CZ40399A3 - DNA kódující ligand příbuzný TNF, způsob jeho přípravy a způsob potlačení imunitní odpovědi - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému faktoru neboli TRELL, což je polypeptid patřící do rodiny proteinů nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor). Tento protein nebo jeho receptor mohou mít protinádorové nebo imunoregulační použití. Kromě toho buňky transfekované genem kódujícím TRELL se mohou použít k protinádorové genové terapii a ke genové terapii autoimunitních a zánětlivých onemocnění a také ke genové terapii dědičných genetických poruch.

Předkládaný vynález byl vytvořen z části v průběhu práce na grantech č. 31-42275.94 a 32-41729.94, které získala Irene Garcia od Swiss National Fund. Výhradní práva jsou definována v odstavcích 28 á 29 statutu Swiss National Fund.

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF) jsou mediátory hostitelské.obranné reakce a regulace imunitní odpovědi. Členové této proteinové rodiny se vyskytují ve £o.r.mě^-u-koty-ené.T-^nh^:ř^buněěnou^^membránu^:~^r=^;'a^TZ::=^;puso^:bi==l⁷dkáTně^:= prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptorů ukazuje na to, že přítomnost těchto proteinů vede k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace cílové tkáně. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 9 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R,

' ' · • · ·

LT-α/β:LT-p-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27,

OX40L:OX40 a .4-1BBL:4-1BB. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to. dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%. - ’

Určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extracelulární doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou různých, receptorů TNF. Tato genová rodina kóduje glykoproreiny s vlastnostmi transmembránových proteinů typu Ϊ. s extracelulární vazebnou doménou , vážící ligand, jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým úsekem, který se podílí na aktivaci buněčných funkcí. Úsěk bohatý na cystein, který je současně vazebným úsekem pro. ligand,· má centrální doménu z hustě spojených disulfidových můstků, která se několikrát opakuje, což závisí na konkrétním členu rodiny.. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv j.sou i receptory se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami. ...

Proteiny z rodiny TNF ligadnů jsou, charakteristické na svém N-konci krátkým úsekem, hydrofilních aminokyselin, který často .obsahuje několik argininových nebo lysinových zbytků, které zřejmě slouží jako sekvence k zastavení přenosu. Pak mají transmembránový úsek a extracelulární úsek proměnné * délky, který odděluje vazebnou doménu pro receptor na C-konci -od—buněčné—membrůn-yT^ř-TTTenrtO—feerk^^e -=· he^kdy nazývá · stopka . Vazebný úsek představuje větší část proteinu a často, i když ne . vždy, obsahuje glykošylační místa. Tyto geny postrádají . klasickou signální sekvenci charakteristickou pro . membránové proteiny 'typu. I, ' spíše odpovídají membránovým proteinům' typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku· ,a krátký N-konec zasahující do cytoplazmy. V některých případech, jako jsou TNF a LT-ά, se může objevit v průběhu Čásného opracování

9'· .9 9

9 9 • · proteinu štěpení v úseku stopky- .a ligand pak existuje především v secernované formě. Avšak většina ligandů se. vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává lokalizovaný přenos signálů.

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-aá CD40L. Struktura TNF a lymfotoxi.nu alfa (LT-ά) je sendvičová,,tj. skládají s ze dvou antiparalelních β-skládaných listů s topologií tzv. Greék key · neboli jel.ly rolí.. -Odchylka rms mezi zbytky řetězců a a β je, .0, 61 C, což vede k domněnce, o vysokém stupni . podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně.vyplývá z molekulárních studií. CD4QL, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomerní komplexy. Oligomerní. struktuře je vlastní vyvtváření vazebných míst pro recéptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se .vytváří multivalentní ligand. Analýzou- . krystalové 'struktury se zkoumala kvarterní struktura CD40L,

TNF a LT-α a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α. existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervovaných mezi těmito ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β-listu,. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou konzervovány; mezi’ různými členy celé rodiny. Kvarterní struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně, také zůstává podobná.

Členy rodiny. TNF' mohou být nejlépe charakterizovány jako hlavní přepínače v imunitním systému pro řízení přežívání buněk a také buněčné diferenciace. V současnosti ·.......:.-jsou známy pouze dva secernované cytokiny, a sice.TNF a LT-a, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF .byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou

I • · ·

• · .funkci, funkcí secernovaných TNF je všeobecná signalizace poplachu . buňkám vzdáleným od místa události, .. která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve. výstelce . cév a v buňkách v místě zánětu.. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptorů .

r . typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné

T-buňky poskytují pomoc zprostředkovanou CD40 pouze takovým ’’ B-buňkám, · se kterými se dostanou do přímého kontaktu \ prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčnýkontakt se týkají.schopnosti indukovat buněčnou smrt u v současnosti zkoumaného systému Fas.

Schopnost indukovat' programovanou buněčnou smrt je důležitou a nyní. velmi zkoumanou vlastností několika členů rodiny TNF. Apoptóza zprostředkovaná Fas hraje .zřejmě roli v regulaci autoreaktivních periferních lymfocytů a možná také v brzlíku (Castro et al., 1996). Současné výzkumy také poukazují na roli TNF a CD30 v přežívaná T-buněk a linií velkých anaplastických lymfomových buněk (Amakawa et al., 1996, Gruss et al., 1994, Sytwu. et al., 1996, Zheng et al.,

1* *995) . Již dříve jsme my i jiní. autoři prokázali, že odumírání takové linie jako reakce na buněčnou signalizaci' zprostředkovanou TNF, Fas nebo LTb,' má vlastnosti apoptózy < (Abreu-Martin et al., 1995,. Browning et al.,.1996).

... Ligandy TNF je možné_ro_:zd.ě.li.-t—do-Jař^.h—na—7rá-k-had-ě.7T=^ * jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt (viz tab. 3 v oddíle Příklady) , . V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, .které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha liniích a jejich receptory mají většinou'kanonické smrtící domény. Pravděpodobně ligand DR-3 (TRAMP/WSL-i) by patřil také dd_; této kategorie. Druhou skupinú tvoří, takové ligandy, které spouštějí slabší signál omezený jen na některé buněčně β C β β

typy. , Do této druhé skupiny patří např. TRELL, CD30 ligand a LTalb2 .. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou smrtící doménu. Nepřítomnost této . domény vede k domněnce, že existuje ' ještě . jiný způsob . signalizace v mechanismu buněčné smrti. Do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný signál vedoucí k buněčné smrti. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy.buněk jako následek indukce diferenciace, jako např.. CD40 (Funakoshi et, ál., 1994) .

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době aj.obsahuje nyní 11 různých signálních drah zahrnujících regulaci, imunitního systému. Expresní vzorce TRELL- a .TRAIL ukazují, že v této rodině existuje značná funkční “variabilita, dosuď nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptorů,. které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru herpes simplex, a také významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje vějičkové TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al., 1996, Smith 1994, Vassali 1992). Vytvoření rozpustného TRELL a identifikace receptoru TRELL by měla poskytnout nástroj k objasnění biologické funkce tohoto zajímavého proteinu. .

TNF je mediátor septi.ckého šoku a kachexie a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk. Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivé reakci a v obraně -proti bakteriálním, virovým ' a .parazitárním infekcím, a - navíc má zřejmě protinádorovou aktivitu. TNF se. podílí také na různých autoimunitních chorobách. TNF vytvářejí různé typy buněk, např. jsou to -makrofágy,. fibroblasty, T-buňky a cytotoxické NK-buň.ky (natural killer). TNF se váže na dva různé ·'· receptory, ' z nichž každý působí prostřednictvím, odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF.' TNF existuje jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako volný secernovaný ·. cytokin.

LT-ct má s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory, ale na rozdíl od TNF je secernován hlavně aktivovanými T-buňkami a některými β-lymfoblasto.idními nádory. Heteromerní komplex LT-α a LT-β je komplex vázaný na membránu, kde se váže na LT-β receptory. Systém LT (tj. LT s receptroem LT) se.podílí' na/vývoji periferních lymfoidních orgánů, neboť genetické narušení LT-β vede k poruchám T a B-buněk ve slezině a k nepřítomnosti lymfatických uzlin. Systém LT-β .se také podílí na buněčné smrti u některých linií adenokarcinomových'buněk.

Fas-L, další' .člen rodiny TNF, je exprimován přednostně v aktivovaných T-buňkáčh.' Indukuje smrt buněk nesoucích' příslušný receptor, . nádorových buněk a buněk infikovaných' HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza. Kromě toho je známo, že nedostatek Fa.s nebo Faš-L vede k lymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi. Fas -systém se také .podílí na poškození jater v důsledku' chronické infekce ' virové hepatitidy a ', na autoimunitní odpovědi u pacientů infikovaných HIV. Systém Fas sb také· účastní destrukce T-buněk u pacientů infikovaných

HIV. ' ........... ’ - .

TRAIL,.další člen. této rodiny, se zřejmě také podílí na smrti mnoha různých transformovaných . buněčných linií různorodého původu.

.CD40-L, další.člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T buněk a indukuje , regulaci B buněk' nesoucích CD40.. Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou ·· ·« » · · 4 » · · ’ • 4 4 ··<

9444 ·<

·· ·· nemoci známé jako syndrom hyper-IgM sjáojený s chromozómem X. Systém CD40 je -také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami a CD40-L má také antivirové vlastnosti. Ačkoliv se systém CD40 podílí také na záchraně apoptických B buněk, u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu. Mnohé , dal-ší lymfocytární členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci.

Obecně lze shrnout, že členy rodiny - TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TMF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné', že členy této rodiny poskytnou jedinečný prostředek kontroly nemocí. Některé ligandy rodiny TNF mohou přímo indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, Iigand Fas ,á TRAIL (Nagata 1997) .. Fas a zřejmě i TNF a ..aktivace receptorů CD30 mohou indukovat buněčnou smrt' netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa_;.et al., 1996, Nagata 19.97, Sytwu et al., 1996, Zheng et al'. , 1995) .

Obecně je známo, že odumírání se spustí po agregaci smrtících domén, které jsou. na cytoplazmatické. straně receptorů TNF. Tyto smrtící domény organizují uspořádání různých složek signální transdukce, .. což nakonec . vede. k aktivaci celé. kaskády. (Nagata 1997( postrádají kanonické smrtící domény,

Některé receptory např. receptor LTb a CD30 (Browning et ' al. 1996, Lee et' al., 1996) á přesto mohou indukovat buněčnou smrt, . i když podstatně slaběji.. Tyto receptory pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují' buněčnou' diferenciaci a smrt je . aberantním důsledkem u některých transformovaných, buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi CD30 null’ se .předpokládá smrticí role v negativní selekci ··· · 4 • · «4 v brzlíku (Amakawa et al., 1996). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržování a. přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba charakterizovat další členy rodiny TNF a poskytnout tak další prostředky ke kontrole nemocí a. ovlivňování imunitního systému.

Popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká polypetidu, a sice ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému faktoru, zvaného TRELL, a tento vynález řeší řadu problémů a omezení a eliminuje nevýhody dosavadních řešení v oboru známých. Původce.objevil nový člen rodiny TNF cytokinů a určil sekvenci aminokyselin jak myšího tak ’i lidského proteinu, včetně příslušných sekvencí DNA kódujících tyto proteiny. Vynález je možné využít pro identifikaci přípravků pro diagnózu a' léčení mnohých nemocí a stavů, což je dále. podrobněji popsáno, a také k získání dalších informací'o imunitním systému, a pro vlastní ovlivňování imunitního systému a imunitních procesů. Kromě toho se předkládaný vynález také týká.indukce buněčné smrti při karcinomu.

Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou

Λ · · · popsány v následujícím popisu, přitom částečně, z popisu vyplynou a částečně· je bude možno rozpoznat' při využití vynálezu. Cíl vynálezu a’ jeho výhody lze dosáhnou pomocí přípravků a způsobů, . které jsou zvláště zdůrazněny v popisu a v nárocích, a také v průvodních' obrázcích., .

V souladu s cílem vynálezu, aby bylo dosaženo .výhod vynálezu, jak je v popisu . a příkladech povedení vynálezu uvedeno, vynález se týká sekvence DNA kódující TRELL.

Nukleotidovásekvence, myšího TRELL (mTRELL) je zde uvedena • 9 · · ·· ·· ft ·.

jako- sekvence s identifikačním číslem 1' (id. č. 1)‘ a sekvence lidského TRELL (hTRELL) je zde uvedena jako sekvence id. -č. 3. Vynález se specificky týká sekvence DNA, která kóduje TRELL, který má sekvenci aminokyselin uvedenou zde jako sekvenci id. č.. 2 (mTRELL) nebo .4. (hTRELL). Další provedení vynálezu se týká sekvence, která má alespoň 50% homologii se sekvencí DNA kódující vazebnou doménu proreceptor na '5'-konci TRELL, a přitom hybridizuje se sekvencí podle vynálezu nebo jejím fragmentem, a která kóduje TRELL, který má sekvenci uvedenou zde jako. Sekvenci id. č. 4 nebo id. č. 2.

Některá provedení vynálezu se týkají sekvence DNA kódující TRELL, kde sekvence je operativně spojena se sekvencí, která řídí expresi. Pro použití ve vynálezu je vhodná jakákoliv sekvence pro řízení exprese a vhodná sekvence může být odborníkem snadno vybrána.

Předkládaný vynález se dále týká rekombinantní DNA, která obsahuje, sekvenci DNA kódující TRELL nebo její fragment,· a také hostitelů, kteří mají trvale integrovanou sekvencí TRELL v genomu nebo v podobě episomálního elementu. Podle vynálezu je. možné užít jakéhokoliv.vhodného hostitele, který může být vybrán odborníkem bez vynaložení nadměrného úsilí.

Další provedení předkládaného Vynálezu se^j týká způsobu, přípravy v podstatě čistého TRELL, který obsahuj, kroky, kdv se kultivuje transformovaný hostitel a dále se týká TRELL prostého všech živočišných proteinů, které' jsou sním. normálně asociovány.

Vynález zahrnuje TRELL, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde. jako sekvenci id. č. ,4 nebo_t sekvenci id, č. 2, nebo jeho fragmenty či homology.. V různých provedeních vynálezu, sekvence aminokyselin nebo sekvence'DNA

L _sý • · ·« ·· ·· • ·· ··

TRELL mohou obsahovat konzervativní inzerce, . delece a substituce, jak bude ukázáno dále nebo mohou obsahovat fragmenty zmíněných sekvencí.

Jiné provedení předkládaného vynálezu . se týká rozpustného konstruktu TRELL, který je možné použít, pro přímé spuštění farmakologické . události zprostředkované TRELL.. Taková'událost může.mít - terapeutický účinek v léčení rakoviny nebo . v manipulaci s imunitním systémem pro léčení imunologických onemocnění. Rozpustné formy TRELL -mohou být metodami genového inženýrství upraveny tak, aby obsahovaly snadno rozpoznatelnou značku, a- tím. umožnily identifikaci receptorů TRELL..

Další provedení předkládaného vynálezu se týká použití TRELL pro genovou terapii.

¹ Farmaceutický přípravek podle, předkládaného vynálezu . může volitelně obsahovat také farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans, plnidlo nebo jiné farmaceutické přípravky, a může být podáván jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

Jak předcházející stručný přehled tak i následující podrobný popis vynálezu je třeba považovat za vysvětlení vynálezu a . za příklady, které slouží k podrobnějšímu vysvětlení předkládaného vynálezu. Taktéž obrázky , slouží k lepšímu porozumění vynálezu, a tvoří součást popisu vynálezu, jsou určeny k tomu, aby ilustrovaly některá provedení vynálezu_a společně s popisem sloužily k Vysvětlení principu předkládaného vynálezu.

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje srovnávací, analýzu aminokyselinových sekvencí lidského a myšího TRELL.

• ·

·· ·· ·· ·· • ·· · · ·· · • · · · · · · • · · · ······ • · · · · • · · ··· ·· ···

Obr. 2A a 2B ukazují srovnávací analýzu aminokyselinových, sekvencí lidských členů rodiny TNF. , .

Obr. 3 ukazuje výsledek northernové analýzy exprese mRNA TRELL v různých liniích myších buněk a tkáních. Dráhy jsou v duplikátech a obsahují RNA z, 1) peritoheálních. makrofágů indukovaných thioglykolátem 2) kostní dřeně 3)sleziny a 4) jater.

Obr. 4 je výsledek northernové analýzy exprese mRNA TRELL .v různých lidských tkáních.

Obr. 5. je výsledek SDS-PAGE elektroforézy rekombinantního TNF> LT-ά a TRELL v. redukujících a neredukujících podmínkách.

Obr. 6 ukazuje, že TRELL je cytotoxičký pro buňky lidského adenokarcinomu HT29. '

A. Schopnost TNF, TRELL, LTa/β a anti-Fas blokovat růst -buněk linie HT29 v přítomnosti lidského interferonu-g. Buňky byly kultivovány. 4 dny v přítomnosti různých činidel a růst byl hodnocen pomocí barvení MTT.

B, Morfologie buněk, u¹ kterých probíhá proces buněčné smrti. Buňky byly předpěstovány 2 dny a pak po 24 hodin podrobeny « . působení 80 U/ml inetrferonu-g, a to buďto bez dalšího . ošetřeni (A)_ iuebjo_pjg__fi.x.a_:c.i—e-t.ano-l-em_-lO-0.nq-/-ml-₃-(_TB₇)-.-₇dIor.nú’ . panely ukazují .buňky ve fázovém kontrastním mikroskopu (zvětšení 400x), dolní panely ' buňky ošetřené barvivém

- · Hoechst 1 pg/ml- pro zvýraznění jader.. Šipky ukazují typické' buňky s kondenzovaným jádrem, které je charakteristické'pro apoptózu. . .

·· ·· ·· ♦· ·· • · · · ·

Podrobný popis vynálezu

Popis se bude týkat především, podrobností výhodného, provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká sekvencí DNA, které kódují lidský nebo myší .TRELL, jeho fragmenty nebo homology, a dále se týká exprese těchto DNA v hostitelích těmito . DNA transformovanými. Kromě toho se vynález týká jak lidské . tak myší aminokyselinové sekvence TRELL, nebo jeho fragmentů či homologů,. a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího tyto sekvence nebo z těchto sekvencí odvozeného.

A. Definice

Termín.homologní, v tomto textu popisuje podobnost mezi sekvencemi srovnávaných molekul. Pokud je jistá pozice v,obou srovnávaných'sekvencích obsazena shodnou monomerní jednotkou, * tj. baží nebo aminokyselinou,· např. jeli stejná, pozice v každé ze dvou molekul DNA obsazena adeninem, pak tyto molekuly j sou homologní v dané pozici..

Homologie mezi dvěma sekvencemi vyjádřená v procentech je funkce počtu shodných čili homologníčh pozic, které j.sou sdíleny oběma sekvencemi, dělená počtem všech srovnávaných pozic a vynásobená' 100. Tak např. jestliže u dvou sekvencí je 6 pozic z 10 shodných neboli homologníčh, pak tyto sekvence mají 60% homologii. Nebo např. dvě sekvence ATTGCC__ a TATGGC sdílejí 50% homologii. Obecně se provádí takové srovnání,, kdy sekvence jsou k sobě navzájem přiloženy tak, aby homologie byla maximální.

Termíny purifikovaný. preparát nebo v podstatě čistý preparát, polypeptidu slouží k označení polypeptidu, který byl oddělen od ostatních proteinů, lipidů a nukleových kyselin,,. se kterými se společně přirozeně vyskytuje) Výhodně,

·· ♦· ·· • · · · · · · ······· • · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· ···· '

je. polypeptid oddělen také od jiných látek jako např. protilátek nebo matrix, které byly použity pro čištění.

Termín transformovaný hostitel zahrnuje jakéhokoliv hostitele se sekvencí, tj . sekvencí TRELL, trvale integrovanou do genomu, nebo hostitele/ který má sekvenci, tj. sekvenci'TRELL, kódovanou episomálními elementy.

Termín ošetření se zde užívá pro jakékoliv terapeutické .ošetření, např.. podávání terapeutického agens nebo látky, např . léku . . ' .

Termín v podstatě . čistá nukleová kyselina, např. v podstatě čistá DNA, znamená nukleóvo.u kyselinu, která 1) není bezprostředně spojena s jednou 'nebo dvěma sekvencemi (jedna na 5'-konci a jedna na 3'-konci), např. kódujícími sekvencemi, še kterými sousedí v přirozeně se vyskytujícím genomu příslušného organismu, ze kterého jé nukleová.kyselina připravena, nebo 2j je v podstatě bez sekvencí nukleových kyselin, které. se vyskytují v organismu, ze kterého je uvedená nukleová kyselina připravena, nebo platí současně obě možnosti. Tento termín zahrnuje např. rekombinantní DNA vloženou do- vektoru, např. do autonomně se replikujícího plazmidu nebo viru, nebo do genomové DNA •prokaryotickěho nebo eukaryotického organismu, nebokterá existuje.jako samostatná molekula, např. cDNA nebo fragment genomové DNA vytvořený pomocí PCR nebo působením restrikčních endonukleáz, nezávislá -na^ú-nýsh—Sje-feshCrí-eh—DNA-^rV—poďs-tatě—ě-i-s-tá—DNA—ta-k-é—zruh-rnuj-erekombinantní DNA, ' která je součástí hybridního genu kóduj íčího TRELL...

Termíný peptidy, proteiny a polypeptidy popisují totéž a jsou užívány navzájem zaměnitelným způsobem.

Termín biologicky aktivní je používán, ve smyslu mít aktivitu, buďto in vitro nebo . in vivo, která se přímo nebo nepřímo projevuje. Tak např. biologicky aktivní fragment ·· ·· · · ·

-9 · 9 · • 99 99 9 • ·

9999

9999 99 99

TRELL může mít např. 70% homologii aminokyselinové sekvence s aktivním místem TRELL, výhodněji alespoň 80% homologii a nej výhodněji alespoň 90% homologii... Identita nebo homologie vzhledem k TRELL je definována jako procenta < ' - A · aminokyselinových zbytků v příslušné sekvenci, které jsou identické s aminokyselinovými zbytky sekvencí TRELL uvedenými . zde jako sekvence id. č. .2 a 4.

Provedení předkládaného vynálezu vyžaduje, pokud není uvedeno jinak, použití technik obvyklých v buněčné biologii, buněčných a tkáňových kulturách,. molekulární . biologii, transgenní biologii, mikrobiologii, techniku rekombinantní DNA a imunologické metody, které jsou v oboru známé. Takové techniky jsou popsány v příslušné odborné literatuře.

B. Sekvence DNA podle vynálezu

Jedním aspektem předkládaného vynálezu je v podstatě čistá (nebo. rekombinantní) nukleová - kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid TRELL, jako je např. sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 1 nebo 3 a/nebo ekvivalenty takových , nukleových kyselin. Termín nukleová kyselina zahrnuje také fragmenty nebo ekvivalenty, jako jsou např. sekvence kódující funkčně ekvivalentní pólypeptidy. Ekvivalentní nukleotidové sekvence mohou obsahovat sekvence, které, se 'liší jednou nebo několika • . / A . nukleoti.dovými substitucemi, adicemi nebi delecemi,_ jako jsen např. alelické varianty, mutace atd., a mohou také obsahovat nukeldtidové. sekvence, které se liší od sekvencí·kódujících TRELL uvedených' zde jako sekvence id. č. 1 nebo -3, díky degeneraci genetického.kódu. Původce sekvencoval lidskou DNA velikosti 1936 bp, která obsahuje otevřený čtecí rámec kódující polypeptid TRELL, který obsahuje 248 aminokyselin, jak je zde uvedeno v sekvenci id, č. 4.

·· • '· • ··· . Ve vynálezu jsou popsány jak lidské tak i myší sekvence,' přičemž popis vynálezu se obecně týká lidských sekvencí, 'ale odborníkovi, je zřejmé, že totéž se obdobně týká myších sekvencí. Pozoruhodným rysem TRELL je rozsah shody sekvence (konzervativnost sekvence) domény vážící receptor mezi člověkem a myší. .Pouze' ligand Fas se blíží obdobné míře. Jak. myší tak lidský protein TRELL mají všechny charakteristické vlastnosti členů rodiny TNF, t j . organizaci, mebránového ’ proteinu typu II a konzervované sekvenční motivy důležité pro prostorové uspořádání. proteinu do struktury antiparalelního β-listu charakteristické'pro TNF. .

Nukleotidové sekvence mTRELL jev této přihlášce uvedena jako. sekvence id. č. 1, sekvence aminokyselin mTRELL je .sekvence id. č. 2. ..Sekvence DNA a sekvence aminokyselin hTRELL,jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 3 a 4.

Sekvence podle předkládaného vynálezu se mohou’ použít pro přípravu série DNA sond, které jsou vhodné pro testování * ' různých sad přirozených nebo syntetických DNA, zda tyto .sekvence kódují TRELL -nebo .jeho fragmenty nebo deriváty.

Odborníkovi je zřejmé, že termín TRELL se.zde užívá v takovém smyslu, že zahrnuje i biologicky aktivní deriváty, fragmenty a homology TRELL.

Sekvence kódující TRELL podle předkládaného vynálezu se; může využít pro expresi , peptidu TRELL v různých prckaryotických_ nebo. eukaryotických__ hostitelích transformovaných takovými sekvencemi.. Peptidy, TRELL se mohou použít jako prot.irakovinná nebo imunoregulační agens. Obecně to znamená, že jedním z kroků aplikace je kultivovat hostitele, transformované molekulou DNA obsahující kódující sekvenci TRELL, operativně spojenou se sekvencí řídící expresi. .

) ·· ·· ·· ··

Sekvence DNA ' a rekombinantní molekuly DNA. podle •předkládaného vynálezu mohou být. exprimovány pomocí širokého .spektra kombinací hostitel/vektor. Tak např. vhodné vektory mohou obsahovat segmenty, .chromosomových, jiných než chromosomových, nebo syntetických sekvencí DNA. Expresní vektory podle vynálezu obsahují alespoň jednu sekvenci pro řízení exprese, která je operativně spojena se sekvencí kódující TRELL vloženou do vektoru, aby bylo možné regulovat či-řídit expresi sekvence DNA.

V rámci každého expresního vektoru se mohou vybrat různá míst-a pro vložení sekvence TRELL .podle předkládaného vynálezu. Místa jsou většinou navržena podle restrikčních endonUkleáz, které v příslušném místě štěpí, a tato místa i· endonukleázy jsou odborníkovi dobře známy. Odborníkovi je také , zřejmé, že vektor, pro. použití podle předkládaného vynálezu nemusí obsahovat místa pro restrikční endonukleázy pro vložení požadovaného fragmentu DNA, místo toho může být fragment klonován do vektoru . alternativním způsobem. Výběr expresního vektoru, a zvláště míst vhodných pro vložení vybraného, fragmentu DNA a jeho spojení se .sekvencí řídicí expresi, závisí na mnoha faktorech. K těmto faktorům patří, např. velikost proteinu, který má být exprimován, citlivost tohoto proteinu k proteolytické degradaci enzymy hostitelské buňky, počet míst pro příslušný restrikční enzym, kontaminace nebo ‘vazba. exprimovaného. proteinu proteiny hostitelské buňky·, které jsou. těžko odstranitelné v.průběhu purifikace apod. Další faktory, které' je třeba vzít v úvahu, jsou expresní charakteristiky jako je např. poloha ^; startovacího a ukončovacího kodonU vzhledem k sekvencím vektoru, a další faktory, které jsou odborníkovi zřejmé. Výběr vektory a vhodných míst pro vložení sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je tedy výsledkem zvážení všech .těchto faktorů,

přičemž ne všechna řešení jsou stejně účinná pro požadované aplikace. Ale pro odborníka je analýza všech .těchto faktorů rutinní záležitostí a výběr vhodného systému pak závisí především na konkrétním použití.

Odborník je snadno schopen vhodně modifikovat sekvence řidiči expresi tak, aby se získala vyšší úroveň .proteinové ..exprese, např. substitucí kodonů nebo výběrem kodonů určitých zvláštních aminokyselin, které jsou přednostně užívány konkrétním - organismem, s cílem zmenšit proteolýzu nebo změnit vzorec glykosylace. Podobně mohou být . nahrazeny .cysteindv.é zbytky jinými aminokyselinami, aby se usnadnila produkce nebo uspořádání proteinu, nebo aby se předešlo problémům se stabilitou.

·: Ne všechny kombinace hostitele a expresního vektoru fungují se stejnou účinností co se týče exprese sekvence DNA podle předkládaného vynálezu. Avšak výběr konkrétní vhodné kombinace hostitele a expresního vektoru může' být odborníkem proveden. K faktorům, které je třeba vzít v.úvahu, patří např. kompatibilita hostitele, a vektoru, toxicita proteinů kódovaných sekvencemi DNA vektoru pro hostitele, snadnost izolace požadovaného proteinu, . expresní charakteristiky sekvencí· DNA a sekvencí řídících expresi s nimi operativněspojených., . biologická' bezpečnost, potřeba energie na uspořádání struktury proteinu, forma proteinu a případně po.expr e.sní. módi f i kac e po ž ado váného. o r o t e i nu__________ .... —

TRELL., a jeho homology, produkované hostiteli transformovanými- sekvencemi DNA podle předkládaného vynálezu, stejně jako nativní TRELL . purifikovaný způsobem podlé vynálezu, nebo vytvořený, na základě aminokyselinové sekvence podle vynálezu, jsou ^užitečné . pro řadu ..aplikací protinádorových a imunoregulačních. Jsou také užitečné v terapii a způsobechtýkájících.se i jiných nemocí.

·· ·· ·· ·· > · · .·· · «··· ···· · · · · · · · * « . ··· · · · ······

Předkládaný vynález se také týká. použití sekvencí DNA podle vynálezu pro expresi TRELL ve zvláštních podmínkách,-, t j . při· . genové terapii. TRELL může ' být exprimován v nádorových buňkách, kde by exprese byla řízena promotory vhodnými pro tento účel. Taková exprese může posílit protinádorovou imunitní odpověď, nebo přímo ovlivnit přežívání nádoru. Takové cytokiny jako TRELL mohou také ovlivnit přežívání orgánových štěpů tím, že změní . lokální imunitní odpověď. V takovém případě by byl sám štěp nebo buňky, které ho obklopují, ovlivněn genem TRELL -upraveným metodami genového inženýrství.

Dalším, aspektem předkládaného vynálezu je použití izolované nukleové kyseliny kódující TRELL pro tzv·. antisense terapii. Termín antisense terapie se týká podání nebo in šitu vytvoření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují (váží se) v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA. a/nebo DNA kódující TRELL, a tak inhibují expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba může být konvenční komplementarita párů baží nebo. např. v,případě vazby na duplexy DNA, vazba prostřednictvím specifických interakcí v hlavním (velkém) zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se antisense terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv . terapie založená na specifické vazbě 0-l.ign.n.u.k.l-e.o-t.idov-é—.s-g-k-v&n-ce-j. . rzerrc:-—

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu je např. expresní plazmid, který -při .trankripci v buňce, produkuje RNA, která je komplemetární (tj . má opačnou, fedy antisense orientaci) k buněčné mRNA kódující TRELL. Alternativně . může být antisense konstrukt také připravená ex vivo. Takové oligonukleotidová sonda oligonukleotidové sondy j sou výhodně modifikované ·· ·· » · · • · · · ·· ··

19.

oligonukleotidy, které . jsou rezistentní k endogenním nukleázám a jsou proto stabilní in vivo.· Příkladem takových molekul·. nukleových kyselin vhodných jako antisense oligonukleotidy jsou fosfoamidátové, fosfothioátové a metylfosfohátové analogy DNA (viz patentové .přihlášky USA č. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775) . Kromě toho obecný postup jak konstruovat oligomery vhodné pro anisense terapii byly přehledně publikovány např. Van Der Krol. et al., 1988,. Biotechniques 6: 958-976 a Stéin. et al., 1988, Cancer Res. .48: 2 659-2 668, na což se tímto odkazujeme. .

C. TŘELL a jeho aminokyselinová sekvence

Protein TRELL, tj.. protein příbuzný- nádorovému nekrotickému faktoru . (TNF), podle předkládaného vynálezu patří do rodiny. proteinů . TNF. Tento protein sám, nebo jeho fragmenty či hom-oiogy, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití.

TRELL se Vyskytuje v mnoha tkáních, ale vzorec výskytu je zpravidla jedinečný pro členy rodiny TNE. Jelikož se členy rodiny TNF podílejí na regulaci buněčné smrti a přežívání, a na -buněčné diferenciaci, je i možné, že TRELL se také podílí na - přežívání buněk, diferenciaci a reparaci buněk v různých tkáních.

I když dosud není známa přesná trojrozměrná struktura TRELL, na základě příslušnosti k rodině TN,F lze předpovědět, že TRELL sdílí určité strukturní rysy s ostatními členy této rodiny. V přihlášce jsou popsány jak myší tak i lidský TRELL. myší TRELL, .jak lze dedukovat z existující sekvence cDNA, obsahuje úsek alespoň 21 hydrofóbních aminokyselin, který pravděpodobně u- membránových proteinů typu II. působí' jako doména ukotvující protein. v membráně. Aminokyselinová sekvence mTRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 2.

•··· · · • · · · • · « ·· ·· ·· *·. .**· • · · . ·?·?:::: • ··· «·· • · ···· ·· ·· »··· ·· ··

Lidský. TRELL obsahuje na -N-konci .hydrofilní cytoplazmatickou doménu, hydrofóbní zhruba v.rozsahu 27' aminokyselin, transmémbránovou'' doménu typu II a extracelulární doménu z 204. aminokyselin. Aminokyselinová sekvence hTRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 4.

Obr.' 1 představuje srovnání aminokyselinových sekvencí lidského a myšího TRELL.

Zatímco 52 aminokyselin N-koncového úseku je možné předpovědět na základě otevřeného čtecího rámce z klonu cDNA, přesná poloha počátečního methioninu > nemohla být určena. Met-36 (methionin v poloze 36) poskytuje. . .přiměřenou konsenzuální Kozákovu sekvenci, takže je' to pravděpodobné vhodný počáteční kodon. Srovnání sekvence TRELL s ostatními členy lidské rodiny. TNF ukazujme značnou, strukturní podobnost.' Tak např. jak je patrno . z obr. 2A a 2B, všechny proteiny připomínaj í membránové proteiny typu TI a · sdílej í· ·'několik' úseků, konzervovaných . sekvencí extracelulární domény. Na' obrázcích úseky s čárkami nad sěkvencemi ukazují ty sekvence TŇF a LTa, které vytvářejí strukturu β-listu v dané molekule.. Předpokládaná místa N-glykosylace jsou podtržena. Hvězdičky označují cysteinové zbytky vytvářející disulfidové vazby v molekule TNF. Konzervativní. domény se. pravděpodobně podílejí na interakcích podjednotek a na vytváření struktury listu.

Prohledávání databáze EST klonů vedlo k objevení lidského klonuÓ velikosti 345 bp, který je silně homologní s myším TRELL. Lidská aminokyselinová sekvence TRELL je zde uvedena jako sekvence id. č. 4.- Otevřené čtecí rámce zmíněného EST ..klonu neobsahují sekvenční motivy, které by. umožnily charakterizovat sekvenci jakožto člena rodiny TNF nebo příslušného ligandu (tj . motivy, které užily Willey' et ·· ·· » · · • ··· ·· ·· • · · ► · · · ··· ··· ···· ·· ·· ···· ·· ·· al. pro identifikaci EST klonu pro TRAIL .v dostupné databázi). .

Nový polypeptid podle předkládaného vynálezu specificky reaguješ receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a. způsoby podle předkládaného vynálezu umožňuj i identifikovat receptory,· které specificky reagují s TRELL nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu zahrnují peptidy. odvozené z TRELL, které mají schopnost vázat se na receptpry pro TRELL. . Fragmenty TRELL je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, protedlytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidu se mohou připravit odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo z obou konců nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu lze také připravit expresí mutované DNA. Pomocí štěpení endonukleázou, která ukusuje konce DNA, je možné připravit celou řadu fragmentů. DNA, která.kóduje fragmenty proteinu, se může také připravit náhodným rozstříháním řetězců DNA, nebo restrikčním štěpením anebo kombinací metod výše uvedených.

Polypeptidové fragmenty se mohou také . chemicky syntetizovat pomocí konvenční techniky známé jako syntéza na pevné fází užívající f-moc nebo t-boc. (Merriffield) . Tak např/. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného ·vynálezu ýe možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované ./ délky, které se nepřekrývají,, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky, -příslušné metody jsou popsány v následujícím.textu.

• * ··· ··.· · · ···· ·« ·· ·.··· ·· ·· *

D. Příprava rozpustného TRELL

Rozpustné formy ligandu jso.u často velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který •I · napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že TRELL je přirozeně secernován jako rozpustný cytokin, ale pokud tomu tak není,., je možné uzpůsobit gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné secernované formy TRELL by bylo třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky stonku, a nahradit je.vedoucí sekvencí typu I nebo typu II, .která umožní, účinné proteolytické štěpení v příslušném hostitelském systému. Odborník je schopen optimalizovat vazebné vlastnosti k recepto.ru a sekreční účinnost tím, že lze měnit rozsah stonkových úseků ponechaných, v expresním konstruktu. Tak např. lze připravit, odštěpováním z N-konce konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, takže vzniknou proteiny, které budoú začínat aminokyselinou 81 až 13.9. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence stonku.

E. Příprava protilátek reaktivních s TRELL .Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících, s TRELL nebo jeho . receptorem. . . Antiséřa anti-proťein/anti-peptid . nebo monoklonální protilátky mohou být připraveny standardními způsoby(viz naoř> Antibodies:A

Laboratory Manual,' Harlow and Lané (eds.J, .Cold Spring Harbor press, 1988). Savci jako nápř. myš, křeček nebo králík, se' mohop imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním tím, že se např. konjuguje s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část TRELL nebo jeho receptorů může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je. možné’ • · · • ·. · » · · · · · monitorovat pomocí detekce . titru protilátek .v plazmě nebo séru. Standardní tesť ELISA nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby . antigenem k ohodnocení hladinprotilátek.

. Ve výhodném provedení předkládaného , vynálezu jsou protilátky imunospecifické nebo antigenní determinanty TRELL nebo jeho receptorů, tj . antigení determinanty . polyp.eptidu sekvence id. č. 2 nebo 4, nebo blízce' příbuzný lidský nebo savčí, jiný než . lidský,, homolog (s homologii 70, 80 nebo %, nejvýhodněji. s homologii alespoň ’ 95 %) . V.-dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-TRELL. nebo anti-receptor 'TRELL v podstatě křížově nereagují (tj . reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně. než z 80 % homologní se sekv.encí id. č. '2 nebo i. č. 4, výhodně méně než z 90 % a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se sekvencí id. č.. 2 nebo id. č. 4. Tím, že v podstatě kří žově. nereaguj i se míní to,. že protilátka má vazebnou afinitu k nehomológnímu proteinu menší než 10 % vazebné afinity k proteinu sekvence id. č. 2 nebo id. č. 4.

Termín protilátka se v tomto textu užívá tak, že zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s TRELL nebo receptorem TRELL. Protilátky lze fragméntovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou' v oborů známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro, .celé protilátky. Tak např. fragment F.(ab')₂ je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby.se redukovaly disulfidové můstky, čímž vznikne fragment Fab.' . Protilátky podle předkládaného vynálezu biospecifickými a, chimérickými aktivitu namířenou proti.. TRELL nebo proti receptorů TRELL. Takže pro blokování TRELL. nebo j.eho receptorů je možné využít jsou.. dále tvořeny molekulami, které mají

C · ' · « jak monoklonálních tak polyklonálních protilátek namířených proti TRELL a receptoru TRELL, a také .příslušné fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')₂.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře .349: 293-299, 1991). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná doména pro antigén z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et £ al., patentová .přihláška USA č. 4 816 567) . Chimérické protilátky redukují pozorovanou imunitní odpověď vyvolanou.

zvířecím protilátkami, když jsou použity v klinických *

aplikacích pro lidské pacienty.

Kromě toho . se mohou syntetizovat rekombinantní humanizované protilátky, rozpoznávající TRELL nebo jeho. receptor. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují· většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly . vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovariým antigenem, pak se izoluje . příslušná protilátka a .odstraní se- z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Úsek vážící antigen ze. zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn, úsek . vážící antigen. ' Humanizované . protilátky . minimalizují . použiti.

, ÁétérdTognTcK fťj” mezídřuhovýčHj~ sekvencí v .ridš^kych protilátkách, které pak s menší pravděpodobností vyvolají λ imunitní odpověď u ošetřovaného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také. tak, že se připraví chimérické nebo humanizované' protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, CH2 a CH3.) izolované- z různých . tříd imunoglobůlínů. Tak např. se mohou připravit rekomhinantním způsobem protilátky' se zvýšenou, valencí vazebných míst pro • · antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro a.ntigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177 : 1439-1450, 1993). Kromě toho .lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro změnu vazebné. afinity rekombiriantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní zbytky aminokyselin v.blízkosti vazebného místa pro anfigen.' Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na molekulovém . modelování (Quenn et al., Proč. Nati? Acad.

Sci. USA 86:	10029-33,	1989).
F.. Vytváření	analogů	a příprava změněných	sekvencí	DNA
a peptidů		>
Analogy	TRELL	se mohou lišit od	přirozeně	se
vyskytujícího	TRELL v	sekvenci aminokyselin,	nebo j inak	než

v sekvenci aminokyselin, nebo oběma způsoby. Jiné modifikace než modifikace sekvence jsou jak. in vitro tak in vivo chemické derivatizace TRELL. K těmto nesekvenčním modifikacím , í' · . · patří (nejen) změny v acetylac.i, metylaci, . fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci.

. K výhodným analogům . TRELL patří TRELL nebo jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od

t.

sekvencí uvedených zde. jako sekvence id. č. 2 a id. č. 4 geci.nou'—' “nebo ně'koTTka konzervativními’ substitucemi aminokyselin nebo jednou nebo několika substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které sice nejsou konzervativní, ale nenarušují aktivitu -TRELL. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících, skupin: . valin - glycin, glycin. alanin,· valin - isoleucin - leucin, kyselina aspartová -'· ·· · ·· · · ii'*.

• ··· · · · · · · ·

«.· ··· · · · · · · .· ··· • · · ··· · · ···· 99 ·1 ···· ·· ··

6 kyselina glutamová, apsaragin - glutamin, serin - thr.eonin, lysin - arginin a fenylalanin - týrosin.

Konzervativní záměny aminokyselin jsou přehledně'uvedeny v tab. 1. Tab.. 1

Konzervativní záměny aminokyselin

Aminokyselinu	Kód '	Nahraď jakoukoliv z následujících
Alanin	A	D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln . ..;
Kyselina . ,. aspartová	D .	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met,.Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn,:D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp,
Kyselina	EG	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn,Gin,
Glycin.......?.....	G	Ala, D-Ála, Pro, D-Přo,-Ala,.Asp	-
Isoleucin	i-	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met ··.··. '.
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met

• · « • · · · · « • « • a a · • ··· • •a • · « • · · · · · ·· ···· i- .

Tabl. pokračování

Aminokyselinu	Kód	Nahraď jakoukoliv z následujících
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Ařg, Homo-Arg, D-Homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Met, S-Me-Oys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val.
Fenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His,.D-His Trp, D-Trp, Trans-3,.4 nebo 5-fenylprolin, ' cis-3,4 nebo 5-fenylprolin
Prolin	P'	D-Pro, L-l-thioazolidin-4-karboxylová kyselina, D- nebo L-l-oxazolidin-4karboxylová kyselina
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, .Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Threonin.	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), Val, D-Val .
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dópa, His, D-His
Valin	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

——. Vhodnými způsoby mutageneze je mutageneze pomocí -pCR ’ a saturační mutageneze, které budou popsány v následující části. Také je možné vytvořit knihovnu variant náhodných sekvencí aminokyselin pomocí syntézy sady degenerovaných oligonukleotidových sekvencí.

« · ···· ·· • 0 ·♦·«

Mutageneze pomocí PCR

Při mutagenezi pomocí PCR se využívá relativně malá přesnost Taq polymerázy k zavedení náhodných mutací do klonovaného fragmentu DNA (Leung eť al., Technique 1: 11-15, 1989) . Je to velmi účinná a přitom velmi rychlá, metoda pro vnesení náhodných mutací. Úsek DNA, který.má být mutován, se amplifikuje pomocí .polymerázové řetězové reakce (PCR) v podmínkách, které snižují přesnost Taq polymerázy, tj. jestliže je poměr dGTP/dATP přibližně roven 5 a přidá se. Mn²⁺ do reakční směsi pro PCR. Celá sada amplifikovaných fragmentů se pak klonuje do vhodných vektorů a vytvoří se tak knihovna náhodných mutantů.

Saturační mutageneze , Saturační mutageneze.dovoluje rychlé vnesení mutací typu substituce jedné baze do klonovaného fragmentu DNA (Mayers et al., Science 229:242, 1985) . Tato technika zahrnuje generaci mutací, tj. chemické ošetření nebo ozáření jednořetězcové DNA in vitro, . a. pak syntézu komplementárního řetězce DNA. > Frekvence mutací může být ovlivněna silou působícího účinku a v podstatě lze dosáhnout substituce všech 'možných baží. Jelikož celý tento proces nezahrnuje žádnou genetickou selekci mutovaných fragmentů, získají se tak fragmenty jak

DNA, ze i-—-s-ub^tařbu^ cíl·-'7.-, --1 íu1íoů.ti e^—TťiCTCovan é j_r a gmenr y kterých se mohou připravit proteiny se změněnou funkcí. Distribuce /bodových mutací není přitom .nijak směrována na konzervativní sekvenční prvky.

Mutageneze pomocí degenerovaných oligonukleotidů

Knihovnu homologů je možné' připravit pomocí. · sady degenerovaných oligonukleotidů.. Chemická syntéza degenerovaných sekvencí ,.se může provést na automatickém • · • ·

9-9 · . · 9 9 •••9 99 ·· ·999 syntetizátoru DNA, a syntetické geny se pak vloží (ligují) do vhodného expresního vektoru. Syntéza degenerovaných oligonukleotidů je způsob v oboru dobře známý (31) a tento - způsob byl již využit pro cílený vývoj jiných proteinů (32).

Způsob cílené nebo nenáhodné mutageneze se může využít pro přípravu specifických, sekvencí nebo mutací v určitých specifických úsecích. Tento způsob se může využít pro vytvoření -variant, které obsahují delece, inzerce nebo > substituce aminokyselinových zbytků ve známé aminokyselinové sekvenci proteinu. Místa mutací' se mohou modifikovat individuálně nebo v, sériích např. tak, že se 1) nejdříve substituují konzervativní aminokyselina a pak se provádějí· ;· radikálnější změny v závislosti na získaných výsledcích

2) deletují se (odstraní) cílové' zbytky a 3) inzerují se (vloží) ' zbytky stejné nebo jiné . třídy do sousedství \ - příslušného místa, nebo se kombinují všechny 3 uvedené způsoby. ’ t Mutageneze nahrazováním alaninem

Mutageneze nahrazováním alaninem (alanin scanning) je metoda vhodná pro - identifikaci určitých zbytků, nebo úseků požadovaných proteinů, která jsou výhodnými místy nebo doménami pro mutagenezi (Cunningham and Wells,. Science 244:

y ..........y«’y j~. Př r t e t o '“me todě . s e 'i^ěrřtnfih^ jT' ~zbý^ký / ’ϊ^: . nebo, skupiny zbytků (např. nabité aminokyselinové zbytky jako__ t Arg, Asp, His, Lys -a Glu) a nahradí se neutrální ' nebo .

negativní aminokyselinou (nejvýhodněji alaninem nebo polyal-aninem)^;. Tyto náhrady aminokyselin mohou , ovlivnit interakci aminokyselin se .okolním vodným .prostředím uvnitř nebo vně .buňky. Domény, u ' kterých se projeví funkční _x citlivost na substituce, se mohou dále zpřesňovat vnášením dalších změn nebo změnami již substítuovných míst. Takže

0·0 '···· ····. · · 0000 ·· · 0 00 ·

0 00« · . · · ·· · · · ·

0·.··· · · ···« ·· ·· -··.·· ·'· ·· zatímco místo pro vložení variace aminokyselinové sekvence je predeterminováno, povaha mutace sama o sobě predeterminována není. Tak např. pro optimalizaci účinnosti mutace v určitém místě je možné provést alanin-nahrazovací nebo náhodnou, mutagenezi na cílovém kodonu nebo úseku a exprimovat varianty podjednotek pož.adovaného proteinu a ty pak . testovat na optimální kombinaci a požadovanou aktivitu.

Mutageneze zprošředkovaná oligonukleotidy

Mutageneze zprošředkovaná. oligonukleotidy je metoda vhodná pro přípravu substitučních, delečních a inzerčních variant DNA (viz např. Adelman et al., DAN 2: 183, 1983) . Požadovaná DNA může být změněna tím, že hybridizuje s oligonukleotidem, který obsahuje mutaci DNA templátu, kde templátem je jednořetězcová forma plazmidu nebo bakteriofágu obsahující nezměněnou nebo nativní sekvenci DNA. pro požadovaný protein. Po hybridizaee sé použije DNA polymerázapro syntézu celého komplementárního řetězce, takže templát pak obsahuje vložený oligonukleotidový primer a tudíž kóduje' vybrané změny v DNA pro daný protein. Obecně.· se užívají, oligonukleotidy velikosti 25 nukleotidů. Optimální oligónukleotid obsahuje 12 až 15 nukleotidů, které jsou plně. komplementární k templátu na obou. stranách od nukleotidu oligonukleotid bude správně hybridizovat s jednořetězcovou templátovou DNA. Oligonukleotidy· lze snadno syntetizovat způsoby známými v oboru (viz např. .Crea et al., Proč. Natí. Acad. Sci. USA 75: 5765, 1978).·.

Kazetová mutageneze • Dalším způsobem, jak připravit . varianty, je kazetová . mutageneze založená na. technice, kterou popsali Wells et

999 99 9

9 .99 • · ·· • · · • · I ««·« ··

9 9 99 9 restrikční neexistuje, pomocí výše oligonukleotidem.

al. (Gene 34: 315, .1985),. Výchozím materiálem je plazmid (nebo jiný vektor), který obsahuje DNA pro proteinovou po.dj endnotku, .která má být mutována. Nejdříve je třeba identifikovat kodon (případně kodony) , které . mají být v proteinové podjednotce mutovány. Je třeba, aby na každé straně od mutovaného místa bylo jedinečné místo pro endonukleázu. Pokud takoví restrikční místo je třeba ho v požadované lokalizaci vytvořit popsané mutageneze zprostředkované

Poté, co do plazmidu byly. vložena restrikční místa, plazmid se v těchto místech naštěpí, a tedy linearizuje. Pak se standardním způsobem syntetizuje dvouřetězcovýoligonukleotid, který kóduje sekvenci DNA mezi dvěma restrikčními místy a obsahuje požadovanou mutaci. Každý oligonukleotidový řetězec je syntetizován samostatně a pak spolu hybridizují zase. standardním způsobem v oboru známým, tento dvouřetězcový oligonukleotid je nazýván kazetou. Kazeta je přitom navržena tak, aby obsahovala 3'-konec a 5'-konec kompatibilní s konci· linearizovaného plazmidu, takže může být ,přímo do plazmidu ligována. Plazmid pak obsahuje mutovanou sekvenci DNA požadovaného proteinu.

Kombinační mutageneze ~ťro vytvořeni mutací íě faTče' , možné použít kombinační mutagenzi. Aminokyselinové sekvence skupiny homoiogních nebo__ jinak příbuzných proteinových sekvencí se uspořádají, tak, aby bylo dosaženo maximální homologíe. Všechny sekvence, které·se.

objeví v daně pozici .u všech uspořádaných· sekvencí se vyberou ' .....·”· * a vytvoří , se z nich degenerovahá sada kombinančních sekvencí. Kombinační mutagenezí se .vytvoří velmi různorodá ..knihovna variant na úrovni nukleových kyselin. Tak např. směs syntetických oligonukleotidů se enzymaticky, liguje do .

• ··· · . · · · · · · • . · ·«· · · · · · · · · · · '·· ···. · ·

99·9 99 99 ···· ·· ·· . 32 genových sekvencí tak, že degenerovaná sada potenciálních sekvencí je exprimovatelná jako individuální peptidy, nebo alternativně, jako sada delších fúzních proteinů obsahujících sadu degenerovaných sekvencí.

Různé techniky jsou v oboru známé pro screening vytvářených mutovaných genů. Techniky pro screening velkých genových knihoven často zahrnují klonování knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných i buněk výslednou knihovnou vektorů, a· expresi genů v podmínkách, kde detekce požadované aktivity, tj . v tomto případě vazbu na TRELL nebo jeho receptor, umožňuje relativně snadnou izolaci vektoru kódujícího gen, . jehož produkt byl detekován. ‘Každá z technik popisovaných v následujících odstavcích je vhodná k vysoce účinnému a vysokokápacitnímu . testování velkého počtu sekvencí vytvářených např. technikami náhodné mutageneze.

Vynález dále poskytuje možnost připravovat mimetika pro redukci proteinových vazebných domén polypeptidu TRELL nebo jeho receptorů, tj. peptidová činidla nebo činidla -jiné povahy než peptidy. Peptidová mimetika. jsou schopna narušit vazbu TRELL a jeho receptorů. Kritické zbytky TRELL účastnící se procesu molekulového rozpoznávání receptorového polypeptidu nebo příslušného následného intracelulárního 'dUctVě >.......^.. iLiol'íou'~”by í^-líc s?.y -a¹ poUžTty ~prú~ přípravu peptidových mimetik TRELL nebo. jeho receptorů, která , kompetitivně nebo nekompetitivně inhibují vazbu TRELL a jeho.

receptorů (viz např. Peptide irthibitors of human papilloma virus protein' binding to retinoblastoma gene protein, patentové přihlášky EP 412'762 A a EP B31 080 A; na které se tímto odkazujeme).

• · · · ♦ · · • · · · ' · · « • · · • Ml ··

9999

9 9

G. Farmaceutické přípravkyTím, že předkládaný vynález poskytuje čistý a/nebo rekombinantní TRELL, poskytuje také metodu pro testování kandidátů léčiv, která jsou funkčně agonisty nebo antagonisty, a sice TRELL nebo jeho receptorů. -V jednom provedení předkládaného vynálezu, se, p*omocí takového testu hodnotí schopnost sloučeniny modulovat vazbu mezi TRELL a jeho receptorem. Je možné pak vytvářet různé, varianty testů podle předkládaného vynálezu, což je odborníkovi zřejmé.

V mnoha programech pro screening léků, které testují celé knihovny sloučenin nebo přírodních extraktů, jsou požadovány metody s velkou účinností a kapacitou zpracovaných vzorků, tj . aby bylo .možné maximalizovat počet sloučenin otestovaných . za jednotku času. testy, které se provádějí na bezbuněčném systému, jako jsou např. purifikované nebo ,šemipurifikované proteiny, jsou často výhodně jako testy pro tzv. primární screening, který dovoluje rychlý vývoj těchto sloučenin, neboť umožňuje relativně snadnou detekci změn molekulového cíle, ke které ' dochází působením testované sloučeniny. Avšak toxické působení na buňky a/nebo biologická dostupnost testované . sloučeniny mohou být, ignorovány v takovém in vitro systému, neboť test je primárně zaměřen na působení léčiva na molekulový cíl a proj.evy změn vazebné afinity s jinými proteiny nebo změny enzymatických vlastností molekulového ' ci_le_.__ __ _ _

Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství TRELL nebo receptorů TREELL, nebo jejich fragmentů nebo mimetik, a případně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky. .

Vynález se tudíž také týká způsobu léčení rakoviny a způsobů stimulace,. nebo v určitých případech naopak inhibice, imunitního systému, nebo jeho částí, které

» spočívají v podávání farmaceuticky účinného množství .sloučeniny podle -předkládaného vynálezu nebo jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů. Přitom odborníkovi je zřejmé, že sloučeniny a způsoby podle vynálezu <

se mohou kombinovat s řadou terapií.

Přípravek podle předkládaného vynálezu může být I formulován pro různé lékové formy a způsoby podávání, včetně systémového, topického nebo lokálního podávání. Pro systémové podávání je výhodné podávání. injekční, včetně intramuskulární, intravenózní,' intraperitoneální a subkutánní injekce, přičemž přípravek podle předkládaného vynálezu může být formulován jako vodný roztok, výhodně ve fyziologicky kompatibilním pufru jako je . např. Hankův nebo Ringerův roztok. Kromě toho přípravek podle předkládaného vynálezu ' může . být formulován -v pevné formě pro případné rozpuštění nebo resuspendování bezprostředně před použitím. Předkládaný .vynález se také týká lyofilizováných forem přípravku. . Přípravek podle předkládaného vynálezu se může podávat také perorálním, transmukosálním nebo transdermálním způsobem. V přípravku pro transmukosální nebo transdermální podávání se použijí vhodné látky usnadňující penetraci

..(penetranty) vzhledem, k bariéře, kterou je nutno překonat.

Takové penetranty jsou v oboru známy a patří k nim např. pro transmukosální podávání . soli žlučové kyseliny, deriváty ~___ _____kyseliny _ fusidové .-.a jdetergentyTransmukosální podávání __ lze « . provádět buď nasální aerodisperzí nebo pomocí čípků. Pro perorální podávání je přípravek formulován v obvyklé lékové formě vhodné pro perorální podávání jako jsou kapsle, tablety a tonika.. Pro topické podávání může být přípravek ve formě mastí, mazání,, gelů nebo krémů, , jak je v oboru všeobecně známo.

· · · · · . 9999

Výhodně je přípravek podle předkládaného vynálezu ve formě jednotkové lékové dávky a· je podáván jedenkrát nebo vícekrát denně. Množství aktivní látky podané v jedné, dávce v průběhu léčení je závislé na mnoha¹ různých faktorech. Tak např. na věku a velikosti subjektu, závažnosti a průběhu onemocnění, které se léčí, způsobu a formě podávání,.

> a samozřejmě na úsudku zkušeného lékaře. Avšak účinná dávka může být v rozmezí přibližně 0, 005 až 5 mg/kg/den,. výhodně ^ť . přibližně 0,05 až 0,5 mg/kg/den. Odborník sám posoudí, kdy mohou být prospěšné nižší či vyšší dávky. , .

Genové konstrukty podle předkládaného vynálezu se mohou použít také jako součást protokolu genové terapie pro přenos nukleových kyselin kódujících buďto agonistické nebo antagonistické formy polypeptidu TRELL.

Expresní konstrukty . TRELL se . mohou podávat prostřednictvím jakéhokoliv biologicky účinného nosiče', tj . jakéhokoliv farmaceutického přípravku schopného účinně

- přenést,in vivo gen pro' TRELL do buňky. Tento přístup znamená vložit gen do virového vektoru, který může přímo transfekovat buňku, nebo podat plazmid.ovou DNA, pomocí např. lipozomů, nebo nějakého vnitrobuněčného nosiče, anebo se může. jednat o . přímou injekci genového, konstruktu. Výhodnou metodou ¹je však přenos, pomocí virového vektoru.

Farmaceutický přípravek s genovým konstruktem pro' __ genovou terapii _se skládá v podstatě ze systému pro přenos ___ # genů a vhodného ředidla, nebo se může jednat o matrix . · umožňující pomalé uvolňování, do které je systém přenášející . gen zapuštěn. Alternativně, pokud celý systém pro přenos genů může být připraven intaktní z rekombinantních buněk, např. jako .retrovirový vektor, farmaceutický přípravek pak obsahuje jednu nebo -několik buněk, které produkují, systém pro přenos genů.

7'

Kromě použití pro terapii se oligomery podle předkládaného . vynálezu mohou použít .jako . diagnostické reagencie pro detekci přítomnosti či absence'cílové DNA, RNA nebo sekvencí aminokyselin, ke kterým se specificky váží.

Jiným, aspektem předkládaného vynálezu je .použití pro hodnocení chemické sloučeniny z hlediska její. schopnosti reagovat, tj . např. vázat se či jinak fyzikálně asociovat, s polypeptidem TRELL nebo jeho fragmenty. Kromě toho TRELL podle předkládaného vynálezu, se může použít v metodách pro hodnocení přirozeně se vyskytuj ících.. ligandů nebo receptorů TRELL, . a'také pro hodnocení chemických látek, které ^:se asociují nebo váží s receptory TRELL.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu: poskytuje způsob •hodnocení chemické látky z hlediska její schopnosti modulovat interakci mezi TRELL· a jeho receptorem, Tento způsob znamená smísit TRELL a receptor TRELL v podmínkách, kde taková 'dvojice je schopna interakce, pak přidat chemickou látku, která se testuje, a detekovat vytvoření a. nebo naopak rozpad komplexu. Takové modulující činidlo může být dále hodnoceno testy in vitro , na aktivitu v bezbuněčném systému a pak se, případně ošetřením buněk nebo podáváním zvířatům, mohou hodnotit účinky. .·:·. ·''··'.

Příklady provedení vynálezu

Izolace cDNA TRELL .Příklad 1

A) Klonování myšího genu TRELL ...

^l’ cDNA kódující mTRELL byla izolována pomocí. PCR.

-Z knihovny cDNA' z myší ch peritoneálních . makrofágů, Sekvence aminokyselin a umístění transmembránového úseku je typické . pro membránové - proteiny. Aminokyselinová sekvence mTRELL je / zde. uvedena jako sekvence id. č.. 2 a příslušná sekvence DNA je zde uvedena jako sekvence id. č. 1. f . Makrofágové buňky byly získány z peritonea myší Balb/c peritonální laváží a buňky, které adherovaly ,k plastu do >. jedné hodiny po odebrání, byly .lyžovány a byla z nich extrahována RNA. Byl .připraven syntetický oligonukleotidový primer 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3'ze sekvence myšího erytropcetinu _v ¹ (viz C.B. Shoemaker a L.D. Misťock: Muřine erythropoietin. gene: cloning, expression and human gene homology, . Mol.

Cell. Biol. 6 :·· 849·, 1986) . Tento primer byl použit pro metodu 5'RACE (systém 5'RACÉ od firmy BRL) podle návodu výrobce ve ,· ’ spojení s kotvicím primerem dle BRL: První řetězec cDNA byl ______..připráven. ..z ..RNA z makrofágů„.adhe.ru.jících. do jedné hodi ny, ja k.

. *·. . bylo uvedeno výše. AmpLi.fikace byla .provedena pomocí termálního DNA cykleru firmy Perkin Elmer a s Taq DNA polymerázou taktéž od Perkin Elmer. Po první, denaturaci 5 minut při 94 °C byly podmínky. cyklů následující : 35 cyklů sestávající z 30 sekund v 94 °C, 30 sekund v 55 °C a 3 minuty v 72 °C. Závěrečným krokem byla dodatečná extenze při 72 °C a pak byla reakce udržována při 4 °C. Analýza experimentu. PCR

X • r ·· na agarózovém gelu ukázala dva amplifikované fragmenty velikosti : 650bp a 500 bp.. Oba fragmenty byly· vyříznuty z gelu, vloženy do vektoru pBS-Τ a sekveňcovány. Ukázalo, že šlo u různé fragmenty. Oba měly na konci shodný oligonukleotid specifický.' pro . stejný erytropoetinový gen, který byl použit jako primer pro PCR syntézu. Northernová ahalýza pomocí fragmentů náhodně značených ³²P ukázala, že hybridizovaly. se dvěma různými RNA, přičemž fragment 500 bp hýbridizoval s RNA velikosti 1,4 kb v makrofágách..Pro určení orientace ·. cDNA byly. v northernové analýze užity ribonukleotidové sondy (ribosondy) značené ³²P.

Z určených sekvencí a orientací byly odvozeny dva vnitřní primery pro RNA velikosti 1,4 kb. Ty byly využity pro metodu 5'RAÓE-PCR. ..Experiment 5'RACE-PCR poskytl fragment velikosti 750’ bp, který byl' vložen do . vektrou pBS—T a sekvencován. · Ukázalo se, že odpovídal. 3'-konci RNA o velikosti 1,4 kb, neboť obsahoval polyaděnylační signál AATAAA právě před polyadenylovou sekvencí polyA. Uplatnění metody 5'RACE nevedlo k‘vytvoření žádného pásu. Souprava pro. amplifikáci. Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) byl použit pro ·. přípravu cDNA knihovny . z . výše popsaných adherujícich makrofágů. Byl použit fragment velikosti 1040 bp : získaný PCR pomocí antisense a sense oligonukleotidových primerů . z určené sekvence i DNA společně s univerzálními p r.imex y^zjm-^snůp ra.vy-₁--_rTo--ve.d Lq _r_Jc _r yy tvoř-eni,. ^pajgmen t u_ de 1-š-ího^-.něž bylo původních 1040 bp. Nový fragment, který byl sekvencován,. byl delší o 60 bp na. 5'-konci (sekvence id. č. 1).

Bylá také. izolována RNA z myších peritoneálnícn makrofágů indukovaných thioglykolátem po . hodinové, adherenci . Hybridi-zace byl provedena s cDNA pro mIRELL značenou ³²P.. . Obr. 3 ukazuje výsledky northernové analýzy exprese' mRNA pro · • ·

TRELL v peritoneálních makrofágách myši. a v dalších myších orgánech.

Prvních 21 aminokyselin představuje hydrofóbní transmémbránovou doménu. V dostupných databázích _; nebyla nalezena žádná shodná sekvence ani na úrovni nukleotidů ani aminokyselin. Pomocí programu PROSÍTE a 225 aminokyselinových sekvencí bylo- zjištěno, že dotčená sekvence patří do proteinové rodiny TNF. Protein má také různé domény popsané pro LT-ci a jiné členy této rodiny (J. Browning. et al., Lymphotoxin-a, a novel mernber of the TNF family that forms heteromeric complex with lymphotoxin on the.$urface, Cell 72: 847, 1993, C.F. Ware et al. THE ligands and receptors of the lymphotoxin systém, in Pathways of cytolysis, G.M., •Griffithš and J. Tschopp (Eds.), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, s. 175-218, 1995) . Ukázalo se, že tato sekvence je jedinečná. Na ' úrovni nukleotidů nebo aminokyselin byla pozorována slabá míra identity nebo podobnosti při srovnání s ostatními členy rodiny TNF nebo i s jinými sekvencemi. Prohledávání databáze EST klonů vedlo k odhalení jedné lidské sekvence zcela jasně homologní s touto myší sekvencí. Klon 154742,5'(GenBank, přístupové číslo R55379) z knihovny z prsu,' kterou vytvořil Soares, Washington University,, velikosti 345 bp vykazoval 89%homologii s myším TRELL.' V dostupných databázích nebyla nalezena žádná sekvence, která by souhlasila s dostupným 5'koncem TRELL. __________ . .

i · .

• · · • · • v 99 • · 99 • · 999· · · · ' · • · 9 9 • 9 · ·

9 9

9 9 9

9

Příklad 2

B) Klonování lidského TRELL

1) Příprava oligonukleotidových sond a primerů pro PCR

Jako základ pro syntézu oligonukleotidových primerů byla využita sekvence lidského EST klonu R55379, která je homologní s myším TRELL. Byly připraveny ' dva sense (souhlasné) oligonukleotidy 20mery :

LTB-065: 5'CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA (nt 70 Až 89 z R55379)a LTB-066: 5'TGA TGA GGG GAA GGC. TGT CT (nt-14 až .33 z R55379) a jeden antisense (s. opačným smyslem orientace) 20mer: LTB-067: 5'AGA CCA GGG CCC CTC AGT GA (nt 251 až 270 z R55379).

2) Identifikace mRNA a zdrojová cDNA knihovna ' pro klonování

TRELL . ,

PolyA+mRNA z lidských jater (katalog, č. 6510-1), sleziny (katalog, č. 6542-1) a lymfatických uzlin (katalog, č. 65941) byly zakoupeny od firmy Clontech. PolyA+mRNA z buněk lidských buněčných linií THP-1, U937 a 11-23 byly připravenou firmou Biogen, Cambridge, MA. cDNA knihovna z lidských toňsil ve fágu Lambda gtlO. a také . DNA z této knihovny byly připraveny také.v Biogenu. . Na šesti vzorcíchRNA byla provedena reverzní transkripce, sdružená s polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PGR). Každá reakce pro syntézu cDNA.obsahovala. 1 μρ polyA+mRNA, 50mM Tris pH .8,3, 75 mM.KCl, . 3mM MgCl₂, lOmM DTT, 250mM dNTP, 50 ng náhodných hexamerů (50ng/ μΐ) a 400 U .reverzní transkriptázy Superscri.pt II (Gibco BRL, katalog, č. ,6542-1) v Celkovém objemu . 40 μΐ. Reakce byla inkubována ve 20°C po 20 minut, ve,' 42 °C po 50 minut a nakonec v 99 °.C 5 minut. . Pro. následující ·· ·· » · · · » · · · ··· *·· • ' · ·· ·· ·· ·· » · · • ··· • · · · · ·· ··

Β · · 4 • 4 ·/ ···· ·· • · · ·· ····

PCR pak byla.užita jedna pětina každé cDNA reakce nebo 100 až 1000 ng- DNA z cDNA knihovny. Byly provedeny dvě PCR reakce pro každý vzorek, jedna s párem primerů LTB-065 a LTB-067,. která by vedla ke vzniku produktu o velikosti 201 bp, a druhá reakce s párem primerů LTB-066 a LTB-067, která by poskytla produkt velikosti 257 bp, pokud bude přítomen příslušný transkript ve vzorku. PCR byla provedena ve lOmM Tris pH 8,3, 50mM KCl, l,5mM M.gCl2, 0,01% želatině, 10% DMSO, 100 μΜ dNTP s 30 pmol každého primerů a 5 U polymerázy AmpliTaq (Perkin. Elemer, katalog. č. N801-0060). PCR byla provedena v termocykleru Perkin Elmer Cetus Model 480. Podmínky cyklů byly 95°C, 1 minuta, 60 °C,. 1 minuta a 72 °C, 1 minuta, a. to opakováno v 35 cyklech. .

Produkt' správné velikosti byl získán z jater, sleziny, lymfatických uzlin, . THP-1. a tonsil, ale U937 a 11-23 mRNA neposkytly žádný produkt. PCR produkt z jater velikosti 201 bp byl purifikován. a použit dále jako sonda pro screening cDNA knihovny. '

3) Screening cDNA knihovny

Poté, co bylo pomocí PCR prokázáno, že cDNA knihovna z tonsil obsahuje TRELL, 1 milion pfu (jednotek vytvářejících plaky) z Lambda. gtlO cDNA knihovny, lidských- tonsil bylo vyseto na misky Nunc™ v hustotě lxlO⁵. pfu. . Byly vytvořeny duplikátní otisky na membránové filtry Schleicher and Shuell. BA-S 85 Opitran™. PCR produkt zmíněný výše o velikosti 201 bp byl označen ³²P pomoci náhodných průměrů -(Feinberg and Vogelstein, 'Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Filtry pak byly hybridi zovány přes noc při 65 °C ve 400 ml Plaque screen pufru (50mM.Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% difosforečnanu sodného, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll) . s 10% dextransulfátem, 100 pg/ml tRNA a 6xl0⁵ cpm/ml sondy. Po.hybridizací byly filtry • · · dvakrát opláchnuty Plaque screen pufrem a pak dvakrát 2xSSC, 0,1% SDS při 65 °C a poté exponovány na film při -70°C s intenzifikačním stínítkem po dobu 40 hodin.

Dvojitě pozitivní plaky byly přeneseny z původních misek.· do média SM (lOOmM NaCl, lOmM MgSO₄, 50mM Tris pH 7,5) s želatinou. 12 pozitivních plaků pak bylo purifikováno. Lambda DNA získaná minipreparací z 12 purifikovanách plaků byla naštěpena restriktázou Notl a analyzována elektroforézou ha 1% agarózovém gelu, pak analyzovány Southernovým přenosem a hybridizována se sondou 210 bp- výše zmíněnou.

Klony s nej delším inzertem (přibližně .2 kb), které hybridizovaly se sondou, byly vybrány pro purifikaci DNA ve velkém měřítku a pro DNA sekvencování. Inzert z každého z těchto klonů byl subklonován do Notl místa plazmidupBleuescript SK+ (Stratagene, katalog. č. 212205). byly získány sekvence DNA lambda a plazmidové DNA. Klon F1, který obsahoval cDNA inzert velikosti 2006 bp obsahoval'intron na 5'konci kódujícího úseku ale neobsahoval úplný čtecí rámec. Klon ' A.2a, zvaný též. PB133 obsahoval cDNA inzert velikosti. 1936 bp. Tento klon obsahoval netranslatováný úsek 3'konce velikosti 543 bp, otevřený čtecí rámec, velikosti ' 852 bp . a netranslatovaný úsek 3'konce, ale neobsahoval polyadenylační signál ani polyA koncovou sekvenci.

Nukleotidová sekvence kódující otevřený čtecí rámec pro hTRELL cDNA. v klonu A2a je zde uvedena jako sekvence id. č, 3. Dedukovaná aminokyselinová sekvence obsahující .284 aminokyselin je zde uvedena jako sekvence id. č. 4. Druhý methionin v pozici 36 je pravděpodobně transláční počátek, neboť toto místo nejlépe odpovídá požadavkům .kladeným na takový počátek podle Kozaka.

Pomocí identifikovaných sekvencí cDNA byla určena cDNA kpdující. TRELL. Ze ; sekvencí výše popsaných (tj, sekvence • · • · ' id. č. 3) byla. dedukována aminokyselinová sekvence TRELL (tj. sekvence id. č. 4). Přitom je zřejmé, že v souladu se stavem techniky, odborník by byl .schopen provést v těchto, sekvencích účelné záměny, inzerce . nebo delece, a tím by získal řadu různých molekul s v podstatě shodnou biologickou nebo imunologickou aktivitou, jakou mají molekuly popisované v této přihlášce.

.4) Northernová analýza exprese lidského TRELL

Fragment PpuMl/BstXl z lidského klonu 2a velikosti

440 bp byl označen 32P pomocí náhodných primerů a použit' jako sonda pro testování komerčně dostupných northgrnových otisků obsahujících RNA z různých tkání člověka. Tato northernová. analýza ukázala, že sonda hybridizovala s jediným druhem. mRNA velikosti 1,4 až 1,6 kb. TRELL je exprimován ve většině orgánů imunitního systému, tj . ve. slezině, lymfocytech periferní krve (pbl),. lymfatickýcgh uzlinách, apendixu, ale reltivně málo v thymu, fetálních. játerch (které jsou zdrojem předchůdců lymfocytů) a kostní dřeni (viz obr. 4). Takže primárně jsou to orgány sekundárního imunitního systému, které exprimují TRELL·'. Ale exprese TRELL byla detekována i ve vaječníku, prostatě, tenkém střevu, tlustém střevu,. 'srdci, mozku, placentě, plicích, játrech, kosterním svalstvu, ledvinách a pankreatu.. Exprese byla relativně nízká ve yarLatech,— gAt_pech,_:-l£dvúná.ch___Ja--thymu..J Tentg_ exp r ep^nL^v z.or e.C ukazující na široce rozšířenou ' expresi,, připomíná expresi ligandu TRAIL, až na to, že TRAIL je málo exprimován v srdci· a mozku. .. . ... , • ·

Příklad 3

C). Izolace recepto.ru vážícího ligand TRELL *

Ligandy rodiny ·. TNF se mohou použít pro identifikaci, a klonování receptorů. S využitím popsaných sekvencí tRELL je' možné fúzovat 5'-konec extracelulární domény TRELL ligandu, který tvoří vazebnou sekvenci pro receptor, k markerové nebo znčkovací sekvenci ·a pak. přidat vedoucí sekvenci, . která podpoří sekreci ligandu v některém z mnoha možných expresních systémů. Jeden příklad takového postupu popsali Browning et al (JBC 271: 8618-8626, 1996), kdy ligand LT-β byl secernován v takové formě. Vedoucí sekvence VCAM byla připojena ke krátké' značkovací sekvenci peptidu myc ‘ s extracelulární doménou LT-β. Sekvence VČAM byla použita proto, aby napomohla sekreci molekuly LT-β, která je normálně vázána na membránu.. Secernovaný protein si ponechává značku myc na svém N-konci, která nijak nesnižuje schopnost vázat se na receptor. Takový secernovaný protein se může exprimovat buďto v přechodně transfekovaných buňkách COS nebo v podobném systémů, např. vektorech odvozených od EBNA, ' systému hmyzí buňky a bakuloviru nebo Pichia sp. apod. Jako zdroj označeného . ligandů se může využít nepurifikováný buněčný supernatant.

Buňky exprimující receptor je možné identifikovat tím, že se exponují.označenému ligandu. Buňky s navázaným ligandem se pak - identifikují pomocí průtokové cytometri FACS, když se <· označí značka myc protilátkou proti peptidu myc (anti-myc, 9E10) a pak fykoerytrinem. (nebo obdobnou značkou) značeným myším imunoglobulinem. Buňky pozitivní ve/ FACS se snadno identifikují a slouží pak jako zdroj RNA kódující receptor. Z této' RNA pak může být připravena standardním postupem expresní knihovna a’ rozdělena do podskupin (pools). Tyto poté, co se imunoglobulinem podskupiny klonů se pak transfekují do. vhodných hostitelských buněk a vazba označeného ligandu na transfekované 'buňky s receptorem se identifikuje pomocí mikroskopického vyšetření navázaný myc peptid označí . anti-myším označeným enzymem, např.- galaktos.idázou, alkalickou fosfatázou nebo luciferázou. Jakmile se jednou identifikuje -pozitivní podskupina^ klonů, zmenšuje, se pak velikost podskupin dokud není identifikována cDNA kódující receptor. Celá tato procedura může být provedena buďto, s myším nebo lidským TRELL, přičemž jedna z nich povede snadněji k receptoru. '· .

Buňky, reagencie a metody použité v př. 1 až 3 z Americké sbírky

Všechny mikroorganismů buňky byly získány '·.... >

. American Type Culture Collection ' (ATCC), Rockville, MD, kromě klonu .13 buněk WEHI 164, které poskytl Dr. Kawashima (Geneva B.iomedical Research Institute, Geneva, Switzerland). Subklon HT29 (HT29-14). byl. již dříve popsán (Browning et al., 1996) a subklon ME180 senzitivní k TNF poskytl Dr. Carl Ware. Hyb.ridom T-buněk- 11-23 byl již také popsán dříve (Browning et al. 1991).

Myši Balb/c byly injikovány peritoneálně. 3 dny před. usmrcením 1,5 ml thioglykolátové suspenze (Difco lab.., MI)·. .Buňky pak- byly - odebrány, i. z peritoneální dutiny a . kultivovány v hustotě 106 buněk/ml po, 1 hodinu v médiu DMEM (Gibco Lab.). Neadherující buňky byly odstraněny opláchnutím misek a adherujcí buňky,, téměř výlučně makrofágy,. byly lyžovány činidlem Tri-Reagent (Molecular Research Center lne.) a byla z nich extrahována RNA.

Rekombinantní lidské proteiny TNF, LTa, LTal/b'2, a také protilátky. k. těmto proteinům jakož i fúzní proteiny • · · · · ·

receptor-Ig byly j iž dříve popsány (Browning eť al., 1995) .'

Také protilátka anti-CD40L nazvaná 5C8 byla publikována. Polyklonální sérum anti-hTRELL bylo připraveno tak, že se injikoval čistý rekombinantní . hTRELL v CFA do lymfatických uzlin, jak bylo již popsáno (Browning a Ribolini, 1989). Po dvou měsících, kdy byla viditelná odpověď proti hTRELL, byly

i.·.... purifikovány. imunoglobuliny pomocí_____sefarózy s proteinem-A_________·___ (Protein-A-Sepharose).

Klonování myšího TRELL

Byl připraven syntetický oligonukleotidový primer 5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3'ze sekvence myšího . erytropoetinu·.

. a tento primer byl použit pro metodu 5'RACE (systém 5'RACE od firmy BRL) podle návodu výrobce ve spojení s kotvicím : primerem dle BRL. První řetězec cDNA byl připraven z RNA z makrofágů adherujících do jedné hodiny, jak bylo uvedeno výše. Amplifikače byla provedena pomocí termálního DNA cykleru firmy Perkin Elmer S Taq DNA polymerázou taktéž od Perkin Elmer. Po první denaturaci 5 minut při 94 °C byly podmínky cyklů následující: .35 cyklů sestávající z 30 sekund v 94 °C, 30 sekund v. 55 °C. a 3 minuty v 72 °C. Závěrečným krokem b.yla' dodatečná extenze při .72 °C. Analýza experimentu PCR na agarózovém gelu ukázala dva amplifikcvané fragmenty

- velikosti 650 bp a 500 bp. Oba fragmenty byly .vyříznuty .

. z .gelu,-, vloženy . do..-, vektoru...oBS-T a·, sekvenco.vány · . Northernová . . . .

analýza pomocí fragmentů náhodně značených ³²P ukázala, že fragment! 500 bp hybridizoval s RNA velikosti 1,4 kb v makrofágách. Pro určení orientace cDNA byly v norťnernové .analýze v.obou směrech · užity ribonukleotidové sondy (ribosondy) značené ³²P.

Z určených sekvencí a orientací byly. odvozeny dva vnitřní primery pro RNA velikosti 1,4 kb, a sice • · · · • · · · · ·

5' TCAGGTGCACTTTGATGAGG3 ' a 5'CTGTCAGCTCCTCCTGAG3', . které byly využity .pro metodu 5'RACE-P.CR. Experiment 5'RACE-PCR' poskytl fragmentvelikosti 750 bp, který byl vložen do vektrou pBS-T a sekvencován. Ukázalo se, že , odpovádal 3'konci RNA o velikosti 1,4 kb,, neboť obsahoval polyadenylační signál AATAAA právě před polyadenylovou sekvencí polyA. Uplatnění metody 5'RACE nevedlo k vytvoření žádného pásu. Souprava pro amplifikaci Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) byl použit pro přípravu cDNA knihovny z výše popsaných adherujících makrofágů. Byl použit fragment velikosti 1040 bp získaný PCR pomocí antisense a sense oligonukleotidových primerů z určené sekvence DNA . společně s univerzálními primery ze soupravy. To vedlo k vytvoření fragmentu o 60 bp delšího než bylo původních 1040 bp.

Klonování lidského TRELL

Průzkum databáze EST· klonů ukázal jeden klon, který byl zjevně homologní s myší sekvencí. Tento klon 154742 (GenBank, přístupové č. R55379)obsahuje sekvenci velikosti 345 bp s 89% homologií s myší cDNA. Z EST - klonu byly odvozeny dva oligonukleotidové primery, 5^; CCC TGC GCT GCC TGG AGG AA3'. a 5'AGA . CCA, GGG CGC CTC AGT GA3 ', které byly. použity pro screening různých tkání a knihoven pomocí RT-PCR na přítomnost transkriptů ' hTRELL. Produkty správné, velikosti byly .o z is kány .. z. jater, s 1 e z iny,.. - 1 ymf a t i ckýcn u z 1 in, . ΤΗ Ρ-1 a tonsil, ale U937 a 11-23 mRNA neposkytly žádný produkt. -PCR produkt velikosti 201 -bp byl klonován a použit dále jako sonda- pro screening Lambda gtlO cDNA knihovny z lidských tonsil. 10^s pfu (jednotek vytvářejících plaky) z Lambda gtlO cDNA knihovny lidských tonsil bylo vyseto na misky Nunc™ v hustotě lxlO⁵ pfu. Byly vytvořeny duplikátní otisky na nitrocelulózově filtry 20x20 a filtry pak byly. hybridizovány ·· ·· · · · · ···· i48

NaCl, O,1% difosforečnanu s . 10% dextransulfátem, 100 Po hybridizaci byly filtry se sondou označenou pomocí náhodných prmerů. Filtry byly hybridizovány přes noc při 65 °C ve 400 ml Plaque screen pufru (50mM Tris pH 7,5, 1M sodného, 0,2% PVP, 0,2% Ficoll) μς/ιηΐ tRNA a, 6xl0⁵ cpm/ml sondy, dvakrát , opláchnuty .Plaque screen pufrem a pak' dvakrát 2xSSC, 0,1% SDS při 65 °C. Lambda DNA byla připravena minipreparací z pozitivních kolonií a klony s.nejdelším inzertem byly vybrány pro purifikaci. DNA ve velkém měřítku a pro DNA sekvencování. Inzert -z každého z těchto klonů byl subklonován - do. Notl místa plazmidu pBleuescript SK+ (Stratagene, katalog, č. 212205).

Analýza RNA

Buďto fragment PpuMl/BstXl velikosti 0,45 kb nebo fragment Narl/Notl velikosti 1,25 kb z hTRÉLL cDNA byl' označen pomocí náhodných primerů a použit jako sonda pro testování lidských a,, myších tkání, zakoupených jako notrthernové qtisky od firmy Clontech, northernovou analýzou. RNA z myších tkání a buněčných linií byla extrahovány pomocí činidla TRI-Reagent. Northernová analýza byla provedena v podstatě postupem, který popsali Chicheportiche a Vassaili (1994) se 4 qg celkové RNA a sondou z mTRELL cDNA' značenou ³²P. '

..

Příklad 4

Přiřazení v chromosomu.

Panel DNA z monochromozomových .buněčných hybridů ,(HGMP Resource Centre, Hinxton, Cambridge, UK), byl použit . pro amplifikaci fragmentu „ velikosti 340 bp pomocí PCR s primery

vybranými podle '3'-koncového 'netranslatovaného úseku,, které .nebyly homologní s myší . sekvencí (5 'AGT.CGTCCCAGGCTGCCGGCT3' a 5 ' CCTGAAGTGGGGTCTTCTGGA3 '.) . Amplifikace byla provedena ve 40 cyklech 94°C, 30 sekund, 65 °C, '90 sekund a 72 °C, 90 sekund. Výsledné produkty byly detekovány na agarózovém gelu . . obarveném ethidiumbromidem.

Příklad 5 *

Exprese rekombinantního proteinu hTRELL

Byl . připraven konstrukt pro· expresi rozpustného produktu, který kombinoval vedoucí sekvenci VCAM, značku peptidu myč a extračélulární doménu. hTRELL podobně jak bylo již popsáno pro LTb '(Browning et al., 1996). Byly izolovány následující fragmenty: Notl'fragment s tupým koncem kódující t vedoucí . sekvenci VCAM, pár oligonukleotidů . kódující značkovací peptid myc (5'-konec tupý, 3'PpuMl), které byly popsány výše, a fragmenty TRELL PpuMl/BstXl velikosti 0,45 kb . aBstXl/Noťl. velikosti 0,65 kb. Všechny čtyři' fragmenty, byly ligovány do vektoru pBleuescript SK+ naštěpeného 'Notl a ošetřeného fosfatázou. Inzert Notl z- tohoto vektoru byl. .

•přenesen -do vektoru pFastTRELL (Gibco BRL) a použit, pro * přípravu, rekombinantního bakuloviru. ... Rozpustný TRELL byl

.. . připraven tak, že -se infikovaly hmyzí ..buňky. HiFive™ infekcí

MOI 10 a po 2 dnech se sbíralo médi.um. Do média byly přidány následující látky: pufr HEPES do výsledné koncentrace 25mM, pH 7,4, lmM AEBBF (Pierce) a 1 mg/ml pepstatinu,. Médium se pak filtrovalo a koncentrovalo 10x ultraf iltra.cí přes hranový filtr Amicon 10 kDA. Koncentrované médium -obsahující. TRELL se přímo naneslo na kolonu SP Sepharose Fast Flow, která se promyla· 25mM' HEPES pufrem pH 7, 0 s 0,4M NaCl. TRELL byl pak eluován stejným pufrem s 0,.6M NaCl. Purifikovaný TRELL byl pak podroben analýze velikosti.

Příklad 6

Analýza sekrece

Vektory pro expresi založenou na EBNA byly konstruovány · i* pomocí vektoru CH269, což je modifikovaná verze pEBVHis ABC (Invitrogen), kde byl odstraněn EBNA gen a histidinová značka. Fragment hTNF velikosti 0,71 kb ve vektoru pFastbac poskytly Dr. P. P.escamento a A. Goldfeld. Inzert SnaBI/Xhol byl ligován do míst PvuII/XhoI vektoru CH269. Genomový .inzert TNF obsahující ďeleci štěpných míst 1-12.poskytl jako dar Dr.

G. Koilias, . a_; A. Goldfeld ho vložil do vektoru. CH269. Notl. inzert hTRELL velikosti . 1,8 kb - z klonu A2a, fragment . velikosti 0,98 kb obsahující hCD40L. cDNA od Dr. E. Garbera a Notl -inzert velikosti 1,46 kb. obsahující hLTa (Browning et, al, 1995). byly ligovány do Notl místa vektoru CH269.. HindlII inzert, velikosti .0,81 kb obsahující kódující úsek hLTb s modifikovaným počátkem’ (Browning et al., 1995) byl ligován do HindlII místa vektoru CH269. Buňky EBNA-293 byly' transfekovány různými vektory CH269 společně s .vektorem .GFP ... ...

' pomocí lipofectaminu a pak v P.BS .s 5mM. ED.TA použity pro

.. ... ... .analýzu FACS - nebo po \ dvou dnech byly buňky·.... použity prc.

í . metabolické. značení. Oba způsoby využívají .následujících protilátek: hTRELL králičí 'polykíonální\ frakci Ig, hTNF .monoklonální protilátka 104c, hLT monoklonální· protilátka , AG9, LTal/b2 monoklonální protilátka B9 a CD40L monoklonální protilátka , 5c8. Analýza FACŠ byla prováděna v médiu RPMI ' . obsahujícím 10% FBS a 50 gg/ml tepelně'agregovaného lidského

IgG s protilátkami v koncentraci 5 jíg/ml. Fykoeryt-rinem

z.anačená anti-myší nebo králičí protilátka IgG (Jakson ImmunoResearch) byly použity k detekci vazby protilátky. Živé transfekované buňky značené GFP byly pomocí FACS. vybrány.. Pro imunoprecipitaci byly buňky 2 dny po transfekci opláchnuty PBS a přeneseny do média MEM bez met/cys obsahujícícho 200

..pCi/ml TranSlabel (ICN) . Pak byl . odebrán supernatant a provedena imunoprecipitace podle Browninga et al. (1995).

Příklad 7 ,

Testy cytotoxicity

Testy.buněčného růstu byly prováděny, jak bylo již dříve publikováno (Browning a Ribolini, 1989). Pro. mikroskopické vyhodnocování byly buňky HT29-14 vysety do.12jamkových misek v hustotě .200 000 buněk/jamku a pěstovány 2 dny. Lidský

TRELL, TNF, lymfotoxin-alb2 (Browning et al., 1995) nebo anti-fas (CH11, ' Kamaya) byly přidány společně s 80 . U/ml lidského' interferonu-g. Po 26 hodinách-se médium odstranilo, . společně s mnoha mrtvými buňkami, které se oddělily od plastové jamky po ošetření cytokiny nebo anti-fas.. Zbylé buňky, byly. fixovány 80% etanolem a opláchnuty P.BS s 1 mg/ml

..barviva Hoechst. Barva byla odstraněna . po dvou. . .. minutách, κ buňky byly opláchnuty PBS a vyšetřovány fluorescenční mikroskopií. __________.1.

Výsledky jsou ukázány v následujících tabulkách.

• 9 99

Tab. 2.

Vazebná místa’ lidského TRELL a cytotoxické působení ná různé buněčné linie

Buněčná ' linie	Typ	Vazba TRELL	Cytotoxicita3-
Buňky hematopoetické řady
Jurkat	T-l.ymfom ·	- .	-
SKW 6,4	EBV B-buňky		-
Namalwa	Burkittův lymfom.		-
K562	promyelocyty	+	-
THP-1	monocytární leukemie	++
Ostatní	buňky
HT29,	adénokarcinom tlustého střeva	+	++b
ME-18Q	cervikální. karcinom
HeLa.	cervikální karcinom		_d
MCF-7	adénokarcinom prsu		+ /~ ,
293	buňky emrybnálních ledvin	+	ndc
Cos	fibroblasty ledvin	+	nd

^a 3 až 5denní proliferační test v přítomnosti či nepřítomnosti lidského interferonu g .

^b cytotoxicita byla pozorována pouze v přítomnosti lidského interferonu g ^c neměřeno ^d morfologidké změny ·,· · · · • · ··· · · · · ··· · · • · · · · · · ···· ·9 ·· ···· ·· ··

Tab. 3

Rozdělení členů rodiny TNF do skupin podle cytotoxicity

Skupina	Aktivace receptorů
Silné ; induktory apoptózy mnoha buněčných typů	TNF,' Fas, TRAIL-R3, DR-3
Slabé induktory pouze u některých buněčných typů	LTb-R,. TRELL-Ra, CD3 0
Nemohou, indukovat . buněčnou smrt., za určitých podmínek působí antoproliferativně	CD27, CD40, OX-40

^a tyto receptory nebyly dosud identifikovány ·· ·· ·· ·· • · · · ·' · · • ··· · · · • · · · · · · • · · · · · ···· ·· · · ····

Seznam citované literatury

1. Smithetal. 1990; Kohnoetal 1990; Loetscheretal 1990; Schalletal 1990.

2. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.

3. K. Tracey. in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, in lumci Necrosis Factors. Tne Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 275 (1992).

4. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role.

in Medicine. B. Beutler (Ed.). Raven Press. NY. ρ 117 (1992). .

5. A. Nakane. in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in ' ' Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark.et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed;), Raven Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Theír.Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F. Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors, The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler. (Ed.). Raven Press. NY, p 371 (1992).

6. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.). Raven Press. NY, p 407 (1992).

7. D. A. Fox, Am. J. Med.,99. 82 (1995).

8. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Ouant. Biol.. 51, 597 (1986); G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press. NY, p 515 (1992).

9. L. A. Tartaglia et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 9292 (1991); L.A. Tartaglia and D. V. Goeddel. Immunol. Today. 13. 151 (1992).

10. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143, 4034 (1989); M. Kriegler et al., £ell, 53, 45 (1988).

11. C. F. Ware et al., in Pathways for Cytolysis. G. M. Griffithš and J. Tschopp (Eds.), Sprmger-Verlag, Berlin, Heidelberg, pl75-2l8 (1995).

12. N. Paul et al.. Ann. Rev. Immunol.,6,407 (1988).

13. P.D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell. 72, 847 (1993); J_; Browning et al.. J, Immunol.. 154.33 (1995).

• · ·β·β • · · · • ··· · • · · · · • · · ·

9999 .99

14. Ρ. De Togni et al..· Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol., 155, 1685 (1995).

15. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol..143.1859 (1989): J. Browning et al., J. Exp, Mel,183, 867 (1996).

16. T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806 (1995)(T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995).

17. B.C. Trauth et al., Science. 245,301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp, Med.. 169,1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267. 1449 (1995); Μ.Ή. Falk et al., Blood, 79,3300(1992).

18. F. Rieux-Laucat et al., Science. 268,1347 (1995); T. Takahashi et al., Cfiíl, 76,969 (1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nátuře, 356, 314 (1992).

19. P. R. Galle and al.. J. Exp, Med.. 182. 1223 (1995).

t ' ·

20. F. Silvestris and al._T Clin. Immunol. Immunopathol.. 75. 197 (1995).

21.. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med..181.2029 (1995); A. D. Badley et al., J, VlrgL.70, 199 (1996). .

22. S. Wiley etal., Inmmiiily, 3, 673 (1995)·

23. J. F. Gauchat et al., FEBS Len.. 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Biood, 83, 2787 (1994). ' ' 24. R. C. Allen et al.. Science. 259. 990 (1993). , ,

25. L. Biancone et al., Kidnev-Int..48.458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol.. 154, 1470 (1995). ·'·

26. J. Ruby and al.. Nátuře Medicine. 1. 437 (1995). .........

.27. Z. Wang et al.. J. Immunol.. 155. 3722 (1995): A: M. Clearv and al., J. Immunol.. 155. - ---3329(1995).

28. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med..l83. 159 (1996). ,

29. R. G. Góodwin et al, Cell. 73,447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol·.. 23, 2631 _: (1993); C. A. Smith etal., Csll, 73,1349(1993).

> 30. See, for example, Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., ed. by Sambrook,

Fritsch and Maniatis (Coíd Spring Harbor Laboratory Press: 1989): DNA Cloning:

Vnlumes I and II (D. N. Glover ed.. 1985): Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed..

' 1984); Mullis et al: U.S. Patent No: 4.683.195; Nucleic Acid Hvbridization (B. D.

'^·· ·»'=--9«^· =-_Λ. «<.:.· ¢-=• · · *··· ·«· · • ··· · · · · ·· · ······ · · ··· ··· • ·· ··· · · ···· ·· ·· ···· ·· ··

Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, lne., 1987); Immobilized Cells And Enzvmes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide Tg Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymoloev (Academie Press, lne., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and Μ. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymológy. Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academie Press, London, 1987); Handbook Of Experimentaj Jmmunology. Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986): Manipulating the Mouše Embryo. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

31. Sca for example, Narang. SA (1983) Tetrahedron 39:3: Itakura et al, (1981) Recombinant DNA. Proč 3rd Cleveland Sympos, Macromoleculss, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ikeetal. (1983) Nuclsic Acid R.SS· 11:477.

32. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts’ et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346', and 5,096,815.

33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF- and ligation of Fas ligand. J. Immunol. 155: 4147-4154. 1995.

34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T. Mori, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829.1995.

35. R. Amakawa, A. Hákem, T.M. Kundig, T. MatsUyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A. Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Siiahinian,

P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T.W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deíicient mice. Cell 84:551-562,1996.

36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K: Hoímann, V. Steiner, M. Thome, T.

Bomand, M. Hahne.M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R.MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosis-mediating receptor with sequence homology to tumor necrósis factor receptor 1 and fas (apo-l/CD95). ’ ’ Immunitv 6:79-88.1997.

37. J. Brojatsch, J. Naughton, MM. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Caři, a TNFRrelated protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosis-sarcomaviruses and mediates apoptosis. Cell 87: 845-855, 1996.

38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated 33kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma.

J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.

·· ·· ·* • · · · · • ··· · · • · · · · · • · · · ·

·.··· ·· ·· «» ·· ·· • · · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ···· ·· ·· 57

39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M.

Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterótrimericcomplexesofhumanlymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26,1996.

40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P.W. Finn and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes. Immunity 5: 617-627, 1996.

41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance in mRNA degradation. Trends in Biol, Sci. 20: 465-470, 1995.

42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouše macrophages of a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence with erythropoietin mRNA. Biochim. Biophys. Res. Comm, 209: 10761081,1995.

43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan, L. Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signál transduction by DR3 a death-domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990-992,1996.

44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7. 1994.

45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Póllok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S. Kwon and T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12 B íymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992, 1995.

46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, P.J. Smolak, R.G. Goodwin and C.A. Smith. Activation of the lymphotoxin-β receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol, 158: 1756-4762, 1997.

47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulation by CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev, Immunol. 14:591-617,1996.

48. H.J. Gruss, Ň. Boiani, D.Ě. Williams, R.J. Armitage, Č.A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell lineš. Blood 83: 2045-56. 1994.

49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involyement in the pathology of malignant Íymphomas. Blood 85: 3378-404, 1995. _;

50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun. C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis. Nátuře 384:372-375,1996.

• · · >·· ···

51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hybridomas mediated by the CD30 cytoplašmic domain in association with tumor necrosis factor receptor-associated factors. J, Exp. Med. 183: 669-674, 1996.

52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427-436, 1996.

53. S. Nagata. -Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.

54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi. Induction of apoptosis bý Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor. cytokine family. J, Biol. Chem, 1996.

55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation. costimulation. and death. Cell 76:959-62, 1994.

.56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in Microbiol, 3: 81-88, 1994.

57. E.Strueber and W. Strober. The.T cell-B cell interaction via OX4CLOX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J.Exp, Med. 183:979-989,

1996.

58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Imm unity 5: 17-30, 1996.

59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol, 10:

411-452, 1992. .

60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor.. Nátuře 377: 348-35 -1, 1995......

i»

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE: · (A) DÉLKA: 1168 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) QPAČNÁ ORIENTACE: ne _c (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: protein-příbuzný rodině TNF (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 2. .676 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCG CTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG CTG 4 6

Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu

1

5

10

15

GTC

GTG

GTC

AGC

CTG

GGG

AGC

TGG

GCA

ACG

CTG

TCT

GCC

CAG

GAG

CCT

94

Val

Val

Val

Ser

Leu

Gly

Ser

Trp'

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro

20

25

30

TCT

CAG

GAG

GAG

CTG

ACA

GCA

GAG

GAC

CGC

CGG

GAG

CCC

CCT

GAA

CTG

142

Ser

Gin

Glu

Glu

Leu

Thr.

Ala

Glu

Asp

Arg

Arg

Glu

Pro

Pro

Glu

Leu

35

40

45

’ΑΑΤ

CCC

CAG

ACA

GAG

GAA

AGC

CAG'

GAT

GTG

GTA

CCT

TTC

TTG

GAA

CAA .

190

Asn

. Pro

Gin

Thr

Glu

Glu

Ser

Gin

Asp

Val.

Val

Pro

Phe

Leu

Glu

Gin'

50

55

60

...

.. ..... _

- .·=- ··

= · „.·

„.......

-

. ...

CTA

GTC

CGG

CCT

CGA

AGA

AGT

GCT

CCT

AAA

GGC

CGG

AAG

GCG

CGG

CCT

238

Leu

Val

Arg

Pro

Arg

Arg

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Ala

Arg

Pro

•

65

7 o

75

CGC

CGA

GCT

ATT

GCA

GCC

CAT

TAT

GAG

GTT

CAT

CCT

CGG

CCA

GGA

CAG

286..

Arg

Arg

Ala

Ile

Ala

Ala

His

Tyr

Glu

Val

His-

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

80

85

90

95

GAT

GGA

GCA'

CAA

GCA

GGT

GTG

GAT

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAA

GAG

334

Asp

Gly

Ala .

Gin

.Ala

Gly

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Glu

100

105

110

• ·

ACC

AAA

ATC

AAC

AGC

TCC

AGC

CCT

CTG

CGC

TAC

GAC

CGC

CAG

ATT

GGG

382

Thr

Lys

Ile

Asn

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Arg·

Tyr

Asp

Arg

Gin

Ile

Gly

115

120

125

GAA

TTT

ACA

GTC

ATC

AGG

GCT

GGG

CTC

TAC

TAC

CTG

TAC

TGT.

CAG

GTG

430

Glu

Phe

Thr

Val

Ile

Arg

Ala

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

13 0

135

140

CAC

TTT

GAT GAG GGA

AAG

GCT

GTC

TAC.

CTG

AAG

CTG

GAC

TTG

CTG

GTG

478

His

Phe

Asp Glu Glý

Lys

Ala

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Leu

Val

Í45

150

155

AAC

GGT

GTG CTG GCC

CTG

CGC

TGC

CTG

GAA

GAA

TTC

TCA

GCC

ACA

GCA

526

Asn

Gly

Val Leu Ala

Leu

Arg

Cys

Leu

Glu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

160

165

17,0

175

GCA

AGC

ŤCT CCT GGG

CCC

CAG

CTC

CGT

TTG

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

574

Ala

Ser

Ser·Pro Gly

Pro

Gin

Leu

Arg

Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu '

180

185

•

190

,TTG

CCG

CTG: CGG-CCA-

GGG

TCT

TCC

CTT

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

622

Leu

Pro

Leu' Arg Pro

Gly

Ser

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

195

200

205

GCT

CAT

CTT AAG GCT

GCC

CCC

TTC

CTA

ACC

TAC

TTT

GGA

CTC

TTT

CAA

670

Ala

HiS

Leu Lys Ala

Ala

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

210 215 220

GTT CAC TGAGGGGCCT TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG GCTCCAGGAG 726

Val His

CATCACCACA	CCTCCCTACC	CCACCCCCAC	TCCTCCACCC	CCTCGCTGCT	CCTTGGTCČA .	786
GTCCTGTCTC	TCCTCAAAGG	CAGCCAGAGC	TTGTTCACAT	GTTTCCATTC	CACAGACGTA	846
TCCTTGCTCT	TCTTAACATC	CCATCCCACC	ACAACTATCČ	ACCTCACTAG	CTCCCAAAGC	906
CCCTACTTAT	CCCTGACTCC·	CCCACCCACT	CACCCGACCA	CGTGTTTATT	GACTTTGTGC	966
ACCAGGCACT	GAGATGGGCT	GGACCTGGTG	GCAGGAAGCC	AGAGAACCTG	GGACTAGGCC	.,102 6
AGAAGTTCCC	AACTGTGAGG	GGGAAGAGCT	GGGGACAAGC	TCCTCCCTGG	ATCCCTGTGG	1086
ATTTTGAAAA	GATACTATTT	TTATTATTAT	TGTGACAAAA	TGTTAAATGG	ATATTAAAGA	1146
GAATAAATCA	TGATTTCTCT	TC			*	1168

I · · ·· ··« ·· ·· » · « <

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 225 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina - . . (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein ' (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2

Val

Leu

Ser

Leu

Gly

Leu

Ala

Leu

Ala

Cys

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Val

1

5

10

15

Val

Val

Ser

Leu

Gly

Ser

Trp

Ala

Thr

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro

Ser

20

25

30

Gin

Glu

Glu

Leu

Thr

Ala

Glu

Asp

Arg

Arg

Glu

Pro

Pro

Glu

Leu

Asn

35

40

45

Pro

Gin

Thr

Glu

Glu

Ser

Gin

Asp

Val

Val

Pro

Phe

Leu

Glu

Gin

Leu

50

55

60

Val

Arg

Pro

Arg

Arg

Ser

Ala

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys

Ala

Arg

Pro

Arg

65

70

75

80

Arg

Ala

Ile

Ala

Ala

His

Tyr.

Glu

Val

His

Pro

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp

85

90

95

Gly

Ala

Gin

Ala

Gly

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu·

Glu

Thr

100

105

110

Lys

Ile

Asn

Ser

Ser

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr Asp

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

115,

120

125

Phe

Thr

Val

Ile

Arg.

Ala

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

130

135

140

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Val

Tyr

Leu.

Lys

Leu

Asp

Leu

Leu

Val

Asn

14 5

150

155

‘l

160

Gly

Val

Leu

Ala

Leu

Arg Cys

Leu

Glu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

Ala

165,

---

170

'

lis

Ser

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Leu

Arg Leu

Cys

Gin

Val

Ser

Gly

Leu

Leu

ISO

185

190

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Ser

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Ala

195

200

205

His

Leu

Lys

Ala .

Ala

Pro '

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

210

215

220

His

225

SS85B9BR!

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1373 párů baží (B) TYP: nukleová' kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne · (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: protein příbuzný, rodině TNE (ix) ZNAKY:

. (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..852 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

ATG • Met 1

TCA TTG TTA GAC

TTT GAA ATT TCC GCC

CGC CGG CTC CCC·

CTC CCC

48

Ser Leu

Leu

Asp 5

Phe

Glu

Ile

Ser

Ala 1.0

Arg Arg

Leu Pro

Leu . 15

Pro

CGA

TCC CTC

GGG

TCC

CGG

GAT

GGG

GGG

GCG

GTG AGG

ί CAG GCA

CAG

CCC

96

Arg

Ser Leu

Gly

Ser

Arg

Asp

Gly

Gly

Ala

Val Arg

Gin. Ala

Gin

Pro

20

25

3 0

» CCC

GCC CCC

ATG

GCC

GCC

CGT

CGG

AGC

CAG

AGG,CGG

,AGG GGG

CGC

CGG

. 144

Prq

Ala Pro

Met

Ala

Ala

Arg

Arg

Ser

Gin

Arg Arg Arg Gly

Arg

Arg

35

40

45

GGG

GAG CCG

GGC

ACC

GCC

CTG

CTG

GTC

CCG

CTC GCG

CTG GGC

CTG

GGC.

192

Gly

Glu Pro

Gly

Thr

Ala

Leu

Leu

Val

Pro

Leu Ala

Leu Gly

Leu

Gly

50

55

60

CTG

GCG CTG

GCC

TGC

CTC

GGC

CTC

CTG

CTG

GCC GTG

GTC AGT

TTG

GGG

240

Leu

Ala Leu

Ala

Cys

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Ala Val

Val Ser

Leu

Gly

65

70

75

80

AGC

CGG.GCA.

.TCG,.

CTG

TCC

GCC

CAG

GAG

CCT

GCC CAG

GAG.GAG

ctg'·

'GTG '

.....28 8 ’

Ser

Arg Ala

Ser

Leu

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro

Ala Gin

Glu Glu

Leu

Vai

a

8 5

90

95

— —

’ GCA

GAG GAG

GAC

CAG“

GAC

CCG

TCG

gaa

CTG

AAT CCC

CAG ACA

GAA

GAA

336

4ě

Ala

Glu Glu

Asp

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu

Leu

Asn Pro

Gin Thr

Glu

Glu

100

105

110

AGC

CAG GAT

CCT

GCG

CCT

TTC

CTG

AAC

CGA

CTA GTT

CGG CCT

CGC

AGÁ

384

Ser

Gin Asp

Pro

Ala

Pro

Phe

Leu

Asn

Arg

Leu Val

Arg Pro

Arg

Arg

115

12 0

125

' AGT GCA CCT AAA GGC CGG AAA ACA CGG GCT CGA AGA GCG ATC GCA GCC

432

Šer Ala Pro Lys Gly Ařg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala

L30

3

135

140

• ·

CAT TAT GAA

GTT CAT

CCA Pro 150

CGA CCT GGA CAG

GAC GGA GCG CAG GCA GGT

480

His 14 5

Tyr

Glu

Val

His

Arg

Pro

Gly Gin

Asp 155

Gly Ala

Gin

Ala

Gly 160

GTG

GAC

GGG

ACA

GTG

AGT

GGC

TGG

GAG

GAA

GCC

AGA

ATC

AAC

AGC

TCC '

52 8

Val

Asp

Gly

Thr

Val

Ser

Gly

Trp

Glu

Glu

Ala

Arg

Ile

Asn

Ser

Ser

165

170

175

AGC

CCT

CTG

CGC

TAC

AAC

CGC

CAG

ATC

GGG

GAG

TTT

ATA

GTC

ACC

CGG

576

Ser

Pro

Leu

Arg

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Gly

Glu

Phe

Ile

Val

Thr

Arg

180

185

190

GCT

GGG

CTC

TAC

TAC

CTG

TAC

TGT

CAG

GTG

CAC

TTT

GAT

GAG

GGG

AAG

624

Ala

Gly

Leu

Tyr

Tyr

Leu

Tyr

Cys

Gin

Val

His

Phe

Asp

Glu

Gly

Lys

195

200

205

GCT

GTC

TAC

CTG

AAG

CTG

GAC

TTG

CTG,

GTG

GAT

'GGT

GTG

CTG

GCC

CTG

672

Ala

Val

Tyr

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Leu

Val

Asp

Gly

Val

. Leu

Ala

Leu

210

215

220

CGC

TGC

CTG

GAG

GAA

TTC

TCA

GCC

ACT

GCG

GCC

AGT

TCC

CTC

GGG

CCC

720

Arg

Cys

Leu

Glu

Glu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

Ala

Ser

Ser

Leu

Gly

Pro

225

230

23 5

240

CAG

CTC

CGC

CTC

TGC

CAG

GTG

TCT

GGG

CTG

TTG

GCC

CTG

CGG

CCA

GGG

768

Gin,

Leu

Arg.,

Leu

Cys

Gin'.

Val

Ser

Gly

Leu

Leu

.Ala.

..Leu

Arg.

. Pro

Gly .

24 5

250

255

-

TCC

TCC

CTG

CGG

ATC

CGC

ACC

CTC

CCC

TGG

GCC

CAT

CTC

AAG

GCT

GCC

816

Ser

Ser

Leu

Arg

Ile

Arg

Thr

Leu

Pro

Trp

Ala

His

Leu

Lys.

Ala

Ala

260

265

270

-

CCC

TTC

CTC

ACC

TAC

.TTC

GGA

CTC

TTC

CAG

GTT

CAC

TGAGGGGCCC

862

Pro

Phe

Leu

Thr

Tyr

Phe

Gly

Leu

Phe

Gin

Val

His

275 280

TGGTCTCCCC	ACAGTCGTCC	GAGGCTGCCG	GCTCCCCTCG	ACAGCTCTCT	GGGCACCČGG	922
TCCCCTCTGC	CCCACCCTCA	GCCGCTCTTT	GCTCCAGACC	.TGCCCCTCCC	TCTAGAGGCT	982
GCCTGGGCCT	GTTCACGTGT	TTTCCATCCC	ACATAAATAC	AGTATTCCCA	CTCTTATCTT	1042
ACAACTCCCC	CACCGCCCAC	TCTCCACCTC	ACTAGCTCCC	CAATCCCT.GA	CCCTTTGAGG. ,	. 11.0.2 .. .
CCCCCAGTGA	TCTCGACTCC	CCCCTGGCCA	CAGACCCCCA	GGGCATTGTG	TTCACTGTAC	1162
TCTGTGGGCA	AGGATGGGTC	CAGAAGACCC	CACTTCAGGC	ACTAAGAGGG	GCTGGACCTG	1222
GCGGCAGGAA	GCCAAAGAGA	CTGGGCCTAG	GCCAGGAGTT	CCCAAATGTG	AGGGGCGAGA	1282
AACAAGACAA·	GCTCCTCCCT	TGAGAATTCC	CTGTGGATTT	TTAAAACAGA	TATTATTTTT.	1342
ATTATTATTG	TGACAAAATG	TTGATAAATG	G ,			13 73

ί«\ ’<· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: ’ (A) DÉLKA: 284 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) .TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi). POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:·

Met 1

Ser

Leu

Leu

Asp 5

Phe

Glu

Ile

Ser

Ala 10

Arg

. Arg

Leu

Pro

Leu 15.

Pro

Arg

Ser

Leu

Gly 20

Ser

Arg

Asp

Gly

Gly 25

Ala

Val

Arg

Gin

Ala 30

Gin

Pro

Pro'

Ala

Pro 35

Met

Ala

Ala

Arg

Arg 40

Ser

Gin

Arg

Arg

Arg 45

Gly

Arg

Arg

Gly

Glu 50

Pro

Gly

Thr

Ala

Leu 55

Leu

Val

Pro

Leu

Ala 60

Leu

Gly

Leu

Gly

Leu 65

Ala

Leu

. Ala

Cys

Leu 70

Gly

Leu

Leu

Leu

Ala 75

Val

Val

Ser

Leu

Gly 8 0

Ser

Arg

Ala

Ser

'Leu 85

Ser

Ala

Gin

Glu

Pro 90

Ala

Gin

Glu

Glu

Leu 95

Val

Ala

Glu.

Glu

Asp 100

Gin

Asp

Pro

Ser

Glu 105

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr 110

Glu

Glu

Ser

.Gin

Asp 115

Pro

• Ala

Pro

Phe

Leu 120

Asn

Arg

Leu

Val

Arg 125

Pro

Arg

Arg

Ser

Ala. 13 0

Pro

Lys

Gly

Arg

Lys . 13 5

Thr

Arg

Ala

Arg

Arg 140

Ala

Ile

Ala

Ala

His 14 5

Tyr

Glu

Val

His

Pro 150

Arg

Pro

Gly

Gin

Asp 155

Gly

Ala

Gin

Ala

Gly 160

Val

Asp

Gly

Thr,

Val.. 16 5

.Ser

Gly

Trp

...Glu

Glu 17 0

.Ala

-Arg.

-Ile

Asn

•Ser 175

Ser

Ser

Pro

Leu

Arg 180

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile 185

Gly Glu

Phe

Ile

Val 190

Thr

Arg

Ala

Gly Leu 195

Tyr

Tyr Leu

Tyr

Cys 200

Gin

Val

His

Phe

Asp 205

Glu

Gly Lys

Λ

I

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Sekvence DNA kódující ligand příbuzný nekrotickému faktoru, přičemž tato . sekvence obsahuje sekvenci, id. č. 1 nebo sekvenci id.. č.

   nádorovému v podstatě .

   Sekvence DNA, která hybridizuje. alespoň s fragmentem sekvence idj. č. 1 nebo' sekvence id. č. 3, kterýžto, fragment se skládá alespoň z 20 po sobě následujících bázi, přičemž uvedená sekvence DNA kóduje .polypeptid, který je alespoň z 50% homologní s ^:aktivním místem ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému faktoru.

   3. Sekvence DNA podle nároku' 1, kde .sekvence obsahuje sekvenci id. č. 1 nebo sekvenci id. č-.. 3 s konzervativními přestavbami, substitucemi, inzercemi nebo delecemi.

   4. Rekombinantní molekula DNA, která obsahuje' sekvenci DNA podle nároku 1, kterážto sekvence je operativně spojena se sekvencí řídící expresi.

   J

   5. Jednobuněčný hostitel transformovaný , rekombinantní molekulou DNA podle nároku 1nebo 4.

   6. Ligand příbuzný nádorovému 'nekrotickému faktoru, který obsahuje biologicky funkční sekvence vybrané ze sekvencí aminokyselin id. č. 2 nebo id. č. 4.

   7. Způsob přípravy v podstatě čistého ligandu příbuzného nádorovému nekrotickému . faktoru, v y z n a č u jící setím, že obsahuje . krok, ’ kdy se ‘ kultivuje . jednobuněčný hostitel podle nároku 5.

   . Ligand příbuzný nádorovému ňekrotickému faktoru, který je

   v podstatě asociovaných. bez živočišných proteinů normálně s ním 9., Farmaceutický přípravek vy z n a č u j í c i se t í m, že obsahuje terapeuticky účinné.. množství . . ligandu

   příbuzného nádorovému ňekrotickému faktoru podle nároku 6 a farmaceuticky přijatelný nosič. .

   .10. Způsob prevence nebo zmenšení závažnosti autoímunitní .choroby, vyznačující se tú m, že : obsahuje • krok, kdv. se. podá terapeuticky účinného .. množství farmaceutického'přípravku podle nároku 9.

   1.1. Způsob prevence. nebo·. zmenšení ‘ síly.. imunitní .odpovědi . na tkáňový štěp, vyznačující. se tím, že Obsahuje krok, kdy se podá terapeuticky účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 9.

   . Způsob stimulace imunitního systému v y z n a-č u j i c i se ti m, že obsahuje podání přípravku podle nároku 9.

   13. Způsob potlačení imunitního systému v y z n a č u j ící s -e t í m, že obsahuje podání účinného množství farmaceutického přípravku podle nároku 9.

   14. Způsob' léčení rakoviny v y z ή a č.u j í d 1 . s e' t í m> žé obsahuje podání, účinného množství, farmaceutického přípravku podle nároku 9.

   ·· ·· ·· ··. • « · · ···· • · · · · · · ·· · · ··· ··· 9 9 9 · *.

   • · ···· ·· · * ,* v

   15.Způsob identifikace. receptorů pro ligand příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru vyznačující se t í m, že obsahuje kroky, kdy se

   a) poskytne ligand příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru nebo jeho fragment, ·

   b) ligand příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru, nebo jeho fragment označí detekovatelnou značkou,

   c) provede. screening směsi pro detekci receptorů, který se váže - k detekovatelné označenému .ligandu příbuznému nádorovému nekrotickému faktoru podle bodu b).

   Rozpustný fragment ligandu příbuzného, nekrotickému faktoru podle nároku 6, který biologickou aktivitu jako ligand podle nároku nádorovému má podobnou.

   6.

   17.Polypeptid obsahující sekvenci, aminokyselin .-kódovanou DNA vybranou ze skupiny, která se skládá z

   a) sekvence DNA obsahují.cíc sekvenci id. č.. *1 nebo id. č. 3 b)sekvence DNa hybridi zujíci se sekvencí DNA definovanou.

   v bodě a) kódující expresi polypeptidu, který je alespoň ze 40% homologní s ligandem příbuzným, nádorovému nekrotickému faktoru podle nároku 12.

   18.Způsob přípravy protilátkového. přípravku 'reagujícího s ligandem příbuzným nádorovému nekrotickému faktoru podle, nároku. 6 nebo jeho receptorem, v y znač u' j- í c í s e tím, že obsahuje uvedeným ligandem faktoru nebo,, jeho fragmentem. ' krok, kdy příbuzným receptorem se imunizuje, organismus nádorovému nekrotickému nebo jejich antigennim ·· ·· • · • ··· ·« ······ · • · * · · · I··· '·· ·· ···· ·· ··

   19. Farmaceutický přípravek vyznačuj ící se t i m, že obsahuje protilátkový přípravek podle nároku 18.

   20. Způsob exprese genu v savčí buňce vyznačující s e t i m, že se

   a)sekvence podle nároku 1 kódující ligand příbuzný nádorovému nekrotickému faktoru zavede, do buňky, i . _ . b)buňky ponechají žít v takových podmínkách, že uvedený gen je v savci exprimován.

   21. Způsob léčení poruch souvisejících ί ligandem příbuzným nádorovému nekrotickému faktoru u. savců vyznačuj i c i s e t i m, že . a) terapeuticky účinné množství vektoru obsahujícího gen ,_t.· .·«, kódující ligand .příbuzný.nádorovému nekrotickému,. .-faktoru se zavede do buňky, . b).uvedený gen se exprimuje v savci buňce. .

   ' .22,. Způsob, podle nároku 21, vyznačuj ící s e tím, že savec je člověk.

   3 . Způsob podle nároku 21, v y z n a č u j í c i s e .. t i m, že uvedený vektor je virus.

   24. Způsob indukování buněčné.smrti v y z n a č u j i c i s e ,_{<· . tím, že se podá agens schopné interferovat s vazbou .

   ligandu příbuzného nádorovému, nekrotickému faktoru podle nároku 6 na receptor.

   25. Způsob podle nároků 24 vy z n a č u j i c i se tím, ' že se dále podá inertferoh γ.

   ··.

   • · · • ···

   9 9 . · · · ···· 99 ·· ·» • 9 9 9 9 9 9 9

   9 9 9 .9 9 9

   9 9 9 9 999 999

   9 9 9 9

   9999 99 99

   9.

   .26.Způsob léčení,. potlačení nebo změněny imunitní odpovědi, která zahrnuje přenos signálů mezi ligandem příbuzným nádorovému nekrotickému faktoru a jeho receptorem, vyznačující se t i m, že obsahuje krok, kdy se. podá účinně množství agens schopného interferovat s vazbou mezi ligandem příbuzným, nádorovému nekrotickému $ faktoru a jeho receptorem.

   27. Způsob podle nároku- 26 vyznačuj ícísetím, že. uvedená imunitní, odpověď zahrnuje buňky lidského adenokarcinomu. ' ',1

   1/8

   O & fc

   H 5

   W W as

   Η H rtí <

   proteinů příbuzných rodině TNF (TFRPs) •r| >W &

   (β co

   Ή C '<0 C >

   O Fl co >o (0 ><D >

   O rH

   O tH

   PÍ tí

   Pí Pí co co co co co co 5 E Η H tí W 3 e* w w *3! < co co gg

   P< Pí « o* 5 w

   H ř< O»O» Pj pí δ Z Ω Ω H W CO Pí Pi Pi Ω W o»3 o o co co > > eh b 0 0 gg 0 0

   O J u3 m 0 O n vj co > > α o υ u as

   Ω Ω Ol Ο»

   Pí pí o o Ω Pí CO CO co co

   3Š

   CO CO

   Pí Pí W PÍ PÍ PÍ Ω Ω O u Pí Pí as gg o o gg

   Ω Ω

   Ω

   Ω

   Pí

   Ω > í>

   ><U p

   o

   H >0 >W gao« o o η ω ο» α h o o w Pí Pí h Pí tí

   O O PÍ PÍ Ω P Pí Pí

   Sgg

   O»O» sgg

   Oř Oí Pí Pí

   Ω P O O Pí Pí pí pí B B Ω Ω Pí Pí Pí Pí £ 52 Pí pf Ω Ω B gí tí tí Η H

   Pí Pí ►4 P co co co co o o Pí Pí tí tí

   Η A 4 m Pí 03 ι-l A ><D

   P O ι—I >0 ><n &

   ><D P O ι—I >W >1 >0 g ><D > O ι—I >0 >w g· >0 hcD27L ΜΡΕΡΑ^5νΐ«ΗΡΥθσνΐ^ϋ™νΑΟΡνΐα^^ΟΚΡΑΟΑ(ΧΧ?ΡΡΡΕ5ΙΧ?hCD30L ΜηΡΠΤ.00ΑΤ.ΝΠΜ&ΡΡΠΤΥΡΑΜΗνΡΑΠ.ςνΑ.ςΗΓ/;τΤ5Ε5ΥΡΥΕΐΤΑΤΡΑίΟΒνΡΤνΑΤΙΜνΡννθΗΤΡ5ΙΡΝ5ΡΡΝνΡΡΚΟΟ

   KCD40L i mtf.tynqtspreaatcLPISMKIPMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEPERNLHEPFV h4-1BBL ΜΕΎΑ£ηΑ.ςτ,ηΡΕΑΡ14ΡΡΑΡΙ1ΑΗΑΟΗνΡΡ{ΜΡνΑ6ΙώΙ,ΡΡΑΑΑ0νΡΑνΡίλ0ΡΝΑν5ΟΑΚΑ5Ρ5Ο5ΑΑ5