CZ382199A3 - Produkce rostlin tolerantních k fungicidům expresí polypeptidů vázajících fungicidy v rostlině - Google Patents

Abstract

Postup produkce rostlin tolerantních k fungicidůmspočívá v expresi protilátky se schopností vázat fungicid v rostlinách.

Description

Produkce rostlin tolerantních k fungicidům expresí polypeptidů vázajících fungicidy v rostlině.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká postupu produkce rostlin tolerantních k fungicidům expresí exogenních polypeptidů se schopností vázat fungicidy do rostlin nebo jejich orgánů. Vynález se dále týká využívání odpovídajících nukleových kyselin kódujících polypeptidy protilátekk nebo částí protilátek s vlastnostmi způsobujícími vazbu fungicidů na transgenní rostliny, čímž transformují samotnou rostlinu.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že metody genetického inženýrství umožňují specifický přenos cizích genů do genomu rostliny. Tento postup se nazývá transformace a výsledné rostliny transgenické rostliny. Transgenické rostliny se běžně používají v různých oblastech biotechnologie. Příkladem jsou rostliny odolné hmyzu (Vaek, et al., Plant Cell, 5, 159-169, 1987), rostliny odolné virům (Powell, et al., Science, 232, 738-743, 1986) a rostliny odolné ozónu (Van Camp, et al., BioTech., 12, 165-168, 1994). Příklady zlepšených kvalitativních charakteristik dosažených genetickým inženýrstvím jsou: zlepšená skladovatelnost ovoce (Oeller, et al., Science, 254, 437-439, 1991), zvýšená produkce škrobu v bramborách (Stark, et al., Science, 242, 419, 1992), změny ve škrobu (Visser, et al., Mol. Gen. Genet., 225, 289-296, 1991) a složení lipidů (Voelker, et al., Science, 257, 72-74, 1992) a tvorba cizích polymerů (Poirer, et al., Science, 256, 520-523, 1992).

Důležitým cílem práce v oblasti molekulární genetiky rostlin je vytváření tolerance vůči herbicidům. Tolerance vůči herbicidům je charakterizována zlepšením snášenlivosti (ve smyslu typu nebo úrovně) rostliny nebo orgánů rostliny na aplikaci herbicidů. To lze ovlivnit několika způsoby. Známými metodami jsou využívání metabolických genů, například kruhových genů ve spojení s odolností ke glufosinátu (WO 8705629) nebo dosažení enzymu odolného vůči herbicidu jako je to v případě syntézy enolpyruvyl shikimat-3-fosfátu (WO 9204449), který je odolný vůči glyfosatu a využití herbicidu v buněčných a tkáňových kulturách k výběru odolných rostlinných buněk a výsledných odolných rostlin jak je to popsáno v případě inhibitorů acetylCoA-karboxylázy (US pat. 5162602, US pat. 5290696).

Protilátky jsou proteiny jako složka imunitního systému. Styčným znakem všech protilátek je jejich prostorová kulová struktura, vytváření lehkých a těžkých řetězců a

- 2 jejich základní schopnost vázat s vysokou specificitou molekuly nebo částí molekulární struktury (Alberts, et al., in: Molekularbiologie der Zelle [Molekulární biologie buněk], 2. vyd., 1990, VCH Verlag, ISBN 3-527-27983-0, 1198-1237). Na základě těchto vlastností byly využity protilátky pro mnoho úkolů. Aplikace lze rozdělit na aplikace protilátek na zvířecí a lidské organizmy ve kterých vznikají, a které se nazývají aplikace in šitu a aplikace ex šitu, tj. používání antilátek poté, co byly izolovány z buněk nebo organizmů, které je vytvářejí (Whitelam a Cockburn, TIPSVol.1, (8), 268-272,1996).

Použití somatických hybridních buněčných linií (hybridomů) jako zdroje protilátek proti velmi specifickým antigenům je založeno na práci provedené Kóhlerem a Milsteinem (Nátuře, 495-97, 1975). Tento postup dovoluje, aby byly produkovány takzvané monoklonální protilátky mající jednotnou strukturu a které jsou vytvářeny fúzí buněk. Buňky sleziny imunizovaných myší se nechají fúzovat s buňkami myšího myelomu. To poskytuje buňky hybridomů, které se multiplikují do nekonečna. Současně buňky vylučují specifické protilátky proti antigenu, kterým byly myši imunizovány. Buňky sleziny umožňují tvorbu protilátky, zatímco myeloidní buňky přispívají k neomezenému růstu a kontinuálnímu vylučování protilátek. Zatímco každá buňka hybridomů, která je klonem, je odvozena od jediné buňky B, všechny vytvořené molekuly protilátky mají stejnou strukturu včetně polohy antigenové vazby. Tato metoda uvedla do života používání protilátek, protože protilátky mající jednotnou a známou specificitu a homogenní strukturu jsou nyní k dispozici v neomezeném množství. Monoklonální protilátky se široce využívají v imunodiagnostice a jako terapeutika.

V posledních letech výrobu protilátek umožnila metoda tzv. fágového displeje (phage display), vyhýbající se imunosystému a různým imunizacím zvířat. Příbuznost a specificita protilátek se měří in vitro (Winter, et al., Ann. Rev. Immunol., 12, 433-455, 1994; Hoogenboom TIBTech Vol. 15, 62-70, 1997). Genové segmenty, které obsahují sekvenci kódující různá místa protilátek, tj. polohu vazby antigenu fúzují s geny proteinového obalu bakteriofága. Bakterie jsou potom infikovány fágem, který obsahuje takové fúzující geny. Výsledné části fága jsou nyní vybaveny obalem obsahujícím fúzující protein podobný jako u protilátky, kde vazebná doména protilátky míří ven. Nyní lze využít fágové displejové knihovny • · • ·

- 3 (phage display library) k izolaci fága obsahujícího fragment požadované protilátky a který se specificky váže na určitý antigen. Každý fág izolovaný tímto způsobem vytváří monoklonální polypeptid vážící antigen odpovídající monoklonální protilátce.

Geny s určitou polohou vazby antigenu, které jsou specifické pro každý fág mohou být izolovány z fágu DNK a použity pro vytvoření úplných genů protilátky.

V oblasti ochrany zemědělských plodin byly protilátky využity zvláště jako analytické nástroje ex sítu pro kvalitativní určení a kvantitativní stanovení protilátek. To se týká detekce v součástech rostliny, herbicidů nebo fungicidů v pitné vodě (Sharp, et al., ACS Symp Ser., 446, 1991; Pestic. Residues Food Saf., 87-95), vzorcích zeminy (WO 9423018) nebo rostlinách nebo jejich orgánech a použití protilátek jako pomocných látek při čištění vázaných molekul.

Tvorba imunoglobulinů v rostlinách byla poprvé popsána Hiattem, et al., Nátuře, 342, 76-78, 1989. Toto spektrum zahrnuje vylučované protilátky s jedním řetězcem až po mnohočetné protilátky (J. Ma a Mích Hein, Annuals New York Academy of Sciences, 72-81, 1996).

Dřívější pokusy využívání protilátek in šitu byly směrovány proti proteinům obalu virů k ochraně rostlin proti patogenům, zvláště proti virovým onemocněním expresí, na rostlinné buňky, specifické protilátky nebo jejich části (Tavladoraki, et al., Nátuře, 366, 469-472, 1993; Voss, et al., Mol. Breeding, 1, 39-50, 1995).

Analogický postup byl využit také k ochraně rostlin proti infekci hlísty (Rosso, et al., Biochem. Biophys. Res. Corn., 220, 255-263, 1996). Ve farmakologii existují příklady aplikace, kde se exprese protilátek na rostliny in šitu využívá k orální imunizaci (Ma, et al., Science, 268, 716-719, 1995; Mason a Arntzen, Tibtech Vol. 13, 388-392, 1996). Látka je vybavena protilátkou vytvářenou rostlinou a mající původ v rostlinách nebo rostlinných orgánech vhodných ke konzumaci ústy, hrdlem nebo trávicím traktem, a tato protilátka způsobuje účinnou imunitní ochranu. Bylo pozorováno, že jednořetězcová protilátka proti kyselině abscisové nízkomolekulárního rostlinného hormonu, již realizovala expresi na rostlinu a omezila dostupnost rostlinných hormonů v důsledku vazby rostlinné kyseliny abscisové (Artsaenko, et al., The Plant Journal, 8, (5), 745-750, 1995).

• φφ ·* φφ • · · · · φ • φ φ φφφφφφ • φ φ · •ΦΦΦΦΦΦ φφ φ·

- 4 Chemická regulace hub v agronomicky důležitých plodinách vyžaduje použití vysoce selektivních fungicidů bez fytotoxického účinku. Fytotoxický účinek fungicidů může být založen například na inhibici růstu rostliny, na snížení fotosyntézy a tím na zmenšení výtěžku. V určitých případech je však obtížné vyvinout dostatečně selektivní fungicidy, které by bylo možno použít pro všechny důležité plodiny pěstované ve velkém a které by nezpůsobovaly poškození rostliny a zmenšení výtěžku sklizně. Zavedení plodin odolných nebo tolerantních k fungicidům může přispět k řešení tohoto problému a může otevřít nové způsoby využívání fungicidů pro plodiny, u kterých dosud nebylo možno použít fungicidy, nebo to sice možné bylo, ale jenom potud, pokud byly sklizňové ztráty ještě přijatelné.

Vývoj užitkových rostlin odolných vůči fungicidům pomocí tkáňových kultur nebo mutagenezi semen a přirozeným výběrem je omezen. Na jedné straně musí být vždy fytotoxický účinek detekovatelný na úrovni tkáňové kultury a na druhé straně mohou být technologií tláňových kultur manipulovány pouze ty rostliny, které mohou být z buněčných kultur úspěšně regenerovány nepoškozené. Následující mutageneze a výběr užitkových rostlin může navíc vykazovat nežádoucí charakteristiky, které musejí být znovu eliminovány, a v některých případech postup opakován zpětným křížením. Zavedení rezistence použitím kříženců může být omezeno jen na některé rostliny stejného druhu.

Pro výše uvedené příčiny je přínos genetického inženýrství v izolaci genu kódujícího rezistenci a jeho převedení do užitkové rostliny cíleným postupem nadřazen tradičnímu způsobu rozmnožování rostlin.

Vývoj užitkových rostlin tolerantních nebo odolných herbicidům metodami molekulární biologie vyžaduje znalost mechanizmu působení herbicidů v rostlině a také genů, které propůjčují odolnost k herbicidům, a to bylo možné až nyní. Velký počet herbicidů, které se v současnosti komerčně využívají působí ve fázi blokování biosyntézy enzymů esenciálních aminokyselin, lipidů nebo pigmentů. Toleranci k herbicidům lze vytvářet měněním genů těchto enzymů takovým způsobem, aby již herbicidy nebyly dále vázány a tyto alternativní geny zavádět do užitkových rostlin. Alternativním příkladem je nalezení enzymů analogických s přírodními, například v mikroorganizmech, které vykazují přirozený odpor k herbicidům. Tyto geny s propůjčenou resistencí se z takových mokroorganizmů izolují, reklonují na vhodné ·· ·» » · · 4 ► · · 4

ΦΦΦ · Φ 4 • · ··

- 5 vektory a následně, po úspěšné transformaci se realizuje exprese do užitkových rostlin (WO 96/38567).

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je vývoj nového obecně využitelného způsobu genetického inženýrství k vytváření transgenických rostlin tolerantních k herbicidům. Zjistili jsme, že tohoto cíle lze překvapivě dosáhnout postupem exprese exogenních polypeptidů, protilátek nebo částí protilátek se schopností vázat fungicidy v rostlinách.

Předkládaný vynález se týká předně výroby protilátek vážících fungicidy a klonování odpovídajících genů nebo genových fragmentů.

Prvním krokem je výroba protilátky, která váže fungicid. To lze učinut mezi jiným imunizací obratlovců, ve většině případů myší, krys, psů, koní, oslů nebo koz antigenem. Antigenem je v tomto případě fungicidně aktivní sloučenina, která je associovaná nebo vázaná na výšemolekulární nosič, jako je například bovinní sérumalbumin (BSA), kuřecí ovoalbumin, hemocyanin přílepky (KLH) nebo další nosiče přes funkční skupinu. Po opakované aplikaci antigenu se imunní odezva sleduje obvyklými způsoby a izoluje se tak vhodné antisérum. Zpočátku tento způsob vede k polyklonálnímu séru obsahujícímu protilátky s rozdílnou specificitou. Pro cílené využívání in šitu je nutno izolovat tu genovou sekvenci, která kóduje jedinou, specifickou monoklonální protilátku. K tomuto účelu vedou rozličné cesty. V prvním přiblížení se využívá fúze buněk produkujících protilátku a nádorových buněk, aby se získaly buněčné kultury hybridomú, které průběžně vytvářejí protilátky a které nakonec vedou k vyjednocení klonů a k homogenní buněčné linii, která vytváří definovanou monoklonální protilátku.

Z takových monoklonálních buněčných linií se izoluje cDNK pro protilátku nebo její část - viz tzv. jednořetězcová protilátka (single chain antibody - scFv). Tyto sekvence cDNK mohou být potom klonovány do expresních kazet (expression cassettes) a použity pro funkční expresi do prokaryotických a eukaryotických organizmů, včetně rostlin.

Alternativně je možno vybrat protilátky přes fágové displejové knihovny (phage display libraries); tyto látky váží fungicidní molekuly a katalyticky je konvertují na produkt s nefungicidními vlastnostmi. Způsoby produkce katalytických protilátek jsou

1« 0 4 4 «· 4 9 9 4

4 9 9 49 9 4 9 4 9 9

4 99 · ΦΦΦΦΦ · 4 4 9 · Φ · ΦΦΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ ΦΦ Φ 4

ΦΦ 4β ··· Φ4Φ4 Φ* ΦΦ

- 6 popsány v publikaci Janda, et al., Science, 275, 945-948, 1997, Chemical selection for catalysis in combinatorial Antibody libraries; Catalytic Antibodies, 1991, Ciba Foundation Symposium, 159, Wiley- Interscience Publication. Klonování genu těchto katalytických protilátek a jejich exprese do rostlin může principiálně vést také k rostlině odolné fungicidu.

Vynález se týká zvláště exprese kazet jejichž kódovací sekvence kóduje polypeptidy se schopností vázat fungicid, nebo jejich funkční ekvivalent a použití těchto expresních kazet k produkci rostliny tolerantní k fungicidu. Sekvencí nukleových kyselin může být například sekvence DNK nebo cDNK. Zakódované sekvence vhodné pro vložení do expresní kazety podle tohoto vynálezu jsou například ty, které obsahují sekvenci DNK z buňky hybridomu, která zakóduje polypeptid s vlastnostmi vazby fungicidu a tím předá rezistenci na specifické fungicidy na hostitele.

Expresní kazety podle tohoto vynálezu navíc obsahují sekvence regulační kyseliny nukleové, která ovládá expresi zakódované sekvence do hostitelské buňky. Expresní kazeta, které se dává podle tohoto vynálezu přednost obsahuje vzestupnou sekvenci, tj. promotor kódované sekvence zakončené na 5’ a sestupnou, tj. polyadenylacní signál zakončený na 3’ a pokud to je žádoucí, další regulační prvky, které se operativně připojí vloženou kódovací sekvencí k polypeptidů s vlastnostmi fungicidní vazby a/nebo k tranzitnímu peptidu. Operativnímu připojení se musí rozumět ve významu sekvenčního uspořádání promotoru, kódovací sekvence, terminátoru a pokud to je vhodné, i dalších regulačních prvků takovým způsobem, že každý z regulačních prvků může fungovat podle záměru jakým způsobem se realizuje exprese kódovací sekvence. Sekvence pro operativní připojení, kterým se dává přednost, avšak tím není vynález omezen, jsou cílovými sekvencemi pro záruku subcelární lokalizace v apoplastu, v buněčné membráně, ve vakuole, v plastidech, v mitochondriích, v endoplazmatickém retikulu (ER), v jádru, v lipozomech nebo v dalších oddílech a translačních enhancerech, jako je řídící 5’- sekvence z viru tabákové mozaiky (Gallie, et al., Nucl. Acids Res., 15, 8693-8711, 1987).

Vhodným promotorem expresní kazety podle tohoto vynálezu je v principu jakýkoliv promotor schopný řídit expresi cizích genů. Promotory, které jsou přednostně používány jsou zvláště promotory odvozené od rostlin nebo promotory • · · · 4 4 · « · · 4 4

4444 4 4 4 4 4 4

4φ 44 4 4 9 444444

4444 44 4 4

4· 44 444 4444 44 44

- 7 pocházející z rostlinných virů. Zvláště se dává přednost promotoru CaMV 35S z mozaikového viru květáku (Franěk, et al., Cell, 21, 285-294, 1980). Tento promotor obsahuje různé rozeznávací sekvence pro transcripční faktory, které ve své celistvosti vedou k trvalé a konstitutivní expresi zavedeného genu (Benfey, et al., EMBO J„ 8, 2195-2202, 1989).

Expresní kazety podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat chemicky iniciovaný promotor tak, aby expresi exogenního polypeptidu do rostliny bylo možno řídit do požadovaného časového období. Takovými promotory popsanými v literatuře, které je možno mezi jinými použít, jsou například promotor PRP1 (Ward, et al., Plant Mol. Biol., 22, 361-366, 1993), promotor, který je iniciovatelný kyselinou salicylovou (WO 95/1919443), promotor, který je iniciovatelný benzensulfonamidem (EP 388186), promotor, který je iniciovatelný kyselinou abscisovou (EP 335528) nebo promotor, který je vybuditelný ethanolem nebo cyklohexanonem (WO 9321334).

Další promotory, kterým se dává přednost jsou ty, které zaručují expresi do tkání nebo orgánů rostliny, ve kterých se uplatňuje fytotoxický fungicidní účinek. Promotory, které zaručují specifickou expresi do listu si zasluhují zvláštní pozornosti. Pozornost je nutno věnovat cytosolickému promotoru FBPase brambor nebo promotoru ST-LSI brambor (Stockhaus, et al., EMBO J., 8, 2245-245, 1989).

Stabilní exprese jednořetězcových protilátek, jejichž obsah byl až do 0,67% z celkových rozpustných proteinů semen transgenických tabákových rostlin byla možná s pomocí promotoru specifického pro semena (Fiedler a Conrad, Bio/Technology, 10, 1090-1094, 1995). Jelikož je exprese možná také do vysetých semen nebo semen, která jsou ve fázi klíčení a mohou být vhodná pro účely tohoto vynálezu, jsou tyto specifické promotory pro klíčení a semena také regulačními prvky podle tohoto vynálezu. Expresní kazety podle tohoto vynálezu mohou tedy obsahovat například promotor specifický pro semena (přednostně promotor USP nebo LEB4), LEB4 signální peptid, gen, který má realizovat expresi a ER retenční signál. Stavba kazety je znázorněna jako příklad ve formě diagramu na obrázku 1 s odkazem na jednořetězcovou protilátku (scFv gen).

·· » · · ·

I · · · • · · · · ·

- 8 Expresní kazety podle tohoto vynálezu se vytvářejí fúzí vhodného promotoru s vhodným polypeptidem DNK a přednostně s DNK, která kóduje chloroplastový specifický tranzitní peptid a která je vložena mezi promotor a polypeptid DNK a polyadenylační signál za použití běžné rekombinační a klonovací technologie tak, jak byla popsána například v T. Maniatis, E.F.Fritsch a J.Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a také v T.J.Šilhavý, M.L.Berman a L.W-Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1984 a v Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and WileyInterscience, 1987.

Zvláště se dává přednost sekvencím, které umožňují cílení do apoplastu, plastidu, vakuoly, plasmatické membrány, mitochondrií, endoplasmatického retikula (ER) nebo se v nepřítomnosti vhodných operativních sekvencí usídlují v oblasti tvorby, jmenovitě v cytosolu (Kermode, Crit Rev. Plant Sci., 15, 285-423, 1996). Lokalizace v ER a buněčné stěně prokázaly, že jsou zvláště užitečné pro kvantitativní akumulaci proteinu v transgenických rostlinách (Schouten, et a!., Plant Mol. Biol., 30, 781-792, 1996; Artsaenko, et al., Plant J, 8, 745-750, 1995).

Vynález se také týká expresních kazet, jejichž zakódovaná sekvence kóduje fúzovaný protein se schopností vázat fungicid, kde část fúzovaného proteinu je tranzitním peptidem, který ovládá translokaci polypeptidů. Zvláště se dává přednost tranzitním peptidům specifickým na chloroplasty, které jsou enzymaticky štěpeny od fungicidní vazby polypeptidového zbytku poté, co byla tato fungicidní vazba polypeptidů translokována na rostlinné chloroplasty. Přednost se dává zvláště tranzitním peptidům odvozeným od plastidové transketolázy (TK) nebo funkčnímu ekvivalentu tohoto tranzitního peptidů (například tranzitní peptid malých podjednotek Rubinsco nebo ferredoxin NADP oxidoreduktazy).

Polypeptidová DNK nebo polypeptidová cDNK nutná pro tvorbu expresních kazet je podle tohoto vynálezu přednostně rozšířena pomocí reakce polymerázového řetězce (PCR). Způsob rozšíření DNK za použití PCR je znám, například od Innis, et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academie Press, 1990. Fragmenty DNK produkované PCR mohou být výhodně zkontrolovány sekvenční analýzou, aby « · · fc. · fcfc ·· ti • · · · fc·· fc · fcfc · • fcfcfc * ····· • fcfc fcfc · · fc fcfcfc··· fcfcfcfc fcfc · · • fc fcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfc fcfc

- 9 nedošlo k chybě při stavbě poiymerázy, u které má dojít k expresi.

Vloženou sekvenci nukleotidu, která kóduje polypeptid se schopností vázat fungicid, lze připravit synteticky nebo ji získat přírodní cestou, nebo může sestávat ze směsi syntetických a přírodních složek DNK. Obecně se připravuje syntetická nukleotídová sekvence s kodoňy, které rostliny preferují. Tyto kodoňy, které rostliny preferují, se mohou stanovit podle kodonů, jejichž proteiny jsou nejčastější a které pronikají do většiny druhů požadovaných rostlin. Při přípravě expresní kazety lze manipulovat s různými fragmenty DNK, a tak získat nukleotidovou sekvenci, která čte ve správném smyslu a je vybavena správným čtecím rámcem (correct reading frame). Pro správné vzájemné propojení fragmentů DNK se mohou k fragmentům přidávat adaptory a vazebné složky.

Oblasti promotoru a terminátoru podle tohoto vynálezu musejí být účelně vybaveny ve smyslu transkripce vazebnou nebo polyvazebnou jednotkou sestávající z jedné nebo více restrikčníh poloh pro vkládání této sekvence. Pravidlem je, že vazebná jednotka (linker) má 1 až 10, obvykle 1 až 8, ale nejlépe 2 až 6 restrikčních poloh (restriction sites). V regulačních oblastech má vazebná jednotka obecně rozměr méně než 100 bp, častěji méně než 60 bp, ale nejméně 5 bp. Promotor podle tohoto vynálezu může být ve vztahu k hostitelské rostlině jak přírodní nebo homologovaný, tak jiného cizího nebo heterologního původu. Expresní kazeta má podle tohoto vynálezu jakoukoliv sekvenci a oblast pro transkriptální terminaci promotoru obsahující transkripci 5’-3’-. Podle požadavků jsou různé oblasti terminace vzájemně zaměnitelné.

Dále lze využít manipulací, které vytvářejí vhodné restrikční polohy, nebo které odstraňují nadbytek DNK nebo restrikčních poloh.. Tam, kde je možná inzerce, delece nebo substituce, například přechody a transverze, lze použít mutageneze in vitro, „párování primerů“ („primerre [sic] pair“), restrikce nebo vazby. Pro případné vhodné manipulace jako je restrikce, exonukleázová digesce („chewing-back“) nebo doplňování stavby pro zatupování konců („blunt ends“), lze vybavit komplementární zakončení fragmentů vazebnými prostředky.

Rro úspěch podle tohoto vynálezu je zvláště důležité připojení specifického ER retenčního signálu SEKDEL (Schuoten, A., et al., Plant Mol. Biol., 30, 781-792, 1996), kterým se průměrná úroveň exprese ztrojnásobí až zečtyřnásobí. Při vytváření

4 4 • 444

9 99

9 9 9

4 4 4

44

9 999

9 ·· 4 4

- 10 kazety lze také použít další retenční signály, které přirozeně vznikají u proteinů rostlin či zvířat a jsou lokalizovány v ER.

Preferovanými polyadenylačními signály jsou rostlinné polyadenylační signály, zvláště ty, které esenciálně odpovídají nezbytně polyadenylačním signálům T-DNK Agrobacterium tumefaciens, zvláště genu 3 z T-DNK (octopin synthasa) Ti plazmidu pTiACH5 (Gielen, et al., EMBO J., 3, 835 a n., 1984), nebo funkčním ekvivalentům. Expresní kazety podle tohoto vynálezu mohou sestávat například z konstitučního promotoru (přednostně promotor CaMV 35 S), signálního peptidů LeB4, genu, který má realizovat expresi a retenčního signálu ER. Stavba kazety je znázorněna na diagramu v obrázku 2 s odkazem na jednořetězcovou protilátku (scFv gen). Přednostně se jako retenčního signálu ER používá aminokyselinové sekvence KDEL (lysin, kyselina aspartová, kyselina glutamová, leucin).

Fúzovaná expresní kazeta kódující polypeptid s vlastnostmi fungicidní vazby se přednostně klonuje do vektoru, například pBinl9, který je vhodný pro transformaci Agrobacterium tumefaciens. Agrobacteria, která se transformuje takovým vektorem může být potom použita známým způsobem pro transformování rostlin, zvláště užitkových rostlin, např. rostlin tabáku příkladně pomocí macerování poškozených listů nebo částí listu v roztoku Agrobakterie a jejich následným růstem ve vhodném mediu. Transformace rostlin pomocí Agrobacterie je známa, mezi jiným od F.F.White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, vyd. S.D.Kung a R.Wu, Academie Press, s. 15-38, 1993 a od S.B.Gelvin, Molecular Genetics of T.DNK Transfer from Agrobacterium to Plants, též v Transgenic Plants, s. 49-78. Transgenické rostliny mohou být regenerovány z transformovaných buněk poškozených listů nebo částí listů známým způsobem a tyto transgenické rostliny obsahují gen pro expresi polypeptidů s vlastnostmi vazby fungicidů, integrované do kazety podle tohoto vynálezu.

Jako doplněk je pro transformaci hostitelské rostliny polypeptidem se zakódovanou fungicidní vazbou DNK podle tohoto vynálezu vložena expresní kazeta jako vložka do rekombinačního vektoru, kde tento vektor DNK obsahuje přídavné signály regulace, např. sekvenci pro replikaci nebo integraci. Vhodný vektor je popsán, mezi ·· *· • · · * • · ·· • · · · • · · · ·· ·♦

- 11 jiným v „Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology“ (CRC Press), kapitola 6/7, s. 71-119, 1993.

Při používání výše uvedených rekombinací a klonovacích technologií se mohou expresní kazety podle tohoto vynálezu klonovat do vhodných vektorů, které umožňují jejich multiplikaci, například v E. coli. Vhodnými klonovaclmi vektory jsou mezi jinými pBR332, řady puC, řady M13mp a pACY184. Zvláště vhodnými jsou binární vektory, které mohou replikovat jak E. coli, tak agrobakterie, například pBin19 (Bevan, et al., Nucl. Acids Res., 12, 8711, 1980).

Vynález se dále týká používání expresních kazet podle tohoto vynálezu k transformaci rostlin, rostlinných buněk nebo rostlinných orgánů. Preferovaným záměrem používání je zprostředkování rezistence na fytotoxické aktivní fungicidy.

V závislosti na volbě promotoru se může exprese realizovat na listy, semena nebo další orgány rostlin. Takovéto transgenní rostliny, jejich propagační materiál a jejich rostlinné buňky, rostlinné tkáně nebo rostlinné orgány jsou dále předmětem předkládaného vynálezu. Převod cizích genů do genomu rostliny se nazývá transformací. V tomto postupu se využívají výše uvedené způsoby transformace a regenerace rostlin z rostlinných tkání nebo rostlinných buněk pro přechodnou nebo trvalou transformaci. Vhodnými způsoby jsou transformace protoplastu absorbcí DNK indukovanou polyethylenglykolem, biolistickým [sic] přístupem využívajícím genového děla (gene gun), elektroporatace, inkubace suchých embryí v roztoku obsahujícím DNK, mikroinjektáž a transfer genu zprostředkovaný Agrobakterií. Zmíněné postupy jsou popsány například v B.Jenes, et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Editors: S.D.Kung a R.Wu, Academie Press, 128-143, 1993, a v Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. plant Molec. Biol., 42, 205-225, 1991. Komplex, který má realizovat expresi je přednostně klonován do vektoru, který je vhodný pro transformaci Agrobacteríum tumefaciens, například pBin19 (Bevan, et al., Nucl. Acids Res., 12, 8711, 1984). Agrobacterie, která byla transformována expresní kazetou podle tohoto vynálezu může být potom použita známým způsobem k transformaci rostlin, zvláště užitkových rostlin jako jsou obilniny, kukuřice, sója, rýže, bavlna, cukrová řepa, kanola, ·♦ ·· · ·· • ·· · ··· · • · ·· · · • ♦ · · · ♦ · • · · « · · ·· ·· Φ··9999 • 9 9 9

999 999

9

9 99

- 12 slunečnice, len, brambory, tabák, rajská jablíčka, hořčice olejnatá, vojtěška, hlávkový salát a různé keře, stromy, a různé druhy ořechů, peckovic, například kávovník, ovocné stromy jako jsou jabloně, hrušně nebo třešně, ořešáky jako je vlašský ořech nebo pekanový ořech a zvláště důležitá vinná réva, například macerováním poškozených listů nebo částí listů v agrobakteriálním roztoku a následným růstem ve vhodném mediu.

Funkční ekvivalentní sekvence kódující polypeptidy s fungicidní vazbou jsou podle tohoto vynálezu ty sekvence, které mají ještě požadované funkce přesto, že jejich nukleotidová sekvence je odlišná. Funkční ekvivalenty tak obsahují přírodně se vyskytující varianty zde popsaných sekvencí a také sekvence umělých nukleotidů, například umělé nukleotidové sekvence, které byly získány chemickou syntézou a jsou adaptovány na kodonové využití pro rostliny.

Jako funkční ekvivalent se musí chápat zvláště ta přírodní nebo umělá mutace původně izolované sekvence, která kóduje polypeptid se schopností vázat fungicid vazbou, kterou mutace pokračuje, aby vykázala požadovanou funkci. Mutace zahrnují substituce, addice, delece, výměnu nebo inzerci jednoho nebo více nukleotidových zbytků. Předkládaný vynález také zahrnuje ty nukleotidové sekvence, které se získají modifikováním nukleotidové sekvence. Účelem takové modifikace může být například další vymezení kódové sekvence v ní obsažené, nebo jiné, například inzerce přesnějších poloh pro restrikční enzymy.

Dalšími funkčními ekvivalenty jsou ty varianty, jejichž funkce je více nebo méně definitivní ve srovnání s výchozím genem nebo genovým fragmentem.

Umělé sekvence DNK jsou dále vhodné pokud fungicidu sdělují požadovanou toleranci k zabránění fytotoxického účinku na užitkové rostliny tak, jak to je výše popsáno. Takové umělé sekvence DNK lze identifikovat například zpětnou translací proteinů, které mají aktivitu fungicidní vazby a které byly vytvořeny molekulárním modelováním nebo selekcí in vitro. Zvláště vhodné jsou sekvence kódující DNK, které byly získány zpětnou translací polypeptidových sekvencí v souvislosti s využitím kodonu specifického pro hostitelskou rostlinu. Specifické využívání kodonu může být odborníkem na metody rostlinné genetiky ihned stanoveno počítačovým

44

4 44

4 4 4

4 4 4

44

444 444

4

44

- 13 zpracováním jiného známého genu rostliny, která se má transformovat.

Dalšími vhodnými ekvivalentními sekvencemi nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, které musí být zmíněny jsou sekvence, které kódují fúzi proteinů, kde část fúzovaného proteinu nerostlinného polypeptidů váže fungicid nebo jeho funkční ekvivalentní část. Druhá část fúzovaného proteinu může být například dalším polypeptidem s enzymatickou aktivitou, nebo antigenní polypeptidová sekvence s jejíž pomocí je možná detekce exprese scFvs (například myc-tag nebo his-tag). Přesto se dává přednost běžné proteinové sekvenci, například signálnímu nebo tranzitnímu peptidu, který řídí vlastnosti polypeptidů vázat fungicid na požadované místo jeho působení.

Tento vynález však také týká expresních produktů vytvářených podle tohoto vynálezu a fuze proteinů tranzitních peptidů a polypeptidů se schopností vázat fungicid.

Rezistence a tolerance pro účely tohoto vynálezu představuje uměle zajištěnou schopnost rostliny odolávat fungicidům s fytotoxickými účinky. Využívá částečné a zvláště úplné necitlivosti k inhibitorům po dobu nejméně jedné generace rostiny. Místem fytotoxického působení fungicidu je obecně listová tkáň, takže specifická exprese polypeptidů se schopností vázat fungicid je schopná působit dostatečnou ochranu listů. Tím je však nutno současně rozumět, že fytotoxický účinek fungicidů nemusí být omezen pouze na tkáň listu, ale může působit na všechny zbývající orgány rostliny specifickým způsobem pro příslušnou tkáň.

Konstitutivní exprese exogenních polypeptidů s fungicidní vazbou je navíc výhodná. Na druhé straně je žádoucí i stimulační exprese.

Účinnost transgenně realizované exprese polypeptidů se schopností vázat fungicidy lze stanovit například in vitro propagací naočkovaného pletiva v mediu obsahujícím fungicid s odstupňovanými koncentracemi nebo pomocí zkoušek klíčivosti. Tolerance zkoušené rostliny k fungicidu, která byla pozměněna s ohledem na typ a stupeň změny, lze zkoušet ve skleníkových pokusech.

• φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ • ····

- 14 Vynález se dále týká transgenických rostlin transformovaných expresními kazetami podle tohoto vynálezu a transgenických buněk, tkání, orgánů a propagačního materiálu takovýcho rostlin. Přednost se dává zvláště transgenickým užitkovým rostlinám, například obilninám, kukuřici, sóje, rýži, bavlně, cukrové řepě, kanole, slunečnici, Inu, bramborám, tabáku, rajským jablíčkům, hořčici olejně, vojtěšce, hlávkovému salátu a různým keřům, stromům, a různým druhům ořechů a peckovic, například kávovníku, ovocným stromům jako jsou jabloně, hrušně nebo třešně, ořešákům jako je vlašský ořech nebo pekanový ořech a zvláště důležité vinné révě. Na transgenické rostliny, rostlinné buňky, rostlinné tkáně nebo rostlinné orgány lze působit fungicidy s fytotoxickým účinkem inhibujícím rostlinné enzymy; rostliny, rostlinné buňky, rostlinné tkáně nebo rostlinné orgány, které nebyly úspěšně transformovány odumírají nebo jsou poškozeny. Příklady vhodných účinných složek jsou strobiluriny, zvláště methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BASF 490F) a metabolity a funkční deriváty těchto sloučenin. DNK, která kóduje polypeptidy s vlastnostmi fungicidní vazby a která byla vložena do expresních kazet podle tohoto vynálezu může být použita jako selekční markér.

Předkládaný vynález má výhodu zvláště pro ty užitkové rostliny, na které, pokud už jednou získaly rezistenci k fungicidům s fytotoxickým účinkem, je možno tyto fungicidy použít k regulaci škodlivých hub i ve větším aplikovaném množství; toto větší množství by totiž jinak vedlo ke zničení rostlin. Sloučeniny ze skupiny dále uváděné lze považovat za příkllady takových fungicidů s fytotoxickým účinkem, avšak jejich výčet nikterak neomezuje tento vynález:

síra, dithiokarbamáty a jejich deriváty jako je dimethyldithiokarbaminan železitý, dimethyldithiokarbaminan zinečnatý, ethylenbisdithiokarbaminan zinečnatý, ethylenbisdithiokarbaminan manganatý, ethylendiaminbisdithiokarbaminan manganato-zinečnatý, tetramethylthiuramdisulfidy [sic], amonný komplex (Ν, Nethylenbisdithiokarbaminanu) zinečnatého, amonný komplex (Ν, N’propylenbisdithiokarbaminanu) zinečnatého, Ν, Ν’- propylenbisdithiokarbaminan zinečnatý, Ν, Ν’- polypropylenbis(thiokarbamoyl)disulfid, nitroderiváty jako je dinitro(1-methylheptyl)fenylkrotonát, 2-sec-butyl-4,6-dinitrofenyl-3,3dimethylakrylát, 2-sec-butyl-4,6-dinitrofenyl-isopropylkarbonát, diisopropyl-5nitroisoftalát, • to ·· toto • toto to · · · to · · • ·· to • · toto • to toto • to· · • toto to • toto · · · • · ·· ··

- 15 heterocyklické látky jako je 2-heptadecyl-2-imidazolinacetát, 2,4-dichlor-6-(och loran il in)-s-triazin, 0,0-diethylftalimidofosfoniumthioát, 5-amino-1 [bis(dimethylamino)fosfinyl]-3-fenyl-1,2,4-triazol, 2,3-dikyano-1,4-dithioantrachinon, 2-th io-1,3-d ithiol[4,5-b]chinoxalin, methyl-1 -(butylkarbamoyl)-2benzimidazolkarbamát, 2-methoxykarbonylaminobenzimidazol,

2-(2-furyl)benzimidazol, 2-(4-thiazolyl)benzimidazol, N-(1,1,2,2tetrachlorethylthio)tetrahydroftalimid, N-trichlormethylthiotetrahydroftalimid, N-trichlormethylthioftalimid,

N-dichlorfluormethylthío-N\N’-dimethyl-N-fenylsulfodiamid,

5-ethoxy-3-trichlormethyl-1,2,3-thiadiazol, 2-thiokyanatomethylthiobenzothiazol,

1.4- dichlor-2,5-dimethoxybenzen,

4-(2-chlorfenylhydrazon)-3-methyl-5-isoxazolon, pyridin-2-thio [sic] 1 -oxid, 8-hydroxychinolin nebo jeho měďnatá sůl, 2,3-dihydro-5-karboxanilido-6-methyl1.4- oxathiin, 2,3-dihydro-5-karboxanilido-6-methyl-1,4-oxathiin-4,4-dioxyd, 2-methyl-5,6-dihydro-4H-pyran-3-karboxanilid,

2-methylfuran-3-karboxanilid; 2,5-dimethylfuran-3-karboxanilid; 2,4,5-trimethylfuran-3-karboxanilid, N-cyklohexyl-2,5-dimethylfuran-3-karboxamid, N-cyklohexyl-N-methoxy-2,5-dimethylfuran-3-karboxamid,

2-methylbenzanilid, 2-jodobenzanilid, N-formyl-N-morfolin-2,2,2-trichlorethylacetal, piperazin-1,4-diylbis-1-(2,2,2-trichlorethyl)formamid,

-(3,4-d ich loran i I in)-1 -formylamino-2,2,2-trichlorethan;

aminy jako je 2,6-dimethyl-N-tridecylmorfolin nebo jeho sole,

2,6-dimethyl-N-cyklododecylmorfolin nebo jeho sole,

N-[3-(p-terc-butylfenyl)-2-methylpropyl]-cis-2,6-dimethylmorfolin,

N-[3-(p-terc-butylfenyl)-2-methylpropyl]-piperidin, (8-(1,1-dimethylethyl)-N-ethyl-N-propyl-1,4-dioxaspiro[4,5]dekan-2-methanamin, azoly jako je 1 -[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-ethyl-1,3-dioxolan-2-ylethyl]-1 H-1,2,4-triazol,

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-n-propyl-1,3-d ioxo lan-2-y lethy l]-1 H-1,2,4-triazol, N-(n-propyl)-N-(2,4,6-trichlorfenoxyethyl)-N’-imidazolylurea,

-(4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-1 -(1 H-1,2,4-triazo 1-1 -yl)-2-butanon,

-(4-chlorfenoxy)-3,3-dimethyl-1 -(1 H-1,2,4-triazol-1 -yl)-2-butanol, (2RS,3RS)-1 -[3-(2-chlorfenyl)-2-(4-fluorfenyl)-oxiran-2-ylmethyl]1 H-1,2,4-triazol, φφ ·· • φ · φ • φφφ • φ φ φ · φ » φ φ φφ φ φ φ φ* ·· φ φ φ φ φ * · φ φ • ΦΦ φφφφ • Φ ·· • φ · φ φ φ φ φ •ΦΦ φφφ φ φ • φ φφ

- 16 1 -[2-(2,4-d ich lorf eny l)-penty l]-1 H-1,2,4-triazol, 2,4’-difluor-a-(1 H-1,2,4-triazo lyl-1 methyl)-benzhydryl alkohol,

-((bis(4-fluorfenyl)methylsilyl)methyl)-1 H-1,2,4-triazol, 1 -[(2RS, 4RS;2RS,4SR)-4brom-2-(2,4-dichlorfenyl)tetrahydrofuryl]-1 H-1,2,4-triazol, 2-(4-chlorfenyl)-3cyklopropyl-1 -(1 H-1,2,4-triazol-1 -yl)-butan-2-ol, (+)-4-chlor-4-[4-methyl-2-(1 H-1,2,4triazol-1 -ylmethyl)-1,3-dioxolan-2-yl]fenyl-4-chlorfenyl ether, (E)-(R,S)-1 -(2,4dichlorfenyl)-4,4-dimethyl-2-(1 H-1,2,4-triazol-1 -yl)-pent-1 -en-3-ol, 4-(4-chlorfenyl)2-fenyl-2-(1 H-1,2,4-triazolylmethyl)-butyronitril, 3-(2,4-dichlorfenyl)-6-fluor-2-(1 H1,2,4-triazo 1-1 -yl)chinazolin-4(3H)-on, (R,S)-2-(dichlorfenyl)-1 H-1,2,4-triazo 1-1 -yl)hexan-2-ol, (1RS,5RS;1RS,5SR)-5-(4-chlorbenzyl)-2,2-dimethyl-1-(1H-1,2,4-triazol1 -ylmethyl)-cyklopentanol, (R,S)-1 -(4-chlorfenyl)-4,4-dimethyl-3-(1 H-1,2,4-triazol-1 ylmethyl)-pentan-3-ol, (+)-2-(2,4-dichlorfenyl)-3-(1 H-1,2,4-triazolyl)-propyl-1,1,2,2tetrafluorethyl ether, (E)-1 -[1 -(4-chlor-2-trifluormethyl)fenyl]imino]-2-propoxyethyl]1H-imidazol, 2-(4-chlorfenyl)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-hexan nitril, a-(2chlorfenyl) -a-(4-chlorfenyl)-5-pyrimidinmethanol, 5-butyl-2-dimethylamino-4hydroxy-6-methylpyrimidin, bis(p-chlorfenyl)3-pyridinmethanol, 1,2-bis(3ethoxykarbonyl-2-thioureido)-benzen, 1,2-bis(3-methoxykarbonyl-2-thioureido)benzen, strobiluriny jako je methyl-E-methoxyimino-[a-(o-tolyloxy)-o-tolyl] acetát, methyl-E2- {2-[6-(2-kyanofenoxy)pyrimidin-4-yloxy]fenyl}-3-methoxyakrylát, methyl-Emethoxyimino-[a-(2-fenoxyfenyl)]acetamid, methyl-E-methoxyimino-[a-(2,5dimethylfenoxy)-o-tolyl] acetamid, anilinpyrimidiny jako je N-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) anilin,

N-[4-methyl-6-(1 -propynyl)-pyrimidin-2-yl] anilin,

N-[4-methyl-6-cyklopropylpyrimidin-2-yl-]anilin, penylpyrroly jako je 4-(2,2-difluor-1,3-benzodioxol-4-yl)-pyrrol-3-karbonitril, cinnamamidy jako je 3-(4-chlorfenyl)-3-(3,4-dimethoxyfenyl)-akryloylmorfolin, a různé fungicidy jako je dodecylguanidin acetát,

3- [3-(3,5-dimethyl-2-oxycyklohexyl)-2-hydroxyethyl]-glutarimid, Ν-methyl-, N-ethyl(4-trifluormethyl-2-[3’,4’-dimethoxyfenyl]-benzamid [sic], hexachlorbenzen, methylN-(2,6-dimethylfenyl)-N-(2-furoyl)-DL-alaninát, methylester DL-N-(2,6dimethylfenyl)N-(2’-methoxyacetyl) alaninu, • · ·· ·· « · · · ··· ··· · · • · · · * · ·

- ¹⁷ N-(2,6-dímethylfenyl)-N-chloracetyl-D,L-2-aminobutyrolakton, methylester DL-N(2,6-dimethylfenyl)-N-(fenylacetyl) -alaninu, 5-methyl-5-vinyl-3-(3,5-dichlorfenyl)2,4-dioxo-1,3-oxazolidin, 3-[3,5-dichlorfenyl-(5-methyl-5-methoxymethyl]-1,3oxazolidin-2,4-dion [sic], 3-(3,5-dichlorfenyl)-1-isopropylkarbamoylhydantoin, N(3,5-dichlorfenyl)-1,2-dimethylcyklopropan-1,2-dikarboximid, 2-kyano-[N(ethylaminokarbonyl)-2-methoxyimino] acetamid, N-(chlor-2,6-dinitro-4trifluormethylfenyl)-5-trifluormethyl-3-chlor-2-aminopyridin.

Funkčně ekvivalentní deriváty těchto fungicidů v kombinaci s méně, stejně nebo více zřetelnou fytotoxickou aktivitou mají porovnatelné spektrum účinků proti fytopatoganním houbám jako látky, které byly specificky vyjmenovány.

Vynález bude nyní ilustrován dále uvedenými příklady, které však rozsah vynálezu nikterak neomezují:

Příklady provedení Obecné klonovací metody

Klonovací kroky provedené v rozsahu předkládaného vynálezu, například restrikce štěpení, elektroforesa na agarovém gelu, čištění fragmentů DNK, transfer nukleových kyselin na nitrocelulozové a nylonové membrány, vazba fragmentů DNK, transformace buněk E. colli, kultivace bakterií, multiplikace fágů a sekvenční analýza rekombinantů DNK byly provedeny podle popisu publikace Sambrook, et al., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6.

Bakteriální kmeny zde dále použité (E. colli, XL-I Blue) byly získány od Stratagenu. Agrobakteriální kmeny použité pro transformaci rostlin (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 s plazmidem pGV2260 nebo pGV3850kan) byly popsány v publikaci Deblaere, et al., Nucl. Acids Res., 13, 4777, 1985. Alternativně mohou být použity agrobakteriální kmeny LBA4404 (Clontech) nebo další vhodné kmeny. Pro klonovací účely byly použity vektory pUC19 (Yanish-Perron, Gene, 33, 103-119, 1985) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitrogen), pBin19 (Bevan, et al., Nucl. Acids Res., 12, 8711-8720, 1984) a pBinAR (Hófgen a Willmitzer, Plant Science, 66, 221-230, 1990).

- 18 Sekvenční analýza rekombinantů DNK

Řazení molekul rekombinantů DNK bylo sledováno pomocí laserového fluorescenčního sekvenčního přístroje pro DNK od Pharmacia s použitím metody

Sangera (Sanger, et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977).

Vytváření rostlinných expresních kazet

Promotor 35S CaMV byl inzertován do plazmidu pBin19 (Bevan, et al., Nuci. Acids Res., 12, 8711, 1984) ve formě fragmentu EcoRI-Kpnl (odpovídající nukleotidům 6909-7437 květákového mozaikového viru - Franck, et al., Cell, 21, 285, 1980). Polyadenylační signál genu 3 kyseliny T-DNK Ti plasmidu pTiACH5 (Gielen, et al., EMBO J., 3, 835, 1984) nukleotidu 11749-11939 byl izolován ve formě fragmentu Pvull-Hindlll a po přidání vazebného Sphl klonováno ve štěpné poloze PvuII mezi štěpnou polohou Sphl-Hindlll vektoru. Tím se získal plazmid pBinAR (pBinAR (Hófgen a Willmitzer, Plant Science, 66, 221-230,1990).

Praktické příklady

Příklad 1

Jelikož fungicidy nejsou imunogenní, musejí být vázány na nosič, například KLH. Pokud molekula obsahuje reaktivní skupinu, může být vazba provedena přímo; pokud ne, musí se při syntéze fungicidu nebo výběru reaktivního prekurzoru během syntézy vložit funkční skupina, aby tyto molekuly vázala na molekulu nosiče jednoduchým reakčním mechanizmem. Příklady vazebných reakcí lze nalézt v publikaci Miroslavic Ferencik v „Handbook of Immunochemistry“, Chapman & Halí., 1993, v kapitole Antigens, s. 20-49.

Opakované injikování této modifikované molekuly nosiče (antigenu) se používá při imunizaci například myší Balb/c. Jakmile je zkouškou ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) detekovatelně dostatečné množství protilátek s vazbou na antigen, odstraní se slezinové buňky těchto zvířat a fúzují se s myelomatickými buňkami v takovém pořadí, aby se vykultivovaly hybridy. Ve zkoušce ELISA se navíc použije jako antigen „fungicidem modifikovaná BSA“, aby se diferencovala imunitní odpověď na hapten od odpovědi na KLH.

• · φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ • ΦΦΦ φ · • · · · · · · • · · · · • φ · · φ · φφφφ · · • Φ φ · ΦΦΦΦ·

- 19 Monoklonální látky se připraví podobnými známými způsoby, například podle popisu v „Practical Immunology“, Leslie Hudson a Frank Hay, Blackwell Scientific Publications, 1989 nebo podle popisu v „Monoclonal Antibodies: Pronciples and Practice“, James Goding, Academie Press, lne., 1983, nebo v publikaci „A practical guide to monoclonal antibodies“, J. Liddell a A. Cryer, John Willey & Sons, 1991; nebo v publikaci Achim Móller a Franz Emling „Monoclonale Antikórper gegen TNF und deren Verwendung“ [Monoklonální protilátky proti TNF a jejich použití]. Evropský patent EP-A260610.

Příklad 2

Počátečním bodem zkoumání byla monoklonální protilátka se specifickým zaměřením na fungicid BAS 490F, která měla navíc vysokou vazebnou affinitu. Vybraná linie buněk hybridomu je charakteristická tím, že vylučované monoklonální protilátky proti fungicidnímu antigenů BAS 490F mají vysokou affinitu a přístupné specifické sekvence imunoglobulinů (Berek, C., et al., Nátuře, 316, 412-418, 1985). Tyto monoklonální protilátky proti BAS 490F byly výchozím bodem pro stavbu jednořetězcového fragmentu protilátky (scFv-antiBAS 490F).

Nejprve byly z mRNK izolovány buňky hybridomů a transkribovány na cDNK. Tato cDNK působila jako šablona pro amplifikaci proměnných imunoglobulinových genů VH a VK se specifickými primery VH1 BACK a VH FOR-2 pro vysokomolekulární řetězce a VK2 BACK a MJK5 FON X pro nízkomolekulární řetězce (Clakson, et al., Nátuře, 352, 624-628, 1991). Výchozím bodem pro výstavbu jednořetězcového fragmentu protilátky (scFv-antiBAS 490F) byly různé izolované imunoglobuliny. Následnou fúzí PCR, tří složek HV, VK a vazebného fragmentu byly tyto složky reakcí PCR spojeny a scFv-antiBAS 490F amplifikován (obrázek 3).

Funkční charakterizace (aktivita antigenové vazby) stavby scFv-antiBas 490F genu byla provedena po expresi do bakteriálního systému. Až potud byl scFv-antiBAS 490F syntetizován v E. colli jako rozpustný fragment protilátky za použití metody podle Hoogenboom, H.R., et al., Nucleic Acids Research, 19, 4133-4137, 1991. Aktivita a specificita vytvořeného fragmentu protilátky byla kontrolována zkouškou ELISA (obrázek 4).

K umožnění exprese fragmentu protilátky specifické na semena tabáku, byl • · · • · ·· • · · · · • · · · • · · »

- 20 gen scFv-antiBAS 490F sestupně klonován z promotoru LeB4. Promotor LeB4 izolovaný z Vicia faba ukazuje u tabáku přísně specifickou expresi různých cizích genů na semena (Báumlein, H., et al., Mol. Gen. Genet., 225, 121-128, 1991). Transport polypeptidu scFv-antiBAS 490F do endoplasmatického retikula vyúsťuje ve stabilní akumulaci velkých množství fragmentů protilátky. Až potud byl gen scFvantiBAS 490F fúzován se sekvencí signálního peptidu, která zaručovala vstup do endoplazmatického retilula a s retenčním ER signálem SEKDEL, který zaručoval to, že polypeptid zůstane v ER (Wandelt, et al., 1992) (obr.5).

Vytvořené expresní kazety byly klonovány do binárního vektoru pGSGLUC 1 (Saito, et al., 1990) a převedeny do kmene agrobakterium EHA 101elektroporatací. Rekombinované agrobakteriální klony byly použity pro následnou transformaci Nicotiana tabacum. Přestavbou bylo regenerováno 70-140 tabákových rostlin. Z regenerovaných tabákových rostlin byla v různých fázích vývoje po opylení sklízena semena. Po extrakci rozpouštěním ve vodném pufrovaném roztoku byly z těchto semen získány rozpustné proteiny. Analýza transgenických rostlin ukazuje, že fúze genu scFv-antiBAS 490F na ER retenční signál SEKDEL sekvence DNK umožnila akumulaci maximálně 1,9% proteinu scFv-antiBAS 490F v dozrálém semenu.

Velikost vytvořeného genu scFv-antiBAS 490F byla asi 735 bp. Proměnné domény byly vzájemně fúzovány do sekvence VH-L-VL.

Specifická selektivita byla stanovena z extraktů vyzrálých tabákových semen přímou zkouškou ELISA. Získané hodnoty jasně ukazují, že proteinové extrakty obsahují funkčně aktivní fragmenty protilátek.

Příklad 3

Exprese specifická na semena a koncentrace jednořetězcových fragmentů protilátek v endoplasmatickém retikulu buněk transgenických tabákových semen řízená promotorem USP.

Počátečním bodem výzkumu byl jednořetězcový fragment protilátky proti fungicidu BAS 490F (scFv-antiBAS 490F). Funkční charakterizace (antigenová vazební aktivita) tohoto vytvořeného genu scFv-antiBAS 490F byla provedena po expresi na bakteriální systém a následné expresi na listy tabáku. Aktivita a specifícita • 4 • · • 4 #4 4 4 4 4 · 4 4 4 • * · * <

4 44 ' ²¹ vytvořených fragmentů protilátek byla kontrolována zkouškou ELISA.

Pro umožnění exprese fragmentů protilátek specifické pro semena, byl gen scFvantiBAS 490F klonován sestupně z promotoru USP. USP promotor, který byl izolován z Vicia faba vykazuje přísně specifickou expresi různých cizích genů na semena tabáku (Fiedler, H., et al., Plant Mol. Biol., 22,669-679, 1993). Transport polypeptidu scFv-antiBAS 490F do endoplasmatického retikula vyústí ve stabilní akumulaci velkého počtu fragmentů protilátek. Až dosud byly geny scFv-antiBAS 490F fúzovány se signální sekvencí polypeptidu, která zaručovala vstup do endoplasmatického retilula a s retenčním signálem SEKDEL, který zaručoval, že polypeptid zůstane v ER (Wandelt, et al., 1992) (obr.1).

Vytvořená expresní kazeta byla klonována do binárního vektoru pGSLUC 1 (Saito, et al., 1990) a převedena do kmene Agrobacterium EHA 101 elektroporací. Rekombinant agrobakteriálních kmenů byl použit pro následnou transformaci Nicotiana tabacum. Po samoopylení byla semena transgenních tabákových rostlin v různých fázích zralosti sklizena. Z těchto semen byly po extrakci z vodného pufrovaného systému získány rozpustné proteiny. Analýza transgenních rostlin ukazuje, že fúze genů scFv-antiBAS 490F do sekvence DNK ER retenčního signálu SEKDEL řízená promotorem USP vytvořila fragmenty jednořetězcových protilátek s vazebnou affinitou k BAS 490F, již desátý den po počátku vývoje semena.

Příklad 4

K dosažení všude se vyskytující exprese fragmentu protilátky v rostlině, zvláště v listech, byl sestupně klonován gen scFv-antiBAS 490F promotoru CaMV 35 S. Tento silný konstitutivní promotor sdělí expresi cizího genu do všech virtuálních rostlinných tkání (Benfey a Chua, Science, 250, 956-966, 1990). Transport proteinu scFvantiBAS 490F do endoplasmatického retikula umožní stabilní akumulaci velkého počtu fragmentů protilátky do hmoty listů. Gen scFv-antiBAS 490F byl nejprve fúzován do sekvence signálního peptidu, která zajistí vstup do endoplasmatického retikula a do retenčního ER signálu KDEL, což umožní, aby produkt zůstal v ER (Wandelt, et al., Plant J., 2, 181-192, 1992). Vytvořená expresní kazeta byla klonována do binárního vektoru pGSGLUC 1 (Saito, et al., Plant Cell Rep., 8, 718-

- 22 721, 1990) a převedena do kmene EHA 101 Agrobacteria elektroporaci. Pro následnou transformaci Nicotiana tabacum byly použity klony agrobakteriálních rekombinantů. Bylo regenerováno okolo 100 tabákových rostlin. Z regenerovaných transgenických rostlin byla odstraněna listová hmota v různých stadiích vývoje. Z této listové hmoty byly získány rozpustné proteiny extrakcí z vodného pufrovaného roztoku. Následné analýzy (speciální analýza [western blot analysis] a zkouška ELISA) ukázaly, že v listech došlo k maximální akumulaci více než 2% biologicky aktivního polypeptidu vážícího antigen scFv-antiBAS 490F. Vysoké expresní hodnoty byly stanoveny u plně rozvinutých zelených listů, avšak fragmenty protilátky byly detekovány i ve hmotě stárnoucích listů.

Příklad 5

Amplifikace PCR fragmentu cDNK kódujícího jednořetězcové protilátky proti BAS 490F za přispění syntetických oligonukleotidů.

Amplifikace PCR fragmentu cDNK kódujícího jednořetězcové protilátky byla prováděna v tepelném cyklovacím zařízení pro DNK od firmy Perkin Elmer.

Reakční směs obsahovala 8 ng.pl'¹ jednořetězcové šablony cDNK, 0,5 μΜ odpovídajících oligonukleotidů, 200 μΜ nuklotidů (Pharmacia), 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3 při 25°C, 1,5 mM MgCI₂) a 0,02 U. μΓ¹ Taq polymerázy (Perkin Elmer). Amplifikační podmínky byly stanoveny takto:

Anelační teplota: 45°C

Denaturační teplota: 94°C

Elongační teplota: 72°C

Počet cyklů: 40

Výsledkem je fragment s přibližně 735 páry bází, které byly navázány do vektoru pBluescript. Pro transformaci E. colli XL-I Blue byla použita ligační směs a byl amplifikován plasmid. Co se týká použití a optimalizace reakce polymerázového řetězce, viz Innis, et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academie Press, 1990.

Příklad 6

Produkce transgenních tabákových rostlin, které přenášejí kódovací informaci cDNK jednořetězcové protilátky se schopností vázat fungicidy.

44 » 4 4

4 4 4

444 444

4

4 4 4 • · • · 4 4 • 4 4 · • 4 4 4 • 4 4 4

4 4 4

4 4 4

- 23 Plasmid pGV2260 1 byl transformován do Agrobacterium tumefaciens

C58C1:pGV2260. K transformaci tabákových rostlin (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) bylo použito kultivace pozitivně transformovaných agrobakteriálních kolonií v Murashige-Skoogově mediu (Physiol. Plant, 15, 473 an., 1962) obsahujícím 2% sacharózy (medium 2MS) v koncentraci 1:50 přes noc. Na Petriho misce byly inkubovány plátky listů sterilní rostliny (každý o rozměru cca 1 cm²) po dobu 5-10 minut v agrobakteriálním mediu o ředění 1:50. Po tom následovala dvoudenní inkubace v temnu při 25°C na mediu obsahujícím 0,8% Bacto-Agaru. V kultivaci se po těchto 2 dnech pokračovalo v cyklech 16 hodin světlo, 8 hodin tma, a dále v týdenních cyklech na mediu obsahujícím 500 mg.l'¹ Claforanu (cefotaximát sodný), 50 mg.l·¹ kanamycinu, 1 mg.l'¹ benzylaminopurinu (BAP), 0,2 mg.l'¹ kyseliny naftyloctové a 1,6 g.l'¹ glukózy. Vyrostlá očka byla přenesena na medium MS obsahující 2% sacharózy, 250 mg.l'¹ Claforanu a 0,8% Bacto-Agaru.

Příklad 7

Stabilní akumulace fragmentu jednořetězcové protilátky proti fungicidu BAS 490F v endoplasmatickém retikulu.

Počátečním bodem zkoumání byl fragment jednořetězcové protilátky proti fungicidu BAS 490F (scFv-antiBAS 490F), jehož informace byla realizována na tabákové rostliny. Množství a kvalita syntetizovaného polypeptidů scFv-antiBAS 490F byla stanovena speciální analýzou (western blot analysis) a zkouškou ELI SA.

K umožnění exprese genu scFv-antiBAS 490F do endoplasmatického retikula byla exprese cizích genů realizována za řízení promotorem CaMV 53S jako translační fuze se signálním peptidem LeB4 (N-terminál) a ER retenčním signálem KDEL (Cterminál). Transport polypeptidů scFv-antiBAS 490F do endoplasmatického retikula umožnila stabilní akumulace velkého množství fragmentů aktivních protilátek. Po odebrání listové hmoty byly její části zmrazený na -20°C (1), lyofilizovány (2) nebo sušeny při laboratorní teplotě (3). Z listové hmoty byly získány dotyčné rozpustné proteiny extrakcí z vodného pufru a polypeptid scFv-antiBAS 490F přečištěn affinitní chromatografii. Ke stanovení aktivity fragmentu protilátky byla použita stejná množství přečištěného polypeptidů scFv-antiBAS 490F (zmrazeného, lyofilizovaného a sušeného) (obr. 6). Obr. 6A znázorňuje aktivitu antigenní vazby polypeptidů • ft « * • · · · · · * · · · · • · ··· ··· • · · ···· ftft ft*

- 24 scFv-antiBAS 490F přečištěného z čerstvých (1), lyofilizovaných (2) a sušených (3) listů. Na obrázku 6B jsou znázorněna odpovídající množství proteinu scFv-antiBAS 490F (přibližně 100 ng), jaká byla použita pro zkoušku ELISA, stanovená speciální analýzou (Western blot). Na levé straně jsou vyznačeny standardní molátní hmotnosti proteinů. Byly zjištěny přibližně identické vazebné aktivity antigenu.

Příklad 8

Pro demonstraci tolerance tabákových rostlin k fungicidům způsobenou polypeptidy se schopností vázat fungicidy, bylo na tyto tabákové rostliny působeno různým množstvím BAS 490F. Ve všech případech bylo ve skleníku možno demonstrovat, že v porovnání se slepým pokusem vykázaly rostliny s realizovanou informací genu scFv-antiBAS 490F vyšší toleranci k fungicidu BAS 490F a menší fytotoxický efekt.

Claims (20)

1. Upravené- Patentové nároky

   1. Postup produkce rostlin tolerantních k methylmethoxyimino--a-(o-tolyloxy)-otolylacetátu (BAS 490F) expresí exogenního peptidu schopného v rostlině vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F)
2. 2. Postup podle nároku 1 vyznačující se tím, že exogenním polypeptidem schopným v rostlině vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) je fragment jednořetězcové protilátky.
3. 3. Postup podle nároku 1 vyznačující se tím, že exogenním polypeptidem se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) je úplná protilátka nebo fragment od ní odvozený.
4. 4. Expresní kazeta pro rostliny skládající se z promotoru, signálního peptidu, genu kódujícího expresi, exogenního polypeptidu se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F), retenčního signálu ER a terminátoru.
5. 5. Expresní kazeta podle nároku 4 vyznačující se tím, že použitým konstitutivním promotorem je promotor CaMV 35S.
6. 6. Expresní kazeta podle nároku 4 vyznačující se tím, že genem, kterého se realizace exprese týká, je gen fragmentu jednořetězcové protilátky.
7. 7. Expresní kazeta podle nároku 4 vyznačující se tím, že genem nebo fragmentem genu, který se pro expresi genu má použít je polypeptid se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) ve formě translační fúze s dalšími funkčními proteiny, například enzymy, toxiny, chromofory a vazebnými proteiny.
8. 8. Expresní kazeta podle nátoku 4 vyznačující se tím, že polypeptidový gen, který má realizovat expresi, se získává z hybridomových buněk nebo s pomocí dalších rekombinačních metod, například metodou fágového displeje protilátky.

   frfr frfr frfr • · frfrfr· fr · · · · • · frfrfr frfrfr • frfr • ···· frfr frfr

   I ·· • · • ·· • fr • · · • frfr

   - 26
9. 9. Použití expresní kazety podle nároku 4 pro transformaci jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, které konstitutivně realizují expresi exogenního polypeptidů se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) specificky semeny nebo listy.
10. 10. Použití podle nároku 9 vyznačující se tím, že se expresní kazeta přenáší do bakteriálního kmene a výsledné rekombinované klony se použijí pro transformaci jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, které konstitutivně realizují expresi exogenního polypeptidů se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)o-tolylacetát (BAS 490F) specificky semeny nebo listy.
11. 11. Použití expresní kazety podle nároku 4 jako selekčního markéru.
12. 12. Použití transformované rostliny získané podle nároku 10 k produkci polypeptidů se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F).
13. 13. Postup pro transformaci rostliny introdukcí genové sekvence, která kóduje polypeptid se schopností vázat vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) do rostlinné buňky, do závalové tkáně, do celé rostliny a protoplastů buněk rostliny.
14. 14. Postup podle nároku 13 vyznačující se tím, že transformace probíhá s pomocí agrobakterie, zvláště druhu Agrobacterium tumefaciens.
15. 15. Postup podle nároku 13 vyznačující se tím, že transformace probíhá s pomocí elektroporace.
16. 16. Postup podle nároku 13 vyznačující se tím, že transformace probíhá s pomocí metody bombardování částicemi.
17. 17. Produkce polypeptidů se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetát (BAS 490F) expresí genu, který takový polypeptid zakóduje v rostlině nebo buňkách rostliny a následnou izolací polypeptidů.

    • te ·· • · · · • · ·· • · te · • « · te

    - 27
18. 18. Rostlina obsahující expresní kazetu podle nároku 4 vyznačující se tím, že expresní kazeta propůjčuje toleranci k methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-otolylacetátu (BAS 490F).
19. 19. Způsob regulace fytopatogenních hub v transgenických užitkových rostlinách tolerantních k methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetátu (BAS 490F), který sestává z použití methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetátu (BAS 490F) proti kterému užitková rostlina vytváří poíypeptidy nebo protilátky se schopností vázat methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F).
20. 20. Polypeptid nebo protilátka se schopností vázat methylmethoxyimino--a-(otolyloxy)-o-tolylacetát (BAS 490F) s vysokou vazebnou affinitou k methylmethoxyimino-a-(o-tolyloxy)-o-tolylacetátu (BAS 490F), který je produkovaný podle popisu v nároku 17.