CZ377697A3

CZ377697A3 - Multifunkční systém ligandů vhodný pro buněčně specifický přenos nukleových kyselin

Info

Publication number: CZ377697A3
Application number: CZ973776A
Authority: CZ
Inventors: Hans Harald Prof. Dr. Sedlacek; Rolf Prof. Dr. Müller
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-11-27
Publication date: 1998-06-17
Also published as: AR010666A1; HUP9702251A2; AU4540797A; BR9706032A; DE19649645A1; TR199701444A2; HUP9702251A3; EP0846772A1; AU729798B2; CA2217159A1; HU9702251D0; MX9709226A; PL323434A1; JPH11169A

Description

Oblast techniky

Vynález se vztahuje k vylepšení techniky a užitých činidel pro přenos polynukleotidů do buněk.

Dosavadní stav techniky

Vazba genového konstruktu na buněčný povrch je nutnou, nikoli však dostačující podmínkou pro transfer genů do buňky. Čím silnější je tato vazba, tím větší je pravděpodobnost, že genový konstrukt bude úspěšně přijat buňkou a v buňce transkribován. Čím je tato vazba k buňce specifičtější, tím je pravděpodobnější, že se bude genový konstrukt vázat přednostně a pouze k cílové buňce a bude touto buňkou přijat. Specifita vazby genového konstruktu k cílové buňce je zvláště důležitá, když je kromě cílových buněk přítomen další typ buněk a přesto musí být genový konstrukt přednostně nebo výlučně přijat cílovou buňkou.

Byly vyvinuty různé techniky usnadňující vazbu genového konstruktu buněčně specifickým způsobem. Pro všechny tyto techniky je společné, že využívají vazby (1) ligandu k receptoru, který se nachází na buněčné membráně, nebo (2) vazby protilátky ke svému antigenu nebo haptenu, který je exponován na buněčné membráně. Příklady těchto technik zahrnují použití metod rekombinantní DNA k inkorporaci ligandů, jako jsou heregulin (Han a další, PNAS 92, strana 9747 (1995)), erythropoetin (Kasahara a další;

Science 266, strana 1373 (1994)), fragmenty protilátek, jako je jednoduchý řetězec Fv (Marin a další, J. Virol. 70, strana 2957 (1996)) nebo pomocí receptoru, jako je extracelulární část Fc receptoru, (Dougherty a další, Transfusion Science 17, strana 121 (1996) do

glykoproteinového obalu retrovirových vektorů, čímž vzniká požadovaný vektor s buněčnou specificitou.

chemické metody k (Wu a další, J. nebo syntetické vazbě ligandů jako Chem. 269, deriváty tohoto strana 612

Biol.

Také se užívají je asialoglykoprotein strana 1152 (1994)) proteinu (Marwin a další, Bioconjugate Chem. (1994)) k polylysinu.

genovým proteinu ligandů konj ugovanému liposomech, a viz Redelmeir

Ten pak bud' tvoří konstruktem nebo se chemicky adenovirového vektoru. Další

5, vlastní váže k metodou komplex s obalovému k streptavidinu, který k fosfolipidové nimi tvoří komplex . další, Drug Deliv.

2, strana 98, se koncové váže s genovým

J.

(1995).

Therap. Agents komplex byl popsán Fominayavou a dalšími, 271, strana 10560, 1996. Tento ligandový fragment protilátky, která je B2 tumorových buněk, dále pak exotoxin A a DNA vaznou doménu je vazba biotinu skupině na konstruktem,

Deliv. Targeting První ligandový J. Biol. Chem.

systém obsahuje specifická pro receptor Erb Pseudomonas fúzní peptidový kvasničného proteinu Gal-4, který se váže k odpovídající vazebné sekvenci, která je vložena do plazmidu obsahujícího transgen. I když použití tohoto ligandového systému vede k buněčně specifické trasfekci cílové buňky, jeho nevýhodou je imunogenita kvasničného proteinu Gal-4.

Žádný z těchto známých způsobů však neřeší problém specifické vazby vektoru k cílové buňce. Hlavními důvody pro nedostatečnou specifitu jsou (1) funkční poškození modifikovaných virových vektorů, (2) značná komplexita a velikost užitého ligandového systému, (3) imunogenita a kompatibilita heterologních nebo modifikovaných proteinů, nebo použitých streptavidin-biotin vazebných systémů, (4) nebo nedostatečná schopnost genového konstruktu ovlivnit buněčně specifickou transdukci cílových buněk.

» ·· ········· • · · « · · · _β_ ·· ··· ··· ···· ·· ·

Díky těmto omezením zůstává velká potřeba snadno připravitelných a funkčně schopných ligandů pro vazbu virových a nevirových vektorů k cílové buňce.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje přípravu ligandového systému pro buněčně specifický transport nukleotidových sekvencí do cílové buňky, který není imunogenní a který je snadněji připravitelný a použitelný, než předchozí známé systémy.

Dalším cílem vynálezu je zvýšení specificity vazby vektorů k cílovým buňkám, a tím zlepšení účinnosti a selektivity přenosu nukleové kyseliny do cílových buňek.

Vynález tedy popisuje přípravu multifunkčního ligandového systému pro buněčně specifický cílený přenos nukleotidových sekvencí, obsahující nejméně jeden, k cílové buňce specifický ligand, nejméně jeden ligand specifický pro genový konstrukt, který seatává z protilátky nebo její části a linker spojující tyto dva ligandy. Celý systém není imunogenní. Ve výhodném provedení vynálezu nejméně jeden ligand je humanizovaná protilátka, či její část. Dalším výhodným provedením vynálezu je farmaceutická kompozice pro léčbu nemocí, obsahující multifunkční ligandový systém pro cílený buněčně specifický přenos nukleotidových sekvencí, obsahující nejméně jeden buněčně specifický ligand, nejméně jeden ligand specifický pro genový konstrukt, který sestává z protilátky nebo její části a linker spojující tyto dva ligandy, přičemž celý systém není imunogenní a je připraven na vhodném nosiči pro užití pacientem.

V dalších výhodných provedeních vynálezu obsahuje ligandový systém podle vynálezu konektor, který spojuje dva ligandy dohromady a tento konektor sestává ze dvou linkerů. Dalším výhodným provedením vynálezu je ligandový systém obsahující: (a) buněčně specifický ligand (TS ligand) ·· ···· • · • · · ·

obsahující anti-NCAM rekombinantní jednoduchý řetězec Fv fragmentu, ve kterém je variabilní těžký řetězec a lehký řetězec Fv fragmentu kovalentně vázán krátkou peptidovou sekvencí, (b) linker obsahující fúzní peptid o sekvenci OLFEALLELLESLiWELiLLEA (Sekvence id. č. : 1); a (c) a ligand specifický pro genový konstrukt (GS ligand) sestávající z rekombinantní protilátky pro N^s-methyladenin.

* V dalším výhodném uspořádání vynález popisuje použití ligandového systému podle vynálezu pro výrobu léčiv k prevenci nebo léčbě nemocí kůže, sliznic, nemocí nervového systému, nemocí vnitřních orgánů, nemocí srážlivosti krve, hematopoetického systému, nemocí imunitního systému, svalového systému a nemocí vyživovacích pletiv a kloubů. Ligandový systém je lokálně podáván nebo injikován pacientovi, nebo alternativně do buněk získaných od pacienta za účelem prevence jako vakcína, nebo pro léčení nemocí spojených s jednou nebo více skupinami sestávajících z nemocí kůže, sliznic, nervového systému, vnitřních orgánů, srážlivosti krve, hematopoetického systému, imunitního systému, svalů, vyživovacích pletiv a kloubů.

Tyto výhody jsou umožněny spojováním buněčně specifických ligandů s genovým konstruktem podle vynálezu.

Další cíle, rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího detailního popisu.

, Rozumí se, že detailní popis a specifické příklady, výhodných použití vynálezu, jsou uvedeny jen pro ilustraci, protože jsou možné různé změny a modifikace v duchu a rozsahu vynálezu, které budou zřejmé odborníkům z následujících příkladů.

• · · · ·

Popis obrázků

Obrázek 1	ukazuje tři alternativy ligandového systému složeného z buněčně specifických ligandů pro cílovou buňku a ligandů specifických pro genový konstrukt, ve kterých jsou ligandy spojeny linkerem (obrázek la a lb) nebo konektorem (obrázek lc).
Obrázek 2	popisuje užití ligandového systému z obrázku lc, kde konektor se skládá z pantové části protilátky.
Obrázek 3	ukazuje další užití ligandového systému z obrázku lc, kde konektor obsahuje protein Gal80 a Gal80-vazebnou doménu proteinu Gal4.
Obrázek 4	popisuje provedení vynálezu, kde je ke spojení dvou fragmentů protilátek použit fúzní protein.
Obrázek 5	schématizuje expresní vektory pHENIS a pABl, které jsou používány ve vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Podle vynálezu lze ligand buněčně specifický pro cílovou buňku a ligand genového konstruktu vzájemně spojit linkerem, jak je ukázáno na obrázku 1, aniž by tvořily imunogenní komplex. Ve výhodném provedení vynálezu lze užitím konektoru, viz obrázek lc a obrázky 2 a 3, zkonstruovat ligandový systém tak, aby překonal dosavadní omezení dané imunogenitou, nízkou specificitou a účinností transdukce buněk.

• · t · · · · «· · • · · · · · · · · · • · · · · ······ · · · ·· · · — Q— ·· ··· ··· ···· »· ·

Ligand specifický pro cílovou buňku, (Target cell specific, TS ligand) podle vynálezu je molekula, která se váže k determinantě na buněčném povrchu cílové buňky, to znamená k vazebnému partnerovi buněčně specifického ligandu cílové buňky, například k receptoru nebo adhesní molekule.

Linker je molekula, která, v nejjednodušším případě, spojuje ligand specifický pro cílovou buňku se specifickým ligandem genového kostruktu a výhodně muže mít fúzní vlastnosti, tzn. vlastnosti, které dovolují průchod nového ligandového systému přes buněčnou membránu, nebo přes lysozomální membránu, tzn. z lysozomů do cytoplasmy. Ve výhodném provedení vynálezu má linker také fúzní vlastnosti.

Ligand specifický pro genový konstrukt (GS ligand) je molekula, která se váže přímo, nebo nepřímo, pomocí protilátky nebo její části, ke genovému konstruktu.

Ve vhodném provedení vynálezu jsou TS ligand a GS ligand spojeny konektorem. Každý z obou ligandů může navíc obsahovat vlastní linkery. Provedení využívající konektor, předpokládá různé formy závisející na užití specifického GS ligandu a TS ligandu (tzn. 1 x linker, 2 x TS ligand, 1 x GS ligand nebo 1 x linker, 1 x TS ligand, 2 x GS ligand).

Spojení mezi TS ligandem, linkerem a GS ligandem může být tvořeno kovalentní vazbou (viz Sedlaček a další, Contrib. to Oncol. 32, Nakladatelství Karger Mnichov (1988)), nebo. nekovalentním způsobem, založeným na rozdílných nábojích (iontová vazba). Avšak, ligandový systém může být také připraven jako fúzní protein pomocí rekombinantních technik, jak již bylo popsáno v EP-A1-0 464 533 .

Nukleové kyseliny, které jsou vpravovány do cílových buněk pomocí navrhovaného ligandového systému, mohou být holé RNA nebo DNA, holé RNA nebo holé DNA smíchané s f!

• ·

nevirovým nosičem, nebo virem. Během užití je ligandový systém podle vynálezu smíchán s genovým konstruktem a výsledný komplex je přidán k buňkám, které mají být transdukovány, nebo může být komplex podán pacientovi.

Pro ilustraci některých možných kombinací jsou uvedeny příklady některých užitých buněčně specifických ligandů, specifických ligandů genových konstruktů, linkerů a konektorů.

Ligand specifický pro cílovou buňku (TS ligand)

TS ligand podle vynálezu může být aktivní sloučenina, část aktivní sloučeniny nebo analog aktivní sloučeniny, která se váže k receptoru na cílové buňce. Endogenní látky, části endogenních látek a další látky, které napodobují jeden či více epitopů endogenních látek, jsou výhodné pro svou nízkou imunogenitu ve srovnání s většinou látek cizích.

Příklady takovýchto aktivních sloučenin jsou: růstové faktory jako je růstový faktor VEGF, PDGF, EGF, TGFa, TGFP, KGF, SDGF, FGF, IGF, HGF, NGF, BDNF, neurotrof iny, BMF, bombesiny, M-CSF, trombopoetin, erythropoetin, SCF, SDGF, onkostatin, PDEGF a endothelin 1; cytokininy, jako jsou například IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 a IL-15; interferony α, β a γ ; faktory nekrotizuj ící tumory TNFcc a TNFP; chemokiny jako je RANTES, MCAF, MIP-la, MIP-ΐβ, NAP a β-thromboglobulin; peptidové hormony jako jsou SRH, SIH, STH, MRH, MSH, PRH, PIH, prolaktin, LH-RH, FSH-RH, LH/ICSH, FSH, TRH, TSH, CRH, ACTH; angiotensin, kinin, nebo histamin nebo jeho analogy; steroidní hormony jako jsou estrogeny, gestageny, androgeny, glukokortikoidy nebo mineralokortikoidy, nebo jejich homology či analogy a vitaminy, jako je kyselina listová.

TS ligandem podle molekula, část adhezní vynálezu může být také adhezní molekuly, nebo analog adhezní molekuly, který se váže k odpovídající adhezní molekule, která je lokalizována na buněčné membráně nebo na další struktuře cílové molekuly, jež specificky váže adhezní molekulu.

Příklady takovýchto adhezních molekul schopných vystupovat ve funkci TS ligandů jsou Lewis X (pro GMP-140),

S-Lewis X (pro ELAM-l) , LFA-1 (pro ICAM-1 a ICAM-2) , MAC-1 (pro ICAM-1), VLA-4 (pro VCAM-1), PECAM (pro PECAM), vitronektin (pro receptor vitronektinu), GMP-140 (pro Lewis X) , S-Lewis X (pro ELAM-l), ICAM-1, ICAM-2 (pro LFA-1, MAC-1), VCAM-1 (nebo VLA-4), fibronektin (pror VLA-4), laminin (pro VLA-6), fibronektin, laminin (pro VLA-1, VLA-2, VLA-3), fibronektin (pro VLA-4), fibrinogen (pro GPIIb-IIIa) , B7 (pro CD28) , CD28 (pro B7) , CD40 (pro CD40L) a CD4 0L (pro CD4 0) .

TS ligand podle vynálezu také může být extracelulární část Fc receptoru (Dougherty a další, Transfusion Science 17, strana 121(1996), ke které se váže protilátka specifická pro cílovou buňku svým Fc koncem.

TS ligandem podle vynálezu také může být ligand pro VDL receptor nebo LDL receptor (tzn. LDL receptor, LDL-protein příbuzný receptoru, FC-receptor z IgG (t. j. Fcy RII-B2, Fcy RI) ; 88 kDa glykoproteinový receptor, acetylovaný LDL receptor, oxidovaný LDL receptor nebo megalin). Ligandy této povahy byly popsány detailně v literatuře a jsou to například: apolipoprotein B-100 nebo jeho fragmenty obsahující koncové karboxyskupiny, apolipoprotein E, komplex proteáza/inhibitor, jako je tPA/PAI-1 komplex, 2-makroglobulin, trombospondin nebo jeho heparin vázající koncová doména (tzn. aminokyseliny 1 až 214) , oxidovaný LDL, acetylovaný LDL nebo acetoacetylovaný LDL, acetylovaný lysin, desialovaný LDL, malondialdehyd • · · · • 4 · konjugovaný LDL, formaldehydem nebo glutaraldehydem ošetřený albumin, maleylovaný albumin, 39 kDa k receptoru asociovaný protein nebo jeho fragmenty, například ty, které obsahují aminokyseliny 18 až 112, 113 až 218 a 219 až 323 nebo aminokyseliny 1 až 114 a 114 až 319, laktoferin, aprotinin, lipoprotein lipáza, prekurzor amyloidového proteinu (nexin 2 proteáza) a exotoxin Pseudomonas.

TS ligandem podle vynálezu může být také molekula protilátky nebo epitop vázající část molekuly protilátky.

Myší monoklonální protilátky, jsou-li používány, přednostně se užívají v humanizované formě, aby se omezila jejich imunogenita. Humanizace může být dosaženo způsobem popsaným Winterem a dalšími (Nátuře 349, strana 293 (1991)) a Hoogenboomem a dalšími (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, strana 19 (1993)). Protilátkové fragmenty jsou připravovány způsobem dle dosavadního stavu techniky, například způsobem popsaným Winterem a dalšími (Nátuře 349, strana 293 (1991), Hoogenboomem a dalšími (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36, strana 19 (1993)), Virol. Mol. Immunol. 28. strana 1379 (1991) nebo Hustonem a dalšími, Int. Rev. Immunol. 10, strana 195 (1993). Rekombinantní fragmenty protilátek mohou být připraveny přímo z existujících hybridomů nebo mohou být izolovány z knihoven (Smith, Science 228, strana 1315 (1985), Winter a další, Annu. Rev. Immunol. 12, strana 433 (1994)). Tyto protilátkové fragmenty jsou potom používány přímo na genetické úrovni pro další manipulace například pro fúze s dalšími proteiny.

Za účelem přípravy rekombinantních fragmentů protilátek z hybridomů se získá genetická informace izolací mRNA kódující vaznou doménu pro antigen (VH, VL), reverzní transkripcí mRNA do cDNA a následnou amplifikací za použití polymerázové řetězové reakce (Saiki a další, Science 230, strana 1350 (1985)) a oligonukleotidů, které jsou komplementární k 5'a 3'koncům, respektive variabilním • · •· •· •· •·

-10·· • · ♦

♦

86, strana 3833 do bakteriálních fragmentům (Orlandi a další, PNAS-USA (1989)). VH a VL fragmenty se poté klonují

Fv fragmentů (Skerra (1988), jednoduchých další, Science 242, expresních vektorů, například ve formě & Plůckthun, Science 240, strana 1038 řetězců Fv fragmentů (sc-Fc) (Bird a strana 423 (1988), Huston a další, (1988)) nebo jako Fab fragmenty 240, strana 1041 (1988)).

PNAS-USA 85, strana 5879 (Better a další, Science také mohou být izolovány

Nové protilátkové fragmenty přimo z protilátkové knihovny (knihovny z imunizovaných, nebo naivních lymfocytů) myšího či lidského původu techniky exprese krátkých peptidových fragmentů v proteinu bakteriofágů a výběru z velkého množství klonů, tzv. phage-display technologie. Při této hledání vhodných protilátkových fragmentů jsou za užití obalovém fágových technice antigen vazebné domény protilátek klonovány jako fúzní proteiny s obalovým proteinem g3P vláknitých bakteriofágů, bud“ do fágového genomu (McCafferty a další, Nátuře 348, strana 552 (1990)) nebo do phagemidového vektoru (Breitling a další, Gene 104, strana 147 (1991)) ve formě scFv fragmentů (1990)) nebo

104, (McCafferty a další, Nátuře 348, strana 552 jako Fab fragmenty (Hoogenboom a další, Nucl. 4133 (1991), Barbas a další, PNAS-USA (1991)). Fágy schopné vazby na antigen pomocí plastikových nádob s imobilizovaným strana

Acid Res. 19, strana 7978 a další, J. Mol. Biol. 222, paramagnetických kuličkách s (Hawkins a další, J. Mol. Biol.

nebo vazbou na buněčné povrchy (Marks a další, Bio/Technol. 11, strana 1145 (1993)).

88, jsou selektovány antigenem (Marks

581 konj ugovaným

226, strana (1991)), na antigenem 889 (1992))

Imunizované knihovny mohou být amplifikací variabilních protilátkových lymfocytů imunizovaných zvířat (Sastry a 86, strana 5728 (1989), Ward a další,

544 (1989), Clackson a další, Nátuře 352, strana 624 připraveny PCR fragmentů z B další., PNAS-USA

Nátuře 341, strana ·· ····

-11strana

7978 nebo pacientů (Mullinax a 8095 (1990), Barbas a další or,

Využívaj í které jsou specifické (1989), (1989), další, BBRC 160, (1991)).

se další,

PNAS-USA 87,

PNAS-USA oligonukleotidů, další, PNAS-USA

86, strana 3833 strana

5728 přitom myší pro

88, strana kombinace (Orlandi a

Sastry a nebo

PNAS-USA 86, imunoglobulinové

1250 (1989)) nebo pro lidské imunoglobulinové genové (Marks a další, Eur. J. Immunol. 21, strana 985 (1991)).

geny (Larrick a další, lidské strana rodiny

Naivní genové knihovny mohou být připraveny užitím neimunizovaných dárců jako zdroje imunoglobulinových genů (Marks a další, J. Mol. Biol. 222, strana 581 (1991)) . Popřípadě mohou být použity immunoglobulinove geny zárodečných linií k přípravě škály semisyntetických protilátek, jejichž komplementaritu zajišťující oblast 3 variabilního fragmentu lze amplifikovat pomocí PCR za použití degenerovaných primerů Mol.

Biol.

89,

692 strana (1994) (1994)) . knihovny linií, protilátkové (Nissim a další, strana 227, 4457 (1992) , Griffths

Tyto tak mají tu výhodu že z jediné fragmenty, EMBO J.

(Hoogenboom & Winter, J.

381 (1992), Barbas a další, PNAS-USA , Nissim a další, EMBO a další, EMBO J. 13, zvané jednozkumavkové oproti knihovnám knihovny mohou proti většímu

13, strana 692 (1994)).

J. 13, strana strana 3245 (single-pot) imunizovaných být izolovány počtu antigenů

Afinita protilátkových fragmentů může být ještě více zvýšena pomocí techniky phage display přičemž se selektují nové knihovny připravené z již existujících protilátkových fragmentů pomocí náhodných mutací (Hawkins a další, J. Mol. Biol. 226, strana 889 (1992), Gram a další, PNAS-USA 89, strana 3576 (1992)), mutací založených na záměně kodonů (Glaser a další, J. Immunol. 149, strana 3903 (1992)) nebo cílených mutací (Balint & Larrick, Gene 137, strana 109 (1993)), záměnou řetězců jednotlivých domén užitím fragmentů z naivních knihoven (Marks a další, Bio/Technol.

• · · 9 ·· ···· · ·· ·· • · · ·«···· · ····· · · ·· · • · ·· · ······ • · · · · * ·

-12- ...............

10, strana 779 (1992)) nebo užitím mutátorových bakteriálních kmenů (Low a další, J. Mol. Biol. 260, strana 359 (1996), přičemž se protilátkové fragmenty s vylepšenými vlastnostmi reselektují za určitých přísných podmínek (Hawkins a další, J. Mol. Biol. 226, strana 889 (1992)).

Dále mohou být myší protilátkové fragmenty humanizovány náhradou jedné z variabilních domén doménou lidského původu s následnou selekcí s originálním antigenem (řízená selekce) (Jespers a další, Bio/Technol. 12, strana 889(1994)). Obdobným způsobem mohou být myší protilátky humanizovány specifickým nahrazením hypervariabilních částí lidských protilátek odpovídajícími částmi původní myší protilátky (Jones a další, Nátuře 321, strana 522(1987)).

TS ligand podle vynálezu může být také obalovým proteinem, nebo částí obalového proteinu virů, které se pomocí svého obalového proteinu specificky vážou na vybrané buňky. Výběr TS ligandu závisí na cílové buňce, která má být transdukována genovým konstruktem.

Příklady ligandů podle vynálezu jsou například látky které: aktivují endoteliální buňky, makrofágy a lymfocyty, vážou se na svalové buňky, hematopoetické buňky, synoviální buňky a zanětlivé buňky, vážou se na buňky, které jsou infikovány viry, vážou se na tkáňové buňky, jako jsou jaterní buňky, gliové buňky a které vážou leukemické buňky. Někteří zástupci těchto ligandů jsou uvedeni níže.

TS ligandy pro aktivované endoteliální buňky

TS ligandy pro aktivované endoteliální buňky podle vynálezu zahrnují protilátky nebo protilátkové fragmenty namířené proti membránovým strukturám endoteliálních buněk, viz například Burrows a další (Pharmac. Ther. 64, strana 155 (1994)), Hughes a další (Cancer Res. 49, strana 6214 (1989)) a Maruyama a další (PNAS-USA 87, strana 5744

-13(1990)). Především pak jsou takovými ligandy podle vynálezu protilátky proti receptorúm VEGF.

TS ligandy podle vynálezu jsou rovněž všechny aktivní sloučeniny, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na povrchu endoteliálních buněk. Takovými sloučeninami jsou například látky zakončené manózou. a dále pak IL-1 nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty nebo částečné sekvence, které jsou schopny vazby na receptory exprimované na povrchu endoteliálních buněk jako jsou například PDGF, bFGF, VEGF or TGFS (Pusztain a další, J. Pathol. 169, strana 191 (1993)).

TS ligandy podle vynálezu jsou rovněž ligandy pro LDL receptory například pro acetylované LDL receptory, oxidované LDL receptory, proteiny příbuzné LDL receptorúm (LRP- LDL related protein), ligandy pro 88 kDa glykoproteinový receptor a pro Fc receptor pro IgG. Takové recptory byly již detailně popsány v literatuře.

TS ligandy podle vynálezu jsou dále adhezní molekuly, které se vážou na aktivované a/nebo proliferující endoteliální buňky. Takové adhezní molekuly jako jsou například Slex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 nebo vitronektin, byly již popsány v literatuře (přehledné

články Augustin-Voss	a další, J.	Cell. Biol. 119,	strana
483	(1992) , Pauli a	další, Cancer	Metast.	Rev.	9,	strana
175	(19 90) a Honn a	další, Cancer	Metast.	Rev.	11,	strana
353	(1992)). Ve výhodném provedení	vynálezu	j sou	TS	ligandy

podle vynálezu glykoproteiny virového obalu pocházející z virů s tropismem v endoteliílních buňkách. Těmito viry jsou například filoviry, například virus Marburg a jeho GP (glykoproteinový) a sGP (druhý glykoproteinový) obalový protein nebo libovolný kmen viru Ebola a jeho obalové proteiny GP a sGP, cytomegalovirus a především jeho gB protein, virus herpes simplex typu I, virus HIV-1, virus spalniček, Hantaan virus, alfaviry jako jsou například

··	····	• ··		·>···
•	•	•	·· · ·	9 9	•
• ·	···	• ·	9 ·	•
•	•	• ·	• · ·	···	•
•	•	•	• ·	•	•
··	···»	··· ····		•

Semliki Forest virus, virus epidemické hemoragické horečky, poliovirus, a enteroviry jako je například ECHO 9, ECHO 12 nebo Coxsackie B3.

TS ligandy pro aktivované makrofágy a/nebo aktivované lymfocyty

Ligandy podle vynálezu mohou obsahovat látky, které jsou schopné specifické vazby na povrch imunitních buněk. Takovými látkami mohou být protilátky nebo protilátkové fragmenty namířené proti strukturám na povrchu imunitních buněk, viz například Powelson a další, Biotech. Adv. 11, strana 725 (1993) .

TS ligandy podle vynálezu jsou dále všechny ligandy pro LDL receptory, viz výše. Dále mohou být TS ligandy podle vynálezu monoklonální nebo polyklonální protilátky nebo protilátkové fragmenty, které jsou svým antigen vazebným variabilním koncem schopny vazby na Fc-γ nebo Fc-ε nebo Fc-μ receptory imunitních buněk, viz Rojanasakul a další, Pharm. Res. 11, strana 1731 (1994).

Mezi ligandy podle vynálezu patří rovněž Fc fragment lidských monoklonálních nebo polyklonálních iminoglobulinů. Takové Fc fragmenty lze například připravit gentetickou manipulací s použitím metod rekombinantní DNA nebo podle článků Haupt a další, Kliň. Wschr. 47, 270 (1969), Kranz a další, Dev. Biol. Standard 44, strana 19 (1979); Fehr a další, Adv. Clin. Pharmac. 6, strana 64 (1974), Menninger a další, Immunochem.13, strana 633 (1976).

TS ligandy podle vynálezu jsou dále všechny látky, které jsou schopny vazby na membránové receptory na povrchu imunitních buněk. Mezi tyto ligandy patří například IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, TNFa, GM-CSF a M-CSF, a rovněž růstové faktory, jako jsou například EGF, TGF, FGF, IGF nebo PDGF, nebo jejich fragmenty, nebo částečné

99 9

-15• 9

sekvencem, které se vážou na receptory exprimované imunitními buňkami.

TS ligandy podle vynálezu jsou dále adhezní molekuly a jiné ligandy, které se mohou vázat na struktury na buněčné membráně jako je například receptor pro manóza

6-fosfát na povrchu makrofágů ve slezinné, játerní, plicní a jiné tkáni. Výběr takovýchto ligandů a membránových struktur je popsán v práci Perales a další. Eur. J. Biochem. 226, strana 255 (1994).

Dalšími vhodnými TS ligandy podle vynálezu jsou obalové glykoproteiny virů, které mají afinitu pro lymfocyty a/nebo makrofágy. Příkladem takovýchto virů infikujících makrofágy jsou: HIV-1 a zvláštěpak jeho kmeny s mutací v oblasti V3 v genu pro gpl20. Tyto mutace vedou g ke zvýšené vazbě na povrch makrofágů. Dále pak mezi tyto viry patří HIV-2, Hantaviry jako je například virus Punmala, cytomegalovirus, virus respirační syncycialidy, virus herpes simplex a filoviry.

Příklady virů infikujících lymfocyty jsou: virus varicella-zoster (VZV), herpes virus 6 (HHV6), virus vztekliny, HIV1, HTLV-II, HTLV-1, chřipkový virus C, vzhledem k tomu, že se chřpkové viry C vážou pomocí hemaglutinin-esteráza fúzního proteinu (HEF)na

N-acetyl-S-acetylneuraminovou kyselinu (Neu 5,9 Ac) která se vyskytuje především na B-lymfocytech a v menší míře, nebo vůbec ne, i na T-lymfocytech. Dále pak chřipkové viry C s mutací nukleotidu 872 (kódujícího aminokyselinu na pozici 284 proteinu HEF) způsobující například záměnu threoninového zbytku za serinový vzhledem k tomu, že tento zmutovaný povrchový HEF protein má výrazně vyšší afinitu k N-acetyl-S-acetylneuraminovému receptoru než virus divokého typu, produkty štěpení proteinu HEF chřipkového viru C, které obsahují část zodpovědnou za vazbu na N-acetyl-S-acetylneuraminovou kyselinu, přičemž tato

	·· ···· « ·β ·· ···· • · · · · · · · · ·
	• · · · · ·	• · · ·
	• « · · ·	• · · · · ·
	• · · · ·	• ·
-16-	• · ··· ·····	• * · · ·
vazebná struktura je definována katalytickou	troj icí
aminokyselin serin 7, histidin	3 68 nebo 3 69 a	kyselinou
asparagovou 261, virus Epsteina	a Barrové protože	infikuje

B-lymfocyty, virus herpes simplex 2 protože infikuje T-lymfocyty a virus spalniček.

TS ligandy pro svalové buňky

Ligandy podle vynálezu, které se vážou na povrch svalových buněk zahrnují například protilátky nebo fragmenty protilátek, které jsou namířené proti membránovým strukturám svalových buněk, především pak proti buňkám hladkého svalstva. Příklady takových protilátek jsou: protilátka 10F3, protilátky proti aktinu, protilátky proti receptorům pro angiotensin II, protilátky proti receptorům pro růstové faktory, protilátky, které jsou namířené například proti EGF receptorům, proti PDGF receptorům, proti FGF receptorům nebo protilátky proti receptorům pro endothelin A.

TS ligandy podle vynálezu dále mohou zahrnovat všechny aktivní látky který se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na svalových buňkách. Takovými ligandy jsou například růstové faktory, jejich fragmenty nebo částečné sekvence, které se vážou na receptory exprimované na buňkách hladkého svalu, například: PDGF; EGF; TGFS; TGFcc; FGF, endothelin A.

TS ligandy podle vynálezu mohou také zahrnovat obalové glykoproteiny virů s afinitou pro svalové buňky. Takovým virem je například cytomegalovirus.

TS ligandy pro hematopoetické buňky

TS ligandy podle vynálezu mohou zahrnovat protilátky nebo fragmenty protilátek, které jsou namířené proti receptorům exprimovaným na relativně nediferencovaných

-17krevních buňkách. Takové protilátky byly popsány například pro následující receptory: receptor pro faktor kmenových buněk, receptor pro IL-1 (typu I) , receptor pro IL-1 (typu II), a receptor pro IL-3, β receptor pro IL-3, receptor pro IL-6 a receptor pro GM-CSF.

Dalšími TS ligandy podle vynálezu jsou moklonální nebo polyklonální protilátky nebo protilátkové fragmenty které se svými konstantními doménami vážou na Fc-γ receptory na imunitních buňkách. TS ligandy podle vynálezu mohou dále také zahrnovat všechny látky, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na povrchu relativně nediferencované krevní buňky . Takovými ligandy mohou být například růstové faktory SCF, IL-1, IL-3, IL-6 GM-CSF, nebo jejich fragmenty nebo částečné sekvence, které se vážou receptory exprimované krevními buňkami.

TS ligandy pro synovialní a buňky zodpovědné za vznik a vývoj zánětu

Tyto ligandy podle vynálezu zahrnují moklonální nebo polyklonální protilátky nebo protilátkové fragmenty které se vážou svými varibilními doménami na membránové struktury synovialních buněk nebo zánětlivých buněk. Příklady takových membránových struktur jsou vimentin, fibronectin a FC receptory.

Tyto ligandy podle vynálezu dále také zahrnují moklonální nebo polyklonální protilátky nebo protilátkové fragmenty které se svými konstantními doménami vážou na Fc receptory. Takovými ligandy podle vynálezu mohou dále být všechny aktivní sloučeniny, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory na synovialních buňkách. Jsou to například cytokiny nebo růstové faktory nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které jsou

-18schopny vazby na receptory exprimované na synovialních buňkách například IL-l-RA, TNFy, IL-4, IL-6, IL-10. IGF a TGFS. Dále mezi tyto ligandy podle vynálezu patří ligandy jejichž podstatnou složkou je terminální manóza, a které se vážou na receptory pro manóza 6-fosfát na makrofázích.

TS ligandy pro buňky infikované virem

TS ligandem podle vynálezu také může být protilátka nebo fragment protilátky namířený proti virovému antigenu, exprimovanému na buněčné membráně buněk infikovaných virem. Takové protilátky byly popsány například pro buňky infikované viry HBV, HCV, HSV, HPV, HIV, EBV a HTLV.

TS ligandy pro buňky játerní a jiné tkáně

Tyto TS ligandy podle vynálezu mohou zahrnovat všechny látky které se vážou membránové struktury nebo membránové receptory na povrchu jaterních buněk. Takovými ligandy jsou například růstové faktory jako cytokiny, EGF, TGF, FGF nebo PDGF, nebo jejich fragmenty či částečné sekvence, které jsou schopny vazby na receptory exprimované těmito buňkami. Tyto ligandy mohou dále zahrnovat TS ligandy, které se vážou na struktury buněčné membrány, selektivně exprimované na buňkách určité tkáně, viz tabulka

1.

Tabulka 1:

Membranózní struktura TS ligand Tkáň receptor pro asialoglykoprotein receptor pro transferrin asialoorosomukoid neoglykoprote in galaktóza transferrin jatemí buňky buňky jatemí a jiných tkání

-19• ·· ·

Membranózní struktura TS ligand Tkáň receptor pro insulin receptor pro manóza

6-fosfát insulin manóza

Fc-γ receptory imunoglobulin G buňky jatemí a jiných tkání makrofágy ve slezině, játrech, plicních lalocích a jiných tkáních retikuloendoteliální systém a jiné tkáně

Tyto ligandy a membránové struktury jsou popsány v souhrném článku Perales a a další , Eur. J. Biochem. 226, strana 255 (1994) .

TS ligandy podle vynálezu jsou dále především obálové glykoproteiny virů s tropisme pro určité buňky, například glykoproteiny viru respirační syncycialidy pro buňky bronchiálního epitelu, glykoproteiny viru hepatitidy C, filoviry, virus hepatitidy B, virus hepatitidy D pro játerní buňky. Například játerní buňky vážou virus Marburg pomocí asialoglykoproteinového receptoru nebo výhodně pomocí asialoglykoproteinového receptoru vážou preS2 a preSl domény viru HBV. Dalším příkladem je glykoprotein viru hepatitidy B, který se váže na játerní sinusoidální buňky pomocí fibronektinu.

TS ligandy pro gliové buňky

Tyto ligandy podle vynálezu mohou zahrnovat protilátky nebo protilátkové fragmenty se specifitou proti membránovým strukturám gliových buňek, viz například Mirsky a další, Coakham a další, McKeever a další . Mezi tyto membranózní struktury dále patří nervové adhezní molekuly jako je například N-CAM, především pak její polypeptidový řetězec C.

Dále mezi tyto ligandy podle vynálezu patří všechny aktivní látky, které se vážou na membránové struktury nebo

-20• · « 99 9 membránové receptory na povrchu gliových buněk. Takovými ligandy jsou například látky, nesoucí na konci svého řetězce manózu a které se vážou na receptor pro manóza 6-fosfát, insulin, růstový faktor podobný insulinu, PDGF, a takové fragmenty těchto růstových faktorů, které se vážou odpovídající membránové receptory.

Dále mezi tyto TS ligandy podle vynálezu patří především obálové glykoproteiny virů s tropismem pro gliové buňky. Příklady těchto virů jsou HIV-1 podtyp JRF 1, virus herpes simplex typu I.

TS ligandy pro leukemické buňky

Tyto ligandy podle vynálezu mohou zahrnovat protilátky nebo protilátkové fragmenty se specifitou proti membránovým strukturám na leukemických buňkách. Takových moklonálních protilátek pro diagnostické a terapeutické účely byl již popsán velký počet, viz Kristensen, Dánish, Medical Bulletin 41, strana 52 (1994); Schranz, Therapia Hungarica 38, strana 3 (1990); Drexler a další , Leuk, Res. 10, 279(1986); Naeim. Dis. Markers 7, strana 1 (1989); Stickney a další , Curr. Opin. Oncol. 4, strana 847(1992); Drexler a další . Blut 57, strana 327 (1988) ; Freedman a další, Cancer Invest. 9, strana 69 (1991)). Pro použití jako ligandy podle vynálezu se hodí následující moklonální protilátky nebo jejich antigen-vazebné fragmenty, s ohledem k typu leukemického onemocnění: (1) pro AML buňky jsou to membránové antigeny CD13, CD14, CD15, CD33, CAMAL, sialosyl-Le; (2)pro B-CLL jsou to membránové antigeny CD5, CDlc, CD23, idiotypy a isotypy membránových imunoglobulinů; (3) pro T-CLL jsou to membránové antigeny CD33, M38, IL-2 receptory, T buněčné receptory; (4) pro ALL jsou to membránové antigeny CALLA, CD19, lymfomy ne-Hodgkinova typu.

0 «000

-21• 0 · 0 0 0 ♦ · 0 ·

0 0 0 0 · · · · · • · · · 0 ···♦·· 0 0 0 0 · ·· • 0 000 000 0000 0· ·

Mezi TS ligandy podle vynálezu dále patří všechny aktivní sloučeniny, které se vážou na membránové struktury nebo membránové receptory leukemických buňek. Takovými ligandy jsou například růstové faktory nebo jejich fragmenty nebo částečné sekvence, které jsou schopny nazby na receptory exprimované leukemickými buňkami.

Takové růstové faktory byly pospány v souhrnných článcích Cross a další, Cell 64, strana 271 (1991);

Aulitzky a další, Drugs 48, strana 667 (1994); Moore, Clin. Cancer Res. 1, strana 3 (1995); a Van Kooten a další, Leuk.

Lymph. 12, strana 27 1993)). Příklady těchto faktorů jsou: IFNa pro lymfomy ne-Hodgkinova typu, IL-2, obzvláště pro leukemie T buněk; FGF pro T buňky, monocytárních, myeloidních, erytroidních a megakaryoblastických leukémií; TGFa v pro leukemie a retinoidy, například kyselina retinová, pro akutní promyelocytární leukémii.

TS ligandy pro buňky tumorů

Tyto ligandy podle vynálezu mohou zahrnovat protilátky nebo protilátkové fragmenty se specifitou proti membránovým strukturám na buňkách tumorů. Takové protilátky jsou například popsány v souhrnných článcích Sedlaček a další, Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Mnichov (1988) a Contrib. to Oncol. 43. Karger Verlag, Munich (1992).

Jinými příklady TS ligandú podle vynálezu jsou protilátky proti: antigenu sialyl-Lewis, což je peptid na tumorových buňkách, který je rozpoznáván T buňkami, proteiny exprimované onkogeny, gangliosidy jako jsou například GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3 a Fucosyl GM 1, antigeny krevních skupin a jejich prekurzory, antigeny na polymorfním epithelovém mucinu, antigeny na heat-shock proteinech.

-229 9 9 99 9

9 9

Linker

Výběr vhodného linkeru závisí na chemické podstatě TS a GS ligandu a na způsobu použitém k vzájemnému propojení TS ligandu a GS ligandu linkerem. Jestliže ligandy jsou peptidy nebo proteiny, je ve výhodném provedení vynálezu jako linker použitý peptid nebo protein. Linker je ve výhodném provedení vynálezu navázán na TS a GS ligand peptidovou vazbou. Takové molekuly typu TS ligand-linker-GS ligand nebo TS ligand-GS ligand-linker jsou ve výhodném provedení vynálezu připravovány jak fúzní proteiny pomocí metod rekombinantní DNA. Výhodný linker bude obecně endogenně se vyskytující látka nebo látka, která se podobá některé endogenní tak, aby byla co nejvíce omezena její imunogenita.

Jestliže TS ligand není peptid ani protein, pak je nej jednodušší formou linkeru struktura, která připojuje TS ligand ke GS ligandu. Struktury této povahy vznikají využitím nejrůznějších chemických metod konjugace, které jsou používány k navázání molekul na aminoskupiny, hydroxylové skupiny, SH skupiny, karboxylové skupiny nebo aldehydové skupiny přítomné v proteinech (souhrn těchto metod je popsán v publikaci Sedlaček a další, Contrib. to Oncol. 32, 42 až 49 a 81 až 85, Karger Verlag, Mnichov, (1988).

Linker a GS ligand mohou být proteinové nebo peptidové povahy. V tomto případě, je spojení mezi těmito částmi uskutečněno ve výhodném provedení vynálezu prostřednictvím peptidové vazby a připojení k linkeru je dosaženo použitím nějaké chemické metody konjugace. To se obzvláště týká případu výhodného provedení vynálezu označeného písmenem c).

Výběr linkeru závisí rovněž na povaze konstruktu,

Jestliže je který je vázán prostřednictvím GS genového ligandu.

tímto genovým konstruktem nemodifikovaná RNA

-23·· ···· nebo nemodifikovaná DNA, buď samotná nebo v komplexu s nevirovým nosičem, pak je linker ve výhodném provedení molekula, která má fúzogenní schopnosti. Tyto fúzogenní schopnosti usnadňují průnik genového konstruktu přes buněčnou membránu a z lyzozomů do cytoplazmy.

Je-li genovým konstruktem virus, pak může být jako linker rovněž vybrána molekula, která má fúzogenní schopnosti. Tyto fúzogenní schopnosti linkeru mohou kompenzovat zhoršené fúzogenní schopnosti obalových proteinů viru, které jsou zapříčiněny navázáním GS ligandu na povrch viru, nebo mohou zesilovat fúzogenní schopnosti obalových proteinů viru.

Jako linkery podle vynálezu s fúzogenní schopností jsou použity virové nebo bakteriální peptidy nebo proteiny, jakož i syntetické peptidy (například takové, které vytvářejí v kyselém prostředí endozomu ct-helixy) . Příkladem molekul, které mají fúzogenní schopnosti jsou: peptidy, které obsahují translokační doménu (doménu III) exotoxinu A získaného z mikroorganizmů rodu Pseudomonas (Wels a další, Cancer Res. 52, strana 6310 (1992); Fominaga a další, J. Biol. Chem. 271, strana 10560 (1996)), peptidy, které obsahují peptid GLFEALLELLESLWELLLEA (Sekvence id.č.:l) (Gottschalk a další, Gene Ther. 3, strana 448 (1996)), peptidy, které obsahují peptid AALAEA [LAEA] ₄LAAAAGC (Sekvence id.č.: 2) (Wang a další, Technol. Advances in Vector Syst. For Gene Ther., 6. až 7. května, 1996, Coronado, Konference IBC), peptidy, které obsahují peptid FAGWLAGAALGVAAAAQI (Sekvence id.č.: 3) přítomný ve fúzním proteinu viru spalniček (Yeagle a další, Biochem. Biophys. Acta 1065, strana 49 (1991)), peptidy, které obsahují peptid GLFGAIAGFIEGGWWGMIDG (Sekvence id.č.: 4) přítomný v proteinu HA2 viru chřipky typu A (Lůneberg a další, J. Biol. Chem. 270, strana 27606 (1995)), peptidy, které obsahují peptid GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGLFGAIAGFIENGWEGMIDG (Sekvence id.č.: 5) (Burger a další, Biochem. 30, strana ·· ·«·· · ·· ·· ···· « · · «·«··· · • · · · · · · ♦· ♦ • · ·· · ···♦·· Ο Λ ♦ < · ··· ·

-24- ·· ··· ♦······ ·♦·

11173 (1991) nebo peptid GLFGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 6),

ALFGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 7), LFLGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 8), LLLGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 9), LILGAIAGFIE: (Sekvence id.č.: 10), GIFGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 11),

GLLGAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 12), GLFAAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 13), GLFEAIAGFIE; (Sekvence id.č.: 14), GLFGAMAGFIE; (Sekvence id.č.: 15), GLFGAIAGLIE (Sekvence id.č.: 16), nebo peptid GLFGAIAGFIV (Sekvence id.č.: 17) (Steinhauer a další, J. Virol. 69, strana 6643 (1995)), nebo peptid

GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG (Sekvence id.č.: 18), nebo peptid GLLEALAELLEGGWEGLLEG (Sekvence id.č.: 19) (Ishiguro a další, Biochem. 32, strana 9792 ( 1993)) .

Ve vynálezu jsou dále použity virové proteiny, které mají fúzogenní schopnosti. Příkladem virů, které mají obalové proteiny s fúzogenními schopnostmi, jsou paramyxoviry, retroviry a herpesviry (Gaudin a další, J. Gen. Virol. 76, strana 1541 (1995)). U velkého množství virů nacházíme rovněž glykoproteiny, které jsou zodpovědné jak za adherenci viru tak za následnou fúzi s buněčnou membránou (Gaudin a další, J. Gen. Virol. 76, strana 1541 (1995)). Proteiny této povahy jsou například vytvářeny alfaviry, rhabdoviry a orthomyxoviry.

Virové fúzogenní proteiny podle vynálezu, jsou přehledně popsány v publikacích Hughson, Curr. Biol. 5, strana 265 (1995),- Hoekstra, J. Bioenergetics Biomembranes

22, strana 675 (1990); White, Ann. Rev. Physiol. 52, strana

675 (1990)). Příkladem fúzogenních proteinů podle vynálezu jsou: hemaglutinin viru chřipky typu A a typu B, zvláště pak komponenta HA2, protein M2 viru chřipky typu A, využívaný bud' samostatně nebo v kombinaci (Ohuchi a další, J. Virol. 68, strana 920 (1994)) s hemaglutininem z viru chřipky nebo v kombinaci s mutanty neuramidázy z viru chřipky typu A, které postrádají enzymatickou aktivitu, ale které nicméně způsobují hemaglutinaci, peptidová analoga hemaglutininu z viru chřipky, protein HEF viru chřipky typu

-25• · ··· ·

C (fúzní aktivita proteinu HEF je aktivována rozštěpením proteinu HEFO na podjednotky HEF1 a HEF2), transmebránový

Marburg nebo viru viru vztekliny, viru vezikulární glykoprotein filovirů, například viru Ebola, transmembránový glykoprotein transmembránový glykoprotein (G) stomatitidy (zánět ústní dutiny), fúzní zvláště pak komponenta gp41 a její fúzogenní protein viru Sendai, zvláště pak 33 aminokyselin komponenty Fl, Semliki Forest transmembránový fúzní protein (RSV-respirátory protein viru HIV, části, fúzní

N-koncových glykoprotein

El, pak transmembránový viru, zvláště pak komponenta glykoprotein viru klíšťové encefalitidy, viru lidské respirační syncycialidy syncycial virus, zvláště pak jeho komponenta gp37), fúzní protein (protein S) viru hepatitidy typu B, fúzní protein viru spalniček, fúzní protein viru způsobujícího Newcastlovo onemocnění, fúzní protein viru Visna, fúzní protein viru myší leukémie (zvláště pak pl5E), fúzní protein viru HTL (zvláště pak gp21) a fúzní protein viru opičí imunodeficience (SIV-simian immunodeficiency virus).

Virové fúzogenní proteiny jsou získány buď rozpuštěním virových obalových proteinů z frakce obohacené o virové částice pomocí detergentů (jako například β-D-oktylglukopyranosid) a jejich oddělením pomocí centrifugace, jak je shrnuto v publikaci Mannio a další, BioTechniques 6, 682 (1988), nebo s využitím molekulárně-biologických metod, které jsou odborníkům dobře známé. Příklady přípravy fúzogenních proteinů jsou popsány například pro hemaglutinin viru chřipky, fúzogenní fragmenty hemaglutininu viru chřipky, protein M2 viru chřipky typu B, protein HEF viru chřipky typu C, transmembránový glykoprotein filovirů, například viru Marburg nebo viru Ebola, transmembránový glykoprotein viru vztekliny, transmembránový glykoprotein viru vezikulární stomatitidy, transmembránový glykoprotein Semliky Forest

-26viru, transmembránový glykoprotein viru klíšúové encefalitidy a transmembránový glykoprotein viru HIV.

Ligand specifický pro genový konstrukt

GS liganden podle vynálezu je struktura, která se přímo nebo nepřímo váže na genový konstrukt a obsahuje celou molekulu protilátky nebo fragment protilátky zodpovědný za vazbu na epitop. Ve výhodném provedení jsou za účelem snížení imunogenicity používány humanizované formy myších monoklonálních protilátek. Tato humanizace byla provedena výše popsaným způsobem, podle postupu popsaného v publikacích Winter a další, Nátuře 349, strana 293 (1991) a Hoogenboom a další, Rev. Tr. Transfus.

Hemobiol. 36, strana 19 (1993) . Fragmenty protilátek a rekombinatní fragmenty Fv jsou připravovány v souladu se poznatků ligandů. fragment, a způsobem popsaným zdali je použit na specifitě Monovalentní případech, kdy aktivitu obalových

To, závisí současným stavem nazvané Popis TS nebo monovalentní a povaze genového konstruktu, protilátky je výhodně používán v protilátka zhoršuje fúzogenní v sekci bivalentní protilátky fragment zvolená proteinů virového genového konstruktu (jak je popsáno například v

Ubol a další, J. Virol. 69, strana 1990 (1995).

Specificita protilátky závisí na povaze použitého genového konstruktu. Jestliže je genovým konstruktem nemodifikovaná RNA nebo nemodifikovaná DNA, bud' samostatná nebo v komplexu s nevirovým nosičem, je jedním z nových provedení vynálezu skutečnost, že protilátka je specificky namířená proti těm epitopům, které byly umístěny do DNA.

Takové epitopy mohou být vytvořeny jednou nebo více modifikacemi DNA, a to s nebo bez zavedení nějaké cizorodé skupiny (xenogenní látka). Příkladem takových modifikací je zesíúování DNA pomocí cisplatiny, alkylace dusíkového atomu N7 guaninu prostřednictvím alkylačních činidel jakými

-27jsou například bis(2-chlorethyl)methylamin hydrochlorid (nitrogen mustard), melfalan, chlorambucil, interkalace nějakého z antracyklinů, jako například doxorubicinu nebo duanomycinu, do dvojvláknové DNA.

Příkladem specifitou proti namířené proti methylované DNA, vystavení DNA ethylguanin,

4-hydroxypyrimidin,

-2'-deoxyguanosin,

-2'-deoxyguanosin, deoxythymidin, antracyklinů.

vytvořené methylací DNA, pochodech.

monoklonálních protilátek s vazebnou epitopu modifikované DNA jsou protilátky 06- ethyldeoxyguanosin (po působení ethylnitrózomočoviny), N⁷N^s-methyl-N^s-formyl-2,5,6-triamino'- deoxyguanosin, 0^s-ethyl 0⁶-izopropyl 0⁴-ethyl-2'a DNA a epitopy DNA

0^s-methyl-2

0^s-n-butyl-2'-deoxyguanosin,

O⁴-methyl-2'-deoxythymidin, adiční produkty melfalanu V tomto kontextu jsou užitečné ke které dochází při metabolických

Je známé, že kmeny E. coli methylují plazmidovou DNA, která byla introdukována do baktérie. Methylace probíhá na dusíkovém atomu na pozici N^s adeninu (Winnacker, From Genes to Clones, strana 18 až 19, VCH Publisher, Weinheim (1987)). V baktériích je přítomen enzym DNA adenin methyláza, který specificky během replikace methyluje adeniny na pozici Ν^δ (Hattman a další, J. Mol. Biol. 126, strana 367 (1978)) . Vynález se proto zvláště týká použití monoklonálních protilátek namířených proti methylované DNA a zvláště pak monoklonálních protilátek namířených proti adeninu methylovanému na pozici N⁶ přítomném v novém ligandu.

Jestliže se genový konstrukt nachází v komplexu s nevirovým nosičem, pak jiné specifické provedení vynálezu popisuje systém, kde je protilátka specificky namířená proti příslušnému epitopu nacházejícím se na nosiči. Mezi tyto nosiče patří kladně nabité polymery, peptidy, proteiny, polyaminy nebo kladně nabité lipidy, jako

-28například kladně nabité lipidy nebo fosfolipidy. Příkladem protilátek namířených proti nosičům této povahy jsou protilátky namířené proti spermidinu, sperminu, putrescinu, polylysinu, albuminu a fosfolipidům.

Jestliže je genovým konstruktem virus, pak je protilátka specificky namířena proti jednomu nebo více totožným nebo rozdílným epitopům obalových proteinů viru. Jelikož ve výhodném provedení je v systému ligandů jako linker použit fúzogenní peptid nebo protein, mohou být rovněž použity protilátky, které zhoršují fúzogenní aktivitu viru a/nebo adhezi viru k buněčnému povrchu tím, že se váží na obalové proteiny.

Příkladem protilátek proti obalovým proteinům virů použitelným jako vektory jsou protilátky proti viru myší leukémie, zvláště pak proti obalovým proteinům gp70 a pl5, protilátky proti viru HIV, adenovirům, viru Herpex simplex, zvláště pak proti glykoproteinu B, glykoproteinu H, glykoproteinu cytomegaloviru, drobnému viru zvláště asociovanému s myší adenomy, glykoproteinu D tohoto pak proti glykoproteinu B (minuté virus of mice), zvláště pak proti proteinům viru, (gpB), viru cap a rep, viru Sindbis, zvláštěpak proti obalovým proteinům E2 nebo E viru neštovic.

V jiném výhodném provedení vynálezu je GS ligand částí nějakého Fc receptoru nacházejícího se vně buněk. Jedna z dříve zmíněných protilátek, které se svou antigen-vazebnou doménou váží přímo nebo nepřímo ke genovému konstruktu, se prostřednictvím své Fc domény váže na takový Fc receptor.

V jiném výhodném provedení vynálezu je GS ligand kladně nabitou strukturní jednotkou, jakou je například kladně nabitá aminokyselina, kladně nabitý peptid nebo protein nebo biogenní amin, která je schopná tvořit komplex s genovým konstruktem. Příkladem takových kladně nabitých

··	4444	• 99	• 4	9999
•	4	•	·· · ·	r ·	9
• 4	444	• ·	4 ·	9
•	•	• ·	• 4 ·	999	9
•	•	•	• 4	9	9
44	444	• 44 4444	99	•

strukturních jednotek jsou: lysin, polylysin, arginin, polyarginin, histidin, polyhistidin, peptidy, které obsahují alespoň jeden lysin, jeden arginin a/nebo jeden histidin a polyaminy jako například kadaverin, spermidin, spermin, agmatin a putrescin.

V jiném výhodném provedení vynálezu je GS ligand receptorem pro obalové proteiny viru, který nese cizorodý gen. Takové receptory byly například popsány pro následující viry: u viru HIV jde o molekulu CD4 (rozpustnou nebo v nativním stavu) a o galaktosylceramid, u HBV jde o receptor pro IL-6 a anexin nebo apolipoprotein, u HTVL jde o receptor pro IL-2 (β a γ řetězce), u viru spalniček jde o molekulu CD4 6, u Friendova viru leukémie jde o receptor pro erythropoietin, u viru varicella Zoster jde o Fc fragment lidského imunoglobulinu G, u viru Sendai jde o glykophorin, u viru chřipky typu C jde o kyselinu N-acetyl-9-acetamido-9-deoxyneuraminovou a kyselinu 9-0-acetyl-N-acetylneuraminovou, u viru způsobujícího slintavku a kulhavku jde o integrin aVS3, u EBV jde o komplementový receptor 2 (CD21) a u viru Herpex simplex jde o receptor pro manóza-6-fosfát o velikosti 275 kDa nebo o receptor pro manóza-6-fosfát o velikosti 46 kDa.

Linker jako komplex (konektor) alespoň dvou molekul

Ve výhodném provedení vynálezu podle písmene c) , je konektor speciálním druhem linkeru skládajícím se z přinejmenším dvou molekul nebo složek. Jedna z těchto molekul nebo složek se váže k přinejmenším jednomu GS ligandu a druhá molekula nebo složka konektoru se váže k přinejmenším jednomu TS ligandu. Tento komplex dále ve výhodném provedení obsahuje alespoň jeden další volitelný linker. Volitelným linkerem může být například fúzogenní peptid. V případech, kdy je použit více než jeden linker, mohou být volitelné linkery identické nebo rozdílné.

-30Fúzogenní peptid usnadňuje vstup nukleové kyseliny dovnitř cílové buňky. V tomto smyslu může být jiným volitelným linkerem látka produkující nějaký signál, jako například radioaktivní izotop, která umožní kvantifikaci komplexů, které vstoupily dovnitř buněk.

Příkladem konektoru, který může být výhodně použit, je pantová oblast nějaké protilátky, jejíž prostřednictvím jsou navzájem spojeny dva těžké řetězce protilátky (Burbon, TIBS 15, strana 64 (1990); Oi a další, Nátuře 307, strana 136 (1984); Alt a další, Science 238, strana 1079 (1987); Lorenz, disertační práce: Konstruktion und Expression von rek. Antikorper-Enzym-Hybridmolekulen fur die Tumortherapie [Konstrukce a exprese rekombinantních protilátek typu protilátka-enzym pro láčbu tumorů], Fakulta všeobecné medicíny univerzity v Marburgu (1991)).

Nové uspořádání pantové oblasti je znázorěno například v diagramu cl) na Obrázku 2. Pantová oblast je ve výhodném provedení připojena k linkerům a k TS a GS ligandům prostřednictvím peptidových vazeb, ve fromě fúzního proteinu, přičemž fúzní protein je připraven pomocí rekombinatních DNA technik.

Jiným příkladem konektoru je protein Gal80 (Leuther a další, Science 256, strana 1333 (1992)) v kombinaci s vazebnou doménou pro Gal80 proteinu Gal4 (Leuther a další, Science 256, strana 1333 (1992)) v souladu s diagramem c2) na Obrázku 3.

Následující příklady mají ilustrovat použití vználezu a nejsou míněny jako omezení jeho použití a popisují tvorbu multifunkčního systému jak je zobrazen na Obrázku 4. ·

Příklad 1: Příprava TS ligandu

Jako výchozí materiál pro přípravu TS ligandu jsou použity hybridomy produkující monoklonální protilátku • · · ·· ·

-31575/100/2 namířenou proti NCAM (Jaques a další, Cancer 72, strana 418 (1993)). Přibližně 107 těchto hybridomů je odděleno centrifugací a za použití kitu pro extrakci mRNA od firmy Pharmacia je z těchto buněk extrahována mRNA. Za použití kitu pro syntézu cDNA a hexaoligonukleotidů o náhodné sekvenci (Pharmacia) je mRNA získaná v předchozím kroku přepsána pomocí reverzní transkriptázy do cDNA. Takto získaná cDNA slouží jako výchozí materiál k amplifikaci variabilních těžkých řetězců nebo variabilních lehkých řetězců imunoglobulinu. Této amplifikace je dosaženo pomocí polymerázové řetězcové reakce (Saiki a další, Science 230, strana 1350 (1985)) s využitím specifických primerů (Clackson a další, Nátuře 352, strana 624 (1991)). Použité primery do sekvence současně zavádějí restrikční místa využitelná ke klonování fragmentů do expresívního bakteriálního vektoru pHENIS (který je odvozen od vektoru pHENl; Hoogenboom a další, Nucl. Acids Res. 19, strana 4133 (1991); viz. Obrázek 5). Tento vektor obsahuje signální sekvenci pelB pro sekreci do periplazmatíckého prostoru, myc kotvu využitelnou k detekci pomocí monoklonální protilátky 9E10, histidinovou kotvu využitelnou při purifikaci pomocí afinitní chromátografie s imobilizovanými kovy (IMAC- immobilized metal affinity chromatography) a rovněž klonovací oblast pro lehký a těžký řetězec a krátkou sekvenci, která kóduje glycin-serinový linker o délce 14 aminokyselin. Za účelem prezentace na povrchu bakteriofágů je navíc uskutečněna fůze s proteinem g3S. DNA kódující těžké a lehké řetězce jsou rozštěpeny odpovídajícími restrikčními enzymy (VH restrikčními enzymy Sfil a Shol; VL restrikčními enzymy ApaLI a Notl) a zaklonovány postupně do vektoru. Výsledkem tohoto jednořetězcový Fv fragment těžkého řetězce, které klonování je rekombinatní skládající se z lehkého a jsou kovalentně spojeny prostřednictvím krátké peptidové sekvence.

• · · · · ·

-32- ·· ... .·· «... .. .

Příklad 2: Příprava GS ligandu

Rekombinatní protilátky specificky namířené proti Νβ-methyladeninu (Sigma) jsou vybrány z knihoven nativních nebo polosyntetických protilátek (Nissim a dalří, EMBO J. 13, strana 692 (1994)) s využitím konjugátů

N6-methyladenin-BSA nebo N⁶-methyladenin-thyreoglobulin (Beiser a další, Methods Enzymol. XII, strana 889 (1968)).

Pozitvně reagující fragmenty protilátek jsou identifikovány na mikrotitračních destičkách povlečených antigenem metodou ELISA (Nissim a dalří, EMBO J. 13,strana 692 (1994)) .

Protilátky z těchto knihoven jsou již přítomny v požadované jednořetězcové formě fragmentu Fv a mohou být přímo využity k následnému klonování.

Příklad 3: Příprava linkeru

Jako linker je aminokyselinovou sekvencí id.č.: 1, viz Gottschalk a použit další, 1996). DNA kódující tento peptid je připravena ve formě dvojvláknového syntetického oligonukleotidu, restrikční na jehož konce místa (AscI a Xbal) .

jsou připojena požadovaná tímto účelem jsou dva

Za syntetické

CCCTTCTGGA (5 oligonukleotidy Ol

AGCCTCTGGG ¹GGCCGCAGGC

TTATTTGAGG

Sekvence

TTCCCAGAGG

ATTGCTAGAG

CTCTCTAGCA

AATTGCTTCT

GGAGGCAT, a 02 (5'CTAGATGCCT

ATTCCAGAAG GGCCTCAAAT

CCAGAAGCAA

AAGCCTG, v souladu s instrukcemi výrobce (Gibco), fosforylovány za použití T4 polynukleotid kinázy po dobu 5 minut zahřívány na 80°C a poté pozvolna ochlazeny na pokojovou teplotu. Tento fragment dvojvláknové DNA je přímo použit k následnému klonování.

Příklad 4: Příprava multifunkčního ligandu

Kompletní ligandový systém je vytvořen v expresívním vektoru pABl (který je konstruován obdobně jako pHENIS, ale • · · ·

-33zaklonováním všech je použita neobsahuje g3p; viz. Obrázek 5) fragmentů. Jako výchozí materiál jednořetězcový fragment Fv namířený proti NCAM který je kóduj ící kóduj ící rozštěpen restrikčními enzymy Sfil linker obsahující je místa Notl a jednořetězcový fragment Fv

N⁶-methyadeninu (GS ligand). Za účelem fragment amplifikovám za použití primerů, vkládají restriční Tímto konstruktem tří

DNA kódující (TS ligand), a Notl, DNA

Xbal a DNA proti je GS které do sekvence namířený klonování místa Xbal (N-konec) a Acsl (C-konec) . je následně transformován bakteriální ligandového systému je regulována pomocí přídavkem popsáno v strana 157 kmen TG1. Exprese promotoru lacZ izopropyl-S-D-thiogalaktosidu

McCafferty a další, (1994)). Exprimovaný protein je z periplazmatického preparátu purifikován pomocí IMAC postupem podle Griffiths a další, EMBO J. 13, molekulovou hmotnost formě monomeru.

j e indukována (IPTG) (jak je Appl. Biochem. Biotech. 47, protein strana 3245 (1994) .

přibližně

Celý protein má

55000 kDa a je přítomen ve

Příklad 5: Testování funkčnosti multifunkčního ligandů

Pomocí technik odborníkům dobře známým jsou nádorové buňky exprimující NCAM (buňky karcinomu průdušek) pomnoženy v buněčné kultuře a poté izolovány. DNA methylovaná na dusíkovém atomu N⁶ adeninu je připravena multiplikací

plazmidu (který	obsahuj e	strukturní	gen kódující
β-glukuronidázu, viz	. Patentová	přihláška	WO	96/06940) v	E.
coli.
Multifunkční	ligandový	systém	je	smíchán	s
plazmidovou DNA v	molárním poměru 20:1	a	celá směs	je

inkubována při 37°C po dobu 3 0 minut. Vazba k plazmidové DNA je ověřena pomocí metody ELISA. Komplex skládající se z multifunkčního ligandů a plazmidu je smíchán s nádorovými buňkami v poměru 10:1 a celek je inkubován při 37°C po dobu

-341 hodiny. Část nádorových buněk je promyta a vazba komplexů na povrch těchto nádorových buněk je zkontrolována s využitím imunofluorescence. Zbylé nádorové buňky jsou inkubovány dalších 24 hodin. Úspěšný příjem komplexů buňkami, jejich uvolnění z endozomů zprostředkované linkerem a transkripce a exprese efektorového genu jsou stanoveny detekcí enzymatické aktivity β-glukuronidázy v kultivačním médiu za použití 4-methylumbeliferyl-β -glukuronidu jako substrátu.

Claims

PATENTOVÉNÁROKY

1. Multifunkční ligandový systém pro buněčně specifický přenos nukleových kyselin vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden ligand specifický pro cílovou buňku, alespoň/ jeden ligand specifický pro genový konstrukt sestávající z protilátky nebo její části a linker spojující tyto dva ligandy, přičemž tento systém není imunogenní.

Ligandový systém podle nároku lvyznačuj ící se tím, že dále obsahuje konektor spojuj ící uvedené ligandy, přičemž tento konektor se skládá ze dvou linkeru.
3. Ligandový systém podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že ligand specifický pro cílovou buňku se váže na povrch cílové buňky.
4. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že ligand specifický pro cílovou buňku je vybrán ze skupiny tvořené růstovými faktory, cytokiny, interferony, faktory nekrotizující tumory, chemokiny, peptidovými hormony, angiotensinem, kininem, nebo histaminem, steroidními hormony, adhezivními molekulami, ligandy VDL receptoru, ligandy LDL receptoru, oxidovanými ligandy LDL receptoru, proteiny blízkími ligandu LDL receptoru, ligandy IgG Fc receptoru, ligandy 88kDa glykoproteinového receptoru, acetylovanými ligandy LDL receptoru, megalinovým ligandem a vitaminy.
5. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že ligand specifický pro cílovou buňku je protilátka nebo fragment protilátky, který se váže na cílovou buňku.
6. Ligandový systém podle nároku 5vyznačuj ící se tím, že fragment protilátky je vybrán ze skupiny tvořené fragmenty F(ab)₂, Fab, dvojitým řetězcem Fv fragmentu, jednoduchým řetězcem Fv fragmentu a fragmentem Fc.
7. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že ligand specifický pro cílovou buňku je extracelulární oblastí Fc receptoru, která je rozpoznávána Fc fragmentem protilátky.
8. Ligandový systém podle libovolného z nároků 5 až 7 vyznačující se tím, že protilátka nebo fragment protilátky je alespoň z části lidského původu.
9. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že ligand specifický pro genový konstrukt je vybrán ze skupiny sestávající z protilátek, fragmentů protilátek, kationtové strukturní jednotky a receptoru obalového proteinu viru.
10. Ligandový systém podle nároku 9vyznačuj ící se tím, že fragment protilátky je vybrán ze skupiny tvořené fragmenty F(ab)₂, Fab, dvojitým řetězcem Fv fragmentu a jednoduchým řetězcem Fv fragmentu.
11. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že ligand specifický pro genový konstrukt je extracelulární oblastí Fc receptoru, která je rozpoznávána Fc fragmentem protilátky.
12. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že protilátka nebo fragment protilátky je alespoň z části lidského původu.
13. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že protilátka nebo fragment protilátky se specificky váže na epitop nukleové kyseliny, který vznikl vazbou cizorodých látek k nukleové kyselině, methylací nebo alkylací nukleové kyseliny.
14 .

Ligandový systém podle libovolného z vyznačující se nebo fragment protilátky nosiči.

nároků 1 až 13 nevirovém tím, se váže že protilátka na epitop na
15. Ligandový systém podle nároku 14 vyznačující se tím, že nevirový nosič je vybrán ze skupiny tvořené kationickými polymery, peptidy, proteiny, biogenními aminy, polyaminy, lipidy a fosfolipidy.
16. Ligandový systém podle libovolného z nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že protilátka nebo fragment protilátky se váže na epitop na obalovém proteinu viru.
17. Ligandový systém podle nároku 1S vyznačující se tím, že virus je vybrán ze skupiny sestávající z viru myší leukémie, HIV, adenovirů, viru herpes simplex, cytomegaloviru, drobného viru myší, virů asocioavaných s adenoviry, virem Sindbis a viru planých neštovic.
18. Ligandový systém podle nároku. 9vyznačuj ící se tím, že kationtová strukturní jednotka sestává samostatně nebo v kombinaci alespoň z jednoho lysinového zbytku, alespoň jednoho argininového zbytku a alespoň jednoho polyaminu.
19. Ligandový systém podle libovolného z nároků 2 až 18 vyznačující se tím, že konektor sestává ze skupiny vhodné pro kovalentní vazbu k funkční skupině vybrané ze skupiny tvořené aminovými skupinami, hydroxylovými skupinami, skupinami SH, karboxylovými a aldehydovými skupinami.
20. Ligandový systém podle libovolného z nároků 2 až 18 vyznačující se tím, že alespoň jeden z uvedených linkerú má fúzogenní účinky.
21. Ligandový systém podle nároku 20 vyznačující se tím, že látka s fúzogenními účinky je vybrána ze skupiny tvořené syntetickými fúzogeními peptidy, bakteriálními fúzogenními peptidy nebo proteiny a fúzními produkty spojení peptidů či proteinu s virem.
22. Ligandový systém podle libovolného z nároků 2 až 21 vyznačující se tím, že konektor obsahuje pantovou oblast protilátky nebo protein Gal80 v kombinaci s proteinem Gal4.

23. Ligandový systém podle nároku lvyznačuj lei se tím, že obsahuje:

a) ligand specifický pro cílovou buňku obsahující anti-NCAM rekombinantní jednořetězcový Fv fragment, ve kterém jsou lehký a těžký řetězec variabilní domény kovalentně spojeny krátkou peptidovou sekvencí

b) linker obsahující fúzogenní peptid o sekvenci GLFEALLELLESLWELLLEA (Sekvence id.č.:l) a

c) ligand specifický pro genový konstrukt obsahující rekombinantní protilátku proti N⁶-methyladenin.

24 . Ligandový vyzná genový kor systém č u j í c í ístrukt. podle se tím nároku , že dále 23 obsahuj e 25 . Ligandový systém podle nároku 24 vyzná č u j í c í se t í m , že genový konstrukt je vybrán ze skupiny sestávající z holé RNA, plazmidu, holé nukleové kyseliny nebo plazmidu v kombinaci s kationickým polymerem, peptidem, proteinem nebo lipidem, a viru. 26 . Použití ligandového systému podle libovolného z nároků 1 až 25 k přípravě léčiva pro prevenci a léčbu

onemocnění kůže, sliznic, nervového systému, vnitřních orgánů, poruchy srážlivosti krve, poruchy krvetvorby, imunitního systému, svalstva, podpůrných tkání nebo onemocnění kloubů.

1/2

Obrázek 1