CZ39093A3 - Oligosaccharide and pharmaceutical preparation in which it is comprised - Google Patents
Oligosaccharide and pharmaceutical preparation in which it is comprised Download PDFInfo
- Publication number
- CZ39093A3 CZ39093A3 CZ93390A CZ39093A CZ39093A3 CZ 39093 A3 CZ39093 A3 CZ 39093A3 CZ 93390 A CZ93390 A CZ 93390A CZ 39093 A CZ39093 A CZ 39093A CZ 39093 A3 CZ39093 A3 CZ 39093A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- glcnac
- mana
- fuca
- cells
- oligosaccharides
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Amplifiers (AREA)
Description
01igosacharid a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje
Oblast techiky
Vynález se týká molekulární biologie a zvláště způsobu přípravy nových uhlohydrátových struktur v buňkách 293 lidské ledviny. Tyto nové uhlohydrátové struktury se mohou používat k ošetřováni zánětů a může se jich také používat ke snižování buněčné adheze.
Dosavadní stav techniky
Buňky 293 lidské ledviny jsou adenovirem transformované buňky, užitečné při produkci rekombinantnich bílkovin. Zjistilo se, že buňky jsou obzvláště užitečné pro produkci krevních bílkovinových produktů, jako například lidské bílkoviny C, lidské bílkoviny S a thrombomodulinu, jakož také tkáňového plasminogenového aktivátoru, různých forem derivátů lidské bílkoviny C a reninu. Lidská bílkovina C, produkovaná v buňkách 293, vykazuje glykosylačni obrazec, který je výrazně odlišný od glykosylačního obrazce, zjištěného v připadě lidské bílkoviny C, odvozené z plasmy. Vynález se týká skutečnosti, že molekuly lidské bílkoviny C, produkované buňkami 293, vykazují podle nových poznatků obsah nových N-vázaných o 1igosacharidů, které obsahují neredukujici koncové větve GalNAcp(1-4)(Fuca(l-3))GlcNAc. Tyto struktury jsou schopné vazby s vysokou afinitou na určité selekce, kterými jsou receptory buněčné adheze lidského imunitního systému. Tato spicifická ligandová afinita dokládá, že nové oligosacharidy, produkované buňkami 293, jsou užitečné pro snížení adheze buněk a zánětu tkání.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu jsou o 1igosacharidy strukury
Fuca (1-43)
GalNAcP (l->4) GlcNAcp (l->2)Mana (1-46) Fuca (l->6)
ManP (1-^4) GlcNAcP (1-^4) GlcNAc
GalNAcP (1-44) GlcNAcp (1-42) Mana (l->3)
Fuca(l->3)}
Fuca (1-43)
GalNAcP (1—»4) GlcNAcp (1-42) Mana (1—»6) Fuca j 1—> 6) { Ma^(l-44)GlcNAcp(l->4)GlcNAc
GalNAcP (1—>2) Mana (l-»3) ?
NeuAca (2—> 6) GalNAcβ (l-»4) GlcNAcP {1-42) Mana (l-»6) Fuca (1-46) { Μαηβ(1->4)GlcNAcP(l->4)GlcNAc
GalNAcβ (1-44) GlcNAcP (l-»2) Mana (1-43)
Fuca (1-43) j
NeuAca (2—»3) Gaip (1-44) σίσΝΑσβ (1-42) Mana {1-p 6) Fuca (1 —» 6) { Manβ(l-44)GlcNAcβ(l—>4)GlcNAc σβίΝΑσβ (1 —>4) σίσΝΑΰβ (1-42) Mana (1-43)
Fucad-43),
J
Zde používané symboly mají následující významy:
Asn - asparagin
Gal - galaktoza
Fuc - fukoza
GalNAc - N-acetyigalaktosamin
GlcNAc - N-acetylglukosamin
Man - mannoza
NeuAc - N-acetylneuraminová kyselina
Vynález blíže objasňuje připojený obrázek obr. 1, na kterém je chromatograf hlavních uhlohydrátů nalezených na molekule lidské bílkoviny C, produkované buňkami 293. Hlavni piky, pro které byly uhlohydrátové struktury objasněny, jsou označeny číslicemi.
Podstatou vynálezu je také způsob produkce peptidů obsahujících oiigosacharidy se strukturou GalNAcp(1-4)(Fuca(1-3))GlcNAc inkubací buněk 293 lidské ledviny za exprese peptidu schopného glykosylace za podmínek vhodných pro expresi peptidu a získáni peptidu z buňky nebo z buněčné kultury supernatantu. Molekuly lidské bílkoviny, produkované v buňkách 293, obsahují tyto struktury na nfiredukujicích koncových větvích N-vázaný^ch oligosacharidů. Vynález také zahrnuje způsoby pro dalši izolaci nových oligosacharidů z peptidu, produkovaného v buňkách 293. Peptidů a/nebo óligosacharidů, takto produkovaných, se může používat tak, aby působily jako ligandy vysoké afinity určitých receptorů buněčné adheze. Takováto ligandová specificita dokládá, že peptidy a nové oligosacharidy se mohou používat k předcházeni nebo snižováni adheze buněk a tim k předcházeni nebo ke snižováni zánětu tkání.
Buňkami 293 lidské ledviny (ATCC CRL 1573) jsou transformované primární embryonální buňky lidské ledviny, které obsahuji a vykazuji expresi transformačního genu Adenoviru 5. Těchto buněk se využívá k expresi několika důležitých genových produktů a použilo se jich v četných různých laboratořích akademických i průmyslových. Napřiklad se popisuje v amerických pate^nových spisech čislo 4 981952 (Yan) a 4 992373 (Bang a kol.) použití řady buněk 293 pro produkci lidské bílkoviny C. Nyní se zjistilo, že řada buněk 293 obsahuje enzymatický systém k vytvářeni nových a užitečných o 1igosacharidů na peptidech produkovaných v buněčné řadě. Tyto nové o 1igosacharidy, jakož také způsoby jejich přípravy a použiti, jsou ve vynálezu zahrnuty.
Lidská bílkovina C (HPC) obíhá v plasmě jakožto zymogen serinové proteázy. Bílkovina C se aktivuje thrombinem v komplexu s endotheliálnim buněčným povrchovým receptorem, thrombomodulinem. Aktivovaná forma lidské bílkoviny C (aPC) má silnou antikoagulační účinnost v důsledku schopnosti inaktivovat faktory Va a Vlila. Pro účely vynálezu se výrazem lidská bílkovina C rozumí jak zymogen tak aktivované formy molekuly. Bílkovina C má důležitý význam v regulaci generace thrombinu a může být účinná při ošetřování četných thrombotických onemocnění. Lidská bílkovina C je posttranslačně modifikována N-glykosylací na čtyřech místech molekuly; jmenovitě v poloze Asn 97 na lehkém řetězci a v poloze Asn 248, Asn 313 a Asn 329 na těžkém řetězci. Jakkoliv nebyla zveřejněna úplná uhlohydrátová struktura z plasmy odvozené HPC, oligosacharidy nalezené na HPC rekombinantně produkované v buňkách 293 (rHPC) jsou dosti rozdílné od uhlohydrátové struktury na plasmě odvozené od HPC. Napřiklad rHPC má pětkrát vyšší obsah fukozy a dvakrát nižší obsah NeuAc ve srovnání s HPC odvozené od plasmy. Kromě toho je 2,6 mol GalNAc na mol rHPC, zatímco z plasmy odvozená HPC je prosta GalNAc.
Vynález se neomezuje na specifické oligosacharidy vázané na peptid na Asn zbytku. Oligosacharidy mohou být vázány na peptidy prostřednictvím N-glykosylace nebo O-glykosylace. Oligosacharidy jsou také v glykolipidech a proteoglykanech a mohou se adovat na bílkoviny membránově vázané prostřednictvím glypiace. Pro účely vy-nálezu se výraz schopný glykosylace neomezuje na N-glykosylaci Asn zbytku, nýbrž zahrnuje všechny mechanismy, kterými se peptidy nebo lipidy glykosylují in vivo.
Hlavni oligosacharidy, nalezené na rHPC, produkované v buňkách 293 mají profil podle obr. 1 po identifikaci na systému Dionex HPAE-PAD. Oligosacharid, odpovídající hlavnímu piku 1, je neutrální biantennární oligosacharid sp oběma antennae obsahujícími strukturu GalNAcp(1-4)(Fuca(1-3))GlcNAca(1-2)^váuunuu—na vázanou na fukosylováné chitobioso-trimannosylové jádro. Několik z ostatních deseti studovaných a zde uvedených oligosacharidů má také novou N-vázanou stukturu obsahující GalNAc. Předpověděné struktury oligosacharidů na píku 2, 7 a 11 obsahují rovněž nové struktury na alespoň jedné větvi fukosylovaného chitobioso-trimannosylového jádra. Kromě toho struktury oligosacharidů na piku 15, 20 a 23 obsahují GalNAc zbytky v 1 - 4 vazbě. T^to nové oligosacharidové struktury se produkuji buněčnou řadou 293, jelikož tyto buňky obsahují specifické enzymy, nutné pro produkci těchto substrátů.
Zdá se, že buňky 293 lidské ledviny máji jak a(2-3) tak a(2-6) sialyltransferázy. Sialyltransferáza a(2-6) je specifická pro sialylaci GalNAc zbytků, zatímco a(2-3) sialyltransferáza je specifická pro sialylaci Gal zbytků. Fukosyltransferáza a(l-3), která se ziská expresi buňkami 293, může působit jakožto substrát obsahující GalNAc. Působeni a(2-6) sialyltransferázy a a(l-3) fukosyl transferázy se vzájemně vylučuje na kterékoliv jednotlivé větvi oligosacharidů, a proto když je GalNAc sialylovaná, je a(l-3) fukosylace zbytku GalNAc na téže antennae předem vyloučena. Naopak jakmile je GalNAc fukosylovaná nemůže být tentýž GalNAc zbytek na téže antenna sialylován a(2-6) sialyltransferázou.
Buňky 293 produkuji rekombinantni glykoproteiny s menší heterogenitou v uhlohydrátovém podilu molekuly, jelikož buňky 293 vykazují expresi velmi vysoké míry aktivity σ(1-6)fukosyltransferázy. Vazbová analýza všech 25 o 1igosacharidových plků izolovaných z rHPC jedině prozrazuje 4-6-vázanou GlcNAc s redukčním koncem. Nezjištěna žádná 4-vázaná GlcNAc s redukčním koncem. Z toho je zřejmé, že chitobiosová jádra všech N-vázaných oligosacharidů jsou skutečně 1OO% fúkosylována. Objasněni 11 hlavních oligosacharidů na rHPC odvozené od buněk 293 se přičítá neobvyklému ob5 sáhu glykosylu rHPC, jak popisuje Yan a kol., (1990, Biotechnology 8, str. 655 až 660). Vysoký obsah fukosy v molekule může být přičítán skutečnosti, že chitobiosové jádro všech N-vázaných oligosacharidů je fukosylované a tedy skutečnosti, že GlcNAc zbytky v antennae čtyř z 11 hlavních N-vázaných o 1igosacharidů jsou fukosylovány. S výjimkou o 1igosacharidu, zjištěného v píku 2, GalNAc zbytky v rHPC jsou všechny nalezeny v N-glykosylovaných o1igosacharidech a jsou umístěny pouze v pozici antennae, kde normálně jsou pouze Gal v N—vázaném komplexu typu oligosacharidů.Pro účely vynálezu mohou zahrnovat výrazy antenna a větev četné antennae a větevi a obráceně.
Vynález se také týká působeni fukosyltransferázy v buňkách 293 a následná a(l-3)fukosylace zbytků GlcNAc o 1igosacharidů, produkovaných v buněčné řadě. Struktury obsahující σ(1-3)fukosylované zbytky GlcNAc jsou užitečnými ligandy pro vázáni selektinů. Selektiny jsou typem adhezního receptorů imunitního systému. Adheze leukocytů na endothe1iálni řazeni je integrálním stupněm z inětlivé odezvy. Dva typy selektinů, CD62 a ELAM-1 (endotheliální leukocytová adhezní molekula 1) jsou vázány o 1igosacharidy, Duhujícími a(l-3)fukoxylovaný GlcNAc. Zkoušky buněčné adheze iádaji, že adice peptidu, obsahujícího takové nové oligosacharíiiy (nebo adice samotných ol igosacharidů) , může vázat selektiny, a tak snižovat buněčnou adhezi nebo ji předcháze. Pokud se buněčn* adheze sníží nebo se ji předejde, může se snížit nebo se může a odejít zánětlivé odezvě.
Objev, že buňky 293 obsahují enzymatický systém potřebný k produkci takových selektin rekognizačnich ligandů, přinášejí žitý a užitečný nástroj lékařům pro ošetřování onemocnění, visejicich s adhezi buněk a se záýětlivou odezvou. V důsledku tohoto objevu glykoproteiny a o 1igosacharidy, produkované buňkami )3, se mohou používat pro ošetřováni zánětů nebo adheze buněk. Ypůsoby použití rHPC k ošetřováni nejrůznějšich zdravotních poruch jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 775624 ;ing a kol.). Nové glykoproteiny, produkované buňkami 293, nej5 omezovány na rekombinantně produkované bílkoviny v tom, Že 3které glykoproteiny produkované neodmyslitelně buňkami 293, mo6 hou mit také nové struktury. Kromě toho se vynález neomezuje na použiti glykopeptidů k předcházení nebo snižování adheze buněk a zánětů. Pracovníkovi v oboru je jasné, že se oligosacharidy mohou odstraňovat z glykoproteinů nejrůznějšimi o sobě známými způsoby. Oligosacharidy se mohou vnášet do farmaceuticky vhodných ředidel a podávat nemocným jedincům, kteří trpi adhezi buněk nebo zánětem.
Pracovníkům v oboru je jasné, že se vynález neomezuje na produkci oligosacharidů lidské bilkovony C v buňkách 293. Jakýkoliv peptid, schopný glykosylace se může transformovat do buněk 293 a může docházet k expresi za použití o sobě známých technik. Seznam takových peptidů zahrnuje bez jakéhokoliv omezováni lidskou bílkovinu S, lidský thrombomodulin, deriváty lidské bílkoviny C, tkáňový plasminogenový aktivátor a renin. Produkci lidské bílkoviny S v bukáňkách 293 popisuje Yan (americký patentový spis čislo 4 981952). Geny, kódující některé deriváty lidské bílkoviny C jsou popsány v evropské patentové přihlášce číslo 91301450.2. Geny, kódující přírodní a odvozené formy lidského thrombomodulinu jsou popsány v evropské patentové přihlášce číslo 90308826.8 a v článku Wen a kol., 1987, Biochemistry 26, str. 4350. Kterýkoliv z těchto genů se může transformovat do buněk 293, které se pak mohou kultivovat za podmínek vhodných pro expresi genu a pro produkci systému peptid/o1igosacharid.
Následující příklady praktického provedeni vynález toliko bliže objasňuji, nijak jej však neomezuji.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Produkce lidské bílkoviny C v buňkách 293
Rekombinantní lidská bílkovina C (rHPC) se produkuje v buňkách 293 lidské ledviny o sobě známými způsoby pracovníkům v oboru napřiklad způsobem, který popsal. Yan v americkém patentovém spise číslo 4 981952. Gen, kódující lidskou bílkovinu C, popsal
Bang a kol. v americkém patentovém spise číslo 4 775624. Plasmid, ouživaný k expresi lidské bílkoviny C v buňkách 293, je plasmipLPC, který popsal Bang a kol. v americkém patentovém spise íslo 4 992373. Konstrukce plasmidu pLPC je také popsána v evropském patentovém spisu číslo O 445939 a popsal ji Grinell a kol., (1987, BioTechno1ogy 5, str. 1189 až 1192). Plasmid se transfektuje do buněk 293 a pak se stabilní tranformanty identifikuji a subkultivuji. Klony, které vykazují nejvyšší úroveň exprese, se pťk nechají růst v dvoujádrové fermentační jednotce Optice 11 na pevné půdě. Pro všechny fermentace se používá prostředí prostého sera. Pro přípravu prostředí, prostého sera, se rozpouštějí následující složky ve 100 litrech vysoce kvalitní vody:
prostředí Dulbecco Modified Eagle (# 200-2010) 1350 g prostředí Ham F12 (#63N3O85) 478 g hydrogenuhličitan sodný 432 g . xtroza 468 g - ' hano 1ami n 5 5 ml sslenit sodný 0,5M 180 ml tamin K (1%) 180 ml 1, glutamin 81 g
Roztok se upraví na 180 litrů a hodnota pH se nastaví na
7,2 použitím 3N kyseliny chlorovodíkové. Po fermentaci při teplotě 37 *C se lidská bílkovina C může oddělit od kultivačí kapaliny způsobem, který popsal Yan v americkém patentovém spise čislo 4 931952. Takto produkované lidské bílkoviny se může použít v neaktivované zymogenové formě nebo se může aktivovat o sobě známými uúsoby pro pracovníky v oboru.
.1klad 2
Oligosacharidová struktura rHPC produkované v buňkách 293
Četné způso^by používané pro objasnění nové struktury rHPC, produkované v buňkách 293, popsal Yan a kol. (1990, BioTechno1ogy
8, str. 655 až 651). Odsolená a 1yofi 1izovaná rHPC se nejprve reikuje a karboxymethyluje v 0,2M Tris pufru (hodnota pH 8,6) obhujíci^m 2mM EDTA a 6M guanidin HCl. Tento roztok se důkladně dialyzuje proti 50 mM hydrogenuhličitanu amonnému a pak se lyofilizuje. Denaturovaná rHPC se resuspenduje v natriumfosfátovém pufru (hodnota pH 8,6) a pak se přidá 12 jednotek N-glykanazy (Genzyme) na každých 8 až 9 mg rHPC. Roztok se inkubuje při teplotě 37 *C po dobu 72 hodin, oddělí se enzymaticky uvolněné N-vázané o 1igosacharidy od deglykosylované rHPC na Bio-gelovén P6 sloupci vyváženém 50 mM hydrogenuhličitanem sodným. Frakce, obsahující deglykosylovanou rHPC se monitoruji ODíeo nnFrakce, obsahující o 1igosacharidy, podie monitorování analýzou glykosylového složeni, se sliji a liofilizuji se. Oligosacharidy se oddělí na systému Dionex HPAE-PAD II za použiti AS6 sloupce (4,6 x 250 mm) s AG6 sloupcem, který je vyvážen 20 mM octanem sodným, 100 mM NaOH. Po třech minutách se octan sodný zvýší na 60 mM v 20 minutách, dále se zvýši na 200 mM ve 120 minutách, zvýši se na 400 mM ve 40 minutách a opět se zvýši na 800 mM v 5 minutách. Koncentrace hydroxidu dsodného se udržuje konstantní 100 mM a průtoková rychlost sloupcem je 1 ml/min. Postsloupec 0,3 M NaOH vykazuje průtokovou rychlost 0,5 ml/min.
Aniontový mikromembránový supresor se umísti za detektor PAD. Pro neutralizaci a pro částečné odsoleni eluentu ze sloupce AG6-AS6 je dostatečná 30mM kyselina sirova za průtoku 9 ml/min aniontovým mikromembránovým supresorem. Každý o 1igosacharidový pik se dále odsoluje na patroně OnGuard H (Dionex), připravené podle pokynů výrobce.
Přibližně 1 až 10 pg odsoleného oligosacharidu se používá jakožto výchozi látky k připravě PMAA derivátů pro vazbovou analýzu. 01igosacharid se předredukuje 25 mikrolitry ÍO mg/ml NaBH, v 1M hydroxidu amonném po dobu dvou hodin při teplotě místnosti. Reakce se ukonči přidáním 20 mikrolitrů ledové kyseliny octové, pak se borátové soli odstraní opakovaným společným odpařováním v prostředí dusíku s 10 % kyseliny octové v methanolu. Redukovaný o 1igosacharid se premethyluje modifikovaným způsobem, který popsal Ciucanu a Kerék (1984, Carbohydr. Res. 131, str. 209 až 217), který popsal Costello a Vath (1990, Meth. Enzymol. 193, str. 738 až 755). Premethylováný o 1igosacharid se hydrolyzuje v 2M trifluoroctové kyselině za teploty 100 ‘C po dobu dvou hodin a pak se vysuš! na rotační odparce. Deuteroredukce se dosahuje
- 9 přidáním NaBD< v 1M hydroxidu amonném za koncentrace 20 mg/ml při teplotě 40 ‘C v průběhu 1,5 hodin. Reakce se ukonči neutralizaci ledovou kyselinou octovou. Borátové soli se odstraní společným odpařením v prostředí dusíku s 10 % kyseliny octové v methanolu. Acetylace se provádí inkubovánim s acetanhydridem za teploty místnosti v průběhu 30 minut. Konečné deriváty PMAA oligosacharidu se extrahuji methylenchloridem, zkoncentrují se vysoušením v prostředí dusíku a opět se rozpustí v 10 až 20 mikrolitrech ethylacetátu .
Systém plynové chromatografie - hmotové spektrometrie (GC-MS) se provádí za použiti jedotky Hewlet Pacjard GC589O-MSD. Deriváty PMAA se rozpustí v ethylacetátu před vstřikováním na sloupec DB-5 (0,24 mm x 30 m, J & W Scientific) při průtokové rychlosti helia 1 ml/min. Vzorek se vstřikuje na sloupec při teplotě 80 'C, která se udržuje po dobu dvou minut, pak se zvýši na 150 ‘C rychlosti 30 ’C/min a pak se teplota opět zvýší ze 150 *C na 240 *C rychlosti 2 ‘C/min a udržuje se na 240 ‘C po dobu 10 minut. Hmotový spektrometr se nechává pracovat způsobem El quadruple. Systém GC-MS se cejchuje standardy pro eluční doby.
Struktura o 1igosacharidového piku 1 se vysvětluje glykosylovým složením, vazebnou analýzou a 1H-NMR. Struktury dalších deseti hlavních oligosacharidů se předpovídají na základě glykosylového složeni a vazbové analyzy. 01igosacharidové strukty se objasňuji, jak dále uvedeno.
Uhlohydrátová struktura píku čislo 1
Fuca (1—>3)
GalNAcP (1-44) GlcNAcP (1-4 2) Mana {1 —>€) Fuca (1-46)
Manp (1-44) GlcNAcP (1-44) GlcNAc
GalNAcP (1—>4) GlcNAcP (1-42) Mana (1-43)
Fuca(l-43)
Uhlohydrátová struktura píku číslo 2
Fuca(l->3)
GalNAc3 (1-44) ΘίοΝΑοβ (1-42) Mana (1-46) Fuca j1-46) { Μβ,ηβ (1—>4) GlcNAcp (1-44) GlcNAc
GalNAcp (1—>2) Mana (1--3)
Uhlohydrátová struktura piku číslo 7
NeuAca (2—»6) GalNAcP (1-44) GlcNAcP (1-42) Mana (l-»6) Fuca (1-46) { ManP (1^4 )σΐσΝΑοβ (1-44) GlcNAc
GalNAcβ (1-44) GlcNAcP {l-»2)Mana (1-43)
Fuca (1—>3)
Uhlohydrátová struktura piku číslo 9
NeuAca (2—>6) σβΙΝΑοβ (1-44)01σΝΑσβ (l—»2)Mana j 1-46) Fuca j 1-46) { Μ|ηβ( 1-44 )σΐοΝΑοβ( 1-44 JGlcNAc ΰΒίΝΑοβ (1-44) σίοΝΑοβ (1-42) Mana (1-4 3)
Uhlohydrátová struktura piku číslo 11
NeuAca (2—»3) Ο&1β (1-44 )σΐοΝΑοβ( 1—42) Mana (1-46) Fuca (1-46) { Mar$( 1-44 )σΐοΝΑοβ( 1-44 )GlcNAc ' σβΙΝΑσβ (1-44) σίοΝΑσβ {l-»2)Mana (1-43)
Fuca(1-43)
Uhlohydrátová struktura piku číslo 15
NeuAca (2-46) ΰΒίΝΑοβ (1-44) σίοΝΑοβ (1-42) Mana (: ->6) Fuca (^l—>6) { Manβ( 1-44 )GlcNAc-4( 1-44 )GlcNAc NeuAca {2-43) Ga^ (1-44) σίοΝΑοβ {1-42)Mana (1-43)
Uhlohydrátová struktura piku číslo 19
NeuAca (2-46) σ&ΐβ (1-44) σΙοΝΑοβ (1-42) Mana {1 —*6) Fuca (1-46 { Mar$( 1-44 )σΐοΝΑοβ( 1-44 JGlcNAc
NeuAca {2-43) ββΐβ (1-44) σίοΝΑοβ (l->2) Mana (1-43)
Uhlohydrátová struktura piku čislo 20 NeuAca (2 —>G) GalNAcP (1-44 ) GlcNAcP {l->6) { Mana(1-46)
NeuAca(2—»3)Galp (1-44) GlcNAcp (l-»2) i
Fuca(l->6)
ManP (1-44) GlcNAc-4 (1-44) GlcNAc
NeuAca (2-43 ) Gaip (l->4) GlcNAcP {1-42)Mana (1-43) Uhlohydrátová struktura piku čislo 23
NeuAca (2-46 )GalNAcp (1-44) GlcNAcp (1-46) { Mana (1-46)
NeuAca (2-43 )Gaip( 1-44 )GlcNAcP( 1-42) | Fuca(l-46) { Manp (1-44) GlcNAcP (1—>4) GlcNAc
NeuAca (2-43) Gaip (1-44) GleNAcP (1-44) í { Mana (1-43)
NeuAca (2-43) Gaip (l->4) GlcNAcP (l-*2)
Uhlohydrátová struktura piku čislo 24
NeuAca (2-46) Gaip (1-44) GlcNAcP (1-46) { Mana (1-46)
NeuAca (2-43) Gaip (1-44) GlcNAcP (1-42) Fuca(l->6) { ManP(l—>4) GlcNAcP (1-44) GlcNAc
NeuAca (2-43) Gaip (1-44) GleNAcP (1-14) J { Mana(l—»3)
NeuAca (2-43) Gaip (1-44) GlcNAcP (1-42)
Uhlohydrátová struktura piku čislo 25
NeuAca(2-43)Gaip (l->4)GlcNAcP (1-46) { Mana(l->6)
NeuAca(2-»3)Galp (1-44)GlcNAcP (1-42) | Fuca(l-46) { ManP (1-44) GlcNAcp (1-44) GlcNAc
NeuAca (2->3) Gaip (1-44) GleNAcP (1-44) { Mana (1-43)
NeuAca (2-43 )Gaip(1-44 ) GlcNAcp (1-42)
Přiklad 3
Zkoušky in vitro adhese buněk
Lidské pupečni cévní endotheliové buňky (Umbilical Vein Endothelium Cell - HUVEC) nebo lidské aortové endothelium (HAE) se ziskaji od organizace Clonetics (San Diego) a nechávají se růst v EBM prostředi dodávaném společnosti Clonetics. Buňky se vnesou na destičku s 96 důlky za hustoty k dosažení slinutých monovrstev načež se provádí inkubace přes noc při teplotě 37 'C. Monovrstvy se inkubuji v přítomnosti nebo v nepřítomnosti 20 nanogramů faktoru tumorové nekrosy (TNF) po dobu 4 až 6 hodin před zkouškou vázání v celkovém objemu 100 až 150 mikrolitrů. Do testu pro inhibici vázáni se vnesou vzorky bílkoviny C nebo uhlohydrátů, z ni izolovaných, za ztrojnásobeni objemů v důlcích až do 20 mikrolitrů ve fosfátem pufrované solance (PBS) nebo ve vodě a pak se provádí inkubace po dobu dalších 20 až 25 minut. Po inkubacích se přidají tritiem značené U937 buňky v 50 mikro1itrových objemech při 1 až 3 x 10(6) buněk na důlek. Buňky U937 jsou značeny tritiem přidáním 3H-thymidinu do konečné koncentrace 1 mikrocurie na mililitr, s následnou inkubaci po dobu 18 až 20 hodin. Buňky se promyji použitím PBS před použitím k odstraněni nadbytku značiciho prostředku. Po 20 minutové inkubaci značených U937 buněk s endotheliálnimi buňkami se důlky odpaři a promyji čtyřikrát vápník obsahujícím PBS. Monovrstva a ulpělé U937 buňky se rozpustí přidáním 0,25¾ SDS/0,1 N NaOH v průběhu pěti minut za mícháni. Stanovuje se úroveň vázání scintilačním počítáním solubilizovaných buněk. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I a II.
Tabulka I
| Pokus číslo | aPC pg/ml | % inhibice» |
| 1 (HUVECS)b | 32 | žádná |
| 1 (HUVECS)b | 120 | 70(12)c |
| 2(HAE) | 120 | žádná |
| 2(HAE) | 240 | 77(30) |
| 3(HAE) | 120 | 54(18) |
a 100% inhibice je rozdílem mezi U937 vázaným v přítomnosti a v nepřítomnosti předběžného zpracováni endotheliálnich buněk použitím TNF b buněčná řada
| c čislo v | závorce znamená směrodatnou | odchylku |
| Tabulka 11 | ||
| Pokus číslo | o 1 igosacharid (μΜ) | % inhibice* |
| l(HAE)b | 5,75 | žádná |
| l(HAE) | 11,50 | 22(0,5)c |
| l(HAE) | 23,00 | 16(4) |
| 2 (HUVECS) | 17,25 | 19d |
| 2 (HUVECS) | 34.50 | 63 |
a 100¾ inhibice je rozdílem mezi U937 vázaným v přítomnosti a v nepřítomnosti předběžného zpracováni endotheliálnich buněk použitim TNF b buněčná řada c čislo v závorce znamená směrodatnou odchylku d z jednobodových stanoveni nevypočtena žádná chyba
Průmyslová využitelnost
Způsob produkce peptidů obsahujícího oligosacharidy se sekvenci
GalNAcp(l-4)(Fuca(l-3))GlcNAc inkubaci buněk 293 lidské ledviny, které vykazuji expresi peptidů schopného glykosylace za vhodných podmínek pro expresi peptidů a oddělení peptidů od buňky nebo od 1)vněčné kultury supernatantu. Způsob dalši izolace nových oligosaoharidů z peptidů, produkovaného buňkami 293. Produkovaných peptidů a/nebo o 1igosacharidů se může použít k působení jakožto vysoce afinitních ligandů určitých receptorů buněčné adhese. Pepti.dů a/nebo oligosacharidů se může použít k předcházeni nebo ke snižování buněčné adhese a zánětu.
Claims (3)
- - 14 PATENTOVÉ NÁROKYOligosacharid strukturyFuca (1-43)GalNAc? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-46) Fucad-46)----------”Man? (1-44) GlcNAc? (1-44 )GlcNAc£ ... - >GalNAc? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-43) Fuca (1—43) .On 3-'<
- 2. Oligosacharid strukturyFuca (1-43)GalNAc? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-46)C':?___ ε 6 ,xi ϊ i0150c ς 9 R V p3Fuca (1-46) — I i ( Man? (1-44) GlcNAc? (1-44) GlcNAcGalNAc? (1-42)Mana (1-43) .Oligosacharid strukturyNeuAca (2-46) GalNAc? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-46) {>( Man? (1-44) GlcNAc? (1-44) GlcNAcGalNAc? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-43)Fuca(l-43).Oligosacharid strukturyNeuAca (2-43) Gal? (1-44) GlcNAc? (1-42) Mana (1 y4 6) Fuca (1-46) ( Man? (1—44) GlcNAc? (1-44) GlcNAc GalNAc? (1—44) GlcNAc? (1-42) Mana (1-43)Fuca (1-43).5. Farmaceutický prostředek použitelný jakožto proti zánět 1 ivé činidlo, k prevenci zánětů, ke snižování adheze buněk a k předcházení buněčné adheze, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku oligosacharid podle nároku 1 až 4 spolu s jednou nebo s několika farmaceuticky vhodnými látkami ze souboru zahrnujícího nosič, excipient a ředidlo.6. Použití oligosacharidů podle nároku 1 až 4 pro přípravu protizánětlivého farmaceutického prostředku.7. Použití oligosacharidů podle nároku 1 až 4 pro přípravu farmaceutického prostředku k předcházení zánětům.
- 3. Použití oligosacharidů podle nároku 1 až 4 pro přípravu farmaceutického prostředku ke snižování buněčné adheze.9. Použití oligosacharidů podle nároku 1 až 4 pro přípravu farmaceutického prostředku k předcházení buněčné adheze.«5 co
PO PO PO PO ó PO σι o PO cn o cn O cn o cn O cn o 1 j—1 O .lilii O iilll O i ι 1 i i. o lil·.· O lilii O 1 1 -1 J-L- O 1 i 1 j oj oo o000 720.0 1440. 2160. 2880. 3600. 4320. 5040. 5760. 6480. 7200.| i i~~i~r | i i1 rj 1 ' 1 ' ' 1 1 1 ' rT » 1 1 1 » 1 l | TT JD O o PO 4^ σ> ε δ XI l z g « Sí v g ii '
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84986892A | 1992-03-12 | 1992-03-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ39093A3 true CZ39093A3 (en) | 1994-03-16 |
Family
ID=25306715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ93390A CZ39093A3 (en) | 1992-03-12 | 1993-03-10 | Oligosaccharide and pharmaceutical preparation in which it is comprised |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0565241B1 (cs) |
| JP (1) | JP3171506B2 (cs) |
| KR (1) | KR930019696A (cs) |
| CN (1) | CN1079967A (cs) |
| AT (1) | ATE137241T1 (cs) |
| AU (1) | AU661762B2 (cs) |
| BR (1) | BR9301136A (cs) |
| CA (1) | CA2091521A1 (cs) |
| CY (1) | CY1947A (cs) |
| CZ (1) | CZ39093A3 (cs) |
| DE (1) | DE69302317T2 (cs) |
| DK (1) | DK0565241T3 (cs) |
| ES (1) | ES2088227T3 (cs) |
| FI (1) | FI931086L (cs) |
| GR (1) | GR3020406T3 (cs) |
| HK (1) | HK132396A (cs) |
| HU (1) | HUT69613A (cs) |
| IL (1) | IL105018A0 (cs) |
| MX (1) | MX9301344A (cs) |
| NO (1) | NO930890L (cs) |
| NZ (1) | NZ247105A (cs) |
| YU (1) | YU16993A (cs) |
| ZA (1) | ZA931723B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1384786B1 (en) * | 2001-04-02 | 2010-01-27 | Glycomedics, Inc. | Process for producing oligosaccharide chains |
| FI20011664L (fi) * | 2001-08-17 | 2003-02-18 | Carbion Oy | Syöpäpesifiset oligoskkaridisekvenssit ja niiden käyttö |
| US7943763B2 (en) * | 2002-07-05 | 2011-05-17 | Otsuka Chemical Holdings Co., Ltd. | Process for preparing glycopeptides having asparagine-linked oligosaccharides, and the glycopeptides |
| AU2003292641B2 (en) * | 2002-12-26 | 2007-11-29 | Glytech, Inc. | Three-branched sugar-chain asparagine derivatives, the sugar-chain asparagines, the sugar chains, and processes for producing these |
| JP3884725B2 (ja) | 2003-06-03 | 2007-02-21 | 三菱電機株式会社 | 導波管装置 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5009889A (en) * | 1987-12-31 | 1991-04-23 | Oklahoma Medical Research Foundation | Treatment of dysfunctional vascular endothelium using activated protein C |
-
1993
- 1993-03-10 NZ NZ247105A patent/NZ247105A/en unknown
- 1993-03-10 ZA ZA931723A patent/ZA931723B/xx unknown
- 1993-03-10 CZ CZ93390A patent/CZ39093A3/cs unknown
- 1993-03-10 HU HU9300687A patent/HUT69613A/hu unknown
- 1993-03-11 MX MX9301344A patent/MX9301344A/es not_active Application Discontinuation
- 1993-03-11 FI FI931086A patent/FI931086L/fi not_active Application Discontinuation
- 1993-03-11 AU AU35199/93A patent/AU661762B2/en not_active Ceased
- 1993-03-11 CA CA002091521A patent/CA2091521A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-11 YU YU16993A patent/YU16993A/sh unknown
- 1993-03-11 BR BR9301136A patent/BR9301136A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-03-11 JP JP05056193A patent/JP3171506B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-11 IL IL105018A patent/IL105018A0/xx unknown
- 1993-03-11 NO NO93930890A patent/NO930890L/no unknown
- 1993-03-11 KR KR1019930003656A patent/KR930019696A/ko not_active Withdrawn
- 1993-03-11 CN CN93104040A patent/CN1079967A/zh active Pending
- 1993-03-12 AT AT93301878T patent/ATE137241T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-03-12 ES ES93301878T patent/ES2088227T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-12 CY CY194793A patent/CY1947A/xx unknown
- 1993-03-12 DE DE69302317T patent/DE69302317T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-03-12 EP EP93301878A patent/EP0565241B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-12 DK DK93301878.0T patent/DK0565241T3/da active
-
1996
- 1996-06-12 GR GR960401581T patent/GR3020406T3/el unknown
- 1996-07-18 HK HK132396A patent/HK132396A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9301344A (es) | 1993-09-01 |
| ZA931723B (en) | 1994-09-10 |
| CN1079967A (zh) | 1993-12-29 |
| GR3020406T3 (en) | 1996-09-30 |
| HUT69613A (en) | 1995-09-28 |
| DK0565241T3 (da) | 1996-05-28 |
| FI931086A0 (fi) | 1993-03-11 |
| BR9301136A (pt) | 1993-09-28 |
| JPH0625302A (ja) | 1994-02-01 |
| EP0565241A1 (en) | 1993-10-13 |
| CA2091521A1 (en) | 1993-09-13 |
| ATE137241T1 (de) | 1996-05-15 |
| YU16993A (sh) | 1996-02-19 |
| JP3171506B2 (ja) | 2001-05-28 |
| DE69302317T2 (de) | 1996-09-19 |
| FI931086A7 (fi) | 1993-09-13 |
| EP0565241B1 (en) | 1996-04-24 |
| ES2088227T3 (es) | 1996-08-01 |
| HK132396A (en) | 1996-07-26 |
| IL105018A0 (en) | 1993-07-08 |
| FI931086L (fi) | 1993-09-13 |
| KR930019696A (ko) | 1993-10-18 |
| NO930890D0 (no) | 1993-03-11 |
| NZ247105A (en) | 1994-11-25 |
| AU661762B2 (en) | 1995-08-03 |
| HU9300687D0 (en) | 1993-05-28 |
| NO930890L (no) | 1993-09-13 |
| CY1947A (en) | 1993-03-12 |
| DE69302317D1 (de) | 1996-05-30 |
| AU3519993A (en) | 1993-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yan et al. | Novel Asn-linked oligosaccharides terminating in GaINAcβ (1→ 4)[Fuca (1→ 3)] GlcNAcB (1→•) are present in recombinant human Protein C expressed in human kidney 293 cells | |
| US6903069B2 (en) | Factor VII glycoforms | |
| AU2001291652A1 (en) | Factor VII glycoforms | |
| Valley et al. | Incorporation of ammonium into intracellular UDP‐activated N‐acetylhexosamines and into carbohydrate structures in glycoproteins | |
| Linsley et al. | Applications of electrospray mass spectrometry to erythropoietin N-and O-linked glycans | |
| AU604425B2 (en) | Oligosaccharides isolated from t-pa glycoproteins | |
| TW201247873A (en) | Method for producing sialic-acid-containing sugar chain | |
| KOTANI et al. | Knockout of mouse β1, 4-galactosyltransferase-1 gene results in a dramatic shift of outer chain moieties of N-glycans from type 2 to type 1 chains in hepatic membrane and plasma glycoproteins | |
| US20080207895A1 (en) | Methods for synthesizing polysaccharides | |
| CZ39093A3 (en) | Oligosaccharide and pharmaceutical preparation in which it is comprised | |
| Pfeiffer et al. | Carbohydrate structure of recombinant human uterine tissue plasminogen activator expressed in mouse epithelial cells | |
| Mizuochi et al. | Studies on the structures of the carbohydrate moiety of human prothrombin | |
| KR20160122158A (ko) | 인자 vii 컨쥬게이트 | |
| US4851517A (en) | Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells | |
| Mori et al. | Isolation and characterization of endogenous ligands for liver mannan-binding protein | |
| Böhme et al. | Tyrosine sulfation and N‐glycosylation of human heparin cofactor II from plasma and recombinant Chinese hamster ovary cells and their effects on heparin binding | |
| Kuraya et al. | Structural analysis of O-linked sugar chains in human blood clotting factor IX | |
| US20150225710A1 (en) | Coagulation Factor IX Conjugates | |
| EP0236289A2 (en) | Tissue plasminogen activator from normal human colon cells | |
| JPS62282581A (ja) | ヒト正常結腸細胞由来組織プラスミノ−ゲン活性化因子 | |
| MELCHER et al. | Glycosylation-site-selective synthesis of N-acetyl-lactosamine repeats in bis-glycosylated human lysozyme |