ES2246093T3

ES2246093T3 - Patogenicida molecular que induce una resistencia a la enfermedad en las plantas.

Info

Publication number: ES2246093T3
Application number: ES99970685T
Authority: ES
Inventors: Rainer Fischer; Stefan Schillberg; Jorg Nahring; Markus Sack; Michael Monecke; Yu-Cai Liao; Holger Spiegel; Sabine Zimmerman; Neil Emans; Achim Holzem
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: EP1123398B1; CA2345903A1; WO2000023593A2; DE69926647T2; US6825325B1; EP1123398A2; DE69926647D1; WO2000023593A3; ATE301715T1; BR9915543A; CA2345903C

Abstract

Una proteína de fusión que comprende (a) al menos un dominio de unión que comprende un anticuerpo o un sitio de unión del mismo que reconoce específicamente un epítopo de un patógeno vegetal; y (b) una secuencia de localización en la membrana y/o una unidad que conduce al anclaje en la membrana y, opcionalmente, una secuencia de redireccionamiento celular.

Description

Patogenicida molecular que induce una resistencia a la enfermedad en las plantas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a constructos génicos adecuados para expresar agentes para proteger una planta frente a patógenos y a las proteínas adecuadas para semejante protección vegetal. Estos agentes son denominados "patogenicidas moleculares". Esta invención está relacionada con el diseño genético de plantas y con los medios y métodos para conferir resistencia a patógenos a una planta utilizando uno o varios genes que codifican: un anticuerpo específico del patógeno y un anticuerpo específico del patógeno incluyendo una actividad tóxica que bloquea las fases del ciclo vital del patógeno, la replicación del patógeno o el movimiento del patógeno dentro de la planta o la transmisión del patógeno de planta a planta. Se proporcionan los medios y métodos para la inmovilización de anticuerpos recombinantes, proteínas de fusión de anticuerpos y complejos anticuerpo-proteína en las membranas celulares en diferentes orientaciones y la presentación de proteínas recombinantes sobre la membrana celular de la planta. En esta invención también se describen métodos novedosos y parejas de unión a proteínas para ensamblar los complejos de proteína a partir de cadenas polipeptídicas individuales durante la expresión de estas proteínas in vivo. Asimismo se dan los métodos para la activación de los patogenicidas moleculares mediante escisión proteolítica in vivo.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades de las plantas constituyen una amenaza principal y en curso para las provisiones alimenticias humanas y el alimento de animales. La mayoría de las plantas de cultivo están regularmente expuestas a uno o más patógenos y pueden causar un daño increíble dando como resultado pérdidas económicas sustanciales todos los años. El ataque por patógenos, tales como virus, bacterias, hongos, nematodos e insectos es un grave problema económico, que golpea a todos los cultivos económicamente importantes, por ejemplo el arroz, la soja, la batata, el trigo, la patata, el pomelo, el maíz y las plantas ornamentales. Las actuales medidas protectoras se sustentan firmemente en las medidas de control químico para los vectores patógenos, que tienen consecuencias medioambientales no deseables. Un enfoque más eficaz para proteger las plantas del ataque de patógenos consiste en crear plantas que sean endógenamente resistentes a los patógenos. Sin embargo, los criadores de plantas tienen fuentes limitadas de genes de resistencia frente a las enfermedades vegetales. Esto se puede lograr ahora utilizando técnicas de ingeniería genética, proporcionando a la planta la información genética requerida para afectar a los patógenos y para que sean resistentes a la enfermedad causada por el patógeno. Por ejemplo, en el caso de un patógeno viral, la planta huésped es resistente si tiene la capacidad de inhibir o retardar la replicación de un virus, los síntomas de la infección viral o el ciclo vital del virus, incluyendo su transmisión. "Resistente" es lo contrario de "susceptible" y se puede ser dividir en tres niveles:

1) Resistencia Completa,

2) Media,

3) Parcial.

Una planta puede ser considerada completamente resistente cuando no muestra síntomas de infección y no hay evidencia de replicación o reproducción del patógeno. La planta huésped puede ser resistente al establecimiento de la infección, a la reproducción del patógeno y/o al movimiento y la transmisión del patógeno.

En los últimos años, los avances en virología molecular vegetal han intensificado el conocimiento de la organización del genoma del patógeno y de la función génica. Por otra parte, la ingeniería genética de las plantas para la resistencia a los virus ha proporcionado recientemente nuevas estrategias para el control de las enfermedades virales (Baulcombe, 1994), (Gadani y col., 1990), (Wilson, 1993). Los siguientes genes fueron expresados en plantas transgénicas con el fin de conferir resistencia: proteínas de la envuelta viral, proteínas no estructurales de los genomas virales, transcritos anti-sentido virales, ARN satélites virales, genes de ribozimas e interferón (Baulcombe, 1994), (Gadani y col., 1990), (Wilson, 1993), Harrison y col., (1987), (Namba y col., 1991), (Anderson y col., 1992). Aunque la mayor parte de estos enfoques han sido eficaces para atenuar infecciones, la resistencia no era completa y estaba confinada a un pequeño espectro de patógenos virales (Falk y Bruening, 1994), (Wilson, 1993) y comporta riesgos significativos (Palukaitis y Roossinck, 1996).

Las principales desventajas de estos métodos son:

1): La gama de huésped es limitada.

2): la gama de patógeno es limitada.

3): la resistencia es parcial y aunque los síntomas sean retardados la infección todavía produce la enfermedad.

4): La resistencia se puede romper en caso de resistencia mediada por proteínas de la envuelta y resistencia mediada por ribozimas.

5): La expresión de las proteínas virales puede conducir a una actividad intensificada del patógeno. Por ejemplo, en el caso de la resistencia mediada por proteínas de la envuelta viral, se puede producir la encapsidación cruzada de cepas no patógenas suaves de virus por la proteína de la envuelta expresada lo que conduce después al desarrollo de una enfermedad más grave.

Una vía alternativa para proteger las plantas de la infección por patógenos es la generación y la expresión de anticuerpos recombinantes (rAb), que a menudo son referidos como "planticuerpos" (anticuerpos producidos por plantas transgénicas). Los anticuerpos recombinantes específicos de los patógenos dirigidos a diferentes compartimentos de células vegetales o diferentes órganos vegetales superan muchos de los problemas mencionados antes y confieren un espectro más amplio de resistencia a las enfermedades (Baulcombe, 1994). Para lograr esto, se tienen que generar anticuerpos recombinantes (Plückthun, 1991), (Winter y Milstein, 1991) contra las proteínas diana clonando los correspondientes genes de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo a partir de células de hibridoma, de bancos de presentación en fagos o de presentación en ribosomas sintéticos, semisintéticos e inmunocompetentes; o mediante la generación de anticuerpos diseñadores completamente sintéticos. Esto está seguido de la posterior modificación y expresión de rAb en diferentes compartimentos de huéspedes heterólogos tales como bacterias, levaduras, algas, células de insectos infectadas por baculovirus, células de mamíferos y plantas. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos y proteínas de fusión con anticuerpos que se unen a dominios funcionales conservados de proteínas de la envuelta viral, proteínas del movimiento, replicasas o factores de transmisión para inactivar tales dianas dentro o fuera de la célula vegetal a través de la inmunomodulación. La posibilidad de expresar anticuerpos recombinantes (Plückthun, 1991), (Winter y Milstein, 1991) para la generación de resistencia ha sido demostrada recientemente tanto para virus de animales (Chen y col. (1994), (Duan y col., 1994), (Marasco y col., 1993) como de plantas (Tavladoraki y col., 1993), (Voss y col., 1995), (Zimmermann y col., 1998). Los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla derivados de anticuerpos monoclonales (scFv) (Bird y col., 1988) dirigidos contra Rev (Duan y col., 1994) y gp120 (Chen y col., 1994) (Marasco y col., 1993) de VIH, inhibían la replicación del VIH, el ensamblaje del virión y la formación de sincitios cuando eran expresados intracelularmente, o dentro del RE de células humanas.

Interesantemente, la expresión intracelular de un scFv específico para la proteína de la envuelta del virus del moteado-rizado de la alcachofa en Tabaco transgénico causaba una reducción de la infección y retardaba el desarrollo de los síntomas (Tavladoraki y col., 1993). El redireccionamiento de anticuerpos de tamaño normal específicos del TMV al espacio intercelular de las plantas de Tabaco inhibía las infecciones virales hasta el 70% (Voss y col., 1995). En el último caso, los anticuerpos producidos por la planta mostraban la misma especificidad y afinidad por el TMV (Fischer y col., 1998) que el anticuerpo murino de origen. La expresión citosólica de un scFv diseñado derivado de este anticuerpo anti-TMV rendía plantas de tabaco totalmente resistentes, incluso en condiciones de infección sistémica (Zimmermann y col., 1998). Estos estudios demuestran el potencial de los anticuerpos recombinantes expresados heterólogamente para combatir patógenos vía modulación intra- o extra-celular de proteínas patógenas.

Las células vegetales pueden sintetizar grandes cantidades de anticuerpos que son funcionalmente indistinguibles del monoclonal de origen. Por ejemplo los anticuerpos completos (Düring y col., 1990), (Hiatt y col., 1989), (Voss y col., 1995), los fragmentos Fab (De Neve y col., 1993), los scFv (Owen y col., 1992; Zimmermann y col., 1998), (Tavladoraki y col., 1993), las proteínas de fusión de scFv (Fischer y col., 1999) y los dAb (Benvenuto y col., 1991) han sido expresados con éxito en Tabaco, Patata (Schouten y col., 1997) o Arabidopsis, alcanzando niveles de expresión tan altos como el 6,8% de la proteína total (Fiedler y col., 1997). El redireccionamiento de anticuerpos recombinantes explotando las secuencias señal del tráfico de proteínas conocidas permite ahora la expresión de rAb en el citoplasma (fragmentos scFv (Tavladoraki y col., 1993; Zimmermann y col., 1998)), el retículo endoplásmico (Fiedler y col., 1997), los cloroplastos (Düring y col., 1990) y el espacio intercelular (Benvenuto y col., 1991; De Neve y col., 1993; Voss y col., 1995); Zimmermann y col., 1998) (fragmentos Fab de tamaño normal, scFv y Abs de dominio individual). Estos resultados demuestran la flexibilidad del sistema vegetal para expresar cualquier anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo recombinante en casi todos los compartimentos vegetales, utilizando secuencias dirigidas que también pueden ser de plantas o derivadas de otros eucariotas.

La ventaja de la expresión de proteínas dirigida es que los rAb pueden ser expresados donde el patógeno es más vulnerable y donde tengan el máximo efecto protector. En WO 96/00783 y WO 95/11305 se describe una proteína de fusión que consta de un dominio de unión (v.g. un anticuerpo o la endotoxina \delta-endotoxina Bt) fusionado a un dominio tóxico (v.g. una enzima tóxica o un veneno) que es tóxico o perjudicial para un patógeno. En la solicitud de Patente WO 96/09398 se propone la utilización de proteínas de fusión a anticuerpos como agentes para controlar enfermedades de cultivos causadas por patógenos.

El anticuerpo libera una toxina que elimina el patógeno en las plantas transgénicas o cuando es expresado o aplicado como inmunotoxina externa. WO 96/09398 está enfocada a proteínas de fusión con Ab recombinante - polipéptidos individuales que están ligados genéticamente, químicamente o "bioquímicamente" para formar una inmunotoxina. Sin embargo, en WO 96/09398 no se proporciona ninguna prueba o principio para la resistencia mediada por anticuerpos y es dudoso que cualquiera de los hipotéticos ejemplos de WO 96/9398 funcione hasta el punto de que se pueda obtener una protección de las plantas frente al ataque por patógenos suficiente para ajustarse a las necesidades de los criadores y granjeros. Así, todavía existe la necesidad de medios y métodos para conferir características antipatógenas/predadoras a las plantas transgénicas.

Compendio de la invención

El objetivo de la presente solicitud de patente es proporcionar medios y métodos para proteger plantas, en particular cultivos agrícolas de monocotiledóneas y dicotiledóneas y plantas ornamentales, frente a los patógenos de una manera más eficaz y más sensible desde el punto de vista medioambiental. Por consiguiente, la solución al problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Como se describirá más abajo, el objetivo antes mencionado se satisface según la invención mediante cualquiera de las siguientes o de cualquier combinación de las siguientes invenciones: i) la expresión de anticuerpos recombinantes específicos para patógenos y de partes de los mismos, o ii) mediante la fusión de anticuerpos o partes de los mismos a toxinas, proteínas, o enzimas que tengan actividad frente a los patógenos o a las partes efectivas de estas toxinas o enzimas, y mediante la expresión después de estas proteínas de fusión, o iii) mediante el ensamblaje de complejos de proteínas compuestos por un anticuerpo o fragmento del mismo utilizando in vivo las proteínas de fusión novedosas descritas aquí o iv) incluyendo una secuencia sensible a una proteasa específica, que es escindida (v.g. en presencia del patógeno o en un compartimento celular vegetal específico) para liberar y/o activar la actividad tóxica de cualquiera de las proteínas recombinantes de i) a iii), y v) dirigiendo cualquiera de las proteínas recombinantes de i) a iv) a membranas celulares o integrándolas en ellas en cualquier orientación. Estos agentes también son denominados "patogenicidas moleculares". Así, en un aspecto la presente invención hace referencia a una proteína de fusión que comprende

a): al menos un dominio de unión que comprende un anticuerpo o un sitio de unión del mismo que reconoce específicamente un epítopo de un patógeno vegetal; y

b): una secuencia de localización en la membrana y/o una unidad que conduce al anclaje en la membrana y, opcionalmente, una secuencia de redireccionamiento celular.

En un aspecto adicional, dicha proteína de fusión comprende al menos un dominio adicional que comprende una proteína o secuencia peptídica que es tóxica para el patógeno o perjudicial para su replicación, transmisión o ciclo celular.

Dichos dominios pueden estar conectados mediante enlaces covalentes o no covalentes. En una realización preferida de la proteína de fusión de la invención, dicho dominio de unión comprende un anticuerpo, un receptor de las células T, un receptor específico de patógenos, un péptido específico para un epítopo de un patógeno, o al menos el sitio de unión de cualquiera de ellos.

En otro aspecto, la invención se refiere a dominios de unión asociados a la membrana y otros dominios, respectivamente, como se ha definido aquí.

Las proteínas de fusión compuestas por anticuerpos específicos de patógenos y moléculas de toxina pueden ser elaboradas fusionando las respectivas partes mediante medios genéticos o bioquímicos. Además, la proteína quimérica puede ser ensamblada preferiblemente in vivo a partir de sus partes por la planta o por medio de la expresión en la maquinaria de proteínas endógenas de los organismos. Estos dominios o partes de los mismos, proteínas de fusión o complejos de proteínas también pueden ser dirigidos a orgánulos y compartimentos de la célula vegetal o inmovilizados y anclados a la membrana mediante la adición de secuencias señal y/o anclas de membrana. La proteína patogenicida molecular recombinante contiene preferiblemente secuencias de escisión de proteasa específicas que son escindidas in vivo, por una o varias proteasas específicas de una planta y/o un patógeno, para liberar y/o activar el agente o los agentes tóxicos, o partes del mismo, tras la infección.

La proteína de fusión de la presente invención puede comprender adicionalmente una proteína portadora adecuada para la liberación de la proteína de fusión o sus dominios en una célula huésped, preferiblemente una célula vegetal o un compartimento celular de la misma. Además, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender un fluoróforo tal como una proteína fluorescente verde fusionada al menos a uno de los dominios descritos antes de los que consta la proteína de fusión. En un aspecto adicional, la presente invención hace referencia a un patogenicida que comprende al menos un dominio de unión y/o uno adicional como se ha definido aquí y una secuencia de redireccionamiento celular y/o una secuencia de localización de membrana y/o una unidad que conduce al anclaje a la membrana. Preferiblemente, la secuencia de localización de membrana es proteolíticamente sensible.

Las secuencias ancla de la membrana adecuadas, que permiten la integración de proteínas de fusión con anticuerpos recombinantes secretores y partes de la misma en la membrana plasmática, incluyen dominios transmembrana de los receptores de las células T humanas (Gross y Eshhar, 1992), anclas de glico-fosfatidilinositol (GPI) (Gerber y col., 1992), anclas de membrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas, miembros de la familia del tetraspan (Tedder y Engel, 1994; Wright y Tomlinson, 1994) y cualquier secuencia o secuencias transmembrana de una proteína conocida o secuencias sintetizadas que tengan una función similar y puedan ser incluidas en la proteína diana mediante tecnología de ADN recombinante. La fusión de una proteína a estas secuencias permitiría la presentación de la proteína recombinante sobre la cara luminal de los orgánulos de la ruta secretora o endocítica o de la membrana de una célula vegetal. Esto tiene la ventaja de que la proteína recombinante puede ser dirigida al espacio intracelular donde muchos patógenos son muy vulnerables.

Además, los anticuerpos o partes de los mismos, o las proteínas de fusión a anticuerpos recombinantes, o partes de las mismas, pueden ser redireccionados a membranas celulares en las que podrían dar al lado citosólico de la membrana. Entre las secuencias de redireccionamiento adecuadas para la presentación citoplásmica se incluyen los dominios transmembrana de: KAR1, para la integración en la membrana nuclear (Rose y Fink, 1987), el antígeno T medio (Kim y col., 1997), para la integración en la membrana plasmática y el citocromo b5, para la integración en la membrana del RE (Kim y col., 1997). También se pueden utilizar conexiones C-terminales a ácidos grasos utilizando secuencias de aminoácidos consenso que conducen a una prenilación, farnesilación, palmitoilación, miristoilación post-traduccional o unidades de la secuencia de ankirina. Esta presentación citoplásmica tiene la importante ventaja de que las proteínas recombinantes pueden ser localizadas en el lugar de replicación del patógeno intracelular, donde tendrán el efecto más potente. Además, la localización en la membrana de las proteínas estabiliza la proteína y reduce el efecto de la degradación de la proteína C-terminal in vivo. Preferiblemente, el patogenicida de la invención comprende la proteína de fusión descrita aquí.

En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a los patogenicidas descritos en los que dicho o dichos dominios de unión y/o dicho o dichos dominios adicionales son capaces de autoensamblarse in vivo.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión o un patogenicida de la invención. Así, la invención se refiere a uno o más constructos génicos que codifican una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o una parte del mismo que es específica para un patógeno y en el caso de las proteínas de fusión, para una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, enzima o péptido que tiene efectos perjudiciales sobre el patógeno e idealmente es tóxico para el patógeno. En esta invención se incluyen los anticuerpos específicos para el patógeno y/o las proteínas del huésped utilizadas por el patógeno durante su ciclo vital. Esta invención también se refiere a proteínas quiméricas que constan de un anticuerpo, anticuerpos o partes del mismo, que son específicos para un patógeno, y una proteína o péptido que tiene efectos perjudiciales o idealmente tóxicos sobre el patógeno y que han sido construidas conectando bioquímicamente el anticuerpo o partes del mismo a la toxina. Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Dicho vector puede comprender polinucleótidos separados que codifican al menos uno de dichos dominios de unión y/o dicho o dichos dominios adicionales de la proteína de fusión descrita antes. Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende vectores en los que cada vector contiene al menos un polinucleótido que codifica al menos un dominio de unión y/o al menos un dominio adicional de la proteína de fusión o el patogenicida de la invención; y donde la expresión de al menos dos de dichos polinucleótidos da como resultado la producción de dicha proteína de fusión o dicho patogenicida o el ensamblaje de los mismos in vivo.

En una realización preferida del vector o la composición de la invención el polinucleótido está conectado operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión de la proteína de fusión, el patogenicida o los dominios del mismo en una célula huésped. Dicha secuencia reguladora puede ser un promotor constitutivo, quimérico, específico de un tejido o inducible.

Además, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende uno cualquiera de los polinucléotidos, vectores o vectores de las composiciones descritos antes.

En otra realización la presente invención se refiere a un método para la producción de un patogenicida molecular que comprende:

(a) cultivar la célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótidos; y

(b) recuperar la proteína de fusión, el patogenicida o los dominios de los mismos del cultivo.

La presente invención también se refiere a un patogenicida molecular obtenible mediante el método de la invención o codificable por el polinucléotido de la invención.

Esta invención también se refiere a complejos de proteínas ensambladas in vivo compuestos por una o más cadenas polipeptídicas discretas, codificadas por secuencias de nucleótidos separadas en uno o más constructos, que son ensamblados por la maquinaria de la síntesis de proteínas de la planta o los organismos de expresión en un complejo proteico.

Además, la presente invención se refiere a un método para la producción de plantas transgénicas, células vegetales o tejidos vegetales resistentes a patógenos, que comprende la introducción de un polinucleótido o vector de la invención o los vectores de la composición de la invención en el genoma de una planta, célula vegetal o tejido vegetal.

La presente invención también se refiere a una célula vegetal transgénica que contiene integrado establemente en el genoma un polinucleótido o vector de la invención o los vectores de la composición de la invención u obtenibles según el método de la invención.

Además, la presente invención se refiere a una planta o tejido vegetal transgénico que comprende las células vegetales descritas antes u obtenibles mediante el método de la invención. Asimismo están incluidas las plantas transgénicas en las que la proteína de fusión o el patogenicida se han hecho funcionales frente a patógenos mediante ensamblaje in vivo tras la transformación simultánea de al menos dos constructos de expresión vegetal independientes o tras el cruzamiento sexual para formar vástagos híbridos a partir de dos plantas de origen que expresan uno o más de los dominios de la proteína de fusión o el patogenicida, o cualquier otra forma de recombinación genética. Preferiblemente, la planta transgénica de la invención muestra una resistencia mejorada frente a un patógeno al que la planta salvaje era susceptible.

Además, la presente invención se refiere a partes cosechables y material de propagación de una planta de la invención que comprende células vegetales de la invención.

En otra realización más, la presente invención se refiere a un estuche que comprende cualquiera de las proteínas de fusión, patogenicidas, polinucleótidos, composiciones o patogenicidas moleculares de la invención descritos antes.

En otra realización la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos, las proteínas de fusión, los polinucleótidos, los vectores, las composiciones y los patogenicidas moleculares de la invención descritos en agricultura para la protección de una planta frente a la acción de un patógeno.

Algunos aspectos de la presente invención se describirán más abajo con detalle.

El término "dominio de unión" se utiliza para indicar una o varias cadenas polipeptídicas que muestran una fuerte unión monovalente, bivalente o polivalente a un epítopo o epítopos dados. Preferiblemente, dicho dominio de unión es un anticuerpo o un sitio de unión del mismo. Los anticuerpos pueden ser generados mediante tecnología de hibridomas, o presentación en ribosomas, o presentación en fagos, de bancos de origen indiferenciado natural, o de origen inmunizado, semi-sintéticos o totalmente sintéticos. El término "anticuerpo" también se utiliza para indicar anticuerpos diseñadores. Estos polipéptidos de anticuerpos son codificados por un gen de inmunoglobulina o por genes de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos que se unen específicamente al epítopo o los epítopos dados. Entre los genes de inmunoglobulinas reconocidos se incluyen los genes de las cadenas ligeras kappa y lambda, las regiones constantes mu, delta, gamma, alfa y épsilon así como todas las regiones variables de las inmunoglobulinas de especies de vertebrados, camélidos, aves y peces. El término anticuerpo, según se utiliza aquí, incluye en particular aquellos anticuerpos sintetizados o construidos de novo utilizando la metodología del ADN recombinante, tal como anticuerpos de tamaño normal, anticuerpos IgA secretores diméricos, anticuerpos IgM multiméricos, fragmentos F(ab')_{2}, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), scFv biespecíficos, "diabodies" (fragmentos bivalentes), anticuerpos de dominio sencillo (dAb), "minibodies" y unidades de reconocimiento molecular (MRU) recombinantes. Las secuencias de anticuerpos pueden derivar de cualquier especie de vertebrado, camélido, ave, o pez utilizando la tecnología del ADN recombinante, o también utilizando bancos de presentación en fagos y ribosomas sintéticos, semi-sintéticos e indiferenciados o inmunocompetentes, bancos de mezclado de genes, y anticuerpos diseñadores completamente sintéticos. En esta invención, los anticuerpos son generados frente a epítopos vegetales específicos del patógeno o del huésped que están implicados en la replicación, reproducción o ciclo vital del patógeno.

El término "patógeno" se utiliza aquí para indicar organismos virales o similares a virus, bacterias, micoplasmas, hongos, insectos o nematodos que afectan a la germinación de semillas, al crecimiento, desarrollo, reproducción, cosecha, rendimiento o utilidad de una planta.

El término "tóxico" hace referencia a una actividad que puede estar codificada por un péptido o un polipéptido, que afecta a la reproducción o replicación de un patógeno y/o a cualquiera de las fases de su ciclo vital. En el caso de los patógenos virales, esto incluye la entrada en la planta, el desprendimiento de la envuelta y el desensamblaje viral, la replicación viral, el ensamblaje viral, el movimiento célula a célula y a larga distancia y el desarrollo, propagación, o el ciclo vital del virus. Entre las actividades tóxicas adecuadas se incluyen ARNasa (Leland y col., 1998) y ADNasa, proteínas que desactivan el ribosoma (Barbieri y col., 1993), (Girbes y col., 1996), (Hartley y col., 1996) y/o toxinas con actividad antimicrobiana (Dempsey y col., 1998). Los anticuerpos o las propias proteínas recombinantes también son considerados tóxicos cuando afectan al patógeno uniéndose al patógeno y/o a las proteínas del huésped que son utilizadas por el patógeno durante la replicación, reproducción, ciclo vital o transmisión. Por ejemplo, una proteína de fusión compuesta por un anticuerpo específico para un virus y una proteína de la envuelta viral que interferirá en la reproducción del virus tanto uniéndose al virus como desorganizando el ensamblaje viral o el desensamblaje en la célula huésped.

El término "patogenicida molecular" hace referencia a los anticuerpos y proteínas descritos en esta solicitud, que tienen efectos tóxicos sobre el o los patógenos en forma de proteínas de fusión individuales, cuando son expresadas combinadas con otras proteínas, o cuando son expresadas como parte de complejos proteicos que se ensamblan in vivo.

Los anticuerpos monoclonales (Köhler y Milstein, 1975) pueden ser originados contra casi cualquier epítopo o estructura molecular de un patógeno o proteína huésped utilizando numerosas técnicas. El método más común es la técnica del hibridoma que parte de linfocitos B inmunocompetentes del bazo o el timo que son obtenidos tras la inmunización con un antígeno nativo, un antígeno recombinante, proteínas de fusión a antígenos, dominios antigénicos o mediante inmunización in vitro o genética. Además, los recientes avances en las técnicas de biología molecular permiten ahora utilizar los fragmentos de anticuerpos recombinantes clonados y anticuerpos derivados de ratones y otros organismos distintos del ratón. Entre los fragmentos de anticuerpos recombinantes adecuados se incluyen los anticuerpos de tamaño normal recombinantes completos, los anticuerpos IgA secretores diméricos, los anticuerpos IgM multiméricos, el fragmento F(Ab')_{2}, el fragmento Fab, el fragmento Fv, los fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv), los dominios de unión sencillos (dAb), un scFv bivalente ("diabody") (Poljak, 1994), un "minibody" (Carter y Merchant, 1997), anticuerpos scFv biespecíficos (Plückthun y Pack, 1997) donde la molécula de anticuerpo reconoce dos epítopos diferentes, (que pueden ser del patógeno o del huésped o tanto del patógeno como del huésped), "triabodies" (fragmentos trivalentes) y cualquier otra parte del anticuerpo tal como unidades de reconocimiento molecular (MRU), que muestran unión a los epítopos diana. Los genes que codifican estos fragmentos de anticuerpos recombinantes adecuados pueden derivar de especies de vertebrados, camélidos, aves o peces.

Asimismo, los anticuerpos de cadena sencilla que tienen afinidades por las estructuras de patógenos o del huésped y las proteínas pueden ser identificados utilizando bancos de presentación en fagos o bancos de presentación en ribosomas, bancos de genes mezclados, que pueden ser construidos a partir de fuentes sintéticas, semi-sintéticas o indiferenciadas e inmunocompetentes (Plückthun, 1991; Winter y col., 1994; Winter y Milstein, 1991). La presentación en fagos y las técnicas adecuadas pueden ser utilizados para identificar específicamente anticuerpos, o fragmentos de los mismos, con las propiedades de unión deseadas. Utilizando la tecnología de los anticuerpos recombinantes es posible identificar anticuerpos o fragmentos que sean altamente específicos para un único patógeno, o que reconozcan un epítopo consenso conservado entre diversos patógenos, donde los anticuerpos tengan una amplia especificidad frente a los patógenos. La durabilidad y el efecto de la resistencia mediada por anticuerpos pueden ser mejorados mediante i) maduración de la afinidad del anticuerpo recombinante, ii) aleatorización y selección de CDR, iii) estabilización mediante optimización del marco de un anticuerpo específico para un patógeno seleccionado, iv) expresión de anticuerpos bi-específicos, v) generación de proteínas de fusión a anticuerpos, o vi) expresión de anticuerpos en combinaciones con otros que puedan potenciar sus efectos individuales. Por ejemplo, la resonancia de plasmón superficial empleada en el sistema BIAcore puede ser utilizada para incrementar la eficacia de las selecciones de anticuerpos presentados en fagos, rindiendo un gran incremento de la afinidad de un banco individual de anticuerpos de fagos que se unen a un epítopo de un patógeno (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Los anticuerpos recombinantes pueden ser identificados y utilizados según los métodos que son familiares para cualquier experto normal en la técnica.

Anticuerpos

Esta invención describe anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen estructuras del patógeno o de la planta huésped y conducen directamente o indirectamente a la resistencia o la resistencia parcial cuando son expresados solos o son expresados en forma de una proteína de fusión quimérica acoplada a una actividad tóxica o cuando son expresados y ensamblados in vivo con una actividad tóxica para formar un complejo proteico patogenicida molecular ensamblado in vivo. Se pueden generar anticuerpos que reconocen epítopos específicos de patógenos o epítopos específicos de plantas huésped que tienen un papel en el ciclo celular de un patógeno. Entre los anticuerpos adecuados para el diseño de la resistencia viral se incluyen, pero no están limitados a, aquellos que se unen a dominios funcionales conservados de proteínas de la envuelta viral, proteínas del movimiento, o replicasas y son un enfoque para obtener resistencia de amplio espectro y reducir los riesgos medioambientales inactivando las dianas dentro y/o fuera de la célula vegetal a través de la inmunomodulación. La posibilidad de este enfoque ha sido demostrada recientemente para la resistencia viral tanto animal (Chen y col., 1994), Duan y col., 1994), (Marasco y col., 1993) como vegetal (Tavladoraki y col., 1993), (Voss y col., 1995), (Zimmermann y col., 1998). Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser inactivados en sí mismos o combinados con uno o más anticuerpos distintos, o una toxina, o combinados con un portador, un dominio transmembrana o un péptido señal. Esencialmente, la resistencia a patógenos vegetales puede ser intensificada mediante la expresión simultánea de múltiples anticuerpos.

En una realización preferida concreta, la presente invención hace referencia a uno de los anticuerpos descritos antes donde el anticuerpo o un derivado del mismo es capaz de unirse al dominio funcional de una proteína de movimiento viral y/o replicasa. Como se pudo demostrar sorprendentemente en los Ejemplos 5 y 6, los anticuerpos dirigidos contra un movimiento viral y una replicasa, respectivamente, pueden ser utilizados para diseñar una resistencia intensificada contra el virus del que derivan el gen del movimiento y de la replicasa. La ventaja de utilizar la proteína del movimiento o la replicasa como diana para el anticuerpo o una proteína de unión equivalente funcional es que se puede esperar que los dominios funcionales de la proteína del movimiento y la replicasa están altamente conservados entre los diferentes virus. Así también se puede esperar que la expresión de un anticuerpo dirigido contra semejante epítopo conservado de, por ejemplo, la proteína del movimiento del TMV sea efectiva contra los virus relacionados. Además, debido a la conservación de los dominios funcionales en estas dos proteínas virales, una ventaja adicional es que la heterogeneidad dentro de un único grupo de virus no debe ser tan elevada como, por ejemplo, la de la proteína de la envuelta. Así, el descubrimiento de la presente invención de que la proteína del movimiento y la replicasa de un virus son accesibles para el redireccionamiento del anticuerpo dentro de la célula vegetal, se hizo posible un concepto novedoso para la generación de plantas resistentes a virus. Es por esa razón, que en un aspecto separado de la presente invención se hace referencia a tales anticuerpos para diseñar resistencia a virus en plantas. Los virus que pueden ser la diana de este enfoque son cualquiera que utilice proteínas del movimiento durante la infección así como todos los virus que codifiquen un gen de la replicasa. Se puede esperar que esto sea eficaz debido a que el movimiento viral es una característica común de muchas infecciones virales (McLean y col., Trends Microbiol. 1, (1993), 105-9) y las replicasas son esenciales para la patogénesis viral. La importancia de los enfoques que dirigen estas proteínas está subrayada por el hecho de que la expresión de versiones de tipo salvaje o defectuosas de las proteínas del movimiento o las replicasas a menudo producen resistencia (Beachy, (1997), Curr. Opin. Biotechnol. 8:215-220). Las plantas transgénicas que expresan proteínas de movimiento del TMV mutantes defectuosas son resistentes a múltiples virus, presumiblemente debido a que las desorganizaciones del movimiento viral intercelular (Cooper y col., (1995), Virology 206, 307-313) y la expresión de la replicasa es una estrategia de resistencia eficaz (Anderson y col., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8759-8763; Baulcombe, (1994), Trends Microbiol. 2:60-63; Brederode y col., (1995), Virology 207:467-470; Nguyen y col., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12643-12467; Rubino y Russo, (1995), Virology 212:240-243).

Una desventaja de los enfoques de resistencia mediada por anticuerpos actuales puede ser la elección de las proteínas de la envuelta viral como diana. Las proteínas de la envuelta viral vegetales tienen una amplia diversidad estructural y esta puede restringir el efecto de los anticuerpos expresados a una pequeña gama de virus y bajo estrés selectivo, la secuencia de la proteína de la envuelta viral puede ser alterada sin pérdida de función. La generación de anticuerpos recombinantes dirigidos contra los dominios funcionales conservados de las replicasas virales y las proteínas del movimiento puede proporcionar una mejor ruta para obtener plantas resistentes a patógenos con una resistencia de amplio espectro frente a los virus. El antígeno para producir cualquiera de los anticuerpos descritos antes puede derivar de proteínas del movimiento o replicasas de origen natural o fragmentos de las mismas o pueden ser producidas por recombinación, sintetizadas químicamente y/o derivadas mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica algunos de los cuales también se tratan aquí. En vista de lo anterior, la invención también se refiere a polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos antes, los vectores que comprenden los mismos y las células huésped transformadas con ellos. Los vectores, las células huésped y las estrategias adecuados para la expresión de anticuerpos recombinantes en plantas se describen aquí y pueden ser fácilmente adaptados a partir de cualquiera de las realizaciones descritas aquí.

Toxinas

Entre las toxinas se incluyen todas las proteínas y péptidos que tienen un efecto perjudicial o tóxico sobre un patógeno durante su ciclo vital y/o un efecto sobre el patógeno durante la infección de la planta o la replicación, propagación o transmisión del patógeno. Esto incluye las toxinas que eliminan específicamente una célula huésped infectada y por tanto limitan la propagación y el desarrollo de una enfermedad. Entre las toxinas adecuadas se incluyen las siguientes:

\ding{226}: péptidos tóxicos que son específicos para el patógeno y median la toxicidad v.g. mediante permeabilización de la membrana basándose en la alteración del potencial de membrana (Ham y col., 1994; Sangster, 1997).

\ding{226}: péptidos bloqueadores que se unen a proteínas del patógeno estructurales o no estructurales, o unidades de ácido nucleico, e inhiben la función, crecimiento, desarrollo del patógeno o la toxicidad para el huésped (Hayakawa, 1991; Silbur y col., 1998).

\ding{226}: miméticos de péptidos que se unen a unidades proteicas del patógeno o del huésped y que modulan o bloquean la replicación del patógeno, v.g. derivados de péptidos de inhibidores de la proteinasa que juegan un papel fisiológico como inhibidores de la replicación viral y pueden ser utilizados como agentes antivirales (Bjorck y col., 1990), (Bjorck y col., 1989).

\ding{226}: dominios de unión, tales como los anticuerpos definidos antes que reconocen específicamente un epítopo de un patógeno vegetal.

\ding{226}: miméticos de péptidos que se unen a unidades proteicas del patógeno o del huésped y que modulan o bloquean el movimiento del patógeno dentro de la planta huésped. Como ejemplo, el péptido BC, que imita la región señal de localización nuclear de VIH-1, reduce la producción de VIH-1 en un 75% cuando es expresado en células T humanas cultivadas en división infectadas (Friedler y col., 1998).

\ding{226}: toxinas que eliminan la célula huésped donde el patógeno se está replicando y ha penetrado en el citosol (Barbieri y col., 1993; Hartley y col., 1996; Madshus y Stenmark, 1992), por ejemplo RIP (proteínas que inactivan el ribosoma) que entran en el citosol y están entre las citotoxinas más potentes conocidas. La inactivación del ribosoma se logra en todos los casos a través de la escisión de un enlace N-glicosídico entre ribosa y un resto adenina específico en la secuencia universalmente conservada 5'-AGUACGA*GAGGA-3' (donde A* indica la adenina diana) localizada a 250-400 nt desde el extremo 3' de los ARNr 23S/25S/28S (Endo y Tsurugi, 1987), (Hardley y col., 1996). Los ribosomas despurinizados de esta manera son incapaces de unirse al complejo EF-2/GTP y la síntesis de proteínas es bloqueada en la etapa de translocación (Montanaro y col., 1975). Una única molécula de RIP es capaz de despurinizar 1000-2000 ribosomas de una célula de mamífero por minuto en condiciones fisiológicas (Eiklid y col., 1980; Endo y Tsurugi, 1988).

\ding{226}: proteínas y enzimas tales como la ARNasa A que son potentes citotoxinas (Leland y col., 1998). Estas ribonucleasas citotóxicas degradan el ARN celular y causan la muerte celular y pueden ser utilizadas para eliminar células infectadas y por tanto para prevenir la proliferación y propagación de un patógeno.

Estos son ejemplos de proteínas que inhibirán la replicación de un patógeno a nivel de ARN, ADN o proteína uniéndose directamente a una proteína patógena, un intermedio de replicación o un factor del huésped que es necesario para la replicación o el movimiento o la transmisión del patógeno y el ciclo vital del patógeno. Esta estrategia es particularmente adecuada para inactivar patógenos virales. Además, se describen toxinas, tales como RIP o ARNasa A que son adecuadas para ocasionar la muerte celular a la entrada del patógeno y por tanto detener la propagación de la infección o la proliferación de un patógeno.

En principio todos los anticuerpos, proteínas, péptidos y enzimas que tienen actividad, que puede ser o no enzimática, que son capaces de interferir en los ciclos vitales de los patógenos son adecuados como parte de los presentes constructos.

En una realización preferida de la presente invención dicha enzima es la quitinasa o la glucanasa, la glucosa oxidasa, la superóxido dismutasa, la ADNasa o la ARNasa o RIP o fragmentos activos de las mismas ya sean individualmente o en cualquier combinación o combinaciones.

Constructos

Los constructos génicos pueden comprender lo siguiente o cualquier combinación de lo siguiente y pueden estar codificados en uno o más plásmidos: Los constructos génicos pueden comprender una secuencia de nucleótidos o secuencias de nucleótidos que codifiquen anticuerpos de tamaño normal recombinantes completos, anticuerpos IgA secretores diméricos, anticuerpos IgM multiméricos, el fragmento F(ab')_{2}, el fragmento Fab, el fragmento Fv, fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla (scFv), dominios de unión sencillos (dAb), un scFv bivalente ("diabody") (Poljack, 1994), "minibody" (Carter y Mechant, 1997), anticuerpos scFv biespecíficos (Plückthun y Pack, 1997; Fischer y col., Eur. J. Biochem. 262:810-816 (1999)) donde la molécula de anticuerpo reconoce dos epítopos diferentes que pueden proceder de un patógeno o de un huésped o de ambos, "triabodys" (fragmentos trivalentes) y cualquier otra parte del anticuerpo (unidades de reconocimiento molecular (MRU)) que muestren unión a los epítopos diana. Los genes que codifican estos fragmentos de anticuerpos recombinantes adecuados pueden derivar de especies de vertebrados, camélidos, aves o peces.

En los constructos según la invención, el anticuerpo está fusionado preferiblemente a una secuencia completa de un agente tóxico o una parte del mismo que todavía tenga actividad, o que todavía sea funcionalmente activa. Asimismo, la proteína quimérica puede ser codificada por secuencias de nucleótidos en uno o más constructos y pueden ser ensamblados in vivo por la planta o la maquinaria de ensamblaje y traducción de las proteínas de los organismos de expresión. También se puede obtener la proteína quimérica mediante ensamblaje bioquímico o ensamblaje in vitro o in vivo de las subunidades de inmunotoxina quimérica utilizando la maquinaria de ensamblaje de proteínas endógena de las células. El anticuerpo, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos están fusionados directamente al agente tóxico o conectados por un espaciador flexible que no interfiera en la estructura o función de las dos proteínas. Entre tales conectores flexibles se incluyen copias del conector (Glicina-Glicina-Glicina-Glicina-Serina)_{n}, donde n es de 1 a 4 o más copias de la unidad conectora, el conector Genex 212 y 218 y el péptido conector flexible de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesi (CBHI) (Turner y col., 1997), (Tang y col., 1996).

Constructos para redireccionamiento celular y la localización en la membrana

En esta invención, este enfoque de redireccionamiento tiene la ventaja de que el patogenicida molecular o anticuerpo o fragmento del mismo puede ser expresado donde el patógeno es más vulnerable a la acción del patogenicida molecular y/o el anticuerpo o fragmento del mismo.

La localización celular deseada del patogenicida molecular, o cualquier componente del mismo, puede ser obtenida utilizando las señales de redireccionamiento celular apropiadas, entre estas se incluyen pero no están limitadas a péptidos señal, secuencias de redireccionamiento, señales de retención, anclas de membrana, modificaciones post-traduccionales y/o dominios membrana-transmembrana que dirigen la proteína al orgánulo deseado, la membrana deseada (membrana plasmática, RE, Golgi, núcleo, cloroplasto o vacuola) u orientación de membrana deseada (citoplásmica o luminal o presentación en la membrana de la célula vegetal) (Kim y col., 1997; Rose y Fink, 1987). Las secuencias de localización pueden ser las secuencias de redireccionamiento que se describen, por ejemplo en el capítulo 35 (redireccionamiento de proteínas) de L. Stryer Biochemistry 4ª edición, W.H. Freeman, 1995. Las proteínas sintetizadas sin un péptido señal funcional no son insertadas mediante traducción simultánea en la ruta secretora y permanecen en el citosol. Las proteínas que llevan un péptido señal que las dirige a la ruta secretora, que puede incluir una secuencia transmembrana o un ancla de membrana, serán dirigidas a la secreción por defecto o residen en sus orgánulos con membrana objetivo. Las señales de redireccionamiento pueden dirigir las proteínas al RE, conservarlas en el RE (unidad LYSLYS y KDEL), TGN 38, o dirigir las proteínas a orgánulos celulares tales como cloroplastos, vacuolas, núcleo, membrana nuclear, peroxisomas y mitocondria. Los ejemplos para las secuencias señal y los péptidos de redireccionamiento se describen en (von Heijne, 1985) (Bennett y Osteryoung, 1991) (Florack y col., 1994). Además, las señales de redireccionamiento pueden ser crípticas y codificadas por una célula de la planta huésped o las proteínas de las células eucariotas heterólogas o proteínas animales en las que se conoce la localización y donde la proteína puede ser clonada. Construyendo una proteína de fusión con esta proteína, se puede dirigir un patogenicida molecular a la localización de la proteína sin la necesidad de identificar la señal de redireccionamiento críptica. Las señales crípticas adecuadas son aquellas codificadas por las enzimas de Golgi residentes. Los patogenicidas moleculares descritos en esta invención pueden ser dirigidos a membranas celulares incorporando secuencias heterólogas en la proteína recombinante que permitan su síntesis como una proteína de la membrana o como una proteína asociada a la membrana o su modificación post-traduccional para asociarla con las membranas celulares. Entre las secuencias ancla a la membrana adecuadas, que permiten la integración de proteínas de fusión a anticuerpos recombinantes y partes de los mismos en la membrana plasmática, se incluyen los dominios transmembrana de los receptores de las células T humanas (Gross y Eshhar, 1992), las anclas de glicofosfatidil-inositol (GPI) (Gerber y col., 1992), las anclas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, los miembros de la familia del tetraspan (Tedder y Engel, 1994; Wright y Tomlinson, 1994) y cualquier secuencia transmembrana de una proteína conocida o secuencias sintetizadas que tengan una función similar y puedan ser incluidas en la proteína diana mediante tecnología de recombinación de ADN.

Además, los anticuerpos o partes de los mismos, o las proteínas de fusión a anticuerpos recombinantes, o partes de las mismas, pueden ser dirigidos a las membranas celulares donde podrían dar al lado citosólico de la membrana. Entre las secuencias de redireccionamiento adecuadas para la presentación citoplásmica, se incluyen los dominios transmembrana de: KAR1, para la integración en la membrana nuclear (Rose y Fink, 1987), el antígeno T medio (Kim y col., 1997), para la integración en la membrana plasmática y el citocromo b5, para la integración en la membrana del RE (Kim y col., 1997). También se pueden utilizar conexiones C-terminales a ácidos grasos utilizando secuencias de aminoácidos consenso que conducen a una prenilación, farnesilación, palmitoilación, miristoilación post-traduccional o unidades de la secuencia de la ankirina.

Constructos para la estabilización de anticuerpos mediante presentación en la membrana

Los anticuerpos recombinantes específicos de patógenos pueden ser fusionados a diferentes anclas transmembrana para mejorar los niveles de expresión y la estabilidad de estas moléculas dentro de la célula vegetal, dirigiendo la proteína recombinante expresada a membranas de la célula de diversas orientaciones. Esto se puede lograr añadiendo:

a): Secuencias de localización C-terminal para dirigir e integrar proteínas citosólicas recombinantes en péptidos líder N-terminales en la bicapa de membranas celulares, encarando de ese modo el apoplasto de la planta. Entre las secuencias de localización de membrana adecuadas se incluyen el dominio transmembrana de la cadena \beta del receptor de las células T humana y el dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (PDGFR), las anclas de glicofosfatidilinositol (GPI), las anclas de membrana de la superfamilia de las inmunoglobulinas y cualquier secuencia transmembrana de una proteína conocida o secuencias sintetizadas que tengan una función similar y puedan ser incluidas en la proteína diana mediante tecnología de ADN recombinante.

b): Proteínas transmembrana amino terminales con dominios que abarcan la membrana plasmática duales o tetraméricos para exponer los extremos tanto N como C de las proteínas recombinantes secretoras al citosol. Esto se puede lograr utilizando miembros adecuados de la familia del tetraspan incluyendo CD9, CD20, CD81 y el híbrido de tipo II-IV de dualspan In-Hc-Ic de la cadena invariable del MHC y la proteína híbrida H-2^{d}. Este método permite la orientación de un constructo de anticuerpo secretado y anclado a la membrana con su extremo N y C en el citosol. Alternativamente se pueden utilizar fusiones SNAP-25 para la misma orientación.

c): Secuencias ancla C-terminales para dirigir e integrar las proteínas citosólicas recombinantes sin péptidos líder N-terminales en la bicapa de endomembranas post-traduccionalmente. Entre las secuencias de redireccionamiento adecuadas se incluyen los dominios transmembrana de KAR1 para la integración nuclear (Rose y Fink, 1987), el antígeno medio T para la integración en la membrana plasmática (Kim y col., 1997) y el citocromo b5 para la integración en la membrana del RE (Kim y col., 1997).

d): Adición de unidades consenso a la proteína que permitan conexiones C-terminales a ácidos grasos mediante prenilación, farnesilación, palmitoilación, miristoilación y el citosol que después conducen a la integración en la membrana.

e): Adición de unidades de secuencia de ankirina (Lambert y Bennett, 1993; Peters y Lux, 1993).

Constructos para el ensamblaje del complejo proteico in vivo

Además, el anticuerpo o el fragmento del mismo puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos separada de la de la toxina y el anticuerpo y la toxina, cualquiera de los cuales puede codificar secuencias de localización en la membrana o de redireccionamiento celular, pueden estar codificados por uno o más vectores, v.g. plásmidos. Los constructos contienen secuencias de nucleótidos que codifican proteínas de unión complementarias de manera que cuando el anticuerpo, o el fragmento del mismo, está genéticamente fusionado a una pareja de unión y la toxina o el fragmento de la misma, está genéticamente fusionado a la segunda pareja de unión, estas dos proteínas independientes portarán actividades de unión que se reconoceran mutuamente. Cuando estas dos proteínas independientes son expresadas en el mismo compartimento vegetal, los dominios de unión se unirán para formar un patogenicida molecular con dos subunidades y propiedades similares a las de una proteína de fusión anticuerpo-toxina. Entre los dominios de unión/parejas adecuados se incluyen:

\ding{226}: Un anticuerpo de cadena sencilla y su correspondiente epítopo, donde la cadena sencilla se une al epítopo y de ese modo permite la unión entre dos proteínas independientes,

\ding{226}: cremalleras de leucina (Carter y col., 1995),

\ding{226}: Cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, donde una proteína es fusionada a la cadena pesada y el ensamblaje de la cadena pesada y ligera tiene lugar en el RE,

\ding{226}: otros homo- o hetero-dominios de unión.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que el componente anticuerpo, anticuerpos o fragmentos de los mismos o el componente péptidos de unión al patógeno, como se ha descrito, y el componente toxina o los fragmentos de la misma pueden portar cada uno una pareja de unión. Cuando se expresan en el mismo compartimento de una planta, o cuando se encuentran entre sí, estos dominios de unión pueden permitir después el ensamblaje de un patogenicida molecular con todas las propiedades requeridas a partir de los componentes. Cualquier experto en la técnica reconocerá que esto se puede lograr por otros medios que los descritos antes que se proponen como ejemplos para ilustrar mejor el principio del ensamblaje in vivo y no se pretende que sean tomados como limitantes de una descripción exhaustiva.

Proteínas portadoras

Cualquier experto en la técnica también reconocerá que los diversos componentes de la presente invención pueden ser expresados de tal manera que estén sobre la superficie de una tercera proteína portadora, entre los portadores adecuados se incluyen glutatión S-transferasa (GST) codificada por Schistosoma japonicum (Smith y Johnson, 1988), la proteína de la envuelta del TMV, la proteína de unión a maltosa y la tiorredoxina (LaVallie y col., 1993) u otras proteínas.

Además, cualquiera de los componentes de la presente invención puede ser etiquetado con un fluoróforo codificado genéticamente, entre los fluoróforos adecuados se incluyen, pero no están limitados a, la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequoria victoria. Este enfoque sería especialmente útil para controlar la localización de un patógeno o un patogenicida molecular durante la infección.

Si la proteína o las proteínas de fusión son expresadas en un organismo heterólogo para la producción de la proteína o las proteínas, puede ser necesario modificar el constructo génico con el fin de equiparar la preferencia del organismo por el codón y separar las unidades de ARNm que reduzcan la estabilidad del transcrito.

Todos los componentes de los patogenicidas moleculares descritos en esta invención pueden ser transformados por separado en líneas vegetales que después pueden ser cruzadas sexualmente para dar vástagos que produzcan los patogenicidas moleculares en una forma funcional.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos, péptidos y toxinas pueden ser combinados de diversas formas y codificados en diferentes plásmidos para producir proteínas que tengan el efecto deseado sobre el patógeno. Cualquier experto en la técnica también reconocerá que el ensamblaje de los patogenicidas moleculares a partir de subunidades codificadas genéticamente de forma individual puede ser logrado mediante numerosos métodos.

Patógenos diana

Virus, bacterias, micoplasmas, hongos, nematodos, insectos y otros patógenos.

Vectores

La presente invención también se refiere a vectores, concretamente plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores utilizados convencionalmente en ingeniería genética que contienen un polinucleótido según la invención o cualquiera de los constructos génicos descritos antes. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden ser utilizados para construir diversos plásmidos y vectores; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden ser reconstituidos en liposomas para la liberación en las células diana.

En una realización preferida, el polinucléotido presente en el vector está conectado a elementos reguladores que permiten la expresión del polinucleótido en células procarióticas y/o eucarióticas. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferiblemente en un ARN traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células procarióticas y/o eucarióticas son bien conocidos por los expertos en la técnica. En el caso de las células eucarióticas comprenden normalmente promotores que aseguran el inicio de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito, por ejemplo, aquellos del ARN 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV). Con respecto a esto, la persona experta en la técnica apreciará fácilmente que los polinucleótidos que codifican al menos uno de los dominios descritos antes de las proteínas de fusión o el patogenicida de la invención pueden codificar todos los dominios o sólo uno. Del mismo modo, dichos polinucleótidos pueden estar bajo el control del mismo promotor o pueden estar controlados por separado para la expresión. Otros promotores comúnmente utilizados son el promotor del virus Mosaico de la Escrofularia, el promotor de la poliubiquitina, y el promotor de la actina para la expresión ubicua. Las señales de terminación empleadas normalmente son de Nopalina Sintasa o del gen 35S de CaMV. Se ha demostrado que un intensificador traduccional vegetal utilizado a menudo es la secuencia omega de TMV, la inclusión de un intrón (Intron-1 del gen Shrunken del maíz, por ejemplo) incrementa los niveles de expresión hasta 100 veces. (Maiti y col., Transgenic Research 6 (1997), 143-156; Ni y col.; Plant Journal 7 (1995), 661-676). Entre los elementos reguladores adicionales se pueden incluir intensificadores transcripcionales así como traduccionales. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procarióticas comprenden, v.g. el promotor P_{L}, lac, trp o tac en E. coli, y los ejemplos de los elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucarióticas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, RSV (virus del Sarcoma de Rous), el intensificador de CMV, el intensificador de SV40 o el intrón de la globina en células de mamíferos y otros animales. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector pcDV1 de expresión de ADNc de Okayama-Berg (Pharmacia), pCDMB8, pRc/CMV, pcDAN1, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL). Ventajosamente, los vectores de la invención descritos antes comprenden un marcador seleccionable y/o puntuable. Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de huéspedes transformados, por ejemplo células vegetales, callos, tejido vegetal y plantas son bien conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, resistencia anti-metabolitos como base de selección de dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglicosidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, es decir trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (WO 94/20627 y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995),
2336-2338).

Los marcadores puntuables útiles también son conocidos por los expertos en la técnica y son asequibles comercialmente. Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica la luciferasa (Giacomin, PI: Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), la proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o la \beta-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para un rastreo simple y rápido de las células, tejidos y organismos que contienen un vector de la invención.

Células huésped y expresión de las proteínas de fusión y patogenicidas

La presente invención se refiere adicionalmente a células huésped que comprenden un vector como se ha descrito antes o un polinucleótido según la invención. El vector o polinucleótido según la invención que está presente en la célula huésped puede estar integrado en el genoma de la célula huésped o puede ser mantenido de alguna forma extracromosómicamente.

La células huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal o animal. Se prefieren las células fúngicas, por ejemplo, aquellas del género Saccharomyces, en particular aquellas de la especie S. Cerevisiae.

Otro sujeto de la invención es un método para la preparación de las proteínas de fusión y los patogenicidas descritos antes que comprende el cultivo de células huésped según la invención que, debido a la presencia de un vector o un polinucleótido según la invención son capaces de expresar semejante proteína, en condiciones que permiten la expresión y opcionalmente el ensamblaje de la proteína de fusión o el patogenicida y la recuperación de la proteína así producida del cultivo. Dependiendo de los constructos específicos y de las condiciones utilizadas, la proteína puede ser recuperada de las células, del medio de cultivo o de ambos. Para la persona experta en la técnica es bien sabido que no sólo es posible expresar una proteína nativa sino también expresar la proteína en forma de polipéptidos de fusión o añadir secuencias señal que dirigen la proteína a compartimentos específicos de la célula huésped, v.g., asegurando la secreción del péptido en el medio de cultivo, etc. Además, semejante proteína y fragmentos de la misma pueden ser sintetizados químicamente y/o modificados según los métodos normalizados descritos, por ejemplo
aquí.

La presente invención se refiere además a patogenicidas moleculares codificados por los polinucleótidos según la invención o producidos mediante el método descrito antes. En este contexto, también se entiende que las proteínas de fusión y los patogenicidas según la invención pueden ser modificados adicionalmente mediante métodos convencionales conocidos en la técnica.

Promotores vegetales y elementos de control de la expresión

Los constructos de fusión son expresados en plantas o bien establemente en plantas transgénicas o bien transitoriamente bajo el control de cualquier tipo de promotor que sea activo en las plantas. Para la resistencia a largo plazo en plantas huésped, se prefiere una producción con elevado rendimiento de proteínas recombinantes, expresión
estable.

En general, tales elementos reguladores comprenden un promotor activo en células vegetales. Para obtener la expresión en todos los tejidos de una planta transgénica, se utilizan preferiblemente promotores constitutivos, tales como el promotor 35S de AcMV (Odell, Nature 313 (1985), 810-812) o promotores de los genes de poliubicuitina de maíz (Christensen, Plant Mol. Biol. 18 (1982), 675-689). Con el fin de lograr la expresión en tejidos específicos de una planta transgénica es posible utilizar promotores específicos de tejidos (ver, v.g., Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Son ejemplos adicionales:

a): Elementos de control de la expresión (v.g. los promotores enumerados más abajo en b a f, las secuencias intensificadoras, los intensificadores transcripcionales y traduccionales, los terminadores de la transcripción, los sitios de poliadenilación etc.) y un marcador seleccionable si fuera necesario.

b): Promotores constitutivos tales como CaMV-35S (Benfey y col., 1989) y el promotor nos (Mitra y Gynheung, 1989).

c): Promotores subgenómicos virales.

d): Promotores específicos de tejidos y promotores quiméricos (Ni y col., 1995), (Comai y col., 1990).

e): Promotores inducibles (Caddick y col., 1998).

f): Sistemas de expresión transitoria (Kapila y col., 1997).

Son conocidos los promotores que son activos específicamente en tubérculos de patatas o en semillas de diferentes especies vegetales, tales como maíz, Vicia, trigo, cebada etc. Los promotores inducibles pueden ser utilizados con el fin de poder controlar exactamente la expresión. Un ejemplo de promotores inducibles son los promotores de genes que codifican proteínas de choque térmico. Asimismo se han descrito elementos reguladores específicos de microesporas y sus usos (WO 96/16182). Además, se puede emplear el sistema Tet inducible químicamente (Gatz, Mol. Gen. Genet. 227 (1991); 229-237). Otros promotores adecuados adicionales son conocidos por las personas expertas en la técnica y se describen, v.g. en Ward (Plant Mol. Biol. 22 (1993), 361-366). Los elementos reguladores pueden comprender adicionalmente intensificadores transcripcionales y/o traduccionales funcionales en células vegetales. Además, entre los elementos reguladores se pueden incluir señales de terminación de la transcripción, tales como una señal de poli-A, que conduce a la adición de una cola de poli-A al transcrito que puede mejorar su estabilidad.

Además, en principio es posible modificar la secuencia codificadora de tal manera que la proteína sea localizada en cualquier compartimento deseado de la célula vegetal. Entre estos se incluyen el retículo endoplasmático, la vacuola, la mitocondria, los plástidos, el apoplasto, el citoplasma etc. Los métodos para llevar a cabo estas modificaciones y para que las secuencias señal aseguren la localización en un compartimento deseado son bien conocidos por las personas expertas en la técnica.

Transformación

Los métodos para la introducción del ADN foráneo en las plantas también son bien conocidos en la técnica. Entre estos se incluyen, por ejemplo, la transformación de células o tejidos vegetales con T-ADN utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes, la fusión de protoplastos, la transferencia génica directa (ver, v.g. EP-A 164 575), la inyección, la electroporación, los métodos biolísticos como el bombardeo de partículas y otros métodos conocidos en la técnica. Los vectores utilizados en el método de la invención pueden contener elementos funcionales adicionales, por ejemplo secuencias "borde izquierdo" y "borde derecho" del T-ADN de Agrobacterium que permiten la integración estable en el genoma de la planta. Además, los métodos y vectores son conocidos por el experto en la técnica que permite la generación de plantas transgénicas libres de marcadores, es decir, el gen seleccionable y puntuable se pierde en una cierta fase del desarrollo de la planta o de la reproducción de la planta. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante transformación simultánea (Lyzink, Plant Mol. Biol. 13 (1989), 151-161; Peng, Plant Mol. Biol. 27 (1995), 91-104) y/o utilizando sistemas que emplean enzimas capaces de promover la recombinación homóloga en plantas (ver, v.g. WO 97/08331; Bayley, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 353-361); Lloyd, Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 653-657; Maeser, Mol. Gen. Genet. 230 (1991), 170-176; Onouchi, Nucl. Acids Res. 19 (1991), 6373-6378). Los métodos para la preparación de vectores apropiados los describe, v.g. Sambrook (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Las cepas de Agrobacterium tumefaciens y los vectores adecuados así como la transformación de Agrobacteria y los medios de crecimiento y desarrollo apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en la técnica anterior (GV3101 (pMK90RK), Koncz, Mol. Gen. Genet. 204 (1986), 383-396; C58C1 (pGV 3850kan), Deblaere, Nucl. Acid Res. 13 (1985), 4777; Bevan, Nucleic. Acid Res. 12 (1984), 8711; Koncz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 8467-8471; Koncz, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 963-976; Koncz, Specialised vectors for gene tagging and expression studies. En: Plant Molecular Biology Manual Vol. 2, Gelvin y Schilperoort (Eds.), Dordrecht, Holanda; Kluwer Academic Publ. (1994), 1-22; EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant Sci., 4, 1-46; An, EMBO J. 4 (1985), 277-287). Aunque en el método de la invención se prefiere el uso de Agrobacterium tumefaciens, se pueden utilizar otras cepas de Agrobacterium, tales como Agrobacterium rhizogenes, por ejemplo si se desea el fenotipo conferido por dicha cepa.

Los métodos para la transformación utilizando métodos biolísticos son bien conocidos por los expertos en la técnica; ver, v.g., Wan, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558 y Christou (1996) Trends in Plant Science 1, 423-431. La microinyección se puede realizar como se describe en Potrykus y Spangenberg (eds.), Gene Transfer To Plants. Springer Verlag, Berlin, NY (1995).

La transformación de la mayoría de las plantas dicotiledóneas es posible con los métodos descritos antes. Pero también para la transformación de monocotiledóneas se han desarrollado numerosas técnicas de transformación útiles. Entre estas se incluyen la transformación utilizando métodos biolísticos, v.g., como se ha descrito antes así como la transformación de protoplastos, electroporación de células parcialmente permeabilizadas, introducción de ADN utilizando fibras de vidrio, etc.

La transformación se puede realizar utilizando cualquier método que conduzca a la expresión de uno o varios constructos en una planta y estos métodos pueden ser utilizados para la transformación estable en la que se incorpora un gen de interés en el ADN de la planta huésped o en la que un constructo es expresado transitoriamente. Entre los ejemplos de la tecnología de la transformación se incluyen:

a): Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes (Turpen y col., 1993; White, 1992): basada en la inserción de un ADN foráneo en el genoma de la planta llevada a cabo en un ADN plasmídico dentro de la agrobacteria. El gen foráneo es insertado en el genoma de la planta junto con las secuencias plasmídicas bacterianas.

b): Bombardeo de partículas (Sanford y col., 1990), (Klein y Fitzpatrick-McElligot, 1993) o procedimiento biolístico (Furth, 1997): En el bombardeo de partículas se utilizan partículas recubiertas con el ADN que penetra en la célula vegetal a alta velocidad y el ADN es incorporado en el genoma del huésped mediante procedimientos de recombinación del huésped. Además de los procedimientos biolísticos de bombardeo de partículas también se incluyen los métodos de inyección.

c): Electroporación de tejidos (Chowira y col., 1995; D'Halluin y col., 1992); bajo la influencia de un campo eléctrico, el ADN penetra por los poros de la membrana celular de la planta y es incorporado en el genoma de la planta mediante recombinación.

d): Uso de liposomas o métodos que incrementan la absorción del ADN libre (Spörlein y Koop, 1991; White, 1992).

e): Cualquier método para la integración de ADN foráneo en una célula vegetal dando como resultado plantas transformadas transitoriamente o establemente.

Plantas diana

La presente invención se refiere a células vegetales transgénicas que contienen un polinucleótido, un vector o una composición de vectores de la invención. Preferiblemente, dicho polinucleótido o vector está establemente integrado en el genoma.

Como resulta inmediatamente evidente para un experto en la técnica, los vectores de la presente invención pueden llevar moléculas de ácido nucleico que codifiquen los dominios del anticuerpo, la proteína de fusión o el patogenicida de la invención ya sea solos o combinados. Lo mismo se aplica a las células vegetales, tejidos vegetales y plantas descritas antes, transformadas con ellos. Del mismo modo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden estar bajo el control de los mismos elementos reguladores o pueden estar controladas separadamente para su expresión. Con respecto a esto, la persona experta en la técnica apreciará fácilmente que las moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios de la proteína de fusión o el patogenicida pueden ser expresadas en forma de un ARNm sencillo como fusiones transcripcionales y opcionalmente traduccionales. Esto significa que los dominios son producidos como polipéptidos separados o en última opción como un polipéptido de fusión que es madurado adicionalmente a las proteínas individuales, por ejemplo por medio de un sitio de escisión para proteinasas que haya sido incorporado entre las secuencias de aminoácidos de ambas proteínas. Los dominios de la proteína resultantes pueden ser auto-ensamblados después in vivo. Por supuesto, los dominios pueden ser expresados en forma de un polipéptido bi- o multifuncional, preferiblemente dispuesto por medio de un conector peptídico que permita ventajosamente suficiente flexibilidad de ambas proteínas. Preferiblemente dicho conector peptídico comprende aminoácidos plurales, hidrófilos, unidos a péptidos de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C-terminal de una de dichas proteínas y el extremo N-terminal de la otra de tales proteínas cuando dicho polipéptido adopta una conformación adecuada para la actividad biológica de ambas proteínas cuando se disponen en solución acuosa en la célula vegetal. Se pueden encontrar ejemplos de las estrategias de expresión descritas antes en la literatura, v.g. para el ARNm dicistrónico (Reiniciación) en Hefferon, J. Gen. Virol. 78 (1997), 3051-3059, las proteínas de fusión se describen en Brinck-Peterson, Plant Mol. Biol. 32 (1996), 611-620 y Hotze, FEBS Lett. 374 (1995), 345-350; se estudian proteínas bifuncionales en Lamp, Biochem. Biophys. Res. Com. 244 (1998), 110-114 y Dumas, FEBS Lett. 408 (1997), 156-160 y el péptido conector y la proteasa son referidos en Doskeland, Biochem. J. 313
(1996), 409-414.

En una realización preferida de la invención, la célula vegetal transgénica comprende un marcador seleccionable. Como se ha descrito antes, se pueden emplear diversos marcadores seleccionables según la presente invención. Ventajosamente, se pueden utilizar marcadores seleccionables que sean adecuados para la selección directa de plantas transformadas, por ejemplo el gen de la fosfinotricin-N-acetiltransferasa cuyo producto génico destoxifica el herbicida L-fosfinotricina (glufosinato o BASTA); ver, v.g., De Block, EMBO J. 6 (1987), 2513-1518 y Dröge, Planta 187 (1992), 142-151.

La presencia y la expresión de los polinucléotidos o vectores en las células de la planta transgénica conducen a la síntesis de una proteína de fusión, anticuerpo o patogenicida de la invención o al ensamblaje de los mismos que tiene una influencia sobre la resistencia al patógeno en las plantas que contienen semejantes células.

Así, la presente invención también se refiere a plantas transgénicas y tejidos vegetales que comprenden células vegetales transgénicas según la invención. Debido a la expresión de una proteína de fusión, el anticuerpo contra la proteína del movimiento y/o la replicasa viral o el patogenicida de la invención o sus dominios, v.g. en compartimentos celulares y/o tejido vegetal estas plantas transgénicas pueden mostrar diversas modificaciones fisiológicas, de desarrollo y/o morfológicas en comparación con las plantas de tipo salvaje. Ventajosamente, estas plantas transgénicas muestran una resistencia contra un patógeno al que la correspondiente planta de tipo salvaje era susceptible.

En general, las plantas que pueden ser modificadas según la invención pueden derivar de cualquier especie de planta deseada. Pueden ser plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, preferiblemente pertenecen a especies vegetales de interés en agricultura, cultivo para madera u horticultura, tales como plantas de cultivos (v.g. maíz, arroz, cebada, trigo, centeno, avenas etc.), patatas, plantas productoras de aceite (v.g. aceite de colza, girasol, cacahuete, soja, etc.) algodón, remolacha, caña de azúcar, plantas leguminosas (v.g. judías, guisantes etc.) plantas productoras de madera, preferiblemente árboles, etc.

En otro aspecto más, la invención también se refiere a las partes cosechables y al material de propagación de las plantas transgénicas según la invención. Las partes cosechables pueden ser en principio cualquiera de las partes útiles de una planta, por ejemplo, hojas, tallos, frutos, flores, semillas, raíces etc. Entre el material de propagación se incluyen, por ejemplo, semillas, frutos, esquejes, plántulas, tubérculos, rizomas etc.

Estuches

Además, la presente invención se refiere a un estuche que comprende los anticuerpos, proteínas de fusión, patogenicida, polinucleótidos o vectores descritos antes. El estuche de la invención puede contener ingredientes adicionales tales como marcadores de selección y componentes para medios selectivos adecuados para la generación de las células vegetales, tejidos vegetales o plantas transgénicos. El estuche de la invención puede ser utilizado ventajosamente para llevar a cabo el método de la invención y podría ser empleado, entre otros, en una variedad de aplicaciones, v.g. en el campo del diagnóstico o como herramienta de redireccionamiento. Las partes del estuche de la invención pueden ser empaquetadas individualmente en viales o combinadas en recipientes o unidades de múltiples recipientes. La fabricación del estuche sigue preferiblemente procedimientos normalizados que son conocidos por los expertos en la técnica. El estuche o sus ingredientes según la invención pueden ser utilizados en cultivos de células vegetales y tejidos vegetales, por ejemplo en agricultura. Se espera que el estuche de la invención y sus ingredientes sean muy útiles en la reproducción de nuevas variedades, por ejemplo, de plantas que muestren propiedades mejoradas tales como las descritas aquí.

También resulta inmediatamente evidente para un experto en la técnica que los polinucléotidos y vectores de la presente invención pueden ser empleados para producir plantas transgénicas con un rasgo adicionalmente deseable debido a la ingeniería genética (ver para la revisión TIPTEC Plant Product & Crop Biotechnology 13 (1995), 312-397). Este puede ser, por ejemplo, una resistencia adquirida a otros patógenos o mejoras de la calidad de las plantas que comprenden (i) tolerancia a herbicidas (DE-A-3701623; Stalker, Science 242 (1988), 419), (ii) resistencia a insectos (Vaek, Plant Cell 5 (1987), 159-169), (iii) resistencia a virus (Powell, Science 232 (1986), 738-743; Pappu, World Journal of Microbiology & Biotechnology 11 (1995), 426-437; Lawson, Phytopathology 86 (1996), 56 supl.), (vi) resistencia al ozono (Van Camp, Biotech, 12 (1994), 165-168), (v) mejora de la conservación de los frutos (Oeller, Science 254 (1991), 437-439), (vi) mejora de la composición y/o producción del almidón (Stark, Science 242 (1992), 419; Visser, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296), (vii) alteración de la composición de lípidos (Voelker, Science 257 (1992), 72-74), (viii) producción de (bio)polímeros (Poirer, Science 256 (1992), 520-523), (ix) alteración del color de las flores, v.g. manipulando la ruta biosintética de la antocianina y los flavonoides (Meyer, Nature 330 (1987), 667-678, WO 90/12084), (x) resistencia a bacterias, insectos y hongos (Duering, Molecular Breeding 2 (1996), 297-305; Strittmatter, Bio/Technology 13 (1995), 1085-1089; Estruch, Nature Biotechnology 15 (1997), 137-141), (xi) inducción y mantenimiento de la esterilidad masculina y/o femenina (EP-A1 0 412 006; EP-A1 0 223 399; WO 93/25695), y (xii) remedio de suelos contaminados (Cunningham, TIBTECH 13
(1995), 393-397).

Estas y otras realizaciones son descritos y abarcados por medio de la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se puede recabar literatura adicional concerniente con cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se van a emplear según la presente invención de bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo se puede utilizar la base de datos pública "Medline" que está disponible en Internet, por ejemplo en http:\www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Son conocidas por los expertos en la técnica bases de datos y direcciones adicionales, tales como http:\www.ncbi.nim.nih.gov/, http:\www.infobiogen.fr/, http:\www.fmi.ch.biology/research_tools.html, http:\www.tigr.org/, y también pueden ser obtenidas utilizando, v.g., http://www.lycos.com. Una vista global de la información de patentes en biotecnología y una vista de conjunto de las fuentes relevantes de la información de patentes útiles para la búsqueda retrospectiva y para el conocimiento actual se dan en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una descripción de diversas orientaciones para la presentación del patogenicida molecular en membranas celulares. Los patogenicidas moleculares recombinantes pueden ser dirigidos por señales celulares y expresados en diversas orientaciones sobre las membranas celulares, por ejemplo: A: cuando la proteína recombinante da al citosol o al espacio extracelular después de la fusión a un dominio transmembrana o tras la modificación lipídica post-traduccional y B: cuando la proteína recombinante es fusionada a una proteína con 4 dominios transmembrana. En C y D se muestran posibles orientaciones de toxinas. Además, la toxina y/o el fragmento de anticuerpo recombinante pueden ser fusionados al extremo C de cualquiera de las estructuras de proteína ejemplares.

N: amino terminal de la proteína; C: carboxi terminal de la proteína; tm: dominio transmembrana; rAb: fragmento de anticuerpo recombinante o dominio de unión.

La Figura 2 muestra constructos ejemplares para el anclaje a la membrana de scFv24 en la membrana plasmática de la célula vegetal (ver ejemplo 1). 35SS; promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor con un intensificador duplicado; CHS 5'-UT: región no traducida 5' de la chalcona sintasa: Péptido líder; secuencia líder murina original de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal parental 24; V_{L}: Dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal parental 24; V_{H}: Dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal parental 24; Conector: secuencia del conector de 14 aminoácidos; c-myc: secuencia etiquetada con el epítopo c-myc; TcR\beta: Cadena \beta del receptor de las células T humano; PDGFRTM: dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas; Term; secuencia de terminación del virus del mosaico de la Coliflor.

La Figura 3 muestra constructos ejemplares para la presentación del patogenicida molecular dando al citoplasma celular. 35SS: promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor con un intensificador duplicado; CHS 5'-UT: región no traducida 5' de la chalcona sintasa: V_{L}: Dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal parental 24; V_{H}: Dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal parental 24; Conector 1: secuencia del conector de 14 aminoácidos (Genex 212); Conector 2: secuencia del conector de 10 aminoácidos (Gly4Ser)2; Term; secuencia de terminación del virus del mosaico de la Coliflor.

La Figura 4 muestra constructos ejemplares para las proteínas de fusión al anticuerpo de la proteína de la envuelta viral y diversas proteínas de fusión anticuerpo-proteína portadoras potenciales; scFv24: anticuerpo de cadena sencilla derivado del mAb24 monoclonal parental que reconoce un neotopo sobre la superficie de viriones de TMV intactos; GST: Glutation S-transferasa de Schistosoma japonicum; Secuencia omega: región no traducida 5' del virus del Mosaico del Tabaco; conector: secuencia conectora de 10 aminoácidos (Gly_{4}Ser)_{2}; His6: secuencia etiquetada con el epítopo de 6 restos histidina; 35SS: promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor con un intensificador duplicado; TRXec: Tiorredoxina de Escherichia coli; TRXnt; Tiorredoxina de Nicotiana tabacum; CP: monómero de la proteína de la envuelta del virus del Mosaico del Tabaco; TMV 3' UT: región no traducida 3' del Virus del Mosaico del tabaco.

La Figura 5 muestra la estrategia y los constructos ejemplares para el ensamblaje del patogenicida molecular in vivo utilizando una interacción anticuerpo:antígeno como pareja de unión para el ensamblaje in vivo. Los dos participes en la unión son una etiqueta epitópica y un anticuerpo de elevada afinidad que reconoce específicamente esta etiqueta epitópica. Para ensamblar un complejo de patogenicida molecular-proteína, el anticuerpo específico del epítopo es fusionado genéticamente a un anticuerpo específico del patógeno y la etiqueta del epítopo es fusionada genéticamente a la secuencia de la toxina. Ambas proteínas recombinantes son expresadas después en el mismo compartimento celular. El anticuerpo específico del epítopo se une al epítopo expresado sobre la superficie de la toxina. Esta interacción de alta afinidad da después un complejo patogenicida molecular-proteína, que reconoce específicamente el patógeno y porta una actividad tóxica. El conector 4 puede codificar sitios de escisión para proteasas específicas. Los anticuerpos específicos del epítopo y del patógeno también pueden ser incluidos en los constructos en la misma orientación pero donde el anticuerpo específico del epítopo preceda al anticuerpo específico del patógeno en la dirección 5' a 3'.

A: esquema del ensamblaje del complejo patogenicida molecular-proteína en un compartimento celular; B: Constructos ejemplares que muestran dos posibles disposiciones (Ab1 y Ab2) de los dominios V_{L} y V_{H} individuales de los fragmentos de anticuerpo tanto específico del patógeno como específico del epítopo; C: dos posibles disposiciones (Tox 1 y Tox 2) para las proteínas de fusión epítopo-toxina.

La Figura 6 muestra la estrategia y los constructos ejemplares para el ensamblaje del patogenicida molecular in vivo utilizando una interacción cadena pesada de anticuerpo:cadena ligera de anticuerpo como parejas de unión para el ensamblaje in vivo. Las dos parejas de unión son una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo que reconoce específicamente esta etiqueta epitópica. Para ensamblar un complejo de patogenicida molecular-proteína, el anticuerpo específico del epítopo es fusionado genéticamente a un extremo C de una cadena pesada del anticuerpo específico del patógeno. Tanto la cadena pesada como la cadena ligera del anticuerpo recombinante son expresadas después en el mismo compartimento celular, donde son ensambladas por medio de puentes disulfuro para dar un complejo patogenicida molecular-proteína, que reconoce específicamente el patógeno y porta una actividad tóxica. El conector 1 puede codificar sitios de escisión para proteasas específicas o el anticuerpo específico del epítopo que reconoce una toxina etiquetada con un epítopo. Asimismo, la toxina puede ser fusionada al extremo N de la cadena pesada del anticuerpo utilizando un conector 1, o el extremo N o C de la cadena ligera.

A: esquema del ensamblaje final del patogenicida molecular ensamblado. B: Constructos ejemplares.

La Figura 7 muestra un constructo de ADNc para el redireccionamiento y la expresión de scFv24 sobre las membranas celulares de la planta. Los ADNc de los dominios de la cadena ligera (V_{L}) y pesada (V_{H}) variables de mAb24 conectados por un conector de 14 aminoácidos fueron fusionados al dominio transmembrana TcR\beta humano y clonados en los sitios de restricción EcoRI y XbaI del vector de expresión de la planta pSS (33). La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFV24-TcR\beta se representa en la SEC ID NUM: 3. 35SS = promotor CaMV-35S doblemente intensificado; CHS-5'-UT = región no traducida 5' de la chalcona sintasa; LP = secuencia señal de la cadena ligera mAb24 murina; c-myc = etiqueta del epítopo con c-myc; TM = dominio transmembrana; TCaMV = secuencia de terminación CaMV.

La Figura 8 muestra los niveles de scFv24-TcR\beta funcional en líneas celulares en suspensión de N. Tabacum cv. BY-2 transgénico. Los niveles de producción de scFv24 en los extractos de células de BY-2 de tabaco y el sobrenadante de cultivo fueron analizados mediante ELISA utilizando los antisueros anti-mAb24 e indicados como ng de scFv24 por g de material celular. T1_{BY-2}-T2_{BY-2} = líneas de células en suspensión BY-2 transgénicas que producen scFv24-TcR\beta.

La Figura 9 muestra análisis de transferencia Western de una planta de tabaco T_{1} que produce scFv24-TcR\beta. Se separaron cantidades equivalentes de proteína de los fluidos de lavado intercelular y de proteínas solubles totales de una planta T_{1} que producía scFv24-TcR\beta (calle 1 y 2) en un gel SDS-PAGE reductor al 12% (p/v) y se transfirieron a nitrocelulosa. La proteína recombinante fue detectada utilizando un antisuero anti-mAb24 de conejo como anticuerpo primario y anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario y seguido de tinción con NBT/BCIP. Se indican los pesos moleculares estimados de proteínas recombinantes (Marcador). IWF = fluido de lavado intercelular; TSP = proteína soluble total.

La Figura 10 muestra la localización subcelular de scFv24-TcR\beta anclado a membrana en protoplastos de N. Tabacum cv. BY-2 transgénico mediante inmunofluorescencia indirecta. Los protoplastos fijados de las células BY-2 no transgénicas (A) y de la línea T2_{BY-2} que producía scFv24-TcR\beta (B, C, D) fueron marcados utilizando anticuerpo anti-mAb24 como anticuerpo primario seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con FITC (A, B, D) o utilizando anticuerpo anti-TcR\beta humano como anticuerpo primario, seguido de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con FITC (C). Aumento = X400.

La Figura 11 muestra la localización por inmunomarcado con oro de scFv24- en hojas de N. Tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico. Se rastrearon con sonda secciones ultrafinas de la línea vegetal T4_{SR1} que producía scFv24-TcR\beta con anticuerpo primario de antisuero anti-mAb24 de conejo y anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con partículas de oro de 12 nm. Las cabezas de flecha indican el inmunomarcaje con oro de plasma celular y membrana nuclear de la planta scFv24-TcR\beta anclado a membrana.

La Figura 12 muestra constructos de ADNc para dirigir a membranas celulares de la planta y expresar en ellas scFv24 citosólico. El ADN de scFv24, que comprende los dominios de la cadena ligera variable (V_{L}) y de la cadena pesada (V_{H}) conectados por un conector 212 de 14 aminoácidos (conector 2), fueron fusionados a los dominios transmembrana C-terminales utilizando el conector Gly_{4}Ser (conector 1) y subclonados en el vector de expresión vegetal pSS. A) Vectores que se dirigen al citoplasma que contienen un dominio transmembrana C-terminal. B) Vector de control que se dirige al citoplasma que carece de un dominio transmembrana (la construcción de este vector es descrita por: Zimmermann y col., 1998). 35SS = promotor 35 de CaMV intensificado; CHS 5'UT = región no traducida 5' de la chalcona sintasa; KAR1 = dominio transmembrana de KAR1 para la integración en el membrana nuclear; mT = dominio transmembrana del antígeno T medio para la de integración en la membrana plasmática; cytb5 = dominio transmembrana del citocromo b5 para la integración en la membrana del RE; syn1 = dominio transmembrana de sinaptobrevina 1 para la integración en la membrana; His6 = etiqueta de histidina 6; c-myc: etiquetada epitópica c-myc; TcAMV = secuencia de terminación de CaMV. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-kar1 se representa en la SEC ID NUM: 12. El uso del codón del dominio transmembrana KAR1 de levadura fue adaptado al tabaco, al trigo y al guisante; excepto los codones TGT (Cys) y CTT (Leu) que son codones poco comunes para el trigo. El codón ATA para Ile (en el dominio transmembrana) también es un codón nada frecuente para el trigo y el codón CTG para Leu (en el dominio transmembrana) es un codón poco común para el guisante y el tabaco, pero ambos codones son necesarios para introducir un sitio de restricción Bst1107. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-mT se muestra en la SEC ID NUM: 13. El uso del codón del dominio transmembrana del antígeno T medio de polimovirus murino fue adaptado a tabaco, trigo y guisante. El codón GCG para Ala y el codón CTG para Leu (ambos en el dominio transmembrana) son codones poco comunes para el tabaco y el guisante, pero ambos eran necesarios para introducir un sitio de restricción Eco47-3. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-cytb5 se muestra en la SEC ID NUM: 14. El uso del dominio transmembrana b5 del citocromo de hígado de rata fue adaptado al tabaco, el trigo y el guisante; excepto que el codón C-terminal (Asp) que es un codón nada frecuente para el trigo. El codón GCG para Ala (en el dominio transmembrana) también es un codón nada frecuente para el guisante y el tabaco y el codón ATA para Ile (en el dominio transmembrana) es un codón nada frecuente para el trigo pero ambos codones son necesarios para introducir un sitio de restricción EcoRV. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-syn1 se representa en la SEC ID NUM: 15. El uso del codón del dominio transmembrana de la sinaptobrevina humana fue adaptado al tabaco, el trigo y el guisante; excepto el último codón (Asp) que es un codón nada frecuente para el trigo.

La Figura 13 muestra un constructo de ADNc para la dirección y expresión de scFv24-PE400. El ADNc de scFv24, que comprende los dominios de la cadena ligera variable (V_{L}) y de la cadena pesada (V_{H}) conectados por un conector 212 de 14 aminoácidos (conector 2), fueron fusionados al dominio III de la exotoxina de Pseudomonas C-terminal utilizando un conector de celobiohidrolasa I (CBH) de Trichoderma reesi y subclonado en el vector de expresión vegetal pSS. 35SS = promotor de CaMV-35S intensificado; CHS 5'UT = región no traducida 5' de chalcona sintasa; LP = secuencia señal de la cadena ligera de mAb24 murino; conector 1 = conector Gly_{4}Ser; tag 54 = etiqueta epitópica; TcAMV = secuencia de terminación de CaMV. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-PE400 se representa en la SEC ID NUM: 18.

La Figura 14: Patogenicida molecular basado en una fusión de una cadena sencilla (scFv24) a ARNasa E de E. coli. Los dos dominios del patogenicida fueron conectados por un péptido conector Gly-Gly-Gly corto. Esta composición puede ser modificada de múltiples maneras utilizando diferentes anticuerpos scFv que se unan a proteínas diana virales estructurales y no estructurales, a otros genes de ARNasa o a dominios de los mismos fusionados al extremo N o C de cualquier ADNc de scFv seleccionado.

La Figura 15 muestra constructos para la expresión de proteínas de fusión scFv24 en el citoplasma y el RE de células vegetales. El ADNc de scFv24, que comprende los dominios de la cadena ligera variable (V_{L}) y de la cadena pesada (V_{H}) conectados por un conector 212 de 14 aminoácidos (conector 2), fueron fusionados a CP utilizando el conector (Gly_{4}Ser)_{2} (conector 1) y subclonados en el vector de expresión vegetal pSS. A) Vectores que se dirigen al citoplasma que contienen una secuencia His6 o KDEL C-terminal. B) Vectores de control que se dirigen al citoplasma que carecen de pareja para la fusión. C) Vector de retención del RE. D) Vector que se dirige al apoplasto (la proteína de fusión es secretada al apoplasto y entrará en la célula uniéndose a los viriones de TMV invasores). 35SS = promotor de CaMV-35S intensificado; \cdot = región no traducida 5' de TMV; LP = secuencia del péptido líder de ratón original de codón optimizado de mAb24; CP = proteína de la envuelta de TMV partícipe en la fusión; His6 = etiquetado con histidina 6; KDEL = señal de retención del RE; Pw = región no traducida 3' de TMV. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de CP-scFv24H se muestra en la SEC ID NUM: 24. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de CP-scFv24K se muestra en la SEC ID NUM: 25. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de scFv24H se muestra en la SEC ID NUM: 26. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de scFv24K se muestra en la SEC ID NUM: 27. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de L-CP-scFv24K se muestra en la SEC ID NUM:28.

La Figura 16 muestra los niveles de proteína de las proteínas de fusión scFv retenidas en el RE. Los niveles de N. Tabacum cv. Petite Havana SR1 fueron transformados transitoriamente con la agrobacteria recombinante conteniendo el constructo L-CP-scFv24K e incubada durante tres días. La proteína soluble total fue aislada y los niveles de proteína de fusión scFv24 funcional fueron cuantificados en un ELISA específico para TMV e indicados como ng por gramo de material foliar. La columna representa el valor medio para cuatro hojas. Se indican las desviaciones
típicas.

La Figura 17 muestra el análisis de transferencia Western de las proteínas de fusión retenidas en el RE. El L-CP-scFv24K purificado por afinidad fue separado mediante SDS-PAGE al 12% y las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias fueron rastreadas mediante sonda con anticuerpo primario mAb29 específico de CP seguido de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra y anti-conejo de cabra conjugados con fosfatasa alcalina y tinción con NBT/BCIP. Calle 1: Marcador proteico teñido previamente; Calle 2: L-CP-scFv24K purificado por afinidad de TMV.

La Figura 18 muestra los niveles de las proteínas de fusión expresadas en el citoplasma. Se transformaron transitoriamente hojas de N. benthamiana con la agrobacteria recombinante y se incubaron durante tres días. La proteína soluble total fue aislada y los niveles de scFv24 funcional, expresado como parte de las proteínas de fusión, fueron cuantificados en un ELISA específico de TMV e indicados como ng por gramo de material foliar. Cada columna representa el valor medio de cuatro hojas y demuestra los niveles de proteína de los constructos CP-scFv24H y scFv24H conteniendo una secuencia His6 C-terminal y los niveles de proteína de los constructos CP-scFv24K y scFv24K conteniendo una secuencia KDEL C-terminal. Las desviaciones típicas se indican con barras.

La Figura 19 muestra la clonación de anticuerpos específicos de la proteína del movimiento 30K de TMV en el vector de expresión vegetal pSSH1. Los fragmentos de cadena sencilla obtenidos mediante la presentación en fagos fueron subclonados en la casete de expresión BISCA2429 (Fischer y col., (1999) Eur. J. Biochem. 262, 810-816) utilizando sitios de restricción NcoI/SalI. Los constructos temporales resultantes (secuencia omega 5'-UTR de TMV, scFv, etiqueta His6) fueron subclonados en el vector de expresión vegetal pSSH1 utilizando el ensamblaje mediante subclonación con EcoRI/XbaI del vector final para la transformación y la expresión vegetal (promotor 35 SS, secuencia omega 5'-UTR de TMV, scFv, etiqueta His6, 3'-UTR y Terminador de CaMV) del scFv anti-30K.

La Figura 20 muestra la reactividad en ELISA de 10 anticuerpos scFv específicos de 30K diferentes frente a GST-30K (biotinilada y no biotinilada) y GST (A) y la Reactividad en ELISA de los mismos 10 fragmentos scFv frente a cinco dominios Diferentes de la proteína del movimiento 30K expresada como proteínas de fusión con GST. (B) Los scFv específicos de 30K fueron seleccionados a partir de una banco de fagos derivado de ratones inmunizados con GST-30K.

La Figura 21 muestra los restos aminoácido de dos scFv seleccionados que se unen a la proteína del movimiento 30K de TMV obtenidos mediante presentación en fagos utilizando ratones inmunizados con GST-30K para la amplificación basada en PCR de fragmentos V_{H} y V_{L}. scFv 30-1 = scFv específico de 30K Núm. 1, scFv 30-2 = scFv específico de 30K Núm. 2. Los restos aminoácido fueron derivados la secuenciación del ADNc de los respectivos clones de ADNc de scFv derivados de fagos como se ha descrito (Figura 19).

La Figura 22 muestra el transcurso del tiempo (44h, 48h, 52h, 56h, 62h y 72h después de la incubación, p.i.) para controlar la acumulación de proteína de la envuelta en plantas que expresan scFv anti-30K transgénicas y no transgénicas detectada mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo específico de la proteína de la envuelta de TMV (mAb 24) tras la incubación con TMV vulgare. SR1 = plantas de tipo salvaje SR1, NC = control negativo (SR1 Transgénico que expresa el scFvT84.66 anti-tumoral).

La Figura 23 muestra secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de ADNc de anticuerpos scFv antivirales obtenidos mediante recuperación del hibridoma (Figura 24) dirigidos contra la proteína del movimiento 3a de CMV (23a), un componente de la replicasa de TMV (23b, 54K de TMV) y una proteína mínima de virus vegetal (23c, 3min de PLRV).

La Figura 24 muestra la competencia de unión entre los anticuerpos y el ssARN de PLRV. Se incubaron 100 ng de la proteína GST-3min durante 30 minutos a la temperatura ambiente o bien con las cantidades indicadas de anticuerpos anti-3m policlonales (pAb, calles 3, 4, 5 y 6), anticuerpo anti-3min (mAb, calles 7, 8, 9 y 10) y anticuerpos anti-GST policlonales (calle 1) o bien sin anticuerpo (calle 2). Los complejos fueron mezclados con 0,5 ng de sonda de ssARN marcada radiactivamente, incubados durante 25 minutos a 4ºC e irradiados con luz UV a la temperatura ambiente. Tras la digestión del ARN no protegido mediante ARNasa A, los complejos fueron analizados mediante SDS-PAGE al 15% y el gel seco fue autorradografiado.

Figura 25 Mapeo de epítopos de los tres anticuerpos antivirales diferentes es decir (a) mAb 29 (ver Ejemplo 1), (b) scFv 54-1 (Ejemplo 6, Figura 23b, Figura 29) y (c) scFv 3a-2 (Ejemplo 6, Figura 23a). Las secuencias fueron obtenidas de clones positivos al ELISA de fagos después de la tercera serie de reconocimiento y selección ("biopanning") utilizando dos bancos de presentación de péptidos (Cortese y col., (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 73-80). Las secuencias resultantes fueron alineadas y el epítopo consenso fue determinado. En cada caso el epítopo pudo ser cartografiado dentro de la secuencia parental de las diferentes secuencias virales analizadas.

Figura 25a: Cartografía de epítopos y secuencia consenso de mAb 29 utilizando la presentación de péptidos y dos bancos de presentación de péptidos diferentes (banco al azar de 9meros (pVIII 9aa) y banco restringido de 9meros (9aa.Cys)). A partir del banco al azar de 9meros se pudieron caracterizar y secuenciar 10 clones positivos diferentes, a partir del banco restringido de 9meros se caracterizaron 5 clones positivos. Ambos bancos daban como resultado la identificación del mismo epítopo basado en una secuencia consenso que pudo ser cartografiada dentro de la secuencia de la proteína de la envuelta de TMV.

Figura 25b: Cartografía de epítopos y secuencia consenso de scFv 54-1 utilizando la presentación de péptidos (banco lineal de 9meros). A partir del banco lineal de 9meros se pudieron caracterizar y secuenciar 4 clones positivos diferentes, dando como resultado la identificación del mismo epítopo scFv basado en una secuencia consenso que pudo ser cartografiada dentro de la proteína 54K.

Figura 25C: Cartografía de epítopos y secuencia consenso de scFv 3min utilizando la presentación de péptidos y dos bancos de presentación de péptidos diferentes (banco al azar de 9meros (pVIII 9aa) y 9meros (9aa.Cys). A partir del banco lineal de 9meros se pudieron caracterizar y secuenciar 8 clones positivos diferentes, a partir del banco restringido de 9meros se caracterizaron 7 clones positivos. Ambos bancos daban como resultado la identificación del mismo epítopo basado en una secuencia consenso que pudo ser cartografiada dentro de la región limítrofe de GST-3min.

La Figura 26 muestra un constructo de ADNc para estudiar el ensamblaje de proteínas recombinantes. Los constructos para la expresión de biscFv2429, PE280-tag20 y PE400-tag29 en el apoplasto de las células vegetales y GST-tag29 en bacterias.

A) los ADNc de scFv, compuestos por mAb24 y mAb29, dominios de la cadena ligera variable (V_{L}) y de la cadena pesada (V_{H}) conectados por un conector 212 de 14 aminoácidos (conector 2), fueron fusionados utilizando el conector CBHI. biscFv2429 fue subclonado en el vector de expresión vegetal pSS. B) PE280 compuesto por el dominio PE II (aa 280-364) y el dominio III (aa 381-609) fue fusionado con el epitag-29 por medio del conector Gly_{4}Ser (conector 1).
PE280-tag29 fue subclonado en el vector de expresión pSS. C) PE400 compuesto por el dominio PE III (aa 381-609) fue fusionado al epitag-29 por medio de un conector Gly_{4}Ser (conector 1). PE400-tag29 fue subclonado en el vector de expresión vegetal pSS. D) El epitag-29 fue fusionado al extremo C de GST por medio de un conector Gly_{4}Ser (conector 1) en el vector pGEX-5X-3. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de PE280-tag29 se muestra en la SEC ID NUM. 161. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de PE400-tag29 se muestra en la SEC ID NUM: 162.

35SS = promotor CaMV-35S doblemente intensificado; Ptac = promotor tac; CHS-5'-UT = región 5' no traducida de la chalcona sintasa; LP = péptido líder de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino mAb24; GST = glutation S-transferasa; his6 = etiqueta histidina 6; tag29 = epitag-29; TCaMV = secuencia de terminación de CaMV.

La Figura 27 muestra la detección de GST-tag29 mediante inmunotransferencia. Se separaron diluciones seriadas de GST-tag29 producido en bacterias y purificado por afinidad en PBS (A) o extracto de proteína de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 (B) en un gel SDS-PAA reductor al 12% (p/v) y transferidas a nitrocelulosa. La proteína recombinante fue detectada utilizando rAb29 y anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario y seguido de tinción con NBT/BCIP. Se indican las cantidades de GST-tag29 cargadas y los pesos moleculares del marcador proteico antes de la tinción.

La Figura 28 muestra la simulación del ensamblaje in vivo mediante ELISA. El ensamblaje de biscFv2429 de plantas transgénicas y GST-tag-29 producido en bacterias seguido de purificación por afinidad fue analizado mediante ELISA. Los componentes fueron añadidos en el siguiente orden a la placa de microtitulación: anticuerpos anti-TMV de conejo TMV policlonales (7 \mug/ml), BSA al 1% para el bloqueo, viriones de TMV (1 \mug/ml), extractos vegetales de una planta transgénica que produce biscFv2429 (diluidos 1:10 o 1:100), mAb anti-GST de ratón, GST-tag29 expresado bacterianamente (1 \mug/ml), anticuerpo anti-Fc de ratón de cabra marcado con fosfatasa alcalina diluida 1:5.000 y sustrato. Los controles se realizaron utilizando extractos de una planta de tabaco no transgénica. Los niveles de ensamblaje in vivo se indican como la DO a 405 nm. Cada columna representa el valor medio de dos experimentos ELISA independientes. Las desviaciones típicas se indican con barras.

La Figura 29 muestra una inmunotransferencia de hojas de tabaco transformadas transitoriamente con PE280-tag29. Las hojas de tabaco transformadas utilizando agrobacteria recombinante fueron incubadas durante 72 horas y el extracto de proteína fue aislado. Se separaron 15 \mul y 5 \mul de proteínas solubles totales de hojas de tabaco que producían PE280-tag29, 10 \mul de una planta no transgénica (WT) y 400 ng de GST-tag29 purificado por afinidad como control sobre un gel SDS-PAGE reductor al 12% (p/v) y se transfirieron a nitrocelulosa. La proteína recombinante fue detectada utilizando un mAb anti-GST de ratón como anticuerpo primario y un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario, seguido de detección por quimioluminiscencia. La flecha indica la posición de la banda de PE280-tag29 degradada. Se indican los pesos moleculares de un marcador previamente teñido.

La Figura 30 muestra un constructo de ADNc para dirigir y expresar scFv24 sobre membranas celulares vegetales. Los ADNc de los dominios de la cadena ligera variable (V_{L}) y pesada (V_{H}) de mAb24 conectados por un conector 14 Genex-212 aminoácidos (36) fueron fusionados al PDGFR y clonados en los sitios de restricción EcoRI y XbaI del vector de expresión vegetal pSS (33). 35SS = promotor CaMV-35S doblemente intensificado; CHS-5'-UT = región 5' no traducida de la chalcona sintasa; c-myc = etiqueta epitópica c-myc; TM = dominio transmembrana; TCaMV = secuencia de terminación de CaMV. La secuencia de ADN del fragmento EcoRI/XbaI de pscFv24-PDGFR se representa en la SEC ID NUM: 163.

La Figura 31 muestra los niveles de scFv24-PDGFR funcional en líneas celulares en suspensión de N. tabacum cv. BY-2 transgénico. Los niveles de producción de scFv24 en extractos celulares de tabaco BY-2 y el cultivo sobrenadante fueron analizados mediante ELISA utilizando antisuero anti-mAb24 y son indicados como ng de scFv24 por g de material celular. P1_{BY-2}-P8_{BY-2} = líneas celulares en suspensión BY-2 transgénicas que producen scFv24-PDGFR.

La Figura 32 muestra el análisis de transferencia Western de plantas de tabaco T_{1} que producen scFv24-PDGFR. Se separaron cantidades equivalentes de proteína de fluidos de lavado intercelular y proteínas solubles totales de tres plantas T_{1} que producían scFv24-PDGFR en un gel SDS-PAGE reductor al 12% (p/v) y se transfirieron a nitrocelulosa. La proteína recombinante fue detectada utilizando antisuero anti-mAb24 de conejo como anticuerpo primario y anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario (A) o bien utilizando un anticuerpo anti-c-myc murino como anticuerpo primario y anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina como anticuerpo secundario (B) y seguido de tinción con NBT/BCIP. Se indican los pesos moleculares estimados de las proteínas recombinantes (marcador). IWF = fluido de lavado intercelular; TSP = proteína soluble
total.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan para describir mejor la práctica y las aplicaciones de la presente invención y no deben ser considerados una descripción limitante ni interpretados como límite del alcance ni de las aplicaciones de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que se pueden realizar diversas modificaciones de los métodos y genes descritos sin apartarse sustantivamente del espíritu y el alcance de la presente invención.

Ejemplo 1 Expresión de un anticuerpo anti-viral integrado en la membrana Expresión dirigida a la membrana plasmática de un anticuerpo recombinante contra la proteína de la envuelta del virus del Mosaico del Tabaco (TMV)

Se efectúan las siguientes etapas:

1): Se generan anticuerpos contra la proteína de la envuelta de TMV, viriones intactos o péptidos de la proteína de la envuelta específicos y monoclonales mediante tecnología del hibridoma.

2): Se clonan líneas celulares de hibridoma y secuencias de ADNc que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo para generar un anticuerpo recombinante o cualquier versión recombinante del mismo. Esto se logra utilizando oligonucleótidos específicos pesados y ligeros del anticuerpo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa utilizando ARNm aislado de un único clon de hibridoma. Esto permite clonar el anticuerpo de tamaño normal;

3): Los ADNc de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo específico de tamaño normal clonados de la etapa 2 se utilizan como molde para la amplificación de los dominios variables de la cadena pesada y ligera utilizando cebadores oligonucleótidos específicos incluyendo una secuencia peptídica conectora (es decir, GENEX 212 o (Gly_{4}Ser)_{n}) y la reacción en cadena de la polimerasa con prolongación del solapamiento del empalme. Esta etapa proporciona después el fragmento de anticuerpo de cadena sencilla y los dos dominios variables se conectan por medio de una secuencia de 14 aminoácidos.

4): El gen scFv recombinante de la etapa 3 es insertado en un vector de expresión microbiano o eucariótico.

5): La especificidad de unión y la función del scFv recombinante (es decir la especificidad y la afinidad por un antígeno diana) se verifican tras la expresión del constructo de la etapa 4 en un huésped heterólogo, tal como periplasma de E. coli, utilizando ELISA, resonancia superficial de plasmón o transferencia western.

6): Se añade una secuencia señal al extremo 5' de la secuencia de nucleótidos del scFv recombinante de la etapa 3. Se añade una secuencia peptídica conectora 3' (dominio constante del receptor de células T humanas) seguido después de la adición de una secuencia transmembrana 3' de la cadena \beta del receptor de las células T. Entre las secuencias de localización transmembrana adecuadas también se incluyen el dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR).

7): Se añade la región 5' no traducida de la chalcona sintasa al extremo 5' del constructo de la etapa 6.

8): El gen quimérico de la etapa 7 es insertado después en un vector de expresión vegetal, tal como PSS (Voss y col., 1995), aguas arriba de la región 3' no traducida del virus del Mosaico de la Coliflor, o cualquier otra fuente y la región de terminación del virus del Mosaico de la Coliflor aguas abajo del promotor 35SS (Figura 2). Este vector también contiene un marcador seleccionable. En el caso de la transferencia génica sin marcador y sin vector, se pueden omitir las secuencias marcadoras.

9): Se transforma Agrobacterium tumefaciens mediante transformación en N_{2} con el constructo de la etapa 8.

10): Se verifican la expresión y la función del constructo scFv recombinante en plantas mediante expresión transitoria en células vegetales y ELISA, resonancia superficial de plasmón o transferencia western.

11): Se generan plantas transgénicas transfiriendo el constructo de la etapa 8, y un marcador de selección rastreable, que está presente en el vector de expresión pSS (v.g. el gen NPT-II para la resistencia a la kanamicina), al genoma vegetal mediante transformación mediada por Agrobacteria.

12): Se rastrean plantas regeneradas utilizando el marcador de selección para la integración del gen de fusión.

13): Se sigue la expresión de la proteína de fusión en plantas regeneradas sometiendo a transferencia western extractos celulares, mediante ELISA o análisis de resonancia superficial de plasmón.

14): La actividad de la proteína de fusión expresada (es decir, la afinidad y la especificidad) se verifica mediante ELISA utilizando viriones de TMV intactos como antígeno.

15): La localización de la proteína de fusión se verifica mediante inmunofluorescencia indirecta, o microscopía confocal o microscopía inmuno-electrónica.

16): La actividad del anticuerpo al generar resistencia contra los virus se somete a ensayo mediante bioanálisis de infección viral de las plantas transgénicas, generadas en las etapas 11 a 12 utilizando viriones o transcritos infecciosos.

La orientación de proteína de membrana de Tipo II o Tetraspan puede ser explotada para permitir la presentación de patogenicidas moleculares al citoplasma tras su síntesis en la ruta secretora. Para la presentación citoplásmica de scFv recombinante, se repiten las etapas 6) a 16) del ejemplo 1 con las siguientes adaptaciones. La secuencia de localización en la membrana C-terminal que incluye la secuencia conectora y la secuencia líder de la etapa 6 del ejemplo 1 se separan y se añade un conector adecuado y una secuencia de redireccionamiento N-terminal perteneciente a la familia del tetraspán al anticuerpo recombinante específico del patógeno para dirigir e integrar post-traduccionalmente las proteínas recombinantes en la bicapa de las membranas plasmáticas. Entre las membranas adecuadas de la familia del tetraspán se incluyen CD9, CD20, CD81 y el híbrido In-Hc-Ic dualspan tipo II-IV de la cadena invariable de MHC y la proteína híbrida H-2^{d}. Este método permite la orientación de un constructo de anticuerpo secretado y anclado a la membrana con sus extremos N y C en el citosol.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos y clonarlos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. Las secuencias ancla a la membrana pueden ser sustituidas frente a cualquier secuencia que facilite la integración en las membranas y proporcione una función biológica. Por otra parte, se puede combinar el ejemplo 1 con la expresión de cualquiera de los ejemplos 2-8 en cualquier combinación que proporcione una elevada resistencia a la enfermedad.

Construcción de la casete de expresión de fusión con scFv24

Para integrar el scFv24 específico de TMV en la membrana celular de la planta, se fusionó el fragmento de anticuerpo a un péptido señal de mamífero N-terminal y un dominio transmembrana receptor C-terminal. El péptido señal de la cadena ligera N-terminal de ratón del anticuerpo de origen (mAb24) utilizado para generar scFv24 fue utilizado para dirigir las proteínas de fusión a la ruta secretora. La secuencia del dominio transmembrana de la cadena \beta del receptor de las células T humanas (TcR\beta) fue seleccionado para la fusión con el extremo C de scFv24, para la dirección heteróloga del anticuerpo scFv24 a la membrana plasmática. Para asegurar el plegamiento apropiado de los fragmentos del anticuerpo de cadena sencilla expresados, el constructo contenía la región constante de TcR\beta (pscFv24-TcR\beta) como secuencia conectora entre el fragmento scFv24 y el ancla a la membrana (Figura 7). La clonación del fragmento scFv24CM de cadena sencilla anti-virus del mosaico del tabaco (anti-TMV) específico del neotopo que incluía el péptido líder ha sido descrita (Zimmermann y col. (1998). Para generar el constructo de fusión pscFv24-TcR\beta (Figuras 2 y 7), un fragmento de ADNc que codificaba el dominio constante y transmembrana de la cadena TcR\beta humana (Yoshikai y col. Nature 312:521-524 (1984)) fue amplificado mediante PCR a partir de ARNm de bazo humano (Clontech, Heidelberg, Alemania) utilizando los cebadores 5'-GCC GTC GAC GAG GAC CTG AAC AAG GTG TTC CCA-3' (SEC ID NUM: 1) Y 5'-GCC TCT AGA TCA GAA ATC CTT TCT CTT G-3' (SEC ID NUM: 2). Los cebadores contenían sitios de restricción SalI y XbaI (cursiva) para permitir la clonación en marco del producto de la PCR con scFv24CM (Zimmermann y col. 1998) dando como resultado el constructo final scFv24-TcR\beta.

Para la expresión en células vegetales, el fragmento EcoRI/XbaI (figura 7) de scFv24-TcR\beta fue subclonado en los sitios de restricción EcoRI y XbaI del vector de expresión vegetal pSS (Voss y col., (1995)) conteniendo el promotor 35S intensificado (Kay y col. (1987)) y la secuencia de terminación de CaMV (Figura 7, pscFv24-TcR\beta).

Expresión de las proteínas de fusión de scFv24 en suspensiones celulares de N. tabacum cv. BY-2

Para analizar el nivel de expresión de la proteína de fusión scFv recombinante fue transformada establemente con A. tumefaciens recombinante y la expresión funcional del dominio scFv24 de la proteína de fusión fue analizado mediante ELISA utilizando antisuero anti-mAb24.

El constructo vector pscFv24-TcR\beta fue transferido a A. tumefaciens GV3101 mediante transformación en N_{2} líquido (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16:9877 (1988)). Se mantuvieron células de N. tabacum L. cv. amarillo brillante (BY-2) en base salina de Murashige y Skoog con sustancias orgánicas mínimas (MSMO+: MSMO (Sigma, Deisenhofen, Alemania) más 200 mg/ml de KH_{2}PO_{4}, 0,6 Mg/ml de tiamina, sacarosa al 3% y 0,2 \mug/ml de 2,4-D, pH 5,8) a 24ºC en la oscuridad sobre un aparato de sacudimiento orbital. Las células fueron subcultivadas cada semana con un inóculo al 5%. Tres días después del subcultivo, las células vegetales fueron transformadas mediante cultivo simultáneo con A. tumefaciens recombinante, como se ha descrito (An, Plant Physiol. 79:568-570 (1985)). La selección de transformantes resistentes a la kanamicina fue realizada sobre medio de agar MSMO+ suplementado con 75 \mug/ml de kanamicina y 100 \mug/ml de Claforan.

Para la extracción de las proteínas solubles totales del cultivo en suspensión de BY-2 transgénico, las células de 1 ml de cultivo fueron recogidas por centrifugación a 4.000 X g durante 5 minutos a 4ºC. El sedimento celular fue resuspendido en 1 ml de tampón de extracción de proteína (Tris-HCl 200 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) y Tween 20 al 0,1% (v/v)) y las células fueron desorganizadas mediante sonicación a 60 watios durante 1 minuto utilizando una sonda de sonicación (B. Braun, Melsungen, Alemania) a 4ºC. El desecho celular fue separado por centrifugación a 14.000 X g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante claro que contenía proteína soluble fue utilizado para un análisis adicional.

Para el ELISA y la transferencia western, se utilizó antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col. (1998)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA). Las concentraciones de proteína fueron determinadas con el Análisis de Proteínas de Bio-Rad utilizando Seralbúmina Bovina (BSA) como patrón. El análisis de las células de N. tabacum BY-2 transformadas establemente reveló que scFv24-TcR\beta era completamente intracelular (Figura 8). ScFv24-TcR\beta no era detectable en el sobrenadante de cultivo, indicando que el dominio transmembrana TcR\beta es estable y adecuado para el redireccionamiento de scFv24 a membranas celulares de tabaco.

Caracterización de plantas transgénicas

Después se sometió a ensayo si el dominio transmembrana de mamífero heterólogo TcR\beta fusionado a scFv24 dirigiría el anticuerpo de cadena sencilla a la membrana plasmática en plantas de tabaco transformadas establemente. Se generaron N. tabacum cv. Petit Havana SR1 transgénicas mediante transformación de discos foliares con A. tumefaciens recombinante y se generaron plantas transgénicas T_{0} a partir de callos transformados (Horsch y col., Science 227: 1229-1231 (1985)). La extracción de proteínas solubles totales a partir de hojas de tabaco y el posterior análisis de scFv24 mediante ELISA fueron realizados como describe Fischer y col. [Fischer R, Drossard J, Liao YC, Schillberg S: Characterisation and applications of plant-derived recombinant antibodies. En: Cunningham C, Porter AJR (eds), Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana Press, Totowa, NJ (1988)]. Para el ELISA y la transferencia western, se utilizó antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col. (1998)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA). Las concentraciones de proteína fueron determinadas con el Análisis de Proteínas de Bio-Rad utilizando Seralbúmina Bovina (BSA) como patrón. Los niveles de expresión de scFv24-TcR\beta fueron mucho mayores en N. tabacum cv. Petite Havana SR1 que en los cultivos en suspensión (Tabla 1). El nivel máximo de scFv24-TcR\beta extraído con detergente era 296 veces superior (8.866 ng/g de tejido foliar) que el obtenido en cultivos en suspensión transgénicos (Figura 8).

Para determinar si el fragmento scFv24 estaba integrado establemente en la membrana plasmática o era secretado en el espacio extracelular de plantas intactas, se analizó mediante ELISA el fluido de lavado intercelular de hojas de plantas de tabaco transgénicas T_{1}. Para la detección de la proteína de fusión scFv24 en fluidos de lavado intercelulares, se prepararon hojas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 como describen Fischer y col., (Fischer: Characterisation and applications of plant-derived recombinant antibodies. En: Cunningham C, Porter AJR (eds), Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana Press, Totowa, NJ (1988)). Los extractos de proteínas totales de los fluidos de lavado fueron concentrados mediante ultrafiltración (Microcon 10, Amicon, Witten, Alemania) y analizados mediante SDS-PAGE al 12% (Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)) seguido de transferencia western. No había anticuerpo detectable en el fluido de lavado intercelular de diez progenies T_{1} de dos líneas vegetales (T4_{SR1} y T6_{SR1}) que producían la proteína de fusión scFv24-TcR\beta. En general, las plantas T_{1} utilizadas para el análisis IWF mostraban elevados niveles de expresión de scFv24-TcR\beta intracelular (1.570-8.490 ng/g de tejido foliar).

El análisis de transferencia western de la proteína soluble total aislada de una progenie T_{1} de la línea vegetal T4_{SR1} mostraba solamente la proteína de fusión scFv24-TcR\beta de longitud normal pronosticada y no eran detectables proteína de fusión intacta ni productos de degradación en el fluido de lavado intercelular (Figura 9). Esto demuestra que scFv24-TcR\beta no era secretado y permanecía anclado a la membrana en plantas transgénicas.

Localización subcelular de scFv24-TcR\beta en protoplastos de N. tabacum cv. BY-2 transgénico

Puesto que el constructo scFv24-TcR\beta contiene secuencias del péptido señal y transmembrana, la proteína de fusión podía ser localizada en la membrana plasmática. Para determinar la localización subcelular de la proteína de fusión, se generaron protoplastos de N. tabacum cv. BY-2 y se analizaron mediante microscopía de inmunofluorescencia (Figura 10).

Los protoplastos fueron preparados mediante digestión de células de tabaco BY-2 de 3 días de edad con celulasa Onozuka RS al 1,5% (p/v) (Yakult Honsha Co., Tokio, Japón), hemicelulasa al 0,7% (p/v) (Sigma) y pectoliasa Y23 al 0,1% (p/v) (Seishin Pharmaceuticals, Nihonbashi, Tokio, Japón) en tampón MES (MES al 0,5% (p/v), CaCl_{2} 80 mM, manitol 0,3 M, pH 5,8) durante 1,5 horas a 25ºC en un aparato de sacudimiento rotatorio. Los protoplastos fueron lavados con tampón MES, transferidos a medio MSMO+ de nueva aportación e incubados durante la noche a 24ºC en un aparato de sacudimiento orbital en la oscuridad. Los protoplastos en regeneración fueron lavados una vez con tampón MES y se dejó que se sedimentaran sobre portas de múltiples pocillos recubiertos de poli-L-lisina. Las células fueron fijadas durante 15 minutos a la temperatura ambiente con formaldehído al 4% (p/v) en tampón MTS (Pipes 50 mM, EGTA 5 mM, Mg_{2}SO_{4} 5 mM, pH 6,9) más manitol 0,3 M. Los fantasmas de protoplasto resultantes fueron lavados con tampón MTS e incubados durante 1 hora a la temperatura ambiente con una dilución 1:2.500 de antisuero anti-mAb24 de conejo (Zimmermann y col. (1998)) o una dilución 1:50 de IgG anti-TcR\beta humano de ratón (T Cell Diagnostics, Woburn, MA) en tampón MTS con BSA al 3% (p/v) suplementado con manitol 0,3 M. Las células fueron lavadas con tampón MTS e incubadas después durante 1 hora a la temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-conejo de cabra conjugado con FITC o anti-ratón de cabra conjugado con FITC (Jackson Immuno Research Laboratories) diluido 1:100 en tampón MTS con BSA al 3% (p/v) suplementado con manitol 0,3 M. Después de lavar con tampón MTS, los portas fueron montados en Citifluor (anti-debilitamiento) (Citifluor Ltd., Londres, Inglaterra) y se formaron imágenes en un microscopio invertido Zeiss equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40X utilizando una excitación de 450-490 nm y filtros de interferencia de la emisión de 520-560 nm. Las imágenes fueron registradas en una película T-max 400pro (Kodak,
Rochester, NY).

Las enzimas de subdivisión de las paredes de la célula ("protoplasting") contienen proteasas que degradan las proteínas de la superficie celular y no era detectable la tinción de la superficie celular directamente después de la subdivisión de las paredes de la célula en las células BY-2. Sin embargo, la regeneración durante la noche de los protoplastos permitió la liberación de scFv24 unido a membrana recién sintetizado a la superficie celular y dio una tinción óptima. Las células de N. tabacum cv. BY-2 de tipo salvaje de control no mostraban evidencia de tinción superficial (Figura 10A). En contraste, los protoplastos derivados de la línea celular en suspensión de N. tabacum cv. BY-2 transgénica T2_{BY-2} productora de scFv24-TcR\beta eran teñidos de manera brillante con suero anti-Ab24 en la membrana plasmática, demostrando la localización en la membrana plasmática de la proteína de fusión scFv24-TcR\beta (Figura 10B). Además, la localización de scFv24-TcR\beta con respecto a la membrana plasmática también fue observada tiñendo con anticuerpo anti-TcR\beta humano, que reconoce la región constante de TcR\beta que conecta el dominio transmembrana a scFv24 (Figura 10C). Además, del marcaje en la membrana plasmática, algunos protoplastos mostraban tinción nuclear para scFv24-TcR\beta-proteína de fusión (Figura 10D).

Microscopía inmunoelectrónica

Se realizó la microscopía inmuno-electrónica sobre secciones ultra-finas de hojas, para verificar la localización del scFv24 unido a la membrana.

Se embebieron pequeños trozos de plantas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénicas a baja temperatura para el inmunomarcaje con oro (Wells, Micron and Microscopica Acta 16: 49-53 (1985)). El marcaje mediante inmunomarcaje con oro de secciones finas sobre gradillas de oro recubiertas con una película de plástico se llevó a cabo como se ha descrito previamente (McCann y col. J. Microsc. 166: 123-136 (1992)), excepto que el tampón de bloqueo utilizado para las incubaciones con anticuerpos contenía BSA al 3% (p/v). Anticuerpos primarios: antisuero anti-mAb24 de conejo a una dilución 1:100 (Zimmermann y col. (1998)) o IgG anti-TcR\beta humano de ratón a una dilución 1:25 (T Cell Diagnostics), fueron incubados con las secciones durante 1 hora. Los anticuerpos secundarios eran anti-conejo de cabra conjugado con oro 12 nm o anti-ratón de cabra conjugado con oro 12 nm (Jackson Immuno Research Laboratories) y fueron incubados con las secciones a una dilución 1:40 durante 1 hora. Las microfotografías ópticas de campo brillante de secciones de resina de 1 \mum de grosor fueron vistas a 80 kV sobre un microscopio electrónico de transmisión Joel 1200EX, y las fotografías fueron tomadas utilizando una película Kodak.

En hojas jóvenes de la planta transgénica T4_{SR1} T_{0} que producía scFv24-TcR\beta, se localizó scFv24 tanto en la membrana nuclear como plasmática (Figura 11), confirmando la localización subcelular de scFv24-TcR\beta mediante inmunofluorescencia en protoplastos de N. tabacum cv. BY-2 transgénico. El número de partículas de oro encontrado en los cloroplastos, mitocondrias, glioxisomas, matrices citoplásmicas y vacuolas era coherente con el marcaje de fondo.

Bioanálisis de la resistencia viral

Para analizar los efectos biológicos el anticuerpo específico de TMV anti-viral anclado a la membrana sobre la resistencia viral, se inocularon progenies T_{1} de una línea vegetal que expresaba la proteína de fusión scFv24-TcR\beta (T6_{SR1}) con TMV.

Se recogieron semillas de plantas T_{0} productoras de anticuerpo y se hicieron germinar sobre medio de agar MSMO suplementado con sacarosa al 2% (p/v), 0,4 \mug/ml de tiamina, 0,4 \mug/ml de glicina, 0,1 \mug/ml de ácido nicotínico, 0,1 \mug/ml de piridoxina y 75 \mug/ml de kanamicina. Las plantas T_{1} resistentes a la kanamicina fueron utilizadas para la inoculación con TMV-v (1 \mug/ml) como se ha descrito previamente (Dietzgen, Arch. Virol. 87:73-86 (1986)). Se utilizaron como control plantas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 de tipo salvaje. Los síntomas de la enfermedad fueron controlados entre los 6 y 20 días posteriores a la inoculación (p.i.) y para las plantas resistentes hasta 180
días p.i.

Las hojas inferiores fueron infectadas con TMV y la diseminación sistémica del virus estuvo seguida del análisis de las plantas superiores 6-20 días más tarde. Todas las plantas de tabaco no transgénicas de control fueron infectadas sistémicamente, pero el 16% (de 31 analizadas) de las plantas transgénicas scFv24-TcR\beta no tenían síntomas visibles de enfermedad en las hojas superiores (Tabla 2). Además, el análisis mediante ELISA demostró que algunas de estas plantas acumulaban partículas de virus en las hojas superiores indicando que aunque se producía la diseminación viral sistémica, no se desarrollaban síntomas. Sorprendentemente, en el 6% de las plantas transgénicas scFv24-TcR\beta no se encontró virus en las hojas superiores hasta 90 días después de la inoculación. Se pudo detectar el virus en sitios de inoculación en las hojas inferiores mediante ELISA demostrando que estas plantas habían sido eficazmente inoculadas con TMV. Los niveles de expresión de anticuerpo-proteína de fusión se correspondían con la expresión de la resistencia a TMV (Tabla 2). Los niveles superiores de scFv24-proteína de fusión conducían a una fracción incrementada de plantas resistentes al virus, confirmando que los scFv anclados a la membrana podían ser utilizados para generar plantas resistentes a virus.

Conclusiones

La proteína de fusión recombinante scFv24-TcR\beta fue expresada funcionalmente en cultivos en suspensión de tabaco transgénico y en plantas transgénicas. El scFv24-TcR reconocía al TMV en un ELISA y mostraba el tamaño esperado en el análisis de inmunotransferencia. Además, la inmunofluorescencia y la microscopía electrónica mostraron que el dominio transmembrana TcR\cdot dirigía el scFv24 al plasma y a la membrana nuclear del tabaco. Los bioanálisis de la infección viral mostraron que las plantas de tabaco transgénicas que expresaban scFv24-TcR\cdot eran resistentes a la infección sistémica por TMV. Estos resultados demostraban que los fragmentos de anticuerpo anti-viral anclados a la membrana son funcionales, pueden ser dirigidos a la membrana plasmática in planta y son un método novedoso para proteger las células vegetales de los patógenos invasores.

TABLA 1

\begin{minipage}[t]{160mm} Niveles de proteína de fusión scFv24 funcional en la generación T_{0} de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico. La proteína vegetal soluble total fue aislada de hojas de plantas transgénicas que producían scFv24-TcR\beta. La expresión de la proteína de fusión scFv24 fue cuantificada mediante un ELISA específico de TMV utilizando antisuero anti-mAb24 y expresada como ng de scFv24 por g de tejido foliar \end{minipage}
Constructo	Número de plantas	Número de plantas que	Intervalo de expresión	Expresión media
	transgénicas	expresan scFv24 funcional	(ng/g de tejido foliar)	(ng/g de tejido foliar)
PscFv-TcR\beta	6	6	30-8.866	1.991

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

\begin{minipage}[t]{160mm} Análisis de la infección viral de plantas transgénicas que expresan scFv24 anclado a la membrana Se aplicó 1 \mug/ml de TMV-v sobre una hoja inferior de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 no transgénico y progenies T_{1} transgénicas de la línea vegetal P9_{SR1} que producía scFv24-PDGFR o T6_{SR1} que producía scFv24-TcR\beta. Los niveles de proteína de fusión scFv24 fueron determinados mediante ELISA utilizando el antisuero anti-mAb24 14 días p.i. y utilizados para la formación de grupos (productores bajos, medios y altos). ^{a} = las hojas superiores no mostraban síntomas de enfermedad visibles; ^{b} = basado en ELISA de TMV; ^{c} = nivel de resistencia de todos los productores bajos, medios y altos, los números entre paréntesis incluyen todas las plantas sin síntomas de enfermedad visibles \end{minipage}
Líneas vegetales	Plantas sometidas	ng scFv24 por g	Fenotipo	Plantas	Nivel de
	a ensayo	de tejido foliar	sano^{a}	resistentes^{b}	Resistencia (%)^{c}
N. tabacum cv.	62	-	0	0	0
Petite Havana SR1

T6_{SR1}, productor bajo	22	10-500	1	0

T6_{SR1}, productor medio	2	501-2000	2	1	6(16)

T6_{SR1}, productor alto	7	2001-21500	2	1

Ejemplo 2 Expresión de un anticuerpo antiviral neutralizador con una secuencia de localización en la membrana C-terminal Presentación citoplásmica de un anticuerpo recombinante localizado en la membrana contra la proteína de la envuelta del virus del Mosaico del Tabaco (TMV)

Las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 se repiten con las siguientes adaptaciones.

1): La secuencia señal N-terminal se separa y se remplaza por un codón de iniciación.

2): La secuencia de localización en la membrana C-terminal que incluía la secuencia conectora del ejemplo 1 fue remplazada por un conector adecuado y secuencias de redireccionamiento C-terminales para dirigir e integrar post-traduccionalmente las proteínas recombinantes a la bicapa de las endomembranas. Entre las secuencias de redireccionamiento adecuadas se incluyen los dominios transmembrana de KAR1 para la integración en la membrana nuclear (Rose y Fimk, 1987), el antígeno T medio para la integración en la membrana plasmática (Kim y col., 1997) y el citocromo b5 para la integración en la membrana del RE (Kim y col. 1997). Por otra parte, se pueden incorporar la prenilación, farnesilación, palmitoilación, miristoilación y unidades de la secuencia de ankirina.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. La secuencia o secuencias de ancla a la membrana pueden ser sustituidas por cualquier secuencia que facilite la integración en la membrana y proporcione una función biológica. Además, el ejemplo 2 puede ser combinado con los ejemplos 1 y 3-8 en cualquier combinación.

Construcción de la casete de expresión de fusión scFv24

Para integrar el scFv24 específico de TMV en la bicapa de endomembranas se fusionó el fragmento de anticuerpo a un dominio transmembrana receptor C-terminal. No se incluyó ninguna secuencia señal N-terminal, por lo tanto el fragmento scFv24 daba al citosol. La secuencia del dominio transmembrana de KAR1 fue seleccionada para la integración en la membrana nuclear (Rose y Fink, 1987), el antígeno T medio para la integración en la membrana plasmática (Kim y col., 1997), el citocromo b5 para la integración en la membrana del RE (Kim y col. 1997) y syn1 para la integración en vesículas (Kim y col., 1997). Para asegurar un plegamiento adecuado de los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla expresados, los constructos scFv24-kar1, scFv24-mT, scFv24-cytb y scFv24-syn1 contenían una secuencia conectora Gly_{4}Ser entre el fragmento scFv24 y el ancla de membrana (Figura 12).

Los dominios transmembrana C-terminales KAR1, T-medio (mT), citocromo b5 (cytb5) y synaptobrevina 1 (syn1) que incluían la secuencia conectora Gly_{4}Ser fueron fusionados a scFv24 mediante PCR. El ADNc de scFv24CW molde (Zimmermann y col. (1998)), el cebador directo -40 (5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3' (SEC ID NUM: 4)) y los siguientes cebadores inversos fueron utilizados para la amplificación por PCR: para kar1 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA AAA CCT ATA ATA CAC ATA GAT GTT GCA ATA AAG CAA AAT CAG TAT ACA AAT AGT CCA CCA GAA ATA CTC CCT ATA CTT CTT AGC GGC CGC AGA ACC TCC ACC TCC GTC G-3' (SEC ID NUM: 5); para mT 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA GAA ATG CCT AGA TCT CTT AAT CAA GAT GAA GAG CAT CAA GCA AAT TCC GAG CAG CGC TGC CAA GAA AGT CAC CAA GAG CAA AGT TCT TCC CAA TCT CCT AGC GGC CGC AGA ACC TCC ACC TCC GTC G-3') SEC ID NUM: 6); para cytb5 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA ATC CTC TGC CAT GTA GAG TCT ATA CAT GAG AGC AAC CAC GAG TGC TGA TAT CGC TGG GAT CAC CCA ATT GGT CCA CCA TGA AGA GTT AGA CTC AAC AGC GGC CGC AGA ACC TCC ACC TCC GTC G-3' (SEC ID NUM: 7) y para syn1 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA AGT GAA GAA ATA AAT AAC AAT AAC AAC AAC AAT AAT AGC ACA AAT AGC ACC AAG CAT AAT CAT CAT CTT ACA ATT CTT CCA AGC GGC CGC AGA ACC TCC ACC TCC GTC G-3' (SEC ID NUM: 8). Los codones de los dominios transmembrana eran codones optimizados para la expresión en tabaco, guisante y trigo. Los fragmentos de la PCR restringidos por 5'-EcoRI y 3'-XbaI fueron subclonados en pUC18 y secuenciados. Las mutaciones del dominio transmembrana mT y syn1 fueron eliminados mediante PCR utilizando el cebador directo -40 (5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3' (SEC ID NUM: 9)) y los cebadores inversos MUT7MT 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA GAA ATG CCT AGA TC-3' (SEC ID NUM: 10) para mT y SYN1SHORT 5'-GGC TCT AGA CGC TCG AGT TTA AGT GAA GAA ATA AAT AAC AAT AAC AAC AAC-3' (SEC ID NUM: 11) para syn1. La región 5' no traducida de la chalcona sintasa y scFv24 fue sustituida por el fragmento EcoRI y SalI de scFv24CW (Zimmermann y col. (1998)). La posterior ligadura de los fragmentos EcoRI-XbaI en el vector de expresión vegetal pSS, que contenía un promotor 35S doblemente intensificado (Voss y col., (1995)), dio como resultado los constructos de expresión finales pscFv24-kar1, pscFv24-mT, pscFv24-cytb5 y pscFv24-syn1 (Figura 12).

Expresión transitoria en hojas de tabaco

Para analizar el nivel de expresión de las proteínas de fusión con scFv recombinante, se transformaron transitoriamente hojas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 con A. tumefaciens recombinante y se analizó el dominio scFv24 de la proteína de fusión mediante ELISA utilizando antisuero anti-mAb24.

Los constructos del vector fueron transferidos a A. tumefaciens GV3101 mediante transformación en N_{2} líquido (Höfgen y Willmitzer (1988)). La transformación transitoria de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 se realizó como se ha descrito (Kapila y col., Plant Science 122 (1996) 101-108). Para extraer las proteínas solubles totales, se congelaron las hojas de Tabaco y se trituraron en nitrógeno líquido y se analizó el nivel de proteína de fusión-scFv mediante ELISA utilizando antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col. (1998)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) (Fischer y col., en: C. Cunninghman, A.J.R. Porter, (Eds.), Methods in biotechnology Vol. 3: Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds. Humana Press, Totowa, MJ (1998), ELISA III).

Las proteínas de fusión scFv24-mT, scFv24-syn1 y el scFv24 de control que carecía de dominio transmembrana C-terminal no fueron detectables en los extractos vegetales de los experimentos de transformación transitoria (límite de detección: 0,5 ng por gramo de tejido foliar). No obstante, scFv24-kar1 y scFv24-cytb5 se acumulaban en el citosol de las células vegetales a un nivel máximo de 1,8 ng y 1,0 ng por gramo de tejido foliar, respectivamente.

Conclusiones

La generación de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transformado establemente y los bioanálisis para analizar los efectos biológicos de scFv24-kar1 y scFv24-cytb5 citosólicos en plantas de tabaco transgénicas están progresando. Basándose en los resultados de los autores de la presente invención con scFv24-TcR\beta (ejemplo 1) se esperaba la integración de las proteínas de fusión en la membrana celular vegetal por medio de los dominios transmembrana C-terminales KAR1 o syn1. El scFv24 da al citosol de la planta, lo que da como resultado una resistencia viral incrementada debido a que el efecto biológico de scFv24 es elevado en el citosol de la planta y la integración en la membrana dirige el scFv24 a la localización en la que el virus es más vulnerable. La replicación del virus y el movimiento tienen lugar en los sistemas de la membrana celular de la planta, por lo tanto se puede evitar eficazmente el desensamblaje viral.

Ejemplo 3 Resistencia viral mediante la expresión de un patogenicida molecular Fusión de una actividad nucleasa a un anticuerpo recombinante específico para TMV

Se repiten las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 y/o las etapas 1) o 2) del ejemplo 2 con las siguientes adaptaciones.

1): El constructo de expresión vegetal contiene una secuencia señal 5' para permitir la liberación del anticuerpo recombinante al lúmen del RE y después la secreción al apoplasto.

2): El dominio de dirección transmembrana se remplaza por un conector que acopla la proteína a una fusión C-terminal con una toxina - en este caso una enzima ARNasa que degrada el ARN celular, el ARN viral, las formas replicativas y/o los intermedios replicativos.

3): Tras unirse a los viriones en el apoplasto, la proteína de fusión entrará en el citosol de las células dañadas por medio de los viriones entrantes, donde la ARNasa citotóxica degradará el ARN viral, los intermedios replicativos y las formas replicativas y/o el ARN celular y causará la muerte celular de las células infectadas viralmente y por lo tanto evitará la replicación y la diseminación del patógeno.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. La secuencia o las secuencias de la ARNasa pueden ser sustituidas por cualquier secuencia enzimática que interfiera en el ciclo vital del patógeno. Por otra parte, el ejemplo 3 puede ser combinado con los ejemplos 1-2 y 4-8 en cualquier combinación.

Construcción de la casete de expresión de fusión con scFv24 (inmunotoxina)

Para generar una inmunotoxina expresada en el apoplasto, se fusionó el scFv24 específico de TMV a un péptido señal de mamífero N-terminal y a una toxina C-terminal. El péptido señal de la cadena ligera N-terminal de ratón del anticuerpo original (mAb24) utilizado para generar scFv24 fue utilizado para dirigir las proteínas de fusión a la ruta secretora. El dominio III de la exotoxina de Pseudomonas (PE) fue seleccionado para la fusión con el extremo C de scFv24. El dominio III de la exotoxina de Pseudomonas media la ribosilación con ADP del factor de elongación 2, que detiene la síntesis de proteínas y ocasiona la muerte celular. Para asegurar el correcto plegado de los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, el constructo de ADNc contenía el conector de la celobiohidrolasa I (CBHI) de Trichoderma reesi (Mallender y Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206) entre el fragmento scFv24 y el dominio III de la PE. Se fusionó una etiqueta epitópica de 12 restos aminoácido (tag54) al extremo C por medio del conector Gly_{4}Ser para permitir la detección de la proteína recombinante en extractos vegetales.

El dominio III de la PE fue amplificado mediante PCR a partir del plásmido PE38 (Theuer y col., Cancer Res 15, 340-347 (1993)) utilizando los cebadores PE400-directo 5'-GCG GAA TTC GAC GTC GCC ATG GCC TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC-3' (SEC ID NUM: 16) y PE-inverso 5'-GCG AAG CTT GTC GAC CGG CGG TTT GCC GGG CTG GCT G-3' (SEC ID NUM: 17). Los cebadores contenían los sitios de restricción EcoRI, AatII y NcoI (PE400 directo) y SalI y HindIII (PE-inverso) para la clonación. El fragmento de la PCR fue subclonado por medio de EcoRI y HindIII en pUC18 dando como resultado el constructo PE400-intermedio y la secuencia fue verificada mediante secuenciación. Para generar la inmunotoxina, se separó la secuencia scFv29 de biscFv2429-apoplasto en pUC18 (Fischer y col., Eur. J. Biochem. 262, 810-816 (1999)) mediante AatII y SalI y se intercambió el fragmento AatII (sitio de restricción interno) y SalI de PE400-intermedio. Finalmente, el fragmento EcoRI y SalI que contenía la región 5' no traducida de la chalcona sintasa, la señal líder de la cadena ligera de mAb24 (Voss y col., 1995), el scFv24, el conector CBHI y el dominio III de PE fue subclonado en los sitios de restricción EcoRI y SalI del derivado pSS que contenía el promotor 35S intensificado (Kay y col., 1987), la etiqueta epitópica tag54 y la secuencia de terminación de CaMV dando como resultado el constructo de expresión vegetal final pscFv24-PE400 (Figura 13).

Conclusiones

La generación de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transformado estable y de bioanálisis para analizar los efectos biológicos de scFv24-PE400 en plantas de tabaco transgénicas está progresando. Sin embargo, PE280-tag29 fue expresado transitoriamente en hojas de tabaco y se detectó un producto ligeramente degradado en extractos vegetales de hojas de tabaco transformadas transitoriamente, indicando que PE280-tag29 es expresado y secretado muy probablemente en el apoplasto y por lo tanto no es tóxico para las células vegetales (ver ejemplo 7). Por consiguiente, la expresión de la imunotoxina scFv24-PE400 no será tóxica para las plantas.

La fusión scFv24-PE (scFv24-PE400) será secretada al apoplasto de plantas de tabaco transgénicas. Durante la infección por TMV la proteína de fusión se unirá a la partícula del virus por medio de scFv24 (como se muestra para rAb24 de tamaño normal) y los viriones de TMV que entran en la célula llevarán la fusión scFv24-toxina. PE400 media la ribosilación con ADP del factor de elongación 2, que detiene la síntesis de proteínas y causa la muerte celular. PE es un toxina muy eficaz, ya que sólo se requieren unas pocas moléculas para destruir la célula infectada, evitando de ese modo la replicación y la diseminación del virus, conduciendo a plantas altamente resistentes.

Fusión del Patogenicida Molecular (fusión de ARNasa)

Una fusión C- o N-terminal de un gen de scFv del anticuerpo específico para la proteína de la envuelta (scFv24) con un ADNc que codifica un gen de la ARNasa (por ejemplo ARNasa E de E. coli) da como resultado una proteína de fusión scFv-enzima que puede ser dirigida al citoplasma vegetal - o a orgánulos celulares, membranas, o al apoplasto para interferir en la replicación viral.

Semejante fusión scFv-ARNasa fue diseñada basándose en el scFv24 específico de TMV que se une a los viriones de TMV intactos en lugar de a la proteína de la envuelta sola. Este scFv24 fue elegido para dirigir el ARN viral en el momento más temprano del ciclo de infección viral para actuar inmediatamente sobre el ARN viral liberado tras el desensamblaje viral. Un segundo constructo está basado en una fusión scFv-ARNasa específica de 30 K que sigue la misma estructura dada en la Fig. 14 basada en el scFv24. Este scFv se describe en el Ejemplo 5 (scFv 30-1 o scFv 30-2) y será expresado simultáneamente con la fusión scFv24-ARNasa E en plantas doblemente transgénicas transformadas con ambos constructos. Para la fusión a los anticuerpos scFv mencionados antes se seleccionó la ARNasa E de E. coli (Claverie-Martin y col., J. Biol. Chem. 266, 2843-2851] y se conectó al scFv tras la amplificación mediante PCR utilizando tecnologías de clonación normalizadas conocidas por los expertos en la técnica.

Ejemplo 4 Resistencia mediada por proteína de la envuelta intensificada con una proteína de fusión anticuerpo-proteína de la envuelta viral Fusión de una proteína de la envuelta viral con un anticuerpo recombinante específico de TMV

Se repitieron las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 y/o las etapas 1) a 2) del ejemplo 2 con las siguientes adaptaciones.

1): El dominio de redireccionamiento transmembrana enumerado en el ejemplo 1 es eliminado pero las secuencias de ancla C-terminal y conectora del ejemplo 2 se pueden mantener.

2): La secuencia señal N-terminal del ejemplo 1 es remplazada por un monómero de la proteína de la envuelta de TMV (N-terminal) localizado aguas arriba y después conectada por medio de un conector flexible al ADNc del anticuerpo recombinante.

3): La proteína de fusión es expresada en el citosol.

4): Alternativamente, el dominio transmembrana es remplazado por un conector que permite la fusión C-terminal con el monómero de la proteína de la envuelta de TMV. La proteína de fusión es expresada en el citosol (sin secuencia señal N-terminal) o enviada a la ruta secretora por medio de un péptido señal N-terminal.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. La secuencia o las secuencias de la proteína de la envuelta N-terminales pueden ser sustituidas por cualquier secuencia (por ejemplo Glutation S-Transferasa, tiorredoxina, proteínas del movimiento de virus vegetales, replicasa, proteínas mínimas o dominios de las mismas) que estabilice un anticuerpo recombinante expresado en el citosol e interfiera en el ciclo vital del patógeno. Además, el ejemplo 4 puede ser combinado con los ejemplos 1-3 y 5-8 en cualquier combinación.

Construcción de las casetes de expresión de la fusión scFv24

Una proteína expresada citoplásmicamente (la proteína de la envuelta del virus del mosaico del tabaco) fue seleccionada como pareja de fusión para analizar su efecto sobre la función y la estabilidad de scFv24 específico de TMV. La proteína de la envuelta del virus del mosaico del tabaco (CP) fue clonada 5' aguas arriba del scFv24 (Figura 15).

La proteína de la envuelta (CP) pareja de fusión génica del TMV fue amplificada mediante PCR. Los ADNc fueron amplificados a partir de un clon de ADNc de TMV como molde. Los cebadores directos introducían un sitio de restricción NcoI (extremo 5') y los cebadores inversos una secuencia conectora C-terminal (Gly_{4}Ser) y un sitio de restricción AatII (extremo 3'). Se utilizaron los siguientes cebadores directo e inverso para la amplificación mediante PCR: CP-directo 5'-ACT GCG CCA TGG CTT ACA GTA TCA CT-3' (SEC ID NUM: 20), CP-inverso 5'-CCG TCA GAC GTC AGA ACC TCC ACC TCC ACT TCC GCC GCC TCC AGT TGC AGG ACC AGA GGT CCA AAC CAA ACC-3' (SEC ID NUM: 21). Los fragmentos de la PCR restringidos con 5'-NcoI y 3'-AatII fueron subclonados en un derivado de pUC18 conteniendo el scFv24 específico de TMV (Zimmermann y col., 1998) flanqueado por la región 5'\Omega no traducida (secuencia omega) y la región 3' no traducida (secuencia Pw) de TMV (Schmitz y col., Nucleic Acids res 24 (1996) 257-263); (Gallie y Kobayashi, Gene 142 (1994) 159-165). Se añadieron una secuencia His6- (H) o KDEL (K) C-terminal a scFv24 del constructo de fusión mediante PCR utilizando los cebadores inversos: His6-inverso 5'-CTA CCC CTC GAG TTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GAG CGG CCG CGT CGA CTG CAG AGA CAG TGA CCA GAG TC-3' (SEC ID NUM: 22) Y KDEL-inverso 5'-CCC TCA CTC GAG TTT AGA GCT CAT CTT TCT CAG ATC CAC GAG CGG CCG CAG AAC CTC CAC CTC CGT CGA CTG CAG AGA CAG TGA CCA G-3' (SEC ID NUM: 23). La posterior ligadura de los fragmentos EcoRI-AscI en el vector de expresión vegetal pSS, conteniendo un promotor 35S doblemente intensificado (Voss y col., 1995), dio como resultado los constructos de expresión final CP-scFv24H y CP-scFv24K, que fueron utilizados para analizar la acumulación de proteína de fusión scFv en el citoplasma (Figura 15A).

Para el redireccionamiento y la retención en el RE, la secuencia líder optimizada del codón vegetal derivado de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino mAb24 (Voss y col., 1995) fue integrada entre la región 5' \Omega no traducida y scFv24 del constructo citoplásmico conteniendo la secuencia KDEL, dando el vector de expresión vegetal L-CP-scFv24K (Figura 15C). Para dirigir el mismo constructo al apoplasto, se remplazó la secuencia KDEL C-terminal por una secuencia His 6, dando el vector de expresión vegetal L-CP-scFv24H (Figura 15D).

Se utilizaron dos vectores de expresión que carecían de secuencia líder y una pareja de fusión N-terminal pero conteniendo scFv24 con una secuencia His6 o KDEL C-terminal como controles para la acumulación citoplásmica (scFv24H, scFv24K, Figura 15B).

Análisis de la acumulación de proteína de fusión en el RE

La acumulación de proteína de fusión funcional en el RE fue analizada mediante la expresión transitoria en hojas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 y el scFv24 funcional fue detectado mediante un ELISA específico de TMV. Los constructos de expresión vegetal fueron transferidos a A. tumefaciens GV3101 por transformación en N_{2} (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res 16 (1988) 9877). La transformación transitoria de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 se realizó como se ha descrito (Kapila y col., Plant Science 122 (1996) 101-108). Para extraer las proteínas solubles totales, se congelaron hojas de tabaco y se trituraron en nitrógeno líquido y se analizó el nivel de proteína de fusión scFv mediante ELISA y transferencia Western (Fischer y col., Methods in biotechnology Vol. 3: Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds. Humana Press, Totowa, NJ (1998), ELISA III). Se utilizó un fragmento Fab de mAb24 como patrón del ELISA. Se determinaron las concentraciones de proteína con BioRad Protein Assay utilizando seralbúmina bovina (BSA) como patrón.

El nivel de scFv24 funcional detectado para la proteína de fusión L-CP-scFv24K retenida en el RE, ascendía a 1 \mug por gramo de material foliar (media de 0,6 \mug por gramo de materia foliar, Figura 16).

Para verificar la integridad de las proteínas de fusión scFv24, se llevó a cabo un análisis de transferencia western utilizando L-CP-scFv24K purificada por afinidad. Para la purificación por afinidad de las proteínas de fusión scFv de extractos vegetales (preparados como se ha descrito antes), se acoplaron viriones de TMV a una matriz de sefarosa activada con CNBr. Se resuspendieron 300 mg de matriz de sefarosa 4B activada con CNBr (Pharmacia, Freiburg, Alemania) en 1 ml de PBS a pH 7,4 (NaCl 1,37 M, KCl 27 mM, Na_{2}HPO_{4} 81 mM, KH_{2}PO_{4} 15 mM) y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente en un aparato giratorio. La matriz fue sedimentada (5.000 x g, 5 minutos, temperatura ambiente), resuspendida en 1 ml de PBS, pH 7,4 conteniendo 10 mg de viriones de TMV e incubada durante 2 horas a la temperatura ambiente en un aparato giratorio. La matriz con el TMV acoplado fue centrifugada (5.000 x g, 5 minutos, temperatura ambiente), resuspendida en 1 ml de PBS pH 7,4 conteniendo BSA al 1% (p/v) y leche en polvo al 1% (p/v) y rotada durante la noche a 8ºC para bloquear los sitios de unión no específicos. La matriz con el TMV acoplado fue lavada tres veces con PBS pH 7,4 y resuspendida en 1 ml de PBS pH 7,4. Se añadieron 30 \mul de matriz con TMV a 1,5 ml de extracto vegetal (preparado como se ha descrito antes) y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente en un aparato giratorio. Después la matriz con TMV se lavó tres veces con PBS y las proteínas unidas a la matriz con TMV fueron solubilizadas en el tampón de la muestra y analizadas mediante SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685) y tinción con azul brillante de Coomassie. Las proteínas de fusión intactas fueron detectadas con el tamaño esperado de 49,5 kDa para L-CP-scFv24K (Figura 17).

Análisis de la acumulación de proteína de fusión en el citoplasma

Para la acumulación citoplásmica transitoria de proteínas de fusión se utilizaron hojas de N. benthamiana. Los constructos del vector fueron transferidos a A. tumefaciens GV3101 mediante transformación en N_{2} líquido (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids res. 16: 9877 (1988)). La transformación transitoria de N. benthamiana se realizó como se ha descrito (Kapila y col., Plant Science 122 (1996) 101-108). Para extraer las proteínas solubles totales, las hojas de tabaco fueron congeladas y trituradas en nitrógeno líquido y el nivel de proteína de fusión scFv fue analizado mediante ELISA y transferencia western (Fischer y col., Methods in biotechnology Vol. 3: Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds. Humana Press, Totowa, NJ (1998), ELISA III). Se utilizó un fragmento Fab de mAb24 como patrón para el ELISA.

Los análisis utilizando los constructos que contenían la secuencia His6 C-terminal (Figura 15) demostraron que CP-scFv24H era detectable en un ELISA específico de TMV, con un nivel de proteína medio de 0,9 ng de scFv24 activo funcional por gramo de material foliar.

Los niveles de proteína del constructo de control scFv24H que carecía de una pareja de fusión N-terminal estaban por debajo del límite de detección del ELISA (0,5 ng) (Figura 18).

Los autores de la presente invención evaluaron la influencia de una secuencia KDEL C-terminal sobre la acumulación de proteínas de fusión scFv24. La adición de la secuencia KDEL C-terminal aumentaba el nivel de la proteína de fusión (Figura 18). El nivel medio de proteína de CP-scFv24 etiquetada con KDEL era 3 veces superior que el de CP-scFv24H (2,9 ng por gramo de material foliar). El nivel del constructo de control scFv24K estaba por debajo del umbral de detección del ELISA. Un ELISA de control realizado sin el antígeno TMV no dio señal, indicando que los valores de CP-scFv24H y CP-scFv24K no se podían corresponder con la unión específica de las fusiones de CP a sueros policlonales anti-TMV.

Caracterización de plantas transgénicas que expresan proteínas de fusión scFv citoplásmicas

Después los autores de la presente invención sometieron a ensayo a qué nivel CP-scFv24K expresada citoplásmicamente se acumulaba en las plantas de tabaco transformadas establemente. Se generó N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico mediante transformación de discos foliares con A. tumefaciens recombinante y se generaron plantas T_{0} transgénicas a partir de callos transformados (Horsch y col., Science 227:1229-1231 (1985)). La extracción de las proteínas solubles totales de hojas de tabaco y el posterior análisis de scFv24 mediante ELISA se realizaron como describen Fischer y col., (Fischer y col., En: Cunningham C, Porter AJR (eds), Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana Press, Totowa, NJ (1988)). Para el ELISA se utilizó antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col., Molecular Biology Breeding 4:369:379 (1998)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) (Fischer, Methods in biotechnology Vol. 3: Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds. Humana Press, Totowa, NJ (1998), ELISA III).

Los niveles de proteína de CP-scF24K mostraban una media de 1,2 ng por gramo de material foliar en 12 plantas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénicas analizadas. El nivel máximo de CP-scFv24K extraída con detergente era de 2,3 ng por g de tejido foliar, por tanto superior a scFv24 sin pareja de fusión y secuencia KDEL (máximo 1,8 ng/g de tejido foliar; media 0,8 ng/g de tejido foliar; Zimmermann y col., Molecular Breeding 4 (1998).

Conclusiones

Los bioanálisis para analizar los efectos biológicos de CP-scFv24K citosólico en N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico están progresando. Basándose en otros experimentos de inoculación, se puede esperar un incremento de la resistencia viral cuando se compara con scFv24 citosólico sin pareja de fusión que crea un fenotipo resistente, basado en el incremento de los niveles de proteína scFv24 y la presencia de secuencias de TMV-CP y TMV-ARN para inducir resistencia al virus mediada por CP y mediada por ARN además de la resistencia del anticuerpo primario.

Ejemplo 5 Resistencia intensificada por la expresión de un anticuerpo anti-proteína del movimiento viral Expresión de anticuerpos recombinantes contra la proteína del movimiento 30K de TMV en tabaco transgénico

Las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 y/o 2) del ejemplo 2 se repiten con las siguientes adaptaciones.

1): Se originan anticuerpos específicos que reconocen la proteína del movimiento 30K de TMV mediante tecnología del hibridoma, rastreo de presentación en fagos o ribosomas y posterior clonación para diseñar anticuerpos de cadena sencilla o cualquier forma recombinante de los mismos.

2): El anticuerpo es expresado en el citosol o enviado a la ruta secretora o está localizado en la membrana. El anticuerpo recombinante puede causar el efecto biológico deseado sin una pareja de fusión de manera que la secuencia de la toxina puede ser omitida.

3): Para el ELISA y la resonancia superficial de plasmón el antígeno de ensayo para la función del anticuerpo es la proteína del movimiento 30K de TMV nativa o recombinante o dominios de la misma.

4): Además de los bioanálisis enumerados en el ejemplo 1 las plantas transgénicas generadas serán sometidas a ensayo en cuanto a la resistencia de amplio espectro frente a diferentes cepas virales o géneros virales mediante inoculación de plantas transgénicas con viriones o transcritos infecciosos.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno viral seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para la proteína del movimiento y cualquier dominio funcional. Por otra parte, el ejemplo 5 puede ser combinado con los ejemplos 1-4 y 6-8 en cualquier combinación.

Generación de anticuerpos específicos anti-proteína del movimiento 30K mediante presentación en fagos

Se generaron anticuerpos recombinantes específicos de la proteína del movimiento (MP) mediante presentación en fagos utilizando proteína del movimiento de TMV 30K expresada bacterianamente fusionada a GST para facilitar la purificación por afinidad (Pharmacia GST-System). Se inmunizaron ratones Balb/c hembra utilizando un protocolo normalizado con proteínas de fusión GST-30K solubles o dominios de las mismas. La estructura nativa de GST y de 30K fusionada fue sometida a ensayo mediante análisis de la actividad GST (Smith y col., Gene 67 (1988), 31-40) y unión de ARN a 30K (Vaquero, J. Gen. Virol. 78 (1997) 2095-2099). Las regiones V_{H}- y V_{L}- del anticuerpo fueron rescatadas con posterioridad de las células plasmáticas de ratones hiperinmunizados y ensambladas a anticuerpos scFv utilizando un protocolo SOE-PCR (Mc Cafferty y col., Nature 348 (1990), 552-554). Se desarrolló y se utilizó un grupo ampliado de cebadores de la PCR para la amplificación específica de la familia de V_{H} y V_{L} (Tabla 4). Utilizando este protocolo se generó un banco > 10^{6} scFv diferentes para la presentación de scFv sobre la superficie de fagos en fusión a la proteína M13 piloto del gen III. Utilizando la presentación en fagos se pudo aislar y caracterizar un panel de 10 anticuerpos específicos diferentes de la proteína del movimiento que mostraban todos una fuerte afinidad de unión a la proteína de fusión GST-30K expresada en bacterias y no a la GST-proteína sola expresada en bacterias (Figura 20a). El dominio de unión de estos 10 anticuerpos de 30K fue cartografiado mediante la expresión de 5 dominios distintos de 30K y análisis ELISA (Figura 20b). Para la evaluación de los efectos biológicos de los anticuerpos anti-30K expresados por la planta se clonaron con posterioridad los 6 aglutinantes más fuertes en vectores de expresión vegetal y se expresaron y analizaron mediante evaluación fenotípica y análisis moleculares para evaluar sus efectos sobre la infección viral con TMV. A partir de estos experimentos dos líneas vegetales que expresaban los fragmentos de anticuerpo scFv 30-1 y scFv 30-2 (Figura 21) mostraban una inhibición significativa de la infección por TMV confirmada por un fenotipo sano de las plantas, una cantidad reducida y una acumulación retardada de proteína de la envuelta de TMV en comparación con N. tabacum Petite Havana SR1 de tipo salvaje.

Construcción de la casete de expresión del anticuerpo anti-30K para la expresión en plantas

Para expresar los anticuerpos anti-30K en el citosol de N. tabacum cv. Petite Havana SR1, se clonaron los fragmentos de anticuerpo en el vector de expresión vegetal pSSH1 (Figura 19) (Voss y col., Molecular Breeding 1 (1995), 39-50). La clonación del fragmento de anticuerpo biespecífico BISCA2429, que se utilizó como constructo parental para la expresión del anticuerpo anti-30K, incluyendo la secuencia Omega derivada de TMV, en el vector de expresión vegetal pSSH1 ha sido descrita (Fischer, y col., (1999) Eur. J. Biochem. 262, 810-816). Para la clonación de los scFv resultantes en este vector los cebadores utilizados para establecer el banco de presentación en fagos contenía los sitios para las enzimas de restricción NcoI y SalI que facilitaban la clonación en marco en el constructo intermedio pUC18-BISCA2429 (secuencia omega 5'-UTR de TMV, scFv, etiqueta His6). Para la expresión en células vegetales, se subclonó el fragmento EcoRI/XbaI (Figura 19) de este constructo intermedio en los sitios de restricción EcoRI y XbaI del vector de expresión vegetal pSS conteniendo el promotor intensificado 35S (Kay y col., Science 236 (1987), 1299-1302) y la secuencia de terminación de CaMV (Figura 19). Los constructos finales contenían una casete de expresión que empezaba con el promotor 35 SS seguido de la secuencia omega 5'-UT de TMV, el scFv específico de 30K, una etiqueta His6 para la purificación por afinidad y la 3'-UTR de CaMV (Figura 19 y 21).

Generación y caracterización molecular de plantas transgénicas

Una vez completado el análisis de scFv in vitro, las plantas de tabaco estaban transformadas establemente para el ensayo in vivo de los efectos de scFv sobre la infección por TMV. Se generó N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico mediante transformación de discos foliares utilizando A. tumefaciens recombinante y se generaron plantas T_{0} transgénicas a partir de callos transformados (Horsch y col., Science 227 (1985), 1229-1231). A partir la generación T_{0} se seleccionaron numerosas plantas y se seleccionaron progenies T_{1} y T_{2} homozigotas para la evaluación fenotípica y molecular de la resistencia mediada por el anticuerpo scFv.

Para someter a ensayo si la expresión de scFv específica anti-30K en plantas transgénicas tenía efecto biológico sobre la replicación y la diseminación de TMV dentro de la planta, se estableció un análisis de proteína de la envuelta de TMV basado en el transcurso del tiempo donde la cantidad de proteína de la envuelta viral era controlada en las hojas superiores tras la infección de plantas transgénicas y no transgénicas con TMV vulgare. La extracción de la proteína de la envuelta de TMV de hojas de tabaco infectadas sistémicamente y el posterior análisis sobre SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685) fue realizada como describen Fischer y col., (Fischer y col., (1989) En: Cunningham C, Porter AJR (eds), Recombinant proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana Press, Totowa, NJ). El control de la expresión de la proteína de la envuelta en hojas de tabaco de tipo salvaje y de control infectadas sistémicamente mediante transferencia western reveló cantidades crecientes de la proteína de la envuelta de TMV. En el caso de plantas que expresan los scFv específicos de 30K, la acumulación de proteína de la envuelta se retrasaba significativamente y los niveles eran significativamente más bajos en comparación con N. tabacum cv. Petite Havana SR1 de tipo salvaje, y N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico que expresaba un scFv no relacionado, utilizado como control (Figura 22). Aunque la proteína de la envuelta era detectable en todas las plantas transgénicas éstas no desarrollaban ningún síntoma o sólo síntomas suaves basándose en las evaluaciones fenotípicas (Tabla 3).

Bioanálisis para someter a ensayo la resistencia viral

Para analizar los efectos biológicos de los scFv específicos de 30K sobre la resistencia viral, se inocularon las progenies T_{1} y T_{2} de líneas vegetales que expresaban scFv 30-1 y scFv 30-2 (Figura 21) con TMV. Se recogieron las semillas de diferentes plantas T_{0} y se hicieron germinar en medio de agar MSMO suplementado con sacarosa al 2% (p/v), 0,4 \mug/ml de tiamina, 0,4 \mug/ml de glicina, 0,1 \mug/ml de ácido nicotínico, 0,1 \mug/ml de piridoxina y 75 \mug/ml de kanamicina. Las plantas en germinación fueron transferidas a tierra y las plantas T_{0} totalmente desarrolladas fueron autofertilizadas para la recolección de las semillas. Se utilizaron las plantas T_{1} y T_{2} homozigotas resistentes a la kanamicina para la inoculación con TMV-vulgare (40 ng/ml). Las plantas de cuatro a seis semanas de edad fueron infectadas mecánicamente en dos hojas superiores utilizando 200 \mul de la suspensión que contenía TMV. Se inocularon como se ha descrito plantas de tipo salvaje o transgénicas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 que producían el scFv específico de tumores T84.66 como control. Los síntomas de enfermedad fueron controlados 7 a 14 días después de la inoculación (p.i.). Tras la infección de las dos hojas superiores con TMV, se controló la diseminación sistémica del virus mediante evaluación fenotípica de las hojas superiores al cabo de 7, 9, 11 y 14 días p.i. Todas las plantas de control fueron infectadas sistémicamente, y mostraban cantidades crecientes de proteína de la envuelta viral. Las plantas T_{1} y T_{2} transgénicas derivadas de diferentes líneas vegetales T_{0} que expresaban scFv 30K-1 y scFv 30K-2 no mostraban síntomas de enfermedad visibles o mostraban síntomas débiles en las hojas superiores (Tabla 3). En los casos en los que el desarrollo de síntomas era visible, éste coincidía entre las plantas derivadas de una línea vegetal. En el caso de scFv 30K-2 se obtuvo una línea vegetal que mostraba síntomas graves en la generación T_{1} así como en la T_{2}. Esto puede ser debido a efectos posicionales del transgen o al efecto silenciador del transgen en la generación T_{1} y T_{2}. Además, el análisis basado en SDS-PAA y la posterior transferencia western de la acumulación de proteína de la envuelta de TMV a lo largo de 72 horas p.i. en plantas infectadas demostró que todas estas plantas acumulaban partículas de virus en las hojas superiores aunque en un menor grado (Figura 22). Esto conduce a la conclusión de que la expresión del scFv específico de la proteína del movimiento puede evitar el comienzo de los síntomas y retrasar la acumulación de CP tras la infección por TMV.

Otras proteínas del movimiento virales

Para ampliar la aplicación de anticuerpos antivirales en plantas transgénicas para el diseño de resistencia se expresó la proteína del movimiento 3a del virus del mosaico del pepino en E. coli en forma de una fusión con GST (Vaquero y col., (1997) J. Gen. Virol. 78, 2095-2099). Se generaron anticuerpos anti-3a específicos mediante presentación en fagos y tecnología de hibridoma utilizando la proteína del movimiento de CMV 3a expresada bacterianamente como ya se ha descrito para la proteína del movimiento 30K de TMV (Figura 19). El mAb 3a-2 fue clonado a partir de células de hibridoma (Krebber y col., (1997), J. Immunol. Methods 201, 35-55) y el scFv resultante 3a-2 fue caracterizado in vitro mediante técnicas de ELISA (Figura 23a). Utilizando el cartografiado de epítopos mediante presentación de péptido se pudo cartografiar el epítopo del anticuerpo para una región distinta de la proteína del movimiento 3a.

TABLA 3

\begin{minipage}[t]{160mm} Evaluación fenotípica de plantas de N. tabacum transgénicas que expresan scFv específico de 30K de TMV en la generación T_{1} y T_{2}. Se sometieron a ensayo diferentes plantas de la generación T_{1} y T_{2} en cuanto a los síntomas de enfermedad fenotípicamente visibles tras la infección de dos hojas superiores con 40 ng/ml de TMV. Los síntomas de la enfermedad fueron controlados a los 7, 9, 11 y 14 días p.i. en las hojas superiores. \end{minipage}
	Plantas T_{1}	Plantas T_{2}
Constructo	Núm. de plantas	Síntomas	Núm. de plantas	Síntomas
	infectad.		infectadas
PSS-scFv-30-1	55	sin síntomas tras 11	22	síntomas débiles tras 14
		a 14 días		días en todas las plantas
PSS-scFv-30-2	124	síntomas débiles	65	ninguno a débil,
		o medios,		síntomas
		raramente graves		raramente graves

TABLA 4

Cebadores utilizados para amplificar dominios de anticuerpos V_{H} y V_{L} murinos para la generación de scFv. Estos cebadores fueron utilizados para clonar scFv antes de la presentación en fagos así como para clonar scFv de líneas celulares de hibridoma pre-existentes ("rescate de hibridoma"). Se enumera la especificidad de todos los cebadores según la base de datos Kabat (Kabat: "Sequences of immunological interest", 1991), todos los cebadores contienen un saliente de 10 pb no codificador 5' para facilitar la digestión con enzimas de restricción y la clonación. Para la clonación de fragmentos V_{H} se utilizaron las enzimas de restricción Sf I, Fse I, para la clonación de los fragmentos V_{L} las enzimas de restricción Asc I/Not I.

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Resistencia intensificada por la expresión de anticuerpos contra la replicasa del Virus del mosaico del tabaco Expresión de anticuerpos contra las subunidades de la replicasa 54K de TMV/183K de TMV en tabaco transgénico

Las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 y/o las etapas 1) a 2) del ejemplo 2 se repiten con las siguientes adaptaciones:

1): Se originan anticuerpos específicos que reconocen la replicasa 54K TMV/183K TMV mediante tecnología de hibridoma y de presentación en fagos o ribosomas utilizando las proteínas 54K de TMV/183K de TMV como antígeno y se clonan para diseñar fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla o cualquier forma recombinante de los mismos incluyendo scFv biespecíficos.

2): Estos anticuerpos son expresados en el citosol o dirigidos a la cara citoplásmica de las membranas intracelulares, donde se forman los complejos de replicación del virus, utilizando una secuencia C-terminal como se describe en el ejemplo 2. El anticuerpo recombinante puede causar el efecto biológico deseado sin fusión con una toxina.

3): Para el ELISA y la resonancia superficial de plasmón el antígeno de ensayo para la función del anticuerpo son las proteínas de la replicasa 54K y 183K de TMV recombinante o dominios de las mismas.

4): Además de los bioanálisis enumerados en el ejemplo 1, las plantas transgénicas generadas serán sometidas a ensayo en cuanto a la resistencia de amplio espectro contra diferentes cepas virales o géneros virales mediante inoculación de plantas transgénicas con viriones o transcritos infecciosos.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno viral seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para la proteína de movimiento y cualquier dominio funcional. Por otra parte, el ejemplo 6 puede ser combinado con los ejemplos 1-5 y 7-8 en cualquier combinación.

ScFv específico anti-replicasa (scFv 54K)

Un método alternativo para evitar la infección viral se basa en la expresión intracelular de anticuerpos tales como los scFv específicos de la replicasa que pueden interaccionar con la replicasa viral para interferir o inhibir la proliferación viral en células infectadas. Como se describe en el ejemplo 5 para la proteína del movimiento 30K la "proteína 54K" de TMV, fue expresada en E.coli y se generaron anticuerpos utilizando tecnologías de hibridoma normalizadas asequibles para los expertos en la técnica. La proteína 54K puede ser considerada como un componente integrante de la proteína 183K, la principal replicasa de TMV, puesto que es expresada a partir de su propio ARN subgenómico y promotor pero comparte el mismo marco de lectura de las últimas 1.400 bases de la proteína 183K. Aquí, son codificadas las regiones conservadas tales como la Unidad GDD que se pueden encontrar en todas las replicasas virales vegetales. Las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo fueron clonadas a partir de los hibridomas utilizando el mismo grupo de cebadores descrito en el ejemplo 5 y ensambladas en los anticuerpos scFv utilizando procedimientos de clonación normalizados (Krebber y col. (1997), J. Immunol. Methods 201, 35-55). La actividad del anticuerpo scFv resultante scFv 54-1 (Figura 23a) fue controlada mediante detección por transferencia western y ELISA utilizando GST-54K expresada bacterianamente. El epítopo del scFv 54-1 fue determinado mediante presentación de péptidos (Figura 25b) y pudo ser cartografiado para una región distinta en el gen 54K/183K de TMV.

Proteínas mínimas de virus vegetales

Las proteínas virales alternativas para el diseño de resistencia viral son las "proteínas mínimas virales vegetales" 1min, 2min y 3min como se ha descrito para PLRV. Una característica de la proteína mínima 3min es su capacidad para unirse a ácidos nucleicos por medio de la cual se une preferentemente a ARN de hebra sencilla (Figura 24) (Prüfer y col., (1992) EMBO Journal 11, 1111-1117). Se generaron anticuerpos específicos para 3min mediante tecnología de hibridoma utilizando GST-3min expresada bacterianamente como antígeno y el anticuerpo scFv3min fue clonado a partir de células de hibridoma (Figura 23c). Puesto que la proteína 3min de PLRV se describe como una proteína de unión a ácido nucleico la estructura nativa de GST-3min expresada bacterianamente podría ser confirmada mediante análisis de unión a ácido nucleico utilizando GST 3min y transcritos in vitro de ARN y ADN viral. Utilizando el anticuerpo scFv 3min la actividad de unión a ARN/ADN de la proteína 3min pudo ser completamente bloqueada in vitro. Utilizando el cartografiado de epítopos mediante presentación de péptidos se pudo cartografiar el epítopo del anticuerpo para una región distinta de la proteína mínima 3min por medio de lo cual el epítopo identificado por la presentación de péptidos se solapaba con la región de clonación GST del constructo GST-3min (Figura 25c).

Cartografiado epitópico de scFv antivirales (scFv 29, 3min y 54K-1)

Para la elucidación de epítopos virales reconocidos por los anticuerpos recombinantes desarrollados se utilizaron dos bancos de presentación de péptidos para el cartografiado epitópico de anticuerpos monoclonales (Cortese y col. (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6, 73-80). Ambos bancos expresan péptidos 9méricos al azar en el extremo N de la proteína pVIII de fagos filamentosos. Un banco presenta los péptidos en forma lineal, el otro banco presenta los péptidos flanqueados por dos restos cisteína que forman un puente disulfuro, restringiendo el péptido a una estructura de bucle.

Para identificar los epítopos de scFv 29, scFv 54-1, y scFv 3min se recubrieron inmunotubos utilizando 20 \mug de antígeno purificado por afinidad utilizando un procedimiento normalizado asequible por cualquier experto en la técnica (Cortese y col., 81995) Curr. Opin. Biotechnol. 6, 73-80). Para la primera serie del reconocimiento y selección ("panning"), se incubaron 5 x 10^{12} fagos en 1 ml de PBS con el antígeno inmovilizado (16 h, 4ºC). Tras un lavado extenso (15 veces PBST y 5 veces PBS), los fagos unidos se hicieron eluir con 1 ml de Glicina-HCl pH 2,2, BSA al 0,1% (p/v) (10 min, 20ºC), se neutralizaron con 60 \mul de Tris 2M y se utilizaron para la infección de E. coli. El título de fagos eluidos fue determinado cultivando en placa 100 \mul de la bacteria infectada sobre 2x placas TY-Amp y contando las unidades formadoras de colonias. Los factores de enriquecimiento fueron calculados tras la comparación con un reconocimiento y selección de control utilizando BSA como antígeno. Los fagos monoclonales de la tercera serie de reconocimiento y selección fueron sometidos a ensayo en cuanto a la reactividad con sus antígenos mediante ELISA de los fagos.

Los fagos identificados positivamente del ELISA de los fagos, utilizando ambos bancos de fagos individualmente sobre todos los scFv, fueron secuenciados con posterioridad. Las secuencias obtenidas fueron alineadas y se determinó la secuencia consenso resultante. En los tres casos (scFv 29, scFv 54-1 y scFv 3min) se pudo determinar una secuencia consenso (Figura 25). La secuencia consenso resultante también pudo ser retrocartografiada a la secuencia parental del antígeno contra el cual se generaron los anticuerpos. Puesto que el banco de péptidos al azar 9méricos presenta preferentemente péptidos lineales se considera que los tres epítopos de los scFv representan una unidad lineal en el antígeno. Los epítopos de scFv29, scFv54-1 y scFv3min fueron determinados mediante presentación de péptidos y una secuencia consenso fue cartografiada para cada scFv (Figura 25). Para los scFv29, la secuencia consenso fue cartografiada en una región distinta de la proteína de la envuelta (Figura 25a) y la secuencia consenso de scFv54-1 fue cartografiada en una región distinta de la proteína 54K de TMV (Figura 25b). Para el scFv3min la secuencia consenso contenía parte de las proteínas GST y 3min (Figura 25c) en el punto en el que 3min se fusionaba con GST. ScFv3min puede ser considerado útil para diseñar resistencia a virus ya que inhibe la actividad de unión al ácido nucleico de la proteína 3min (Figura 24).

Ejemplo 7 Ensamblaje in vivo de un patogenicida Molecular Ensamblaje in vivo de un patogenicida molecular que consta de un anticuerpo específico de TMV marcado con un anticuerpo de cadena sencilla específico del epítopo y una toxina marcada con una etiqueta epitópica

Se efectúan las siguientes etapas:

1): Se generan anticuerpos contra viriones de TMV intactos y se generan monoclonales mediante tecnología de hibridoma.

2): Se clonan líneas celulares de hibridoma y se clonan secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de los anticuerpos para generar un anticuerpo de cadena sencilla o cualquier versión recombinante del mismo que se una a los viriones de TMV (scFv24).

3): El anticuerpo de cadena sencilla que se une a los viriones intactos (scFv24) se fusiona con un ADNc clonado del anticuerpo de cadena sencilla (scFv-epitag29), que se une a un epítopo de aminoácidos específico (epitag29), utilizando un conector flexible tal como el péptido conector de la celobiohidrolasa I (CBHI) de Trichoderma reesi para generar una proteína recombinante que reconoce el patógeno, TMV, y la etiqueta epitópica. El scFv-epitag29 ha sido generado previamente (mediante tecnología de hibridoma convencional y después clonado como un scFv) y el epítopo específico es identificado mediante presentación de péptidos en fagos. Cualquier otro anticuerpo de elevada afinidad que reconozca un epítopo peptídico identificado sería adecuado como medio par de unión con su correspondiente epítopo como el otro miembro.

4): El gen recombinante de la etapa 3 es insertado en un vector de expresión microbiano o eucariótico.

5): La especificidad de unión y la función (es decir la especificidad y la afinidad) de la proteína recombinante de la etapa 3 se verifican tras la expresión en un huésped heterólogo, tal como en el periplasma de E. coli.

6): Se añade una secuencia señal al extremo N del constructo scFv biespecífico recombinante de la etapa 3, para permitir la liberación de la proteína al RE y la secreción al apoplasto tras la expresión en plantas. Se introducirán una región 5' no traducida y una 3' no traducida y una secuencia de una etiqueta para la detección (es decir c-myc) mediante tecnología de ADN recombinante, si fuera necesario.

7): El gen quimérico de la etapa 6 es insertado en el vector de expresión vegetal, v.g., pSS (Voss y col., 1995). Entre los vectores de expresión vegetales adecuados se incluyen secuencias promotoras, intensificadoras, terminadoras y marcadores de selección adecuados. En el caso de las secuencias marcadoras de selección de transferencia génica sin marcador y sin vector, se pueden omitir las secuencias marcadoras.

8): El ADNc que codifica una RIP (proteína inactivadora de ribosomas) fusionada por medio de un conector adecuado a la marca epitópica epitag29 (en el extremo N o C), que es específicamente reconocido por el scFv-epitag29, es preparado en paralelo para generar un segundo constructo de expresión independiente que codifica un gen RIP etiquetado.

9): El gen RIP etiquetado es insertado en un vector de expresión microbiano o eucariótico y la funcionalidad de la fusión RIP-epítopo se verifica tras la expresión en un huésped heterólogo.

10): Se preparará un segundo vector de expresión vegetal independiente, tal como pSS, conteniendo el gen RIP etiquetado recombinante con un péptido señal N- terminal, como se describe en la etapa 6 y en la etapa 7. la secuencia RIP etiquetada puede ser integrada después o bien en una disposición en tándem sobre el mismo plásmido que la proteína de fusión de la etapa 3 o bien integrada en un segundo plásmido independiente. Obsérvese que las secuencias permanecen discretas incluso si están en una disposición en tándem.

11): Ambos constructos de expresión vegetal enumerados en las etapas 6 y 10 son transformados en dos líneas vegetales independientes o son transformados simultáneamente en el mismo genoma vegetal, o si la proteína de fusión al anticuerpo de la etapa 3 y la toxina etiquetada de la etapa 10 están integradas en una disposición en tándem ese constructo es transformado en las mismas plantas.

12): Las plantas regeneradas son rastreadas utilizando el marcador de selección para la integración del gen de fusión en las líneas vegetales independientes o las líneas transformadas simultáneamente de la etapa 11.

13): Las plantas transgénicas que expresan solamente una cualquiera de la proteína de fusión al anticuerpo de la etapa 3 o la RIP etiquetada epitópicamente de la etapa 10 son cruzadas después sexualmente para dar vástagos que producirán ambas proteínas. Las plantas que producen ambas proteínas, ya sea a partir de esta etapa o de etapas anteriores, producirán complejo de proteínas ensambladas donde los dos partícipes en la unión, el anticuerpo específico del epítopo (scFv-epitag29) y el epítopo se unen y permiten el ensamblaje de un complejo de patogenicida molecular-proteína.

14): La expresión de la proteína de fusión scFv biespecífica y/o la RIP etiquetada así como el patogenicida molecular ensamblado in vivo es controlada mediante transferencia western de los extractos celulares, ELISA o análisis de resonancia de plasmón superficial. La actividad del scFv biespecífico se verifica mediante ELISA utilizando viriones de TMV intactos como antígeno.

15): La actividad de los patogenicidas moleculares ensamblados se verifica mediante ELISA y análisis de citotoxicidad.

16): La localización de la proteína de fusión se verifica mediante imunofluorescencia indirecta, microscopía confocal o microscopía inmunoelectrónica y transferencia western o ELISA o análisis de resonancia de plasmón superficial del fluido de lavado intercelular.

17): La actividad biológica del patogenicida molecular ensamblado in vivo frente a TMV es analizada mediante bioanálisis de las plantas transgénicas generadas utilizando viriones o transcritos infecciosos.

Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos y clonarlos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. En lugar de RIP, se pueden utilizar toxinas similares con actividad exterminadora celular o interferencia en la patogenicidad (ARNasa, ADNasa, etc.). El ensamblaje de patogenicidas moleculares puede ser logrado utilizando cualquier etiqueta epitópica y un anticuerpo específico del epítopo dado con una interacción molecular adecuada y estable in vivo, o cualquier otro par de proteínas que se unan entre sí. Por otra parte, el ejemplo 7 se puede combinar con los ejemplos 1-6 y 8 en cualquier combinación.

Constructos para analizar el ensamblaje de parejas de fusión

Para analizar el ensamblaje de un patogenicida molecular que constaba de un anticuerpo específico de TMV marcado con un anticuerpo de cadena sencilla específico del epítopo y diferentes constructos de toxina marcados con etiquetas epitópicas los autores de la presente invención generaron diferentes constructos y se estudió el ensamblaje mediante inmunotransferencia y ELISA.

Anticuerpo específico de TMV marcado con un anticuerpo de cadena sencilla específico del epítopo (bisFv2429): El anticuerpo de cadena sencilla que se unía a los viriones intactos (scFv24) fue fusionado a un ADNc clonado a partir del anticuerpo de cadena sencilla scFv-epitag29; que se une a un epítopo de aminoácidos específico (epitag29), utilizando el péptido conector flexible de la celobiohidrolasa I de Trichoderma reesi (CBHI) para generar una proteína recombinante que reconoce el patógeno, TMV, y la etiqueta epitópica. El scFv-epitag29 ha sido generado previamente (mediante tecnología de hibridoma convencional y después clonado en forma de scFv) como se describe para scFv24 (Schillberg y col., Transgenic Research 8, 255-263 (1999)) y el epítopo específico identificado mediante presentación de péptidos en fagos. El péptido señal de la cadena ligera N-terminal de ratón del anticuerpo original (mAb24) utilizado para generar scFv24 fue utilizado para dirigir biscFv2429 a la ruta secretora. Para la expresión en células vegetales, la 5' UT de la chalcona sintasa fue introducida y la casete fue insertada entre el promotor 35S intensificado y la secuencia de terminación de CaMV en el vector de expresión pSS (Figura 26) (Fischer y col., Eur. J. Biochem. 262, 810-816 (1999)).

Toxina marcada con etiqueta epitópica (PE280-tag29 y PE400-tag29): Se generaron dos constructos que contenían partes de la exotoxina de Pseudomonas (PE) y el epitag29 C-terminal fusionado por medio del conector Gly_{4}Ser. El constructo PE280-tag29 (Figura 26B) contiene la secuencia de aminoácidos (aa) 280 a 609, que comprende el dominio II y el dominio III de PE. El constructo PE400-tag29 (Figura 26C) contiene el dominio III de PE desde el aa 400 al aa 609. El dominio III de PE media la ribosilación con ADP del factor de elongación 2, que detiene la síntesis de proteínas y ocasiona la muerte celular. El epitag-29, que es específicamente reconocido por scFv-epitag29, fue fusionado en posición C-terminal a ambos constructos vía un conector Gly_{4}Ser. El péptido señal de la cadena ligera N-terminal de ratón del anticuerpo monoclonal murino mAb24 fue utilizado para dirigir PE280-tag29 y PE400-tag29 a la ruta secretora.

PE280 y PE400 fueron amplificados mediante PCR a partir del plásmido PE38 utilizando los siguientes cebadores: para PE280: PE-280-directo 5'-GCG GAA TTC GAC GTC GCC ATG GGC TGG GAA CAA CTG GAG CAG-3' (SEC ID NU: 157) Y PE-inverso 5'-GCG AAG CTT GTC GAC CGG CGG TTT GCC GGG CTG GCT G-3' (SEC ID NUM: 158); para PE400: PE400-directo 5'-GCG GAA TTC GAC GTC GCC ATG GCC TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC-3' (SEC ID NUM: 159) Y PE-inverso 5'-GCG AAG CTT GTC GAC CGG CGG TTT GCC GGG CTG GCT G-3'(SEC ID NUM: 160). Los cebadores contenían los sitios de restricción EcoRI, AatII y NcoI (PE280-directo y PE400-directo) y HindIII (PE-inverso) para la clonación. Los fragmentos de la PCR fueron subclonados por medio de EcoRI y HindIII en pUC18 dando como resultado los constructos PE280 y PE400 intermedios y la secuencia fue verificada mediante secuenciación. El fragmento NcoI/SalI de los constructos (PE280 y PE400 intermedios) fue subclonado en un derivado de pUC18 conteniendo la región 5' no traducida de la chalcona sintasa, la señal líder optimizada del codón de la cadena ligera de mAb24 y la etiqueta epitópica tag29 C-terminal dando como resultado los constructos PE280-tag29 y PE400-tag29. Para la expresión en células vegetales, los fragmentos EcoRI/XbaI (Figura 26) de PE280-tag29 y PE400-tag29 fueron subclonados en los sitios de restricción EcoRI y XbaI del vector de expresión vegetal pSS (Voss y col., Molecular Breeding 1: 39-50, (1995)) conteniendo el promotor 35S intensificado (Kay y col., Science 236: 1299-1302 (1987)) y la secuencia de terminación de CaMV (Figura 26B y C).

Constructo de control, GST marcado con la etiqueta epitópica (GST-tag29): Para analizar el ensamblaje del epitag29 y el correspondiente anticuerpo, se generó el constructo de control GST-tag29 introduciendo la secuencia epitag-29 en el vector pGEX-5X-3 (Pharmacia) en el extremo C de GST.

Análisis de GST-tag29

El epitag-29 es específicamente reconocido por scFv-epitag29 y el correspondiente anticuerpo de tamaño normal mAb29 o su versión recombinante rAb29. Para analizar la especificidad de unión de rAb29 a epitag-29, se diluyó GST expresado bacterianamente, purificado por afinidad o bien en PBS o bien en extracto de proteína de una planta de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 de tipo salvaje y se separaron diluciones seriadas sobre un gel de SDS-PAA y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa.

El plásmido recombinante GST-tag29 fue transformado en E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla CA, USA) y la proteína de fusión fue expresada induciendo un cultivo en fase log con IPTG 0,2-1,0 mM durante 1-3 horas a 30ºC. La proteína de fusión GST-tag29 fue purificada por afinidad sobre glutatión-agarosa mediante purificación por lotes según las instrucciones del fabricante (Pharmacia). Se resolvieron las diluciones seriadas de GST-tag29 mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond®-C (Amersham, Braunschweig, Alemania). Las membranas fueron bloqueadas durante la noche con leche desnatada sin grasa en PBS al 2% (MPBS) a 4ºC seguido de incubación con rAb29 (Schillberg, y col., Transgenic Research 8, 255-263 (1999)) a la temperatura ambiente durante 2 horas. Los anticuerpos unidos fueron detectados utilizando IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) y los sustratos cloruro de p-nitroazul de tetrazolio (NBT) y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP).

Como se muestra en la Figura 27A, 80 ng de GST-tag29 en PBS eran detectables utilizando rAb29. Aunque en extracto de tabaco el límite de detección disminuía a 200 ng de GST-tag29 (Figura 27B), este resultado indica que las proteínas derivadas de la planta no evitaban la unión de rAb29 al epitag-29.

El ensamblaje in vivo en una célula vegetal fue simulado mediante ELISA, en el cual el scFv-epitag29 se unía al epítopo epitop-29. Como se muestra en la Figura 28, era detectable una reactividad DO significativa, indicando que la unión de los dos miembros de la pareja tenía lugar en extractos vegetales.

Expresión transitoria en hojas de tabaco

Para analizar el nivel de proteína recombinante PE280-tag29 se transformaron transitoriamente hojas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 con A. tumefaciens recombinante y se analizó la acumulación de PE280-tag29 mediante inmunotransferencia.

El constructo de expresión vegetal PE280-tag29 fue transferido a A. tumefaciens GV3101 mediante transformación en N_{2} (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res 16 (1988) 9877). La transformación transitoria de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 se realizó como se ha descrito (Kapila y col., Plant Science 122 (1996) 101-108). Para extraer las proteínas solubles totales, se congelaron hojas de Tabaco y se trituraron en nitrógeno líquido y se analizó el nivel de proteína de fusión scFv mediante transferencia Western (Fischer y col., en: C. Cunningham, A.J.R. Porter, (Eds.), Methods in biotechnology Vol. 3; Recombinant proteíns in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds. Humana Press, Totowa, NJ (1998)).

No fue detectable una proteína del tamaño esperado (37,1 kDa) en los extractos vegetales (Figura 29). Sin embargo era detectable un producto de degradación, indicando que la proteína PE280-tag29 recombinante se acumulaba en las hojas de tabaco. Las hojas de la planta mostraban un fenotipo sano, indicando que PE280-tag29 era secretada muy probablemente al apoplasto y por lo tanto no era tóxica para la célula vegetal.

Caracterización de plantas transgénicas

N. tabacum cv. Petite Havana SR1 fue transformado con el constructo PE280-tag29 utilizando agrobacteria recombinante. Se generó N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico mediante transformación de discos foliares con A. tumefaciens recombinante y se generaron plantas transgénicas T_{0} a partir de las células transformadas (Horsch y col., Science 227:1229-1231 (1985)). La regeneración de plantas transgénicas está en marcha.

Además, las plantas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénicas que acumulaban biscFv2429 en el apoplasto serán retransformadas con el constructo de expresión vegetal PE280-tag29 para analizar el ensamblaje in vivo y los efectos biológicos del patogenicida molecular.

Conclusiones

El Patogenicida Molecular será ensamblado en el RE por medio de scFv-epitag29 y epitag29. Los experimentos presentados muestran que las proteínas pueden ser ensambladas utilizando scFv-epitag29 y epitag29 en extractos vegetales. Tras el ensamblaje el Patogenicida Molecular será secretado al apoplasto. Durante la infección por TMV la proteína de fusión se unirá a la partícula viral por la parte scFv24 y los viriones de TMV que entren en la célula llevarán unida la proteína de fusión scFv24-toxina. PE400 media la ribosilación con ADP del factor de elongación 2, que detiene la síntesis de proteínas y ocasiona la muerte celular. PE es una toxina muy eficaz ya que sólo se requieren una pocas moléculas para destruir la célula infectada, evitando de ese modo la replicación del virus, conduciendo a plantas altamente resistentes.

Ejemplo 8 Protelisis in vivo

Las etapas 1) a 16) del ejemplo 1 y las etapas 1) a 2) del ejemplo 2 se repiten con las siguientes adaptaciones.

1): Se añade una secuencia de escisión de proteasa que es procesada por una planta y/o una proteasa de patógeno in vivo o bien entre el constructo scFv recombinante y la secuencia de localización en la membrana C-terminal, utilizando un conector adecuado, o bien entre una toxina N-terminal y un anticuerpo recombinante anclado a la membrana C-terminal o viceversa.

2): El gen quimérico es insertado en un vector de expresión vegetal v.g. pSS (Voss y col., 1995).

3): Las secuencias de escisión de proteasa adecuadas incluyen una secuencia seleccionada de un banco de conectores al azar (Doskeland, Biochem. J. 313 (1996), 409-414) que habían sido seleccionados mediante proteolisis in vitro y cualquier sitio de proteasa conocido que es único para la proteína de fusión y no destruye el viricida molecular ni su actividad in vivo.

Como ejemplo, la etiqueta c-myc o el conector CBHI es sensible a las proteasas vegetales. Cualquier experto en la técnica reconocerá que estas etapas pueden ser seguidas para cualquier otro patógeno seleccionando anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para el patógeno diana. Por ejemplo, se pueden originar anticuerpos y clonarlos contra proteínas estructurales y no estructurales de cualquier patógeno. Además, se pueden clonar toxinas C- o N-terminales de la secuencia de escisión de la proteasa. Entre las toxinas se incluyen todas las proteínas y péptidos que tienen un efecto perjudicial o tóxico sobre el patógeno durante su ciclo vital y/o un efecto sobre el patógeno durante la infección de la planta o la replicación, la diseminación o la transmisión del patógeno. Esto incluye las toxinas que destruyen específicamente una célula huésped infectada y por tanto limitan la diseminación y el desarrollo de una enfermedad. Por otra parte, el ejemplo 8 puede ser combinado con los ejemplos 1 a 7 en cualquier combinación.

Construcción de las casetes de expresión de fusión scFv24

Para integrar el scFv24 específico de TMV en la membrana celular de la planta, se fusionó el fragmento de anticuerpo a un péptido señal de mamífero N-terminal y un dominio transmembrana receptor C-terminal. El péptido señal de la cadena ligera N-terminal de ratón de un anticuerpo parental (mAb24) utilizado para generar scFv24 fue utilizado para dirigir las proteínas de fusión a la ruta secretora. Los autores de la presente invención seleccionaron las secuencias del dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas humano (PDGFR) para la fusión con el extremo C de scFv24, para el redireccionamiento heterólogo del anticuerpo scFv24 a la membrana plasmática. Para asegurar el apropiado plegado del fragmento de anticuerpo de cadena sencilla expresado y después escindido, el constructo contenía la secuencia c-myc (pscFv24-PDGFR) como conector y una secuencia de escisión entre el fragmento scFv24 y el ancla de membrana (Figura 30).

Para construir pscFv24-PDGFR, el ADNc que codificaba el epítopo c-myc seguido del dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) (18) fue escindido del vector pHOOK-1 (Invitrogen, Leek, Holanda) y ligado en los sitios de restricción SalI y XbaI del plásmido pscFv24-TcR\beta (Ejemplo 1) para generar el constructo de fusión pscFv24-PDGFR (Figura 30).

Expresión de la proteína de fusión scFv24 en suspensiones celulares de N. tabacum cv. BY-2

Para analizar el nivel de expresión de las proteínas de fusión scFv recombinantes, la línea celular en suspensión de N. tabacum cv. BY-2 fue transformada establemente con A. tumefaciens recombinante y la expresión funcional del dominio scFv24 de la proteína de fusión fue analizada mediante ELISA utilizando antisuero anti-mAb24.

El constructo vector pscFv24-PDGFR fue transferido a A. tumefaciens GV3101 mediante transformación en N_{2} líquido (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16:9877 (1988)). Se mantuvieron células de N. tabacum cv. Amarillo brillante 2 (BY-2) en sal base de Murashige y Skoog con sustancias orgánicas mínimas (MSMO+: MSMO (Sigma, Deisenhofen, Alemania) más 200 mg/ml de KH_{2}PO_{4}, 0,6 \mug/ml de tiamina, sacarosa al 3% y 0,2 \mug/ml de 2,4-D, pH 5,8) a 24ºC en la oscuridad sobre un aparato de sacudimiento orbital. Las células fueron subcultivadas cada semana con un inóculo al 5%. Tres días después del subcultivo, las células vegetales fueron transformadas mediante cultivo simultáneo con A. tumefaciens recombinante, como se ha descrito (An, Plant Physiol. 79:568-570 (1985)). La selección de transformantes resistentes a la kanamicina fue realizada sobre medio de agar MSMO+ suplementado con 75 \mug/ml de kanamicina y 100 \mug/ml de Claforan.

Para la extracción de las proteínas solubles totales del cultivo en suspensión de BY-2 transgénico, las células de 1 ml de cultivo fueron recogidas por centrifugación a 400 X g durante 5 minutos a 4ºC. El sedimento celular fue resuspendido en 1 ml de tampón de extracción de proteína (Tris-HCl 200 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, azida de sodio al 0,02% (p/v) y Tween 20 al 0,1% (v/v)) y las células fueron desorganizadas mediante sonicación a 60 watios durante 1 minuto utilizando una sonda de sonicación (B. Braun, Melsungen, Alemania) a 4ºC. El desecho celular fue separado por centrifugación a 14.000 X g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante claro que contenía proteína soluble fue utilizado para un análisis adicional.

Para el ELISA y la transferencia western, se utilizó antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col. Molecular Breeding 4:369-379 (1998)) o el anticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 (Evan y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3610-3616 (1985)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA). Las concentraciones de proteína fueron determinadas con el Análisis de Proteínas de Bio-Rad utilizando Seralbúmina Bovina (BSA) como patrón.

El análisis de las células de N. tabacum BY-2 transformadas establemente reveló que scFv24-PDGFR estaba presente tanto en el extracto celular como en el sobrenadante de cultivo (Figura 31). Las líneas en suspensión de célula transgénicas mostraban niveles de expresión similares para ambas proteínas recombinantes, pero el 44-88% (valor medio = 69%, n=5) de scFv24-PDGFR fue secretado en el sobrenadante de cultivo. Esto indicaba que scFv24-PDGFR es liberado mediante proteolisis de la membrana plasmática.

Caracterización de plantas transgénicas

Después los autores de la presente invención sometieron a ensayo si el dominio transmembrana de mamífero heterólogo PDGFR fusionado a scFv24 dirigiría el anticuerpo de cadena sencilla a la membrana plasmática en plantas de tabaco transformadas establemente. Se generaron N. tabacum cv. Petit Havana SR1 transgénicas mediante transformación de discos foliares con A. tumefaciens recombinante y se generaron plantas transgénicas T_{0} a partir de callos transformados (Horsch y col., Science 227: 1229-1231 (1985)). La extracción de proteínas solubles totales a partir de hojas de tabaco y el posterior análisis de scFv24 mediante ELISA fueron realizados como describe Fischer y col. (Fischer y col., en: Cunningham C. Porter AJR (eds). Recombinant Proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana press, Totowa NJ, (1998)). Para el ELISA y la transferencia western, se utilizó antisuero anti-mAb24 (Zimmermann y col. Molecular Breeding 4: 369-379 (1998)) como anticuerpo primario combinado con una dilución 1:5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra (Jackson Immuno Rsearch Laboratories, West Grove, PA). Las concentraciones de proteína fueron determinadas con el Análisis de Proteínas de Bio-Rad utilizando Seralbúmina Bovina (BSA) como
patrón.

Los niveles de expresión de scFv24-PDGFR fueron mucho mayores en N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico que en los cultivos en suspensión (Tabla 5). El nivel máximo de scFv24-PDGFR extraído con detergente era 13 veces superior (388 ng/g de tejido foliar) que el obtenido en cultivos en suspensión transgénicos (Figura 31).

En células en suspensión de N. tabacum cv. BY-2 que producían la proteína de fusión scFv24-PDGFR, scFv24 era detectable en el sobrenadante de cultivo. Para determinar si los fragmentos scFv24 eran secretados en el espacio extracelular de plantas intactas, se analizó mediante ELISA el fluido de lavado intercelular de hojas de plantas de tabaco T_{1} transgénicas. Para la detección de las proteínas de fusión scFv24 en los fluidos de lavado intercelulares, se prepararon hojas de N. tabacum Petite Havana SR1 como describen Fischer y col. (Fischer y col., en: Cunningham C. Porter AJR (eds). Recombinant Proteins in plants: Production and Isolation of Clinically useful compounds, págs. 45-68. Vol. 3, Humana press, Totowa NJ, (1998)). Los extractos de proteína totales de los fluidos de lavado fueron concentrados mediante ultrafiltración (Microcon 10, Amicon, Witten, Alemania) y analizados mediante SDS-PAGE al 12% (Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)) seguido de transferencia western. ScFv24 estaba presente en el fluido de lavado intercelular de siete progenies de una línea vegetal (P9_{SR1}) que producía scFv24-PDGFR y el nivel de scFv24 secretado no se correspondía con los niveles de expresión de proteína en hojas intactas. En general, las plantas utilizadas para el análisis IWF mostraban niveles de expresión de scFv24 de 1.080-1.540 ng/g de tejido foliar. Por lo tanto, la proteína es escindida por una proteasa del huésped.

El análisis de transferencia western, utilizando antisuero anti-mAb24, reveló que un único polipéptido de scFv24 de 28 kDa era detectado en el fluido de lavado intercelular de progenies T_{1} de transgénicos scFv24-PDGFR (P9_{SR1}). Esto correspondía a un producto de escisión de la proteína de fusión puesto que el peso molecular pronosticado de scFv24-PDGFR era de 35KDa. No obstante, tanto los fragmentos de tamaño normal (35KDa) como escindidos (28KDa) de scFv24 estaban presentes en extractos de proteínas celulares solubles totales a una proporción 1:1 de producto de tamaño normal con respecto al fragmento (Figura 32A). En análisis por transferencia western de extractos de proteínas solubles totales con un anticuerpo anti-c-myc sólo detectaba la proteína de fusión intacta scFv24-PDGFR (Figura 32B). Esto indica que el fragmento scFv24 en el apoplasto era separado por escisión de la membrana cerca o en la etiqueta epitópica c-myc.

Bioanálisis de resistencia viral

Para analizar los efectos biológicos del anticuerpo específico de TMV anti-viral anclado a la membrana sobre la resistencia viral, se inocularon progenies T_{1} de la línea vegetal que expresaba la proteína de fusión scFv24-PDGFR (P9_{SR1}) con TMV.

Se recogieron semillas de plantas T_{0} productoras de anticuerpo y se hicieron germinar sobre medio de agar MSMO suplementado con sacarosa al 2% (p/v), 0,4 \mug/ml de tiamina, 0,4 \mug/ml de glicina, 0,1 \mug/ml de ácido nicotínico, 0,1 \mug/ml de piridoxina y 75 \mug/ml de kanamicina. Las plantas T_{1} resistentes a la kanamicina fueron utilizadas para la inoculación con TMV-v (1 \mug/ml) como se ha descrito previamente (Dietzgen y col., Arch. Virol. 87:73-86 (1986)). Se utilizaron como control plantas de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 de tipo salvaje. Los síntomas de la enfermedad fueron controlados a los 6 y 20 días después de la inoculación (p.i.) y para las plantas resistentes hasta 180
días p.i.

Las hojas inferiores fueron infectadas con TMV y la diseminación sistémica del virus estuvo seguida del análisis de las hojas superiores 6-20 días más tarde. Todas las plantas de tabaco no transgénicas de control fueron infectadas sistémicamente, pero el 19% (de 68 analizadas) de las plantas transgénicas scFv24-PDGFR no tenían síntomas visibles de enfermedad en las hojas superiores (Tabla 6). Además, el análisis mediante ELISA demostró que algunas de estas plantas acumulaban partículas de virus en las hojas superiores indicando que aunque se producía la diseminación viral sistémica, no se desarrollaban síntomas. Sorprendentemente, en el 13% de las plantas transgénicas scFv24-PDGFR no se encontró virus en las hojas superiores hasta 90 días después de la inoculación. Se pudo detectar el virus en sitios de inoculación en las hojas inferiores mediante ELISA demostrando que estas plantas habían sido eficazmente inoculadas con TMV. Los niveles de expresión de anticuerpo-proteína de fusión se correspondían con la expresión de la resistencia a TMV (Tabla 6). Los niveles superiores de expresión de la proteína de fusión scFv24 conducían a una fracción incrementada de plantas resistentes al virus.

Conclusiones

Se pudo observar que la región conectora entre scFv24 y el dominio transmembrana PDGFR es sensible a las proteasas vegetales, el scFv24 es separado por escisión in vivo y secretado al apoplasto en plantas transgénicas. scFv24 conserva su función después de la escisión y crea un fenotipo resistente al virus.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

\begin{minipage}[t]{160mm} Niveles de proteína de fusión scFv24 funcional en la generación T_{0} de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 transgénico La proteína vegetal soluble total fue aislada de hojas de plantas transgénicas que producían scFv24-PDGFR. La expresión de la proteína de fusión scFv24 fue cuantificada mediante ELISA específico de TMV utilizando antisuero anti-mAb24 y expresada como ng de scFv24 por g de tejido foliar. \end{minipage}
Constructo	Número de plantas	Número de plantas que	Intervalo de expresión	Expresión media
	transgénicas	expresan scFv24 funcional	(ng/g de tejido foliar)	(ng/g de tejido foliar)
PscFv24-	12	9	3-388	114
PDGFR

\newpage

TABLA 6

\begin{minipage}[t]{160mm} Análisis de la infección viral de plantas transgénicas que expresan scFv24 anclado a la membrana. Se aplicó 1 \mu g/ml de TMV-v sobre una hoja inferior de N. tabacum cv. Petite Havana SR1 no transgénico y progenies T_{1} transgénicas de la línea vegetal P9_{SR1} que producía scFv24-PDGFR. Los niveles de proteína de fusión scFv24 fueron determinados mediante ELISA utilizando el antisuero anti-mAb24 14 días p.i. y utilizados para la formación de grupos (productores bajos, medios y altos). ^{a} = las hojas superiores no mostraban síntomas de enfermedad visibles; ^{b} = basado en ELISA de TMV; ^{c} = nivel de resistencia de todos los productores bajos, medios y altos, los números entre paréntesis incluyen todas las plantas sin síntomas de enfermedad visibles. \end{minipage}
Líneas vegetales	Plantas sometidas	ng scFv24 por g	Fenotipo	Plantas	Nivel de
	a ensayo	de tejido foliar	sano^{a}	resistentes^{b}	Resistencia (%)^{c}
N. tabacum cv.	62	-	0	0	0
Petite Havana SR1

P9_{SR1}, productor bajo	34	10-500	1	0

P9_{SR1}, productor medio	23	501-2000	6	4	13(19)

P9_{SR1}, productor alto	11	2001-4200	6	5

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Anderson, J.M., P. Palukaitis, and M. Zaitlin. 1992. A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic sugarbeet plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:8759-8763.

Barbieri, L., M.G. Battelli, and F. Stirpe. 1993. Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim Biophys Acta. 1154:237-282.

Baulcombe, D. 1994. Novel strategies for engineering virus resistance in plants. Current Opinion in BioTechnology. 5:117-124.

Benfey, P., L. Ren, and N.-H. Chua. 1989. The CaMV 35S enhancer contains at least two domains which can confer different developmental and tissue-specific expression patterns. EMBO J. 8:2195-2202.

Bennett, A., and K. Osteryoung. 1991. Protein transport and targeting within the endomembrane system of plants. In Plant Genetic Engineering. Vol. 1. D. Grierson, editor. Blackie publishing, London. 199-237.

Benvenuto, E., R.J. Ordas, B. Tavazza, G. Ancora, S. Biocca, A. Cattaneo, and P. Galeffi. 1991. "Phytoantibodies": a general vector for the expression of immunoglobulin domains in transgenic plants. Plant Mol Biol. 17:865-74.

Bird, R.E., K.D. Hardman, J.W. Jacobson, S. Johnson, B.M. Kaufmann, S.M. Lee, T. Lee, H.S. Pope, G.S. Riordan, and M. Whitlow. 1988. Single-chain antigen-binding proteins. Science. 242:423-426.

Bjorck, L., P. Akesson, M. Bohus, J. Trojnar, M. Abrahamson, I. Olafsson, and A. Grubb. 1989. Bacterial growth blocked by a synthetic peptide based on the structure of a human proteinase inhibitor. Nature. 337:385-6.

Bjorck, L., A. Grubb, and L. Kjellen. 1990. Cystatin C, a human proteinase inhibitor, blocks replication of herpes simplex virus. Nature. 337:385-386.

Caddick, M., A. Greenland, I. Jepson, K. Krause, N. Qu, K. Riddell, M. Salter, W. Schuch, U. Sonnewald, and A. Tomsett. 1998. An ethanol inducible gene switch for plants used to manipulate carbon metabolism. Nat. Biotechnol. 16:177-180.

Carter, P., and A. Merchant. 1997. Engineering antibodies for imaging and therapy. Curr Opin Biotechnol. 8:449-454.

Carter, P., J. Ridgway, and Z. Zhu. 1995. Toward the production of bispecific antibody fragments for clinical applications. J Hematother. 4:463-470.

Chen, S.Y., Y. Khouri, J. Bagley, and W.A. Marasco. 1994. Combined intra- and extracellular immunisation against human immunodeficiency virus type 1 infection with a human anti-gp 120 antibody. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91:5932-5936.

Chowrira, G., V. Akella, and P. Lurquin. 1995. Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta. Generating transgenic plants without in vitro tissue culture. Mol Biotechnol. 3:17-23.

Comal, L., P. Moran, and D. Maslyar. 1990. Novel and useful properties of a chimeric plant promoter combining CaMV 35S and MAS elements. Plant Mol. Biol. 15:373-381.

De Neve, M., M. De Loose, A. Jacobs, H. Van Houdt, B. Kaluza, U. Weidle, M. Van Montagu, and A. Depicker. 1993. Assembly of an antibody and its derived antibody fragment in Nicotiana and Arabidopsis. Transgenic Res. 2:227-37.

Dempsey, D., H. Silva, and D. Klessig. 1998. Engineering disease and pest resistance in plants. Trends Microbiol. 6:54-61.

D'Halluin, K. E. Bonne, M. Bossut, M. De Beuckeleer, and J. Leemans. 1992. Transgenic maize plants by tissue electroporation. Plant Cell. 4:1495-1505.

Duan, L., O. Bagasra, M.A. Laughlin, J.W. Cakes, and R.J. Pomerantz. 1994. Potent inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by an intracellular anti-Rev single chain antibody. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91:5075-5079.

Düringv, K., S. Hippe, F. Kreuzaler, and J. Schell. 1990. Synthesis and selfassembly of a functional monoclonal antibody in transgenic Nicotiana tabacum. Plant Mol. Biol. 15:281-293.

Eiklid, K., S. Olsnes, and A. Pihl. 1980. Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol of HeLa cells. Exp Cell Res. 126:321-6.

Endo, Y., and K. Tsurugi. 1987. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. J Biol Chem. 262:8128-30.

Endo, Y., and K. Tsurugi. 1988. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Nucleic Acids Symp Ser. 19:139-42.

Falk, B.W., and G. Bruening. 1994. Will transgenic crops generate new viruses and new diseases. Science. 263:1395-1396.

Fiedler, U., J. Phillips, O. Artsaenko, and U. Conrad. 1997. Optimisation of scFv antibody production in transgenic plants. Immunotechnology. 3:205-216.

Fischer, R.S., A. Schillberg, Y.D. Stierhof, and F. Kreuzaler. 1999. Production, characterisation and molecular cloning of Tobacco Mosaic Virus (TMV)-specific neutralizing monoclonal antibodies with different epitope specificities. Molecular Immunology.

Florack, D., W. Dirkse, B. Visser, F. Heidekamp, and W. Stiekema. 1994. Expression of biologically active hordothionins in tobacco. Effects of pre- and pro-sequences at the amino and carboxyl termini of the hordothionin precursor on mature protein expression and sorting. Plant Mol Biol. 24:83-96.

Friedler, A., N. Zakai, O. Karni, Y. Broder, L. Baraz, M. Kotler, A. Loyter, and C. Gilon. 1998. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localisation signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37:5616-5622.

Furth, P. 1997. Gene transfer by biolistic process. Mol Biotechnol. 7:139-143.

Gadani, F., M. Mansky, R. Medici, W.A. Miller, and J.H. Hill. 1990. Genetic engineering of plants for virus resistance. Archives of Virology. 115:1-21.

Gerber, L.D., K. Kodukula, and S. Udenfriend. 1992. Phosphatidylinositol glycan (Pl-G) anchored membrane proteins. Amino acid requirements adjacent to the site of cleavage and Pl-G attachment in the COOH-terminal signal peptide. J Biol Chem. 267:12168-73.

Girbes, T., J. Ferreras, R. Iglesias, L. Citores, C. De Torre, M. Carbajales, P. Jimenez, F. De Benito, and R. Munoz. 1996. Recent advances in the uses and applications of ribosome-inactivating proteins from plants. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 42:461-471.

Gross, G., and Z. Eshhar. 1992. Endowing T cells with antibody specificity using chimeric T cell receptors. Faseb J. 6:3370-8.

Ham, P.J., C. Albuquerque, B. Smithies, P. Chalk, S. Klager, and H. Hagen. 1994. Antibacterial peptides in insect vectors of tropical parasitic disease. Ciba Found Symp. 186:140-51.

Harrison, B.D., M.A. Mayo, and D.C. Baulcombe. 1987. Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Nature. 328:799-802.

Hartley, M.R., J.A. Chaddock, and M.S. Bonness. 1996. The structure and function of ribosome inactivating proteins. Trends in Plant Science. 1:254-260.

Hayakawa, Y. 1991. Structure of a growth-blocking peptide present in parasitzed insect hemolymph. J Biol Chem. 266:7982-7984.

Hiatt, A., P. Cafferkey, and K. Bowdish. 1989. Production of antibodies in plants. Nature. 342:469-470.

Kapila, J., P. De Rycke, M. Van Montagu, and C. Angenon. 1997. An Agrobacterium mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 122:101-108.

Kim, P., F. Janiak-Spens, W. Trimble, B. Leber, and D. Andrews. 1997. Evidence for multiple mechanisms for membrane binding and integration via carboxyl-terminal insertion sequences. Biochemistry. 36:8873-8882.

Klein, T., and S. Fitzpatrick-McElligott. 1993. Particle bombardment: a universal approach for genetransfer to cells and tissues. Curr Opin Biotechnol. 4:583-590.

Köhler, G., and C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256:495-497.

Lambert, S., and V. Bennett. 1993. From anemia to cerebellar dysfunction. A review of the ankyrin gene family. Eur J Biochem. 211:1-6.

LaVallie, E., E. DiBlasio, S. Kovacic, K. Grant, P. Schendel, and J. McCoy. 1993. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y).
11:187-193.

Leland, P., L. Schultz, B. Kim, and B. Raines. 1998. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 95:10407-10412.

Madshus, I., and H. Stenmark. 1992. Entry of ADP-ribosylating toxins into cells. Curr Top Microbiol Immunol. 175:1-26.

Marasco, W.A., W.A. Haseltine, and SY. Chen. 1993. Design, intracellular expression, and activity of a human anti-human immunodeficiency virus type 1 gp 120 single-chain antibody. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 90:7889-7893.

Mitra, A., and A. Gynheung. 1989. Three distinct regulatory elements comprise the upstream promoter of the nopaline synthase gene. Mol. Gen. Genet. 215:294-299.

Montanaro, L., S. Sperti, A. Mattioli, G. Testoni, and F. Stirpe. 1975. Inhibition by ricin of protein synthesis in vitro. Inhibition of the binding of elongation factor 2 and of adenosine diphosphate-ribosylated elongation factor 2 to ribosomes. Biochem J. 146:127-31.

Namba, S., K. Ling, C. Gonsalves, D. Gonsalves, and J.L. Slightom. 1991. Expression of the gene encoding the coat protein of cucumber mosaic virus (CMV) strain WL appears to provide protection to sugarbeet plants against infection by several different strains. Gene. 107:181-188.

Ni, M., D. Cui, J. Einstein, S. Narasimhulu, C.E. Vergara, and S.B. Gelvin. 1995. Strength and tissue specificity of chimeric promoters derived from octopine and nopaline synthase genes. Plant J. 7:661-676.

Owen, M., A. Gandecha, B. Cockburn, and G. Whitelam. 1992. Synthesis of a functional anti-phytochrome single-chain Fv protein in transgenic tobacco. Bio/Technology. 10:790-794.

Palukaitis, P., and M.J. Roossinck. 1996. Spontaneous change of a benign satellite RNA of cucumber mosaic virus to a pathogenic variant. Nature Biotechnology. 14:1264-1268.

Peters, L.L., and S.E. Lux. 1993. Ankyrins: structure and function in normal cells and hereditary spherocytes. Semin Hematol. 30:85-118.

\newpage

Plückthun, A. 1991. Antibody engineering. Current Opinion in Biotechnology. 2:238-246.

Pluckthun, A., and P. Pack. 1997. New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments. Immunotechnology. 3:83-105.

Poljak, R.J. 1994. Production and structure of diabodies. Structure. 2:1121-3.

Rose, M., and G. Fink. 1987. KAR1, a gene required for function of both intranuclear and extranuclear microtubules in yeast. Cell. 48:1047-1060.

Sanford, J.C., E.D. Wolf, and N.K. Allen. 1990. Method for transporting substances into living cells and apparatus therefore. Patent #4,945,050. Cornell Research Foundation Inc, Ithaca, NY.

Sangster, B. 1997. Identification of cytotoxic peptide as possible mechanism for neurotoxicity of HIV viral envelope and AIDS pathogenesis. Med Hypotheses. 48:463-8.

Schouten, A., J. Roosien, J.M. de Boar, A. Wilmink. M.N. Rosso, D. Bosch, W.J. Stiekema, F.J. Gommers, J. Eakker, and A. Schots. 1997. Improving scFv antibody expression levels in the plant cytosol. FEBS letters. 415:235-241.

Silburn, K., D. McPhee, A. Maerz, P. Poumbourios, R. Whittaker, A. Kirkpatrick, W. Reilly, M. Manthey, and C. Curtain. 1998. Efficacy of fusion peptide homologs in blocking cell lysis and HIV-induced fusion. AIDS Res Hum Retroviruses. 14:385-392.

Smith, D., and K. Johnson. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione 5-transferase. Gene. 67:31-40.

Spörlein, B., and H.U. Koop. 1991. Lipofectin: direct gene transfer to higher plants using cationic liposomes. Theor. Appl. Genet. 83:1-5.

Tang, Y., N. Jiang, C. Parakh, and D. Hilvert. 1996. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. J Biol Chain. 271:15682-6.

Tavladoraki, P., E. Benvenuto, S. Trinca, D. DeMartinis, and P. Galeffi. 1993. Transgenic plants expressing a functional scFv antibody are protected from virus attack. Nature. 366:469-472.

Tedder, T.F., and P. Engel. 1994. CD20: a regulator of cell-cycle progression of B lymphocytes. Immunol Today. 15:450-4.

Turner, D.J., M.A. Rifler, and A.J. George. 1997. Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimisation of peptide sequence using phage display technology. J Immunol Methods.
205:43-54.

Turpen, T.H., A.M. Turpen, N. Weinzettl, M.H. Kumagai, and W.O. Dawson. 1993. Transfection of whole plants from wounds inoculated with Agrobacterium tumefaciens containing cDNA of Tobacco Mosaic Virus. J. Virol. Meth. 42:227-240.

Von Heijne, G. 1985. Signal sequences. The limits of variation. J Mol Biol 1985. 184:99-105.

Voss, A., M. Niersbach, R. Ham, H.J. Hirsch, Y.C. Liao, F. Kreuzaler, and B. Fischer. 1995. Reduced virus infectivity in N. tabacum secreting a TMV-specific full size antibody. Mol. Breeding. 1:39-50.

White, F.F. 1992. Vectors for gene transfer in higher plants. In Transgenic Plants. Vol. 1. Academic Press. 15-47.

Wilson, T.M.A. 1993. Strategies to protect crop plants against viruses: Pathogen-derived resistance blossoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3134-3141.

Winter, G., A.D. Griffiths, R.E. Hawkins, and H.R. Hoogenboom. 1994. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. 12:433-55.

Winter, G., and C. Milstein. 1991. Man made antibodies. Nature. 349:293-299.

Wright, M.D., and M.G. Tomlinson. 1994. The ins and outs of the transmembrane 4 superfamily. Immunol Today. 15:588-94.

Zimmermann, S., S. Schillberg, Y.C. Liao, and R. Fischer. 1998. Intracellular expression of a TMV-specific single chain Fv fragment leads to improved virus resistance in Nicotiana tabacum. Molecular Breeding. 4:369-379.

<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Forderung der Agewandten Forschung e.V.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Molecular Pathogenicide Mediated Plant Disease Resistance

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> C2428 EP S3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 99 07 844

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-10-18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgtcgacg aggacctgaa caaggtgttc cca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctctagat cagaaatcct ttctcttg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctctagac gctcgagttt agaaatgcct agatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctctagac gctcgagttt aagtgaagaa ataaataaca ataacaacaa

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 900

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 918

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 915

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 900

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattcg acgtcgccat ggccttcctc ggcgacggcg gcgac

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaagcttg tcgaccggcg gtttgccggg ctggctg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1604

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1050

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

46

47

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgcgccat ggcttacagt atcact

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1561

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1582

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1059

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1077

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1654

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt gtgmtgwchc agtctcca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt cagatgattc agtctcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt gttctcwhcc agtctcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt gtgmtgwchc agtctcaa

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgatrtt ktgatgaccc arrckgca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgatrtt ktgatgaccc arrckcca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt gtgatgaccc arbhtg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgatatt ktgatgaccc araytcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctramatt gtgmtgaccc aatytccw

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctsaaawt gtkctsaccc agtctcca

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgayaty cagatgacmc agwctac

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgayaty cagatgachc agwctcc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctgacatt gtgatgactc aggctac

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctcarsyt gtkstsactc agkaat

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatga ctcgcggcgc gcctcarsyt gtkstsactc agkcat

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacggccg gcccctgmrg agacdgtgas mgtrgtc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacggccg gcccctgmr agacdgtgas rgtrgtg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacggccg gcccctgmrg agacdgtgas cagrgtc

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacggccg gcccctgmrg agacdgtgas tgaggtt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacggccg gcccctgmrg agacdgtgas tgaratt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacgcggc cgcgtcgaca gcmcgtttca gytccarytt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggtac tccacgcggc cgcgtcgaca gcmcgtttka tytccarytt

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

84

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Ile Val Glu Leu Ile Arg Gly Thr Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es Val o Cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Thr Asp Leu Xaa Arg Ala Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile Val Ile Cys Gly Arg Val Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Thr Leu Xaa Arg Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Arg Gln Arg Asp Thr Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Arg Val Asp Ala Arg Glu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ala Gly Met Leu Gly Lys Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Ala o Asn

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Trp Glu Leu Xaa Arg Ser Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Ala Leu Xaa Arg Glu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Val o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asn Asp Leu Xaa Arg Ala Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ile Val Ser Ala Trp Arg Glu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ala Leu Xaa Arg His Ile Gly Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Gln Leu Xaa Arg Ala Thr Ser Ser Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ile Thr Ser Gln Arg Glu Thr Gly Trp Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Arg Arg Ser Thr Thr Gly Ile Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Tyr o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Thr Thr Leu Xaa Arg Gly Thr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_rasgo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Pro o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Val Asp Leu Xaa Arg Glu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys His Ile Lys Asp Trp Glu His Leu Glu Glu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Arg Lys Asp Gly Glu His Trp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gln Ala Lys Ser Trp Ser Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Gln Ala Lys Glu Trp Ser Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Trp Glu His Arg Val Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Trp Glu His Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Trp Ser His Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Ser Asp Pro Gln Met Gly Lys Arg Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Pro Arg Pro Gln Leu Ala Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Pro Asp Pro Gln Ser Ser His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Phe Thr Asp Pro Gln Leu His Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gln Asp Pro Gln Gln Gln Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Pro Asp Ser Gln Leu Glu Trp Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Cys Asp Pro Gln Leu Tyr Gln Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Pro Gln Met Phe Arg Arg His Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Lys Asp Gly Gln Leu Arg Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Arg Leu His Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Asn Gly Thr Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Ser Ser Leu Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Arg Leu His Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Thr Leu His Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Pro Gln Leu Ser Leu Gln Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Asp Ala Gln Leu Ser Gly Thr Arg Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Pro Asp Pro Gln Leu Ser Leu His Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattcg acgtcgccat gggctgggaa caactggagc ag

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaagcttg tcgaccggcg gtttgccggg ctggctg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggaattcg acgtcgccat ggccttcctc ggcgacggcg gcgac

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaagcttg tcgaccggcg gtttgccggg ctggctg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

86

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 827

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1046

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: origen sintético, no natural

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

89

Claims

1. Una proteína de fusión que comprende

(a) al menos un dominio de unión que comprende un anticuerpo o un sitio de unión del mismo que reconoce específicamente un epítopo de un patógeno vegetal; y

(b) una secuencia de localización en la membrana y/o una unidad que conduce al anclaje en la membrana y, opcionalmente, una secuencia de redireccionamiento celular.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende al menos un dominio adicional que comprende una secuencia de proteína o péptido que es tóxica para el patógeno o perjudicial para su replicación, transmisión o ciclo vital.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 2, donde la secuencia de localización en la membrana es proteolíticamente sensible.

4. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha secuencia de localización en la membrana es un dominio transmembrana del receptor de las células T humano o cualquier otro miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, anclas de glicofosfatidilinositol (GPI), KAR1, antígeno T medio, citocromo b5 o syn1.

5. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dichos dominios están conectados mediante enlaces covalentes o no covalentes.

6. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde la actividad tóxica de la secuencia de proteína o péptido es activada por la presencia del patógeno, un componente del mismo o un componente de una célula huésped.

7. La proteína de fusión de la reivindicación 6, donde la actividad tóxica de la secuencia de proteína o péptido es activada por una proteasa específica del patógeno o de la célula huésped.

8. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho anticuerpo o sitio de unión del mismo es un anticuerpo de tamaño normal recombinante, un anticuerpo IgA secretor dimérico, un anticuerpo IgM multimérico, un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento Fab, un fragmento Fv, un anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv), un scFv biespecífico, un diabody, un anticuerpo de un único dominio (dAb), un minobody o una unidad de reconocimiento molecular (MRU), derivados de bancos de presentación en fagos o de presentación en ribosomas de células de hibridoma, sintéticos, semi-sintéticos, indiferenciados o inmunocompetentes, o mediante generación de anticuerpos diseñadores completamente sintéticos.

9. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende al menos dos dominios de unión para el mismo o diferentes epítopos.

10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, donde dichos epítopos son del mismo o de diferentes patógenos.

11. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde la toxina es una enzima o una proteína estructural o no estructural viral o un dominio de unión como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 11, donde dicha enzima es la quitinasa o la glucanasa, la glucosa oxidasa, la superóxido dismutasa, la ADNasa o la ARNasa o RIP o la lipasa o fragmentos activos de las mismas ya sean solos o en cualquier combinación.

13. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el patógeno es un virus, bacteria, micoplasma, hongo, nemátodo o insecto.

14. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde al menos uno de dichos dominios está fusionado a una proteína portadora C- o N-terminal.

15. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde al menos uno de dichos dominios comprende un fluoróforo.

16. Un patogenicida que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el patogenicida de la reivindicación 16, donde dicho dominio o dominios de unión y dicho dominio o dominios adicionales son capaces de autoensamblarse in vivo.

18. El patogenicida de las reivindicaciones 16 o 17, donde al menos uno de dichos dominios de unión de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 reconoce específicamente una proteína del movimiento viral y/o una replicasa.

19. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o 17 o el patogenicida de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19.

21. Un vector que comprende polinucleótidos separados que codifican al menos uno de dichos dominios de unión y/o dichos dominios adicionales de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o 17 o el patogenicida de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

22. Una composición que comprende vectores donde cada vector contiene al menos un polinucleótido que codifica al menos un dominio de unión y/o al menos un dominio adicional de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o 17 o el patogenicida de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18; y donde la expresión de al menos dos de dichos polinucleótidos da como resultado la producción de dicha proteína de fusión o dicho patogenicida o el ensamblaje del mismo in vivo.

23. El vector de la reivindicación 20 a 21 o la composición de la reivindicación 22, donde el polinucleótido está conectado operativamente a secuencias reguladoras que permiten la expresión de la proteína de fusión, el patogenicida o los dominios de los mismos en una célula huésped.

24. El vector o la composición de la reivindicación 23, donde dicha secuencia reguladora es un promotor constitutivo, quimérico, ubicuo, específico de tejidos, específico de órganos o inducible.

25. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19, el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 20, 21, 23 o 24, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24.

26. Un método para la producción de un patogenicida molecular que comprende:

(a): cultivar la célula huésped de la reivindicación 25 en condiciones adecuadas para la expresión del polinucleótido; y

(b): recuperar la proteína de fusión, el patogenicida o los dominios del mismo del cultivo.

27. Un patogenicida molecular obtenible mediante el método de la reivindicación 26 o codificable por el polinucleótido de la reivindicación 19.

28. Un método para la producción de plantas transgénicas resistentes a patógenos, células vegetales o tejido vegetal que comprende la introducción de un polinucleótido de la reivindicación 19, el vector de la reivindicación 20, 21, 23 o 24 o los vectores de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 en el genoma de una planta, célula vegetal o tejido vegetal.

29. Una célula vegetal transgénica que contiene integrado establemente en el genoma un polinucleótido de la reivindicación 19, un vector de la reivindicación 20, 21, 23 o 24 o los vectores de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 u obtenible según el método de la reivindicación 28.

30. Una planta o tejido vegetal transgénica que comprende células vegetales de la reivindicación 29 u obtenible mediante el método de la reivindicación 28.

31. La planta transgénica de la reivindicación 30, donde la proteína de fusión o el patogenicida se hacen funcionales contra patógenos mediante ensamblaje in vivo tras la transformación simultánea de al menos dos constructos de expresión vegetales independientes o tras el cruzamiento sexual para formar vástagos híbridos a partir de dos plantas parentales que expresan uno o más de los dominios de la proteína de fusión o el patogenicida, o cualquier otra forma de recombinación genética.

32. La planta transgénica de la reivindicación 30 o 31, que muestra una resistencia mejorada a un patógeno al que la planta de tipo salvaje era susceptible.

33. Partes cosechables o material de propagación de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, comprendiendo dichas partes cosechables o material de propagación células vegetales de la reivindicación 29.

34. Un estuche que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o 17, el patogenicida de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, el polinucleótido de la reivindicación 19, el vector de la reivindicación 20, 21, 23 o 24, la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 o el patogenicida molecular de la reivindicación 27.

35. El uso de la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o el patogenicida de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, el polinucleótido de la reivindicación 19, el vector de la reivindicación 20, 21, 23 o 24, la composición de una cualquier de las reivindicaciones 22 a 24 o el patogenicida molecular de las reivindicación 27 para la protección de una planta frente a la acción de un patógeno.