PL184518B1

PL184518B1 - Sposób selekcji świń sposób określania markera i zestaw do selekcji świń

Info

Publication number: PL184518B1
Application number: PL96324028A
Authority: PL
Inventors: Mileham@Alan@J; Plastow@Graham@S; Southwood@Olwen@I
Original assignee: Dalgety Ltd
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2002-11-29
Also published as: BR9608763A; DE69620249D1; ATE215129T1; KR19990022827A; AU6012096A; GB9511888D0; WO1996041892A1; EP0879296A1; PT879296E; EP0879296B1; RU2162895C2; KR100441311B1; US6410227B1; MX9710091A; ES2175095T3; AU723769B2; CA2224394A1; DE69620249T2; NZ309858A; JPH11507548A

Abstract

1. Sposób selekcji swin w celu okreslenia, które prawdopodobnie dadza wieksze mioty, i/lub które prawdopodobnie dadza mniejsze mioty, znamienny tym, ze: (i) uzy- skuje sie próbke genomowego DNA swini; i (ii) analizuje sie genomowy DNA otrzymany w (i) w celu okreslenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) sa obecne. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są sposoby selekcji świń do oceny obecności lub nieobecności alleli osteopontyny (OPN) związanych ze zwiększonym rozmiarem miotu, zastosowania takich sposobów przewidywania rozmiaru miotu u świń i zestawu do stosowania takich sposobów.

Wydajności produkcji mięsa i hodowli zwierząt można poprawić, gdyby było możliwe zwiększenie miotów zwierząt. Możnaby uzyskać taką samą produkcję inwentarza żywego z mniejszej liczby macierzystych zwierząt, zmniejszając z ten sposób koszty produkcji. Ponadto organizacje hodowców zwierząt skorzystałyby z możliwości selekcji większej liczby potomstwa z poszukiwaniu zwierząt o poprawionej genetyce. Jednakże rozmiar miotu jest czynnikiem trudnym do konwencjonalnej selekcji, ponieważ ogranicza się do jednej płci i silnie reaguje na czynniki niegenetyczne (zdolność do dziedziczenia, miara ułamka zróżnicowania fenotypowego związanego z różnicami genetycznymi, wynosi około 0,1 dla rozmiaru miotu u świń).

Jednym z podejść do polepszania rozmiaru miotu mogłoby być wprowadzenie korzystnych genów w linie produkcyjne z ras o znacznie większych rozmiarach miotu. Jednakże genetyka ilościowa sugeruje, że złożone cechy, takie jak rozmiary miotu, są kontrolowane przez wielką liczbę genów, z których każdy ma mały wpływ na cechę. Jeśli jest to prawdą, postępy genetyczne przez selekcję złożonych cech powinny być bardzo powolne. Alternatywny punkt widzenia stwierdza, że chociaż wiele genów angażuje się w złożone cechy, niewiele genów zaangażowanych (geny główne) ma duży wpływ na cechę. Jeśli ten alternatywny pogląd jest słuszny, to postęp genetyczny w takich cechach mógłby być szybki, jeśli tylko jest możliwe zidentyfikowanie i selekcja korzystnych alleli odpowiednich głównych genów. Od czasu rozpoczęcia mapowania genomu stała się możliwa identyfikacja genów wpływających na cechy ilościowe (miejsca cech ilościowych, QTL) przez stwierdzenie związku pomiędzy cechą i markerami molekularnymi rozłożonymi równomiernie w genomie zwierząt, dla których dostępne są mapy. Istotne, dla celów selekcji, zdolność dziedziczenia takich znakowanych fenotypów wynosi 1,0.

Chińska rasa świń Meishan jest znana z rodzenia około 4 prosiąt na miot więcej niż najpłodniejsze rasy europejskie. Geny płodności (rozmiaru miotu) tej rasy miałyby wielką wartość dla programów zwiększania rozmiarów miotu u przemysłowych ras świń na Zachodzie. Istotnie, marker genetyczny związany z genem receptora estrogenu (ESR) rasy Meishan okazał się mieć korzystny wpływ na rozmiar miotu, a opisano go w publikacji W092/18651.

Rasa owiec Booroola Merino jest niezwykle płodna Pospolite są liczebności miotu trzy lub więcej. Znacząco zwiększona płodność tej rasy okazała się być skutkiem działania pojedynczego genu, FECB (za przeglądem patrz G. W. Montgomery, i in., Endocrine Reviews, 13: 309-328 (1992)). Mapowanie genetyczne z użyciem ludzkich markerów DNA wykazało, że ludzka wersja FECB jest umieszczona na chromosomie 4 (G. W. Montgomery, i in.. Nature Genetics, 4: 410-114 (1993)) i jest ściśle związana z genem kodującym wydzielaną fosfoproteinę-1. (SPP-1), także znanąjako osteopontyna (OPN), 2ar, sialoproteina kości, fosfoproteina kości 44 kDa i fosfoproteina wydzielana przez nowotwór. Porównawcze mapowanie (H. Ellegren, i in., Genomics, 17: 599-603 (1993) wykazało, że ludzki chromosom 4 i świński chromosom 8 są wysoce podobne (synteniczne). Świński gen SPP-1 jest także umieszczony na chromosomie 8.

184 518

Ostatnio wykazano, że związany z FECB marker u bydła nie działa jako marker zwiększania rozmiarów miotu w stadach selekcjonowanych na zwiększoną częstość owulacji (Blattman i in., Mid-West Animal Science Meeting, 18: 43 (1995)).

Jednakże niespodziewanie odkryliśmy, że u świń pewne markery DNA dla OPN są związane z rozmiarem miotu, tak więc można je stosować do selekcji świń dających wyższe szanse wydania miotu o większych rozmiarach i negatywnej selekcji świń, które mają allele wskazujące na mniejsze rozmiary miotów. W niniejszym opisie „zwiększone rozmiary miotu” oznacza znaczący wzrost rozmiarów miotu powyżej średniej danej populacji.

Ciekawie jest zauważyć, że występuje wyraźny punkt złamania w chromosomie syntezy wokół OPN pomiędzy owcami, bydłem i człowiekiem z jednej strony i myszami i świniami z drugiej (Montgomery i in, J. Reproduction and Fertility supplement, 49:113-121 (1995)). Sugeruje to, że struktura chromosomu może się zmieniać w tym regionie pomiędzy zwierzętami mającymi duże mioty (mysz i Świnia) i zwierzętami mającymi małe mioty (człowiek, owca i krowa), tak że ulega zmianie działanie głównego genu płodności. Możliwe wyjaśnienia obejmują zwiększanie lub zmniejszanie ekspresji głównego genu przez umieszczenie w bardziej transkrypcyjnie aktywnym lub nieaktywnym regionie; dostanie się głównego genu bezpośrednio pod kontrolę zmienionego elementu promotora; zmianę położenia głównego genu względem OPN może ulec zmianie tak, że OPN staje się bardziej przydatnym markerem do oceny potencjału rozmiarów miotu u świni niż u owcy lub bydła.

Przedmiotem wynalazku jest sposób selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które prawdopodobnie dadzą mniejsze mioty charakteryzujący się tym, że: (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni; i (ii) analizuje się genomowy dNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne.

W sposobie tym, korzystnie (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni; (ii) hybrydyzuje się genomowy dNa otrzymany w (i) z jednym lub więcej odpowiednich starterów; przeprowadza się jeden lub więcej cykli PCR stosując otrzymany zhybrydyzowany kwas nukleinowy; oraz analizuje się długość otrzymanych produktów PCR w celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne.

Korzystnie (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni;

(ii) analizuje się genomowy DNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne; oraz (iii) analizuje się genomowy DNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele przynajmniej jednego innego genu kojarzonego z wielkością miotu u świń są obecne.

Korzystnie, co najmniej jeden inny gen jest genem receptora estrogenu (ESR).

Korzystnie, określanie alleli OPN w etapie (ii) obejmuje stwierdzenie obecności co najmniej jednego allelu związanego z co najmniej jednym markerem DNA związanym bezpośrednio lub pośrednio z OPN.

Korzystnie, marker DNA jest mikrosatelitą.

Korzystnie, markerem DNA jest Swl085, Swl94, Swl6, Sw790, Sol78 lub Sw61.

Korzystnie, jeden lub więcej starterów zdolnych do hybrydyzacji z regionem związanym z mikrosatelitą dodaje się do próbki genomowego DNA, a następnie wykonuje się jeden lub więcej cykli PCR dla uzyskania produktów przedłużenia startera.

Korzystnie, allel lub allele OPN obecne z próbce genomowego DNA określa się przez odniesienie do długości produktu lub produktów przedłużenia startera.

Korzystnie, stosuje się jeden lub więcej następujących starterów:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA; CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; lub CAACCCACTTGCTCCCAC.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które prawdopodobnie dadzą mniejsze mioty, charakteryzujący się tym, że zawiera jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli genu osteopontyny (OPN) w próbce genomowego DNA świni, zwłaszcza do identyfikacji mikrosatelitamych markerów DNA związanych z genem OPN, przy czym korzystnie zestaw zawiera jeden lub więcej następujących starterów:

184 518

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA;

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC; GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; lub CAACCCACTTGCTCCCAC.

Korzystnie zestaw ten zawiera jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli OPN w próbce genomowego DNA świni, oraz jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli przynajmniej jednego innego genu kojarzonego z wielkością miotu u świń z próbce genomowego DNA świni.

Korzystnie, co najmniej jednym innym genem jest gen ESR.

Korzystnie zestaw ten obejmuje standardowe reagenty PCR.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania, który alei lub allele dla markera DNA związanego z genem OPN świni są związane z większym rozmiarem miotu, charakteryzujący się tym, że (i) określa się, który allel lub allele są obecne dla konkretnego markera DNA związanego z genem OPN w próbce genomowego DNA otrzymanego od jednej lub więcej świń;

(ii) porównuje się wyniki etapu (i) z podobnymi oznaczeniami uzyskanymi dla jednej lub kilku świń znanych z dużych rozmiarów miotów.

Tak więc, w pierwszym aspekcie, ujawniony jest sposób selekcji świń w celu wybrania tych, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub mniej prawdopodobnie dadzą większe mioty, złożony z etapów:

(i) uzyskania próbki genomowego DNA świni; i (ii) analizy genomowego DNA otrzymanego w (i) w celu określenia, które allel(e) OPN jest/są obecne(y).

Dogodnie etap (ii), konkretnie określenie alleli OPN, prowadzi się szukając konkretnych markerów DNA związanych bezpośrednio lub pośrednio z OPN.

Związek pomiędzy genetycznymi markerami i genami odpowiedzialnymi za konkretną cechę można zerwać przez genetyczną rekombinację. Tak więc im mniejsza fizyczna odległość pomiędzy markerem i badanym genem, jest mniej prawdopodobne, że rekombinacja je rozdzieli. Jest także możliwe ustalenie związku pomiędzy konkretnymi allelami alternatywnych markerów DNA i allelami markerów DNA o znanym związku z konkretnym genem, (np., genem OPN omawianym tutaj), które przedtem okazały się związane z konkretną cechą. Tak więc, w obecnej sytuacji, biorąc gen OPN, byłoby możliwe, co najmniej doraźne, wybranie świń dających prawdopodobnie większe mioty; lub negatywny wybór świń dających prawdopodobnie mniejsze mioty, pośrednio, przeprowadzając selekcję na pewne allele markera związanego z OPN przez selekcję specyficznych alleli alternatywnych markerów chromosomu 8. Przykłady takich markerów związanych z OPN na świńskim chromosomie 8 obejmują Sw61, Swl085, Swl94, Swló, SW790 i S0178, które to markery są wszystkie mikrosatelitami.

W kolejnej odmianie wynalazku stosuje się pewną liczbę takich markerów. Np., pary markerów można stosować do zamykania głównego genu w celu zmniejszenia wszelkich możliwych efektów rekombinacji. Przykłady takich kombinacji markerów obejmują SO178 i SW61 oraz SO170 i SW790.

Ponieważ efekt może być związany z różnicą uporządkowania genów u świń (i myszy) oraz owiec (i ludzi i bydła), sugeruje to, że najbardziej przydatnym drugim markerem będzie niehomologiczny (nie-synteniczny) region chromosomu B świni. Przykładem odpowiedniej kombinacji markerów znanej z zamykania tego regionu będzie OPN i SO178. Jednakże, specjalista zauważy, że inne przydatne markery można zidentyfikować rutynowo .

Konkretny genetyczny marker związany z OPN jest mikrosatelitą. Są to proste powtórzenia sekwencji 4, 3 lub, częściej, 2 nukleotydów, umieszczone zasadniczo przypadkowo wokół genomu co około 50000 zasad (około 60000 mikrosatelitów na genom haploidalny). Zacinanie się polimerazy DNA podczas replikacji i nierówny crossing-over podczas rekombinacji daje prawdopodobnie w wyniku utratę lub uzyskanie jednostek powtarzalnych. Oznacza to, że mikrosatelity są zwykle polimorficzne i mogą mieć kilka alleli o wielokrotności jednostkowej długości.

184 518

Przykładem mikrosatelity związanego z danym genem jest (CA)_n, dający możliwe allele o wielokrotności jednostkowej długości, np. (CA)₂, (CA)₉, (CA)₁₀, (CA), i (CA)₁₂.

Stosując startery zdolne do hybrydyzacji (na przykład, w ostrych warunkach) z regionami flankującymi mikrosatelity związane z danym genem, w kombinacji ze standardowymi technikami PCR, można wytworzyć produkty PCR o różnych długościach, przy czym długość zależy od konkretnych alleli o wielokrotności jednostkowej długości mikrosatelity.

Analiza związku takich produktów PCR, wykorzystujących mikrosatelitę związanego z genem OPN, z rozmiarem miotu, pozwoliła na określenie u świń alleli długości markera związanych ze zwiększonymi, i zmniejszonymi, rozmiarami miotu.

Odpowiednie pary starterów hybrydyzujących z flankującymi regionami takich mikrosatelitów obejmują mające następującą sekwencję:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA; lub

CCAATCCTATTCACGAAAAAGC; i

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; lub

CAACCCACTTGCTCCCAC.

W szczególności, allele o wielokrotności jednostkowej długości dla powyżej wspomnianego mikrosatelitowego markera, oznaczone 032 i 036, okazały się związane ze zwiększonym rozmiarem miotu u świń. Ponadto allele o wielokrotności jednostkowej długości, oznaczone 0 02, okazały się związane ze zmniejszonym rozmiarem miotu u świń.

W istocie, allel związany ze zwiększonym rozmiarem miotu pochodzi głównie z macierzystej rasy europejskiej. Jest to wynik przeciwny do spodziewanego, ponieważ, jak wspomniano powyżej, rasa Meishan ma 4 prosięta na miot więcej niż rasy Landrace lub Duroc, i można by się spodziewać, że korzystne markery będą związane z genami odziedziczonymi od macierzystej rasy Meishan.

W drugim aspekcie ujawniony jest sposób selekcji świń w celu wybrania tych, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub mniej prawdopodobnie dadzą większe mioty, złożony z etapów:

(i) uzyskania próbki genomowego DNA świni;

(ii) hybrydyzacji genomowego DNA z (i) z jednym lub kilkoma odpowiednimi starterami;

(iii) przeprowadzenia jednego lub kilku cykli PCR z użyciem hybrydyzowanego kwasu nukleinowego z (ii); i (iv) analizy długości produktu PCR otrzymanego w (iii).

Dogodnie sposoby realizuje się stosując reagenty i instrukcje przedstawione z postaci zestawu.

Tak więc, w trzecim aspekcie, ujawniony jest zestaw do selekcji świń w celu wybrania tych, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub mniej prawdopodobnie dadzą większe mioty, który obejmuje jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli OPN z próbce genomowego dNa świni.

Korzystny zestaw zawiera przykładowo reagenty lub materiały nadające się do identyfikacji alleli związanych z markerami DNA połączonymi z genem OPN, np. mikrosatelitowym markerem. Taki zestaw najkorzystniej zawiera jeden lub więcej starterów DNA ewentualnie wraz ze standardowymi reagentami PCR.

Na koniec, specjalista rozumie, że sposoby i zestawy opisane tutaj można stosować w połączeniu z innymi już opisanymi sposobami i zestawami do selekcji świń z celu określenia tych, które prawdopodobnie dadzą większe mioty (lub mniej prawdopodobnie). Przykładem takich innych sposobów i zestawów są opisane z publikacji W092/08650.

Oczywiście będzie możliwe wytworzenie łączonych zestawów, które będzie można stosować do selekcji DNA świni z użyciem obu sposobów.

W publikacji WO-A-9208650 i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr USSN 08/302302 ujawniono sposoby określania, które świnie prawdopodobnie dadzą większe mioty, w oparciu o powiązanie z genem ESR. Specjalista zrozumie, że sposoby selekcji według niniejszego wynalazku można łączyć ze wcześniej ujawnionymi sposobami selekcji ESR z wytworzeniem jeszcze silniejszego narzędzia do takich badań. Tak więc,

184 518 w kolejnym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które prawdopodobnie dadzą mniejsze mioty, obejmujący etapy:

(i) uzyskania próbki genomowego DNA świni;

(ii) analizy genomowego DNA otrzymanego w etapie (i) w celu określenia, które allele OPN są obecne; i (iii) analizy genomowego DNA otrzymanego w etapie (i) w celu określenia, które allele co najmniej jednego innego genu związanego z rozmiarem miotu u świń są obecne.

W jednej korzystnej odmianie tego aspektu wynalazku tym co najmniej jednym innym genem jest gen ESR, jak opisano z publikacji WO-A-9218651 i zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr USSN 08/312312.

W końcowym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest zestaw do selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które mniej prawdopodobnie dadzą większe mioty, obejmujący jeden lub bardziej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli OPN w próbkach genomowego DNA świni, wraz z jednym lub kilkoma reagentami lub materiałami zdolnymi do identyfikacji alleli co najmniej jednego innego genu związanego z rozmiarem miotu u świń w próbce genomowego DNA świni.

Korzystne cechy każdego aspektu wynalazku stosują się do każdego innego aspektu mutatis mutandis.

Wynalazek opisano poniżej w odniesieniu do następujących przykładów, które nie powinny być rozumiane jako ograniczające wynalazek.

Przykład 1

Wytwarzanie DNA

DNA można wytwarzać z dowolnego źródła tkanki zawierającej jądra komórek, np. białe ciałka, cebulki włosów, wcięcia ucha i mięśnie. Procedura opisana tutaj odnosi się do preparatów komórek krwi; inne tkanki można przetwarzać podobnie bezpośrednio umieszczając materiał w zawiesinie w buforze K i następnie postępując podobnie od tego samego etapu procedury. Sposób opisany tutaj pozwala na otrzymanie lizatu komórek zawierającego surowy DNA, który nadaje się do wzmacniania PCR. Jednakże dowolny sposób wytwarzania oczyszczonego lub surowego DNA powinien być równie skuteczny.

Krew powinna być zebrana w 50 mM EDTA pH 8,0 w celu zapobiegania koagulacji. 50 pl krwi umieszczono w malej probówce do mikromiareczkowania (0,5 ml Eppendorfa lub równoważna) 450 pl bufora TE dodano w celu lizowania czerwonych ciałek krwi (grupy hemowe inhibitują PCR) i mieszaninę wstrząsano przez 2 sekundy. Nietknięte białe i resztę czerwonych ciałek krwi odwirowano następnie przez 12 sekund przy 13000 g w mi-kro wirówce. Supematant usunięto przez łagodne odessanie stosując układ próżniowej pompy. Dodano dalsze 450 pl bufora TL w celu lizy pozostałych czerwonych ciałek i białe ciałka odwirowano jak przedtem. Jeśli grudka pozostawała jeszcze czerwona, proces powtarzano aż do białości grudki. Po usunięciu reszty supematanta z grudki białych ciałek dodano 100 pl bufora K zawierającego proteinazę K i mieszaninę inkubowano w temperaturze 55°C przez 2 godziny. Mieszaninę ogrzewano do 95-100°C przez 8 minut i lizaty DNA przechowywano z temperaturze -20°C do zastosowania.

Reagenty bufor TE: 10 mM IRISH1C1 pH 8,0 mM EDTA bufor K: 50mMKCl mM TRIS-HCl pH 8,3

2,5 mM MgCl₂0,5% Tween 20

Przed użyciem do lizatów dodano 10 pl 20 mg/ml proteinazy K (Boehringer Mannheim) na 1,0 ml bufora K.

PCR

Reakcje przygotowano jak następuje w cienkościennych 0,25 ml probówkach (Perkin Elmer):

184 518

1,5 pl bufora 10x;

1,5 pl 15 mM MgCl₂;

1,5 pl 2 mM dNTP (Pharmacia);

0,5 pl każdego startera przy 5 mM (Genosys);

pl sterylnej dejonizowwaj wodo;

0,1 pl (0,5 jednostek) polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin Elmer);

pl lizatu DNA.

Probówki reakcyjne umieszczono następnie w termicznym cyklizatorze Perkin Elmer 9600 i PCR poprowadzono zgodnie z reżimem wskazanym poniżej:

94°C przez 4 minuty;

cykli 94°C przez 30 sekund, 58°C przez 1 minutę; i 72°C przez 1 minutę;

72°C przez 9 minut;

4°C dopóki to potrzebne.

Reagenty bufor PCR 10x 100 mM Tris-HCl pH 8,3 (25°C), 500 mM KCl starter prosty GCTAGTTAATGACATTGTACATAA lub CCAATCCTATTCACGAAAAAGC starter odwrotny GTGTCATGAGGTTTGTGCCACTGC lub CAACCCACTTGCTCCCAC

Jeśli jeden ze starterów jest znakowany fluorescencyjnym markerem, powstałe produkty można analizować na automatycznym sekwencerze DNA takim jak Applied Biosystems 373 DNA Sequencer stosując oprogramowanie Genescan i Genotyper.

Przykład 2

Elektroforeza na żelu poliakryloamidowym pl produktów PCR zmieszano z 2 pl bufora nośnego i rozdzielono na nie denaturującym żelu poliakryloamidowym w. buforze TBE 1x przy 100 V przez 4 godziny. Żel zabarwiono następnie 50 ng/ml roztworem bromku etydyny przez 30 minut i produkty PCR uwidoczniono i sfotografowano w prześwietlaczu nadfioletowym. Oceniono następnie rozmiary produktów PCR w parach zasad ze względnych ruchliwości, w porównaniu z markerami o znanej masie cząsteczkowej testowanymi na tym samym żelu. Oszacowany rozmiar produktów PCR odzwierciedla długość mikrosatelitowych alleli.

Produkty PCR zanalizowano także na Applied Biosystems DNA Sequencer po zastosowaniu fluorescencyjnie znakowanego startera z PCR.

Wyniki

Częstości allelu OPN

Wyniki dla częstości allelu OPN z różnych populacjach świń przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Częstości allelu OPN z różnych populacjach świń

Populacja	Allel OPN	Liczba	Procent
1	2	3	4
Landrace	112	3	21
	132	6	43
	136	2	14
	142	3	21
Meishan	132	2	17
	140	8	67
	142	1	8
	154	1	8
L93	112	10	3
	122	2	1
	124	30	8
	132	39	10
	134	1	0
	136	36	9

184 518 cd. tabeli

1	2	3	4
	140	171	43
	142	60	15
	153	2	1
	154	43	11
L94	124	45	28
	132	15	9
	136	9	6
	140	84	52
	154	9	6
L93 Zwierzęta z populacji z	crzyżówki Landrace x Meishan

L94 Zwierzęta z populacji z krzyżówki Duroc x Meishan.

Analiza statystyczna

Samice zwierząt otrzymanych z L93 i L94 oceniono pod względem rozmiarów miotu (wszystkie urodzone (TNB) i urodzenia żywe (NBA)), w miarę możliwości z kilku porodów, i dane te porównano z genotypami mikrosatelity OPN dla tego samego zestawu zwierząt. Statystyczne powiązania pomiędzy rozmiarem miotu i genotypami OPN zbadano stosując sposób najmniejszych kwadratów dopasowania do ogólnego modelu liniowego. Średnie najmniejszych kwadratów (LSM) dla rozmiaru miotu oszacowano dla każdego genotypu OPN. LSM są średnimi poprawionymi na inne efekty z modelu wpływającym na rozmiar miotu.

Wpływ indywidualnych alleli OPN podzielono następnie stosując model podstawienia alleli, w którym zwierzęta sklasyfikowano z grupach z zależności od niesienia 0, 1 lub 2 kopii konkretnych alleli. LSM dla rozmiaru miotu oszacowano dla każdej grupy. Wyniki dla L93 pokazano w tabeli 2.

Tabela 2

Liczba kopii alleli
	0	1	2
Allel	Cecha	LSM	n	LSM	n	LSM	n	LSM	n
112	TNB	13,0	306	11,8	21		0	+	+
	NBA	11,8		10,9				NS	NS
124	TNB	12,9	281	13,0	46		0	+	NS
	NBA	11,8		11,6				NS	NS
132	TNB	12,9	260	13,3	57	14,3	10	+	+
	NBA	11,5		12,3		13,9		NS	NS
136	TNB	12,9	271	12,9	53	17,5	3	+	NS
	NBA	11,8		11,6		11,1		NS	NS
140	TNB	12,7	81	13,1	175	12,8	71	+	NS
	NBA	11,5		11,9		11,6		NS	NS
142	TNB	13,0	253	12,8	68	11,3	6	+	NS
	NBA	11,8		11,7		9,8		NS	NS
153	TNB	12,9	320	13,0	7	0	0	+	NS
	NBA	11,8		10,9				NS	NS
154	TNB	13,0	284	12,5	39	11,5	4	+	NS
	NBA	11,8		11,4		10,7		NS	NS

Poziomy istotności: *, P<0,05; +, P<0,10; NS, P>0,10

Model obejmuje porę roku, karmienie sztuczne lub naturalne, wielorództwo, generację i genotyp OPN

TNB całkowita liczba urodzeń

NBA liczba żywych urodzeń

LSM średnia najmniejszych kwadratów n liczba zapisów, to jest potomstwa

184 518

Z danych widać, że allel 112 wydaje się być związany z negatywnym wpływem na rozmiar miotu, podczas gdy pozytywne trendy widać dla alleli 132 (NBA) i 136 (TNB). Dane przedstawione z tabeli 1 sugerują, że podczas gdy allele 112 i 136 pochodziły zapewne z Landrace, allel 132 mógł pochodzić od przodka Landrace lub Meishan. Jednakże, ponieważ allel 132 jest co najmniej dwukrotnie pospolitszy w Landrace niż w Meishan, jest możliwe, że znacząca część allelu 132 z L93 pochodzi z Landrace.

W celu zbadania potencjału tych alleli w działaniu przewidującym rozmiary miotu, włączono w analizę dodatkowe dane z L94. Allelu 112 nie znaleziono w tej linii (przypuszczalnie ten allel nie znajduje się z Duroc). Połączone dane dla alleli 132 i 136 pokazano w tabeli 3.

Tabela 3

	Liczba kopii alleli
	0	1	2	Istotność
Allel	Cecha	LSM	n	LSM	n	LSM	n	Model	OPN
132	TNB	12,2	372	12,9	82	14,2	12	***	+
	NBA	10,9		11,9		13,5		**	**
136	TNB	12,3	393	12,3	73	16,9	3	***	+
	NBA	11,1		11,0		10,5		NS	NS

Poziomy istostności: ***, P<0,01; **, P<0,01; +, p<0,05; ns, nieistotne

Te dane pokazują, że tylko allel 132 ma znacząco pozytywny wpływ na rozmiary miotu dla TNB i NBA. Chociaż allel 136 był bliski uzyskaniu znaczenia dla TNB, możliwe, że efekt jest związany z małą ilością zwierząt 136/136 (3) o bardzo wysokich wynikach.

Związek pomiędzy allelem 132 OPN i dużym miotem wykazano u dwu różnych linii świń (L93 i L94). Wskazuje to, że QTL wpływający na rozmiary miotu jest ściśle związany ze świńskim genem OPN. Jednakże jest możliwe, że w innych rodzinach, liniach lub rasach świń różne allele OPN będą związane ze wzrostem wielkości miotu.

Wyniki powtórnej analizy danych dla L93 i L94 i dla dodatkowej linii L07 (duże białe) pokazano poniżej w tabeli 4 stosując alternatywny model. Obejmował on dopasowanie każdego allelu OPN jako zmiennej i zakodowanie każdego zwierzęcia 0, 1 lub 2 dla każdego allelu (to jest 0,1 lub 2 kopii każdego allelu).

Stałe efekty były typu stado-pora roku-obsługa i wielorodności. Rozpłodnika dołączono jako efekt przypadkowy. ESR i OPN ustalono jako współzmienne. Dołączono wszystkie dane dla linii, nie tylko rodzinę pełnego lub częściowego rodzeństwa. Allele OPN dające mniej niż 10 potomstwa drugiego genotypu wykluczono z analizy.

Cechami analizowanymi była łączna liczba urodzin (TNB) i liczba żywych urodzeń (NBA).

Zbadano trzy modele dla każdej linii obejmujące wpływy ustalone, stochastyczne i ESR, jak podano powyżej.

1. Model wykluczający OPN

2. Model obejmujący wszystkie allele OPN

3. Model obejmujący allele OPN indywidualnie.

Otrzymano podobieństwo logarytmiczne dla każdego modelu. Istotność modelu obliczano odejmując podobieństwo logarytmiczne z modeli 2 lub 3 od podobieństwa z modelu 1 i porównanie wyników rozkładem chi-kwadrat. Stopniami swobody (df) była różnica pomiędzy dwoma modelami.

Poziom istotności na linię dla modelu 2 i dowolnych znaczących alleli w modelu 3 podano w tabeli poniżej.

184 518

Tabela 4

	TNP	NBA
Linia	Model /allel	Istotność	Efekt podstawienia alleli	Istotność	Efekt podstawienia alleli
7	2	P<0,10		P<0,10
	3/OPN122	P<0,05	-130	P<0,05	-1,37
93	2	P<0,10		P<0,05
	3/OPN112	P<0,10	-0,87	P<0,10	-0,92
	3/OPN132	NS	+0,49	P<0,05	+0,72
	3/OPN154	P<0,10	-0,72	NS	-0,46
94	2	P<0,01		P<0,05
	3/OPN124	P<0,10	-0,83	P<0,10	-0,74
	3/OPN132	P<0,01	+ 1,62	P<0,05	+1,42

Z danych tych można wyciągnąć następujące wnioski:

1. OPN spowodował znaczącą liczbę wahań w rozmiarach miotu (po włączeniu ESA) dla L07 (P<0,10); L93 (TNB; P<0,10; NBA; P<0,05) i L94 (TNB: P<0,01; NBA: P<0,05).

2. Allel OPN 132 wykazał znaczący pozytywny wpływ na rozmiary miotu u L93 i L94 .

3. Inne allele OPN122 (L07), OPN112 i OPN154 (L93) i OPN124 (L94) wykazały znaczący negatywny wpływ.

Przykład 3

Próbki genomowego DNA z dalszej linii L03 (inna linia dużych i białych) otrzymano i zanalizowano. Wyniki pokazano poniżej w tabeli 5. Zanalizowano 416 zwierząt z 1010 zanotowanego potomstwa.

Zbadano kilka różnych modeli. Wszystkie modele obejmowały wpływ ilość miesięcznych oprosień na farmie, wielorództwo i rozpłodnika. ESR ustalono jako współzmienną we wszystkich analizach.

Cechy analizowane to łączna liczba urodzin (TNB) i liczba żywych urodzeń (NBA).

Modele użyte:

1. łączna liczba urodzin = liczba miesięcznych oprosień +rozpłodnik+ allel RSR+OPN

2. tNb lub NBA = liczba miesięcznych oprosień +rozpłodnik+ESR+OPN112+OPN122 itp.

Tabela 5

	TNP	NBA
Linia	Model/allel	Istotność	Efekt podstawienia alleli	Istotność	Efekt podstawienia alleli
1	2	3	4	5	6
03	1/OPN124	P<0,01	+0,72
	1/OPN136	P<0,15	-0,27
	1/OPN138	P<0,15	+2,04
	1/OPN142	P<0,15	-0,27
	2/OPN112	NS	+0,34	NS	+0,58
	2/OPN122	NS	-0,13	NS	-0,18
	2/OPN124	<0,05	+0,65	NS	+0,33
	2/OPN132	NS	+0,31	NS	+0,08

184 518 cd. tabeli

1	2	3	4	5	6
	2/OPN136	NS	-0,29	NS	-0,37
	2/OPN138	<0,15	+2,06	NS	+1,81
	2/OPN140	NS	-0,11	NS	-0,16
	2/OPN142	NS	-0,22	<0,15	-0,40
	2/OPN144	NS	-1,06	NS	-1,16
	2/OPN146	NS	+1,08	NS	+0,15
	2/OPN154	NS	+0,02	NS	-0,02

Dane wskazują, że OPN 124 wykazuje znaczący pozytywny wpływ na TNB 0,7 na każdą kopię allelu. Ponadto, OPN142 wykazał trend w kierunku negatywnego wpływu na rozmiary miotu w L03, podobny do obserwowanego dla L93.

Jak przedyskutowano powyżej, inny gen ESR, okazał się wpływać na rozmiar miotu u świń i jest możliwe, że inne geny związane z rozmiarem miotu będą zidentyfikowane w przyszłości. Zbadaliśmy, czy pewne korzystne kombinacje alleli na dwu odrębnych genach, OPN i ESR, wywierają dodatkowy wpływ na rozmiary miotu.

Dla zbadania tej możliwości sprawdziliśmy związek pomiędzy rozmiarem miotu i różnymi kombinacjami alleli ESR i OPN. Wyniki przedstawione poniżej w tabelach 4 i 5 pokazują że istotnie korzystne allele OPN mogą łączyć się pozytywnie z korzystnymi allelami ESR, tak że można uzyskać większy rozmiar miotu niż możliwy do osiągnięcia przez stosowanie samych korzystnych alleli OPN lub ESR.

Tabela 4:

Wpływ podstawienia alleii dla markerów OPN i ESR na rozmiar miotu (TND) z linii 93 (L93)

Marker	Efekt podstawienia alleli dla TNB	Istotność
OPN 132	+0,49	ns
ESR A	+0,34	ns
OPN 132 lub ESR B	+0,39	P<0,1

Tabela 5:

Spodziewane rozmiary miotu (TNB) dla różnych kombinacji markerów OPN i ESR z linii 93 (L93) z oparciu o dane przedstawione z tabeli 4

Genotyp	Wpływ na rozmiary miotu (TNB)
ESR	ESR	OPN	OPN
-	-	-	-	0,00
B	-	-	-	+0,34
B	B	-	-	+0,68
-	-	132	-	+0,49
-	-	132	132	+0,98
B	-	132	-	+0,83 (+0,78)
B	B	132	-	+ 1,17 (+1,12)
B	-	132	132	+1,32 (+1,27)
B	B	132	132	+ 1,66 (+1,56)

Wpływ na rozmiary miotu zakładają całkowitą addytywność (OPN 132 = -+0,49; ESR B= +0,34) poza tymi z nawiasach, które zakładają wpływ OPN 132 lub ESR B = - +0,39.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które prawdopodobnie dadzą mniejsze mioty, znamienny tym, że: (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni; i (ii) analizuje się genomowy DNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni; (ii) hybrydyzuje się genomowy DNA otrzymany w (i) z jednym lub więcej odpowiednich starterów; przeprowadza się jeden lub więcej cykli PCR stosując otrzymany zhybrydyzowany kwas nukleinowy; oraz analizuje się długość otrzymanych produktów PCR z celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że: (i) uzyskuje się próbkę genomowego DNA świni; (ii) analizuje się genomowy DNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele genu osteopontyny (OPN) są obecne; oraz (iii) analizuje się genomowy DNA otrzymany w (i) w celu określenia, który allel lub które allele przynajmniej jednego innego genu kojarzonego z wielkością miotu u świń są obecne.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że co najmniej jeden inny gen jest genem receptora estrogenu (ESR).
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że określanie alleli OPN w etapie (ii) obejmuje stwierdzenie obecności co najmniej jednego allelu związanego z co najmniej jednym markerem DNA związanym bezpośrednio lub pośrednio z OPN.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że marker DNA jest mikrosatelitą.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że markerem DNA jest Swl085, Swl94, Sw16, Sw790, Sol78 lub Sw61.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jeden lub więcej starterów zdolnych do hybrydyzacji z regionem związanym z mikrosatelitą dodaje się do próbki genomowego DNA, a następnie wykonuje się jeden lub więcej cykli pCr dla uzyskania produktów przedłużenia startera.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że allel lub allele OPN obecne z próbce genomowego DNA określa się przez odniesienie do długości produktu lub produktów przedłużenia startera.
10. Sposób według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że stosuje się jeden lub więcej następujących starterów:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA; CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; lub CAACCCACTTGCTCCCAC.
11. Zestaw do selekcji świń w celu określenia, które prawdopodobnie dadzą większe mioty, i/lub które prawdopodobnie dadzą mniejsze mioty, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli genu osteopontyny (OPN) z próbce genomowego DNA świni, zwłaszcza do identyfikacji mikrosatelitamych markerów DNA związanych z genem OPN, przy czym korzystnie zestaw zawiera jeden lub więcej następujących starterów:

GCTAGTTAATGACATTGTACATAA; CCAATCCTATTCACGAAAAAGC;

GTGTCATGAGGTTTTTTCCACTGC; lub CAACCCACTTGCTCCCAC.
12. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli OPN z próbce genomowego DNA świni, oraz jeden lub więcej reagentów lub materiałów zdolnych do identyfikacji alleli przynajmniej jednego innego genu kojarzonego z wielkością miotu u świń w próbce genomowego DNA świni.
13. Zestaw według zastrz. 12, znamienny tym, że co najmniej jednym innym genem jest gen ESR.

184 518
14. Zestaw według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że obejmuje standardowe reagenty PCR.
15. Sposób określania, który allel lub allele dla markera DNA związanego z genem OPN świni są związane z większym rozmiarem miotu, znamienny tym, że (i) określa się, który allel lub allele są obecne dla konkretnego markera DNA związanego z genem OPN z próbce genomowego DNA otrzymanego od jednej lub więcej świń; (ii) porównuje się wyniki etapu (i) z podobnymi oznaczeniami uzyskanymi dla jednej lub kilku świń znanych z dużych rozmiarów miotów.