č.6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 948 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

• 4

-89• · · ·

(A) ORGANISMUS: Spodoptera exigua (ix) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č: 6

AGGCCGGAGT	GCGTGGTGCC	AGAAAACCAG	TGTGCAATGA	AAAGGAAAGA	GAAAAAGGCA	60
CAAAGGGAAA	AAGACAAGTT	GCCAGTCAGT	ACAACGACAG	TGGATGATCA	CATGCCTCCC	120
ATTATGCAGT	GTGATCCACC	GCCTCCAGAG	GCCGCAAGAA	TTCACGAGGT	GGTGCCACGA	180
TTCCTGAATG	AAAAGCTAAT	GGACAC-GACA	AGGCTCAAGA	ATGTGCCCCC	TCACTGCCAA	240
CCAGAAGTCC	TTAATAGCGA	GGCTGGTCTG	GTACCAAC-AA	GGCTATGAAC	AGCCATCAGA	300
AGAGGATCTA	AAAAGAGTCA	CACAGTCGGA	TGAAGACGAA	GAAGAGTCGG	ACATGCCGTT	360
CCGTCAGATC	ACCGAGATGA	CGATCCTCAC	AGTGCAGCTC	ATTGTTGAAT	TCGCTAAGGG	420
CCTACCAGCG	TTCGCAAAGA	TCTCACAGTC	GGATCAGATC	ACATTATTAA	AC-GCCTGTTC	480
GAGTGAGGTG	ATGATGTTGC	GAGTAGCTCG	C-CGGTACGAC	GCGGCC-ACAG	ACAGCGTGTT	540
GTTCGCCAAC	AACCAGGCGT	ACACCCC-CGA	CAACTACCGC	AAGGCAGGCA	TC-GCCTACGT	600
CATCGAGGAC	CTGCTGCACT	TCTGCCC-GTG	CATGTACTCC	ATC-ATGATGG	ATAACGTCCA	6 60
CTATC-CACTG	CTCACTGCCA	TCGTC.-.TTTT	CTCAGACCC-A	CCCGGGCTTG	AGCTAACCCT	72 0
GTTGGTGGAG	GAGATCCAGA	GATATTACCT	GAACACGCTG	CGGGTGTACA	TCCTGAACCA	780
GAACAGTCGG	TCGCCGTGCT	GCCCTGTCAT	CTACGCTAÁG	ATCCTCGGCA	TCC7GACGC-A	840
GCTGCGGACC	CTGGGCATGC	AGAACTCCAA	CATGTGCATC	TCACTCAAGC	TGAAGAACAG	900
GAACGTGCCG	CCGTTCTTCG	AGC-ATATCTG	GGACGTCCTC	GAGTAAAA		948

INFORMACE 0 SEKVENCI ID.Č.7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA; 319 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č: 7

Arg 1

Pro Glu Cys

Val 5

Val

Pro Glu Asn Gin Cys Ala Met 10

Lys Arg Lys 15

Glu

Lys

Ala

Gin

Arg

Glu

Lys

Asp

Lys Leu

Pro

Val

Ser

ΤΠ2Γ

Thr

20

25

30

Thr

Val

Asp

His

Met

Pro

Ile

Met Gin

Cys

Asp

Pro

35

40

45’

Pro

Glu

Ala

Arg

Ile

Leu

Glu

Cys

Val Gin

His

Glu

Val

Pro

55 60

Arg Phe Leu 65

Asn Thr

Glu Ala 85

Lys 70 Asn

Leu Met

Glu Gin

Asn Arg Leu Lys 75

Asn Val 80

Pro

Pro Leu

Gin

Lys

Ser

Leu 90

lle Ala Arg

Leu

Val 95

Trp

Tyr

Gin

Glu

Gly

Tyr

Glu

Gin

Pro

Ser

Glu

Asp

Leu

Lys

Arg

Val

100

105

110

Thr

Gin

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Asp

Ser

Asp

Met

Pro

Phe

Arg

Gin

115

120

125

lle

Thr

Glu

Met

Thr

lle

Leu

Thr

Val

Gin

Leu

lle

Val

Glu

Phe

Ala

130

135

140

Lys

Gly

Leu

Pro

Gly

Phe

Ala

Lys

lle

Ser

Gin

Ser

Asp

Gin

lle

Thr

145

150

155

160

Leu

Lys

Ala

Cys

Ser

Glu

Val

Met

Leu

Arg

Val

Ala

Arg

165

170

175

Arg

Tyr

Asp

Ala

Thr

Asp

Ser

Val

Leu

Phe

Ala

Asn

Gin

Ala

180

185

190

Tyr

Thr

Arg

Asp

Asn

Tyr

Arg

Lys

Ala

Gly

Met

Ala

Tyr

Val

lle

Glu

195

200

205

Asp

Leu

His

Phe

Cys

Arg

Cys

Met

Tyr

Ser

Mg £

Met

Asp

Asn

210

215

220

Val

His

Tyr

Ala

Leu

Thr

Ala

lle

Val

lle

Phe

Ser

Asp

Arg

Pro

225

230

235.

240

Gly

Leu

Glu

Gin

Pro

Leu

Val

Glu

Ile

Gin

Arg

Tyr

Leu

245

250

255

Asn

Thr

Leu

Arg

Val

Tyr

lle

Leu

Asn

Gin

Asn

Ser

Ala

Ser

Pro

Arg

260

265

270

Gly

Ala

Val

lle

Phe

Gly

Glu

lle

Leu

Gly

lle

Leu

Thr

Glu

lle

Arg

275

280

285

Thr

Leu

Gly

Met

Gin

Asn

Ser

Asn

Met

Cys

lle

Ser

Leu

Lys

Leu

Lys

290

295

300

Lys

Arg

Lys

Leu

Pro

Phe

Leu

Glu

lle

Asp

Trp

Asp

Val

305

310

315

Claims

1. DNA vyznačující se tím, že obsahuje

Sekvenci id. č.: 2 nebo sekvenci vykazující homologii k této sekvenci, nebo obsahuje sekvenci která se Sekvencí id. č.: 2 hybridizuje.

2. DNA vyznačující se tím, že obsahuje Sekvenci id. č.: 3 nebo sekvenci vykazující homologii k této sekvenci, nebo obsahuje sekvenci která se _ Sekvencí id. č.: 3 hybridizuje.

3. DNA vyznačující se tím, že obsahuje Sekvenci id. č.: 4 nebo sekvenci vykazující homologii k této sekvenci, nebo obsahuje sekvenci která se Sekvencí id. č.: 4 hybridizuje.

4. DNA podle libovolného z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci vykazující 60% nebo vyšší homologii se Sekvencemi id.č.1,2 nebo 4.

5. DNA podle nároku 4 vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci vykazující 65 až 99% homologii se Sekvencemi id.č.1,2 nebo 4.

6. DNA podle libovolného z předchozích nároků vyznačující se tím, že kóduje alespoň část receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

7. DNA vyznačující se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a která kóduje alespoň část vazebné domény pro ligand receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

• ·

8. DNA vyznačující se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a která kóduje alespoň část vazebné domény pro DNA receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

9. DNA vyznačující se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a která kóduje alespoň část transaktivační domény receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

10.- DNA v y znač u j í c í se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a která kóduj e alespoň část pantové domény receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis. 11. DNA v y znač u j í c í se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a která kóduj e alespoň část C-koncové domény receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

12. DNA vyznačující se tím, že je v důsledku degenerace genetického kódu ekvivalentní s DNA podle libovolného z nároků 1 až 11.

13. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje receptor pro ekdyzon motýlů Heliothis nebo jeho fragment, přičemž je tento polypeptid v podstatné míře zbaven všech proteinů, se kterými je běžně asociován, a který je kódován DNA podle libovolného z předchozích nároků.

14. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v

Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolnou alelickou variantu či derivát.

• ·

15. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje část aminokyselinové sekvence znázorněné v Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty či derivátu a která tvoří vazebnou doménu pro ligand receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

16. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje část aminokyselinové sekvence znázorněné v Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty či derivátu a která tvoří vazebnou doménu pro DNA receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

17. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje část aminokyselinové sekvence znázorněné v Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty či derivátu a která tvoří transaktivační doménu receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

18. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje část aminokyselinové sekvence znázorněné v Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty či derivátu a která tvoří pantovou doménu receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

19. Polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje část aminokyselinové sekvence znázorněné v Sekvenci id. č.: 4 nebo její libovolné alelické varianty či derivátu a která tvoří C-koncovou doménu receptoru pro ekdyzon motýlů Heliothis.

20. Polypeptid podle libovolného z nároků 14 až 19 vyznačující se tím, že derivátem je homologní varianta zahrnující záměny konzervovaných aminokyselin.

21. DNA vyznačující se tím, že obsahuje Sekvenci id. č.: 6 nebo sekvenci vykazující homologii k této sekvenci, nebo obsahuje sekvenci která se Sekvencí id. č.: 6 hybridizuje.

22. DNA podle nároku 21 vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci vykazující 60% nebo vyšší homologii se Sekvencí id.č.6.

23 . DNA vyznačuj í c í se tím, že obsahuj e sekvenci vykazující id.č.6. 65 až 99% homologii se Sekvencí 24 . DNA podle libovolného z nároků 21 až 33 vyznačuj íc í se t í m , že kóduj e

alespoň část receptoru pro ekdyzon ze Spodoptera.

25. DNA vyznačující se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 21 až 24 a která kóduje alespoň část vazebné domény pro ligand receptoru pro ekdyzon Spodoptera.

26. DNA vyznačující se tím, že obsahuje část DNA podle libovolného z nároků 21 až 24 a která kóduje alespoň část pantové domény receptoru pro ekdyzon Spodoptera.

27. DNA vyznačující se tím, že je v důsledku degenerace genetického kódu ekvivalentní s DNA podle libovolného z nároků 21 až 26.

28. Polypeptid vyznačující se tím, že je kódován DNA podle libovolného z nároků 21 až 27.

• ·

29. Fúzní polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 15 nebo 20 (je-li závislý na nároku 15) funkčně spojený s vazebnou doménou pro DNA a transaktivační doménou.

30. Rekombinantní DNA vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 7 funkčně spojenou s DNA kódující vazebnou doménou pro DNA a transaktivační doménu.

31. - Fúzní polypeptid podle nároku 29 nebo rekombinantní

DNA podle nároku 30 vyznačující se tím, že vazebná doména pro DNA a/nebo transaktivační doména je houbového, bakteriálního, rostlinného nebo savčího původu.

32. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 31 vyznačující se tím, že vazebnou doménou pro DNA je GAL4 nebo A1CR/A.

33. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 31 nebo 32 vyznačující se tím, že transaktivační doménou je VP16.

34. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku

31 vyznačující se tím, že vazebná doména pro DNA a/nebo transaktivační doména patří do nadrodiny steroidních receptoru.

35. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 34 vyznačující se tím, že vazebná doména pro DNA a/nebo transaktivační doména pochází z receptoru pro ekdyzon Spodoptera.

• ·

36. Rekombinantní DNA konstrukt vyznačuj ící se tím, že obsahuje rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 30 až 35 a DNA, která kóduje gen operativně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem pro hormon, který je cílovým místem pro vazebnou doménu pro DNA kódovanou rekombinantní DNA.

37. Fúzní polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 16 nebo 20 (je-li závislý na nároku 16) a funkčně připojenou vazebnou doménu pro ligand a transaktivační doménu.

38. Rekombinantní DNA vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 8 funkčně spojenou s DNA kódující vazebnou doménu pro ligand a transaktivační doménu.

39. Fúzní polypeptid podle nároku 37 nebo rekombinantní DNA podle nároku 38 vyznačující se tím, že vazebná doména pro ligand a/nebo transaktivační doména je houbového, bakteriálního, rostlinného nebo savčího původu.

40 . Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 39 vyznač u j í c í se t í m , ze transaktivační doménou je VP16. 41. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 39 vyznaču j í c í se t í m , že vazebná

doména pro ligand a/nebo transaktivační doména patří do nadrodiny steroidních recpetorů.

42. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku

34 vyznačující se tím, že vazebná • ·

-97doména pro DNA a/nebo transaktivační doména pochází z receptoru pro glukokortikoidy nebo z receptoru pro ekdyzon hmyzu rodu Spodoptera.

43. Rekombinantní DNA konstrukt vyznačuj ící se tím, že obsahuje rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 38 až 42 a DNA, která kóduje gen operativně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem pro hormon, který je cílovým místem pro vazebnou doménu pro DNA kódovanou rekombinantní DNA.

44. Fúzní polypeptid vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 17 nebo 20 (je-li závislý na nároku 17) a funkčně připojenou vazebnou doménu pro ligand a vazebnou doménu pro DNA.

45. Rekombinantní DNA vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 9 funkčně spojenou s DNA kódující vazebnou doménu pro ligand a vazebnou doménu pro DNA.

46. Fúzní polypeptid podle nároku 44 nebo rekombinantní

DNA podle nároku 45 vyznačující se tím, že vazebná doména pro ligand a/nebo vazebná doména pro DNA je houbového, bakteriálního, rostlinného nebo savčího původu.

47. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 46vyznačující se tím, že vazebnou doménou pro DNA je GAL4 nebo A1CR/A.

48. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 46 vyznačující se tím, že vazebná

-98doména pro ligand a/nebo vazebná doména pro DNA patří do nadrodiny steroidních receptorů.

49. Fúzní polypeptid nebo rekombinantní DNA podle nároku 48 vyznačující se tím, že vazebná doména pro ligand a/nebo vazebná doména pro DNA pochází z receptoru pro glukokortikoidy nebo z receptoru pro ekdyzon hmyzu rodu Spodoptera.

50. Rekombinantní DNA konstrukt vyznačuj ící

- se tím, že obsahuje rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 45 až 49 a DNA, která kóduje gen operativně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem pro hormon, který je cílovým místem pro vazebnou doménu pro DNA kódovanou rekombinantní DNA.

51. Rekombinantní DNA konstrukt vyznačuj ící se tím, že obsahuje rekombinantní DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 a DNA obsahující sekvenci, která kóduje gen operativně spojený s promotorovou sekvencí a responzivním elementem pro hormon, který je cílovým místem pro vazebnou doménu pro DNA kódovanou DNA podle libovolného z nároků 1 až 6 .

Rekombinantní

DNA nároků 36, 43, tím, ze konstrukt podle libovolného ačující s sekvence kóduje a 51 v y z n konstitutivně, promotorova prostorově nebo časově regulovaný pomotor.

53 .

Rekombinantní nároků 36,43,50 a 51

DNA konstrukt podle libovolného z vyznačuj ící

-99t í m , že obsahuje více než jednu kopii responzivního elementu pro hormon.

54. Buňka transformovaná pomocí DNA podle libovolného z nároků 1 až 12 a 21 až 27, polypeptidu podle libovolného z nároků 13 až 20,fúzního polypeptidu podle libovolného z nároků 29,31 až 35,37,39 až 42, 44 a 46 až 49,rekombinantní nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 30,35 38 až 42 a 45 až 49 nebo rekombinantního DNA konstruktu podle libovolného z nároků 36,43,50 a 51.

55 . Buňka podle nároku 54 v y z n a č u j í c í se tím, že jde o rostlinnou, houbovou nebo savčí buňku. 56 . Rostlina, houba nebo savec v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje rekombinantní DNA podle

libovolného z nároků 36,43,50 a 51.

57 .

Způsob selekce sloučenin schopných vazby steroidních že nadrodiny hmyzích vyznačující se schopnost sloučenin vázat libovolného z nároků 13 podle

42, se až na

59.

polypeptid

35,37,39 až sloučeniny, které libovolného

44 a 46 až 49 se vážou.

Sloučenina v byla vybrána

Zemědělská načuj ící y z způsobem podle nároku nebo vyznačuj ící sloučeninu podle nároku na receptor recpetorů se testuje polypeptid podle nebo na fúzní nároků vyberou

39,31 až se takové že farmaceutická se tím, že kompozice obsahuje

57.

58 .

-10060. Použití sloučeniny podle nároku

58 jako agrochemikálie nebo farmaceutika.

61. Způsob přípravy proteinu, peptidu nebo polypeptidu vyznačující se tím, že zahrnuje vložení sloučeniny do buněk podle nároku 54 nebo 55,přičemž tato sloučenina se váže na vazebnou doménu pro ligand v těchto buňkách.