JP2000503541A - アントラニル酸シンターゼ遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は植物に対するトリプトファンのアミノ酸類似体に耐性を付与するおよび／または植物のトリプトファン含有量を該植物の細胞中のアントラニル酸シンターゼをコードする単離したＤＮＡセグメントを導入及び発現させることによって変化させる方法である。アントラニル酸シンターゼをコードする単離されたＤＮＡセグメントで形質転換したトランスジェニック植物ならびに、それらの植物の種子および子孫もまた提供された。本発明はまた、トウモロコシアントラニル酸シンターゼのβサブユニットのｃＤＮＡ配列をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 アントラニル酸シンターゼ遺伝子およびその使用 発明の背景 アントラニル酸シンターゼ（ＡＳ）は、植物、菌類および細菌類において、芳 香族アミノ酸経路からトリプトファンの生合成まで分岐する最初の反応を触媒す る。アントラニル酸シンターゼにより触媒される反応はグルタミン依存反応にお けるコリスミ酸からアントラニル酸への変換である。微生物において、アントラ ニル酸シンターゼは２つの同一ではないサブユニットからなる：αサブユニット はコリスミ酸に結合し、エノールピルビン酸側鎖を除去し、およびβサブユニッ トはアミノ基をグルタミン酸からエノールピルビン酸残基によって空けられた位 置に移動させる。 トリプトファンの合成におけるその次の反応は、ホスホリボシルピロホスフェ ートのホスホリボシル残基のアントラニル酸への移動である。該インドール環は リボース基をインドールグリセロールリン酸を産生する環状化反応の後のリブロ ースへの変換を行うイソマー化に関する２工程において形成される。該経路にお ける最終反応は、１または２のサブユニットを有するであろう単一酵素によって 触媒される。該反応は、グリセルアルデヒド−３−リン酸の開裂およびセリンと 共にインドール基の変換を達成する（ウムバーガー（Umberger）、Ann ．Rev.Bio chem. 、４７、５５５（１９７８））。 高等植物および微生物におけるトリプトファン経路における代謝の流れは、ト リプトファンによるアントラニル酸シンターゼのフィードバック阻害を通して明 らかに調節される。従って、アントラニル酸シンターゼがトリプトファンにおい て阻害されるフィードバックであるので、野生型アントラニル酸シンターゼの過 剰産生はトリプトファン過剰産生となることができない。 アントラニル酸シンターゼが、高等植物の細胞培養物の粗製抽出物から部分的 に精製される間（ハンキンス（Hankins）ら、Plant Physiol.、５７、１０１ （１９７６）；ウィドホルム（Widholm）、Biochim．Biophys．Acta、３２０、 ２１７（１９７３））、非常に不安定であることがわかった。植物のアントラニ ル酸シンターゼをさらに特徴付けるために、ニヨギ（Niyogi）およびフィンク（ Fink）（Plant Cell、４、７２１（１９９２））およびニヨギら（Ｐlant Cell 、５、１０１１（１９９３））は分子的アプローチを採用した。彼らはシロイヌ ナズナ属アントラニル酸シンターゼαサブユニットが、別個に調節されている２ つの密接に関連した非対立遺伝子によってコードされていることを発見した。こ れらのαサブユニット遺伝子の１つであるＡＳＡ１は、傷害および細菌病原体の 潜入によって誘発され、その防御反応における関連を示唆し、一方、他のαサブ ユニット遺伝子であるＡＳＡ２は構成的基礎レベルで発現される。両方の推定可 能なタンパク質は細菌および菌類アントラニル酸シンターゼタンパク質とホモロ ジー領域を共有し、および細菌におけるトリプトファンフィードバック阻害に関 連されると示されている位置で保存されたアミノ酸残基を含む（カリギウリ（Ca ligiuri）ら、J.Biol.Chem．２６６、８３２８（１９９１））。 トリプトファン生合成経路におけるトリプトファンのアミノ酸類似体または中 間体の類似体（例えば５−メチルトリプトファン、４−メチルトリプトファン、 ５−フルオロトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、７−アザトリプ トファン、３β−インドールアクリル酸、３−メチルアントラニル酸）は原核生 物および真核生物の培養物の両者からの増殖を阻害すると示される。植物細胞培 養はこれらのアミノ酸類似体に対する耐性に関して選択されることおができる。 例えば、培養されたタバコ、ニンジン、ジャガイモ、トウモロコシおよびダチュ ラ・イノキシア（Datura innoxia）細胞株は、下記のように変化したアントラニ ル酸シンターゼの発現のため、５−メチルトリプトファン（５−ＭＴ）、トリプ トファンのアミノ酸類似体によって増殖抑制に対するものである。 ウイドホルム（Biochem．Biophys．Acta、２６１、４４（１９７２））はトリ プトファン類似体５−ＭＴ、４−メチルトリプトファン、５−フルオロトリプト ファンおよび６−フルオロトリプトファンはタバコ（Nicotiana tabacum）およ びニンジン（Daucus carota）細胞培養の増殖阻害を引き起こす。増殖阻害 は、アントラニル酸、インドール、またはＬ−トリプトファンの付加によって逆 にされることができる。アントラニル酸シンターゼをこれらの類似体に非常に高 感受性であると決定された。トリプトファン類似体はアントラニル酸シンターゼ の阻害を通して制限されたトリプトファン合成において細胞増殖を阻害した。 多数の培養されたタバコ細胞株の増殖は５−ＭＴによって阻害されるが、タバ コ細胞株の中には５−ＭＴの増殖阻害濃度に耐性があるものもある（ウィドホル ム、Biochem.，Biophys．Acta.、２６１、５２（１９７２））。耐性表現型は、 選択圧なしでさえ（すなわち、５−ＭＴなし）少なくとも６０細胞の大きさが二 倍になるのに適切であった。さらに、５−ＭＴ耐性細胞は他のトリプトファン類 似体において増殖を阻害するのに耐性があった。遊離トリプトファンレベルはコ ントロール組織の約１０倍を越えて５−ＭＴ耐性細胞において増加した。これら の５−ＭＴ耐性細胞中のアントラニル酸シンターゼは、トリプトファンまたは５ −ＭＴによる阻害にそれほど感受性がないことがわかった。 ５−ＭＴによる増殖阻害に耐性があるニンジン細胞株はまた、ウィドホルムに よっても選択される（Biochim．Biophys．Acta、２７９、４８(１９７２)）。こ の表現型は一般的に少なくとも１００細胞のダブリングに関して、トリプトファ ン類似体の不在下で安定である。５−ＭＴ耐性細胞はまた、他のトリプトファン 類似体に対しても耐性である。５−ＭＴ耐性細胞中の遊離トリプトファン濃度は コントロール組織でであるのに比較して２１７０μＭにまで（８１μＭ(２７倍) ）実質的に増加した。アントラニル酸シンターゼは、５−ＭＴ耐性細胞中で変化 すると示された。該酵素は、変化させていないアントラニル酸シンターゼよりト リプトファンまたは５−ＭＴによる阻害に感受性が約５倍低い。 シンフ（Singh）ら（Biochem．Genet．１３、３５７（１９７５））はトウモ ロコシにおける変異体、Zea mays Ｌ.、blue fluorescent-1はフィードバック阻 害が感受性が低い増加したアントラニル酸シンターゼ活性を所有することを記載 した。その変異体はまた、アントラニル酸も蓄積した。しかしながら、タバコお よびニンジンにおける以前の業績に対して、変化したアントラニル酸シンターゼ 活性は成熟トウモロコシ植物または種子におけるトリプトファンの有意な過 剰産生に導かない。 ヒバード（Hibberd）らはアントラニル酸シンターゼを含む５−ＭＴ耐性トウ モロコシ細胞は野生型アントラニル酸シンターゼよりフィードバック阻害に対し て一層感受性が低い事を記載した（１９８６年４月１５日に発行された米国特許 第４,５８１,８４７号）。１つの５−ＭＴ耐性細胞株は、非形質転換細胞株のほ とんど２０倍より多大なレベルでは、遊離トリプトファンを蓄積した。 カールソン（Carlson）ら（Physiol．Plant、４４）は５−ＭＴに耐性のある ジャガイモ細胞培養物を得た。これらの培養物中のアントラニル酸シンターゼは トリプトファンまたは５−ＭＴによる阻害にそれほど感受性が高くないと示され たが、該培養物の細胞に存在する酵素の５−ＭＴ耐性および感受性低いおことを 示した。選択した細胞株において、耐性アントラニル酸シンターゼの耐性レベル を非常に増加させた。選択された培地におけるフリーのトリプトファン濃度は約 ２９μＭであるコントロール培地に比較して９７０〜１４００μＭであった。 ウィドホルム（Plant Cell Cultures：Results and Perspectives、Ｆ．Sala 、Ｂ．Parisi、Ｒ．Cella、Ｏ．Cifferri(編)、エルゼビア（Elsevier）／North Holland Biomedical Presss、アムステルダム、１５７−１５９（１９８０）） は５−ＭＴ耐性Ｎ．tabacum懸濁培養液から再生された植物について記載した。 該培養は、トリプトファンによるフィードバック阻害にそれほど感受性のないア ントラニル酸シンターゼ酵素を発現し、フリーのトリプトファンの増大したレベ ルをも示すが（２５倍）、再生した植物の葉は該酵素の変化した形態を発現せず 、ついで５−ＭＴを含む培地において根を形成しない。しかしながら、耐性の特 徴は、再生した植物からのカラス中で発現される。したがって、培養物中で選択 された５−ＭＴ耐性細胞からのタバコ植物における５−ＭＴ耐性表現型の発現を 得ることは困難であると思われる。 最終的に、ランチ（Ranch）ら（Plant Physiol.、７１、１３６(１９８３)） はダチュラ・イノキシア、双子葉植物の細胞培養における５−ＭＴ耐性を選択し 、増大したトリプトファンレベル（野生型レベルより８から３０倍高い）を含む 耐性細胞培養物およびトリプトファンフィードバック阻害に感受性が低いアント ラ ニル酸シンターゼを報告した。再生した植物はまた、５−ＭＴにも耐性であり、 コントロール植物の葉においてより葉においてフリーのトリプトファン（４から ４４倍）の多大な濃度を有する。タバコに関する研究に対して、変化した酵素を 耐性細胞株から再生した植物において発現されなかったものであるが、これらの 結果はアミノ酸過剰産生表現型が細胞レベルで選択されることができ、ダチュラ ・イノキシアにおいて選択された細胞から産生された全植物において発現するこ とを示している。 ある細胞培養物および植物における５−ＭＴに関して選択することができるが 、この特徴は全植物におけるフリーのトリプトファンの過剰産生と必ずしも相関 があるわけではない。さらに、５−ＭＴ耐性株から再生した植物は、しばしば酵 素の変更した形態を発現しない。またこの特徴がある期間を越えて安定であるか または遺伝可能な特徴として継代することは予測不可能である。 従って、植物のトリプトファン含有量を増大させる、および／またはトリプト ファンまたはその類似体の増殖抑制量に耐性のある植物を提供する必要性が存在 する。 発明の要約 本発明は、以下で議論するようなフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプト ファンのアミノ酸類似体アミノ酸により実質的に耐性があるアントラニル酸アン トラニル酸シンターゼ（ＡＳ）をコードするＤＮＡセグメントを含む単離し、精 製したＤＮＡ分子を提供する。本発明の好ましい態様は、フリーのＬ−トリプト ファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体により阻害に実質的に耐性がある 植物アントラニル酸シンターゼである。本発明の他の態様は、トウモロコシアン トラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含み、単離し、精製した ＤＮＡ分子である。本発明のＤＮＡ分子は、アントラニル酸シンターゼコーディ ング配列に作動可能に連結したアミノ酸植物葉緑体トランジット（transit）ペ プチド配列をさらに含むことができる。 本発明の他の態様は、トリプトファンのアミノ酸類似体に対して耐性を付与す るおよび／または植物細胞におけるアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮ Ａセグメントおよび産生することによって植物植物組織植物の一部または植物細 胞を変更する方法を提供する。また、アントラニル酸シターゼをコードする遺伝 子における制限酵素多型部位の道程を含むトリプトファンアミノ酸類似体による 阻害に実質的に耐性であるアントラニル酸シンターゼを検出する分子的方法を提 供する。該方法は培養物、生物体、または生物の一部から単離されたＤＮＡ抽出 物をNlaIII制限エンドヌクレアーゼのある量と混合し、ついで制限酵素エンドヌ クレアーゼがアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡの一部内のＤＮＡを 開裂するか否かを決定することを含む。 植物、植物細胞、植物の一部または植物組織にトリプファンアミノ酸類似体に 対する耐性を付与する方法は、トリプトファン類似体またはフリーのＬ−トリプ トファンによる阻害に対する実質的に耐性であり、かつ植物細胞中で機能的なプ ロモーターに作動可能に結合しているアントラニル酸シンターゼをコードする前 もって選択されたＤＮＡセグメントを導入する工程を含む。ついでその形質転換 した植物細胞を再生して分化した豊かな植物を提供する。該プロモーターは誘発 可能であるかまたは組織特異的プロモーターであることができる。ＤＮＡセグメ ントに対するプロモーターの機能的な連結が発現カセットとなる。他の転写また は翻訳調節要素、例えば、エンハンサーまたはターミネーターはまた、ＤＮＡセ グメントに機能的に結合されることができる。ＤＮＡセグメントの発現は、ＤＮ Ａセグメント（「形質転換していない」物質）なしで、対応する植物、植物の一 部、植物細胞または植物組織の増殖を抑制するトリプトファンのアミノ酸類似体 の量またはフリーのＬ−トリプトファンの量に対する実質的な耐性の植物、植物 の一部、植物細胞または植物細胞を変化させるのに有効であるアントラニル酸シ ンターゼの量を産生する。 耐性を示す形質転換した植物細胞が一旦獲得されると、トランスジェニック植 物はそれらから再生されることができ、耐性または忍耐的特徴の遺伝の安定性に 関して評価され、すなわち、耐性または忍耐性特徴は、子孫に移されるか否かで ある。従って、本発明の他の態様は、トリプトファンのアミノ酸類似体に対して 実質的に耐性である形質転換した植物である。形質転換した植物の細胞は、本来 のアントラニル酸シンターゼおよび形質転換した植物の細胞は外在性アントラニ ル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含む。植物細胞中の外在性アン トラニル酸シンターゼの発現はそのままのアントラニル酸シンターゼの活性を抑 制するトリプトファンのアミノ酸アナログの量に対する植物に対する耐性または そのままのアントラニル酸シンターゼの活性を抑制するフリーのＬ−トリプトフ ァンに対する耐性を付与する。 抵抗性または耐性の特徴の伝達は、例えば、サザンブロット分析またはノザン ブロット分析、ＰＣＲに基づく方法論またはアントラニル酸シンターゼの生化学 的または免疫学的検出、または表現型分析、すなわち、形質転換された子孫は、 形質転換していない植物の増殖を阻害するトリプトファンのアミノ酸類似体は、 それらからの種子でもある。 本発明はまた、植物中のトリプトファン含有量の変化、好ましくは、増加の方 法を提供する。該方法は、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンの アミノ酸類似体による阻害に対する実質的に抵抗性があるアントラニル酸シンタ ーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントに導入することを含み、そこで は、該セグメントは植物細胞中の機能的なプロモーターに作動可能に結合したも のである、植物細胞のトリプトファン含有量に対して変化させるのに有効な量に おいて該遺伝子を発現する。従って、本発明の他の態様は、変化した細胞トリプ トファン含有量を有する形質転換した植物である。 本発明の好ましい態様において、総トリプトファン含有量において約１.１− ５０倍の増加を示す形質転換した細胞は、トリプトファン内用物における実質的 な増加を示すトランスジェニック植物、植物の一部および種子を産生するのに使 用される。トリプトファン含有量における実質的な増加は、対応する非形質転換 植物において存在する約１.１−５０倍の増加の範囲で、例えば、葉または果実 または種子などの形質転換していない植物、植物の一部において通常存在するト リプトファン含有量に関して決定される。 また、フリーのＬ−トリプトファンまたはプロモーターに作動可能に結合する トリプトファンのアミノ酸類似物による阻害に実質的に抵抗性であるアントラニ ル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含む豊かなトランスジェニック Ｚea mays植物もまた提供する。このＤＮＡセグメントは、完全な正常の性周期 を通してその子孫およびさらなる世代に伝えられる。 本発明はまた、宿主細胞にアントラニル酸シンターゼを産生する方法を提供す る。該方法は、アントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含む 発現カセットを宿主細胞中に導入することおよびＤＮＡセグメントを宿主細胞に 発現させて、アントラニル酸シンターゼを産生する工程を含む。発現カセットは 例えば、真核生物または原核生物のいずれかの宿主細胞中において機能的である プロモーターなどの転写および翻訳調節領域を含む。好ましくは発現カセットは 大腸菌などの原核生物細胞に導入されるか、酵母または昆虫細胞などの真核生物 細胞に導入されることは組換えタンパク質の産生に有用であると知られている。 組換え的に産生されたアントラニル酸シンターゼを使用して他の薬剤を同定して 、アントラニル酸シンターゼに結合し、阻害することができる。 本発明はまた、植物のアントラニンル酸シンターゼなどのようにフリーのＬ− トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体による阻害に実質的に抵 抗性であるアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含むＤＮ Ａ分子に対して高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする少なくとも７つ のヌクレオチドの精製し、単離したＤＮＡ分子を提供する。また、少なくとも７ つのヌクレオチド塩基の単離しかつ精製したＤＮＡセグメントを含むハイブリダ イゼーションプローブ、これは検出可能に標識されるかまたは可能な標識と結合 することができ、植物のアントラニル酸シンターゼなどのアントラニル酸シンタ ーゼをコードし、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸 類似体、またはトウモロコシアントラニル酸シンターゼによる阻害に実施低気に 的構成であるアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含むＤ ＮＡ分子の非コーディング鎖に対して、ハイブリダイズする。高ストリンジェン シー条件は５×ＳＳＣ１×Denhardt溶液、５０ｍＭ Tris-ＨＣ１（ｐＨ．８）、 ０.２％ＳＤＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１mg/ml salmon Sperm ＤＮＡ中で６５ ℃にて少なくとも１６時間ハイブリダイズさせ、その後、２５℃で２×ＳＳＣ、 ０.５％ＳＤＳで５分間２回洗浄し、２５℃で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中 で１０分間１回、および５６℃で０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで３０分間２回 洗浄した。 本発明は、また、アントラニル酸シンターゼ、宿主細胞中で作動可能に結合す る機能的なプロモーターをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットでイ ン・ビトロで宿主細胞を形質転換し、イン・ビトロで形質転換した宿主細胞を拡 張し、ついでＤＮＡセグメントによってコードされるアントラニル酸シンターゼ を発現する形質転換した宿主細胞を同定すること、を含む宿主細胞に外在性アン トラニル酸シンターゼ遺伝子を導入する方法を提供する。本発明のより好ましい 態様は形質転換される植物細胞が、分化した双子葉植物または単子葉植物に再生 される方法である。 本発明の他の態様は形質転換した植物細胞を選択する方法である。該方法は、 前もって選択したＤＮＡセグメントを植物細胞に導入して、形質転換した植物細 胞を産生することを含む。該ＤＮＡセグメントはフリーのＬ−トリプトファンま たはトリプトファンのアミノ酸類似体に実質的に抵抗性であるアントラニル酸シ ンターゼをコードする。形質転換した細胞は前以て選択したＤＮＡセグメントを 含まない植物細胞の増殖を阻害するフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプト ファンのアミノ酸類似体において培養される。本発明の好ましい態様は、植物ア ントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントである。本発明の他の好 ましい態様は前以て選択したＤＮＡセグメントを植物細胞に導入して、形質転換 した植物細胞を再生することを含む形質転換した植物細胞を選択する方法である 。該ＤＮＡセグメントはフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのア ミノ酸類似体による阻害に対して実質的に抵抗性であるアントラニル酸シンター ゼに作動可能に結合した葉緑体トランジットペプチドをコードする。 植物アントラニル酸シンターゼ遺伝子の転写調節要素をコードするＤＮＡセグ メントを含む単離かつ精製したＤＮＡ分子を提供する。 アントラニル酸シンターゼのβサブユニットをコードするＤＮＡセグメントを 含む単離かつ精製したＤＮＡ分子をさらに提供する。 本ＤＮＡ分子、配列またはセグメントに関して使用される「本質的に構成する 」なる語は、アントラニルシンターゼをコードするヌクレオチド配列の主要部分 、時に、葉緑体トランジットペプチドに作動可能に結合し、およびヌクレオチド 配列がアントラニル酸シンターゼ以外のタンパク質、時に葉緑体トランジットペ プチドに作動可能に結合して存在しないことを意味するよう定義される。 本明細書で使用する「トリプトファンのアミノ酸類似体」なる語はトリプトフ ァン生合成経路における中間体のアミノ酸類似体またはトリプトファンのアミノ 酸類似体である。これらの類似体は、以下に限るものではないが、６−メチルア ニトラニル酸、５−メチルトリプトファン、４−メチルトリプトファン、５−フ ルオロトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、７−アザトリプトファ ン、３β−ィンドールアクリル酸、３−メチルアントラニル酸などが含まれる。 本明細書で使用する、植物細胞、植物組織または植物中のフリーのＬ−トリプ トファンの「実質的に増加した」または「上昇した」レベルとは、約１.１から ５０倍、好ましくは約２から２０倍、およびより好ましくは約３から１０倍であ り、外在性遺伝子の存在によって変化を受けないゲノムである、形質転換してい ない植物細胞、植物組織または植物レベルで見いだした。例えば、形質転換した 植物中のフリーのＬ−トリプトファンは形質転換していない植物のものと比較さ れる。別法において、同種配偶子のバッククロスした変換した近親交配した形質 転換植物におけるフリーのＬ−トリプトファンのレベルは、再発する近親交配植 物においてのレベルと比較する。同種配偶子のバッククロスした変換した近親交 配した形質転換植物は、該形質転換した植物が、導入されたトランス遺伝子の存 在を除き、再発する近親交配の親を有して実質的に同一遺伝受粉であり、子であ るまで、再発する近親交配親と同じであり、ついで、少なくとも１回自己受粉さ れる。 本明細書で使用する「実質的に同一遺伝子である」は、同種配偶子のバックク ロスした近親交配した形質転換植物のゲノムＤＮＡ内容物は少なくとも９２％、 より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは約９９％形質転換した植物の 再発する近親交配した親のゲノムＤＮＡ内容物に一致する。 本明細書で使用する「フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのア ミノ酸の類似体による阻害に対する実質的に抵抗性または耐性である」植物細胞 、植物組織または植物は、当該技術分野に公知である方法論によって決定される ように、非形質転換植物細胞、植物組織または植物の増殖を通常阻害するトリプ トファンの量またはトリプトファンのアミノ酸類似体において増殖する植物細胞 、植物組織または植物である。例えば、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリ プトファンのアミノ酸類似体による阻害に対して実質的に抵抗性であるかまたは 耐性であるアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡ分子で形質転換された 同種配偶子の戻し交雑した近親交配した形質転換植物は、対応する、すなわち実 質的に同一遺伝子の、再発する近親交配植物の増殖を阻害するトリプトファンの 量またはトリプトファンのアミノ酸類似体中で増殖する。 本明細書において使用する、「フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトフ ァンのアミノ酸類似体による阻害に対する実質的に抵抗性または耐性」であウア ントラニル酸シンターゼは、対応する「野生型」またその種本来のアントラニル 酸シンターゼを通常阻害するフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファン のアミノ酸類似体の量によって阻害されないものである。 本明細書で使用する「感受性の強い植物の細胞」なる語は、フリーのＬ−トリ プトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体による増殖の阻害に感受性で ある細胞である。例えば、Ｃ２８トウモロコシ細胞株からの植物細胞は、近親交 配株Ｈ９９から得られたものまたはＡ１８８×Ｂ７３のようなハイブリッドから 得られたものなどの多数の他のトウモロコシ細胞株の増殖を阻害し、５−メチル トリプトファンのレベルで５−メチルトリプトファンによって増殖をの５−メチ ルトリプトファンレベルによって増殖を阻害する（ミアオ（Miao）ら、PlantCel l Tissue and Organ Culture１４、３（１９８８））。従って、Ｃ２８細胞が、 感受性植物の細胞ではなかった。 「外在性」アントラニル酸シンターゼがアントラニル酸シンターゼが、精製さ れ、増幅された細胞から単離されているＤＮＡ配列によってコードされているア ントラニル酸シンターゼである。 すなわち、本明細書で使用する「本来の」遺伝子とは、単離され、精製され、 増幅していないイン・ビトロでの操作をされていない遺伝子をいう。 本明細書で使用する形質転換した植物、植物組織又は植物細胞におけるトリプ トファンの「変化した」レベルとは、対応する非形質転換植物、植物組織または 植物細胞において発見されるレベルより非常に多大であるレベルをいう。別法と して、バッククロスした変換した近親交配した形質転換した植物におけるトリプ トファンの変化したレベルは再生近親交配植物において見いだされるレベルより 非常に多大である。 図面の簡単な説明 図１は、クローンｐＡＳＡ２ ２−１の模式図である。 図２は、トウモロコシアントラニル酸シンターゼαサブユニット遺伝子のヌク レオチド配列（配列番号：１）である。 図３は、トウモロコシＡＳＡ１ ２−１（配列番号：２）およびアラビドプシ ス(Arabidopsis)アントラニル酸シンターゼＡＳＡ１αサブュニット（配列番号 ：３）およびアラビドプシスアントラニル酸シンターゼＡＳＡ２αサブユニット (配列番号：４)のものとの推定アミノ酸配列のアラインメントである。点はサル モネラTrpＥ（Salmonella TrpＥ）遺伝子におけるフィードバック調節に関する 残基を示している（カリギウリ（Caligiuri）およびバウエル（Bauerle）、J．B iol．Chem．２６６（１９９１））。矢印は、Ｃ２８細胞中でのＭ→Ｋ変化の位 置を示す。 図４は、３トランスフォーマント（ＴＲＰＡ０１５、ＴＲＰＡ０３０およびＴ ＲＰＡ０１３）に関する対トリプトファン濃度（μＭ）に対する活性のグラフで ある。 図５は、トウモロコシアントラニル酸シンターゼαサブユニットコーディング 領域（配列番号：１４）のすぐ上流領域のヌクレオチド配列である。該アントラ ニル酸シンターゼの推定ＡＴＧは配列番号：１４の３'のたいていのヌクレオチ ドの３'の約１３０ヌクレオチドである。 図６は、トウモロコシアントラニル酸シンターゼβサブユニット遺伝子の部分 的なヌクレオチド配列である（配列番号：８）。下線を付したヌクレオチドはア ラビドプシスアントラニル酸シンターゼＡＳＢ１βサブユニットに存在するヌク レオチドに類似である。 図７は、トウモロコシアントラニル酸シンターゼのＣ２８対立遺伝子の推定ア ミノ酸配列である（配列番号：１６）。 発明の詳細な説明 本発明は、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似 体による阻害に実質的に抵抗性であるアントラニル酸シンターゼをコードするＤ ＮＡ分子を提供する。また、トリプトファンのアミノ酸類似体に耐性を付与する および／または植物細胞中にアントラニル酸シンターゼ遺伝子導入または発現さ せることによって植物組織および細胞のトリプトファン含有量を変化させる方法 をも提供する。通常は増殖を阻害するトリプトファンのアミノ酸類似体またはフ リーのＬ−トリプロファンのレベルに対して耐性および／または抵抗性であるカ ルス培養物、植物組織、植物および種子を産生するための方法および組成物を提 供する。そのような植物および種子は、遺伝的に本特徴をその子孫に伝達するこ とができる。 トリプトファンフィードバック阻害に対する抵抗性と関連する遺伝子をクロー ニングし、トリプトファンを過剰産生し、子孫にこの特徴を伝達するカルス培養 物、植物組織、植物、植物の一部および種子を産生するための方法および組成物 もまた提供される。トリプトファンもまた過剰産生するトリプトファン類似体に 対する新規遺伝子型抵抗性の選択のための細胞培養選択技術もまた記載される。 例えば、抵抗性トウモロコシ株を産生するため、トリプトファン類似体またはフ リーのＬ−トリプトファンに対して抵抗性であるトウモロコシ細胞が単離および 特徴付けされ、ついで該類似体またはフリーのＬ−トリプトファンによる増殖阻 害に対して抵抗性である植物に再生される。本発明に提供される方法はまた、単 子葉植物および以下に限られるものではないが、コメ、ライ麦、キビ、小麦、大 麦、モロコシおよびオートを含む他の穀物収穫物におけるフリーのトリプトファ ンのレベルを増大させるためにも使用することができる。 本発明により、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸 類似体による阻害に抵抗性である酵素をコードするアントラニル酸シンターゼ遺 伝子を同定し、単離し、植物細胞において少なくとも機能的なプロモーターと組 合せて組換え発現カセットを提供する。 本発明とあわせて使用することができるそのような発現カセットの構築は、本 発明の開示に照らし、当業者に公知である（例えば、サンブルック（Sambrook） ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・ スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９（Molecular Ｃloning：ＡLabo ratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，１９８９）；ゲルビン（Gelvi n）ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Plant Molecular Biology Manual）、１９９０）。好ましい構築物は、一般に、以下に限るもの ではないが、ＣaＭＶ ３５Ｓプロモーター（オーデル（Ｏdell）ら、Nature、３ １３、８１０（１９８５））またはＣaＭＶ １９Ｓ（ロートン（Lawton）ら、Pl ant Mol.Biol．９、３１Ｆ(１９８７)）、nos（エーベルトら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ 、８４、５７４５（１９８７））、Adh（ウォーカーら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８４ 、６６２４（１９８７））、スクロースシンターゼ（ヤング（Yang）ら、ＰＮＡ Ｓ ＵＳＡ、８７、４１４４（１９９０））、α−テュブリン、アクチン（ウォ ング（Wang）ら、Mol.Cell．Biol.、１２、３３９９（１９９２））、cab（サリ バン（Sullivan）ら、Mol.Gen.Genet.２１５、４３１（１９８９））、ＰＥＰＣ ase（ハドスペス（Hudspeth）ら、Plant Mol.Biol．１２、５７９（１９８９） ）またはＲ遺伝子複合体（チャンドラー（Chandler）ら、The Plant Cell、１、 １１７５（１９８９））などの植物プロモーターを含む。本発明の実施において 有用である他のプロモーターは当業者に公知であると考えられる。 さらに、転写エンハンサーまたはエンハンサーの複製は、特定のプロモーター からの発現を増大させるために使用することができる。そのようなエンハンサー の例には、以下に限るものではないが、ＣaＭＶ ３５Ｓプロモーターおよびオク トピンシンターゼ遺伝子（ラスト（Last）ら、米国特許第５,２９０,９２４号、 １９９４年３月１日発行）。例えば、本発明の使用のためのベクターはocsエン ハンサー要素を含むように構築されることができる。該要素は、アグロバクテリ ウムのオクトピンシンターゼ（ocs）遺伝子からの１６塩基対再発性エンハンサ ーとして最初に同定され（エリス（Ｅllis）ら、ＥＭＢＯ J.、６，３２０３（ １９８７））、ついで、少なくとも１０の他のプロモーター（ブーチェ（Bouche z）ら、ＥＭＢＯＪ.、８、４１９７（１９８９））に存在する。ocs要素などの エンハンサ一要素および要素の特に多数のコピーの使用は、単子葉植物の形質転 換において応用される近隣のプロモーターからの転写レベルを増加させるために 機能するであろう。組織特異的プロモーターは以下に限るものではないが、根細 胞プロモーター（コンクリング（Conkling）ら、Plant Physiol.、９３、１２０ ３（１９９０）および組織特異的エンハンサー（フロム（Fromm）ら、ThePlant Cell、１９７７（１９８９））もまた特に有用であると考えられ、ＡＢＡ−およ び膨圧誘発可能なプロモーター（turgor-inducible promoter）などの誘発可能 なプロモーターである。 転写開始部位およびコーディング配列の開始、すなわち未翻訳リーダー配列の 間のＤＮＡ配列が、遺伝子発現に影響を及ぼすことができるので、特にリーダー 配列を使用することも可能である。好ましいリーダー配列は、付着の遺伝子の直 接的な最大発現と推定された配列を含むと考えられ、ｍＲＮＡ安定性を増加また は維持することができ、翻訳の不適切な開始を妨害することができる好ましい一 致のリーダー配列を含むと考えられている（ジョシ（Joshi）、Nucl.AcidRes.、 １５、６６４３（１９８７））。そのような配列の選択は、当業者に公知である であろう。植物、特にトウモロコシに高発現する遺伝子由来の配列が最も好まし い。 構築物は、転写を終結させるためのシグナルとして機能し、得られたｍＲＮＡ のポリアデニル化を可能にするＤＮＡ３'末端とともに関心のある遺伝子をも含 む最も好ましい３'要素はアグロバクテリウム・テュメファシエンス（Agrobacte rium tumefaciens）のノパリンシンターゼ（ビーバン（Bevan）ら、Nucl.Acid.R es.、１１、３６９（１９８３））、アグロバクテリウム・テュメファ シエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子からのＴ７転写のターミネーター、およ びジャガイモまたはトマトからのプロテアーゼインヒビタ−ＩまたはIIの３'末 端、他の当業者に公知の他の３'要素からのものであると考えられている。Adhイ ントロンＩ（カリス（Callis）ら、Genes Develop．１、１１８３（１９８７） ）、スクロースシンターゼイントロン（バジル（Vasil）ら、PlantPhysiol．９ １、５１７５（１９８９））またはＴＭＶオメガ要素（ギャリー（Gallie）ら、 The Plant Cell、１、３０１（１９８９））などの調節要素はさらに、所望の場 所に含まれる。本発明の実施において有用である他のそのような調節要素は、当 業者に公知である。 さらに、発現カセットが構築され、ついで植物細胞内に細胞内コンパートメン トに遺伝子産物をターゲティングし、細胞外環境にタンパク質を導くのに使用さ れることができる。これは一般的に、トランジットまたはシグナルペプチド配列 をコードするＤＮＡ配列を特定の遺伝子のコーディング配列に結合させることに よって達成されるであろう。得られた一時的またはシグナルペプチドは、それぞ れ該タンパク質を特定の細胞内または細胞外目的地に輸送され、その翻訳後に除 去されるであろう。一時的またはシグナルペプチドは、例えば液胞、小胞体、色 素体およびミトコンドリア膜などの細胞内膜を通してタンパク質の輸送を促進す ることによって機能する一方で、シグナルペプチドは、細胞外膜を通してタンパ ク質に指令する。細胞内または細胞外コンパートメントへの該タンパク質の輸送 を促進することによって、これらの配列は遺伝子産物の蓄積を増加させることが できる。 そのような使用の特定の例は細胞質よりむしろ葉緑体などの特定の細胞小器官 に対するアントラニル酸シンターゼの指令に関する。これは、タンパク質の色素 体特異的ターゲティングを付与するrbcS（ＲｕＢＩＳＣＯ）のトランジットペプ チドの使用によって実施される。 植物細胞内の細胞内コンパートメントに対する遺伝子産物のターゲティングが 、細胞内コンパートメントに遺伝子の直接的な運搬によって達成することができ ると考えられる。例えば、葉緑体において所望される存在のタンパク質をコード す る遺伝子発現カセットは参照のために本明細書に包含されている１９９５年９月 １９日に発行された米国特許第５,４５１,５１３号のマリガ（Maliga）らに記載 されている方法を用いて葉緑体ゲノムに直接的に導入されることができる。 ＤＮＡそのものを細胞内に標的化することは有用であるとも考えられている。 例えば、核に導入されたＤＮＡを標的化することは、有用であるかもしれない。 核そのもの内に、部位特異的組込みを達成するための遺伝子を標的化するのに有 用であるであろう。例えば、形質転換によって導入された遺伝子を、細胞内に存 在する遺伝子と置換させるのに有用であろう。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子を含む発現カセットの構築後、ついで該カセ ットは植物細胞に導入されることができる。植物細胞タイプに依存して、遺伝子 発現のレベルおよび該遺伝子によってコードされる酵素の活性、該植物へのアン トラニル酸シンターゼ遺伝子の導入は５−メチルトリプトファンまたは６−メチ ルアントラニル酸などのトリプトファンのアミノ酸類似体に対する耐性を付与す るおよび／または植物細胞のトリプトファン含有量を変えることができる。 また、本発明により、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのア ミノ酸類似体による阻害に感受性のある酵素をコードする植物アントラニル酸シ ンターゼ遺伝子などのアントラニル酸シンターゼ遺伝子が同定され、単離された 。そのような遺伝子を使用して、アントラニル酸シンターゼ変異を単離するため に、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似物による 阻害に抵抗性である細胞からの組換えｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスク リーニングするかまたはフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのア ミノ酸類似物による阻害に抵抗性である酵素との結果であるアントラニル酸シン ターゼコーディング領域に特異的な変異を導入する。さらに、該遺伝子は宿主細 胞において機能的であるプロモーターと組み合わせて、組換え発現カセットを提 供する。宿主細胞における遺伝子の発現は、酵素阻害の効果のための薬剤のイン ・ビトロでのスクリーニングに有用である組換えアントラニル酸シンターゼの量 を提供する。 単子葉植物において、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファン類似 物による阻害に抵抗性である酵素をコードする外在的に導入されたアントラニル 酸シンターゼ遺伝子は本来のまたは内在的なアントラニル酸シンターゼを通常阻 害するＬ−トリプトファンの量でフリーノトリプトファンによる阻害をフィード バックするため実質的に耐性である植物組織の細胞を変えるのに有効なレベルで 発現させることができる。該組織は、また、植物細胞の増殖または組織または本 来のまたは内在的なアントラニル酸シンターゼの活性を通常阻害する類似体の量 でトリプトファンのアミノ酸類似体による増殖阻害に抵抗性にさせることができ る。本来のまたは内在性のアントラニル酸シンターゼは、通常、形質転換前の植 物細胞において通常コードされ、発現される酵素である。外在的に導入されたア ントラニル酸シンターゼ遺伝子は、細胞から単離され、増幅された遺伝子である 。単子葉植物および双子葉植物の両方におけるアントラニル酸シンターゼ遺伝子 の外在的な導入および発現はトリプトファン含有量および植物組織および種子の 品質の変化という結果となる。細菌などの宿主細胞中の外在的な導入および発現 は、多量な酵素を単離する源を提供することができる。結晶化されたアントラニ ル酸シンターゼはアントラニル酸に結合し、阻害する他の薬剤を同定するのに有 用である。単離した酵素はまた、酵素の阻害の効能に関与できるであろう薬剤を スクリーニングするのに使用されることもできる。 関心のあるアントラニル酸シンターゼ遺伝子を一旦単離すると、有効な宿主ベ クター系が植物細胞のゲノムに単離した遺伝子または遺伝子群を導入するために 必要である。外来遺伝子は形質転換された植物細胞に発現されるべきであり、産 生された細胞の次世代に安定に伝達（体細胞的および性的に）される。植物細胞 内の遺伝子の導入、維持および発現が可能であるべきベクターは、例えば、以下 に限るものではないが、植物および動物、細菌、真菌、酵母またはウイルスなど を含む多様な源からのものである。さらに、該ベクターを多様な広範囲の単子葉 および双子葉植物に導入することが可能であるべきである。該新規遺伝子は通常 の交配により子孫に伝達される。 タバコ、ジャガイモおよびアルファルファなどの双子葉植物（広葉植物）にお ける外来遺伝子の導入および発現は、アグロバクテリウム・テュメファシエンス の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドのＴ−ＤＮＡを使用することが可能であることが 示されている。組換えＤＮＡ技術および細菌遺伝学の使用により、広範囲の外来 ＤＮＡがアグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡに挿入されることができる。組換えＴ iプラスミドを含む細菌による感染後、外来ＤＮＡは宿主植物の染色体に挿入さ れ、従って、遺伝的に操作された細胞を産生し、最終的に遺伝的に操作された植 物である。第２のアプローチは、遺伝子ベクターとしてのルート誘発（Ｒｉ）プ ラスミドを導入することである。 アグロバクテリウムが、双子葉植物のみを感染するようであるが、トウモロコ シ、小麦、米、大麦、オート麦、モロコシ、キビおよびライ麦を含む重要な穀物 植物は、アグロバクテリウムによる形質転換を受け易いと知られてはいない。し かしながら、Tiプラスミドは、単子葉植物のベクターとして機能するため将来に 操作されることができるであろう。さらに、モデルシステムとしてTiプラスミド を使用するので、単子葉植物のための遺伝ベクターを人工的に構築することがで きるであろう。Ti−プラスミドはまた、植物核ＤＮＡに組み込まれることができ るＴ−領域を含む単子葉プロプラストおよび細菌スフェロプラスト間のマィクロ インジェクションまたは融合などの人工的な方法によって単子葉植物に導入され ることができる。 アントラニル酸シンターゼによる植物の形質転換は、また、ＣaＭＶまたはジ ェミニウイルス、ＲＮＡウイルスおよびウイロイドなどのＤＮＡウイルスなど； 細胞小器官（例えば、葉緑体またはミトコンドリアなど）における染色体外ＤＮ Ａ要素などの不安定な植物ゲノム成分からのＤＮＡ分子またえは不明瞭にコード されたコントロール要素；安定な植物ゲノム成分からのＤＮＡ分子（例えば、複 製起点および導入されたＤＮＡを該細胞小器官または核ゲノムに組み入れられる ことが可能であるＤＮＡ配列、通常の複製、自立複製、植物の継続世代において 遺伝されるべき植物の細胞分割および性生殖の間に分離する他のＤＮＡ配列であ る）またはトランスポゾン植物病原体などの植物ゲノムに挿入されたＤＮＡを移 動させることができる他の核酸分子にアントラニル酸シンターゼをコードするＤ ＮＡを導入することによって達成されることもできである。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子を含むＤＮＡは感染性プラスミド、感染性ウ イルス、リポソームの使用、機械またはレーザービーム法によるマイクロインジ ェクションなどは、全染色体および染色体断片、エレクトロポーレーションおよ びマイクロプロジェクタイル・ボンバードメント（microprojectile bombardmen t）によって直接的に微生物によって運搬される。 Ａ．トリプトファン過剰産生細胞株の選択のための方策 所望のトリプトファン類似体抵抗性、組織培養法を用いたトリプトファン過剰 産生変異体の効率よい選択は選択条件の注意深い決定を必要とする。これらの条 件は、培養液中でトリプトファン類似体耐性トリプトファン過剰産生細胞の増殖 および蓄積を可能にするのにできるだけ利用するが、一方、細胞集団の塊の増殖 を阻害する。該状況は集団における個々の細胞の多様性が、近隣の細胞の活力に 高く依存することができるという事実によって複雑化されている。 細胞培養物が、トリプトファン類似体にさらされている条件は、組織と該化合 物の相互作用の特徴によって決定される。毒性の程度および阻害の速度のような 因子が考えられるべきである。培養物中の細胞による化合物の蓄積および、培地 中および細胞中の両者における化合物の持続性および安定性もまた、考慮される 必要がある。さらに、該化合物の効果が、トリプトファンの添加によって容易に 逆転されることができるか否かを決定するのは重要である。 培養の生存および形態への類似体の効果は注意深く評価される。特に、培養物 の植物再生能力に関する印象が全くない類似体露出条件の類似体を選択するのは 特に重要である。類似体露出条件の選択はまた、該類似体が細胞を殺害するか、 細胞の分割を阻害するだけかによっても影響される。 選択プロトコールは、上記の考慮に依存される。以下に簡単に記載されるプロ トコールは、選択手法において利用できる。たとえば、トリプトファンまたはそ の類似体、液体懸濁培養物中のよく分離した細胞による増殖の阻害に抵抗性であ る細胞に関する選択は、短期間の高トリプトファンまたは高類似体レベルにさら されることができる。ついで、回収および蓄積されることができる生存細胞が、 さらに長い期間再度さらされた。別法として、組織化し、部分的に分化した細胞 培養物が増殖され、フリーで最初は低レベルのＬ−トリプトファンまたその類似 体の最初は低いレベルに持続的にさらされる。ついで、濃度は徐々にサブカルチ ャ間隔を越えて、増加する。これらのプロトコールは、選択的手法において有用 であるが、本発明は、これらの手法に限られていない。 Ｂ．抵抗性細胞株の選択および特徴付 細胞または組織が、トリプトファンまたはその類似体の正常な抑制レベルの存 在下で、よく増殖されると観察されるところで回収されるまで選択が行われる。 これらの細胞「株」は、トリプトファンまたは類似体の存在下で、非抵抗性の細 胞を除去するために数回さらにサブカルチャーされ、特徴付けられる。得られた 抵抗性の量は、多様な類似体またはフリーのＬ−トリプトファン濃度の存在にお ける非選択細胞または組織の増殖とこれらの細胞株の増殖を比較することによっ て決定される。培養された細胞の抵抗性の特徴の安定性は、多様な期間に類似体 またはフリーのＬ−トリプトファンの不在下で、選択された細胞株を単に増殖さ せることによって査定され、ついで類似体またはフリーのＬ−トリプトファンの 組織に再度さらした後の増殖を分析する。 抵抗性細胞はまた、該類似体の作用の部位がトリプトファンおよび／またはそ の類似体による阻害にそれほど感受性のない形態に変化させられることを確認す るためのイン・ビトロ化学実験を用いて評価されることができる。 Ｃ．植物の再生および種子の産生 トリプトファン類似体またはフリーのＬ−トリプトファンに対する抵抗性の満 足できるレベルを示す細胞株は、抵抗性の特徴を発現する成熟植物および種子を 得るための植物再生プロトコールを行う。該植物再生プロコトコールは、体細胞 胚の発達および根および新芽の続く増殖を可能にする。 ついで、成熟植物は、該特徴を発現すると知られている細胞株から得られる。 もし、可能であるなら、再生した植物は、自己受粉する。さらに、再生された植 物から得た花粉は、農業経済学的に重要な生得的株の種子増殖植物に交雑される 。場合によっては、これらの生まれつきの株の植物からの花粉は、再生した植物 を授粉させるのに使用される。該特徴は、最初に、該特徴の分離を評価し、つい で、 子孫世代の評価によって、遺伝的に特徴つけられる。遺伝可能性および組織培養 において選択された特徴の植物における発現は、該特徴が商業上有用であるなら 、特に重要である。 Ｄ．トリプトファン過剰産生市販ハイブリッド種子 トリプトファン過剰産生トウモロコシの商業的価値はもし、多数の異なるハイ ブリッドの組合せは、販売に利用可能であるなら最も高くなる。農業従事者は、 成熟、標準性、または他の農業経済的特徴などの差異などに基づく一種のハイブ リッド以上を典型的に育成する。さらに、コーンベルトの一部に適したハイブリ ッドは、他の部位には適さない。というのは成熟、疾患および昆虫抵抗性などの 特徴における差異のためである。このため、親株の多数にトリプトファン過剰産 生交配させ、多数のハイブリッド組合せが産生されることができるようにするの が必要である。 変換プロセスは（戻し交雑）、該本来の過剰産生株を通常の精鋭株に交雑させ 、ついで正常親株に戻る子孫を交雑させることによって行う。この交雑からの子 孫は、いくつかの植物が過剰産生に責任のある遺伝子を運搬するが他は運搬しな いよう分離するであろう。そのような遺伝子を運搬する植物は、過剰産生および 正常の産物を再度分離する子孫となる正常の親に再び交雑されるであろう。これ らは本来の通常の親が過剰産生株に変換されるまで、繰り返され、しかし正常の 親においてもともと見いだされているものとして他のすべての重要な属性を所有 する。別々の戻し交雑プログラムがトリプトファン過剰産生株に変換されるべき 個々の精鋭株に実施される。 戻し交雑に引き続き、新規の過剰産生株およびよい市販のハイブリッドを製造 する株の適切な組合せは過剰産生ならびに重要な農業経済上の特徴の組合せに関 して評価される。過剰産生株およびハイブリッドは、もともとの正常株およびハ イブリッドの型にあてはまるよう産生される。これは、一般的に株またはハイブ リッドが商業上発育されるであろう環境上の条件の範囲下での評価を必要とする 。高トリプトファントウモロコシの産生に関して、ハイブリッド種子トウモロコ シの両親が高トリプトファン特徴に関する同種接合子であることが必要である。 満 足におこなわれるハィブリッド株の親株は、増強され、標準的ハイブリッド種子 トウモロコシ産生慣例を用いたハイブリッド産生に関して使用される。 Ｅ．トリプトファンを過剰産生する変異植物を得るための別法 質および植物におけるフリーのトリプトファンの量を改善する任意の方法が利 用できる。一般的に、アミノ酸（トリプトファンを含む）の生合成は、フィード バック調製によってコントロールされる。フィードバック調製の２つの主要な型 はフィードバック（または最終産物）阻害である。フィードバック阻害において 、該経路の最終代謝物は該経路の酵素の活性を阻害する。フィードバック抑圧は 、最終産物または最終産物の誘導体により経路において、１またはそれ以上の酵 素の形成である。多数のアミノ酸生合成経路に関して、該アミノ酸最終産物は抑 圧を引き起こすべくトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）と最初に組み合わせる。 フィードバック調節は、（ａ）最終産物の阻害または抑圧の濃度における減少ま たは（ｂ）フィードバック効果にそれほど敏感でない条件、すなわち、フィード バック抵抗性に対する変異の条件に系を形成する酵素または酵素変異変化におい て回避されることができる（この話題の一層完全な概説のため、デマイン(Demai n)、Advan．Biochem．Eng.、１、１１３−１４１（１９７１））。 変異体は、フィードバック阻害に抵抗性の酵素を所有するものが単離され、お よび／またはタンパク質合成に関して使用され得ない阻害および／または抑圧を 実行するアミノ酸類似体を用いてフィードバック抑圧を可能にする。変異体はフ ィードバック阻害酵素（阻害抵抗性）の構造における変化のため類似体に抵抗性 であるが、他は変化した酵素形成系を有することができる（抑圧抵抗性）。さら に、これらの変異体は、変化したコントロールメカニズムのためアミノ酸を過剰 産生する。１株における抵抗性の両タイプに対する変異はアミノ酸産生において 顕著な増加となることができる。 カルス培養、組織培養、種子におけるトリプトファンの過剰産生および再生し た植物が本発明において利用されることができる。アントラニル酸シンターゼは 、任意の植物種において、変化または置換されることができる；特に非常に重要 であるのは、通常、トリプトファンの低量を欠失しているかまたは産生している 農 業経済的および園芸作物である。アントラニル酸シンターゼの変化は、以下に限 るものではないが、以下の方法を含む多様な方法のいずれかによって達成される ことがきる：（１）組織培養における自発的な変化および直接的変異の選択；（ ２）すべての型の組織培養、種子および植物の培養上の直接または間接変異誘発 手法；および（３）分子生物学、化学技術および最高の産物および植物に抵抗性 の遺伝子の再導入を用いて遺伝子の一部または全体における遺伝子の単離、操作 、修飾または合成。 従って、トリプトファン過剰産生植物は以下に限るものではないが、従来の遺 伝子および植物交配プロデューサー、全植物遺伝的およびトランスジェニック法 および原形質融合による体細胞ハイブリダイゼーションである。 Ｆ．発現カセットの形成 本発明の発現カセットは、宿主細胞中で機能的なプロモーターに作動可能に結 合したアントラニル酸シンターゼ遺伝子をコードするＤＮＡ分子を含むことがで きる。該遺伝子は、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ 酸類似体による阻害に実質的に耐性であるおよび／または抵抗性であるアントラ ニル酸シンターゼをコードすることができる。 １．アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子の単離および同定 アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子は、サンブルックら、モレキュ ラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ ハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載のような標準方法によって同定およ び単離されることができる。該遺伝子は、また、米国特許第４,６４２,４１１号 （参照のため引用して本明細書の記載とする）のように調製され、植物細胞株な どのトリプトファン類似体耐性細胞株から得ることができる。 アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子は、特定の細胞タイプ、細胞株 、初代細胞または組織由来の核酸から産生されたＤＮＡまたはｃＤＮＡのスクリ ーニングによって同定することができる。植物アントラニル酸シンターゼを同定 および単離するためのライブラリーの例は、以下に限るものではないが、近交系 Ｂ７３（ストラタジーン（Stratagene）、ラジョラ（La Jolla）、カリフォル ニア、Cat．＃９３７００５号、クローンテク、パロ・アルト（Clontech,Palo， Alto）。カリフォルニア、＃ＦＬ１０３２ａ号、＃ＦＬ１０３２ｂ号および＃Ｆ Ｌ１０３２ｎ号）、Mo１７（ストラタジーン、ゲノムライブラリーは近交系株Ｂ ７３（クローンテク、Cat．＃ＦＬ１０３２ｄ）からのものである。アントラニ ル酸シンターゼをコードする遺伝子のすべてまたは一部をコードするＤＮＡ断片 のスクリーニングは、他の生物体からのアントラニル酸シンターゼのプローブへ のハイブリダイゼーションのゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーからのプラー クのスクリーニングまたはアントラニル酸シンターゼを特に認識する抗体に結合 するｃＤＮＡ発現ライブラリーからのプラークをスクリーニングすることによっ て達成されることができる。他の生物からのアントラニル酸シンターゼプローブ にハイブリダイズするＤＮＡ断片および／またはアントラニル酸シンターゼに対 する抗体と免疫応答的であるＤＮＡ断片を運搬するプラークはベクターにサブク ローニングされることができ、かつ配列決定され、および／または所望のアント ラニル酸シンターゼ遺伝子のすべてまたは一部をコードする他のｃＤＮＡまたは ゲノム配列を同定するためのプローブとして使用される。トウモロコシまたは植 物ライブラリーをスクリーニングするために好ましいｃＤＮＡプローブは、ｐＤ ＰＧ６００またはｐＤＰＧ６０２プラスミドクローンから得られることができる 。 好ましいバージョンにおいて、トウモロコシアントラニル酸シンダーゼ遺伝子 は、実施例１、３および４に記載のように調製された５−メチルトリプトファン または６−メチルアントラニル酸耐性植物細胞株から同定および単離される。ｃ ＤＮＡライブラリーは、オリゴｄＴプライミングによって調製されることができ る。ＤＮＡ断片を含むプラークはアントラニル酸シターゼに特異的であるプロー ブまたは抗体でスクリーニングすることができる。アントラニル酸シンターゼ遺 伝子の一部をコードするＤＮＡ断片は、サブクローニングされ、シークエンシン グされ、ついでゲノムアントラニル酸シンターゼ遺伝子を同定するためのプロー ブとして使用されることができる。トウモロコシアントラニル酸シンターゼの一 部をコードするＤＮＡ断片は、他の公知のアントラニル酸シンターゼ遺伝子との 配列ホモロジーの決定またはアントラニル酸シンターゼ特異的メッセンジャーＲ ＮＡにハイブリダイズすることによって評価されることができる。一旦、トウモ ロコシアントラニル酸シンターゼの５'、中間および３'末端の部位をコードする ｃＤＮＡ断片が得られると、それらはトウモロコシゲノムライブラリーからのト ウモロコシアントラニル酸シンターゼ遺伝子の完全なコピーを同定およびクロー ニングするプローブとして使用されることができる。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子のゲノムのコピーの一部、または複数のコピ ーはシークエンシングされることができ、他のアントラニル酸シンターゼ遺伝子 に対するＤＮＡ配列ホモロジーを含む標準的方法によるか、またはサンブルック ら、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・ スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）によって記載されるようにＲ ＮＡase保護分析によって同定される遺伝子の５'末端である。該遺伝子の５'末 端の部分が一旦同定されると、アントラニル酸シンターゼの完全な複数のコピー は、該遺伝子の５'末端でのＤＮＡ配列に相補的であるオリゴヌクレオチドプラ イマーを用いてクローニングまたはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Ｐ ＣＲ）合成を含む標準的な方法により得られることができる。アントラニル酸シ ンターゼ遺伝子の単離された全長のコピーの存在は、ハイブリダイゼーション、 部分的配列分析またはトウモロコシアントラニル酸シンターゼ酵素の発現により 確認することができる。５−ＭＴまたは６−ＭＡ抵抗性細胞株からクローニング されたアントラニル酸シンターゼ遺伝子は米国特許第４,５８１,８４７号、１９ ８６年４月１５日に発行されたものの記載のような標準的な方法（参照のため引 用して本明細書の記載とする）による、５−ＭＴ、６−ＭＡまたはトリプトファ ンの他のアミノ酸類似体に対する耐性を評定されることができる。 トリプトファンのアミノ酸類似体に対して抵抗性および／または耐性であるア ントラニル酸シンターゼ遺伝子は、いくつかの方法によって得ることができる。 該方法は、以下に限るものではないが、 １．培養物中で自発的な変異および直接的な変異選択； ２．任意の細胞型または組織、種子または植物の組織培養の直接または間接的 な変異体誘発方法；および ３．部位特異的変異体誘発（サンブルックら、上記に引用）、トランスポゾン は媒介変異体誘発（バーグら、Biotechnology、１、４１７（１９８３））およ び変異誘発（ミトラ（Mitra）ら、Molec．Gen．Genetic．２１５、２９４（１９ ８９））などの方法によるクローニングされたアントラニル酸シンターゼ遺伝子 の変異 である。フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体の 存在における遺伝子によりコードされる酵素の機能的な活性における変化によっ て、または制限酵素マッピングまたはＤＮＡ配列分析を用いて、ＤＮＡ配列にお ける変化を検出することによって、同定することができる。 好ましいバージョンにおいて、５−メチルトリプトファンに実質的に耐性であ るトウモロコシアントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子は、トウモロコシ ５−メチルトリプトファン耐性細胞株から単離されている。１９８６年４月１５ 日に発行された米国特許第４,５８１,８４７号（参照のため引用して本明細書の 記載とする）を参照。端的には、部分的に分化した植物細胞培養は、増殖され、 ついで５−メチルトリプトファンの低いレベルに持続的にさらすことでサブカル チャーされる。ついで、５−メチルトリプトファンの濃度は徐々にいくつかのサ ブカルチャー間隔を越えて増加する。通常の毒性５−メチルトリプトファンレベ ルの存在下で増殖する細胞または組織は、５−メチルトリプトファンの存在下で 繰り返しサブカルチャーされ、特徴付けられる。培養された細胞の５−メチルト リプトファン耐性特徴の安定性は、多様な期間の５−メチルトリプトファンの不 在下で、選択された細胞を増殖させ、ついで、該組織を５−メチルトリプトファ ンにさらした後に増殖を分析することによって評価されることができる。 変化したアントラニル酸シンターゼ酵素を有するために耐性である細胞株は、 正常は毒性である、すなわち、増殖インヒビターである、５−メチルトリプトフ ァンのレベルの存在において、酵素活性を有する細胞株を同定することによって 選択されることができる。 ５−メチルトリプトファン阻害に対する低減された感受性のアントラニル酸シ ンターゼを有する細胞株は、５−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シ ンターゼを単離するために使用されることができる。５−メチルトリプトファン にアントラニル酸シンターゼ遺伝子のすべてまたは一部分をコードするＤＮＡ断 片はアントラニル酸シンターゼ遺伝子の一部をコードするｃＤＮＡプローブにハ イブリダイズすることによって同定されることができる。変化した遺伝子の完全 なコピーは、クローニングおよびライゲーションまたは適切なプライマーを用い てＰＣＲ合成によって得られることができる。アントラニル酸シンターゼをコー ドする変化した遺伝子の単離は、通常では毒性レベルである５−メチルトリプト ファンにさらされる場合に発現されているアントラニル酸シンターゼが酵素活性 を保持しているか否かを決定することによって、形質転換した植物細胞において 確認されることができる。 ２．プロモーター アントラニル酸シンターゼ遺伝子を一旦得て増幅すると、プロモーターと組合 わさって、発現カセットを形成する。 たいていの遺伝子は、プロモーターとして知られる、遺伝子発現を調節するＤ ＮＡ配列の領域を有する。プロモーター領域は、典型的には原核生物細胞および 真核生物細胞の両方におけるコーディング配列から上流のフランキングＤＮＡ配 列において見いだされる。プロモーター配列は、下流遺伝子配列の転写の調節を 提供し、ついで約５０から約２,０００ヌクレオチド塩基配列を含む。プロモー ター配列はまた、遺伝子発現のレベルに影響を及ぼすエンハンサー配列などの調 節配列も含む。いくつかの単離されたプロモーター配列は、異種遺伝子の遺伝子 発現を提供することができ、それは、本来の遺伝子または同種の遺伝子とは異な る遺伝子である。プロモーター配列は、また、強力であるか、弱いのであるか、 または誘発できるものであると知られている。強力なプロモーターは高レベルの 遺伝子発現を提供し、弱いプロモーターは、非常に低レベルの遺伝子発現を提供 する。誘発できるプロモーターは、外在的に添加された薬剤または環境または増 殖上の剌激に応じた遺伝子発現のオンおよびオフの切り替えを提供する。プロモ ーターはまた、組織特異的または増殖上の調節を提供する。異種遺伝子のための 強力なプロモーターである単離したプロモーターは有利である。というのは、形 質転換した細胞の容易な検出および選択を可能にする遺伝子発現の十分なレベル を提供し、所望の場合、遺伝子発現の高レベルを提供するからである。 本発明の発現カセットにおけるプロモーターは、アントラニル酸シンターゼ遺 伝子からアントラニル酸シンターゼの発現を提供することができる。好ましくは 、該遺伝子は、フリーのＬ−トリプトファンによるフィードバック阻害またはト リプトファンのアミノ酸類似体による増殖阻害または、該細胞の総トリプトファ ン含有量における増加となるように発現される。該プロモーターはまた、遺伝子 発現が外在的に添加された薬剤によってオンまたはオフと切り替えられることが できるよう誘発可能である。例えば、Ｐ_tacプロモーターなどの細菌プロモータ ーは、誘発されて、形質転換された細菌細胞に添加されたイソチオプロピルガラ クトシドのレベルに依存して遺伝子発現のレベルを変化させることができる。植 物において、組織特異的な発現または増殖的に調節された遺伝子発現を提供する プロモーターと該遺伝子を組み合わせることも好ましい。 植物細胞において機能的な特定のプロモーターは、以下に限られるものではな いが、３５ＳCaＭＶプロモーター、ライスアクチンプロモーター、ユビキチンお よびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターを含む。現在、単子葉植物にお ける発現のための好ましいプロモーターは３５ＳCaＭＶである。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子は、サンブルックら（上記に引用）に記載さ れるような標準的な方法によってプロモーターと組み合わせられる。端的には、 ３５ＳCaＭＶプロモーターなどのプロモーターを含むプラスミドは、ジェファソ ン（Jefferson）、Plant Molecular Biology Reporter、５、３８７（１９８７ ）に記載されるように構築されるかまたはクローンテク・ラブ（Clontech Lab） 、パル・アルト（Pal Alto）、カリフォルニア（例えば、ｐＢＩ１２１またはｐ ＢＩ２２１）から得ることができる。典型的には、これらのプラスミドは構築さ れて該プロモーターからの下流の異なる制限酵素の特異性を有するマルチプル・ クローニング・サイトを提供する。アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝 子は、遺伝子が発現されるようにプロモーターに関して適 切な方向に挿入されることを確実にされる制限酵素を用いてプロモーターから下 流にサブクローニングされることができる。好ましいバージョンにおいて、植物 アントラニル酸シンターゼはプラスミド内で、３５Ｓ CaＭＶプロモーターに作 動可能に結合する。本発明のより好ましい態様において、トウモロコシアントラ ニル酸シンターゼ遺伝子は、プラスミド内で３５Ｓ CaＭＶプロモーターに作動 可能に結合する。一旦アントラニル酸シンターゼ遺伝子が、プロモーターに作動 可能に結合すると、そのように形成された発現カセットは、プラスミドまたは他 のベクターにサブクローニングされる。 ３．発現カセットにおける任意の配列 該発現カセットはまた、他のＤＮＡ配列を任意に含むことができる。該発現カ セットはさらに、プロモーターとアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡ 配列間に作動可能に結合したＤＮＡ配列をコードする葉緑体トランジットペプチ ドからなることができる（色素体ターゲティングペプチドの概説には、ヘイジン （Hei jne）ら、Eur．Ｊ．Biochem.、１８０、５３５（１９８９）；キーグスト ラ（Keegstra）ら、Ann．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol.、４０、４７ １（１９８９）参照）。発現カセットが、植物細胞内に導入される場合、該発現 カセットはまた、植物転写終結シグナルおよびポリアデニレーションシグナルお よび植物アントラニル酸シンターゼ遺伝子の３'末端に結合された翻訳シグナル を含むことができる。該発現カセットはまた、プラスミドＤＮＡをさらに任意に 含むことができる。 外在性葉緑体トランジットペプチドは、本来の植物アントラニル酸シンターゼ 遺伝子内でコードされないものであるが、使用することができる。葉緑体変化ペ プチドは、典型的には、長さ４０から７０アミノ酸長であり、タンパク質を葉緑 体に直接翻訳後に機能する。トランジットペプチドは葉緑体に輸送される間かま たはその直後のいずれかに開裂されて成熟タンパク質を産生する。植物アントラ ニル酸シンターゼをコードする遺伝子の完全なコピーは、葉緑体トランジットペ プチド配列を含むことができる。その場合、外在的に得られた葉緑体トランジッ トペプチド配列を発現カセット内で組み合わせる必要はない。 配列をコードする外在性葉緑体トランジットペプチドは、該遺伝子の産物がア ミノ末端変化ペプチドを含むプレタンパク質として発現され、葉緑体に輸送され る限り、多様な植物核遺伝子から得られることができる。そのようなトランジッ トペプチド配列を含むと知られる植物遺伝子産物の例は、以下に限るものではな いが、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ、フェレドキシン、クロロフィルａ ／ｂ結合タンパク質、核遺伝子によってコードされる葉緑体リボソームタンパク 質、アセト酪酸シンターゼ、３−エノールピリビンホスホシキミ酸シンターゼ、 ジヒドロジピコリン酸シンターゼなどのアミノ酸生合成酵素の小さな単位を含む 。別法として、トランジットペプチドをコードするＤＮＡ断片は、全体かまたは 上記に挙げたようなトランジットペプチドの公知の配列からの一部に化学的に合 成されることができる。 該トランジットペプチドをコードするＤＮＡ断片の源にかかわらず、宿主植物 の葉緑体により認識され、適応に機能するであろう翻訳開始コドンおよびアミノ 酸配列を含むべきである。開裂されて成熟酵素を産生する場合の変化ペプチドと アントンラニル酸シンターゼ酵素の間の接合点でアミノ酸配列に注意が向けられ る。ある保存されたアミノ酸配列は、同定され、ガイドラインとして機能するか もしれない。アントラニル酸シンターゼコーディング配列を有するトランジット ペプチドコーディング配列の正確な融合は、例えば、便利な制限部位を導入する ための１または両方のＤＮＡの操作を必要とするかもしれない。これは、部位指 令突然変異誘発、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの挿入などを含む方法 によって達成されることができる。 一旦得られると、葉緑体トランジットペプチド配列は、適切に該プロモーター および発現カセットにおけるアントラニル酸シンターゼ遺伝子に、標準的方法を 用いて結合することができる。端的には、植物細胞中で機能的なプロモーターを 含むプラスミドおよび顆粒のマルチプル・クローニング・サイトを有するプラス ミドは、ジェファソン（Jefferson）（上記に引用）に記載されるように構築さ れることができる。葉緑体トランジットペプチド配列は、制限酵素を用いて、該 プロモーターの顆粒に挿入される。ついでアントラニル酸シンターゼ遺伝子は、 葉緑体トランジットペプチド配列の３'末端で、すぐ下流で、イン・フレームに て挿入され、結果、該葉緑体トランジットは、ペプチドはアントラニルさんシン ターゼのアミノ酸末端に結合する。一旦形成されると、該発現カセットは、他の プラスミドまたはベクターにサブクローニングすることができる。 発現カセットが植物細胞中に挿入されると、発現カセットはまた、任意に３' 未翻訳植物直接ＤＮＡ配列を含むことができる。３'未翻訳植物調節ＤＮＡ配列 は、約３００から１,０００ヌクレオチド塩基対を含み、植物転写および翻訳終 結配列を含む。植物細胞中で機能的である３'未翻訳調節ＤＮＡ配列の例は、以 下に限るものではないが、エンドウマメリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小 サブユニットＥ９遺伝子の約５００塩基対、オクトピンシンターゼ遺伝子の３' フランキングＤＮＡ配列およびノパリンシンターゼ遺伝子の３'フランキングＤ ＮＡ配列が含まれる。これらの３'未翻訳調節配列は、Methods in Enzymology、 １５３、２９２（１９８７）に記載されるように得られるか、または、クローン テク、パロ・アルト、カリフォルニアなどの会社から市販されて利用できるプラ スミドに既に存在している。３'未翻訳調節配列は、標準的な方法によって、ア トラニル酸シンターゼ遺伝子の３'末端に作動可能に結合することができる。 本発明の発現カセットはまた、さらにプラスミドＤＮＡを含むことができる。 プラスミドベクターには、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵ Ｃ２３、ｐＵＣ１１９およびｐＵＣ１２０、ｐＳＫ−由来ベクター、ｐＧＥＭ− 由来ベクター、ｐＳＰ−由来ベクターまたはｐＢＳ−由来ベクターなどのような 例えば、ｐＵＣ−由来ベクターなどの、原核および真核細胞における発現カセッ トの容易な選択、増幅および形質転換を提供するさらなるＤＮＡを含む。さらな るＤＮＡ配列は、好ましくは抗生物質または除草剤耐性の、発現カセットにおい てコードされるＤＮＡ配列または遺伝子を挿入するためのマルチプル部位を提供 するためのマルチプル・クローニング・サイトおよび原核または真核細胞の形質 転換を増強する配列をコードするベクター、選択可能なマーカー遺伝子の自律複 製を提供するための複製起点を含む。 植物および原核細胞の発現に有用である他のベクターは、ベクターｐＧＡ５８ ２によって例示されるように、２つのTiプラスミド（シルパルート（Schilperoo rt）ら、米国特許第４,９４０,８３８号、１９９０年７月１０日発行に開示され るように）である。この２つのTiプラスミドベクターは、上記に引用されるもの によって以前に特徴付けられるものであり、An博士から利用可能である。この２ つのTiベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウムなどの原核細胞において複 製されることができる。該アグロバクテリウムプラスミドベクターは、発現カセ ットを植物細胞へと移動するために使用されることができる。２つのTiベクター は、有効な植物細胞形質転換、選択可能なマーカー遺伝子、Ｔ協会領域において 独特のマルチプル・クローニング・サイト、起点のcolＥ１複製および広い宿主 の範囲のレプリコンを提供するための好ましくはノパリンＴＤＮＡ右および左の ボーダーを好ましくは含む。本発明の発現カセットを運搬する２つのTiベクター は原核および真核細胞の両方を形質転換するために使用することができるが、好 ましくは植物細胞を形質転換するために使用される。 Ｇ．アントラニル酸シンターゼ遺伝子の発現のためのスクリーニング方法 アントラニル酸シンターゼ遺伝子の発現のスクリーニング方法も本発明によっ て提供される。一旦形成されると、アントラニル酸シンターゼ遺伝子を含む発現 カセットは、公知の発現ベクターにサブクローニングされることができる。本発 明のスクリーニング方法は、発現ベクターを宿主細胞に導入し、アントラニル酸 シンターゼ遺伝子の発現を検出および／または定量する工程を含む。スクリーニ ングの方法は、アントラニル酸シンターゼ遺伝子の発現、形質転換した植物細胞 の葉緑体におけるアントラニル酸シンターゼ遺伝子の発現を提供する発現カセッ トを同定するために有用である。 適切な公知の発現ベクターは、原核および／または真核細胞において自律複製 されるプラスミドを含む。具体的な例には、上記のように、ｐＵＣ、ｐＳＫ、ｐ ＧＥＭ、ｐＳＰおよびｐＢＳ−由来ベクターなどのようなプラスミドが含まれ、 ジェファソン（上記に引用）によって記載されたように構築されたｐＢＩ１２１ またはｐＢＩ２２１プラスミドまたは、アン（上記に引用）によって記載された ようにｐＧ５８２などの２つのTiプラスミドベクターなどのプラスミドが含ま れる。 本発明の発現カセットは、標準的な方法によって発現ベクターにサブクローニ ングされることができる。ついで発現ベクターは、以下に限るものではないが、 原形質の形成、アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、マ イクロプロジェクタイル・ボンバードメント、タングステン・ウィスカーズ（tu ngsten whiskers）（コーヒー（Coffee）ら、米国特許第５,３０２,５２３号、 １９９４年４月１２日発行）およびリポソームを含む現在使用可能である方法に よって原核または真核細胞に導入されることができる。トウモドコシ、タバコ、 ブラッシカ（Brassica）、メキシカン・スイート・コーンおよびアラビドプシス 細胞などの植物細胞に導入されることができる。形質転換に有用な植物細胞は、 カラス（callus）、胚、分裂組織、配偶子組織（gametic tissue）または培養さ れた懸濁細胞を含む。 該ベクターはまた、大腸菌またはアグロバクテリウムなどの原核細胞に導入さ れることができる。形質転換された細胞は、発現ベクター上にコードされる選択 可能なマーカーを典型的に用いて選択することができる。 マーカー遺伝子もまた、本発明において有用である。マーカー遺伝子はまた、 本発明において有用である。マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子を発現する細胞 に顕著な表現型を付与する遺伝子であり、従って、マーカーを持たない細胞から 区別されるような形質転換された細胞を認める。そのような遺伝子は、化学的手 段、すなわち選択的な薬剤（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用によって、 「選択」できるかまたは「スクリーニング」（例えば、Ｒ−遺伝子座の特徴）を 通して観察または試験をすることによって得られる特徴であるかいなかに依存す る。もちろん、適当なマーカー遺伝子の多くの例は、本当は当該技術分野におい ての発明の実施例に使用されることができる。 適切または選択可能な遺伝子なる語には、またその分泌が形質転換した細胞を 同定するかまたは選択する手段として検出されることができる「選択可能なマー カー」をコードする遺伝子も含む。実施例には、抗体の相互作用によって同定さ れることができる選択可能な抗原をコードするマーカーまたは触媒活性によって 検出されることができる検出可能な酵素でさえもコードするマーカーを含む。選 択可能なタンパク質は、多数のクラスにあてはまり、例えばＥＬＩＳＡなどの検 出可能な、放散可能なタンパク質を含み；および細胞壁に挿入または捕らえられ ているタンパク質である(例えば、エクステンシン(extensin)またはタバコＰＲ −Ｓの発現単位において見いだされるようなリーダー配列を含むタンパク質)。 選択可能なマーカーに関して、細胞壁においてシークエンシングされるタンパ ク質をコードする遺伝子の使用、および独特のエピトープを含むタンパク質は、 特に有利である。そのような選択された抗原マーカーは、植物組織内において低 バックグランドを提供するであろうエピトープ配列、有効な発現を付与し、プラ ズマ膜を横切って、標的化するプロモーターリーダー配列およひ細胞壁に結合し 、しかし抗体に接触可能であるタンパク質を産生するであろうエピトープ配列を 理想的には使用するであろう。 このやり方において、修飾に適しているタンパク質の一例は、エクステンシン またはヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）である。トウモコシ ＨＰＲＧ（ステイフェル（Steifel）ら、The Plant Cell、２、７８５（１９９ ０））は、この分子は、分子生物学、発現およびタンパク質の構造の点でよく特 徴付けられているので好ましい。しかしながら、多様なエクステンシンの任意の １つおよび／またはグリシンリッチウォールタンパク質（glycine-richwall pro teins）（ケーラー（Keller）ら、ＥＭＢＯＪ、８、１３０９（１９８９）はス クリーニング可能なマーカーを創造するための抗原部位の添加によって修飾され ることができる。 本開示の要素は、特定のマーカー遺伝子の使用を通して詳細に例示されるが、 しかしながら、本開示に照らし合わせると、多大な他の可能性のある選択可能な および／またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子は以下に示されるものに加 えて当業者に明らかであるであろう。それゆえ、以下の議論は、徹底的であると いうよりはむしろ例示的であることが理解されるであろう。本明細書に開示され 技術および当該技術分野において公知である一般的な組換え技術に照らし合わせ て、本発明はマーカー遺伝子を含む任意の遺伝子の形質転換された単子葉植物を 産生するための受容細胞への導入を可能にする。 本発明に関する使用のための可能性のある選択可能なマーカーは、以下に限る ものではないが、カナマイシン耐性をコードし、およびカナマイシンを用いて選 択され得るＧ４１８などのneo遺伝子（ポトリカス（Potrykus）ら、Mol.Gen.Gen et.、１９９、１８３（１９８５））；ビアラホス（bialaphos）抵抗性をコード するbar遺伝子；変化したＥＰＳＰシンターゼタンパク質をコードし（ヒンチー （Hinchee）ら、Biotech.、６、９１５（１９８８））、従ってグリホセート（g lyphosate）耐性を付与する遺伝子；ブロモキシニル（bromoxynil）に耐性を付 与するクレブシエラ・オザエナエ（Klebsiella ozaenae）からのbxnなどのニト リラーゼ（nitrilase）耐性：イミダゾリノン、スルホニルウレエアまたは他の ＡＬＳ−抑制化学物質への耐性を付与する変異アセト酪酸シンターゼ遺伝子（ac etolactate synthase gene）（ＡＬＳ）（ヨーロッパ特許出願番号第１５４,２ ０４号、１９８５）；メトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（チレ（Thillet） ら、J．Biol．Chem．２６３、１２５００（１９８８））；ヘルビシド・ダラポ ン（herbicide dalapon）への耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子； または、５−メチルトリプトファンへの耐性を付与する変異アントラニル酸シン ターゼ遺伝子が含まれる。変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子が使用される場合、さ らなる利益は、適当な葉緑体トランジットペプチド、ＣＴＰ（ヨーロッパ特許出 願番号第０,２１８,５７１号、１９８７）の導入を通して知られている。 システム内において使用可能である選択可能なマーカー遺伝子の例解的な態様 は、ストレプトマイセス・ヒグロスコピウス（Streptmyces hygroscopius）から または、ストレプトマイセス・ビリドクロモジェネス（Streptmyces viridochro mogenes）からのpat遺伝子からのbar遺伝子（米国特許出願番号第０７／５６５, ８４４号、参照のため本明細書に包含する）。酵素ホスフィノスリチンアセチル トランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、ヘルビシドビアラホス、ホスフィノスリシン （ＰＰＴ）において活性成分を不活性化する。ＰＰＴは、グルタミンシンターゼ （ムラカミ（Murakami）ら、Mol．Gen．Genet.、２０５、４２（１９８６）を抑 制する；トウェル（Twell）ら、Plant Pysiol.、９１、１２７０（１ ９８９））はアンモニアの急速な蓄積および細胞死を引き起こす。単子葉植物に 関する選択系の使用における０７／５６５，８４４出願の発明者の継続者は、穀 草の形質転換において報告されている主要な困難点のために、特に驚くべきもの であった（ポトリカス、Trends Biotech.、７、２６９（１９８９））。 使用されることができるスクリーニング可能なマーカーには、以下に限るもの ではないが、多様な色素産生基質β−グルクロニダーゼまたはuidＡ遺伝子（Ｇ ＵＳ）が知られている；Ｒ−遺伝子座遺伝子は植物組織において、アントシアニ ン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするものである（デラポルタ（De laporta）ら、Chromosome Structure and Function、２６３−２８２頁（１９８ ８）中）；β−ラクタマーゼ遺伝子（スクトクリッフェ(Sutcliffe)、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、７５、３７３７（１９７８））、多様な色素産生基質は公知であると酵 素をコードする（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素産生セファロスポリン）；色素産生 カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘ ｙｌＥ遺伝子（ズコブスキー（Zukowsky）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ、８０、１１０１ （１９８３））；α−アミラーゼ遺伝子（イクタ（Ikuta）ら、Biotech.、８.２ ４１（１９９０））；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンを今度は濃縮して 容易に検出可能な化合物メラニンを形成することができるチロシナーゼ遺伝子（ カッツ（Katz）ら、J．Gen．Microbiol.、１２９、２７０３（１９８６））、そ れは生物蛍光検出を認めている。：またはエキロリン遺伝子（プラッシャー（Pr asher）ら、Biochem．Biophys．Res．Comm、１２６、１２５９（１９８５）であ り、カルシウム感受性生物蛍光発行検出または緑蛍光タンパク質遺伝子（ニエツ ら、Plant Cell Reports、１４、４０３（１９９５））において使用されること ができる。 形質転換された細胞中でのｌux遺伝子の存在は、例えば、Ｘ−線フィルム、シ ンチレーションカウンティング、蛍光分光計測、低照明ビデオカメラ、ホトン− カウンテイングカメラ（photon-counting camera）またはマルチウェル・ルミノ メトリー（multiwell luminometry）を用いて行った。この系が、組織培養皿上 または全植物のスクリーニングのため生物発光の集団スクリーニングのために開 発されると予想される。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子の一時的な発現は、形質転換した細胞におい て検出および定量化されることができる。遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によ って、定量されることができ、クローニングされたアントラニル酸シンターゼに 特異的である抗体を用いた定量的なウエスタンブロットまたは、トリプトファン のまたはトリプトファンのアミノ酸類似体の存在下での酵素活性を検出すること によって、定量されることができる。クローニングされたアントラニル酸シンタ ーゼの組織および細胞下位置は、クローニングされたアントラニル酸シンターゼ または細胞下フラクショネーション（fractionation）および引き続く生化学的 および／または免疫学的分析を用いて免疫化学染色方法によって決定されること ができる。薬剤に対するクローニングされたアントラニル酸シンターゼの感受性 はまた評価された。アントラニル酸シンターゼまたはトリプトファンのアミノ酸 類似体またはフリーのＬ−トリプトファンによる阻害に対して耐性であるアント ラニル酸シンターゼは、ついで、単子葉植物および／または双子葉植物沿い衣細 胞を形質転換するためおよび形質転換された植物および種子を再生するために使 用されることができる。 Ｈ．トリプトファンのアミノ酸類似体に耐性を付与するおよび／または植物細胞 または組織中でのトリプトファン含有量を変化させる方法 本発明は、植物細胞または組織にトリプトファンまたはトリプトファンのアミ ノ酸類似体に耐性を付与する方法を提供する。該方法は、アントラニル酸シンタ ーゼをコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを導入する工程、そこでは、ア ントラニル酸シンターゼ内在的または本来のアントラニル酸シンターゼを阻害す る濃縮アントラニル酸類似物またはフリーのＬ−トリプトファンの存在下で酵素 的に活性である。該ＤＮＡ配列は、植物組織の細胞中にそれによってプロモータ ーに作動可能に結合し、該配列は、トリプトファンまたはその類似体に実質的に 耐性な植物組織の細胞とさせるのに有効な量において発現する。 例えば、５−ＭＴまたは６−ＭＡに体して実質的に耐性である植物組織の細胞 にさせる遺伝子発現の有効量は、約３３から３００μＭ５−ＭＴまたは６−Ｍ Ａにおける植物細胞増殖を提供する量であり、好ましくは約７２−２５０μＭ５ −ＭＴまたは６−ＭＡにおける量である。これらは本来のアントラニル酸シアー ゼを通常阻害する５−ＭＴまたは６−ＭＡの量である。該類似体に対して実質的 に耐性である細胞にさせるために有効である他のトリプトファンの量は、当該技 術分野において公知の方法によって決定されることができる。 本発明の発現カセットは以下に限るものではないが、未成熟胚（米国特許出願 番号第０８／２４９,４５８号、１９９４年５月２６日出願、参照のため本明細 書に引用する；米国特許出願番号第０８／１１２,２４５号、１９９３年８月２ ５日出願、参照のため本明細書に引用する）またはゴードン−カム（Gordon-Kam m）ら（Plant Cell、２、６０３（１９９０））、フロム（Ｍ.Ｅ.Fromm）ら（Bi o／Technology）８、８３３（１９９０））およびウォルターズ（Ｄ．Ａ.Walter s）ら（Plant Molecular Biology）１８、１８９（１９９２））またはダルイン (Ｄ'Halluin)ら（The Plant Cell、４、１４９５（１９９２））またはクリゼッ ク（Kryzek）（米国特許第５，３８４，２５３号、１９９５年１月２４日に発行 ）によって記載されたようにII型胚カラス細胞のマイクロプロジェクタイルボン バードメント、を含む単子葉植物に特に有効な形質転換法によって導入されるこ とができる。 形質転換された細胞は、選択可能なマーカー遺伝子の存在を選択することがで きる。アントラニル酸シンターゼ一時的な発現はクローニングされたアントラニ ル酸シンターゼに特異的である抗体を用いてトランスジェニック胚形成カリまた は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって検出されることができる。形質転換した胚ジェニ ックカリは形質転換したアントラニル酸シンターゼ遺伝子の安定な遺伝を示すト ランスジェニック植物を産生するために使用されることができる。トリプトファ ンのアミノ酸類似体またはフリーのＬ−トリプトファンの耐性の満足いくレベル を示しており、その植物細胞株は当該技術分野においてよく知られた方法いよっ て耐性特徴を発現する成熟植物および種子をえるための植物再生プロトコールを 経験することができる（例えば、米国特許出願番号第０８／１１２,２４５号； ローゼン（Lausen）ら、Plant Mol.Biol.２４、５１（１９９４）を参照)。該 植物再生プロトコールは、体細胞胚の増殖および、根および新芽の引き続く増殖 を可能にする。耐性の特徴が、植物の分化器官において発現され、未分化の細胞 培養において単独ではなく、再生された植物は再生された、非形質転換植物に相 対的な植物の多様な部位において存在するトリプトファンのレベルに関してアッ セイされることができる。 本明細書において産生されたトランスジェニック植物は、多様な市販および研 究目的に関して有用であると期待される。トランスジェニック植物は、該植物か ら回収された穀物の消費者に有利である特徴を所有するための伝統的農業におけ る使用に関して製造されることができる（例えば、ヒト食物または動物の餌にお ける改良された栄養物）。そのような使用において、該植物は、一般的にヒトま たは動物の食物におけるその穀物の使用に関して増殖される。しかしながら、茎 、さや、皮の部分などを含む植物の他の部分もまた動物貯蔵生牧草の部分として の使用を含むか、または装飾的目的を含む利用を有することができるかもしれな い。 トランスジェニック植物はまた、タンパク質または他の分子の装飾的市販製造 においての使用が見いだされるかもしれず、そこでは、関心のある分子は植物の 一部、種子などから抽出または生成されるものである。該植物からの細胞または 組織は、培養されるかもしれず、イン・ビトロで増殖され、またはそのような分 子を製造するために発酵されるかもしれない。 トランスジェニック植物はまた、市販の交配プログラムにおいて使用されるこ とができ、または関連穀物種の植物に交雑または交配させることができる。組換 えＤＮＡによってコードされる改良点は、例えば、トウモロコシ細胞を他の種の 細胞へ、例えば、プロトプラストの融合によって移されることができる。 再生植物は、自己受粉する。再生した植物から得られた花粉は、農業経済的に 重要な交配株の種子が増殖した植物に交雑され、再生した植物を自己受粉する。 逆に、これらの交配した株の植物からの花粉は、使用されて再生した植物を授粉 する。その特徴の遺伝学は、ついで、第一世代および最後の世代の子孫において 特徴の分離を評価することによって特徴付けられる。 再生した植物は繰り返し交雑した、交配したトウモロコシ植物であり、外在的 に導入されたまたは前以て選択されたアントラニル酸シンターゼ遺伝子を交配し たトウモロコシ子孫の特徴の分離を評価する。このプロセスは、戻し交雑変換と いう。繰り返し交配する親に交雑するのに十分な数が、導入されたトランス遺伝 子の存在を除いて交配した親の再生と実質的に同一遺伝子である戻し交雑変換プ ロセスの産物を産生する場合、該植物は少なくとも１度自己授粉し、前以て選択 されたトランス遺伝子を含む同種遺伝子の戻し交雑変換を産生する。これらの植 物の子孫はトリプトファン類似体耐性および戻し交雑変換した交配のトリプトフ ァンの濃縮が再生親交配と比較される。 かわりに、形質転換した組織培養から再生した形質転換された単子葉植物から の種子は、野原で増殖し、自己授粉して、真の交雑植物を産生する。これらの植 物からの子孫は、環境条件の範囲のもとで、野原においてアミノ酸類似体耐性ト リプトファンに関して評価される真の交雑植物である。トリプトファンアミノ酸 類似体耐性は、最も活性であるアミノ酸類似体を引き起こす野原の条件下で運搬 速度が催促である単子葉植物を保護するのに十分でなければならない。これらの 薬剤の適切な濃縮および応用の方法の決定は当該技術分野においてよく知られて いる。 好ましいバージョンにおいて、５−ＭＴに耐性のトウモロコシ細胞株から単離 され、３５Ｓ CaＭＶプロモーターに結合したトウモロコシアントラニル酸シン ターゼ遺伝子発現カセットは、バイオリスティック形質転換（biolistic）を用 いて５−ＭＴ感受性単子葉組織に導入される。形質転換されたカリは、選択され 、使用されたトランスジェニック植物を産生する。形質転換されたカリおよびト ランスジェニック植物は、５−ＭＴまたは６−ＭＡに耐性であると評価され、そ の耐性の特徴の安定な遺伝に関して評価される。 本発明はまた、植物細胞または組織においてトリプトファン含有量を変化させ る方法を提供する。該方法は、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファ ンのアミノ酸類似体による阻害に耐性であるアントラニル酸シンターゼをコード するＤＮＡ配列を含む発現カセットに導入し、植物細胞において機能的であるプ ロモーターに作動可能に結合し、植物細胞のトリプトファン含有量を変化させカ ラスるのに有効である量において遺伝子を発現する。植物細胞のトリプトファン 含有量における変化は、発現カセットで形質転換された植物細胞の型において通 常存在する総トリプトファン含有量における変化を含むことができる。アントラ ニル酸シンターゼ遺伝子の発現は、植物細胞中に通常存在する約１.１−５０倍 を越えるまでの細胞のトリプトファン含有量において変化を提供し、および好ま しくは、植物細胞において通常存在する約２から２０倍を越えるトリプトファン 含有量の量を増加させる。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子の発現を提供するため、該遺伝子は３５ＳCa ＭＶプロモーターなどの植物細胞における遺伝子発現の高レベルを提供するプロ モーターと組み合わせられることができる。 上記の発現カセットは単子葉植物または双子葉植物に導入されることができる 。発現カセットはプロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム媒介形質転換、 マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント、エレクトロポレーションなどを 含む標準的な方法によって導入されることができる。形質転換された細胞または 組織は、選択可能なマーカー遺伝子の存在を選択することができる。 アントラニル酸シンターゼ遺伝子の一時的な発現は、アントラニル酸シンター ゼに特異的である抗体での免疫応答によって形質転換された細胞または組織にお いて検出されることができる。安定なアントラニル酸シンターゼは、定量的なウ ェスタンブロットによって検出されることができる。トリプトファンまたはその 類似体の阻害量の存在下における該酵素の特異的な活性における変化はウィドホ ルム、Biochemica et Biophysica Acta、２７９、４８（１９７２）に記載され るように形質転換した細胞における酵素活性を測定することによって検出される ことができる。総トリプトファン含有量における変化はまた、ジョンズ（Jones ）ら、Analyst、１０６、９６８（１９８１）によって記載されるような標準的 な方法によって試験されることができる。 トランスジェニック植物および種子は形質転換した細胞およびトリプトファン 含有量における変化を示す組織または標準的な方法を用いてトリプトファン類似 体に抵抗性である組織から産生されることができる。葉、種子または果実のトリ プトファン含有量が増加されるのが特に好ましい。 Ｉ．アントラニル酸シンターゼの導入および産生方法 本発明はまた、アントラニル酸シンターゼを宿主細胞に導入および産生する方 法を提供する。該方法には、アントラニル酸シンターゼをコードする遺伝子を含 む発現カセットを宿主に導入し、ついで、発現カセットおよび／または該遺伝子 を発現する細胞を同定する工程を含む。 発現カセットは原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて機能的で あるプロモーターを含むことができる。該発現カセットは、大腸菌などの原核生 物細胞または植物または酵母などの真核生物細胞に導入されることができる。好 ましい細胞は大腸菌などの組換えタンパク質を日常的に産生するのに使用される 原核細胞である。原核細胞または真核細胞で形質転換した細胞は、標準的な方法 によって選択されることができる。 アントラニル酸シンターゼは、例えば、サンブルックら、モレキュラー・クロ ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（１９８９）などの標準的な方法を用 いて、細菌細胞から単離されることができる。ついで、該精製したアントラニル 酸シンターゼは、標準的な方法によって特徴付けられる。 Ｊ．高トリプトファンとドラゴンズ種子からのトリプトファン抽出の商業上のア プローチ ついで繁殖力のあるトランスジェニック植物は、従来のトウモロコシ交配プロ グラムにおいて使用され、所望の株または変異体に導入されたＤＮＡを組み入れ る。トウモロコシの集中的な改善のための方法および参考文献は、ホーローアー （Hallauer）ら、コーン・アンド・コーン・インプルーブメント（Corn and Cor n Improvement）、スプラウグ（Sprague）編、４６３−５６４頁（１９８８）中 （参照のため本明細書に引用する）によって与えられる。従来の交配プログラム が使用するアプローチの中に変換プロセスがある（戻し交雑）。端的には、変換 は、初代のトランスジェニックの繁殖力のある植物を精鋭の交配株に交雑させる ことによって行われる。この交雑からの子孫は、植物のいくつかは組換えＤＮＡ を運搬するであろうが、またいくつかはそうではないというものを分離する であろう。ついで該ＤＮＡを運搬する植物は、再び精鋭の交配株に交雑させ、そ の結果、子孫は、再度分離するであろう。この戻し交雑工程は、もともとの精鋭 交配が組換えＤＮＡを含む株に変換されるまで、しかしすべての重要な属性が、 もともとは親において見いだされるものを所有するまで繰り返される。一般的に 、これは約６−８世代を必要とするであろう。別個の戻し交雑プログラムは、一 般的に、遺伝的に操作された精鋭株に変換されるべき各精鋭株に使用されるであ ろう。 一般的に、本明細書にて産生された形質転換したトウモロコシの商業的価値は 、多くの異なるハイブリッド組換え体に組み込まれることができるなら、最大で あろう。成熟、安定性および他の農業経済的特徴に基づくいくつかのハイブリッ ドを典型的には増殖させる。また、農業従事者はその地理的位置に基づくハイブ リッドを選択しなければならない。というのは、一領域に適応したハイブリッド は、成熟、疾患および昆虫抵抗性における差異のため他に適応している。そのよ うに、導入されたＤＮＡを多数の親株に組み入れて、所望のＤＮＡを含む多くの ハイブリッド組合せである。 トウモロコシの交配および、技術および１株または多様な株から遺伝子を移す のに必要な技能は、当業者によく知られている。従って、組換えＤＮＡを任意の 他の株または変異体に導入することが、これらの交配手法によって達成されるこ とができる。高トリプトファントウモロコシからのフリーのトリプトファンを抽 出するのに使用させることができる多数の方法が存在するが、これらの一層経済 的なものは、前以てトリプトファンを抽出することにも関連するであろうし、ま たは標準的湿ったかまたは乾燥の製粉工程にも関するであろう（ワトソン（Wats on）、コーン・アンド・コーン・インプルーブメント、スプラウグ編、Amer．So c．of Agronomy、マディソン、ウィスコンシン（１９７７））。これは製粉され た産物の価値に加えられるべき、トリプトファンの価値を認める。 湿潤製粉工程において、最初の工程のうちの１つは、酸性水溶液で穀粒を処理 することに関係し、酪酸発酵が起こる制限量をみとめる。この処理は、穀粒を条 件付けかつ柔らかくし、ついで、フリーのアミノ酸を含む穀粒における多数の症 分子を可溶化する。しかしながらこの酸性の環境はたいていの可溶化トリプトフ ァンの崩壊となる。従って、大量のトリプトファンを得るため、酸処理工程以前 にトリプトファンを抽出するのは好ましい。この前以て抽出した工程を行うのに 使用させることができる方法は以下に記載する。 トウモロコシ種子は、水溶液環境において、塩基性／中性ｐＨ（ｐＨ≦１０） で上昇された温度（約１５０°F）のバット系列において処理されることができ る。その後数日間抽出して、ついで該トウモロコシを標準的な湿潤製粉植物にト ランスファーする。ついで、抽出工程からの液体を濾過し、固体を除去し、つい で標準的な科学的手段によって処理し、溶媒抽出／相分離、イオン交換クロマト グラフィーおよび結晶化、トリプトファンの濃縮および精製を行うことができる 。精製の程度は、食物の供給、化学的食物貯蔵、化学的薬剤などの所望の産物の 型に依存するであろう。 乾燥製粉工程において、トウモロコシ穀粒を浄化し、湿度２０−２２％にまで し、ついで、製粉し、圧し、ついで分類して多様な断片を得る…ヒキワリトウモ ロコシ食料、フレーキング、中間および細かいヒキワリトウモロコシ、ひきわり 粉および小麦粉。これらの断片の１またはそれ以上を中性から塩基性条件の水で 、高温で抽出して、トリプトファンを得る。ついで再度、該トリプトファンを濃 縮し、溶媒抽出／相分離、イオン交換クロマトグフィーおよび結晶化を含む標準 的な化学的方法によって精製することができる。 トリプトファンはまた他の従来手法によって回収されることができる。例えば 、回収の方法は、米国特許第３,７５９,７９０号（参照のため、本明細書に引用 する）に示されている。 実施例 １ トウモロコシアントラニル酸シンターゼαおよびβサブユニットをコードする遺 伝子に対応する組換えＤＮＡクローンの同定 アントラニル酸シンターゼのαサブユニットをコードするトウモロコシ遺伝子 に対応するクローンを得るため、アラビドプシスＡＳＡ２遺伝子配列（ジーンバ ンク（GenBank）受託番号第Ｍ９２３５４）に対応する遺伝子特異的なオリゴ ヌクレオチドプライマーはマラビドプシスのエクソン１０から１１の領域のＰＣ Ｒ増幅を認めるよう設計された。アラビドプシスアントラニル酸シンターゼのα サブユニットのエクソン１０および１１はニヨギ（Niyogi）およびフィンク（Fi nk）（上記）によって定義されている。これらのプライマーはＡＳＡ２−Ｃと名 付けられた および ASA2-D は、以下の条件下でのアラビドプシスのＰＣＲ増幅において使用された：０.５ μｇのＤＮＡを各０.５μＭのプライマーＡＳＡ２−ＣおよびＡＳＡ２−Ｄ、各 ２００ｐＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｃＧＴＰおよびｃＴＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭのTris-ＨＣｌ（ｐＨ８.３）および２.５ＵのＴ ａｑＤＮＡポリメラーゼを含む反応液中で鋳型として使用する。温度周期条件は 、以下のとおりである：最初の変性は、９７℃で２分間；９７℃で１分間、５３ ℃で１分間ついで７２℃で１分間を３回；９４℃で１分間、５３℃で１分間つい で７２℃で１分間を３３回；最終伸展は、７２℃で４分間である。１０７３塩基 対のＰＣＲ産生増幅産物は、NcoＩで開裂され、２つの断片６８５断片および３ ５２塩基対である遺伝子、アラビドプシスＡＳＡ２のエクソン１１、Ｍ９２３５ ４配列の５３６２から５７１４位置において対応する。この断片はよく精製され ており、授粉後２７日で、トウモロコシの胚（交配株Ｖａ２６）から得られたｍ ＲＮＡｓに対応するラムダザップ（Lamda ＺＡＰ（ストラタジーン、ラ・ジョラ 、カリフォルニア））クローニングベクターにおいて構築されるｃＤＮＡライブ ラリーをスクリーニングするために放射線標識したプローブとして使用されるる （ベランガー（Belanger）およびクリツ（Kriz）、Plant Physiol.、９１、６３ ６（１９８９））。 そのライブラリーの最初のスクリーニングは、低いストリンジェンシーのハイ ブリダィゼーション条件（４２℃、６×ＳＳＣ、１×Denhardt's solution ０. １％ＳＤＳ、１０μｇ／ｍｌ超音波処理したウシ胸腺ＤＮＡ）下で行った。フィ ルターを室温で６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、で洗浄し、ついで１×ＳＳＣ、０. １％ＳＤＳ、ついで最終的には６０℃で１×ＳＳＣで洗浄してもよい。プラーク 精製を目的とするスクリーニングの次のラウンドは、ハイブリダイゼーション工 程で４８℃が使用される以外は、同様のやり方で行われた。総量５つの推定アン トラニル酸シンターゼｃＤＮＡクローンが、スクリーニングプロトコールによっ て同定されている。 これらの各クローンは、ベクター特異的プライマーおよび標準的プロトコール （サンブルックら、（上記）を参照）を用いて、ヌクレオチド配列の分析の制限 量にかけた。これらのヌクレオチド配列は、クローンのうちの４つ（ｐｃＡＳＡ ２ １−１、２−１、４−１および５−３）が配列において同一であり、その他 の１つ（pcＡＳＡ２ ３−１）は他に類似ではあるが、同一ではない。これらの 結果は２つの顕著な遺伝子に対応するｃＤＮＡクローンはアラピドプシスアント ラニル酸シンターゼ遺伝子配列由来のプローブでそのライブラリーをスクリーニ ングすることによって得られる。これらのクローンの遺伝子配列とアラビドプシ スアントラニル酸シンターゼ遺伝子（GenBank Ｍ９２３５４およびＭ９２３５５ ）の配列と比較すると、トウモロコシとアラビドプシス配列間の類似性が明らか である。 トウモロコシアントラニル酸シンターゼαサブユニットに対応するゲノムクロ ーンを得るため、トウモロコシ交配株Ｂ７３からの核ＤＮＡの部分的消化によっ て産生されたＤＮＡ断片のライブラリーは、標準的プロトコールを用いてＥＭＢ Ｌ３ラムダクローニングベクター中に構築される。このライブラリーは、クロー ンｐｃＡＳＡ２２−１（図１）から得られた３５１塩基対のBan９１Ｉ断片から なる放射線標識されたプローブでスクリーニングされた。ハイブリダイゼーショ ンは６８℃で、６×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、１×Denhardt's solutionおよび１ ０μｇ／ｍｌ超音波処理したSalmon sperm ＤＮＡ溶液中で一夜行った。フィル ターの洗浄は、６８℃で２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳにて行った。単一のラムダ クローンを分析のために選択した。このクローンからのＤＮＡは、多様な制限酵 素で消化すること洗浄し、ついでｐｃＡＳＡ２ ２−１（図１）の５'領域から の４４０塩基対のSalI/EcoRI断片がプローブとして使用するサザンブロット分析 を行った。この分析は、５.９キロ塩基対のEcoRＩ断片を同定し、それはプラス ミドベクターｐＢＳＫ（ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリフォルニア）に続い てクローニングされた。このクローンは、ｐＤＰＧ６６８と名付けられた。 β−サブユニットアントラニル酸シンターゼに対応するｃＤＮＡクローンを得 るため、長さ４０塩基のオリゴヌクレオチド（ＡＳＢ−１、 配列番号：７）を、ＭＺＥＯＲＦＨ（GenBank Ｍ９５０６７）配列に合致するよ う設計した。ＭＺＥＯＲＦＨ配列は、アラビドプシスＡＳＢ１遺伝子（GenＢank Ｌ２２５８５；ニヨギら、Plant Cell、５、１０１１（１９９３））に類似の 配列を示すと示されているランダムに単離されたトウモロコシｃＤＮＡに対応す る。そのＡＳＢ−１オリゴヌクレオチドは、製造者（ＢＲＬ）によって推薦され るようなポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐ−ＡＴＰでエンドラベリングし た。プローブとして放射線標識したＡＳＢ−１ラムダＺＡＰベクター中のトウモ ロコシ胚ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、アントラニル酸シンターゼ のαサブユニットに対応するゲノムクローンの単離に関して記載されるように行 った。１つのクローン、ｐｃＡＳＢ１−４と名付けられているが、スクリーニン グプロトコールによって得られる。配列情報の制限された量が、ベクター特異的 プライマーを用いたクローンの末端から得られた。内部ヌクレオチド配列は、９ ３ヌクレオチド（GenBank Ｌ２２５８５）（配列番号：８、図６）を越える領域 のアラピドプシスＡＳＢ１遺伝子配列に７１％の配列の同一性を示すＡＳＢ１− ４クローンを得た。 実施例 ２ トウモロコシにおける５−ＭＴ抵抗性特徴およびアントラニル酸シンターゼ配列 をコードする遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列の遺伝的マッピング トウモロコシ株Ｃ２８に存在する５−ＭＴ抵抗性特徴は、ワックス相互転座（ waxy reciprocal translocation）を用いた染色体１の短腕に位置する。５−Ｍ Ｔ抵抗性の特徴に相同であるＣ２８植物は、Maize Genetics Stock Center、 Urbana、イリノイから得られたワックス転座貯蔵の系列によって交雑される。 これらの交雑からのＦ１植物は、引き続き、同種のワックステスターの在庫に交 雑させ、このテスト交雑からの子孫は、日常的なヨード染色手法を用いてデンプ ン［Ｗｘ／（？）］およびワックス［ｗｘ／ｗｘ］の穀粒に分けた。各クラスの 穀粒を引き続きヒバード（Hibberd）ら、米国特許第４,５８１,８４７号におて 記載されるように５−メチルトリプトファン抵抗性に関しての根の増殖バイオア ッセイにかけた。５−ＭＴ抵抗性の特徴およびＷｘ間の結合は、ｗｘストックＴ １−９ｃに関する最初の交雑から得られた子孫において観察された：分析した９ １のＷｘ穀粒のうち、７７は５−ＭＴに抵抗性であり、１４は５−ＭＴに感受性 であった；分析した１０４のｗｘ／ｗｘ穀粒のうち、２８は５−ＭＴに抵抗性で あり、７６は５−ＭＴに感受性であった。 染色体１の短腕上のマーカーへの結合は、テスター在庫（ｓｒ／１／ｓｒ１ｚ ｂ４／ｚｂ４Ｐ１-ＷＷ）を５−ＭＴ抵抗性およびテスター在庫に５−ＭＴ抵抗 性に戻るＦ１子孫のテスト交雑を引き続き行い、それ関して相同であるＣ２８株 に交雑させることによって確立された。その結果の子孫を５−ＭＴ抵抗性および 縞のついた葉の存在に関して評価された。試験した１３４個体のうち６１が５− ＭＴ抵抗性と分類され；５−ＭＴ抵抗性で縞ありは分類され；５−ＭＴ感受性の ９は、正常な葉および５−ＭＴ感受性のうちの５７は縞の葉であった。 これのデータは、Ｃ２８変異によって定義された５−ＭＴ遺伝子座が染色体１の 短腕上のｓｒ１遺伝子座から約１２センチモルガン（cm）である。 トウモロコシアントラニル酸シンターゼｃＤＮＡクローンに対応する遺伝子の オマップの位置は、Ｃ２８変異によって定義された５−Ｍｔｒ遺伝子座の近くの 任意のこれらの遺伝子座マップが、定義されるか否かを確実にするよう決定され る。 ３つのＡＳＡ２ｃＤＮＡクローン（ＡＳＡ２１−１、ＡＳＡ２２−１およびＡＳ Ａ２ ３−１）に特異的である３つの異なるプローブおよびｐｃＡＳＢ１−４ク ローンは、トウモロコシ遺伝子マップ上の遺伝子の位置を促進するために開発さ れたトウモロコシ植物の密度をマップする交配組換えをマッピングされる（バ ール（Burr）ら、Genetics、１１８、５１９（１９８８））。その結果は以下で ある。 a位置とは、１９９４RIマップ上にマッピングされたように短 腕上の最初のプローブからの染色体番号、腕およびマッピング 単位をいう（Maize Genetics Newsletter，68，198(1994))。 これらのデータはｐｃＡＳＡ２ ２−１およびｐｃＡＳＡ２ １−１マップはＴ s２遺伝子座より１２ｃｍ遠位であり、染色体１の短腕にマップする遺伝子座を 示している。ｓｒ１およびＴｓ２は、形態上のマップ上に２４単位によって分離 されるので、そのゲノムのこの領域においてアントラニル酸シンターゼ配列の遺 伝子座は、５−ＭＴ特徴の位置特徴一致する。さらに、ｐｃＡＳＡ２２−１およ びｐｃＡＳＡ２ １−１クローンのヌクレオチド配列は、これらの２つのクロー ンは配列において同一である遺伝子、トウモロコシゲノムの同一の領域から由来 するので、アントラニル酸シンターゼ遺伝子に対応するこれらの２つのクローン およびＣ２８変異によって定義された５−ＭＴ遺伝子座に対応するものであると 結論する。他の２つの染色体腕上にｐｃＡＳＡ２ ３−１およびｐｃＡＳｂ１− ４は４つの他の染色体腕における遺伝子座にマッピングされる。これらの後の２ つのクローンは、それゆえ、Ｃ２８株において修飾される遺伝子座には対応しな い。 実施例 ３ アントラニル酸シンターゼαサブユニットをコードするトウモロコシ遺伝子に対 応するＤＮＡ配列の特徴付け 最初に分析された領域に同一の配列を示している４つのクローンのうち（pcＡ ＳＡ２ １−１、２−１、４−１、５−３）ｐｃＡＳＡ２ ２−１を該クローンの 分析をマッピングする制限酵素による最も長いクローンであると決定された。従 って、ｐｃＡＳＡ２ ２−１をさらなる分析に関して選択した。ｐｃＡＳＡ２ ２ −１クローンにおいて含まれるトウモロコシｃＤＮＡの全ヌクレオチド配列は、 以下にｐＤＰＧ６００と名付けられ、シークエナーゼ・システム（ＵＳＢ、グリ ーブランド、オハイオ）を用いた標準的手法を用いて決定された。配列分析をク ローニングベクターｐＢＳＫに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて 行い、ｃＤＮＡ断片の末端からの配列情報を得て、ついで図１において示される ＥcoRVで末端点でpBSKにおいてクローニングされるpcASA2 2-1から産生される サブクローンからの内部配列常法に基づく内部配列に関する特異的なプライマー を得る。ベクター特異的プライマーの使用を通して得られた配列情報は、ｐＤＰ Ｇ６００ヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーの使用によっ て伸展され、ついで両方の方向においてクローンの長さを通して「走らせる」。 配列分析およびオリゴヌクレオチドプライマー設計を、それぞれGene Works（In tellegenetics,Inc．、マウンテンビュー、カリフォルニア）およびオリゴ（ナ ショナル・バイオサイエンスィズ、プリマス、ミネソタ）ソフトウェアプログラ ムを用いて行われる。 ＡＳＡ２転写の５'末端を、標準的な反応条件（サンブルックら、モレキュラ ー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（１９８９））下で、標識し たデオキシヌクレオチド三リン酸の存在下で、鋳型として開発しつつあるトウモ ロコシ胚から単離されたＲＮＡを用いてオリゴヌクレオチドプライマーＰＥ−１ （配列番号：９）を伸展させるのに使用した。プライマー伸展産物とＰＥ−１プ ライマーを有するｐＤＰＧ６６８ゲノムクローンから産生されたシークエンシン グラダーとの比較は、転写の５'末端がｐＤＰＧ６００ｃＤＮＡクローンの５'末 端の上流の６５位塩基対に対応することを示す。ｃＤＮＡ配列における最初のＡ ＴＧと転写の５'末端との間には全くＡＴＧは存在せず、そのことは、ｐＤＰＧ ６００に対応するトウモロコシアントラニル酸シンターゼ転写物は、１４２ヌク レオチドの５'未翻訳領域（ＵＴＲ）を有する。 ｐＤＰＧ６００のｃＤＮＡ挿入は、長さ２０６０塩基対であり、１８４５ヌク レオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む(図２、配列番号： １)。このＯＲＦは、ｐＤＰＧ６００配列中の最初のＡＴＧを表す５'末端は、推 定分子量６７.８キロダルトンを有する６１５アミノ酸のポリペプチドに一致す る。以前の仕事は、芳香族酸の生合成に関するたいていの酵素は、プラスチド（ plastid）に限局されることを示す（ザーオ（Zhao）ら、J．Biol．Chem.２７０ 、６０８１（１９９５））。これらの生合成酵素をコードする遺伝子は核コード 遺伝子であるので、そのプラスチドに対する遺伝子産物のターゲティングはコー デング配列の５'末端での一時的なぺプチドの存在による。ｐＤＰＧ６００（配 列番号：２）によりコードされた推定ポリペプチドは、アミノ酸残基４４−４７ で推定トランジットペプチド開裂配列（ＶＫＣ▼Ｓ）を含み、それはガベル（Ｇ avel）およびフォン・ヘイン（Von Heijne）、ＦＥＢＳ Lett．２６１、４５５ （１９９０））によって記載されるように（Ｖ／Ｉ）Ｘ（Ａ／Ｃ）▼Ａの一致ト ランジットペプチド開裂シグナルと一致している。トウモロコシアントラニル酸 シンターゼ酵素のＮ−末端での実際のアミノ酸配列は、未だ決定されていない。 もしアミノ酸残基１−４６がトランジットペプチドとして機能数なら、および、 この配列が色素体に輸送される間に除去されるならば、６３.２キロダルトンの 分子量を有する５６９アミノ酸のポリペプチドが期待できるであろう。 ｐＤＰＧ６００によってコードされる成熟アントラニル酸シンターゼαサブユ ニットの大きさの決定のため、ポリクローナル抗体はｐＤＰＧ６００ ｃＤＮＡ 配列によってコードされるポリペプチドの一部に産生される。EcoRＶ／XbaＩ制 限断片はｐＤＰＧ６００配列の１０９３から２０１７部分のヌクレオチドに対応 し、そのベクターのマルチプル・クローニング・サイトにおける認識部位を有す る制限酵素StuＩおよびXbaＩで開裂されるpProEx−１（ＢＲＬ）タンパク 質発現ベクターに挿入される。EcoＲＶおよびStuＩの両者は平滑末端を産生する 。これは６×His tag配列を含むpProEx−１の３'ｐＤＰＧ６００の３４４から６ １５のコドンを含むクローンとなる。このクローンは、ｐＤＰＧ６００配列の３ '終結コドンを含み、および１０３塩基対ＵＴＲを含む。このクローンはＤＨα ５に形質転換される。組換え融合タンパク質の発現は、０.６ｍＮのイソプロピ ル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼによって誘発される。組換え融合タンパク質 における６×His tagの存在は、製造者であるＢＲＬによって推薦されたように （デベリ（Dobeli）ら、米国特許第５,２８４,９３３号、１９９４年２月８日発 行、参照のため本明細書に引用する）ニッケルニトリロ−トリ−酢酸樹脂を用い て組換え融合タンパク質のアフィニティー精製を認める。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって約９５％の純度であると推定される３３.５kD 組換え融合タンパク質の総７.８ｍｇが得られた。このタンパク質の総４ｍｇは 、ウサギポリクローナル抗体の製造のため、ＨＴＩ Bio Prodcts，Inc.（ラモ ナ（Ramona，California）に提供される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるトウモロコシ タンパク質抽出物の分析およびポリクローナルウサギ結成による免疫ブロッティ ングは、これらの抽出物における６３ｋＤポリペプチドの存在を明らかにする。 このデータは成熟トウモロコシアントラニル酸シンターゼ酵素は、ｃａ.４キロ ダルトントランジットペプチド配列の開裂と一致する分子量を有することが強く 示唆されている。 ｐＤＰＧ６００ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列はアントラニル 酸シンターゼ、特にアラビドプシスのアントラニル酸シンターゼ（図３）をコー ドする他の単離された遺伝子の配列に有意なホモロジーの量を示す。トウモロコ シアントラニル酸シンターゼは推定アミノ酸配列は、ＡＳＡ１（配列番号：３） およびＡＳＡ２（配列番号：４）によってコードされるアラビドプシスアントラ ニル酸シンターゼαサブユニットの各々に６３％の同一性を示す。図３に示すよ うに、トウモロコシおよびアラビドプシスＡＳＡ２配列の間の類似性は、ｐＤＰ Ｇ６００推定アミノ酸配列におけるアミノ酸位１０１の後で明らかである。これ らの類似性は、ｐＤＰＧ６００は明らかにアラビドプシスアントラニル酸シンタ ーゼ遺伝子ＡＳＡ２のトウモロコシホモログに対応することを示唆している。 実施例 ４ ５−ＭＴ抵抗性特徴に同種であるトウモロコシ植物から得たアントラニル酸シン ターゼｃＤＮＡ配列における一塩基対差異の同定 上記のように、５−ＭＴ抵抗性の特徴がそうであるように、ゲノムの同領域に 対するｐＤＰＧ６００マップにより代表されるトウモロコシアントラニル酸シン ターゼ遺伝子は、トリプトファンフィードバック阻害に関して減少した感受性に 導かれるＣ２８細胞株におけるｋｏの遺伝子の修飾を強く示唆している。TrpE遺 伝子（カリギウリ（Caligiuri）およびボーレル（Baurele）、Ｊ．Biol.Chem． 、２６６、８３２８（１９９１））によってコードされたサブユニットにおける Ｓ．tryphuriumアントラニル酸シンターゼ変異の分析は、フィードバック阻害に 関するアントラニル酸シンターゼポリペプチドの２つの領域を同定する。これら の変異ポリペプチドのたいていは、基質または触媒活性における変化が全くない トリプトファンに関する減少したアフィニティーを示すが、TrpEの１８アミノ酸 領域は、トリプトファン調節に関して重要であるものを同定する。この領域は、 ５−ＭＴ抵抗性植物からのアントラニル酸シンターゼ配列の分析に関して選択さ れる。 ｐＤＰＧ６００からのヌクレオチド配列情報は、Ａ２１−８（配列番号：１０ ）およびＡ２１−９（配列番号：１１）などのプライマーのセットを設計するた めに使用され、TrpE変異分析によって同定された１８アミノ酸領域を含む遺伝子 の有意な一部を増幅する。これらのプライマーは、５−ＭＴ抵抗性植物（葉、増 殖途中の胚、増殖途中の内胚乳、発芽胚（germinating embryo））から得られた ＲＮＡの逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイにおいて使用される。Ｒ Ｔ−ＰＣＲアッセイは以下のとおりに、GeneAmp ＲＮＡ ＰＣＲ Kit中のパーキ ン−エルマー・セタス（Perkin-Elmer Cetus）によって提供される試薬を用いて 行う：ＲＮＡ１μｇを、１ｍＭの各dＡＴＰ、dＣＴＰ、cＧＴＰおよびdＴＴＰ、 ５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭTris-ＨＣｌ(ｐＨ８.３)、５ ０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素および２.５μＭのオリゴｄ（Ｔ）₁₆を含む２０μ l逆転写反応にかける。４２℃で１５分間で反応を行い、のち９９℃で５分間行 う。ついで、０.２５μＭのＡ２１−８およびＡ２１−９の各プライマー、各２ ００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのTris-ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、２.５ＵのTaq Ｄ ＮＡポリメラーゼを含む１００μｌの反応液中でＰＣＲにかける。反応はＭＪRe search thermal cycler(モデルＰＣＴ−１００)中の９６穴プレートブロックを 有するマイクロタイタープレートのウエル内で反応する。温度周期の条件は以下 の通りである：９７℃で２分間で最初の変性；９７℃で１分間、５６℃で１分間 ついで７２℃で１分間で３サイクル；９４℃で１分間、５６℃で１分間ついで７ ２℃で１分間で３３サイクル；ついで最終的な伸展を７２℃で４分間行う。アッ セイされたすべてのサンプルはｐＤＰＧ６００配列から推定されるように７００ 塩基対の期待されるバンドを産生する。 プラスミドベクターにこれらの配列を挿入するため、「ＴＡ」クローニング技 術、それはＰＣＲ増幅の間に使用されたTaqポリメラーゼが増幅産物の５’末端 （ホルトン（Holton）およびグラハム（Graham）、ＮＡＲ、１９、１１５６（１ ９９１））に１つのｄＡ残基を添加するという事実を利用するものであるが、こ れを使用した。プラスミドベクタ−ｐＢＳＫをEcoRＶで開裂して平滑末端を産生 し、引き続き末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼの活性により得られ た３’に１つのｄＴ残基を添加することによって修飾される。ＲＴ−ＰＣＲ産物 のＴ末尾（Ｔ−tailed）ベクターへのライゲーションは、増殖産物における５' Ａオーバーハングとベクター上の３'Ｔオーバーハングを達成し、Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼの活性との関連により達成される。ライゲーション反応は、競合細菌を形 質転換するのに使用される。ついで、個々の細菌クローンからのＤＮＡは、配列 分析にかけられ、５−ＭＴ抵抗性に関する残基に対応する領域を試験する。４つ のクローン両鎖は、各々が、異なるＲＮＡ源であり、シークエンシングされる。 これらのクローンの各々（葉から、２４ＤＡＰ内胚乳、２４ＤＡＰ胚、または同 種Ｃ２８植物からの発芽胚）は配列において同一であり、これら４つのクローン の各々はｐＤＰＧ６００配列における１１９４位に対応する単一塩基置換（Ｔか らＡへ）を含む。このヌクレオチド置換は、開始メチオニンコドンに相対的に、 コドン３７７位で、メチオニンからリジンへの置換となる。この残基は、Ｓ．ty phimrium TrpE変異分析によるフィードバックシステムにおいて関係するもので ある。TrpE遺伝子における他の残基は、図３でトウモロコシおよびアラビドプシ スの配列において示唆されるように、トリプトファンフィードバック調節に関係 する。これらの他の残基でのアミノ酸の置換はまた、アントラニル酸シンターゼ のトリプトファンフィードバック感受性の修飾となるであろう。 コドン３７７でのメチオニンからリジンへの置換を有するトウモロコシアント ラニル酸シンターゼをコードする全タンパク質を含むｃＤＮＡクローンを産生す るため、５−ＭＴ抵抗性対立遺伝子を持つＲＴ−ＰＣＲ増幅クローン（pcＡＳＡ ２ｍ４）の内の１つからの領域は野生型pcＡＳＡ２ １−１クローンの対応領域 と置換される。これはｐＤＰＧ６００およびｐｃＡＳＡ２ｍ４の両方を開裂する ことによって達成され、Ｃ２８変異（配列番号：１２）を有するNsiIとVan９１ Ｉの制限酵素で開裂して４０３塩基対のNsiI／Van９１Ｉ断片および351塩基対の Van９１断片およびｐＢＳＫベクターに融合した第２のVan９１Ｉ部位から３’領 域上流であった。ｐｃＡＳＡ２ｍ４からの４０３塩基対のNsiＩ／Van９１Ｉ断片 は単離され、ついでpＤＰＧ６００からの３５１塩基対のVan９１I断片および４ ２５８塩基対のNsiＩ／Van９１Ｉ断片をも含む３方向のライゲーション反応にお いて使用された。ｐＤＰＧ６００の２つのVan９１Ｉ認識部位内の５つの残基は 互いに異なるため、そのような３方向のライゲーションから得られるであろう組 換えＤＮＡ分子のみがVan９１Ｉ部位内でのもともとの配列を構築するものであ る。この３方向のライゲーションから得られた１０クローンを選択し、ついでNs iＩ部位および２つのVan９１Ｉの存在をスクリーニングした。 すべての１０クローンがこれらの部位を各々含む。オリゴヌクレオチドプライマ ーＡ２１−８（配列番号：１０）で核配列に関して２つのクローンが選択され、 両方のクローンが、１９４位でＴからＡへの置換を含むとわかった。これは全長 アントラニル酸シンターゼｃＤＮＡクローンに対応する組換えＤＮＡクローンを 確認するが、しかし、３７７位においてメチオニンからリジンコドンへと変化さ せる。このクローンは、ｐＤＰＧ６０２と名付けられた。 実施例 ５ 修飾したアントラニル酸シンターゼ配列を含むトウモロコシトランスフォーマン トの産生および同定 ｐＤＰＧ６０２からのアントラニル酸シンターゼ配列をこの修飾したアントニ ル酸シンターゼ配列の発現が５−ＭＴまたは６−ＭＡ抵抗性および／またはトリ プトファン過剰産生特徴をトウモロコシ細胞培養に付与することができるか否か を決定するために３５Ｓ CaＭＶプロモーターのコントロール下に置く。３５Ｓ プロモーターで構築した適切な遺伝子産物を産生するため、該プラスミドｏＤＯ Ｇ１６５をXbaＩおよびKpnＩ制限酵素で開裂し、３５Ｓ CaＭＶプロモーターお よびｐＵＣ１９プラスミド骨格に融合したTr７ターミネーターを含む断片を単離 し、pＤＰＧ６０３を産生するためにクローニングベクターpＢＳＫのマルチプル ・クローニング・サイトからの８２塩基対のXbaＩ／KpnＩ断片にライゲーション する。 ｐＤＰＧ６０２を制限酵素BamHＩおよびＣlaＩで開裂し、ｃＤＮＡ断片をフラ ンキングするマルチプル・クローニング・サイトにおいて存在する配列を開裂す る。結果の２１０７塩基対断片はｐＤＰＧ６０３のマルチプル・クローニング・ サイトに存在するBamHＩおよびＣlaＩにライゲーションして３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ ２８と名付けられた構築物を産生する。このライゲーションから得た組換えプラ スミドの方向は、修飾したアントラニル酸シンターゼｃＤＮＡ配列が３５ＳCaＭ Ｖプロモーターの３'およびTr７ターミネーター配列の５'であり、従って、修飾 したアントラニル酸シンターゼ酵素をコードする機能的な転写物が、植物細胞内 で産生されるようなこれらの２つの調節配列の転写コントロールの下に修飾した アントラニル酸シンターゼ配列をおく。類似の構築物は、ｐＤＰＧ６００からの 野生型アントラニル酸シンターゼ配列を用いて構築され、３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２ ８の産生に関して記載されるのと同様の方策を用いて調製する。野生型構築物は 、野生型アントラニル酸シンターゼ配列が、３５ＳおよびTr７配列のコントロー ル下にあるものは３５Ｓ／ＡＳＡ２と名付けられた。 ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８および３５Ｓ／ＡＳＡ２に含まれるアントラニル酸シ ンターゼ配列の発現を評価することおよび５−ＭＴまたえは６−ＭＡのトウモロ コシに対する抵抗性を付与する能力に関して、またはトリプトファン過剰産生の 特徴に関して、これらの遺伝子構築物は、形質転換実験において使用される。 これらの実験は、プラスミドｐＤＰＧ１６５（３５Ｓ／bar／Ｔｒ７）ととも に３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８または３５Ｓ／ＡＳＡ２のいずれかの同時形質転換に 関し、ビアラフォス含有培地上に形質転換の選択を認める。クロスしたＡＢ８０ （Ｒ１）×ＣＷおよびＣＷ×ＡＢ８０（Ｒ１）からの穂を授粉１０日後で収穫し 、ついで未熟胚を切り出し、ついで、培地２３６５にプレーティングし（２％ス クロース、表２での２３６６培地）プレートあたり１０胚である。たいていの胚 の長さ１.２−１．７ｍｍにわたり、１.２ｍｍより小さいものはほとんどない。 胚は単離４日後に１プレートあたり３０胚で浸透圧調節培地２３６６（表２参照 ）上に同心円状に並べられる。 約４時間後、その胚をヘリウム銃を用いて爆破された（デイビス（Davis）ら 、国際特許出願公開番号第９５／０６１２８、３月２日、１９９５）。２つのプ ラスミド組合せのうちの１つ、３５Ｓ／ＡＳＡ２＋ｐＳＰＧ１６５または３５Ｓ ／ＡＳＡＣ２８＋ｐＳＰＧ１６５を各プレートに使用して、トランスフォーマン トを得る。２日の回収時期の後、１プレートあたり８−１０胚で培地２３７７（ 表２）の上で前以て選択を開始した。培地２３７７での１５日後、その胚を選択 培地、培地２０６６（表２）または培地２０７１のいずれかに移し、１プレート １胚として胚間のクロスフィーディング（cross feeding）を排除した。トラン スフオーマントはビアラフォス選択培地上に１２週のインキュベート後同定した 。 ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８または３５Ｓ／ＡＳＡ２構築物のいずれかを運搬する それらのビアラフォス耐性トランスフォーマントおよびＰＣＲ分析によってアッ セイされた個々の培養物がある。Puregene Ｄ−５５００Ａ Kit（Gentra System s Inc.）を用いて１００−２００ｍｇのカラス組織からＤＮＡを抽出し、ついで １５０μ１のＨ₂Ｏに再懸濁した。各サンプルの５μｌはついで、０.２５μＭの 各プライマ−Ａ２１−８（配列番号：１０）およびＡ２１−９（配列番号 ：１１）、０.３ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０％グリセロール、２００μＭの各ｄＡＴ ＰｄＣＴＰｄＧＴＰcおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭのTris-HCI（ ｐＨ８.３）および１.２５ＵのTaqＤＮＡポリメラーゼを含む最終容量５０μｌ 中でＰＣＲにかける。反応は９６ウェルプレートブロックでＭＪリサーチ・サー マル・サイクラー（モデルＰＣＴ−１００）中のマイクロタイタープレートのウ ェル中で行った。サーマル／サイクリング条件は、以下の通りである：９７℃で ２分間で最初の変性;９７℃で１分間、５６℃で１分間ついで７２℃で１分間で ３サイクル;９４℃で４５秒間、５６℃で４５秒間ついで７２℃で４５秒間で３ ３サイクル;ついで最終的な伸展を７２℃で４分間行う。反応産物を７００塩基 対産物の存在に関してアガロースゲル電気泳動によって分析された。 Ｎ６培地は、チュ（Chu）ら、Scientia Sinica、１８、６５９（１９７５）。 実施例 ６ ５−メチルトリプトファン抵抗性およびトリプトファン過剰産生に関する３５Ｓ ／ＡＳＡ２Ｃ２８の遺伝子構築物を含むトウモロコシトランスフォーマントの分 析 １５の３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８およびｐＤＰＧ１６５でのトランスフォーマン トまたはｐＤＰＧ１６５単独でのトランスフォーマントの総量はビアラフォス含 有培地上で選択され、７つが３３μＭまたは１００μＭの濃度で５−ＭＴ−補足 した培地上で４週間後激しい増殖を示した。サンプルを恣意的な目盛りを用いて 測定され、「０」の割合は、１００μＭの５−ＭＴ培地上で増殖がほとんどない かまたは全く増殖がなく、「１」は、１００μＭの５−ＭＴ培地上でコントロー ル培地ほどではないがいくぶん増殖があり、「２」はコントロールおよび１００ μＭ５−ＭＴ培地の間の増殖において全く差異がないことを示している。５つの コントロールは１００μＭ５−ＭＴ培地上でほとんど増殖がないかまたは全く増 殖がないことを示す。 他の実験において、２９のビアラフォス耐性トランスフォーマントの総量、３ ５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８に関してＰＣＲ陽性であった１７、３５Ｓ／ＡＳＡ２に関 してＰＣＲ陽性であった１、および全く構築物を含まない１１は１００μＭ５− ＭＴ、２００μＭ５−ＭＴ、１００μＭ６−ＭＡまたは２００μＭ６−ＭＡを補 った２０７Ｄ培地に移される。３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８構築物を運搬する５のト ランスフォーマントは試験された培地のすべてに平等によく増殖し、４つは１０ ０μＭまたは２００μＭ６−ＭＡ培地のいずれかで増殖するが、５−ＭＴのいず れかの濃度でも増殖せず、６−ＭＡの両方の濃度および２００μｍの５−ＭＴし かし１００μＭ５−ＭＴはないもの濃度両者の存在下で減少した増殖が見られた 。他の８株は５−ＭＴまたは６−ＭＡ培地いずれか上でほとんど増殖がないか、 全く増殖がなく、そのことは、それらの株においてトランス遺伝子は発現されな かった。形質転換した株のたいていはまたは６−ＭＡまたは５−ＭＴ培地上でほ とんど増殖がないかまたは全く増殖がないことを示し、試験した単一の３５Ｓ／ ＡＳＡ２トランスフォーマントは、いずれの型の補足した培地上でも増殖しなか った。従って、同モル濃度での５−ＭＴよりインヒビターである可能性が６−Ｍ Ａのほうが多大であるようである。これらのデータは３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８構 築物で形質転換した細胞は５−Ｍｔｒ特徴を発現し、ついで、２００μＭまでの ５−ＭＴまたは６−ＭＡの濃度で激しく増殖を示すことができる。 これらのトランスフォーマントが、トリプトファン過剰産生に関連したものと して、これらの細胞培養中のフリーのトリプトファンのレベルをジョーンズら（ Analyst．１０６、９６８（１９８１））によって記載された手法の修正を用い て評価した。カラス組織サンプルの重量は、組織１ｍｇに対して５ｍｌのバッフ ァーの割合で、抽出バッファー（２５％アセトニトリル、１０ｍＭの酢酸ナトリ ウムバッファー、ｐＨ７．０）中で１分間ポリトロン（GBrinkmann Instruments）で基づかせた。サンプルは、４℃で２時間振盪し、３５００×ｇ で１０分間遠心し、ついで０.５ミクロンフィルターを通して濾過する。結果の 上清は、逆相Ｃ−１８カラム（４.５×２５ｃｍ）を用いてＨＰＬＣによって、 蛍光検出（興奮２５４ｎｍ、発光３２０ｎｍ）およびイソクラティック溶離（２ ５ｍＭ、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．８）：メタノール、３：１vol/vo l）を流速１ｍｌ／分および５０℃の温度で流す。サンプルの２０μは各ランに 注入される。ピークの分析は、ＭＡＸＩＭＡソフトウェア（ウォーターズ・イン ストルメンツ）を用いて行い、ＥＸＣＥＬ（マイクロソフト）スプレッドシート （シート）を用いて行う。 これらの株のトリプトファン分析の結果は、表３および表４に示されている。 アッセイされた株のうち、２つ（ＴＲＰＡ０３０およびＴＲＰＢ０４４）はコン トロールに比較してトリプトファンのレベルを実質的に上昇させる。これらのレ ベルは６０から１０２ｐｐｍのフリーのトリプトファンの範囲にある。他の３５ Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８株のほとんどは、２０から３０ｐｐｍのフリーのトリプトフ ァンの範囲におけるレベルを含み、一方、たいていのコントロールにおけるレベ ルは６から１１ｐｐｍであった。ＴＲＰＡ０３０株におけるトリプトファンのレ ベルは５−ＭＴに抵抗性であるもともとのＣ２８カルス株のものに類似である。 これらのデータは遺伝子構築物５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８を含むトウモロコシ細胞が 、この構築物を含まないトウモロコシ細胞に比較してトリプトファンを過剰産生 するうことができることを示唆している。 実施例 ７ トリプトファンフィードバック阻害に対する低減した感受性を示すアントラニル 酸シンターゼ活性のための遺伝子構築物３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８を含むトウモロ コシトランスフォーマントの分析 遺伝子構築物３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８を運搬するトウモロコシのトランスフォ ーマントがコントロール細胞に存在するアントラニル酸シンターゼよりトリプト ファンフィードバック阻害に対して感受性であるアントラニル酸シンターゼ活性 を含むか否かを決定するために、アントラニル酸シンターゼ酵素アッセイを選択 したトランスフォーマント細胞株上で行った。アントラニル酸シンターゼアッセ イはウィドホルム（Biochemica et Biophysica Acta、２７９、４８（１９７２ ））によって本質的に記載されるように行った。カラス組織５ｇは、ポリン（ブ リンクマン・インストゥルメンツ）で１分間等量の抽出バッファー（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０.４ｍＭβ−メルカプトエタノール、０.２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１００μＭのグルタミン、４０％グリセロール ）と共に挽いた。得られたホモジネートは６０００×ｇで２０分間遠心し、つい で上清をバイオラド（Biorad）Ｐ６−ＤＳカラム（１２ｍｌのベッド容量、４ｍ ｌのサンプルをアプライする）上で脱塩した。その酵素アッセイを３０℃で行い 、アントラニル酸の産物を持続的に、分光蛍光的に３４０ｎｍの切り出し波長で 測定し、ついで４００ｎｍの発光波長（それぞれスリットの幅５および１０ｎｍ ）であった。最終的に１ｍｌの反応混合液は２５０μｌまで酵素抽出物で、８μ ＭのＭｇＳＯ₄、４０μＭのＬ−グルタミンおよび１μＭのコリスミ酸を含む。 反応を０から１５μＭのトリプトファンの存在下で行う。サンプルのタンパク質 内容物を標準的ブラッドフォードアッセイ（Bradford assay）によって決定され る。アントラニル酸標準は発光読み取りの定量化に使用される。 図４に示すように、細胞株ＴＲＰＡ０３０およびＴＲＰＡ０１５は、両方とも ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８遺伝子構築物を含むものであり、１００μＭの５−ＭＴ 上で増殖する能力を示し、コントロールに比べて相対的に高いトリプトファンレ ベルを含み、ついで３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８構築物を含まないコントロール細胞 株ＴＲＰＡ０１３より高いアントラニル酸シンターゼ活性のレベルを示す。３５ Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８株中でのアントラニル酸シンターゼの活性もまた、コントロ ールが示すよりもトリプトファン阻害に一層多大な耐性を示す。 実施例 ８ トウモロコシＡＳＡ２遺伝子からの転写プロモーター領域の特徴付け トウモロコシ細胞における遺伝子発現の指示におけるトウモロコシアントラニ ル酸シンターゼ遺伝子ＡＳＡ２の５’調節配列の利用を評価するため、クローン ｐ ＤＰＧ６６８からの断片をＧＵＳリポーター遺伝子の５'に挿入した。これは ｐＤＰＧ６６８の制限マッピングによって行われ、１２塩基対の５'ＵＴＲ（Pvu II部位）および５'フランキング配列の約１１００塩基対を含むXba／PvuIＩ断片 の同定を認めた。ｐＤＰＧ６６８からのXba／PvuII断片を単離し、Xｂａオーバ ーハングはＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで埋め、得られた平滑末 端断片をBamHＩおよびHindIIIを有するプラスミドは、ｐＤＰＧ１２６(３５Ｓ／ ＧＵＳ／ＴＲ７)における３５Ｓプロモーターと置換され、平滑末端を産生する ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で埋め、アルカリホスファターゼで処理し 、ついで線形べクターをｐＤＰＧ６６８平滑末端にライゲーションしてｐＤＰＧ ６７１（Asa２／ＧＵＳ／ＴＲ７）を得る。ｐＤＰＧ６７１構築物は、未成熟ト ウモロコシ胚に以下の特定の爆破によって導入される：胚を受粉１０日後で切り 出し、２７℃で２日間、２１１Ｖ（表２）の固体培地上で維持し、ついで、爆破 の４時間前に２１１ＳＶ（表２）培地に移す（デイビス（Davis）ら、ＰＣＴ国 際特許出願公開番号第ＷＯ９５／０６１２８、１９９５年３月２日参照）。爆破 後２日間、胚を２１１ＳＶ培地上に維持し、組織化学的ＧＵＳアッセイバッファ ー（０.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）、５ｍＭ フェロシアン化カリウム 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ TritonX−１００、０.３％Ｘ−グルクロニド）に移し た。限定された数の青く染まった点を染色の２４時間後に観察し、そのことはｐ ＤＰＧ６６８からのXba／PvuII断片がトウモロコシ細胞中でＧＵＳリポーター遺 伝子の発現を指令することができることを示唆している。そのインサートは、ヌ クレオチドシークエンシング分析にかけた。推定翻訳開始部位の５'末 端１２００ヌクレオチドを図５に示す（配列番号：１４）。 実施例 ９ ＡＳＡ２Ｃ２８対立遺伝子を運搬する植物または３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８遺伝子 構築物中に存在するトランス遺伝子を発現する植物の同定を促進する方法 上記に示すように、所有のＣ２８トウモロコシ株における５−ＭＴ抵抗性の生 物学的本質は、アントラニル酸シンターゼ酵素をコードする遺伝子における変異 によるものである。その変異はトリプトファンフィードバック阻害に対する酵素 の感受性における減少となる。それゆえ、該細胞中のトリプトファン過剰産生を 可能にする。修飾した酵素はトリプトファン経路を介して殺草性の効果を有する 他のトリプトファン類似体に対する類似の耐性を示すことができる。そのような 類似体６−ＭＡの内の１つの使用は、この遺伝子座での野生型の対立遺伝子のみ を含むものからのトウモロコシＡＳＡ２ Ｃ２８対立遺伝子を運搬する植物を区 別するように設計されたアッセイにおいて評価される。 スプレー試行をＣ２８／Ｃ２８の７〜１０日齢の苗木および野生型の源は１０ ｍＭの６−ＭＡ、１０％のグリセロール、０.５％のTween-２０の溶液でスプレ ーして行った。スプレーした５日後、野生型植物は特に葉脈間に退緑（chlorosi s）を示したが、Ｃ２８植物は正常であった。これは、この６−ＭＡ製剤が、野 生型植物に毒性であるが、Ｃ２８／Ｃ２８植物には毒性でないことを示している 。５−ＭＴおよび６−ＭＡの野生型およびＣ２８植物に及ぼす影響をついで比較 する。その実験は、Ｃ２８対立遺伝子が１：１の割合で分離する多様な遺伝的背 景を表す植物の処理からなる。各２０穀粒列は、８つの異なるＣ２８戻し交雑変 換集団を表し、２つの同一のフラットに植える。１つのフラットは５−ＭＴをス プレーし、他は６−ＭＡをスプレーする（両方とも１０％グリセロールおよび０ .５％Tween-２０を含む溶液中１０ｍＭの濃度である）。植樹８日後、植物にス プレーする。スプレー処理はスプレー６および１０日後に評価される。すべての 場合において、５−ＭＴおよび６−ＭＡの両方に対する明らかな分離は明瞭であ り、ある場合においては、その効果は他の場合よりも一層劇的である。すべての 場合において、６−ＭＡ処理は、一層明らかな抵抗性の分離および感受 性植物となる。 ６−ＭＡのスプレーされた苗木への効果を与えると、６−ＭＡの存在下でのＣ ２８対立遺伝子を運搬する趣旨の繁殖能力を評価すると決定した。５−ＭＴでの 以前の仕事は、米国特許第４,５８１,８４７号に記載されるように、切除された 場合における５−ＭＴ阻害された発芽を示唆している。７つの分離したＣ２８の 戻し交雑集団からの種子は、Ｃ２８／Ｃ２８および野生型コントロール源い加え て、１００μＭ６−ＭＡの溶液で飽和した濾紙の間で萌芽する。インキュベーシ ョン６日後、個々の苗木の一次根の長さを測定する。すべてのＣ２８／Ｃ２８苗 木の根は長さ８ｃｍより長く、およびコントロールの野生型のすべての根は３ｃ ｍより短い。Ｃ２８対立遺伝子に関して分離するサンプルにおいて、感受性であ るとして測定された植物は根の長さが５ｃｍより短く、および陽性として計測さ れたものの長さは７ｃｍより長かった。この実験は明らかに１００μＭの濃度で ６−ＭＡは種子萌芽アッセイにおいてＡＳＡ２のＣ２８対立遺伝子を運搬する植 物を同定するために使用されることができる。 ＡＳＡ２Ｃ２８対立遺伝子を運搬する植物の同定に関する６−ＭＡ処理に関す る苗木スプレーアッセイおよび種子萌芽アッセイは、物理的にＡＳＡ２遺伝子の Ｃ２８対立遺伝子を定義する分子マーカーの使用によって確認する。上記のよう に、Ｃ２８対立遺伝子における修飾はｐＤＰＧ６００ヌクレオチド配列における １１９４位でＴからＡへ置換することに関する。この置換は制限酵素NlaIIIのた めの認識配列であるＣＡＴＧ脈絡において起こる。ＡＳＡ２ Ｃ２８に存在する ＴからＡへの置換は、ＣＡＴＧからＣＡＡＧへとの変化を起こし、それゆえ、こ の部位でのNlaIII認識配列の喪失となる。それゆえ、この部位の欠如はＣ２８ ＡＳＡ２対立遺伝子の診断分子マーカーとして機能する。従って、プライマーＡ ２１−１５（配列番号：１３）およびＡ２１−１６（配列番号：１５）（この部 位をフランキングする）を用いたＰＣＲにおいて５００塩基対断片を増幅するこ とによって、その産物をNlaIIIで消化し、Ｃ２８対立遺伝子からの非開裂産物（ ５００塩基対）は容易にアガロースゲル電気泳動によって野生型対立遺伝子（４ ００＋１００塩基対）の開裂産物から区別される。このマーカーは６−Ｍ Ａおよび５−ＭＴ抵抗性の両方を分離する集団からの個体におけるＣ２８対立遺 伝子の存在を同定するために使用される。 実施例 １０ ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８で形質転換したトランスジェニック植物の分析 トランスジェニック植物は３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８を含むカラス培養から再生 される。これらの植物は、精鋭の交配株において存在する雄性または雌性として 使用される。これらの植物からの穀粒子孫は上記の方法を使用することによって （それぞれ実施例９および実施例６）、６−ＭＡの存在において萌芽する能力お よび穀粒トリプトファン含有量を評価する。形質転換プロセスはトランス遺伝子 の関して半接合体植物がトランス遺伝子に関して、親がトランス遺伝子の存在の ために１：１で分離されることを期待されるもののうちの１つとして使用される ：子孫の半分は半接合体であり、半分は野生型である。いくつかの３５Ｓ／ＡＳ Ａ２Ｃ２８トランスフォーマントからの穀粒子孫の６−ＭＡの存在における萌芽 能力が評価されるアッセイの結果は表５に示されている。これらのトランスフォ ーンマントの３つからの子孫（ＴＲＰＡ ０３０を含む）は、１：１に近い割合 で６−ＭＡ抵抗性に関する分離率を示す。３つの他のトランスフォーマントは、 カラス培養としての６−ＭＡでの増殖能力を示しているものであり（表４）、６ −ＭＡの存在において萌芽する能力を有する穀粒子孫を産生しない。これはカラ スにおける３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８トランス遺伝子の発現レベルにおける差異に よるようである。これらのデータはトランスフォーマントＴＲＰＡ３０は、カラ ス培養物におけるトリプトファンの異常に高いレベルを含み、６−ＭＡの存在に おいて萌芽する能力を示す。 ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８トランス遺伝子発現の穀粒におけるトリプトファン過剰 産生への効果を評定するため、ＴＲｐＡ０３０が雌性として使用される穂からの 個々の穀粒におけるトリプトファンレベルを決定する。コントロールとして、選 択可能なマーカーバートランス遺伝子のみを運搬し、しかし３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ ２８トランス遺伝子ではない穀粒におけるトリプトファンレベルは雌性親として 使用される。ＴＲＰＢ０３９穀粒子孫のうちの１つも２２.８ｐｐｍ（１６．０ 〜２２.８ｐｐｍの範囲）を越えるトリプトファンレベルを含まず、ＴＲＰＡ０ ３０子孫の半分は、６２−９８.９ｐｐｍにおけるトリプトファンレベルを示し 、ついで、他の半分は１６.５−３０.４ｐｐｍ範囲（表６）においてのレベルを 示す。これらのデータは、明らかにＴＲＰＡ０３０が親として使用される交雑は 生まれる穀粒子孫は３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８トランス遺伝子を運搬しないトラン スジェニック植物のものより有意に高いトリプトファンのレベル含むことをはっ きりと証明した。 実施例 １１ 植物形質転換のための選択可能なマーカーとしての３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８の使 用 ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８構築物はトウモロコシ細胞中における５−ＭＴまたは ６−ＭＡに対する耐性を付与することが見いだされているので（実施例６）、選 択可能なマーカーとしてのこの構築物の有用性は、形質転換実験のシリーズにお いて評価された。これらの実験は、上記実施例５において記載されるものと類似 のやり方で行われ、未熟トウモロコシ胚はプラスミド組合せ３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ ２８＋ｐＤＰＧ１６５または組合せ３５Ｓ／ＡＳＡ２＋ｐＤＰＧ１６５のいずれ かで爆破された。しかしながら、ビアラフォス含有培地上のトランスフォーマン トの選択よりむしろ、選択プロセスは以下のとおり６−ＭＡ培地上で行った：爆 破後、２日間培地２１１ＶＷ（６−ＭＡで３３μｌまで補った表２からの培地２ １１Ｖ）上で１プレートあたり８−１０胚で前もった選択を開始した。培地２１ １ＶＷ上での１５日後、胚を１プレートあたり１胚で選択培地２１１Ｘ（培地２ １１Ｖから硝酸銀を除き、ついで１００μＭまで６−ＭＡで補う）。３５Ｓ／Ａ ＳＡ２Ｃ２８＋ｐＤＰＧ１６５組合せで爆破したトランスフォーマントを１００ μＭの６−ＭＡ選択培地上で１２週間後の選択を同定する。３５Ｓ／ＡＳＡ２＋ ｐＤＰＧ１６５組合せで爆破した胚からトランスフォーマントは全く得られかっ た。６−ＭＡを介した３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８＋ｐＤＰＧ１６５の組合せで得ら れたトランスフォーマントの数はビアラフォス選択を介して得られたものと類似 である。これは３５Ｓ／ＡＳＡ２Ｃ２８構築物の使用および６−ＭＡ選択がｐＤ ＰＧ１６５およびビアラフォス選択がトランスフォーマントの同定に使用される ものと同様のやり方でのトランスフォーマントの同定を認めた。 すべての刊行物および特許が、参照のために個々が組み入れられるように参照 のため本明細書に包含される。本発明はまさにそのとおりの詳細な提示および記 載に限定されるものではない。というのは多数の変更および修正が、請求の範囲 に定義される本発明の精神および範囲内を逸脱せずになされると理解されるべき ものであるからである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年２月３日（１９９８．２．３） 【補正内容】 請求の範囲 １．フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体によ って抑制されるのに実質的に抵抗性である植物アントラニル酸シンターゼをコー ドするＤＮＡセグメントを含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ２．ＤＮＡセグメントがトウモロコシアントラニル酸シンターゼをコードする 請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ３．該ＤＮＡセグメントが配列番号：１６を有するタンパク質をコードする請 求項１に記載のＤＮＡ分子。 ４．該ＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１２からなる請求項２に記載の ＤＮＡ分子。 ５．トウモロコシアントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを 含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ６．該ＤＮＡセグメントが配列番号：１２を有するタンパク質をコードする請 求項５に記載のＤＮＡ分子。 ７．該ＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１からなる請求項５に記載のＤ ＮＡ分子。 ８．第１のＤＮＡセグメントに作動可能に結合したアミノ末端葉緑体トランジ ットペプチドをコードする第２のＤＮＡセグメントをさらに含む請求項１、２、 ３、４、５、６、または７に記載のＤＮＡ分子。 ９．（ａ）植物細胞において機能的であるプロモーターに作動可能に結合した 外在性アントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセ ットを感受性植物に導入し、アントラニル酸シンターゼがフリーのＬ−トリプト ファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体によって実質的に阻害されるのに 抵抗性である形質転換した植物細胞を産生し、 （ｂ）該ＤＮＡセグメントによってコードされるアントラニル酸シンターゼを植 物細胞に発現させ、感受性植物の形質転換されていない細胞の増殖を阻害する、 フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体の量に実質 的に耐性である形質転換された植物細胞にするのに有効な該アントラニル酸シン ターゼの量を産生する を含む植物細胞にトリプトファンのアミノ酸類似体に対する耐性を付与する方法 。 １０．該ＤＮＡセグメントの発現が誘発可能である請求項９に記載の方法。 １１．該発現カセットがさらにプラスミドＤＮＡを含む請求項９に記載の方法 。 １２．アントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントが、エレクト ロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト形質転換、マイク ロプロジェクタイル・ボンバードメント、アグロバクテリウム−媒介形質転換お ょびリポソームカプセル化よりなる群から選択された方法によって植物細胞に導 入されるアントラニル酸シンターゼをコードする請求項９に記載の方法。 １３．該アントラニル酸シンターゼが植物アントラニル酸シンターゼである請 求項９に記載の方法。 １４．該植物アントラニル酸シンターゼがトウモロコシアントラニル酸シンタ ーゼである請求項１３に記載の方法。 １５．該トウモロコシアントラニル酸シンターゼが配列番号：１６を有する請 求項１４に記載の方法。 １６．第１のＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１２からなる請求項９に 記載の方法。 １７．該植物細胞が、カラス、胚、分裂組織、配偶子組織または懸濁液中の培 養された細胞を含む請求項９に記載の方法。 １８．該アミノ酸類似体が５−メチルトリプトファンである請求項９に記載の 方法。 １９．該発現カセットが第１のＤＮＡセグメントに作動可能に結合しているア ミノ末端葉緑体トランジットペプチドをコードする第２ＤＮＡセグメントをさら に含む請求項９に記載の方法。 ２０．該アミノ酸類似体が６−メチルアントラニル酸である請求項９に記載の 方法。 ２１．第１のＤＮＡセグメントがコードする該アントラニル酸シンターゼが該 植物細胞葉緑体中に発現される請求項１９に記載の方法。 ２２．形質転換した植物が、請求項９に記載の方法によって得られた形質転換 した植物差衣あぼうから再生される。 ２３．請求項２２に記載の形質転換した植物の形質転換した種子。 ２４．（ａ）感受性植物の細胞に組換えＤＮＡセグメント ２５．慢性傷害の治癒を促進するために使用する請求項２１に記載の分子。 ２６．写真、醸造、食糧、織物または接着剤に使用するための請求項１〜２０ に記載のいずれか１つの分子。 ２７．請求項１〜２５のいずれか１つに記載の分子の使用を含むヒトまたは動 物体の治療または診断の方法。 ２８．請求項１−２０のいずれか１つに記載の分子をコードするＤＮＡ。 ２９．発現を指令するのに十分である調節配列に作動可能に結合した請求項２ ８に記載のＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションした発現宿主。 ３０．発現を指令するのに十分である調節配列に作動可能に結合した請求項２ ９に記載のＤＮＡをゲノムが含むトランスジェニックマウス。 ３１．動物が非ヒト胎性哺乳動物であって、成熟雌性動物の乳汁における発現 を調節配列が指令する請求項３０に記載のトランスジェニックマウス。 ３２．天然に不在のコラーゲンを産生する方法であって、該方法が、請求項２ ９に記載の発現宿主または請求項３０または３１に記載のトランスンジェニック マウスからのコラーゲンを回収すること、および時に天然に不在のコラーゲンを 引き続き精製することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 グリフォー，マシュー・シー アメリカ合衆国06359コネチカット州ノー ス・ストニントン、ウィアサップ・ロード 386番 (72)発明者 クリズ，アラン・エル アメリカ合衆国06335コネチカット州ゲイ ルズ・フェリー、ロビン・フッド・ドライ ブ23番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体によ る阻害に実質的に抵抗性である植物アントラニル酸シンターゼをコードする第１ のＤＮＡセグメントを含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ２．該第１のＤＮＡセグメントが植物アントラニル酸シンターゼをコードする 請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ３．該第１のＤＮＡセグメントがトウモロコシアントラニル酸シンターゼをコ ードする請求項２に記載のＤＮＡ分子。 ４．該第１のＤＮＡセグメントが配列番号：１６を有するタンパク質をコード する請求項３に記載のＤＮＡ分子。 ５．該第１のＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１２からなる請求項３に 記載のＤＮＡ分子。 ６．トゥモロコシアントラニル酸シンターゼをコードする該第１のＤＮＡセグ メントを含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ７．該第１のＤＮＡセグメントが配列番号：１２を有するタンパク質をコード する請求項６に記載のＤＮＡ分子。 ８．該第１のＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１からなる請求項６に記 載のＤＮＡ分子。 ９．第１のＤＮＡセグメントに作動可能に結合したアミノ末端葉緑体トランジ ットペプチドをコードする第２のＤＮＡセグメントをさらに含む請求項１、２、 ３、４、５、６、７または８に記載のＤＮＡ分子。 １０．（ａ）植物細胞において機能的であるプロモーターに作動可能に結合し た外在性アントラニル酸シンターゼをコードする第１のＤＮＡセグメントを含む 発現カセットを感受性植物細胞に導入し形質転換した植物細胞を産生し、該アン トラニル酸シンターゼがフリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのア ミノ酸類似体によ阻害に実質的に抵抗性であり、 （ｂ）該第１のＤＮＡセグメントによってコードされるアントラニル酸シンター ゼを植物細胞に発現させ、形質転換された植物細胞を感受性植物の形質転換され ていない細胞の増殖を阻害する、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトフ ァンのアミノ酸類似体の量に実質的に耐性であるようにするのに有効な該アント ラニル酸シンターゼの量を産生する を含む、植物細胞にトリプトファンのアミノ酸類似体に対する耐性を付与する方 法。 １１．該第１のＤＮＡセグメントの発現が誘発可能である請求項１０に記載の 方法。 １２．該発現カセットがさらにプラスミドＤＮＡを含む請求項１０に記載の方 法。 １３．アントラニル酸シンターゼをコードする第１のＤＮＡセグメントが、エ レクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト形質転換、 マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント、アグロバクテリウム−媒介形質 転換およびリポソームカプセル化よりなる群から選択された方法によって植物細 胞に導入される請求項１０に記載の方法。 １４．該アントラニル酸シンターゼが植物アントラニル酸シンターゼである請 求項１０に記載の方法。 １５．該植物アントラニル酸シンターゼがトウモロコシアントラニル酸シンタ ーゼである請求項１４に記載の方法。 １６．該トウモロコシアントラニル酸シンターゼが配列番号：１６を有する請 求項１５に記載の方法。 １７．第１のＤＮＡセグメントが本質的に配列番号：１２からなる請求項１０ に記載の方法。 １８．該植物細胞が、カラス、胚、分裂組織、配偶子組織または懸濁液中の培 養された細胞を含む請求項１０に記載の方法。 １９．該アミノ酸類似体が５−メチルトリプトファンである請求項１０に記載 の方法。 ２０．該発現カセットが第１のＤＮＡセグメントに作動可能に結合しているア ミノ末端葉緑体トランジットペプチドをコードする第２のＤＮＡセグメントをさ らに含む請求項１０に記載の方法。 ２１．該アミノ酸類似体が６−メチルアントラニル酸である請求項１０に記載 の方法。 ２２．第１のＤＮＡセグメントがコードする該アントラニル酸シンターゼが該 植物細胞葉緑体中に発現される請求項８に記載の方法。 ２３．請求項１０に記載の方法によって得られた形質転換した植物細胞から再 生された形質転換した植物。 ２４．請求項２３に記載の形質転換した植物の形質転換した種子。 ２５．（ａ）植物細胞において機能的であるプロモーターに作動可能に結合し たアントラニル酸シンターゼをコードする組換えＤＮＡセグメントを含む発現カ セットを感受性植物細胞に導入し、アントラニル酸シンターゼがフリーのＬ−ト リプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体によって実質的に阻害され るのに抵抗性である形質転換した植物細胞を産生し、 （ｂ）該ＤＮＡセグメントによってコードされるアントラニル酸シンターゼを植 物細胞に発現させ、感受性植物の形質転換されていない細胞の増殖を阻害する、 フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体の量に実質 的に耐性である形質転換された植物細胞にするのに有効な該アントラニル酸シン ターゼの量を組換えＤＮＡセグメント ２６．形質転換した細胞のトリプトファン含有量が、工程（ａ）の感受性の植 物細胞のものより約１.１〜５０倍である請求項２５に記載の方法。 ２７．（ａ）アントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを含む 発現カセットを細胞集団に導入し； （ｂ）アントラニル酸シンターゼをコードするＤＮＡセグメントを該細胞におい て発現させ；ついで （ｃ）該細胞からのアントラニル酸シンターゼを回収する ことを含むアントラニル酸シンターゼを産生する方法。 ２８．該第１のＤＮＡセグメントが、その５’末端で正確なリーディングフレ ーム中でアミノ末端葉緑体トランジットペプチドをコードする第２のＤＮＡセグ メントに結合し、および該第１のＤＮＡセグメントおよび第２にＤＮＡセグメン トが植物細胞中で機能的な調節領域の転写および翻訳上の調節コントロール下に ある、フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類似体によ る阻害に実質的に抵抗性であるアントラニル酸シンターゼをコードする第１のＤ Ｎセグメントを含む発現カセット。 ２９．さらに選択可能なマーカー遺伝子またはリポーター遺伝子を含む請求項 ２８に記載の発現カセット。 ３０．植物アントラニル酸シンターゼの転写調節要素をコードするＤＮＡセグ メントを含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ３１．植物アントラニル酸シンターゼがトウモロコシアントラニル酸シンター ゼである請求項３０に記載のＤＮＡ分子。 ３２．該ＤＮＡセグメントが配列番号：１４よりなる請求項３０に記載のＤＮ Ａ分子。 ３３．（ａ）フリーのＬ−トリプトファンまたはトリプトファンのアミノ酸類 似体による阻害に実質的に抵抗性であるアントラニル酸シンターゼをコードする 第１のＤＮＡセグメントを含む発現カセットを植物細胞に導入して形質転換した 植物細胞を産生し；および （ｂ）第１のＤＮＡセグメントを含まない植物細胞の増殖お阻害するフリーのＬ −トリプトファンまたはトリプトファン類似体の量において形質転換した植物細 胞を培養する ことを含む形質転換した植物細胞を選択する方法。 ３４．アントラニル酸シンターゼのβサブユニットをコードするＤＮＡセグメ ントを含む単離および精製したＤＮＡ分子。 ３５．該ＤＮＡセグメントが植物アントラニル酸シンターゼのβサブユニット である請求項３４に記載のＤＮＡ分子。 ３６．該ＤＮＡセグメントが植物アントラニル酸シンターゼのβサブユニット である請求項３５に記載のＤＮＡ分子。 ３７．該ＤＮＡセグメントが、本質的に配列番号：８の配列を含む請求項３６ に記載のＤＮＡ分子。