CZ382196A3 - Protilátky, které se vážou na proteiny přítomné na střevech hmyzu a jejich využití - Google Patents

Protilátky, které se vážou na proteiny přítomné na střevech hmyzu a jejich využití Download PDF

Info

Publication number
CZ382196A3
CZ382196A3 CZ963821A CZ382196A CZ382196A3 CZ 382196 A3 CZ382196 A3 CZ 382196A3 CZ 963821 A CZ963821 A CZ 963821A CZ 382196 A CZ382196 A CZ 382196A CZ 382196 A3 CZ382196 A3 CZ 382196A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
plant
toxin
dna sequence
dna
Prior art date
Application number
CZ963821A
Other languages
English (en)
Inventor
Nadine Barbara Carozzi
Michael Gene Koziel
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ382196A3 publication Critical patent/CZ382196A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblast techniky
JAIOINISVIA ΟΗ3ΛθΤ3λΙΛΙ0ϊΜ avyQ
Vynález popisuje protilátky, které se vážou na proté-i«J/»——-—'— přítomné na střevech hmyzu a jejich využití, zvláště JlK £ ?
jejich využití při tvorbě nových hybridních molekul toxJ Vynález se dále týká mikroorganismů, rostlinných buně rostlin produkujících zmíněné protilátky a hybridní mole!
toxinů. Vynález se také týká insekticidních kompozic a jejji využití při ochraně rostlin proti hmyzím škůdcům.
Dosavadní stav techniky nu.
aOi^oa uly
T 6 0 •f-0
Využívat biologické molekuly k regulaci populací nejrůznějších škůdců je za dosavadního stavu techniky možné jen v omezeném množství případů. Nej známějšími příklady použití pesticidních biologických molekul je využití δ-endotoxínů produkovaných bakteriemi rodu Bacillus thuringiensis (Bt) . Jsou známy různé kmeny Bt produkující během sporulace insekticidní proteiny - δ-endotoxiny. Některé z těchto δ-endotoxinů jsou pro své insekticidní vlastnosti používány proti různým hmyzím škůdcům. Použití δ-endotoxinů je nicméně limitováno, protože tyto látky jsou účinné pouze proti malé části populace z celkového počtu hmyzích škůdců.
Omezená specifita endotoxinů produkovaných Bt je způsobena, alespoň z části, jak mechanismem aktivace příslušného toxinu ve střevech hmyzu (Haider, M. Z. a další, 1986, Eur. J. Biochem. 156, strana 531 až 540) tak schopností tohoto toxinu vázat se na specifické receptory přítomné na povrchu epiteliálních buněk středního střeva hmyzu (Hofmann,
-2C. P. a další, 1988, PNAS 85, strana 7844 až 7848) . Mezi faktory omezující insekticidní aktivitu jednotlivých δ-endotoxinů produkovaných Bt patří nedostatek vhodných receptorů přítomných na střevech hmyzu a nedostatečná afinita δ-endotoxinů vůči receptorům, které mohou být povrchu střev přítomny. Z toho vyplývá neschopnost δ-endotoxinů vázat se na membrány kartáčového lemu. V současné době závisí schopnost regulovat populaci určitých hmyzích škůdců pomocí δ-endotoxinů produkovaných bakteriemi Bt na schopnosti nalézt vhodné δ-endotoxiny s požadovaným rozsahem insekticidních aktivit. Takový δ-endotoxin není v mnoha případech znám a není jisté, zda vůbec existuje. Za účelem nalezení toxinu účinného proti Diabrotica virgifera (WCRW-western corn rootworm), hlavnímu škůdci u kukuřice, byl například proveden screening tisíců kmenů bakterií Bt. V současné době nicméně neexistuje žádná zmínka o kmenech bakterie Bt produkujících δ-endotoxin vysoce účinný proti WCRW.
δ-endotoxiny mají obvykle každý je účinný pouze proti hmyzích škůdců.
účinné pouze řádů
Jednotlivé spektrum aktivit a několika málo druhům δ-endotoxiny jsou náležejícím k malému počtu Možnost produkovat proteiny vytváří více alternativ v zemědělství, zvláště pak biologických molekul, které proti nimž nejsou tyto molekuly potřeba produkce vazebných proteinů, proti jednotlivým hmyzím škůdcům.
velmi úzké j ednomu nebo Navíc bylo zjištěno, že proti několika zástupcům ve třídě Insecta (Hmyz). s unikátním pesticidním účinkem k regulaci populací škůdců hmyzích škůdců, při použití jsou netoxické pro organismy, namířeny. Vyvstává tedy které mohou být namířeny
Podstata vynálezu
Vynález popisuje protilátky, především pak monoklonální protilátky a jejich fragmenty, které se vážou na vezikuly membrán kartáčového lemu střev hmyzu (BBMV-brush border membrane vesicles), a rovněž popisuje gen nebo geny kódujcí tyto proteiny. Protilátky podle vynálezu se vážou na proteiny přítomné na střevech jedinců hmyzu, proti kterým jsou tyto protilátky namířeny. Zástupci hmyzu proti nimž jsou protilátky podle vynálezu namířeny náleží především k řádům Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera a Trichoptera; protilátky podle vynálezu se nicméně nevážou na membrány kartáčového lemu savců ani na rostlinné mikrosomy. Vynález se především týká monoklonálních protilátek nebo jejich fragmentů, které se vážou na střevo WCRW. Ve výhodném provedení vynálezu jsou monoklonálními protilátkami protilátky 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 a 16E4.
Vynález popisuje buněčné linie hybridomů produkující monoklonální protilátky podle vynálezu, zvláště pak buněčné linie hybridomů, které jsou umístěny v ATCC pod čísly HB 11616, HB 11617, HB 11618, HB 11619 a HB 11620.
Vynález dále popisuje sekvenci DNA kódující monoklonální protilátku nebo vazebné místo zmíněné protilátky podle vynálezu. Vynález především popisuje sekvenci DNA kódující monoklonální protilátku nebo vazebné místo zmíněné protilátky, kde uvedená DNA sekvence je vybrána z Sekvence id. č. 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 44 nebo 46. V tomto vynálezu je rovněž popsána sekvence DNA, kde je uvedená sekvence DNA operativně připojena k sekvenci DNA kódující molekulu toxinu, kde zmíněná molekula toxinu náleží ke
-4skupině molekul zahrnující toxiny produkované zástupci rodu
Bacillus, exotoxin produkovaný zástupci rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy nebo proteiny inaktivující ribozomy.
Protilátky a geny kódující tyto protilátky mohou být využity ke konstrukci hybridních molekul toxinů sloužících k regulaci počtů jedinců hmyzích škůdců. Vynález se dále týká hybridní toxinové molekuly, která se skládá z monoklonální protilátky nebo fragmentu monoklonální protilátky obsahujícím vazebné místo podle vynálezu operativně spojené s molekulou toxinu. Ve výhodném provedení vynálezu náleží zmíněná molekula toxinu ke skupině molekul zahrnující toxiny produkované zástupci rodu Bacillus, například endotoxinv produkované zástupci rodu Bacillus, především však náleží ke skupině molekul zahrnující endotoxiny produkované zástupci rodu Bacillus, vegetativní insekticidní proteiny, exotoxin produkovaný zástupci rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy nebo proteiny inaktivující ribozomy.
Vynález se dále týká hybridní molekuly toxinu skládající se z monoklonální protilátky nebo fragmentu monoklonální protilátky obsahujícím vazebné místo umožňující vazbu na střevo hmyzu, ale především na membrány kartáčového lemu střeva hmyzu, proti kterému je tato protilátka namířena (tato monoklonální protilátka nebo její fragment se nicméně nevážou na membrány kartáčového lemu savců nebo na rostlinné mikrozomy), operativně spojené s molekulou toxinu. Zmíněná molekula toxinu náleží ke skupině molekul zahrnující toxiny produkované zástupci rodu Bacillus, například endotoxiny produkované zástupci rodu Bacillus, především však náleží ke skupině molekul zahrnující endotoxiny produkované zástupci rodu Bacillus, vegetativní insekticidní proteiny, exotoxin
-5produkovaný zástupci rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy nebo proteiny inaktivující ribozomy.
Vynález dále popisuje sekvence DNA, které kódují hybridní molekulu toxinu podle vynálezu skládající se z monoklonální protilátky nebo fragmentu monoklonální protilátky operativně spojené s molekulou toxinu obsahující vazebné místo umožňující vazbu na střevo hmyzu, proti kterému je tato protilátka namířena, ale nevážou se na membrány kartáčového lemu savců nebo na rostlinné mikrozomv.
Vynález dále popisuje mikrobiální hostitele transformované vhodným vektorem s vloženou sekvencí DNA kódující hybridní molekulu toxinu podle vynálezu. Zvláště vhodnými mikroorganismy jsou zástupci bakterií, řas a hub.
Vynález se dále týká rekombinantních organismů, zvláště pak mikroorganismů náležejících ke skupině tvořrné bakteriemi jako jsou bakterie rodů Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, a zvláště pak kvasinky jako jsou Sacharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium a viry jako například jaderný polyhedrální virus Autographica californica, transformované alespoň jednou ze sekvencí DNA podle vynálezu.
Vynález dále popisuje rekombinantní mikroorganismus, který nese alespoň jednu molekulu DNA kódující hybridní molekulu toxinu skládající se z protilátky nebo fragmentu této protilátky operativně spojené s molekulou toxinu, která se váže na střevo hmyzu proti kterému je namířena, ale přitom
-6se neváže na membrány kartáčového lemu savců nebo na rostlinné mikrozomy,. Zmíněná DNA kódující monoklonální protilátku obsahuje sekvenci, která je vybrána ze skupiny tvořené Sekvencemi id. č. 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 44 a 46.
Vynález se dále týká insekticidní kompozice obsahující jakýkoliv z výše zmíněných rekombinantních mikroorganismů podle vynálezu, které jsou spolu s vhodným nosičem přítomny v této kompozici v množství dostatečném k manifestaci jejich insekticidních vlastností.
Vynález dále popisuje insekticidní kompozici obsahující izolovanou hybridní molekulu toxinu podle vynálezu, která je spolu s vhodným nosičem přítomna v této kompozici v množství dostatečném k manifestaci jejich insekticidních vlastností.
Vynález se dále týká sekvence DNA skládající se z první expresivní kazety obsahující sekvenci DNA kódující promotor, který je schopen řídit expresi proteinu v rostlině, operativně spojenou s první sekvencí DNA kódující lehký řetězec monoklonální protilátky nebo vazebnou doménu lehkého řetězce této protilátky, kde zmíněná protilátka je schopna vazby na střevo hmyzu, proti kterému je namířena. V dalším provedení vynálezu zmíněná kazeta dále obsahuje druhou sekvenci DNA, která kóduje molekulu toxinu operativně spojenou se zmíněnou první sekvencí DNA kódující lehký řetězec monoklonákní protilátky nebo vazebnou doménu lehkého řetězce této protilátky. Zvláště výhodná je expresivní kazeta, kde druhá DNA sekvence kóduje toxinovou molekulu náležející ke skupině molekul zahrnující toxiny produkované zástupci rodu Bacillus, exotoxin produkovaný zástupci rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy nebo proteiny inaktivující ribozomy.
-7Vynález dále popisuje sekvenci DNA obsahující druhou expresivní kazetu sestávající ze sekvence DNA kódující promotor, který je schopen řídit expresi proteinu v rostlině, operativně spojenou s první sekvencí DNA kódující těžký řetězec monoklonální protilátky nebo vazebnou doménu těžkého řetězce této protilátky, přičemž zmíněná protilátka je schopna vazby na střevo hmyzu, proti kterému je namířena. V dalším provedení vynálezu dále zmíněná kazeta obsahuje druhou sekvenci DNA, která kóduje molekulu toxinu operativně spojenou se zmíněnou první sekvencí DNA kódující těžký řetězec monoklonákní protilátky nebo vazebnou doménu těžkého řetězce této protilátky. Zvláště výhodná je expresivní kazeta, kde druhá DNA sekvence kóduje toxínovou molekulu náležející ke skupině molekul zahrnující toxiny produkované zástupci rodu Bací Hus, exotoxin produkovaný zástupci rodu Pseudomonas, phytolaccin, gelonin, ribonukleázy nebo proteiny inaktivující ribozomy.
Sekvence DNA podle vynálezu může být přítomna v izolované a purifikované formě anebo jako součást genomu rostliny.
Vynález dále popisuje rostlinné buňky nebo celé rostliny včetně jejich potomstva, zvláště pak rostliny kukuřice, kde jsou zmíněné rostlinné buňky nebo celé rostliny transformovány sekvencí DNA podle vynálezu, ale především rostlinnou expresivní kazetou podle vynálezu. Vynález se dále týká transgenních rostlinných buněk nebo celých rostlin včetně jejich potomstva, zvláště pak rostlin kukuřice, které exprimují hybridní molekuly toxinu podle vynálezu, a které výhodně exprimují hybridní molekuly toxinu v množství dostatečném tomu, aby byla u rostlinných buněk nebo celých rostlin navozena tolerance nebo rezistence vůči hmyzím
-8škůdcům. Rostliny podle vynálezu jsou výhodně hybridní rostliny.
Vynález rovněž popisuje rostlinné propagule, především pak semena rostlin, které jsou ošetřeny směsí vytvářející na jejich povrchu ochranný obal.
Vynález dále popisuje způsoby sloužící k přípravě buněčných linií hybridomů, které produkují protilátky nebo monoklonální protilátky podle vynálezu. Zmíněné způsoby zahrnuj 1:
a) využití střev hmyzu, výhodněji membrán kartáčového lemu hmyzu, jako antigenu;
b) imunizaci živočicha, který bude následně zdrojem Bbuněk, zmíněným antigenem;
c) izolaci imunokompetentních B-buněk z organizmu tohoto živočicha;
d) fúzi zmíněných imunokompetentních B-buněk s buněčnou linií nádorových buněk schopných nekonečného počtu buněčných dělení;
e) izolaci výsledného fúzního produktu, jeho kultivaci ve vhodném kultivačním médiu a následné klonování pozitivních hybridních buněk; a
f) screening klonovaných hybridních buněk, produkují-li tyto monoklonální protilátky, a následnou selekci těch klonů, které vykazují požadované vlastnosti.
Vynález dále popisuje způsob sloužící k produkci protilátky, především pak monoklonální protilátky nebo jejího fragmentu, která se váže na membránové vezikuly kartáčového
-9lemu střeva hmyzu. Tento způsob zahrnuje kultivaci buněčné linie hybridomů produkujících zmíněné protilátky ve vhodném kultivačním médiu in vivo a in vitro a izolaci vzniklých protilátek.
Vynález se dále týká způsobu produkce hybridních molekul toxinů skládajících se z monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu této monoklonální protilátky podle vynálezu, která se váže na membránové vezikuly kartáčového lemu střeva hmyzu, operativně spojené s molekulou toxinu. Tento způsob sloužící k produkci hybridních molekul toxinů zahrnuje klonování variabilní oblasti zmíněné protilátky a připojení zmíněné variabilní oblasti k molekule toxinu.
Vynález dále popisuje způsob přípravy sekvence DNA, která kóduje monoklonální protilátku podle vynálezu. Tento způsob sloužící ke tvorbě sekvence DNA zahrnuje klonování příslušných genů hybridomů kódujících protilátky za použití primerů ke konzervovaným DNA sekvencím kódujícím konstantní oblasti a úseky základní struktury variabilních oblastí příslušné protilátky.
Vynález se dále rostlinných buněk a transformaci zmíněné týká způsobu přípravy transgenních rostlin. Tento způsob zahrnuje rostlinné buňky nebo rostliny prostřednictvím jedné nebo více výše uvedených sekvencí DNA, které kódují hybridní molekulu toxinu podle vynálezu. Tato hybridní molekula toxinu se skládá z monoklonální protilátky nebo vazebného fragmentu této monoklonální protilátky operativně spojené s molekulou toxinu, která se váže na membránové vezikuly kartáčového lemu střeva hmyzu, ale neváže se na membrány kartáčového lemu savců nebo na rostlinné mikrozomy.
-10Vynáiez popisuje protilátky a monoklonální protilátky včetně jejich fragmentů, které jsou schopny vázat se specificky na proteiny přítomné na střevech hmyzu. Takové protilátky se vážou na buňky střeva hmyzu, ale nevážou se ani na membránové vezikuly kartáčového lemu savců (BBMV - brush border membrane vesicles) ani na rostlinné mikrozomy. Protilátky podle vynálezu zahrnují polyklonální a monoklonální protilátky včetně jejich fragmentů, které si udržely schopnost vázat se na proteiny přítomné na střevech hmyzu. Mluvíme-li u protilátky, monoklonální protilátky nebo jejího fragmentu o schopnosti vázat určitou molekulu, myslíme tím schopnost zmíněné protilátky, monoklonální protilátky nebo jejího fragmentu specificky reagovat se zmíněnou molekulou a tím se na tuto molekulu vlastně vázat. Termínem protilátka (Ab) a monoklonální protilátka (Mab) jsou míněny intaktní molekuly, jakož i jejich fragmenty nebo vazebné oblasti nebo domény (jako například Fab a F(ab)2 fragmenty) schopné vázat hapten. Takové fragmenty jsou obvykle připraveny proteolytickým štěpením intaktních molekul za použití například papainu nebo pepsinu. Alternativní cestou přípravy fragmentů schopných vázat hapten je použití postupů využívajících techniky rekombinace DNA nebo chemická syntéza.
Způsoby sloužící k přípravě protilátek podle vynálezu jsou v současnosti dobře známé; viz například Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lané (editoři) Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988) a rovněž i zde citované práce. Mezi standardní práce týkající se obecných principů imunologie patří: Klein, J. Immunology: The Science of CellNoncell Discrimination, John Wiley & Sons, NY (1982); Dennett, R. a další, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenům Press, NY (1980); a
-11Campbell, A. Monoclonal Antibody Technology, In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon a další (editoři), Elsevier, Amsterdam (1984); viz též americké patenty číslo: 4,609,893; 4,713,325; 4,714,681; 4,716,111; 4,716,117; 4,720,459.
Při přípravě protilátek a monoklonálních protilátek podle vynálezu můžeme jako antigen použít střeva hmyzu, a zvláště pak membrány kartáčového lemu střeva hmyzu. Metodika přípravy takových membrán ze střeva hmyzu je v současnosti dobře známá. Membrány kartáčového lemu mohou být z larev hmyzu izolovány postupem zahrnujícím nejprve disekci střev, následnou homogenizaci a precipitaci membrán chloridem vápennatým; viz například Wolfersberger (1986) Comp. Biochem. Physiol. 86A, strana 301 až 308.
Je zřejmé, že prostřednictvím způsobů popsaných v tomto vynálezu mohou být připraveny protilátky specificky namířené proti příslušnému druhu hmyzu. Hmyzem, proti kterému je protilátka namířena rozumíme hmyz, v jehož organismu dochází k vazbě protilátky podle vynálezu na protein nebo proteiny přítomné na střevech tohoto hmyzu. Z toho vyplývá, že je možné připravit protilátky schopné selektivně se vázat na proteiny přítomné na střevech hmyzu, proti kterému jsou namířeny.
Zástupci hmyzu, proti nimž jsou zmíněné protilátky namířeny náleží k řádům Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera atd. Ze zmíněných řádů je tedy možné vybrat jakéhokoliv zástupce a vytvořit protilátky specifické proti tomuto jedinci. Zvláště zajímaví z tohoto hlediska jsou hmyzí škůdci, pro něž neexistuje žádný protein produkovaný
-12bakteriemi Bt schopný vazby v organizmu daného škůdce a následného zahubení tohoto organizmu. Jedním z takových škůdců je například WCRW.
Buněčné linie podle vynálezu produkující protilátky a monoklonální protilátky tvoří jenom část ze všech buněčných linií, které produkují protilátky, jestliže jsou membránové vezikuly kartáčového lemu (BBMV) hmyzu použity jako antigen ke stimulaci produkce protilátek. Vazebné charekteristiky požadovaných protilátek produkovaných buněčnými liniemi jsou stanovovány metodou diferenčního screeningu všech možných monoklonálních protilátek proti BBMV hmyzu, proti kterému jsou namířeny.
Metodou diferenčního screeningu podle vynálezu identifikujeme rovněž protilátky produkované buněčnými liniemi, které se vážou rovněž na BBMV savců a/nebo na rostlinné mikrozomy. Protilátky (a příslušné buněčné linie produkující tyto protilátky), které se vážou na BBMV savců nebo na rostlinné mikrozomy nejsou už dále používány. Metodou diferenčního screeningu můžeme rovněž identifikovat buněčné linie produkující monoklonální protilátky, které se vážou na BBMV jedinců hmyzu odlišných od jedinců hmyzu, proti kterým jsou tyto protilátky namířeny. Protilátkami podle vynálezu tedy rozumíme protilátky, které se vysoce selektivně vážou na hmyz, proti kterému jsou namířeny, a zvláště pak na střevo tohoto hmyzu.
Buněčné linie produkující monoklonální protilátky s požadovanou vazebnou specifitou mohou být použity jako zdroj messenger RNA určené ke klonování cDNA pro příslušnou monoklonální protilátku. Geny kódující protilátky mohou být z linií hybridomů klonovány za použití primerů ke konzervativním sekvencím DNA kódujícím konstantní oblasti a
-13úseky základní sruktury variabilních domén příslušné protilátky. Po tomto postupu může následovat amplifikace DNA metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). Databáze sekvencí lehkých a těžkých řetězců myší vytvořená Rabatem a dalšími byla úspěšně použita k vytvoření primerů (jak specifických pro jednotlivé izotypy tak degenerovaných vzhledem k jednotlivým izotypům) pro klonování genů kódujících protilátky (Rabat, E. A. a další, 1987, minsterstvo zdravotnictví Spojených Států, Vládní tiskový úřad Spojených Států a Jones, S. T. a Bendig, M., 1991, Bio/technology 9, strana 83 až 89). V současnosti je navíc známo mnoho způsobů sloužících ke klonování menších fragmentů protilátek, které mají vazebnou specifitu původní protilátky.
Rlonovaná DNA může být sekvenována způsoby dobře známými ve stavu techniky; viz například Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) svazky 1 až 3 a články zde citované. Proteinová sekvence vazebné domény příslušné protilátky může být odhadnuta z odpovídající sekvence nukleové kyseliny.
Protilátky a monoklonální protilátky podle vynálezu jsou použity při tvorbě hybridních molekul toxinů. Termíny hybridní molekula toxinu nebo hybridní toxin označují fúzní proteiny nebo imunotoxiny, které se skládají z monoklonální protilátky nebo fragmentu monoklonální protilátky operativně spojené s molekulou toxinu a které jsou schopny vazby na střevo hmyzu. To znamená, že i po spojení s molekulou toxinu si monoklonální protilátka nebo fragment monoklonální protilátky zachovávají svoje vazebné vlastnosti a naopak, že molekula toxinu si zachovává své cytotoxické vlastnosti.
-14Jako molekula toxinu může být použito velké množství cytotoxických proteinů. Sem patří (nejenom) endotoxinů) produkované bakteriemi Bacillus insekticidní proteiny; viz toxiny (včetně a vegetativní americká oatentová naoříklad přihláška 08/037,057, 25. březen 1993, a WO 93/07278, která je zde citována. Jako další toxiny je možné použít katalytické inaktivátory ribozomů, jako například gelonin; phytolaccin nebo exotoxin A produkovaný bakteriemi Pseudomonas (struktura toxinu produkovaného bakteriemi Pseudomonas je dobře popsána v článku Chaudhary a další, (1990) J. Biol. Chem. 265, strana 16303 až 16310); látky narušující buněčný metabolismus jako například ribonukleázy (viz například Mariani a další, (1990) Nátuře 347, strana 737 až 741); PE-Bar, což je vlastně chimérický toxin odvozený od ribonukleázy produkované bakteriemi Bacillus amyloliquefaciens (barnáza-Bar) a endotoxinů A produkovaného bakteriemi Pseudomonas (viz Prior a další, (1991) Cell 64, strana 1017 až 1023); hydrofilní peptidy vytvářející póry v membránách (Frohlich a Wells (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, strana 2 až 6); atd.
Hybridní molekuly toxinů podle vynálezu se tudíž skládají z oblasti umožňující vazbu na molekuly přítomné na střevech hmyzu (Část odpovídající molekule protilátky) a z části odpovídající molekule toxinu, jejímž úkolem je destrukce cílové buňky a nakonec celého organismu hmyzu, proti kterému jsou namířeny. Použití monoklonálních protilátek nebo fragmentů monoklonálních protilátek v hybridních molekulách toxinů způsobí, že hybridní molekula toxinu se váže pouze na střevo hmyzu, proti kterému je že je toxická pouze pro tento hmyz. Vazebné takových hybridních molekul toxinů jsou namířena, a charakteristiky odvozeny od vazebné oblasti Mab, zatímco toxický účinek
-15těchto hybridních molekul toxinů závisí na druhu použité molekuly toxinu.
Ve stavu techniky je známá řada způsobů sloužících k připojeni protilátky nebo fragmentů protilátek k molekule toxinů. Ve zmíněných způsobech jsou použity k vytvoření jednořetězcového imunotoxinu linkery (Chaudhary a další, (1989) Nátuře 339, strana 394 až 397; Chaudhary a další, (1990) PNAS 87, strana 9491 až 9494; Batra a další, (1991), Mol. and Cellular Biol. 11, strana 2200 až 2205; Brinkmann, a další, (1991), PNAS 88, strana 8618 až -8620; Brinkman a další, (1992), PNAS 89, strana 3075 až 3079; Whitlow a další, (1993) Protein Engineering 6, strana 989 až 995). Jeden ze zvláště vhodných linkerů je založen na sekvenci pantové oblasti lidského IgAl jak je popsáno v Hallewell a další, (1989), J. Biol. Chem. 264, strana 5260 až 5268 a v Sekvenci id. č.:43.
Aktivita hybridní molekuly toxinu může záviset na několika faktorech, které mohou být optimalizovány. Tato aktivita může být měřena, použijeme-li protein produkovaný protoplasty kukuřice. Protoplasty kukuřice exprimující hybridní molekuly toxinů mohou být přidávány do diety hmyzu za účelem stanovení jejich aktivity. Obecně jsou dané způsoby popsány v Marrone (1985) J. Econ. Entomolo. 78, strana 260 až 293, Macintosh a další, (1990) J. of Invertebrate Pathology 56, strana 258 až 266 a článcích zde citovaných.
Je tedy možné měřit insekticidní aktivity hybridních molekul toxinů namířených proti jednotlivým hmyzím škůdcům. Hybridní molekuly toxinů, které vykazují příslušnou insekticidní aktivitu mohou být dále upraveny a použity v zemědělství.
-16Je zřejmé, že je možné vytvořit nejrůznější hybridní molekuly toxinů. Hybridní molekula toxinu může být například kódována dvěma expresivními kazetami, z nichž jedna kóduje lehký řetězec a druhá těžký řetězec molekuly protilátky. Tato binární hybridní molekula toxinu může být pak in vivo sestavena běžným mechanismem používaným buňkami ke tvorbě vazebného místa protilátky. Část hybridní molekuly toxinu odpovídající molekule toxinu může být operativně připojena na N nebo C konce těžkého nebo lehkého řetězce, nebo může nahradit část či dokonce cellou konstatní oblast kteréhokoliv řetězce. Molekula toxinu může být rovněž vložena do konstantní oblasti nebo mezi konstantní oblasti řetězců protilátky; viz například Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) svazky 1 až 3 a články zde citované.
Hybridní molekuly toxinů (včetně binárních toxinů) podle vynálezu mohou být produkovány v rostlinách. Geny kódující protilátky mohou být tedy klonovány a exprimovány v rostlinách takovým způsobem, aby došlo k vytvoření funkčních molekul protilátek; viz například Hiatt a další, (1989) Nátuře 342, strana 76 až 78; During a další, (1990) J. Plant Molecular Biology 15, strana 281 až 293; a PCT Application WO 91/06320. Hladina exprese bivalentních protilátek dosahovala například u tabáku 1% množství všech rozpustných proteinů. Je zřejmé, že tak jako intaktní molekuly protilátek mohou být použity i fragmenty těchto protilátek jako například Fab nebo Fv prokázáno, že menší Fab a Fv fragmenty zachovávají vazebnou afinitu jakou měly příslušné intaktní protilátky. Jednořetězcové Fv fragmenty (scFv) u nichž jsou domény Vh a VI spojeny prostřednictvím hydrofilních a fragmenty. Bylo (12 kDa-50 kDa)
-17ohebných peptidů byly s úspěchem použity při namíření enzymů a toxinů proti specifickým buňkám (Bird (1988) Science 423, strana 423 až 426 a Huston (1988) PNAS 85, strana 5879 až 5883) . Samostatné Vh domény (Dabs) a samostatné komplementaritu určující oblasti (complementarity determining regions-CDR) o velikosti 20 aminokyselin nazývané minimální rozpoznávací jednotky (minimal recognition units-mru) byly rovněž použity k vazbě antigenů (Ward (1989) Nátuře 341, strana 544 až 546 a Taub (1989) J. Biol. Chem. 264:259-265 a Williams (1989) PNAS 86, strana 5537 až 5541). Použití těchto fragmentů protilátek poskytuje možnost minimalizovat velikost domény odvozené od Mab odpovědné za specifitu vazby na hmyz.
Vynález rovněž popisuje fragmenty DNA kódující protilátky nebo oblasti protilátek, které se vážou na střevo hmyzu. Ve výhodném provedení vynálezu kódují tyto fragmenty DNA vazebné oblasti, které jsou odvozeny z monokionálních protilátek namířených proti BBMV cílového organismu hmyzu a u které byly otestovány, zda se nevážou na BBMV savců nebo na rostlinné mikrozomy. Takové fragmenty DNA mohou být použity při konstrukci nových genů kódujících hybridní toxinové molekuly zmiňované v předešlém textu.
Sekvence DNA kódující v hybridní molekule toxinu část odpovídající molekule toxinu jsou v současnosti dobře známy; viz Lamb a další, (1985) Eur. J. Biochem. 148, strana 275 až 170 (Ricin); Gray a další, (1984) PNAS 81, strana 2645 až 2649 (sekvence DNA kódující toxin produkovaný bakteriemi Pseudomonas); Hindley a Berry (1988) Nucleic Acids Res. 16, strana 4168 (gen kódující toxin produkovaný bakteriemi B. sphaericus); Bauman a další, (1988) J. Bacteriol. 170, strana 2045 až 2050; Bauman a další, (1987) J. Bacteriol. 169, strana 4061 až 4067; Berry a Hindley (1987) Nucleic Acids Res. 15, strana 5891; Berry a další, (1989) Nucl. Acids Res.
-1817, strana 7516 (B. sphaericus); WO 9309130-A (gelonin); EP 466222-A americký patent 5,128,460 (protein inaktivujici ribozomy); EP 412911-A (barnáza); Heernstadt a další, (1987) Gene 57, strana 34 až 46 (crylIIA) ; Brizzard a Whiteley (1988) Nucleic Acids Res. 16, strana 2723 až 2724 (crylB); Geiser a další, (1986) Gene 48, strana 109 až 118 (crylA(b)). Dále pak Porter a další, (1993) Microbiological Reviews 57, strana 838 až 861; Hofte a Whiteley (1989) Microbiological Reviews 53, strana 242 až 255; a WO 93/07278.
Geny kódující hybridní molekuly toxinů podle vynálezu mohou být upraveny za účelem dosažení zvýšené exprese v rostlinách; viz například WO 93/07278; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak a další, (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, strana 3324 až 3328; a Murray (1989) Nucleic Acids Res. 17, strana 477 až 798. Mohou být syntetizovány geny s kodony upřednostňovanými při translaci v rostlinách. Slovním spojením upřednostňovaný kodon rozumíme kodon v hostiteli, který je v organismu tohoto hostitele nejčastěji používán ke kódování dané aminokyseliny. Například u kukuřice může být upřednostňovaný kodon pro danou aminokyselinu odvozen ze známých genových sekvencí kukuřice. Použití kodonu v 28 genech kukuřice můžeme nalézt v Murray, (1989), Nucleic Acids Research 17, strana 477 až 498. Syntetické geny mohou být rovněž vytvořeny na základě znalosti distribuce kodonů využívaných jednotlivými hostiteli ke kódovaní příslušných aminokyselin.
Tímto způsobem je možné optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresí proteinů v jakékoliv rostlině. Je zřejmé, že jakákoliv genová sekvence nebo její část může být optimalizována a syntetizována. To znamená, že je možné použít jak syntetické (částečně optimalizované) tak nativní sekvence.
-19Způsoby sloužící k transformaci rostlinných buněk a k regeneraci transformovaných buněk jsou ve stavu techniky velmi dobře známé. Obecně je možné k zavedení cizorodé DNA do rostlinných buněk použít buď plazmidové vektory Ti nebo přímý příjem DNA, lipozomy, elektroporaci, mikroinjekce nebo mikroprojektily. Všechny tyto metody jsou publikované; viz například Guerche a další, (1987) Plant Science 52, strana 111 až 116; Neuhause a další, (1987) Theor. Appl. Genet. 75, strana 30 až 36; Klein a další, (1987) Nátuře 327, strana 70 až 73; Howell a další, (1980) Science 208, strana 1265; Horsch a další, (1985) Science 227, strana 1229 až 1231; DeBlock a další, (1989) Plant Physiology 91, strana 694 až 701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach a Weissbach, editoři) Academie Press, lne. (1988); Methods in Plant Molecular Biology (Schuler a Zielinski, editoři) Academie Press, lne. (1989); dále rovněž EPA 0193259 a EPA 0451878A1. Je samozřejmé, že použité metody transformace budou záviset na druhu transformovaných rostlinných buněk.
Je rovněž zřejmé, že jednotlivé části expresivní kazety obsahující požadované sekvence mohou být upraveny za účelem zvýšení hladiny genové exprese v rostlinách nebo rostlinných buňkách. Mohou být například použity zkrácené sekvence, může být provedena záměna některých nukleotidů nebo mohou být provedeny ještě jiné modifikace; viz například Perlak a další, (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, strana 3324 až 3328; Murray a další, (1989) Nucleic Acids Research 17, strana 477 až 498; a WO 91/16432.
Vytvářené sevence mohou rovněž obsahovat další nezbytné regulační prvky, jako například terminátory (Guerineau a další, (1991), Mol. Gen. Genet. 226, strana 141 až 144; Proufoot a další, (1991) Cell 64, strana 671 až 674; Sanfacon a další, (1991) Genes Dev. 5, strana 141 až 149; Mogen a
-20další, (1990) Plant Cell 2, strana 1261 až 1272; Munroe a další, (1990) Gene 91, strana 151 až 158; Ballas a další, (1989) Nucleic Acids Research 17, strana 7891 až 7903; Joshi a další, (1987) Nucleic Acids Research 15, strana 9627 až 9639); rostlinné translační konvenční sekvence (Joshi, C. P., (1987), Nucleic Acids Research 15, strana 6643 až 6653), introny (Luehrsen a Walbot (1991), Mol. Gen. Genet. 225, strana 81 až 93) a podobné operativně připojené nukieotidové sekvence. Může být výhodné zavést do expresivní kazety 5' vedoucí sekvence. Tyto vedoucí sekvence mohou zvýšit účinnost translace. Mezi v současnosti známé vedoucí sekvence patří:
vedoucí sekvence Picornavirů, například vedoucí sekvence EMCV (Encephalomyocarditis 5' nékódující oblast) (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T. R., a Moss, B. (1989) PNAS USA 86, strana 6126 až 6130);
vedoucí sekvence Potyvirů, například vedoucí sekvence viru leptané mozaiky tabáku (TEV, Tobacco etch virus), (Allison a další, (1986); vedoucí sekvence viru zakrslé mozaiky kukuřice (MDMV, Maize dwarf mosaic virus);
Virology 154, strana 9 až 20 a lidský protein vážící se na těžké řetězce imunoglobulinů (BiP) (Macejak, D. G., a Sarnow, P., (1991) Nátuře 353, strana 90 až 94;
nepřekládaná vedoucí sekvence z mRNA kódující obalový protein viru mozaiky vojtěšky (AMV RNA 4, Alfa-alfa mosaic virus), (Jobling, S. A., a Gehrke, L., (1987)
Nátuře 325, strana 622 až 625;
vedoucí sekvence viru tabákové mozaiky (TMV, Tobacco mosaic virus), (Gallie, D. R., a další, (1989) Molecular Biology of RNA, strana 237 až 256; a vedoucí sekvence viru chlorotické mozaiky kukuřice (MCMV, Maize chlorotic mosaic virus), (Lommel, S. A., a další, (1991) Virology 81, strana 382 až 385; a také Della-Cioppa a další, (1987) Plant Physiology 84, strana 965 až 968.
V expresivní kazetě mohou být použity i rostlinné terminátory transkripce; viz Rosenberg a další, (1987) Gene 56, strana 125; Guerineau a další, (1991), Mol. Gen. Genet. 226, strana 141 až 144; Proufoot a další, (1991) Cell 64, strana 671 až 674; Sanfacon a další, (1991) Genes Dev. 5, strana 141 až 149; Mogen a další, (1990) Plant Cell 2, strana 1261 až 1272; Munroe a další, (1990) Gene 91, strana 151 až 158; Ballas a další, (1989) Nucleic Acids Research 17, strana 7891 až 7903; Joshi a další, (1987) Nucleic Acids Research 15, strana 9627 až 9639.
Pro zajištění tkáňově specifické exprese mohou být nukleotidové sekvence podle vynálezu operativně spojeny se tkáňově specifickými promotory; viz například US WO 93/07278 a zde citované práce.
Vynález se dále týká transgenních rostlin, zvláště pak transgenních fertilních rostlin transformovaných výše zmíněnými postupy a jejich potomstva vzniklého sexuální a/nebo asexuální cestou, které trvale obsahuje molekulu DNA kódující monoklonální protilátku nebo hybridní molekulu toxinu podle vynálezu. Dospělé rostliny vypěstované z transformovaného rostlinného materiálu podle vynálezu jsou buď příbuzensky nebo nepříbuzensky kříženy za účelem produkce semen.
Transgenními rostlinami podle vynálezu mohou být buď dvouděložné nebo jednoděložné rostliny.Výhodnější jsou jednoděložné rostliny čeledi Graminaceae zahrnující rostliny Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
Zvláště výhodné jsou pak transgenní kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves a rýže.
Z dvouděložných rostlin jsou nejvýhodnější sója, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka a slunečnice.
Termín potomstvo zahrnuje potomstvo transgenních rostlin vzniklé z mateřské rostliny buď sexuální nebo asexuální cestou. Tato definice rovněž zahrnuje všechny mutanty a nej různější varianty rostlin, které mohou vzniknout použitím známých způsobů jako například buněčnou fúzí nebo selekcí mutantů a které stále vykazují charakteristické vlastnosti původní transformované rostliny. Tato definice rovněž zahrnuje všechny produkty vzniklé křížením a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.
Vynález se dále týká materiálu sloužícího k rozmnožování transgenních rostlin.
Materiál sloužící k rozmnožování transgenních rostlin je podle vynálezu definován jako jakýkoliv rostlinný materiál, který může být množen sexuálně nebo asexuálně in vitro nebo in vivo. Zvláště výhodné jsou podle vynálezu protoplasty, buňky, kalusy, tkáně, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, hlízy, suché plody a dužnaté
-23plody spolu s dalším materiálem sloužícím k rozmnožováni získaným z transgenních rostlin.
Vynález se dále týká částí rostlin jako například květů, stonků, plodů, listů a kořenů, které pocházejí z transgenních rostlin nebo jejich potomstva transformovaných pomocí způsobů podle vynálezu a skládajících se tedy (alespoň částečně) z transgenních buněk.
Ještě před tím než je materiál sloužící k rozmnožování rostlin (dužnaté plody, hlízy, suché plody, semena) prodán jako komerční produkt, je tento materiál obvykle ošetřen herbicidy, pesticidy, fungicidy, prostředky na hubení měkkýšů baktericidy, nematocidy, nebo směsí připravenou z některých z těchto preparátů, které vytvoří na jeho povrchu ochrannou vrstvu. Spolu s výše uvedenými látkami jsou v současnosti obvykle na materiál sloužící k rozmnožování rostlin aplikovány ještě různé nosiče, povrchově aktivní látky nebo adjuvans usnadňující aplikaci výše uvedených látek. Cílem popsaného ošetření materiálu sloužícího k rozmnožování rostlin je ochrana tohoto materiálu před možným poškozením způsobeným bakteriemi, houbami nebo živočišnými škůdci.
Ochranná vrstva může být za účelem ošetření semen aplikována na tyto semena buď impregnací hlíz a suchých plodů kapalnými směsmi nebo nanesením suchých nebo mokrých směsí na povrch těchto hlíz nebo suchých plodů. Ve zvláštních případech můžou být k aplikaci zmíněných směsí na rostliny použity ještě jiné způsoby, například aplikace namířená na pupeny nebo na dužnaté plody.
Rostlinné semeno podle vynálezu, které nese sekvenci DNA kódující monoklonální protilátku nebo hybridní molekulu
-24toxinu podle vynálezu, může být ošetřeno ochranným prostředkem vytvářejícím na semenu ochrannou vrstvu. Mezi zmíněné ochranné prostředky patří například kaptan, karboxin, thiram (TMTD®) , methalaxyl (Apron®) a pirimiphos-methyí (Actellic®) a jiné látky, které jsou běžně používány k ošetřování semen.
Hybridní molekuly toxinů podle vynálezu mohou být použity k ochraně zemědělské produkce před nejrůznějšími škůdci. Jinou možností je zavedení genu kódujícího hybridní molekulu toxínu prostřednictvím vhodného vektoru do mikrobiálního hostitele a zmíněný hostitel může být následně vysazen do okolního prostředí, na rostliny nebo živočichy. Je možné vybrat mikrobiální hostitele, kteří žijí v určité fytosféře (fyloplanu, fylosféře, rhizoplanu a/nebo rhizosféře) jedné nebo více rostlinných odrůd. Tyto mikroorganismy jsou vybrány tak, aby byly schopny v daném prostředí úspěšně soutěžit s mikroorganismy přirozeně se vyskytujícími v tomto prostředí. Tímto by mělo být zaručena stabilní exprese genu kódujícího polypeptidový pesticid a účinější ochrana pesticidu před degradací nebo inaktivací v okolním prostředí.
Mezi takové organismy patří bakterie, řasy a houby. Zvláště výhodné jsou mikroorganismy jako například bakterie, například Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, a zvláště pak kvasinky jako například Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvláště výhodné jsou bakteriální druhy žijící ve fylosféře jako například Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia
-25marcescens, Acetobacter
Rhodopseudomonas spheroides, xylinum, Agrobacteria,
Xhanthomonas campestris,
Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii a druhy kvasinek žijící ve fytosféře jako například Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii,
Saccharomyces rosei, S. Sporobolomyces rosues, S. Aureobasidium pollulans.
pretoriensis, S. cerevisiae, odorus, Kluyveromyces veronae a Zvláště výhodné jsou izolovaný gen vynálezu může fotosyntetizuj ící mikroorganismy.
Užitečnost genů kódujících hybridní molekuly toxinů přítomných v rekombinantních kmenech mikroorganismů je ilustrována na Příkladu 7. Mělo by být rovněž zřejmé, že kódující hybridní molekulu toxinu podle být přenesen do organismu jakéhokoliv mikrobiálního hostitele a že propůjčuje těmto hostitelům, své insekticidní vlastnosti. Alternativní hostitel do něhož je přenesem gen kódující hybridní molekulu toxinu podle vynálezu může být vybrán, jestiže je, za účelem zvýšení jeho efektivity, přístupný pro klonování, pro charakterizaci formy a funkce genu nebo proteinu kódovaného tímto genem, pro použití jako produkční hostitel ke zvýšení výtěžku hybridní molekuly toxinu, pro efektivnější přenos alespoň jedné hybridní molekuly toxinu do organismu hmyzího škůdce proti kterému je tato molekula namířena nebo pro zavedení genu kódujícího hybridní molekulu toxinu do patogenů hmyzu, jakými jsou například bakuloviry (jaderné polyhedrální viry například (Autographica californica)).
Geny nebo jejich rekombinantní formy kódující hybridní molekulu toxinu mohou být do takového alternativního hostitele přeneseny pomocí v současnosti způsobů. Jedním z výhodných postupů je dobře známých elektroporace
-26mikrobiálních buněk popsaná například v Dower (U. S. Patent No. 5,186,800). Jiným výhodným způsobem je způsob popsaný v Schurter a další, ( Mol. Gen. Genet. 218, strana 177 až 181 (1989)). Tento způsob je rovněž popsán v EP-A 0 342 633.
Je zřejmé, že zmíněný alternativní hostitel by měl být následně vysazen do okolního prostředí, na rostliny nebo živočichy za účelem regulace populací hmyzu. Je možné vybrat mikrobiální hostitele, kteří žijí v určité fytosféře (fyloplanu, fylosféře, rhizoplanu a/nebo rhizosféře) jedné nebo více rostlinných odrůd. Tyto mikroorganismy jsou vybrány tak, aby byly schopny v daném prostředí úspěšně soutěžit s mikroorganismy přirozeně se vyskytujícími v tomto prostředí. Tímto by mělo být zaručena stabilní exprese genu kódujícího polypeptidový pesticid a účinejší ochrana pesticidu před degradací nebo inaktivací v okolním prostředí.
Vynález dále popisuje insekticidní kompozice, jejichž aktivní složkou je alespoň jedna hybridní molekula toxinu podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus nesoucí alespoň jeden z genů kódujících rekombinantní molekulu toxinu. Spolu s těmito aktivními složkami jsou ve zmíněné insekticidní kompozici přítomny adjuvans jako například nosič, rozpouštědlo, povrchově aktivní látka nebo adjuvans usnadňující aplikaci výše uvedených látek. Kompozice může rovněž obsahovat i jiné biologicky aktivní sloučeniny. Zmíněné sloučeniny mohou být buď fertilizéry, zdroje živin nebo jiné látky ovlivňující růst rostlin. Mohou to být rovněž herbicidy, pesticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, prostředky na hubení měkkýšů nebo směsi připravené z některých z těchto sloučenin. Spolu s těmito sloučeninami můžeme dále aplikovat nosiče přijatelné v zemědělství, povrchově aktivní látky nebo adjuvans usnadňující aplikaci výše uvedených látek, které jsou využívány pří tvorbě směsí.
~Υ1·
Vhodné nosiče a adjuvans mohou být buď v pevné nebo kapalné formě a jsou totožné s látkami běžně používanými v postupech pro přípravu směsí jako například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, zvlhčovadla, látky způsobující lepivost, pojívá nebo fertilizéry.
Kompozice mohou obsahovat aktivní složku v množství 0,1 až 99% z celkové hmotnosti, kapalné nebo pevné adjuvans v množství 1 až 99% z celkové hmotnosti a povrchově aktivní látku v množství 0 až 25% z celkové hmotnosti. Aktivní složka, která se skládá z alespoň jedné hybridní molekuly toxinu podle vynálezu nebo rekombinantního mikroorganismu nesoucího jeden z genů kódujících rekombinantní molekulu toxinu nebo kompozice obsahující zmíněnou aktivní složku, může být aplikována na rostliny nebo na plodiny, které mají být chráněny, spolu s jinými insekticidy nebo chemickými látkami (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canada), aniž dojde ke ztrátě aktivity zmíněné aktivní složky. Tato aktivní složka může být aplikována ve formě prášku, suspenze, smáčivého prášku nebo v jakékoliv jiné formě použitelné v zemědělství.
Vynález dále popisuje způsoby sloužící k regulaci počtu hmyzích škůdců nebo k jejich hubení prostřednictvím aplikace aktivní složky, která se skládá z alespoň jedné hybridní molekuly toxinu podle vynálezu nebo rekombinantního mikroorganismu nesoucího jeden z genů kódujících rekombinantní molekulu toxinu nebo kompozice obsahující zmíněnou aktivní složku. Tato aktivní složka je aplikována (a) do prostředí ve kterém by mohlo dojít k výskytu hmyzího škůdce, (b) na rostlinu nebo na část rostliny za účelem ochrany zmíněné rostliny nebo její části před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem nebo (c) na semena rostlin za
-28účelem ochrany rostliny, která vyroste ze zmíněného semene, před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem.
Výhodnými způsoby při aplikaci látky v oblasti, kde požadujeme ochranu rostlin, je aplikace látky na listoví rostlin. Počet a frekvence aplikací závisí na druhu rostliny, kterou ochraňujeme, a na rozsahu zamoření dané oblasti příslušným škůdcem. Aktivní složka může nicméně pronikat do organizmu rostlin i přes kořeny (systemický účinek) a to, jestliže místo kde rostlina roste je prosyceno kapalnou směsí nebo jestliže je do tohoto místa (například do půdy) aktivní složka inkorporována v pevné formě, například ve formě granulí (půdní aplikace). V případě rýže rostoucí na zavodněných rýžových polích mohou být tyto granule aplikovány v odměřeném množství.
Kompozice podle vynálezu jsou rovněž vhodné k ochraně materiálu sloužícího k rozmnožování rostlin, například semen jako například dužnatých plodů, hlíz nebo suchých plodů nebo řízků rostlin před hmyzími škůdci. Materiál sloužící k rozmnožování rostlin může být před výsadbou ošetřen pomocí zmíněných kompozic: semena mohou být například ošetřena před vlastní setbou. Aktivní složka podle vynálezu může může být rovněž aplikována na suché plody a to buď impregnací těchto suchých plodů kapalnou směsí nebo mohou být tyto plody obaleny směsí v pevné formě. Směs může být rovněž aplikována do místa kde je materiál sloužící k rozmnožování rostlin vyséván, například do brázd během setby. Vynález rovněž popisuje způsoby ošetření materiálu sloužícího k rozmnožování rostlin a rovněž zmíněného materiálu sloužícího k rozmnožování rostlin.
Kompozice podle vynálezu obsahující jako aktivní složku rekombinantní mikroorganismus nesoucí alespoň jeden z genů
-29kódujících rekombinantní molekulu toxinu mohou být aplikovány pomocí způsobů sloužících k ošetření semen nebo půdy prostřednictvím bakteriálních kmenů; viz například americký patent 4,863,866. Použití těchto bakteriálních kmenů je efektivní, i když nejsou tyto mikroorganismy živé. Výhodnější je nicméně aplikace živých organismů.
Mezi plodiny, pro které je vhodný systém ochrany popsaný v tomto vynálezu, patří například následující rostlinné druhy:
obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepa (cukrová řepa a krmná řepa), pícniny (Dactylis, kostřava a obdobné plodiny), peckovice, malvice a dužnaté ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny a ostružiny), luštěniny (fazole, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka olejka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosové ořechy, rostliny produkuje! ricínový olej, kakaové boby, podzemnice), plodovány (okurka, dýně, melouny), textilní rostliny (bavlna, len, konopí, juta), citrusy (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, hlávkový salát, chřest, zelí a další rostliny náležející do čeledi Brassicae, cibule, rajská jablka, brambory, paprika), rostliny náležející do čeledi Lauraceae (avokádo, mrkev, skořice, kafr), jehličnany a listnaté stromy (např. lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako například kukuřice, tabák, ořechy, kávovník, cukrová třtina, čajovník, vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník a rovněž i okrasné rostliny (včetně složnokvětých).
Rekombinantní mikroorganismy nesoucí alespoň jeden z genů kódujících rekombinantní molekulu toxinu jsou obvykle aplikovány ve formě insekticidních kompozic a mohou být na
-30rostlinnou produkci nebo na rostliny aplikovány spolu s nebo před nebo po aplikaci dalších biologicky aktivních sloučenin. Zmíněné sloučeniny mohou být buď fertilizéry, zdroje živin nebo jiné látky ovlivňující růst rostlin. Mohou to být rovněž herbicidy, pesticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, prostředky na hubení měkkýšů nebo směsi připravené z některé z těchto sloučenin. Spolu s těmito preparáty můžeme dále aplikovat nosiče, povrchově aktivní látky nebo adjuvans usnadňující aplikaci výše uvedených látek, které jsou využívány při tvorbě směsí.
Aktivní složka podle vynálezu může být použita samostatně (nikterak modifikována) nebo spolu s vhodným nosičem přijatelným pro použití v zemědělství. Takové nosiče jsou adjuvans používané běžně v zemědělství při přípravě různých směsí a jsou tedy známým způsobem míchány do formy emulzifikovaných koncentrátů, pasty, kterou je možné opatřit povlakem, stříkatelných roztoků nebo roztoků přístupných dalšímu ředění, zředěných emulzí, smáčivých prášků, rozpustných prášků, poprašků, zrněných materiálů a také látek zapouzdřených v pouzdru z polymerních sloučenin. Tak jako povaha kompozic rovněž i způsoby jejich aplikace jako rozprašování, práškování, jsou vybírány v souladu cílem například rozstřikování, rozptylování nebo polévání, a převažujícími množství aplikace podmínkami. Vhodné aplikované aktivní látky (a.i.) se obvykle nachází v rozmezí od 50 g do přibližně 5 kg'na hektar výhodněji pak v rozmezí od 100 g do 2 kg aktivní látky/ha. Významné jsou aplikace u nichž se množství aplikované aktivní látky pohybuje mezi 200 g a 1 kg a.i./ha a 200 g a 500 g a.i./ha.
Pro ošetření pohybuje v rozmezí semen se vhodné množství aktivní látky od 0,5 g do 1000 g a.i./100 kg semen,
-31výhodněji pak v intervalu od 3 g do 100 g a.i./100 kg semen nebo v intervalu od 10 g do 50 g a.i./100 kg semen.
zvlhčovadla, fertilizéry.
Vhodné nosiče a adjuvans mohou být buď pevné nebo kapalné a jsou totožné s látkami běžně používanými v postupech pro přípravu směsí jako například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, látky způsobující lepivost, pojidla nebo
Kompozice, tzn. insekticidní kompozice, přípravky nebo směsi obsahující jako aktivní složku rekombinantní mikroorganismus nesoucí rekombinantní gen nebo tento mikroorganismus v kombinaci s jinými aktivními složkami, a je-li to vhodné, obsahující rovněž pevné nebo kapalné adjuvans. Tyto kompozice jsou připravovány pomocí známých postupů, například mícháním a/nebo mletím aktivních složek s přísadami, například rozpuštědly, pevnými nosiči a v některých případech i povrchově aktivními látkami.
Vhodnými rozpouštědly jsou: aromatické uhlovodíky, zvláště pak frakce obsahující 8 až 12 atomů uhlíku, například směsi xylenu nebo substituované naftaleny, ftaláty jako například dibutylester kyseliny ftalové nebo dioktylester kyseliny ftalové, alifatické uhlovodíky jako například cyklohexan nebo parafiny, alkoholy a giykoly a jejich estery a ethery jako například ethanol, monomethyl nebo monoethyl estery ethylenglykolu, ketony jako například cyklohexanon, silně polární rozpouštědla jako například N-methyl-2pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid a rovněž i rostlinné oleje nebo epoxidizované rostlinné oleje jako například epoxidizovaný kokosový olej nebo sojový olej; nebo voda.
Jako pevné nosiče používané například k přípravě směsí ve formě prášku nebo dispergovatelného prášku, jsou obvykle
-32využívány přírodní anorganické plniče jako například kalcit, slída, kaolin, montmorilonit nebo attapulgit. Ke zlepšení fyzikálních vlastností je také možné přidat dispergovanou orthokřemičitou kyselinu nebo dispergované absorbující polymery. Vhodnými adsorbujícími nosiči ve tvaru granulí jsou pórovité materiály jako například pemza, rozbité cihly, sepiolit nebo bentonit; a vhodné neadsorbující nosiče jsou materiály jako například kalcit nebo písek. Dále pak může být použito velké množství nej různějšího materiálu organického nebo anorganického původu například dolomit nebo rozdrcené rostlinné zbytky, předem upraveného do formy granulí.
V závislosti na povaze aktivní složky přidávané do kompozice patří mezi vhodné povrchově aktivní látky neiontové, kationtové a/nebo aniontové povrchově aktivní látky, které mají dobré emulzifikační, dispergační a zvlhčující vlastnosti. Termín povrchově aktivní látka rovněž označuje i směs povrchově aktivních látek. Vhodnými aniontovými povrchově aktivními látkami mohou být ve vodě rozpustná mýdla a ve vodě rozpustné povrchově aktivní látky. Vhodnými mýdly jsou soli vyšších mastných kyselin (s počtem atomů uhlíku 10 až 22) s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin nebo substituované či nesubstituované amonné soli vyšších mastných kyselin, například sodná nebo draselná sůl kyseliny olejové nebo stearové, nebo přírodní směsi mastných kyselin získaných například z kokosového oleje nebo z loje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními látkami jsou rovněž soli mastných kyselin s methyltaurinem a rovněž i modifikované nebo nemodifikované fosfoiipidy.
Daleko častěji jsou nicméně používány takzvané syntetické povrchově aktivní látky, zvláště sulfonáty mastných kyselin, sulfáty mastných kyselin, sulfonované benzimidazolové deriváty nebo alkylarylsulfonáty. Alifatické
-33sulfonáty nebo sulfáty jsou obvykle připravovány ve formě solí s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin nebo ve formě substituovaných či nesubstituovaných amonných solí a obvykle obsahují alkylové zbytky s počtem 8 až 22 uhlíkových atomů mezi něž také patří alkylové řetězce acylových zbytků například sodná nebo draselná sůl kyseliny lignosulfonové, sodná nebo draselná sůl dodecylsulfátu nebo sodná nebo draselná sůl směsi esterů kyseliny sírové s alifatickými alkoholy získanými z přírodních mastných kyselin. Mezi tyto sloučeniny patří rovněž soli esterů kyseliny sírové s alifatickými alkoholy nebo s adukty ethylenoxidu nebo soli esterů sulfonové kyseliny s alifatickými alkoholy nebo s adukty ethylenoxidu. Sulfonované deriváty benzamidazolu výhodně obsahují 2 skupiny sulfonové kyseliny a jeden zbytek mastné kyseliny obsahující 8 až 22 uhlíkových atomů. Jako příklad alkylarylsulfonátů můžou sloužit sodné, vápennaté nebo triethanolaminové soli dodecylbenzensulfonové kyseliny, dibutylnaftalensulfonové kyseliny nebo soli kondenzačního produktu naftalensulfonové kyseliny a formaldehydu. Vhodné jsou rovněž odpovídající fosfáty, například soli esterů kyseliny fosforečné s aduktem p-nonylfenolu se 4 až 14 moly ethylen oxidu.
Mezi neiontové povrchově aktivní látky řadíme především deriváty polygkykoletheru s alifatickými nebo cykloalifatickými alkoholy, nebo nasycenými či nenasycenými mastnými kyselinami a alkylfenoly; zmíněné deriváty obsahují 3 až 30 etherových skupin polyglykolu a 8 až 20 uhlíkových atomů v (alifatickém) uhlovodíkovém řetězci a 6 až 18 uhlíkových atomů v alkylovém zbytku u alkylfenolů.
Dalšími vhodnými neiontovými povrchově aktivními látkami jsou ve vodě rozpustné adukty polyethylenoxidu s polypropylenglykolem, ethylendiaminopolypropylenglykolem a
-34alkylpropylenglykolem obsahujícím v alkylovém řetězci 1 až 10 uhlíkových atomů, přičemž adukt obsahuje 20 až 250 etherových skupin ethylenglykolu a 10 až 100 etherových skupin propylenglykolu. Tyto sloučeniny obvykle obsahují 1 až 5 jednotek ethylenglykolu na jednu jednotku propylenglykolu. Reprezentativními příklady neiontových povrchově aktivních látek jsou nonylfenolpolyethoxyethanoly, polyglykolethery ricinového oleje, adukty polypropylenu a polyethylenoxidu, tributylfenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglykol a oktylfenoxypolyethoxyethanol. Estery mastných kyselin a sorbitanu polyoxyethylenu jako například trioleát sorbitanu polyoxyethylenu, jsou rovněž vhodnými povrchově aktivními látkami.
Výhodnými kationtovými povrchově aktivními látkami jsou kvarterní amoniové soli, které jako substituent na dusíku obsahují alespoň jeden alkylový zbytek skládující se z 8 až 22 atomů uhlíku, a jako další substituenty pak nižší nesubstituované nebo halogenované alkylové zbytky, benzylové zbytky nebo nižší hydroxylované alkylové zbytky. Zmíněné soli jsou nejlépe ve formě halidů, methylsulfátů nebo ethylsulfátů, například stearyltrimethylamonium chlorid nebo benzyldi-(2-chloroethyl)ethylamonium bromid.
Povrchově aktivní látky obvykle používané při přípravě kompozic jsou popsány například v McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp. Ridgewood, N.
J., 1979; Helmut Stache, Tensid Taschenbuch (Handbook of Surfactants) , Carl Hanser Verlag, Munich/Vienna.
Dalším výhodným rysem insekticidní kompozice podle vynálezu je persistence aktivní složky po aplikaci na rostliny a do půdy. Možnými příčinami snižování aktivity jsou ultrafialové záření, tepelná inaktivace, inaktivace
35rostlinnými ochrannými látkami uvolňovanými na povrch listu a inaktivace změnou pH. V insekticidni kompozici podle vynálezu je inaktivaci zabráněno buď vhodnými aditivy, která mohou prodloužit životnost aktivní složky, nebo zapouzdřením kompozice takovým způsobem, který ji ochrání před inaktivaci. Takovéto zapouzdření může být provedeno chemickou cestou (viz McGuire a Sasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425 až 1433, 1992) nebo biologickým způsobem (viz Barnes a Cummings, 1986, EP-A, 0 192 319). Chemickým zapouzdřením se rozumí proces, při němž je aktivní složka potažena polymerním materiálem, zatímco biologickým zapouzdřením se rozumí exprese hybridních toxinových genů v mikroorganismech. V biologicky zapouzdřeném přípravku je jako aktivní složky použito intaktního mikroorganismu, který obsahuje hybridní gen toxinového proteinu. Přídavek látek, které chrání před UV zářením může výrazně redukovat radiační poškození aktivní složky. Rovněž tak i tepelná inaktivace může být zmírněna přídavkem vhodných aditiv.
Výhodné formulace podle vynálezu obsahují jakožto aktivní složku živé mikroorganismy a to buď ve formě vegetativních buněk, anebo výhodně ve formě spor, je-li to možné. Vhodné formulace mohou sestávat například z polymerního gelu, který je zesíťován pomocí polyvalentních kationtů, a který obsahuje tyto mikroorganismy (viz například D.R. Fravel a další, Phytopathology, svazek 75, č. 7, strana 774 až 777, 1985, v této práci je jako polymerní materiál použit alginát). Tato publikace rovněž popisuje použití nosných materiálů (carriers) . Obecně lze kompozice podle vynálezu připravit smíšením roztoku přirozeného nebo syntetického polymeru (například alginátů) s vodným roztokem soli polyvalentního kovového iontu za vzniku malých individuálních kapiček. Mikroorganismy je možné suspendovat
-36v jednom nebo v obou reakčních roztocích. Formování gelu začíná míšením ve formě kapiček. Je možné rovněž následné sušení gelových partikulí. Tento proces se nazývá ionotropické zgelovatění. V závislosti na stupni vysušení se formují kompaktní a tuhé částice polymeru, které jsou strukturně zesíťované polyvalentními kationty a obsahují rovnoměrně distribuované mikroorganismy a nosný materiál. Velikost těchto částic může být až 5 mm.
V dokumentu EP-A1-0 0957 571 jsou popsány kompozice založené na částečně zesíťených polysacharidech , které kromě mikroorganismů obsahují například jemně mletou kyselinu křemičitou jakožto nosný materiál a vápenaté ionty jako zesíťovací činidlo. V těchto kompozicích není aktivita vody vyšší než 0,3. W.J. Cormick a další popisují v souhrném článku (New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases,Nové směry biologické kontroly: Alternativy boje se škůdci a chorobami v zemědělství, strany 345 až 372, nakladatelství Alan R. Liss, 1990) různé systémy, granules vermikulitem jakožto nosičem a kompaktní alginátové kuličky připravené výše popsaným způsobem ionotropního zgelovatění. Takové kompozice popisuje rovněž D.R. Fravel v Formulations and application systems, Vzorce a aplikační systémy, svazek 11, ASTM STP 1112, Americká společnost pro testování a materiály, Philadelphia, 1992, strany 173 a 179) . Tyto kompozice mohou být také použity s rekombinantním mikroorganismem podle vynálezu.
Insekticidní kompozice podle vynálezu obvykle obshují 0,1 % až 99 % aktivní složky, výhodně 0,1 % až přibližně 95 % a nejvýhodněji 3% až 90 % aktivní složky, dále pak 1 % až 99,9 % pevného nebo kapalného adjuvans, výhodně 1 % až přibližně 99 % a nejvýhodněji 5 % až přibližně 95 % adjuvans
-37a nakonec 0 % až 25 % povrchově aktivní látky (surfaktantu), výhodně 0,1 % až 25 % a nej výhodněji 0,1 až přibližně 20 % povrchově aktivní látky.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahují insekticidní kompozice 0,1 až 99,9 % rekombinantního mikroorganismu, výhodně pak 0,1 až 95 % tohoto mikroorganismu, který obshuje alespoň jeden nový rekombinantní gen, nebo obsahují kombinaci těchto mikroorganismů s dalšími aktivními složkami, 1 až 99, 9% pevného nebo kapalného adjuvans a 0 až 2 5 %, výhodně 0,1 % až 20 % povrchově aktivní látky.
Zatímco komerční produkty jsou většinou ve formě koncentrátů koncový uživatel bude většinou používat prostředku v podstatně nižším ředění, Insekticidní kompozice mohou rovněž obsahovat další složky, jako jsou například stabilizátory, činidla potlačující pěnění, regulátory viskozity, pojivá, prostředky ke zlepšení konfekční lepivosti, hnojivá nebo další aktivní složky sloužící k dosažení požadovaných vlastností.
Existuje mnoho způsobů introdukce genu exprimujícího hybridní toxin do cílového mikroorganismu za podmínek, které umožní stabilitu a expresi genu. Například mohou být vytvořeny expresní kazety, které obsahují požadované DNA konstrukty operativně navázané na transkripční a translační regulační signály pro expresi těchto konstruktů. Dále pak tyto kazety obsahují sekvenci DNA, která je homologní se sekvencí hostitelského organismu a zajistí tak integraci celého konstruktu. Popřípadě mohou takovéto konstrukty obsahovat replikační systémy funkční pro hostitelský organismus, které zajistí stabilitu a udržení konstruktu v hostiteli.
-38Transkripční a. translační regulační signály zahrnují například promotory, místo iniciace transkripce, operátory, aktivátory, enhancery, jiné regulační elementy, místa pro vazbu ribosomů, iniciační kodon, terminační signály a podobně, přičemž výše uvedený výčet není nikterak omezující. Viz například: americké patenty č. 5,039,523, č. 4,853,331; EPO 0480762A2, Sambrook a další (viz výše), Molecular Cloning-Laboratory Manual, Maniatis a další, Cold Spring Harbor Lab., New York, 1980.
Vynález bude dále popsán v následujících příkladech, které však nejsou nikterak omezující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava monoklonálních protilátek
Imunizace
Vhodná množství antigenu (přibližně 50 μg membránových vezikulů kartáčového lemu WCRW) se suspendují v neolejovém adjuvans a použijí se k imunizaci skupiny myší BALB/c. Obnovovací injekce (booster) je myším podávána každý druhý týden. Sedm dní po třetí onovovací dávce jsou myším odebrány vzorky séra a pomocí ELISA testu je stanoven relativní titr protilátek v séru, viz níže. Vybraným čtyřem myším s nej vyšším titrem jsou v průběhu tří dní podány závěrečné obnovovací injekce s nízkým obsahem antigenu (přibližně s jednou desetinou dávky použité pro imunizaci). Slezinné buňky těchto myší jsou poté použity k k fúzi, viz níže.
-39Fúze
Pro dvě fúze byly vybrány čtyři myši s titrem specifických protilátek vyšším než 1:5.000. V aseptických podmínkách byly vyjmuty sleziny. Sleziny byly poté mechanicky homogenizovány a byly z nich následujícím způsobem izolovány lymfocyty. Červené krvinky byly odstraněny inkubací v 0,155 M roztoku chloridu amonného v 0,017 M bázi TRIZMA, pH 7,2 (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo) . Buňky byly dvakrát promyty PBS pufrem a lymfocyty byly dále přečištěny centrifugací v hustotním gradientu, viz dále. Buňky byly opatrně navrstveny na roztok Ficollu (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo) o specifické hustotě 1,065 (Van Mourik a další, Meth. in Enzymology, 121, strana 174 až 182, (1996) . Centrifugace probíhala 20 minut při 450 x g. Peleta obsahující buňky s vyšší specifickou hustotou než 1,065 je velmi bohatá na lymfocyty. Tato peleta byla použita pro fúzi s myeloidními buňkami.
Při fúzí pomocí polyethylen glykolu bylo použito izolovaných lymfocytů a HPGRT (hypoxanthín-guaninfosforibosyl transferáza) deficientní plasmacytomové buněčné linie SP2/0, odvozené od myší linie BALB/c. Lymfocyty byly smíšeny s myeloidními buňkami v poměru 4:1. Směs buněk byla důkladně promíchána, zcentrifugována a poté byla následujícím způsobem provedena buněčná fúze (viz Oi a další, Selected Meth. ,ín Cellular Immunology, editoři Michell, B.B., a Shiigi, S.M., Freeman San Francisco, strna 351 až 371, (1980), Fazekas a další, J. Immunol. Meth., 35, strana 1 až 21, (1980)). Buněčná peleta byla opatrně suspendována v 1 ml 50% polyethylen glykolu (PEG) za stálého míchání po dobu jedné minuty. Koncentrace PEG byla pozvolně snižována přídavkem bezsérového RPMI media (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Po fúzi byly zfázované buňky peletovány centrifugací při
-4080 x g po dobu 5 minut, resuspendovány a umístěny na 96 jamkové mikrotitrační desky tak, aby na jednu jamku připadlo celkem asi 105 až 10s buněk. Slezinné buňky určené jako podpůrné (feeder) byly připraveny tak, že slezinné buňky neimunizovaných myší byly ošetřeny 20 μρ/ιηΐ mitomycinu C. Tyto buňky byly poté přidány do kultivačních jamek, aby produkovaly pomocné růstové faktory. V několika následujících dnech probíhala selekce na mediu HAT aminopterin-thymidin) s obsahem 17,6 μρ/ml
Rostoucí kolonie byly v inverzním mikroskopu patrné již 3. až 4. den po fúzi. Makroskopické kolonie byly však viditelné až po 10 či 14 dnech po fúzi. V této fázi byly supernatanty jednotlivých jamek testovány na protilátek.
(hypoxanthinaminopterinu.
produkci specifických
Výběr hybridomů
Nejprve se detekují kolonie, které přežily selekci pomocí HAT media. Supernatanty z těchto koloniíse testují pomocí ELISA (imunosorbční enzymatická detekční technika, viz Engvall, Meth. Enzymology 70, strana 419, (1980), Engvall a další, Immunochemistry 8, strana 871, (1971). Supernatanty hybridomů byly kultivovány na mikrotitračních deskách s 96 jamkami. Jamky byly předem potaženy zhruba 500 ng antigenu na jednu jamku. Po příslušném promytí (viz Engvall a další) byly navázané protilátky detekovány sekundární kozí-anti-myší protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRPhorseradish peroxidase). Po dalším důkladném promytí byla za pomoci chromogenního substrátu vyhodnocena enzymatická aktivita v jednotlivých jamkách. Pozitivní kolonie byly určeny z výsledné absorbance při vlnové délce 492 nm. Absorbance byly stanoveny pomocí automatického ELISA-readeru. Hybridomatické linie s vysokou vazebnou afinitou k membránovým vezikulům kartáčového lemu WCRW byly dále
-41testovány v dalších třech testech ELISA, aby se eliminovaly takové klony, které jsou schopny vazby i na lidské nebo savčí proteiny. Konkrétně byly provedeny testy s deskami potaženými membránovými vezikuly králičího kartáčového lemu a přípravky z mikrosomálních membrán z listu a kořene kukuřice. Rovněž byla provedena ELISA zaměřená na identif ikaybiridomů, které vykazují křížovou reaktivitu s membránovými vezikuly zavíječe kukuřičného (Ostrinjraibilalis, European corn borer, ECB).
Hybridomatické kolonie sekretující protilátky specifické k antigenu (membránovým vezikulům kartáčového lemu WCRW) a přitom nejsou schopné vazby na savčí nebo rostlinné proteiny byly klonovány níže popsaným způsobem.
Klonování
V této fázi byly klonovány hybridomy sekretující protilátky se zjevnou specifitou pro antigen. Hybridomy byly expandovány a klonovány při koncentracích 0,5, 1 a 5 buněk na jamku. Hybridomům bylýc urychlení růstu do kultivačního media přidávány růstové faktory (Sugasawara a další, J. Immunol. Meth. 79, strana 276 až 275 (1985)) . Po dvou až třech týdnech, když kolonie dorostly do dostatečné velikosti, byly pozitivní klony opět testovány ELISA testem viz výše. Reprezentativní Hony byly poté expandovány a určeny pro produkci protilátek.
Produkce ascitických tekutin
Velkoobjemová produkce monoklonálních protilátek bylo dosaženo použitím hybridomů rostoucích jako ascitické tumory v myších BALB/c (Brodeur a další, J. Immunol. Meth. 71, strana 265 až 272, (1984)), kterým byl tumor indukován přistáném. Ascitické tekutiny byly shromážděny a protilátky
-42byly částečně purifikovány z dialyzovaných ascitů pomocí chromatografie na koloně s proteinem A. Výsledné protilátky byly rozděleny na alikvoty a poté zmraženy.
Buněčné linie produkující protilátky podle vynálezu jsou popsány v tabulce 1. Hybridomatické buněčné linie u nichž je v tabulce 1 uvedeno jejich přístupové číslo ATCC byly uloženy 19. dubna 1994 v Americké sbírce typových kultur, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.
Hybridomatické buněčné linie proti BBMV WCRW
Buněčná linie Křížová reakce se zavíječem Western blot Izotyp číslo u ATCC
1A4 ano 2 WCRW pruhy IgM-k
1A11 ne 2 WCRW pruhy IgM-k
1F51 ano 2 WCRW pruhy IgM-k
2B5 ano 2 WCRW pruhy IgM-k HB 11691
3B1 ne 1 WCRW pruh IgGl-k HB 11617
17G6 ne > 5 pruhů IgM-k
10A1 ne žádný signál IgM-k
10B6 ne > 5 pruhů C IgG3-K HB 11618
10F9 ne > 5 pruhů B IgM-k
12G4 ne neprovedeno IgM-k
14G1 ne > 5 pruhů IgG2B-k
17 F6 ne > 5 pruhů A IgGl-k HB 11620
17H6 ne > 5 pruhů A IgG2A
18A7 ne > 5 pruhů B IgGl-k
16E4 ano > 5 pruhů IgM HB 11616
Tabulka 1
-43Příklad 2: Izolace membránových vezikulů kartáčového lemu (BBMV)
Izolace BBMV Diabrotica virgifera (WCRW)
Vezikuly byly připraveny metodou podle Wolfesbergera a dalších, Comp. Biochem. Physiol. 86A, strana 301 až 308 (1987) modifikovanou Englishem a Readdym (Insect Biochem. 19, strana 145 až 152, (1989)) . Střeva larvy WCRW ve třetím instarstadiu byly homogenizovány v ledovém pufru obsahujícím 50mM sacharózu, 2mM Tris-HCl (pH 7,4)a 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) za pomoci homogenizátoru firmy Potter-Elvenhem. Pak byl k homogenitu přidán chlorid vápenatý do koncentrace 50 mM a směs byla 15 minut míchána na ledu. Pak byl homogenit centrifugován při 4.300 x g po dobu 10 minut a za teploty 4°C. Peleta byla odstraněna. Poté byl supernatant centrifugován při 27.000 x g po dobu 10 minut. Peleta byla resuspendována v 0,32M sacharóze. Suspenze byla propasírována přes jehlu průměru 27 a uchována při 70°C.
Izolace BBMV zavíječe kukuřičného (Ostrinia nubilalis)
Střeva byla vyjmuta z pátého instarstadia zavíječe kukuřičného a podélně rozříznuta, aby mohly být odstraněny zbytky potravy a peritrofní membrány. Izolace BBMV proběhla podle výše popsaných metod.
Izolace rostliných mikrozómů
Listové nebo kořenové tkáně z kukuřic pěstovaných 72 hodin ve tmě a při teplotě 28°C byly rozmělněny v třecí misce s tloučkem ve stejném objemu 0,3M draselnofosfátového pufru s přídavkem 5 mM DTT a 1% (w/v) PVPP. Směs byla poté přefiltrována přes čtyři vrstvy jemného plátna. Přefiltrofaná směs byla centrifugována 15 minut při 10.000 x g. Supernatant
-44byl poté centri f ugován 60 minut při 100.000 x g a peleta resuspendována v 0,1 M draselnofosfátovém pufru pH 7,4.
Izolace savčích membránových vezikulů kartáčového lemu
Savčí membrány kartáčového lemu byly připraveny ze sliznice králičího dvanáctníku a stromatu (Kessler a další, BBA 506, strana 136 až 154, (1978)) pomocí podobného postupu jaký byl použit k izolaci membránových vezikulů kartáčového lemu z hmyzích střev. Vnitřní povrch čerstvého králičího dvanáctníku a dolního žaludku byl promyt a slizničná vrstva byla oddělena od níže položené stromy. Materiál byl suspendován v desetinásobku ledového pufru obsahujícího 50 mM sacharózu, 0,1 mM PMSF a 2 mM Tris-HCl pH 7,4. Poté byl materiál homogenizován 15 údery. Nakonec byl přidán chlorid vápenatý do výsldené koncentrace 10 mM a směs byla 15 minut míchána na ledu. Pak byl homogenát centrifugován při 4.300 x g po dobu 10 minut a za teploty 4°C. Poté byl supernatant centrif ugován při 27.000 x g po dobu 10 minut. Peleta byla resuspendována v 0,32M sacharóze a uchována při 70°C.
Příklad 3: Charakterizace monoklonálních buněčných linií se specifitou k WCRW BBMV
Monoklonální buněčné linie u nichž byla pomocí ELISA testu zjištěna vysoká afinita k membránovým vezikulům kartáčového lemu WCRW, byly dále selektovány, aby byly vyloučeny klony křížově reagující s kukuřičnými nebo se savčími mikrozomy. Další ELISA testy byly provedeny s mikrozomy z listů a z kořenů kukuřice a s vesikuly z králičích střevních membrán. Simultánně byly provedeny rovněž testy všech linií proti proteinům zavíječe kukuřičného (ECB) . Ze 78 testovaných linií bylo vybráno 11 linií specifických k Diabrotica virgifera. Dále byly izolovány čtyři linie, které vykazovaly křížovou reaktivitu se
-45zavíječem. kukuřičným. Těchto patnáct klonů je tvořeno buněčnými liniemi sekretujíčími protilátky tříd IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3 a IgM. Monoklonální buněčné linie byly analyzovány pomocí western blotu, čímž se potvrdila jejich specifita k WCRW a nereaktivita s králičími nebo mikrozomy kukuřičného zrna. Specifiká vazba těcto protilátek k různým proteinům WCRW BBMV je dobře patrná z obrázku 1. Z obrázku je patrné, že můžeme rozlišit pět různých vazebných skupin. Dvě skupiny jsou specifické pro jeden až dva proteiny a zbylé tři reprezentují vazbu na 7 až 15 proteinů. Skupina se 7 až 15 proteiny byla dále rozdělena na podtřídy A, B a C podle vazebného obrazce.
Analýza monoklonálních buněčných linií pomocí western blotu
Membránové vezikuly kartáčového lemu byly připraveny podle příkladu 2. Poté byly elektroforeticky rozděleny na 8 až 16% akrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (Novex, San Diego, CA) . Proteiny byly poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Burnette, W.N., Western blotting, 112, 195, (1981). Na tuto membránu se poté nechaly působit roztoky supernatantů z hybridomatických linií. Vazba protilátek na blotované proteiny byla vizualizována pomocí standardních postupů (viz například Antibodies: A laboratory Manual - Protilátky: Laboratorní příručka, E. Harlow a D. Lané, Cold Spring Harbor, 1988 a v něm citované odkazy).
Příklad 4: Klonování vazebných domén protilátek proti WCRW
Jsou známy různé způsoby umožňující získat geny specifických protilátek proti WCRW. Jedním ze způsobů je klonování náhodné knihovny protilátkových genů v bakteriofágovi a vyhledání takových klonů z této knihovny které se váží na proteiny střev WCRW. Jiným možným způsobem je příprava monoklonálních protilátek proti střevním
-46proteinům WCRW klasickým způsobem a v dalším kroku se pak klonují pro protilátky z hybridomů. V tomto příkladě bylo postupováno druhým uvedeným způsobem. Geny protilátek byly vyjmuty z hybridomatických buněčných linií pomocí primerů, které byly komplementární ke konzervovaným sekvencím DNA v konstantních oblastech a k úsekům základní struktury (framework regions) variabilních oblastí. Geny byly poté amplifikovány pomocí PCR, viz Mullis a další, Meth. Enzymol., 155, strana 335 až 350, (1987), Ehrlich (editoři), PCR Technology, Stockton Press (New York 1989) . Pro přípravu isotypově specifických a degenerovaných primerů určených ke klonování protilátkových genů (viz Jones a další, Bio/technology 9, strana 88 až 89, (1991)) byla s úspěchem použita databáze myších sekvencí těžkých a lehkých řetězců sestavená Rabatem a dalšími, Ministerstvo zdravotnictví Spojených Států, (1987). Je známo mnoho technik určených ke klonování menších fragmentů protilátek (například Fab), které vykazují vazebné vlastnosti původních protilátek. Celá molekula protilátky je poměrně veliká (150 kDa), nicméně bylo dokázáno, že mnohem menší Fab a Fv fragmenty (12 až 50 kDa) si zachovávají plnou vazebnou afinitu. Jednořetězcové Fv fragmenty (scFv), ve kterých jsou domény Vh a VI spojeny hydrofilním a flexibilním peptidem, byly úspěšně použity k nasměrování enzymů a toxinů na specifické buňky (Bird, Science 423, strana 423 až 426, (1988), Huston, PNAS 85, strana 5879 až 5883, (1988)). Pro vazbu antigenů byly rovněž použity samotné Vh domény (Dabs) a samotné komplementaritu určující oblasti o délce pouhých 20 aminokyselin (tzv. minimální rozpoznávací jednotky - m.r.u., minimal recognition units) viz Ward, Nátuře 341, strana 544 až 546, (1989), Taub, J. Biol. Chem 264, strana 259' až 265 (1989), Wiliams, PNAS 86, strana 5537 až 5541, (1989). Vyplývá z toho tedy, že je
-47možné redukovat doménu specificky rozeznávající proteiny WCRW na velmi malé molekulu.
Klonování genů protilátek pomocí PCR
Pro klonování genů pro imunoglobuliny nebo pro části imunoglobulinů byly použity specifické primery a polymerázová řetězová reakce. Pomocí výše popsané databáze byly vybrány PCR primery specifické jak pro těžký tak i pro lehký řetězec IgM a tří isotypů IgG. Primery pro úsek, který kóduje N-konec variabilní oblasti byly navrženy tak, aby byly komplentárni k prvnímu úseku základní struktury a navíc, aby byly jistou dávku degenerované a daly se tak použít jako univerzální primery. 3' primery použité ke specifické PCR amplifikaci variabilních oblastí byly navrženy z konzervativních sekvencí první konstantní domény (CH1) lehkého a těžkého řetězce. Různé 3' primery byly použity pro amplifikaci imunoglobulinů isotypů IgGl (3B1 a 17F6), IgG3 (10B6) a IgM (2B5). Protilátky isotypů IgG2A a IgG2B lze amplifikovat pomel stejného primerů, který byl použit pro amplifikaci IgGl. Geny variabilních úseků protilátek byly klonovány do expresivních vektorů pCIB4612 (lehký) a pCIB4611 (těžký řetězec). Tyto expresivní vektory obsahovaly signální peptid pro transport do endoplasmatického retikula a konstantní oblasti lehkého respektive těžkého řetězce IgGl.
Tabulka 2 ukazuje strukturu primerů použitých k PCR klonování těžkého a lehkého variabilního řetězce myších imunoglobulinů. Popřípadě lze použít jiných primerů popsaných v literatuře (Coloma a další, Bio/Techniques 11, strana 152 až 156, (1991), Jones a další, Bio/Technology 9, strana 88 až 89, (1991)) . Oligonukleotidy byly připraveny na DNA syntetizátoru 380B firmy Applied Biosysytems (Applied Biosystems, Foster City, CA) za standardních podmínek. V PCR
-48primerech byla zabudována cílová místa pro restrikční enzymy, která usnadnila po amplifikaci a naštěpeni příslušným enzymem klonování do rostlinného expresivního vektoru pod kontrolou promotoru CaMV 35S. Byla vybrána taková cílová místa, která se nevyskytují v sekvenovaných genech pro protilátky.
-49Tabulka 2
PCR primery použité při amplifikaci genů pro protilátky
Variabilní úseky lehkého řetězce protilátek 3B1, 2B5, 10B6,
14G1 a 17F6 ve vektorech pCIB4614, pCIB4616, pCIB4625,
PCIB4636 a pCIB4617:
NC92: 5' Primer 5'-GTC TCG AGG AYA TYS WGM TSA CCC ART CT-3' (Sekvence id. č.:37)
NC130: 3' Primer 5'-GCA GAT CTA GTT GGT GCA GCA TCA GCC CG-3'(Sekvence id. č.:38)
Variabilní oblast těžkého řetězce protilátek 3B1 and 17F6 ve vektorech pCIB4613 and pCIB4609:
NC91: .5' Primer 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3' (Sekvence id. č.:39)
NC114: 3' Primer 5'-GCA GAT CTA GAT CCA GGG GCC AGT GGA TA-3' (Sekvence id. č.:40)
Variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 2B5 ve vektoru
PCIB4615:
NC91: 5’ Primer 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3'(Sekvence id. č.:39)
NC111: 3' Primer 5'-GCA GAT CTG CAG GAG ACG AGG GGG AAG ACA TT-3' (Sekvence id. č.:41)
Variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 10B6 ve vektoru
PCIB4637:
DB91: 5' Primer 5' -ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA
RWC TG-3 (Sekvence id. č.:48)
NC117: 3' Primer 5'-GCA GAT CTG CAG CCA GGG ACC AAG GGA
TA-3' (Sekvence id. č.:42)
Variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 14G1 ve vektoru
PCIB4635:
DB91: 5' Primer 5'-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA
RWC TG-3' (Sekvence id. č.:48)
DB114: 3' Primer 5'-CAA TTC GCA TAT GAG ATC CAG GGG CCA
GTG GAT A-3'(Sekvence id. č.:49)
Y=CorT;S=CorG;W=AorT;M=CorA;R=AorG
K přípravě prvního vlákna cDNA, použitého pro následné PCR reakce, byla použitá poly-A+ RNA, izolovaná z hybridomatických buněčných linií. Poly-A+ RNA byla extrahována z 103 hybridomatických buněk pomocí guanídíum thiokyanátové lýzy a oligo (dT) celulózové purifikace. K purifikaci bylo použito kitu Fast Track mRNA pro izolaci mRNA (Invitrogen, San Diego, CA) . Pro tvorbu prvního vlákna cDNA bylo použito zhruba jedné desetiny izolované RNA (přibližně 500 ng) . RNA byla byla inkubována 30 minut za teploty 42°C, pak byla zahřáta na 5 minut na 95°C spolu se směsí deoxynukleotidů (0,2mM každého dNTP), 5 μg náhodných hexamerů pd (N6, Pharmacia LKB Biotechnology lne, Piscataway) použitých ve funkci primerů, 50 jednotkami MuMLV (Murine Moloney Leukemia Virus, virus myší leukémie) reverzní transkriptázy a Ix PCR pufrem v celkovém objemu 100 μΐ reakční směsi. První vlákno cDNA bylo izolováno pomocí chloroform.fenolové etrakce a centrifugace přes cetrifugační chromatografickou kolonu dělící podle velikosti molekul (Chromá Spin 30, Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA), čímž byly odstraněny náhodné hexamery. Jedna desetina (10 μΐ) reakční směsi s prvním vláknem cDNA byla přidána k 50 μΐ PCR reakční směsi se specifickými primery pro ímunglobuliny podle instrukcí uvedených v amplifikačním kitu firmmy Perkin-Elmer Cetus. Směs byla amplifikována 20 cykly v termocykleru firmy Perkin-Elmer Cetus. Při amplifikaci byly použity následující teploty: denaturace 94°C po dobu 1 minuty, hybridizace s primery 52°C po dobu 1 minuty a 30 sekund a extenze při 72°C na 1 minutu. PCR produkty byly elektrořoreticky rozděleny na 6% akrylamidovém gelu (Novex, Encinitas, CA) a DNA byla purifikována z výřezů gelu. Výřezy gelu byly nejprve zhomogenizovány v 200 μΐ TE pufru a poté purifikovány centrifugací přes kolonku Ultrafree-MC Milipore (Milipore, Bedford, MA) . Eluát byl štěpen 30 minut 50 μς/πιΐ proteinázy
K při teplotě 37°C a poté byl extrahován směsí fenolchloroform-isoamyl (50:48:2). Po extrakci následovala další extrakcce chloroformem a precipitace ethanolem. DNA byla resuspendována v 40 μΐ pufru TE a poté štěpena příslušnými restrikčními enzymy. PCR produkty variabilních oblastí protilátek byly štěpeny enzymy Xhol a Bgl II a opětovně elektroforeticky purifikovány na 6% akrylamidovém gelu viz výše. V posledním kroku byly Xho Ι/Bgl II fragmenty ligovány do expresivního vektoru pro lehký (pCIB4612) nebo těžký (pCIB4611) řetězec. Vektory byly předem rovněž štěpeny restrikčními enzymy Xho Ι/Bgl II. Expresivni vektor pCIB4612 obsahuje promotor CaMV 35S a terminační sekvenci s 19 aminokyselin dlouhým signálním peptidem, jakož i konstantní oblast lehkéhořetězce CH1. Variabilní úseky lehkého řetězce byly klonovány do Xho Ι/Bgl II místa tak, aby byl exprimován úplný lehký řetězec.
Všechny protilátkové geny byly klonovány výše uvedeným způsobem kromě těžkého řetězce 10B6 a těžkého a lehkého řetězce 14G1. Tyto geny protilátek byly rovněž klonovány z PCR produktů, ale produkty byly děleny elektroforézou na 6% akrylamidovém/TBE gelu. Fragmenty byly vyříznuty z gelu a eluovány pomocí 0,7M LiCl s přídavkem 2mM EDTA. Poté byly fragmenty precipitovány a resuspendovány v pufru 10 mM Tris, 2 mM EDTA, pH 7,5. Izolované PCR produkty byly přímo ligovány do klonovacího vektoru pT&Blue (Novagen) odvozeného od vektoru pUC. Vzhledem k tomu, že Taq DNA polymeráza ponechává na 3' konci reakčního produktu jeden přesahující adeninový nukleotid (Clark, Nucl. Acids Res. 16, strana 9677 (1988)) je možné klonovat přímo tento produkt do vektoru, který obsahuje komplementární volný přesahující T-nukleotid (Marchuk a další, Nucl. Acids Res. 19, strana 1154, (1990)).
-53Vektor pCIB4612 byl připraven čtyřnásobnou ligací 155 bp dlouhého Ddel/Styl fragmentu konstantní oblasti lehkého řetězce z myší ho Ig Kappa řetězce (Schulze-Gahmen a další, J. Biol. Chem. 263, strana 17100 až 17106, (1988), Kabat a další, Ministerstvo zdravotnictví Spojených Států (1987)) a 71 bp dlouhého fragmentu Xhol/Ddel, 101 bp dlouhého fragmentu Styl/BglII a 3,8 kb dlohého zbytku vektoru pCIB4610 po štěpení enzymy Xhol/BglII. Hybridizaci oligonukleotidů KE109A28 a KE 110A28 byl připraven 101 bp dlouhý fragment s přesahujícími místy Styl a BamHI.
KE109A28: 5' -CAA GGA CGA GTA TGA ACG ACA TAA CAG CTA
TAC CTG TGA GGC CAC TCA CAA GAC ATC AAC TTC ACC CAT TGT
CAA GAG CTT CAA CAG GAA TGA GTG TTA GG- 3' (Sekvence i d. č. : 19)
KE110A28: 5' -GAT CCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG AAG CTC
TTG ACA ATG GGT GAA GTT GAT GTC TTG TGA GTG GCC TCA CAG
GTA TAG CTG TTA TGT CGT TCA TAC TCG TC- 3' (Sekvence id. č.:20)
Hybridizaci oligonukleotidů KE111A28 a KE 112A28 byl připraven 71 bp dlouhý fragment s přesahujícími místy Xhol a Ddel.
KE111A28: 5' -TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC- 3' (Sekvence id. č.:21 )
KE112A28: 5' -TGA GGC ACC TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA TAC AGA TCT AGA GCT CGG TAC CC3' (Sekvence id. č.:22)
Expresivní vektor pCIB4611 obsahuje konstantní oblastí těžkého řetězce CH1 až CH3 a podobně může být klonována do
-54místa Xhol/BgLII i variabilní oblast těžkého řetězce tak, aby se exprimoval kompletní těžký řetězec. Vektor pCIB4611 byl připraven ligací NcoI/BstXI fragmentu genu konstantní oblasti těžkého řetězce z myšího IgGl Gama (viz Honjo a další, Nátuře 277, strana 627 až 633, (1979), Kabat a další, US Dept of Health and Human Services(1987) ) se dvěma hybridizovanými 40 bp dlouhými oligonukleotidovými fragmenty a následnou ligací výsledného 982 bp dlouhého fragmentu do vektoru pCIB4610, který byl předtím štěpen restriktázami BglII a Xhol. Jeden 40 bp dlouhý fragment byl připraven hybridizaci oligonukleotidů KE106A28 a KE107A28 a má přesahující konce Xhol/Ncol, zatímco druhý 40 bp dlouhý fragment byl připraven hybridizaci oligonukleotidů KE108A28 a KE105A28 a má přesahující konce BstXI a BamHI.
KE106A28 : 5 ' -TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GCT GCC
CAA ACT AAC TC- 3' (Sekvence id . č. : 23)
KE107A28 : 5 ' -CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AGA TCT AGA
GCT CGG TAC CC- 3’ (Sekvence id . č. :24)
KE108A28 : 5 ' -CTG GTA AAG GCG GCC GCA TCG ATT AAG TCG
ACC CGC GGG- - 3' (Sekvence id. č . :25 )
KE105A28 : 5 ' -GAT CCC CGC GGG TCG ACT TAA TCG ATG CGG
CCG CCT TTA CCA GGA GA- 3' (Sekvence id. č.:26)
Vektor pCIB4610 obsahuje sekvenci kódující 19 aminokyselin dlouhý signální peptid pro myší endoplasmatické retikulum umístěnou mezi CaMV 35S promotor a CaMV 35S terminační sekvenci. Vektor pCIB 4610 byl připraven ligací 83 bp dlouhého produktu PCR naštěpeného enzymy BamHI a Hpal do vektoru pCIB 4600 naštepeného stejnými enzymy. Produkt PCR reakce byl připraven za použití vektoru pCIB4600 jakožto
-55templátu pro PCR a primerů KE102A28 a KE101A28. Vektor pCIB4610 se liší od původního vektoru pCIB4600 pouze nepřekládanou vedoucí sekvencí za promotorem CaMV 35S. Vektor pCIb 4610 obsahuje konsensuální rostlinnou sekvenci pro iniciaci translace AACA ATG (sekvence id. č. 27), kde ATG je počátkem translace, zatímco vektor pCIB4600 obsahuje sekvenci TCCG ATG (sekvence id. č. 28).
KE102A28: 5 ' -CGA AGT TAA CAG ATC TAG AGC TCG G-
(Sekvence id. č. : 29)
KE101A28: 5 ’ -CGG GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG
TT-3'(Sekvence id. č.:30)
Vektor pCIB4610 byl připraven ligací derivátu expresivního vektoru pCIB710 s promotorem CaMV 35S (Rohstein a další, Gene 53, strana 153 až 161, (1987)) naštěpeného enzymy BamHI a Sací s 86 bp dlouhým BamHi/SacI fragmentem kódujícím signální peptid pro endoplasmatické retikulum (Kabat a další, Ministerstvo zdravotnictví Spojených Států (1987). Sekvence tohoto 86 bp dlouhého fragmentu je následuj ící.
5 ' - GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG
TCA GTT GTT ACC CTA CCT CGA CCT AGA AAG AGA AGG AGG ACA GTG
GAG CTG CAG GTG TCC ATT GCC TAC TCG AGG GTA CCG AGC TCC TCG
ACG TCC ACA GGT AAC GGA TGA GCT CCG ATG GC- 3' (Sekvence id.
č. : 31)
Jednotlivé variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců pěti různých monoklonálních linií proti WCRW byly klonovány do expresivních vektorů za vzniku následujících konstruktů:
pCIB4613: variabilní oblast těžkého řetězce 3B1 pCIB4614: variabilní oblast lehkého řetězce 3B1
pCIB4615: variabilní B-21216) oblast těžkého řetězce 2B5 (NRRL
pCIB4616: variabilní B-21217) oblast lehkého řetězce 2B5 (NRRL
PCIB4609: variabilní B-21215) oblast těžkého řetězce 17F6 (NRRL
PCIB4617: variabilní B-21218) oblast lehkého řetězce 17F6 (NRRL
PCIB4637: variabilní B-21279) oblast těžkého řetězce 10B6 (NRRL
pCIB4625: variabilní B-21219) oblast lehkého řetězce 10B6 (NRRL
pCIB4635: variabilní B-21277) oblast těžkého řetězce 14G1 (NRRL
pCIB4636: variabilní B-21278) oblast lehkého řetězce 14G1 (NRRL
pCIB4631: variabilní 3B1 (NRRL B oblast ,-21278) lehkého i těžkého řetězce
Výše zmíněné expresivní- vektory následované přístupovým číslem NRRL byly 7. března 1994 uloženy u Agricultural Research Service, Patent Culture Colection (NRRL), Northern Regional Research Centre, 1815, North University Street, Peoria, Illinois 61604, Spojené státy. Výjimku tvoří vektory pCIB4637, pCIB4635 a pCIB4636, které byly uloženy 3. června 1994 .
Tabulka 3 obsahuje přehled identifikačních čísel sekvencí variabilních oblastí. V případě vektorů pCIB4613, pCIB4617, pCIB4625, pCIB4637, pCIB4635 a pCIB4636 jde o kompletní sekvence variabilních oblastí začínající prvním kodónem prvního úseku základní struktury a končící posledním ~5Ίkodónem čtvrtého úseku základní struktury variabilní oblasti. Variabilní oblast ve vektoru pCIB4609 není úplná, 5' konec kódující sekvence je zkrácen a sekvence tak začíná druhou CDR oblastí variabilní oblasti.
58Tabulka 3
Přehled DNA
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id
Sekvence id sekvenci
č. 1:
č.2 :
č.3:
č. 4 :
č. 5 :
č. 6:
č.7 :
č. 8 :
č. 9 :
č.10:
č. 11:
č.12 :
řetězců protilátek
DNA variabilní oblasti těžkého řetězce 3B1 sekvence proteinu variabilní oblasti těžkého řetězce 3B1
DNA variabilní oblasti lehkého řetězce 3B1 sekvence proteinu variabilní oblasti lehkého řetězce 3B1
DNA variabilní oblasti těžkého řetězce 2B5 sekvence proteinu variabilní oblasti těžkého řetězce 2B5
DNA variabilní oblasti lehkého řetězce 2B5 sekvence proteinu variabilní oblasti lehkého řetězce 2B5
DNA variabilní oblasti těžkého řetězce 17F6 sekvence proteinu variabilní oblasti těžkého řetězce 17F6
DNA variabilní oblasti lehkého řetězce 17F6 sekvence proteinu variabilní oblasti lehkého řetězce 17F6
Sekvence id. č . 13 : DNA variabilní oblasti těžkého řetězce 10B6
Sekvence id. č. 14 : sekvence proteinu variabilní oblasti těžkého řetězce 10B6
Sekvence id. č.15: DNA variabilní oblasti lehkého řetězce 10B6
Sekvence id. č.16: sekvence proteinu variabilní oblasti lehkého řetězce 10B6
Sekvence id. č.17: DNA jednořetězcové protilátky 3Bl
Sekvence id. č.18 : sekvence proteinu jednořetězcové protilátky 3B1
Sekvence id. č.44 : DNA variabilní oblasti těžkého řetězce 14G1
Sekvence id. č.45: sekvence proteinu variabilní oblasti těžkého řetězce 14G1
Sekvence id. č.46: DNA variabilní oblasti lehkého řetězce 14G1
Sekvence id. č.47 : sekvence proteinu variabilní oblasti lehkého řetězce 14G1
-60Syntéza DNA oligonukleotidů
DNA ologonukleotidy byly syntetizovány pomocí syntetizátoru 380B firmy Applied Biosystems a standardního postupu. Oligomery byly připraveny modernizovaným SSCAF3 cyklem na 0,2 μπιοί malé koloně ABI s velkými póry. Na konci procedury byl z kolony vymyt trityl a oligomer byl odštěpen z pevné fáze standardním automatickým štěpícím cyklem syntetizátoru 380B. Oligonukleotidy byly poté odblokovány v přebytku hydroxidu amonného při teplotě 55°C. Odblokování trvalo 8 až 12 hodin. Poté byly oligonukleotidy vysušeny v evaporátoru v dusíkové atmosféře. Nakonec byly oligonukleotidy resuspendovány v 0,25 až 0,5 ml deionizované vody.
Purifikace syntetických DNA oligonukleotidů
Alikvot každého oligonukleotidů byl smíšen s ekvivalentním množstvím směsi modrého barviva a formamidu tak, aby výsledný rozto obsahoval 0,05 % bromfenolové modři, 0,05 % xylen kyanolu FF a 25 % formamidu. Tato směs byla 10 minut zahřívána při teplotě 95°C tak, aby došlo k denaturaci oligonukleotidů. Vzorky byly poté naneseny na 12% polyakrylamidový gel obsahující 7M močovinu (Sambrook a další). Po 3 až 4 hodiny trvající elektroforéze při napětí 300 a 400 V ve vertikální elektroforezní jednotce firmy Hoefer (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) byly pomocí UV transiluminátoru v gelu vyhledány fragmenty o správné velikosti, které byly poté skalpelem vyříznuty. Tyto fragmenty gelu byly homogenizovány a inkubovány přes noc v pufru s obsahem 0,4 M LiCl, lmM EDTA (pH 8) při teplotě 37°C.
K separaci oligonukleotidů z gelu byla použita jedna ze dvou následujících metod: použití mikronové porézní polyethylenové filtrační jednotky Gel/X (Genex Corp., Gaithersburg) nebo 0,45 mikronové filtrační jednotky Millipore (Millipore ultrafreee-MC 0,45μ). Purifikované oligonukleotidy byly precipitovány ethanoiem, peletovány centrifugací v mikrocentrifuze (20 minut při 4°C) a nakonec rozpuštěny v TE pufru (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) . Na základě absorbancí při vlnové délce 260 nm byla upravena koncentrace oligonukleotidů na 50 ng/μΐ.
Fosforylace oligonukleotidů
V každé 20 μΐ kinázové reakci bylo použito jednoho pikomolu purifikovaného oligomeru v purfu obsahujícím 7,0 mM Tris, pH 7,5, lOmM KC1, lmM MgCl2, 0,5mM DTT, 50 pg/ml BSA, 3000 μθί (3 pikomoly) 32Ρ-γ-ΑΤΡ a 8 jednotek T4 polynukleotid kinázy. Kinázová reakce byla inkubována 1 hodinu při teplotě 37°C, poté následovala fenol/chloroformová extrakce a trojnásobná precipitace v ethanolu s glykogenem jakožto nosičem (Tracy, Prep. Biochem. 11, strana 251 až 268, (1981)).
Hybridizace oligonukleotidů pro přímé klonování
Oligomery určené pro hybridizaci byly shromážděny (od 1 μg do 20 μg celkové DNA) a fosforylovány jednu hodinu v lx ligačním pufru Promega obsahujícím 30mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl2, lOmM DTT a lmM dATP při inkubační teplotě 37°C. V reakci bylo použito jedné až dvaceti jednotek T4 polynukleotid kinázy podle toho, jaké bylo množství celkové DNA. Fosforylace byla ukončena ponořením reakční směsi do vroucí vodní lázně na dobu 5 minut. Shromážděné oligonukleotidy byly doplněny hybridizačním pufrem na objem 50 až 100 μΐ tak, aby konečná koncentrace solí byla
-62lOOmM NaCl, 120mM Tris pH 7,5 a lOmM MgCl2. Fosforylované i nefosforylované oligonukleotidy byly spojeny dohromady a opět inkubovány 5 minut ve vroucí vodní lázni a poté byly postupně po dobu zhrub a čtyř hodin ochlazovány na pokojovou teplotu. Hybridizované oligonukleotidy byly poté extrahovány fenol/chloroformovou směsí, precipitovány ethanolem a resuspendovány v 17 μΐ TE pufru (lOmM Tris, lmM EDTA, pH 8,0) . K těmto 17 μΐ byl přidán ligační pufr tak aby ve výsledných 20 μΐ roztoku byly tyto koncentrace reaktantů 30mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl2, 10mM DTT, lmM dATP a 3 jednotky T4 DNA ligázy (Promega, Madison, WI). Ligační reakce probíhala přibližně dvě hodiny při pokojové teplotě. Hybridozované/ligované fragmenty byly elektroforeticky přečištěny na 2% agaróze Nusieve (FMC BioProducts, Rockland, ME) a to před a/nebo po enzymatické restrikci a před vlastním klonováním do vektorů. Ve 20 μΐ ligační směsi bylo použito 100 ng až 500 ng každého fragmentu s přibližně ekvimolárním množstvím DNA vektoru v pufru obsahujícím 30mM Tris-HCl, pH 7,8, lOmM MgCl2, lOmM DTT, lmM dATP a 3 jednotky T4 DNA ligázy (Promega, Madison, WI). Ligační reakce probíhala přibližně dvě hodiny při pokojové teplotě. Po ligační reakci byly DNA transformovány zmražené kompetentní bakterie E. coli za použití standardních postupů (Sambrook a další). Transformanti byly selektováni na LB-agaru (Sambrook a další) s obsahem 100 μg/ml ampicilinu (viz dále)
Příklad 5: Konstrukce molekuly jednořetězcové protilátky (SCA)
Vektor pCIB4631 obsahuje DNA kódující jednořetězcovou protilátku (SCA-single chain antibody) specifickou k BBMV WCRW fúzovanou s genem pro konstantní oblasti těžkého řetězce protilátky. Gen SCA obsahuje fúzní variabilní fragmenty protilátky 3B1 (monoklonální linie 3Bl se specifitou proti
-63membránovým vezikulům kartáčového lemu WCRW) z lehkého i těžkého řetězce spolu s 19 aminokyselin dlouhou signální sekvencí pro endoplasmatické retikulum. Mezi fragmenty Fv těžkého a lehkého řetězce je vložen 10 aminokyselin dlouhý doménový linker (GGGGSGGGGS, sekvence id. č. 32), viz Huston a další, PNAS 85, strana 5879 až 5883, (1988). Vektor pCIB4631 byl připraven ligací 4,1 kb dlouhého Xbal/Xhol fragmentu (Fv: konstantní oblast těžkého řetězce: CaMV 35S terminační úsek: fragment vektoru pCIB4613) a 1,4 kb dlouhého Xbal/BglII fragmentu (CaMV 35S promotor: lehký fragment Fv z vektoru pCIB4614) a dále pak ještě 36 bp dlouhého linkeru s přesahujícími konci BglII/Xhol.
Tento 36 bp dlouhý linker vznikl hybridizaci oligonukleotidů KE147A28 a KE182E28:
KE147A28: 5' -GAT CTG GTG GCG GTG GCT CGG GCG GTG GTG
GGT CGC- 3' (Sekvence id. č.:33)
KE182A28: 5 '-TCG AGC GAC CCA CCA CCG CCC GAG CCA CCG
CCA CCA- 3' (Sekvence id. č.:34)
Oligonukleotidy byly purifikovány výše uvedeným způsobem na 12% akrylamidovém gelu se 7M močovinou. Po UV transiluminaci byly z gelu vyříznuty proužky obshující fragmenty o správné délce. Oligonukleotidy byly dále fosforylovány, viz výše.
Expresivní vektor pCIB4631 byly 7. března 1994 uložen u
Agricultural Research Service, Patent Culture Colection (NRRL), Northern Regional Research Centre, 1815, North
University Street, Peoria, Illinois 61604, Spojené státy a bylo mu přiděleno přístupové číslo NRRL B-21220.
-64Příklad 6: Charakterizace vazebných vlastností SCA
Jednořetězcové protilátky byly exprimovány v kukuřičných protoplastech a izolovány. Bylo dokázáno, že se vážou na proteiny membránových vezikulů kartáčového lemu WCRW ve western blotu i na izolované řezy středního střeva WCRW v imunotestu (Bravo a další, J. of Invert. Path. 60, strana 237 až 246, (1992), (Bravo a další, J. of Invert. Path. 60, stran 247 až 253, (1992)).
Izolace suspenzních kukuřičných protoplastů
Emryogenní suspenzní kultury odvozené od nedospělých embryonálních kultur kukuřice odrůdy Ciba Seeds inbred B73 nebo popřípadě od Černé v bazálním médiu B6 (Chu sacharózou a 2 mg/ml 2,4-D.
Mexické Sladké byly udržovány a další, 1975) doplněném 3% Kultivace probíhala při teplotě
27°C na otočnném shakeru při 130 otáčkách za minutu a kultury byly jednou za týden pasážovány. Suspenzní buňky byly odebrány 1 až 2 dny po pasážování a byly resuspendovány v enzymatickém roztoku (3% celuláza RS, 1% macerozym R10 v pufru KMC: 8,7 g/1 KC1, 12,5 g/1 CaCL, 16,4 g/1 MgSO4, 5 g/1 MES, pH 7,5) v poměru 2 ml kompaktního buněčného objemu ku 20 ml enzymatického roztoku. Buňky byly rozděleny do Petriho misek 100 x 25 mm a inkubovány čtyři hodiny při pokojové teplotě na otočném shakeru při 50 otáčkách za minutu.
Transformace protoplastů
Ihned po izolaci byly protoplasty resuspendovány v pufru RS (0,45M manitol, 15mM CaClž, 0,1% MES, pH 7,5) tak, aby výsledná hustota činila 6 milionů buněk na 1 ml. 0,5 ml velké alikvoty byly umístěny do polystyrénových zkumavek 17x100 mm. Poté bylo přidáno 50 pg DNA vektoru pCIB4631 a
-6550 μς CaMV 35S GUS (například pB1221, Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA) jakožto pozitivní kontrola. Poté bylo do zkumavek přidáno 0,5 ml roztoku polyethylenglykolu (40% PEG 6000, 0,4M manitol,· 0,lM Ca (NO) 3) a celá směs byla jemně promíchána lehkým třepáním zkumavky. Po 30 minutách inkubace při pokojové teplotě byly protoplasty po krocích rozpuštěny v 1 ml, 2 ml, 5 ml a 10 ml roztoku W5 (9,0 g/1 NaCl, 18,5 g/1 CaCl2, 0,37 g/1 KC1, 0,9 g/1 glukózy, pH 5,6), sedimentovány a resuspendovány v kultivačním médiu (MS soli, vitaminy B5, 3% sacharóza, 2 mg/ml 2,4-D. 0,3M manitol) tak, abuy buněčná hustota byla 2xl06 protoplastů na ml. Protoplasty byly inkubovány ve tmě při teplot+ 26°C. Po 18 až 22 hodinách byly protoplasty přeneseny do mikrozkumavek, sedimentovány a resuspendovány v 0,4 ml extrakčního pufru (lOOmM KHP04,lmM DTT, pH 7,8) . Vzorky byly poté sonikovány a debris byla peletována centrifugací.
Vazba jednořetězcových protilátek na membránové vezikuly kartáčového lemu WCRW:
Výše zmíněným způsobem byly připraveny membránové vezikuly kartáčového lemu. Vezikuly byly poté elektroforeticky rozděleny na 8 až 16% akrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (Novex, San Diego, CA) . Proteiny byly poté přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Burnette, Western Blotting 112, strana 195, (1991)). Poté byly membrány inkubovány s extraktem z kukuřičných protoplastů, který obsahoval proteiny jednořetězcových protilátek. Jednořetězcový protilátkový protein 3B exprimovaný vektorem pCIB4631 byl ve western blotu schopen vazby na protein BBMV o stejné molekulové hmotnosti, na který se vázala původní monoklonální protilátka 3B1. Jednořetězcové protilátka exprimovaná v kukuřici byla rovněž schopna vazby na řezy ze středního střeva WCRW v imunosekčních experimentech (Bravo a
-66další, J. of Invert. Path. 60, strana 237 až 246, (1992), (Bravo a další, J. of Invert. Path. 60, stran 247 až 253, (1992) ) .
Příklad 7: Konstrukce imunotoxinů specifických na WCRW
Jednořetězcová protilátka se specifitou proti membránovým vezikulům kartáčového lemu WCRW byla spojena s toxickou oblastí exotoxinu A bakterií Pseudomonas. Pseudomonas exotoxin A byl použit při syntéze rekombinantích hybridních proteinů skládajících se z toxinu a protilátky, které byly použity při léčbě rakoviny a imunologických onemocnění (Pastan I., Fitzgerald D., J. Biol. Chem. 264, strana 15157 až 15160, (1989) a Patan a další, Annu. Rev. Biochem. 61, strana 331 až 354, (1992) ) . Struktura pseudomonálního exotoxinu je dobře známa a rovněž je známa i j eho funkce.
Myšlenka použití hybridních proteinů toxin/protilátka v roli insekticidů je nová a bezprecedentní.
Pseudomonální exotoxin (PE) je jednořetězcový toxin produkovaný bakteriemi Pseudomonas aeruginosa. Zabíjí buňky ireverzibilní ADP-ribosylací a inaktivací translačního elongačního faktoru 2 (EF-2). Struktura PE je dobře známa (Chaudhary V.K. a další, J. Biol. Chem. 265, strana 16303 až 16310, (1990)). PE sestává ze tří domén. Doména la je zodpovědná za rozpoznávání buněk a vazbu PE na cílovou buňku, doména II je potřebná pro translokaci ADP-ribosylační aktivity do cytosolu a konečně doména III je nositelem ADPribosylační aktivity. Při vstupu do buňky je toxin nejprve internalizován endocytickými vesikuly. Uvnitř vezikulů dojde k proteolytickému štěpení za vzniku 37 kDa domény III aktivovaného toxinu. Delece domény la vede k odstranění domény, která zprostředkovává vazbu na cílovou buňku. Vzniká tak 40 kDa protein (PE40) s extrémně nízkou cytotoxicitou.
-67Vazba protilátky na PE40 byla využita při tvorbě mnoha rekombinantních imunotoxinů pro léčbu rakoviny. Má se za to, že vazba řúzního proteinu PE4O-protilátka musí být následována receptory zprostředkovanou endocytózou, jinak nedojde k náležité aktivaci PE40 a následnému průchodu do cytosolu.
Toxická doména PE byla navázána na C-konec fragmentu těžkého řetězce jednořetězcové protilátky WCRW 3B1 jelikož bylo dokázáno, že fúze na N-konec PE40 nevede ke ztrátě cytotoxicity. Je rovněž možno vytvořit fúzní proteiny, ve kterých je jednořetězcová protilátka vázána na C-konec toxinu PE40 (Prior a další, Cell svazek 64, strana 1017 až 1023) . Tyto fúzní proteiny jednořetězcové protilátky byly vytvořeny a testovány v expresivních vektorech v bakteriích E. coli. Byl přitom použit expresivní vektor p-FLAG, který obsahuje tac promotor indukovatelný IPTG, po kterém následují sekvence kódující signální peptid ompA pro sekreci do periplasmy a osm aminokyselin dlouhý epitop FLAG, který umožňuje izolaci fúzního proteinu pomocí afinitní chromatografie. Z tohoto expresivního vektoru FLAG byly purifikovány fúzní jednořetězcové protilátky. Tyto jednořetězcové protilátky se poté staly součástí diety zkoumaného hmyzu při testech aktivity.
Tento fúzní protein PE40-jednořetězcová protilátka byl připraven ligací přibližně 1,2 kb dlouhého SphI/EcoRI fragmentu obsahujícího PE40 a 700 bp dlouhého HindlII/Sphl fragmentu obsahujícího jednořetězcovou protilátku 3B1 do 5,37 kb dlouhého vektoru pFLAG (IBI, New Haven, CT) naštěpeného restriktázami HindlII/EcoRI. Fragment obsahující PE40 byl získán z vektoru pWW20, který obsahuje toxickou doménu pseudomonálního exotoxinu pod kontrolou indicibilního promotoru Lac (Wels a další, Cancer Research 52, strana 6310
-68až 6317, (1992)). 700 bp dlouhý fragment obsahující jednořetězcovou protilátku 3B1 byl vytvořen pomocí PCR, přičemž jakožto templátu bylo použito vektoru pCIB4631 a jako primerů bylo použito oligonukleotidů NC200 a NC202.
NC200: CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG (Sekvence id. č . : 35)
NC202: GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGAGACGGT GACTGA (Sekvence id. č.:36)
Příklad 8: Transformace a exorese v rostlinách
Hybridní toxiny sestávající z protilátkové domény a z toxinové domény se trnasformují do rostlin obvyklým způsobem, viz WO 93/07278, 08/008,006 a 08/037,057. Binární toxiny sestávající ze dvou nezávislých protilátkových řetězců s toxinem jsou běžným buněčným z jednořetězcové mechnismem protilátky nebo protilátkových domén sfúzovaných exprimovány a sestaveny v rostlinách Proteiny skládající se a toxinu jsou exprimovány buď v cytoplasmě rostlinné buňky a směrovány do rostlinné apoplasmy, a nebo v případě hybridních toxinů s buněčnou cytotoxicitou jsou směrovány do nitra organel v rostlinné buňce (Taviadoraki a další, Nátuře 366, strana 469 až 472, (1993), Owen a další,
Bio/Technology 10, strana 790 až 794, (1992), Firek a další,
Plant Molecular Biology 23, strana 861 až 870, (1993). Známé, v literatuře popsané způsoby jsou použity k nasměrování proteinů do chloroplastů nebo do vakouly pře endoplasmatické retikulum. V literatuře jsou popsány směrovací signály ve formě peptidů na karboxy konci (Bednarek S. a další, Plant Cell 3, strana 1195 až 1206, (1991) , Neuhaus J.M. a další, PNAS 88, strana 10362 až 10366, (1991), Bednarek S. a další,Plant. Mol. Biol. 20, strana 133 až 150, (1992),
-69Chrispeels M.J. a další, Cell 68, strana 613 až 616, (1992), Nakamura K., Plant Physiol. 101, strana 1 až 5, (1993), Dombrowski J.E., Plant Cell 5, strana 587 až 596, (1993), Schroeder M.R., Plant Phisiol 101, strana 451 až 458, (1993)) . Rovněž tak signály pro směrování do chloroplatů jsou popsány v literatuře a mají podobu N-koncových peptidů (Van Den Broeck G. a další, Nátuře 313, strana 358 až 363, (1985), Smeekens S. a další, Plant Mol. Biol. 9, strana 377 až 388, (1987), Szabo L.J. a další, v knize Plant DNA Infectious Agents (Rostlinné infekční DNA), editoři Hohn T. a Schell J., nakladatelství Springer, Vídeň, strana 321 až 339, (1987), Keegstra K. a další, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40, strana 471 až 501, (1989)).
Vynález popisuje zbůsoby konstrukce toxinových molekul, které jsou specificky namířené na určitý druh hmyzu. Tyto konstrukty jsou specificky namířeny na hmyz, který odolal vazbě toxinu a cytotoxickým účinkům Bt endotoxinu. Dále jsou toxinové molekuly konstruovány tak, aby byly specificky toxické pro konkrétní hmyzí škůdce.
Přestože byly poměrně detailně popsány i vynálezy patřící do stavu techniky je zřejmé, že se tak stalo pouze v zájmu větší jasnosti a snadného pochopení, a že byly učiněny změny ve smyslu nároků.
Příklad 9: Příklady aplikačních forem vynálezu
Aktivní složkou použitou v následujících aplikačních formách vynálezu jsou purifikované fúzní proteiny jednořetězcových protilátek podle příkladu 7.
-70A1 Smáčivé prášky
a) b) c)
aktivní složka 25 % 50 % 75 %
lignosulfát sodný 5 % 5 % --
laurylsulfát sodný 3 % -- 5 %
diisobutylnaftalensulfonát sodný -- 6 % 10 %
oktylfenol-pólyethylenglykoléter -- 2 % --
(7 až 8 molů ethylen oxidu)
jemně dispergovaná kyselina křemičitá 5 % 10 % 10 %
kaolin 65 % 27 % —
Spory se důkladně promíchají s adj uvans a celá směs
poté důkladně rozemele ve vhodném mlecím zařízení za vzniku smáčivého prášku. Smáčivý prášek lze rozpustit ve vodě, čímž vznikne suspenze s požadovanou koncentrací aktivní složky.
A2 Emulgovatelný koncentrát aktivní složka 10 % oktylfenol-polyethylenglykoléter 3 % (7 až 8 molů ethylen oxidu) dodecylbenzensulfonát vápenatý 3 % ricínový olej polyglykol éter (36 molů 4 % ethylen oxidu) cyklohexanon 30 % směs xylenů 50 %
Rozpuštěním ve vodě je možno získat elmulzi libovolné koncentrace.
-71A3 Prášky
b) aktivní složka mastek kaolin
Prášky připravené k okamžitému použití se získají smíšením aktivní složky s nosičem a důkladným rozemletím směsi ve vhodném mlecím zařízení.
A4 Lisovaný granulát
aktivní složka 10 o. 0
lignosulfát sodný 2 0, 0
karboxymethyl celulóza 1 O, Ό
kaolin 87 O 3
Aktivní složka nebo směs se smísí adjuvans a rozemele se. Směs se poté lisuje protlačováním, granuluje a suší se v proudu vzduchu.
A5 Potahované granule aktivní složka 3 % polyethylenglykol (mol.hm. 200) 3 % kaolin 94 %
Aktivní složka nebo směs pomalu a rovnoměrně přidává do mixeru ke kaolinu, který je zvláčněn polyethylenglykolem. Tímto způsobem se získají neprášivé potahované granule.
-72A6 Koncentrovaná suspenze
aktivní složka 40 o. 0
ethylenglykol 10 Q, O
nonylfenol-polyethylenglykol-éter 6 O. O
(15 molů ethylen oxidu)
lignosulfát sodný 10 o. 0
karboxymethyl celulóza 1 o. o
37% vodný roztok formaldehydu 0,2 Q. 5
silikonový olej ve formě 75% vodného 0,8 Q. Ό
roztoku
voda 32 O. O
Aktivní složka je neprodleně smíšena s adjuvans za vzniku
koncentrované suspenze, ze které může být připravena
libovolná suspenze požadované koncentrace naředěním vodou.
Stručný popis obrázku
Obrázek 1
Na obrázku je patrný výsledek analýzy pomocí westernblotu. BBMV Diabrotica virgifera byly elektroforeticky rozděleny na polyakrylamidovém gelu a poté byly přeneseny na membránu a detekovány pomocí monoklonálních protilátek. Při tomto pokusu bylo použito protilátek produkovaných buněčnými liniemi 3B1, 2B5, 17F6 a 10B6. MW značí standardy molekulové hmotnosti.
-73INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:357 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 357 (D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 3B1 z vektoru pCIB4613 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
CAG GTC Gin Val 1 AAA CTG CAG GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG 48
Lys Leu Gin 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Lys 15 Gly
TCA TTG AAA CTC TCA TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
GCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT 144
Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT 192
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp
50 55 60
TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG 240
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met
65 70 75 80
TTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT 288
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85 90 95
-Ί4TAC TGT GTG AGG GTA GTA TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
336
100 105 110
• ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:119 aminokyselin
(B) TYP: amino kyselina
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
Gin Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly
1 5 10 15
* v Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
9 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
90 95
357
-75Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:333 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 339 (D) DALŠÍ INFORMACE:variabilní oblast lehkéhořetězce protilátky 3B1 z vektoru pCIB4614 (#2lFvAb) (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 3:
GAC Asp 1 ATT Ile GTG Val CTG Leu ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG
Thr Gin 5 Ser Pro Ala Ser 10 Leu Ala Val Ser Leu 15 Gly
CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT CAT TAT
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC
Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
-76AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Ala
55 60
AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
70 75 80
CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT TTC TGT CAG CAA AGT AGG
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg
90 95
GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC ACG CTG GAA ΑΤΑ AAA
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105 HO
192
240
288
333
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:111 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) f ΌΡΙ S Sl EKVENCE ID .Č. 4 :
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
Lys Leu 50 Leu Ile Tyr Ala Ala 55 Ser Asn Gin Gly Ser 60 Gly Val Pro Ala
Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Ser Leu Asn Ile His 80
Pro Met Glu Glu Asp 85 Asp Thr Ala Ile Tyr 90 Phe Cys Gin Gin Ser 95 Arg
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys
100 105 HO
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:372 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 372 (D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 2B5 z vektoru pCIB4615 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 5:
CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT 48
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC 96
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Thr Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr
TAT ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG 144
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
GGT TTT ATT AGA CAC AAA GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAA TAC AGT GCA 192
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAC ATC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Ile
65 70 75 80
CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT 288
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
TAC TGT GCA AGA GAT ATA TGC TAT GGT TAC GAC GTT GGG GCT CTG GAC 336
Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp
100 105 110
TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 372
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:124 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
-79(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 6:
Gin Val. Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Ala Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:330 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-80(ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 330 (D) DALŠÍ INFORMACE:varlabilní oblast lehkéhořetězce protilátky 2B5 z vektoru pCIB4616
(xi ) POPIS SEKVENCE ID, .C. 7 :
GAT ATC GTG ATG ACC CAG TCT CCT GCT TCC TTA GCT ATA TCT CTG GGG 48
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly
1 5 10 15
CAG AGG GCC ACC ATC TCA TAC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT 96
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
AGA CTC CTC ATC TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 192
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
55 70 75 80
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG 288
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ile Arg
85 90 95
GAG CTT ACA CGT TCG GAG GGG GGA CCA AAG CTG GAA ATA AAA 330
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys
100
105
110
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:110 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 8:
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ile Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ile Arg 85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110
82INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 165 párů basí' (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 165 (D) DALŠÍ INFORMACE:variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 17F6 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 9:
TCT Ser 1 GTG Val AAA GGC AGA Arg 5 TTC ACT Phe Thr ATT Ile TCA AGA GAT GAT TCA CAA AGT ACT 48
Lys Gly Ser Arg 10 Asp Asp Ser Gin Ser 15 Thr
GTC TAC CTG GAG ATG AAC ACG CTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 96
Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
20 25 30
TAT TGT TGT AGA GGG GGG GAG GAG GGG TTT CCT TAC TGG GGG CAA GGG 144
Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
35 40 45
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 165
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
55
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:55 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 10:
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Thr 15 10 15
Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 20 25 30
Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 35 40 45
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 50 55
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:339 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 339
-84(D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast lehkého řetězce protilátky 17F6 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 11:
GAC ATC Asp Ile 1 GTG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GTA GGA 48
Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Val 15 Gly
GAG AAG GTC ACC ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTT TTC GAC AGT 96
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
GGA AAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
CCT CCT AAA CTA TTG ATC TAC GGG ACA TCC ACT AGG GAT TCT GGG GTC 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGT GGT ATA CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Gly Ile Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT TAT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG ATA 336
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
AAA
Lys
339
-85INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:113 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
(xi) POPI S S EKVENCE : id • C. 12 :
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
Pro Pró Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Gly Ile Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
-8 6-
(A) DÉLKA:357 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: : lineární
(ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 357 (D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 10B6 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 13:
GAG Glu 1 GTG Val AAG GTG GAT Asp 5 GAG AGT Glu Ser GGG Gly GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT Pro Gly Asn 15 48
Lys Val Gly Gly 10 Leu Val Arg
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GAA ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT TAT TAT 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
TGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GCT GTG ATT AAA GTC AAA TCT GCT AAT TAT GGA TCA AAT TAT GCA GAG 192
Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu
55 60
-87240
TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAT AGC GGT
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly
65 70 75 80
GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAA GAA GAC ACT GCC ACT TAT
Val Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
TAT TGT AGT AGA GGG GGG GCC CCC GGG TTT CCT TAT TGG GGC CAA GGG
Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 14
288
336
357 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 14:
Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40
Ala Val Ile Lys Val Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ala Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:339 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 339 (D) DALŠÍ INFORMACEivariabilní oblast lehkéhořetězce protilátky 10B6 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 15:
GAT Asp 1 ATC Ile GTG ATC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTA AGT GTG TCT TTA GGA 48
Val Ile Thr 5 Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Leu Gly 15
GAG AAG GTC ACT TTG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTT ACC GGT 96
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly
20 25 30
GGA GAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA GCA GGG CAG 144
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin
35 40 45
CCT CCT AGA CTG TTG ATC TAC GGG ACT TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192
Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT GCC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala
65 70 75 80
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GGT TAT TAC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT AGT TAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA ATG TTG GAA GTA 336
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val
100 105 110
AAA 339
Lys
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 16
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:113 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina
-90(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 16:
Asp Ile Val Ile Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly 20 25 30
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala 65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val 100 105 110
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:1797 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
-91(ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 1797 (D) DALŠÍ INFORMACE: jednořetězcová protilátka z vektoru pCIB4631
(Xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. . 17
ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA' GCT GCA GGT 48
Met 1 Gly Trp Ser Trp 5 Ile Phe Leu Phe Leu 10 Leu Ser Gly Ala Ala 15 Gly
GTC CAT TGC CTA CTC GAG GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCT TCT 96
Val His Cys Leu 20 Leu Glu Asp Ile Val 25 Leu Thr Gin Ser Pro 30 Ala Ser
TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC 144
Leu Tkla Val 35 Ser Leu Gly Gin Arg 40 Ala Thr Ile Ser Cys 45 Arg Ala Ser
GAA AGT GTT GAT CAT TAT GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG 192
Glu Ser 50 Val Asp His Tyr Asp 55 Ile Ser Phe Met Asn 60 Trp Phe Gin Gin
AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA 240
Lys 65 Pro Gly Gin Pro Pro 70 Lys Leu Leu Ile Tyr 75 Ala Ala Ser Asn Gin 80
GGA TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288
Gly Ser Gly Val Pro 85 Ala Arg Phe Ser Gly 90 Ser Gly Ser Gly Thr 95 Asp
TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ΑΤΑ TAT 336
Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala 110 Ile Tyr
100 105
TTC TGT CAG CAA AGT AGG GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC 384
Phe Cys Gin 115 Gin Ser Arg Glu Leu Pro 120 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 125
ACG CTG GAA ΑΤΑ AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT AGA TCT GGT GGC 432
Thr Leu Glu 130 Ile Lys Arg Ala Asp Ala 135 Ala Pro Thr Arg Ser 140 Gly Gly
GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG CTC GAG CAG GTC AAA CTG CAG GAG 480
Gly Gly Ser 145 Gly Gly Gly 150 Gly Ser Leu Glu Gin 155 Val Lys Leu Gin Glu 160
TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TCA TGT 528
Ser Gly Gly Gly Leu Val 165 Gin Pro Lys Gly Ser 170 Leu Lys Leu Ser Cys 175
GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC GCC ATG AAC TGG GTC CGC 576
Ala Ala Ser Gly Phe Thr 180 Phe Asn Asn 185 Phe Ala Met Asn Trp 190 Val Arg
CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC ATA AGA AGT AAA 624
Gin Ala Pro 195 Gly Lys Gly Leu Glu Trp 200 Val Ala Arg Ile Arg 205 Ser Lys
AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT TCA GTG AAA GAC AGG TTC 672
Ser Asn Asn 210 Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser 215 Val Lys Asp 220 Arg Phe
ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG TTC TAT CTG CAA ATG AAC 720
Thr 225 Val Ser Arg Asp Asp 230 Ser Gin Ser Met Phe 235 Tyr Leu Gin Met Asn 240
-- AAC TTG AAA Asn Leu Lys ACT GAG Thr Glu 245 GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGG GTA GTA 768
Asp Thr Ala Met Tyr 250 Tyr Cys Val Arg Val Val 255
TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 816
Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
- TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT 864
- Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser
275 280 285
AGA TCT GCT GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC 912
Arg Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
290 295 300
AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC 960
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC 1008
• Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu
325 330 335
TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC 1056
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
- 340 345 350
- GAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG 1104
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
355 360 365
GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT 1152
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
370 375 380
ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG 1200
Thr 385 Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
390 395 400
GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG ACT CCT AAG GTC ACG TGT GTT GTG GTA 1248
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
405 410 415
Μ GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT 1296
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp
- 420 425 430
GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC 1344
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe
435 440 445
AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG GAC 1392
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gin Asp
450 455 460
TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC 1440
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
465 470 475 480
CCT GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA ACC AAA GGC AGA CCG AAG 1488
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
485 490 495
GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT CCA CCT CCC AAG. GAG CAG ATG GCC AAG 1536
Ala Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys
500 505 510
GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC 1584
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
515 520 525
ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG 1632
Ile Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
530 535 540
AAC ACT CAG CCC ATC ATG AAC ACG AAT GGC TCT TAC TTC GTC TAC AGC 1680
Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
545 550 555 560
AAG CTC AAT GTG CAG AAG AGC AAC TGG GAG GCA GGA AAT ACT TTC ACC 1728
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
565 570 575
TGC TCT GTC TTA CAT GAG GGC CTG CAC AAC CAC CAT ACT GAG AAG AGC 1776
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
580 585 590
CTC TCC CAC TCT CCT GGT AAA 1797
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
595
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 18
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:599 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 18:
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15
Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
-9635 40 45
Glu Ser Val Asp His Tyr Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin 50 55 · 60
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gin ' 65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110
Phe Cys Gin Gin Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125
Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Arg Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gin Val Lys Leu Gin Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg 180 185 190
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys 195 200 205
Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe 210 215 220
Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met Phe Tyr Leu Gin Met Asn 225 230 235 240
-9ΊAsn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val 245 250 255
Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser 275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 290 295 300
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu
325 330 335
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 340 345 350
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 355 360 365
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 370 375 380
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
385 390 395 400
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
405 410 415
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 420 425 430
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe
435 440 445
Asn Ser 450 Thr Phe Arg Ser Val Ser 455 Glu Leu Pro Ile Met 460 His Gin Asp
Trp Leu 465 Asn Gly Lys Glu Phe Lys 470 Cys Arg Val Asn Ser 475 Ala Ala Phe 480
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 485 Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 490 495
Ala Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro 500 Pro Pro Lys Glu Gin 505 Met Ala Lys 510
Asp Lys Val 515 Ser Leu Thr Cys Met 520 Ile Thr Asp Phe Phe 525 Pro Glu Asp
Ile Thr 530 Val Glu Trp Gin Trp Asn 535 Gly Gin Pro Ala Glu 540 Asn Tyr Lys
Asn Thr 545 Gin Pro Ile Met Asn Thr 550 Asn Gly Ser Tyr Phe 555 Val Tyr Ser 560
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn 565 Trp Glu Ala Gly Asn 570 Thr Phe Thr 575
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 580 585 Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 595 INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 19: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA:101 párů basí Glu Lys Ser 590
-99(B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE109A28 použitý k přípravě lOlbp dlouhého fragmentu Styl/BglII ve vektoru pCIB4612 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 19:
CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT TCAACAGGAA TGAGTGTTAG G
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 101 párů. basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE110A28 použitý k přípravě lOlbp dlouhého fragmentu Styl/BglII ve vektoru PCIB4612 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 20:
GATCCCTAAC ACTCATTCCT GTTGAAGCTC TTGACAATGG GTGAAGTTGA TGTCTTGTGA GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTTATGTCGT TCATACTCGT C
-100INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:72 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE111A28 použitý k přípravě 71bp dlouhého fragmentu Xhol/Ddelve vektoru pCIB4612 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 21:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG CC
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:71 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE112A28 použitý k přípravě
71bp dlouhého fragmentu Xhol/Ddel ve vektoru pCIB4612 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
TGAGGCACCT CCAGATGTTA ACTGCTCACT GGATGGTGGG AAGATGGATA CAGATCTAGA GCTCGGTACC C
-101INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 23:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:41 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid ΚΕ106Ά28 použitý k
40bp dlouhého fragmentu Xhol/Ncol pCIB4611 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 23:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGCTGCC CAAACTAACT C
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:41 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE107A28 použitý k
40bp dlouhého fragmentu Xhol/Ncol pCIB4611 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 24:
CATGGAGTTA GTTTGGGCAG CAGATCTAGA GCTCGGTACC C přípravě ve vektoru přípravě ve vektoru
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 25:
-102-
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:39 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE108A28 použitý k přípravě
40bp dlouhého fragmentu BstXI/BamHI ve vektoru pCIB4611 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 25:
CTGGTAAAGG CGGCCGCATC GATTAAGTCG ACCCGCGGG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 26:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:47 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE108A28 použitý k přípravě
40bp dlouhého fragmentu BstXI/BamHI ve vektoru pCIB4611 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 26:
GATCCCCGCG GGTCGACTTA ATCGATGCGG CCGCCTTTAC CAGGAGA
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
-103(A) DÉLKA:7 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: rostlinná konvenční sekvence počátku translace pro vektor pCIB4610 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 27:
AACAATG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:7 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: rostlinná konvenční sekvence počátku translace pro vektor pCIB4600 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 28:
TCCGATG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:25 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno
-104(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer KE102A28 použitý pro přípravu 83bp dlouhého fragmentu pro vektor pCIB4610 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 29:
CGAAGTTAAC AGATCTAGAG CTCGG
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:32 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer KE101A28 použitý pro přípravu 83bp dlouhého fragmentu pro vektor pCIB4610 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 30:
CGGGATCCAA CAATGGGATG GAGCTGGATC TT
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:164 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
-105 (A) POPIS: oligonukleotid kódující signální peptid pro endoplazmatické retikulum, viz Kabat a další 1987 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 31:
GATCCAACAA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC TGTCAGTTGT
TACCCTACCT CGACCTAGAA AGAGAAGGAG GACAGTGGAG CTGCAGGTGT CCATTGCCTA CTCGAGGGTA CCGAGCTCCT CGACGTCCAC AGGTAACGGA TGAGCTCCGA TGGC
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 32 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: doména (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 10 (D) DALŠÍ INFORMACE: 10 aminokyslein dlouhý linker spojující lehký a těžký Fv fragment (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 32:
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
-106-
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 33 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:36 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE147A28 použitý při přípravě bp dlouhého linkeru pro vektor pCIB4631 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 33:
GATCTGGTGG CGGTGGCTCG GGCGGTGGTG GGTCGC
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 34:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:36 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) •TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonukleotid KE182A28 použitý při přípravě bp dlouhého linkeru pro vektor pCIB4631 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 34:
TCGAGCGACC CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCA
-107INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 35:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:26 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC200použitý pro přípravu 700bp dlouhého fragmentu obsahujícího kódující sekvenci jednořetězcové protilátky 3B1 pro fúzi s PE40 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 35:
CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 36:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:36 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC202použitý pro přípravu 700bp dlouhého fragmentu obsahuj íclásaluj ící sekvenci jednořetězcové protilátky 3B1 pro fúzi s PE40 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 36:
GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGAGACGGT GACTGA
-108-
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. C. 37 :
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:29 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: jedno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC92 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 37:
GTCTCGAGGA YATYSWGMTS ACCCARTCT
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 38:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů basi (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC130 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 38:
GCAGATCTAG TTGGTGCAGC ATCAGCCCG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 39:
-109(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC91 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 39:
GTCTCGAGCA GGTSMARCTG CAGSAGTCWG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 40:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů basí
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) POČET VLÁKEN: j edno
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC114 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 40:
GCAGATCTAG ATCCAGGGGC CAGTGGATA
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 41:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina
110 (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC111 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 41:
GCAGATCGGC AGGAGACGAG GGGGAAGACA TT
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 42:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 29 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer NC117 použitý pro amplifikaci genů protilátek (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 42:
GCAGATCTGC AGCCAGGGAC CAAGGGATA
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 43:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
-111(ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (v) TYP FRAGMENTU: interní (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: doména (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 22 (D) DALŠÍ INFORMACE: alternativní doménový linker lehkým a těžkým Fv fragmentem.
(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 43:
Gly Pro Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro 15 10 15
Thr Pro Ser Gly Pro Gly 20
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 44:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA:357 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:! až 357 mezi
-112(D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast těžkého řetězce protilátky 14G1 z vektoru pCIB4635
(xi) POPIS SEKVENCE ID. Č. 44 :
GAG GTG AAG CTT GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn
1 5 10 15
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GTT ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAC 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GCT GTA ATT ACA CTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA ACA ATT TAT GCA GAA 192
Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu
50 55 60
TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATT TCA AGA GAA GAT TCA GAA AGC AGC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser
65 70 75 80
ATC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 288
Ile Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
TAC TGT AGT AGA GGT AGT GAC TGG GGA TTT CCT TAT TGG GGG CAA GGG 336
Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100
105
110
-113ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
357
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 45:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 119 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 45:
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser
65 70 75 80
Ile Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100
105
110
-114Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
INFORMACE 0 SEKVENCI ID. Č. 46:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 339 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ:1 až 339 (D) DALŠÍ INFORMACE: variabilní oblast lehkéfietězce protilátky 14G1 z vektoru pCIB4636 (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 46:
- GAT Asp 1 ATT Ile GTG ATG ACC Thr 5 CAG Gin TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GCA GGA 48
Val Met Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Val Ser Ala 15 Gly
GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTA AAT AGT 96
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
-115-
GGA AAT CAA Gly Asn Gin AAG Lys CAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGC CAG 144
His Tyr Leu Ala 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
35
CCT CCT AAA CTG TTG ATC TAC GGG GCA TCC ACT AGG GAA TCT GGG GTC 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGG TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CGT AGT TAT CCG TTC ACA TTC GCC TCG GGG ACA AAG TTG GAA ATA 336
Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Ala Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
AAA 339
Lys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 47:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 113 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 47:
-116Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
5 10 15
Glu Lys Val Thr 20 Met Asn Cys Lys Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 Asn Ser
Gly Asn Gin 35 Lys His Tyr Leu Ala 40 Trp Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
Pro Pro 50 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly 55 Ala Ser Thr Arg 60 Glu Ser Gly Val
Pro 65 Asp Arg Phe Thr Gly 70 Ser Gly Ser Gly Thr 75 Asp Phe Thr Leu Thr 80
Ile Ser Ser Val Gin 85 Ala Glu Asp Leu Ala 90 Val Tyr Phe Cys Gin 95 Asn
Asp Arg Ser Tyr 100 Pro Phe Thr Phe Ala 105 Ser Gly Thr Lys Leu 110 Glu Ile
Lys
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 48:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer DB91 použitý pro amplifikaci protilátek genů
-117(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 48:
ACGTCTCGAG GARGTGAAGC TKRWKGARWC TG
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 49:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů basí (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: PCR primer DB91 použitý pro amplifikaci genů protilátek (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 49:
CAATTCGCAT ATGAGATCCA GGGGCCAGTG GATA
-118rfWr-

Claims (6)

  1. PATENTOVÉNÁROKY
    1. Protilátka nebo její fragment vyznačuj ící se tím, že se váže na střevo cílového hmyzu, ale neváže se na membrány savčího kartáčového lemu ani na rostlinné mikrosomy.
  2. 2. Protilátka podle nároku 1 vyznačující se tím, že jde o monoklonální protilátku nebo její fragment.
  3. 3. Monoklonální protilátka nebo její fragment podle nároku 2 vyznačující se tím, že se váže na membrány kartáčového lemu hmyzu.
  4. 4. Monoklonální protilátka podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že cílový hmyz hmyz náleží do
    Hymenoptera,
    Hemiptera, jednoho z řádů Coleoptera, Diptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera,
    Isoptera, Anoplura, Siphanptera a Trichoptera.
  5. 5. Monoklonální protilátka podle nároku 4 vyznačující se tím, že cílový hmyz je Diabrotica virgifera.
    Monoklonální protilátka vyznačující se t tvořené protilátkami 2B5, 3B1, podle nároku 5 í m , že patří do skupiny
    10B6, 17F6, 14G1 16E4.
    Sekvence DNA vyznačující se kóduje monoklonální protilátku podle z nároků 2 až 6 nebo vazebné místo této tím, že libovolného monoklonální protilátky.
    -1198. Sekvence DNA podle nároku 7 vyznačující se tím, že je vybrána ze skupiny tvořené Sekvencemi id.
    č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 44 a 46. 9. Sekvence DNA podle nároku 7 nebo 8 v y z n ačující se tí m , že je operativně spoj ená se sekvencí DNA kódující molekulu toxinu. 10. Sekvence DNA podle nároku 9 v y z n ačující se tím, že toxinová molekula je vybrána ze skupiny tvořené toxiny bakterií Bacillus, exotoxiny bakterií
    Pseudomonas, phylotaccinem, geloninem, ribonukleázami a proteiny inaktivujícími ribosomy.
    11. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 7 až 10 vyznačující se tím, že tato DNA je součástí rostlinného genomu.
    12. Hybridní molekula toxinu vyznačující se tím, že obsahuje protilátku, která se váže na střevo cílového hmyzu, ale neváže se na membrány savčího kartáčového lemu ani na rostlinné mikrosomy, operativně navázanou na toxinovou skupinu.
    13. Hybridní molekula toxinu vyznačující se tím, že sestává z monoklonální protilátky nebo z vazebného fragmentu monoklonální protilátky podle nároku 2 a z toxinové skupiny, která je na ni operativně navázána.
    14. Hybridní molekula toxinu podle nároku 12 nebo 13 vyznačující se tím, že toxinová skupina je vybrána ze skupiny tvořené toxiny bakterií Bacillus, exotoxiny bakterií Pseudomonas, phylotaccinem,
    -120geloninem, ribonukleázami proteiny inaktivujícími ribosomy.
    15. Hybridní molekula toxinu podle nároku 14 vyzná č u j ící se tím , že toxin bakterií Bacillus je vybrán ze skupiny tvořené endotoxiny bakterií Bacillus a vegetativními insekticidními proteiny. 16. Hybridní molekula toxinu podle nároku 15 vyzná č u j ící se tím , že toxin bakterií Bacillus je Bt endotoxin. 17. Hybridní molekula toxinu podle nároku 12 vyzná č u j ící se tím, že monoklonální
    protilátka je protilátka podle libovolného z nároků 2 až
  6. 6.
    18. Hybridní molekula toxinu podle nároku 17 vyznačující se tím, monoklonální protilátka je protilátka, nebo její vazebná oblast, se váže na membrány kartáčového lemu hmyzu.
    19. Hybridní molekula toxinu podle nároku 18 vyznačující se tím, monoklonální protilátka je protilátka je vybrána ze skupiny tvořené protilátkami 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 a 16E3.
    20. Sekvence DNA kódující hybridní molekulu toxinu podle libovolného z nároků 12 až 19.
    21. Sekvence DNA podle nároku 20 vyznačuj ící tím, že je součástí rostlinného genomu.
    -12122.
    Sekvence sestává sekvenci
    DNA vyznačující se tím, ze z první expresivní kazety, která obsahuje DNA kódující promotor umožňující expresi v rostlinách a dále pak operativně navázanou sekvenci DNA kódující lehký řetězec monoklonální protilátky nebo vazebnou doménu uvedené monoklonální protilátky, přičemž tato protilátka je schopna se vázat na střevo cílového hmyzu.
    23. Sekvence DNA podle nároku 22 vyznačující se tím, že kazeta dále obsahuje sekvenci DNA kódující toxinovou skupinu operativně spojenou se sekvencí DNA kódující lehký řetězec monoklonální protilátky nebo vazebné domény protilátky.
    Sekvence DNA vyznačující se tím, že obsahuje druhou expresivní kazetu sestávající z DNA kódující promotor umožňující expresi v rostlinách operativně spojenou s další sekvencí DNA, která kóduje těžký řetězec monoklonální protilátky nebo její vazebné domény, přičemž je tato monoklonální protilátka schopna vazby na střevo cílového hmyzu.
    25. Sekvence DNA podle nároku 24 vyznačující se tím, že kazeta dále obsahuje sekvenci DNA kódující toxinovou skupinu operativně spojenou se sekvencí DNA kódující těžký řetězec monoklonální protilátky nebo vazebné domény protilátky.
    26. Sekvence DNA podle libovolného z nároků 22 až 25 vyznačující se tím, že dále obsahuje terminační sekvenci funkční v rostlinách.
    -12227. Sekvence DNA podle nároku 23 nebo 26 vyznačující se tím, že toxinová skupina patří mezi toxiny bakterií Bacillus, exotoxiny bakterií Pseudomonas, phylotaccin nebo ribonukleázy.
    28. Sekvnece podle libovolného z nároků 22 až 27 vyznačující se tím, že je tato DNA součástí rostlinného genomu.
    29. Rostlinná buňka transformovaná sekvencí DNA podle libovolného z nároků 7 až 11 a 20 až 21.
    30. Rostlinná buňka transformovaná sekvencí DNA podle libovolného z nároků 22 až 28.
    31. Rostlina a její potomstvo vyznačující se tím, že byla transformována sekvencí DNA podle libovolného z nároků 7 až 11 a 20 až 21.
    32. Rostlina a její potomstvo- vyznačující se tím, že byla transformována sekvencí DNA podle libovolného z nároků 20 až 28.
    33. Rostlina a její potomstvo vyznačující se tím, že exprimují monoklonální protilátku podle libovolného z nároků 1 až 6.
    34. Rostlina a její potomstvo vyznačující se tím, že exprimují hybridní molekulu toxinu podle libovolného z nároků 12 až 19.
    35. Rostlina podle libovolného z nároků 31 až 34 vyznačující se tím, že jde o kukuřici.
    -12336. Rostlina podle libovolného z nároků 31 až 35 vyznačující se tím, že jde o hybridní rostlinu.
    37. Rostlinný materiál sloužící k rozmnožování podle libovolného z nároků 31 vyznačující se tím, že ochraným povlakem.
    rostliny až 36 byl ošetřen
    38. Rostlinný materiál sloužící k rozmnožování podle nároku 37 vyznačující se tím, žek ošetření bylo použito přípravku vybraného ze skupiny tvořené herbicidy, insekticidy, nematocidy, prostředky na směsmi.
    fungicidy, baktericidy, hubení měkkýšů a jejich
    39. Rostlinný materiál sloužící k rozmnožování podle nároku 37 nebo 38 vyznačující se tím, že sestává ze semen.
    40. Rekombinantní mikroorganismus vyznačuj ící se tím, že byl transformován alespoň jednou ze sekvencí DNA podle libovolného z nároků 7 až 11 a 20 až . 21.
    41. Rekombinantní mikroorganismus vyznačuj ící se tím, že byl transformován alespoň jednou z izolovaných sekvencí DNA podle libovolného z nároků 22 až 28 .
    42. Rekombinantní mikroorganismus vyznačuj ící se tím, že obsahuje alespoň jednu molekulu DNA kódující hybridní molekulu toxinů sestávající z protilátky nebo jejího fragmentu schopného vazby na střevo cílového hmyzu, ale přitom se neváže na membrány
    -124kartáčového lemu savců nebo na rostlinné mikrosomy, a která je operativně spojená s toxinovou skupinou, přičemž uvedená sekvence DNA kódující protilátku obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny tvořené Sekvencemi id. č. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 44 a 46.
    43. Rekombinantní mikroorganismus podle nároků 40 až 42 vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny tvořené bakteriemi jako jsou bakterie Bacillus, Bacillus, Caulobacter, Agmenellum, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, a zvláště pak kvasinky jako jsou Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporbolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium a viry jako je jaderný polyhedrální virus Autographica californica
    44. Insekticidní kompozice vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní mikroorganismus podle libovolného z nároků 40 až 43 v insekticidně účinném množství spolu s vhodným nosičem.
    45. Insekticidní kompozice vyznačující se tím, že obsahuje hybridní molekulu toxinu podle libovolného z nároků 12 až 19 v insekticidně účinném množství spolu s vhodným nosičem.
    46. Rostlinný materiál sloužící k rozmnožování rostliny vyznačující se tím, že byl ošetřen insekticidní kompozicí podle libovolného z nároků 44 až 45.
    -12547. Rostlinný materiál sloužící k rozmnožování rostliny podle nároku 46 vyznačující se tím, že jde o rostlinná semena.
    48. Způsob trvalé transformace hostitelského organismu vyznačující se tím, že dojde k vložení sekvence DNA podle libovolného z nároků 7 až 10, 21, 23 až 25 a 27 až 29 do genomu tohoto hostitelského organismu.
    Způsob tím, podle nároku 33 vyzná že hostitelský organismus je čující se mikroorganismus.
    Způsob podle nároku 33 vyznačující se tím, že hostitelský organismus je rostlina.
    51. Způsob přípravy hybridomatické buněčné linie produkující protilátku nebo monoklonální protilátku podle nároku 1 vyznačující se tím, že se
    a) jako antigenu použijí střeva hmyzu, zejména pak membrány kartáčového lemu
    b) tímto antigenem imunizuje zvířecí příjemce
    c) z příjemce izolují imunokompetentní B-lymfocyty
    d) tyto imunokompetentní B-lymfocyty zfúzují s tumorovou buněčnou linií, která je schopna kontinuálního buněčného dělení.
    e) izoluje vzniklý fúzní produkt, kultivuje se ve vhodném kultivačním mediu a poté se klonují pozitivní hybridní buňky.
    f) testují klonované hybridní buňky na produkci
    -126protilátek a vyberou se takové, které vykazují požadované vlastnosti.
    52. Způsob konstrukce hybridních molekul protilátka-toxin podle nároku 11 až 20 vyznačující se tím, že se klonuje variabilní oblast protilátky a tato oblast se poté spojí s toxinovou skupinou.
    53. Způsob produkce monoklonální protilátky nebo jejích fragmentů schopných vazby na vezikuly membrány kartáčového lemu hmyzího střeva vyznačuj ící se tím, že se ve vhodném kultivačním mediu in vivo nebo in vitro kultivují hybridomatické buněčné linie produkující tyto protilátky a poté se izolují vzniklé protilátky.
    54. Způsob produkce sekvence DNA kódující monoklonální protilátku podle nároku 1 vyznačující se tím, že se klonují příslušné geny protilátky z hybridomatické buněčné linie za pomoci primerů ke konzervovaným sekvencím DNA v konstantních oblastech a v úsecích základní struktury variabilních oblastí.
    55. Hybridomatické buněčná linie vyznačující se tím, že produkuje protilátku podle libovolného z nároků 2 až 6.
    56. Hybridomatické buněčné linie podle nároku 55 uložené pod přístupovými čísly HB 11616, HB 11617, HB 11618, HB11619 a HB 11620 u ATCC.
CZ963821A 1994-06-28 1995-06-20 Protilátky, které se vážou na proteiny přítomné na střevech hmyzu a jejich využití CZ382196A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26764194A 1994-06-28 1994-06-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ382196A3 true CZ382196A3 (cs) 1998-03-18

Family

ID=23019624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ963821A CZ382196A3 (cs) 1994-06-28 1995-06-20 Protilátky, které se vážou na proteiny přítomné na střevech hmyzu a jejich využití

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5686600A (cs)
EP (1) EP0804579A1 (cs)
JP (1) JPH11505401A (cs)
CN (1) CN1151759A (cs)
AU (1) AU696661B2 (cs)
BG (1) BG101171A (cs)
BR (1) BR9508154A (cs)
CA (1) CA2193859A1 (cs)
CZ (1) CZ382196A3 (cs)
EE (1) EE9600192A (cs)
HU (1) HUT76089A (cs)
MX (1) MX9700007A (cs)
NZ (1) NZ287124A (cs)
PL (1) PL318164A1 (cs)
SK (1) SK166996A3 (cs)
WO (1) WO1996000783A1 (cs)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6403371B1 (en) * 1996-02-08 2002-06-11 Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung Cassettes for the expression of storable proteins in plants
IL132039A0 (en) * 1997-04-03 2001-03-19 Novartis Ag Plant pest control
US7011835B1 (en) 1997-07-10 2006-03-14 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US6013510A (en) * 1997-09-25 2000-01-11 Becton, Dickinson And Company Identification of a DNA region potentially useful for the detection of Mycobacterium kansasii
US7250494B2 (en) * 1998-06-15 2007-07-31 Biosynexus Incorporated Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
CA2331921A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. A novel invertebrate intestinal mucin cdna and related products and methods
US6187558B1 (en) 1998-06-24 2001-02-13 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Invertebrate intestinal mucin cDNA and related products and methods
ES2246093T3 (es) * 1998-10-16 2006-02-01 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Patogenicida molecular que induce una resistencia a la enfermedad en las plantas.
AU2001236806A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-20 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US9522217B2 (en) 2000-03-15 2016-12-20 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
US7465790B2 (en) * 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
WO2002030460A2 (en) 2000-10-09 2002-04-18 Isis Innovation Ltd. Therapeutic antibodies
US6716421B2 (en) 2001-03-05 2004-04-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
US7030156B2 (en) 2001-03-05 2006-04-18 University Of Florida Research Foundation, Inc Devices and methods for eliminating termite colonies
US6969512B2 (en) 2001-03-05 2005-11-29 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
CA2441808A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-03 Syngenta Participations Ag Insect nuclear receptor genes and uses thereof
GB0119274D0 (en) * 2001-08-08 2001-10-03 Univ Durham Fusion proteins for insect control
US20040052779A1 (en) * 2001-12-21 2004-03-18 Stinson Jeffrey R. Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US20040016004A1 (en) * 2002-04-01 2004-01-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 238P1B2 useful in treatment and detection of cancer
US7531522B2 (en) 2002-04-22 2009-05-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Antibodies, recombinant antibodies, recombinant antibody fragments and fusions mediated plant disease resistance against fungi
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
TW200605910A (en) 2004-04-30 2006-02-16 Orbus Medical Technologies Inc Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
CA2623329A1 (en) * 2005-10-13 2007-04-19 Virexx Medical Corp. Chimeric antigen containing hepatitis c virus polypeptide and fc fragment for eliciting an immune response
CA2684617C (en) * 2007-04-21 2014-07-08 Manuel Gidekel Biofertilizer formulation
US7879326B2 (en) * 2007-06-15 2011-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human neutralizing monoclonal antibodies to H5N1 influenza A virus
CA2705289A1 (en) * 2007-11-13 2009-05-22 The Scripps Research Institute Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3415010A1 (en) 2017-06-13 2018-12-19 Agrosavfe Nv Insect-controlling polypeptides and methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
US5196320A (en) * 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
US5202422A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
EP0438312A3 (en) * 1990-01-19 1992-07-01 Merck & Co. Inc. Recombinant human anti-cd18 antibodies
US5143905A (en) * 1990-05-03 1992-09-01 The Regents Of The University Of California Method and means for extending the host range of insecticidal proteins
US5665595A (en) * 1991-06-07 1997-09-09 Dowelanco Immunoglobulins against insect tissue
EP0526397B1 (de) * 1991-07-25 1996-01-17 Ciba-Geigy Ag Immunologisches Nachweisverfahren

Also Published As

Publication number Publication date
BG101171A (bg) 1997-10-31
HUT76089A (en) 1997-06-30
EE9600192A (et) 1997-06-16
MX9700007A (es) 1997-04-30
US6069301A (en) 2000-05-30
CA2193859A1 (en) 1996-01-11
PL318164A1 (en) 1997-05-26
BR9508154A (pt) 1998-07-14
AU2573595A (en) 1996-01-25
SK166996A3 (en) 1997-08-06
WO1996000783A1 (en) 1996-01-11
NZ287124A (en) 1999-04-29
EP0804579A1 (en) 1997-11-05
CN1151759A (zh) 1997-06-11
JPH11505401A (ja) 1999-05-21
AU696661B2 (en) 1998-09-17
US5686600A (en) 1997-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ382196A3 (cs) Protilátky, které se vážou na proteiny přítomné na střevech hmyzu a jejich využití
RU2196824C2 (ru) Новые пестицидные протеины и штаммы
JP4389075B2 (ja) 広域スペクトルのデルタ−エンドトキシン
US6172281B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding BT insecticidal crystal proteins
KR101156893B1 (ko) 살충 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들
US6291156B1 (en) Plant pest control
US8569583B2 (en) Secreted insecticidal protein and gene compositions from Bacillus thuringiensis and uses therefor
MXPA99009043A (en) Plant pest control
UA75317C2 (uk) Виділений і очищений кристалічний білок bacillus thuringiensis, композиція кристалічного білка, очищений сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб застосування сегмента нуклеїнової кислоти, що кодує кристалічний білок, спосіб виявлення послідовності нуклеїнових кислот, що кодує кристалічний білок, очищене антитіло, генероване шляхом використання кристалічного білка, штам клітин bacillus thuringiensis, що містить сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує кристалічний білок, спосіб одержання кристалічного білка, інсектицидна композиція, яка містить кристалічний білок
US7019197B1 (en) Pesticidal fusions
US5665595A (en) Immunoglobulins against insect tissue
US6855873B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
US11761015B2 (en) Binary insecticidal Cry toxins
HK1008050B (en) Prevention of resistance development against bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic