CZ401797A3

CZ401797A3 - DNA markery pro velikost vrhu mláďat

Info

Publication number: CZ401797A3
Application number: CZ974017A
Authority: CZ
Inventors: Alan John Mileham; Graham Stuart Plastow; Olwen Irene Southwood
Original assignee: Dalgety Plc
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 1998-08-12
Also published as: BR9608763A; DE69620249D1; ATE215129T1; KR19990022827A; AU6012096A; PL184518B1; GB9511888D0; WO1996041892A1; EP0879296A1; PT879296E; EP0879296B1; RU2162895C2; KR100441311B1; US6410227B1; MX9710091A; ES2175095T3; AU723769B2; CA2224394A1; DE69620249T2; NZ309858A

Description

DNA markéry pro velikost vrhu mláďat

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu screeningu prasat pro stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti osteopontinových (OPN) allel spojených se zvýšenou velikostí vrhu mláďat, použití takových metod při předpovídání velikosti vrhu mláďat u prasat a kitů pro provedení takových metod.

Dosavadní stav techniky

Produkce masa a efektivnost chovu zvířat by mohly být zlepšeny, jestliže by bylo možno zvýšit velikost vrhu mláďat u zvířat. Stejný výstup zvířectva by mohl být dosažen od méně rodičovských zvířat a tak by bylo možno dosáhnout snížených produkčních nákladů. Navíc organizace chovu zvířat by mohla být zlepšena potenciálním vyhledáváním více potomstva od zvířat se zlepšenými genetikami. Avšak je velmi obtížné běžně vybrat velikost vrhu, protože je omezena na jedno pohlaví a je velmi ovlivněna negenetickými faktory (dědičností, měřením frakce fenotypických variací, která je díky genetickým rozdílům přibližně 0,1 pro velikost vrhu u prasat).

Za jedno z řešení zlepšení velikosti vrhu se považuje zavedení vylepšujících genů do produkční linie z chovů, které mají významně větší velikosti vrhů. Avšak kvantitativní genetiky naznačují, že komplexní znaky jako je velikost vrhu, jsou kontrolovány velkým množstvím genů, majících každý malý vliv na znak. Jestliže toto je pravdivé, genetický progres selekce komplexních znaků je pravděpodobně velmi pomalý. Alternativním pohledem je, že ačkoliv je mnoho genů zahrnuto v komplexních znacích, málo ze zahrnutých genů (hlavních genů) má velké vlivy na znaky. Jestliže tento alternativní pohled je pravdivý, pak genetický progres takových znaků by mohl být rychlý s podmínkou, že je možné identifikovt a vybrat přínosné allely relevantních hlavních genů. Protože je možno mapovat genom, stalo se možným identifikovat geny, ovlivňující kvantitativní znaky (kvantitativní znaková místa - quantitative trait loci, QTL) hodnocením spojení mezi znaky a molekulárními markéry distribuovanými v genomu zvířat pro který jsou mapy dostupné. Důležité je, že pro selekční účely je dědičnost takových markerových fenotypů 1,0.

Chov prasat Chinese Meishan je znám tím, že produkuje o asi 4 selata více na vrh než nejvíce plodné evropské chovy. Geny pro plodnost (velikost vrhu) z tohoto chovu by mohly být velmi cenné v programech vedených na zvýšení velikosti vrhu komerčních západních chovů prasat. Skutečně genetický znak spojený s estrogen receptorovým genem (ESR) Meishanu byl zjištěn jako mající přínosné vlivy na velikost chovu a je popsán ve WO92/18651.

Chov ovcí Booroola Merino je extrémně plodný. Běžné jsou vrhy velikosti tři nebo více. Významné zvýšení plodnosti tohoto chovu bylo zjištěno jako způsobené působením jediného genu, FECB (přehled viz G.W.Montgomery a spol., Endocrine Rewiews, 13: 309-328 (1992)). Genetické mapování za použití lidských DNA markérů ukázalo, že lidská verze FECB je lokalizována na chromosomu (G.W.Montgomery a spol., Nátuře Genetics, 4: 410-114 (1993)) a je pevně spojena s genem, kódujícím sekretovaný fosfolipoprotein-1 (SPP-1), také známý jako osteopontin (OPN), 2ar, kostní silaoprotein-1, 44 kDa kostní fosfoprotein a tumorový sekretovaný fosfoprotein. Srovnávací mapování (H.Ellegren a spol., Genomics, 17: 599-603 (1993) ukázalo, že lidský chromosom 4 a prasečí chromosom 8 jsou vysoce podobné (syntenické). Prasečí SPP-1 gen je také lokalizován na chromosomu 8.

V poslední době bylo zjištěno, že FECB-navázený markér u hovězího dobytka nepůsobí jako markér pro zvýšení velikosti vrhu u stád vybraných pro zvýšenou ovulační rychlost (Blattman a spol., Mid-West Animal Science Meeting, 18: 43 (1995)).

Podle předmětného vynálezu bylo však překvapivě nalezeno, že u prasat jsou určité DNA markéry pro OPN spojeny s velikostí vrhu a že mohou být použity pro výběr prasat s větší šancí produkovat zvýšenou velikost vrhu a pro výběr proti zvířatům, která mají alely indikující menší velikosti vrhu. Jak je zde použito zvýšená velikost vrhu znamená výzmané zvýšení velikosti vrhu nad průměr dané populace.

Je zajímavé poznamenat, že je zde zřejmý bod zlomu v chromosomové syntenii kolem OPN mezi ovcí, hovězím dobytkem a člověkem na jedné straně a myší a prasetem na straně druhé (Montgomery a spol., J.Reproduction and Fertility supplement, 49: 113-121 (1995)). Toto naznačuje, že struktura chromosomu může být v této oblasti změněna, mezi zvířaty, majícími velké vrhy (myš a prase) a těmi s vrhy malými (člověk, ovce a kráva), takže je vliv hlavního genu pro plodnost modifikován. Možná vysvětlení zahrnují, že exprese hlavního genu může být zvýšena nebo snížena zavedením do traskripčně aktivnější nebo neaktivní oblasti;

hlavní gen můž být zaveden přímo pod kontrolu změněného promotorového prvku; poloha hlavního genu vzhledem k OPN mohla být změněna tak, že OPN se stává použitelnějším markérem v hodnocení potenciálu velikosti vrhu u prasat než u ovcí nebo hovězího dobytka.

Podstata vynálezu

Podle prvního aspektu předložený vynález poskytuje způsob screeningu prasat pro stanovení těch, která pravděpodobně produkují větší vrhy a/nebo těch s menší pravděpodobností produkce větších vrhů, kde tento způsob zahrnuje stupně:

(i) získání vzorku genomické DNA z prasete; a (ii) analýzu genomické DNA získané ve stupni (i) pro stanovení, která(é) OPN allela(y) je/jsou přítomny.

Vhodně se stupeň (ii), totiž stanovení OPN allel, provádí vyhodnocením jednotlivých DNA markérů navázaných buď přímo nebo nepřímo k OPN.

Spojení mezi genetickými markéry a geny odpovědnými za jednotlivý znak může být přerušeno genetickou rekombinací. Čím těsnější fyzická vzdálenost mezi příslušným markérem a genem, tím je méně pravděpodobné, že je rekombinace bude separovat. Je také možné zavést vazbu mezi specifickými allelami alternativních DNA markérů a allel DNA markérů známých jako spojených s jednotlivým genem (např. zde diskutovaným OPN genem), který byl dříve zjištěn jako spojený s jednotlivým znakem. V dané situaci odebráním OPN genu, by bylo možné, alespoň na krátkou dobu, vybrat prasata pravděpodobně produkující větší vrhy, nebo alternativně prasata pravděpodobně produkující menší vrhy, nepřímo, výběrem určitých allel OPN spojeného markéru přes selekci specifických allel alternativních chromosomových 8 markérů. Příklady takových markérů, o kterých je známo, že jsou navázány k OPN na prasečím chromosomu 8 zahrnují Sw61, Swl085, sW194, sW16, SW790 a SO178, tyto markéry jsou všechny mikrosatelity.

V dalším provedení vynálezu se používá mnoho takových markérů. Například páry markérů by mohly být použity pro uzavření hlavního genu pro snížení jakýchkoliv možných účinků rekombinace. Příklady takových kombinací markérů zahrnují SO178 a SW61 a SO178 a SW790.

Protože takový účinek může být spojen s rozdílem v genových uspořádáních prasat (a myši) a ovce (a lidí a hovězího dobytka), toto naznačuje, že nejvhodnější druhý markér bude v nehomologní (nesyntetické) oblasti prasečího chromosomu 8. Příklad vhodné kombinace markérů známých k uzavření této oblasti by byl OPN a SO178. Avšak odborníkovi v oboru bude zřejmé, že by mohly účinně být identifikovány jiné vhodné markéry.

Jednotlivý genetický markér spojený s OPN je mikrosatelit. Jsou to jednoduchá sekvenční opakování 4, 3 nebo obvykleji 2 nukleotidů, kerá se objevují v podstatě náhodně kolem genomu přibližně každých 50000 bází (asi 60000 mikrosatelitů na haploidní genom). Zadrhávání (stuttering) DNA polymerasy během replikace a nestejné zesítění během rekombinace jsou považovány za vedoucí ke ztrátě nebo zisku opakujících se jednotek. Toto znamená, že mikrosatelity jsou obvykle polymorfní a mají určitou • · • · · · · · opakující se délku allel.

Příkladem mikrosatelitu spojeného s daným genem je (CA)_n, vedoucí k možným allelám, opakující se délky, např. (CA)₂, (CA)₉, (CA)₁₀, (CA)_X1 a (CA)₁₂.

Použitím primerů schopných hybridizace (například za přísných podmínek) k oblastem, přiléhajícím k mikrosatelitům spojeným s daným genem, v kombinaci se standardními PCR technikami, mohou být generovány PCR produkty různé délky, kde délka je závislá na délce jednotlivé opakující se jednotky allely mikrosatelitu.

Analýza spojení takových PCR produktů za použití mikrosatelitu spojeného s OPN genem s velikostí vrhu umožnila stanovit u prasat markér délky allel spojených se zvýšenou a sníženou velikostí vrhu.

Vhodné primerové páry, které budou hybridizovát k přiléhajícím oblastem takových mikrosatelitů zahrnují ty, které mají následující sekvenci:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA; nebo

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC; a

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; nebo CAACCCACTTGCTCCCAC.

Zejména allely opakující se jednotkové délky pro výše uvedený mikrosatelitový markér, označené 132 a 136, byly shledány jako spojené se zvýšenou velikostí vrhu u prasat.

Navíc, allela opakující se jednotkové délky, označená 112, byla zjištěna jako spojená se sníženou velikostí vrhu u prasat.

• ·· · ·· • « ·· ··· · • ' ·

Ve skutečnosti allela spojená se zvýšenou velikostí vrhu byla převážně získaná z evropského rodičovského původu. Toto je v rozporu s předpoklady, protože jak diskutováno výše, Meishan má navíc čtyři selata na vrh než buď Landrace nebo Duroc a mohlo by se očekávat, že přínosné markéry by měly být spojeny s geny děděnými z Meishan rodičovstva.

Podle druhého aspektu předložený vynález poskytuje způsob screeningu prasat pro stanovení těch, u kterých je pravděpodobnější, že budou produkovat větší vrhy, a tento způsob zahrnuje stupně:

(i) získání vzorku genomické DNA z prasete;

(ii) hybridizací genomické DNA z (i) s jedním nebo více vhodnými primery;

(iii) provední jednoho nebo více PCR cyklů za použití hybridizované nukleové kyseliny z (ii); a (iv) analýzy délky PCR produktu získaného ve (iii).

Výhodně jsou způsoby podle předloženého vynálezu prováděny za použití činidel a instrukcí předložených ve formě kitu (soupravy).

Podle třetího aspektu tak předložený vynález poskytuje kit pro screening parasat pro stanovení těch, která pravděpodobněji produkují větší vrhy a/nebo těch, která méně pravděpodobně produkují větší vrhy, který obsahuje jedno nebo více činidel nebo materiálů schopných identifikace OPN allel ve vzorku prasečí genomické DNA.

Preferovaný kit podle vynálezu bude obsahovat činidla nebo materiály schopné identifikace allel spojených s DNA markéry navázanými k OPN genu, např. mikrosatelitový markér.

Takový kit by výhodně měl obsahovat jeden nebo více DNA primerů popřípadě společně se standardními PCR činidly.

Konečně, odborníkovi pracujícímu v daném oboru bude zřejmé, že způsoby a kity zde popsané mohou být použity ve spojení s jinými již popsanými metodami a kity pro vyhledávání prasat pro určení těch, která pravděpodobněji produkují větší vrhy (nebo také těch, produkujících menší vrhy). Příklady jiných takových metod a kitů jsou ty, které jsou popsány ve WO82/18651. Mělo by, samozřejmě, být možné produkovat kombinované kity, které by mohly být použity pro screening prasečí DNA za použití obou metod.

Ve WO-A-9218651 a USSN 08/312312 jsou popsány metody stanovení, která prasata budou mít větší vrhy, na základě navázání s ESR genem. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že screeningové metody podle předloženého vynálezu mohou být kombinovány s v poslední době popsanými ESR screeningovými metodami pro poskytnutí ještě hodnotnějšího nástroje pro taková určení. V dalším aspektu poskytuje tak předložený vynález způsob screeningu prasat pro stanovení těch, která pravděbodobně poskytují větší vrhy a/nebo těch, která méně pravděpodobně poskytují větší vrhy, kde tento způsob zahrnuje stupně:

(i) získání vzorku genomické DNA z prasete;

(ii) analýzy genomické DNA získané ve stupni (i) pro stanovení, která(é) OPN allela(y) je/jsou přítomny; a (iii) analýzy genomická DNA získané ve stupni (i) pro stanovení, která allela(y) z alespoň jednoho genu spojeného s velikostí vrhu u prasat je/jsou přítomny.

V jednom z výhodných provedení tohoto aspektu vynálezu je alespoň jedním jiným genem ESR gen, jak je popsáno ve WO-A-9218651 a USSN 08/312312.

V konečném aspektu poskytuje předložený vynález kit pro screening prasat pro určení těch, která pravděpodobněji produkují větší vrhy a/nebo těch, která pravděpodobněji produkují menší vrhy, který obsahuje jedno nebo více činidel nebo materiálů schopných identifikace OPN allel ve vzorku prasečí genomické DNA, společně s jedním nebo více činidly nebo mateiály, schopnými identifikace allel alespoň jednoho jiného genu spojeného s velikostí vrhu u prasat ve vzorku prasečí genomické DNA.

Preferované znaky každého aspektu vynálezu jsou aplikovatelné na každý jiný aspekt mutatis mutandis.

• · • ··

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude blíže vysvětlen s pomocí následujících konkrétních příkladů provedení , které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Příklad 1

Příprava DNA

DNA může být připravena z jakéhokoliv zdroje tkáně, obsahujícího buněčná jádra, například bílých krvinek, vlasových folikul, ušních boltců a svalů. Postup uvedený zde se týká přípravků z krevních buněk; jiné tkáně mohou být zpracovány podobně přímým suspendováním materiálu v K pufru a pak zpracováním stejně jako v postupu s krví. Způsob zde popsaný produkuj buněčný lyzát, obsahující surovou DNA, která se vhodná pro PCR amplifikaci. Nicméně by mohla být stejně účinná jakokoliv metoda pro přípravu čištěné nebo surové DNA.

Krev by měla být shromážděna v 50 mM EDTA pH 8,0 pro zabránění srážení. 50 μΐ krve se umístí do malé odstředivkové zkumavky (0,5 ml Eppendorfova zkumavka nebo její ekvivalent). Pro lýzi červených krvinek se přidá 450 μΐ TE pufru (hae skupiny inhibující OCR) a směs se vortexuje 2 sekundy. Intaktní bílé a zbylé červené krvinky se odstřeďují 12 sekund při 13000 g v mikroodstředivce. Supernatant se odstraní šetrným odsátím za požití systému nízkotlakové vakuové pumpy. Pak se přidá dalších 450 μΐ TE pufru pro lýzi zbývajících červených krvinek a bílé krvinky se oddělí odstřeďování jako dříve. Jestliže peleta zůstává načervenalá, opakuje se postup až je peleta bílá. Po ·· ····

- 11 odstranění poslední kapky supernatantu z peletovaných bílých krvinek se přidá 100 μΐ K pufru, obsahujícího proteinasu

K a směs se inkubuje při 55 °C 2 hodiny. Směs se pak zahřívá na 95 až 100 °C 8 minut a DNA lyzáty se uchovávají při -20 °C do upotřebení.

Činidla

TE pufr:	10 mM TRIS-HC1 pH 8,0 1 mM EDTA
K pufr:	50 mM KC1 10 mM TRIS-HC1 pH 8,3 2,5 mM MgCl₂ 0,5 % Tween 20

Před použitím pro lyzáty se přidá 10 μΐ 20 mg/ml proteinasy K (Boehringer Mannheim) na 1,0 ml K pufru.

PCR

Reakce se provádějí následovně v tenkostěnných 0,25ml zkumavkách (Perkin Elmer):

1,5 μΐ lOx pufr;

1,5 μΐ 15 mM MgCl₂;

1,5 μΐ 2 mM dNTP (Pharmacia);

0,5 μΐ každého primeru při 5 mM (Genosys);

μΐ sterilní deionizované vody;

0,1 μΐ (0,5 jednotek) AmpliTaq DNA polmerasy (Perkin

Elmer);

μΐ DNA lyzátů.

Reakční zkumavky se pak umístí do Perkin Elmer 9600 tepelného cyklovače a PCR se provádí režimem, který je uveden dále:

’C 4 minuty; cyklů při 94 °C po °C 1 minutu;

C 4 minuty;

°C podle potřeby.

Činidla lOx PCR pufr přední primer nebo reverzní primer nebo ···· 44

4·

44

4 44

44 4 sekund, 58 °C 1 minutu; a

100 mM Tris-HCl pH 8,3 (25 °C),

500 mM KC1

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC

GTGTCATGAGGTTTGTGCCACTGC

CAACCCACTTGCTCCCAC • · • · • · · • · jeden z primerů označen fluorescentním

Jestliže je markérem, mohou být výsledné produkty analyzovány na automatizovaném DNA sekvenátoru jako je Applied Biosystems 373 DNA Sequencer za použití Genescan and Genotyper softwaru.

Příklad 2

Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu μΐ PCR produktů se smísí se 2 μΐ plnícího pufru a dělí se na destičce nedenaturujícího polyakrylamidového gelu v 1 x TBE pufru při 100 V po 4 hodiny. Gel se pak vybarví v 50 ng/ml roztoku ethidiumbromidu po 30 minut a PCR produkty se vizualizují a fotografují v UV světelném prosvětlovacím přístroji. Velikosti PCR produktů v párech bází se pak hodnotí z relativních pohyblivostí ve srovnání se známými markéry molekulové motnosti na stejném gelu.

• ·· ·

·>

Velikost hodnocených PCR produktů odpovídá délce mikrosatelitové allely.

PCR produkty byly také analyzovány na Applied

Biosystems DNA Sequenceru po použití fluorescenčně značeného primeru v PCR.

Výsledky

Frekvence OPN allely

Výsledky pro frekvence OPN allely v různých prasečích populacích jsou uvedeny v tabulce 1.

• e

Tabulka 1

Frekvence OPN allely v různých prasečích populacích

Populace	OPN allely	počet	procenta
Landrace	112	3	21
	132	6	43
	136	2	14
	142	3	21
Meishan	132	2	17
	140	8	67
	142	1	8
	154	1	8
L9 3	112	10	3
	122	2	1
	124	30	8
	132	39	10
	134	1	0
	136	36	9
	140	171	43
	142	60	15
	153	2	1
	154	43	11
L94	123	45	28
	132	15	9
	136	9	6
	140	84	52
	154	9	6

- 15 L93 zvířata z populace získané křížením Landrace x Meishan.

L94 zvířata z populace získané křížením Duroc x Meishan.

Statistická analýza

Samice zvířat získané z L93 a L94 byly hodnoceny na velikost vrhu (jak celkový počet mláďat (total number born (TNB) tak na počet živých mláďat (number born alive (NBA)), během několika porodů je-li to možné a tato data byla porovnána s OPN mikrosatelitními genotypy pro stejnou sadu zvířat. Statistické vztahy mezi velikostí vrhu a OPN genotypy byly hodnoceny za použití metody nejmensích čtverců pro převedení do obecného lineárního modelu. Průměry nejmenších čtverců (Least Squares Means - LSM) pro velikosti vrhu byly hodnoceny pro každý OPN genotyp. LSM jsou průměry upravené pro jiné účely v modelu, který by mohl ovlivnit velikost vrhu.

Vliv jenotlivých OPN allel byl dále rozebírán za použití allelového substitučního modelu, ve kterém byla zvířata klasifikována do skupin v závislosti na tom, zda nesou 0, 1 nebo 2 kopie jednotlivé allely. LMS pro velikost vrhu byly hodnoceny pro každou skupinu. Výsledky jsou uedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Allelová substituční data pro L93

Počet kopií allel

0	1	2
Allela	znak	LSM	n	LSM	n	LSM	n	model	OPN
112	TNB	13,0	306	11,8	21		0	+	+
	NBA	11,8		10,9				NS	NS
124	TNB	12,9	281	13,0	46		0	+	NS
	NBA	11,8		11,6				NS	NS
132	TNB	12,8	260	13,3	57	14,3	10	+	NS
	NBA	11,5		12,3		13,9		NS	*
136	TNB	12,9	271	12,9	53	17,5	3	*	+
	NBA	11,8		11,6		11,1		NS	NS
140	TNB	12,7	81	13,1	175	12,8	71	+	NS
	NBA	11,5		11,9		11,6		NS	NS
142	TNB	13,0	253	12,8	68	11,3	6	+	NS
	NBA	11,8		11,7		9,8		NS	NS
153	TNB	12,9	320	13,0	7		0	+	NS
	NBA	11,8		10,9				NS	NS
154	TNB	13,0	284	12,5	39	11,5	4	+	NS
	NBA	11,8		11,4		10,7		NS	NS

·· ····

- 17 Významnost hladiny: *, P<0,05; + P<0,10; NS, P>0,10. Model zahrnuje roční období, AI nebo přírodní servis, paritu, generaci a OPN genotyp.

TNB celkový počet narozených NBA počet živých narozených LSM metoda nejmenšího čtverce n počet záznamů, t.j. vrhů

Z těchto údajů je vidět, že allela 112 se jeví být spojena s negativním vlivem na velikost vrhu, zatímco pozitivní sklony jsou vidět z allel 132 (NBA) a 135 (TNB). Data uvedená v tabulce 1 naznačují, že zatímco allely 112 a 136 jsou pravděpodobně získány z Landrace, allela 132 by mohla být získána bud’ z Landrace nebo Meishan předků. Nicméně protože 132 allela je více než dvakrát běžnější v Landrace než v Meishan, je pravděpodobné, že významný podíl 132 allel v L93 pochází z Landrace.

« · · · « · • ♦

Tabulka 3

Počet kopií allel

0	1	2	významnost
allela	znak	LSM	n	LSM	n	LSM	n	model	OPN
132	TNB	12,2	375	12,9	82	14,2	12	***	+
	NBA	10,9		11,9		13,5		**	**
136	TNB	12,3	393	12,3	73	16,9	3	***	*
	NBA	11,1		11,0		10,5		NS	NS

Hodnocení významnosti: ***, P<0,001; **, P<0,01; + , P<0,05; NS, nevýznamné.

Tyto údaje ukazují, že pouze allela 132 měla významný pozitivní vliv na velikost vrhu jak u TNB tak NBA. Ačkoliv allela 136 byly blízká významnosti TNB, je pravděpodobné, že tento vliv je způsoben malým množstvím 136/136 zvířat (3) s velmi vysokými pozorováními.

Spojení mezi OPN allelou 132 a velkou velikostí vrhu bylo nyní demonstrováno ve dvou různých liniích prasat (L93 a L94). Toto naznačuje, že QTL ovlivňující velikost vrhu je těsně spojen s prasečím OPN genem. Nicméně je možné, že v jiných rodinách, liniích nebo chovech prasat, bude různá OPN alela spojena se zvýšenou velikostí vrhu.

Výsledky re-analýzy dat pro L93 a L94 a pro další linii L07 (velká bílá linie) jsou uvedeny dále v tabulce 4 za použití alternativního modelu. Tento zahrnuje zapojení každé OPN allely jako variabilní a kódování každého zvířete s 0, 1 nebo 2 z každé alely (tj. 0, 1 nebo 2 kopiemi každé allely).

Stálé vlivy jsou typ stádo-období-servis a parita. Samec byl zahrnut jako náhodný vliv. ESR a OPN byly brány jako kovariabilní. Všechna data na linii byla zahrnuta, ne jen plně nebo polo-sourozencké rodiny. OPN allely s méně než 10 vrhy druhého genotypu byly z analýz vyloučeny.

Analyzované znaky byly celkový počet narozených (total number born - TNB) a počet živě narozených (number born alive - NBA).

Pro každou linii proběhly tři modely, zahrnující stálé, náhodné a ESR vlivy jak jsou uvedeny výše.

1. Model vylučující ΟΡΝ

2. Model zahrnující všechny OPN allely

3. Model zahrnující OPN allely individuálně —2 log pravděpodobnost byla získána pro každý model.

Významnost modelu byla vypočtena odečtením log pravděpodobnosti z modelů 2 nebo 3 od modelu 1 a porovnáním výsledku proti Chi-čtvercové distribuci. Použité stupně nezávislosti (degrees of freedom - df) byl rozdíl mezi dvěma modely.

Hladiny významnosti na linii pro model 2 a jakékoliv významné allely v modelu 3 jsou uvedeny dále v tabulce.

- 21 Tabulka 4

	TNB	NBA
linie	model/	význam-	vliv	význam-	vliv
	allela	nost	allelové	nost	allelové
			substituce		substituce
7	2	P<0,10		P<0,10
	3/OPN122	P<0,05	-1,30	P<0,05	-1,37
93	2	P<0,10		P<0,05
	3/OPN112	P<0,10	-0,87	P<0,10	-0,92
	3/OPN132	NS	+0,49	P<0,05	+0,72
	3/OPN154	P<0,10	-0,72	NS	-0,46
94	2	P<0,01		P<0,05
	3/OPN124	P<0,10	-0,83	P<0,10	-0,74
	3/OPN132	P<0,01	+1,62	P<0,05	+ 1,42

·· ····

- 22 Z těchto dat je možno učinit následující závěry:

1. OPN odpovídá za významné množství variací ve velikosti vrhu (po zahrnutí ESR) pro L07 (P<0,10); L93 (TNB: P<0,10; NBA: P<0,05) a L94 (TNB: P<0,01; NBA: P<0,05).

2. OPN allela 132 ukazuje významný pozitivní vliv na velikost vrhu u L93 a L94.

3. Další allely OPN122 (L07), OPN112 a OPN154 (L93) a OPN124 (L94) ukazují významné negativní vlivy.

Příklad 3

Byly získány a analyzovány vzorky genomické DNA z další linie L03 (jiná velikost bílé základní linie). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5. Bylo analyzováno 416 zvířat se záznamy 1010 vrhů.

Pracovalo se s některými odlišnými modely. Všechny modely zahrnují vliv farma-měsíc vrhu selat, parity a samce. ESR byl brán jako kovariující ve všech analýzách.

Analyzované znaky byly celkový počet narozených (TNB) a počet živých narozených (NBA).

Použité modely:

1. Celkový počet narozených = vrh selat-měsíc + samec + ESR + OPN allela

2. TNB nebo NBA = vrh selat-měsíc + samec + ESR+OPN112+OPN122 atd.

- 23 Tabulka 5

TNB

NBA

model/allela významnost allelová	významnost e	allelová substituce n vliv
e	e	substituce n vliv
1/OPN124	P<0,01	+0,72
1/OPN136	P<0,15	-0,27
1/OPN138	P<0,15	+2,04
1/OPN142	P<0,15	-0,27
2/OPN112	NS	+0,34	NS	+0,58
2/OPN122	NS	-0,13	NS	-0,18
2/OPN124	<0,05	+0,65	NS	+0,33
2/OPN132	NS	+0,31	NS	+0,08
2/OPN136	NS	-0,29	NS	-0,37
2/OPN138	<0,15	+ 2,06	NS	+1,81
2/OPN140	NS	-0,11	NS	-0,16
2/OPN142	NS	-0,22	<0,15	-0,40
2/OPN144	NS	-1,06	NS	-1,16
2/OPN146	NS	+1,08	NS	+0,15
2/OPN154	NS	+0,02	NS	-0,02

*

- 24 Tato data naznačují, že OPN 124 vykazuje významný (P<0,01) pozitivní vliv pro TNB 0,7 pro každou kopii allely. Navíc OPN 142 ukazuje trend proti negativnímu vlivu na velikost vrhu u L03, podobný vliv jako je vidět u L93.

Jak je diskutováno výše, jiný gen ESR byl také shledán jako ovlivňující velikost vrhu prasat a je pravděpodobné, že v budoucnosti budou identifikovány i jiné geny spojené s velikostí vrhu. Bylo vyhodnocováno, zda určité přínosné allelové ombinace dvou odlišných genů, OPN a ESR, poskytují aditivní vliv na velikost vrhu.

Pro testování této možnosti byl hodnocen vztah mezi velikostí vrhu a různými kombinacemi ESR a OPN allel. Výsledky uvedené dále v tabulkách 4 a 5 ukazují, že skutečně se přínosné allely OPN mohou kombinovat pozitivně s přínosnými allelami ESR tak, že je možno výhodě realizovat i větší velikosti vrhu než při použití přínosných allel OPN nebo ESR samotných.

Tabulka 4

Vliv allelové substituce pro OPN a ESR markéry na velikost vrhu (TNB) v linii 93 (L93)

Markér	vliv allelové substituce na TNB	významnost
OPN 132	+0,49	ns
ESR B	+0,34	ns
OPN 132 nebo ESR B	+0,39	P<0,l

- 25 Tabulka 5

Očekávaná výhoda velikosti vrhu (TNB) pro různé kombinace OPN a ESR markérů v linii 93 (L93) za základě dat uvedených v tabulce 4

Genotyp vliv na velikost vrhu

ESR	ESR	OPN	OPN	(TNB)
-	-	-	-	0,00
B	-	-	-	+0,34
B	B	-	-	+0,68
-	-	132	-	+0,49
-	-	132	132	+0,98
B	-	132	-	+0,83 (+0,78)
B	B	132	-	+1,17 (+1,12)
B	-	132	132	+1,32 (+1,27)
B	B	132	132	+1,66 (+1,56)

Vlivy na velikost vrhu zahrnují kompletní aditivitu (OPN 132 % +0,49; ESR B = +0,34) s výjimkou údajů vzávorkách, které shrnují vliv OPN 132 nebo ESR B = +0,39.

- 26 Ρν ···· ·· · ·· ·· ···· « 9 9 99 9 9 9 99 • · · · · · ·· • · · ♦ · · · ···· • · · · · · 99 • · ·· ♦······ ·· ·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob screeningu prasat pro stanovení těch, která pravděpodobněji budou produkovat větší vrhy a/nebo těch, která budou méně pravděpodobně produkovat větší vrhy, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně (i) získání vzorku genomické DNA z prasete a (ii) analýzu genomické DNA získané v (i) pro stanovení, která/é osteopontinová/é (OPN) allela(y) je/jsou přítomny.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že stanovení OPN allel ve stupni (ii) zahrnuje stanovení přítomnosti alespoň jedné allely spojené s alespoň jedním DNA markérem navázaným buď přímo nebo nepřímo k OPN.
3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že DNA markér je mikrosatelit.
4. Způsob podle nároku 3,vyznačuj ící se tím, že DNA markér je Swl085, SW194, Swl6, Sw790, Sol78 nebo Sw61.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že se ke vzorku genomické DNA přidá jeden nebo více primeru schopných hybridizace k oblasti spojené s mikrosatelitem s následujícím jedním nebo více cykly PCR pro generování příměrových prodloužených produktů.
6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že OPN allela nebo allely přítomné ve vzorku genomické DNA je determinována odkazem na délku příměrového(ých) prodlouženého(ých) produktu(ů).
7. Způsob podle nároku 5 nebo nároku 6, vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více z následujících primerů:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; nebo CAACCCACTTGCTCCCAC.
8. Způsob screeningu prasat pro stanovení těch, která pravděpodobně budou produkovat větší vrhy a/nebo těch, které budou méně pravděpodobně produkovat větší vrhy, vyznačující se tím, že zahrnuje (i) získání vzorku genomické DNA z prasete;

(ii) hybridizací genomické DNA z (i) s jedním nebo více vhodnými primery;

(iii) provedení jednoho nebo více PCR cyklů za použití hybridizované nukleové kyseliny z (ii); a (iv) analýzu délky PCR produktu získaného v (iii).
9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že je modifikován jakýmkoliv jedním nebo více rysy z nároků 2 až 4.

• · φ · φ φ ·· φφφφ
10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že se použije jeden nebo více z následujících primerů: GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; nebo CAACCCACTTGCTCCCAC.
11. Kit pro screening prasat pro určení těch, která pravděpodobně budou produkovat větší vrhy a/nebo těch, která méně pravděpodobně budou produkovat větší vrhy, vyznačující se tím, že obsahuje jedno nebo více činidel nebo materiálů schopných identifikovat OPN allely ve vzorku prasečí genomické DNA.
12. Kit podle nároku 11,vyznačující se tím, že obsahuje činidla nebo materiály schopné identifikovat allely spojené s DNA markéry navázanými k OPN genu.
13. Kit podle nároku 12,vyznačující se tím, že DNA markér je mikrosatelit a kit obsahuje jeden nebo více DNA primerů schopných hybridizace k oblasti genomické DNA spojené s mikrosatelitem.
14. Kit podle nároku 13, vyznačuj ící tím, že v něm jsou obsaženy následující primery: GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; nebo

CAACCCACTTGCTCCCAC.

···· ·· • *
15. Kit podle nároku 13 nebo nároku 14, vyznačující setím, že obsahuje standardní PCR činidla.
16. Způsob stanovení, která allela nebo allely pro DNA markér spojený s prasečím OPN genem je/jsou spojeny s větší velikostí vrhu, vyznačuj ícísetím,že zahrnuje stupně:

(i) získání genomické DNA z jednoho nebo více prasat;

(ii) stanovení, která allela nebo allely jsou přítomny pro jednotlivý DNA markér spojený s OPN genem;

(iii) porovnání výsledků ze stupně (ii) se stejným stanovením provedeným na jednom nebo více prasatech, o kterých je známo, že produkují větší velikosti vrhu.
17. Způsob screeningu prasat pro stanoveni těch, která s větší pravděpodobností budou produkovat větší vrhy a/nebo těch, která méně pravděpodobně budou produkovat větší vrhy, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

(i) získání vzorku genomické DNA Z prasete;

(ii) analýzy genomické DNA získané ve stupni (i) pro stanovení, kter OPN allela(y) je/jsou přítomny a (iii) analýzu genomické DNA získané ve stupni (i) pro stanoveni, která allela(y) z alespoň jednoho jiného genu spojeného s velikosti vrhu u prasat je/jsou přítomny.

• · • · · *···
18. Způsob podle nároku 17,vyznačující se tím, že alespoň jeden jiný gen je estrogen receptorový (ESR) gen.
19. Způsob podle nároku 17 nebo nároku 18, vyznačující se tím, že je modifikován jakýmkoliv jedním nebo více rysy ze kteréhokoliv z nároků 2 až 7.
20. Kit pro screening prasat pro stanovení těch, která s větší pravděpodobností budou produkovat větší vrhy a/nebo těch, která budou s menší pravděpodobností produkovat větší vrhy, vyznačující se tím, že obsahuje jedno nebo více činidel nebo materiálů schopných identifikovat OPN allel ve vzorku prasečí genomické DNA, společně s jedním nebo více činidly nebo materiály schopnými identifikovat allely alespoň jednoho jiného genu spojeného s velikostí vrhu u prasat ve vzorku prasečí genomické DNA.
21. Kit podle nároku 20,vyznačující se tím, že alespoň jedním jiným genem je ESR gen.
22. Kit podle nároku 20 nebo nároku 21, vyznačující setím, že je modifikován jedním nebo více rysy podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15.