CZ419491A3 - Novel thf preparations - Google Patents
Novel thf preparations Download PDFInfo
- Publication number
- CZ419491A3 CZ419491A3 CS914194A CS419491A CZ419491A3 CZ 419491 A3 CZ419491 A3 CZ 419491A3 CS 914194 A CS914194 A CS 914194A CS 419491 A CS419491 A CS 419491A CZ 419491 A3 CZ419491 A3 CZ 419491A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- thf
- fractions
- leu
- amino acid
- gamma
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- NYJVPTKMDYSZDU-MRNVWEPHSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 NYJVPTKMDYSZDU-MRNVWEPHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JTKGCYOOJLUETJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 108010036775 thymic humoral factor gamma 2 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 13
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- LIFNDDBLJFPEAN-BPSSIEEOSA-N (2s)-4-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-oxopyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 LIFNDDBLJFPEAN-BPSSIEEOSA-N 0.000 description 55
- 101710185318 Thymic factor Proteins 0.000 description 55
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 39
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 31
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 19
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 10
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 9
- -1 UB IP Proteins 0.000 description 8
- 239000000898 Thymopoietin Substances 0.000 description 7
- FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N formic acid;pyridine Chemical compound OC=O.C1=CC=NC=C1 FDTUVFSBEYKVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 108010003422 Circulating Thymic Factor Proteins 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000753683 Bos taurus Thymopoietin-2 Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102100023981 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Human genes 0.000 description 2
- 101710163560 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 description 2
- 101710189385 Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 description 2
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJYMYJRAQYREBT-UHFFFAOYSA-N 1-(4-methylphenyl)sulfonylimidazole Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N1C=NC=C1 YJYMYJRAQYREBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101000638751 Bos taurus Thymopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007584 Prealbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241001608455 Rossia <Bacillariophyta> Species 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N durene Chemical compound CC1=CC(C)=C(C)C=C1C SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- BLTAPEIEHGWKKN-UHFFFAOYSA-N methanesulfonate;pyridin-1-ium Chemical compound CS(O)(=O)=O.C1=CC=NC=C1 BLTAPEIEHGWKKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O pyridinium Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N thiram Chemical compound CN(C)C(=S)SSC(=S)N(C)C KUAZQDVKQLNFPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002447 thiram Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N thymopentin Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PSWFFKRAVBDQEG-YGQNSOCVSA-N 0.000 description 1
- 229960004517 thymopentin Drugs 0.000 description 1
- 108700016958 thymosin fraction 5 Proteins 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
- C07K7/065—Thymic humoral factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/18—Thymus derived hormone or factor; related peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Vynález se tý a jejich syntetických derivátů·
Dosavadní stav techniky
V posledních letech byl patrný zvýšený zájem o extrakty získané ze zvířecích, zejména telecích brzlíků a o jejich imunologické charakteristiky·
V práci autorů Allana J.Goldsteina a Jeffrye L· Rossia v Comprehensive Therapy, 4, 49-57 /1978/ se uvádí, že kromě vlastní sledované látky /označené jako thymosirt”/ byly hodnoceny další tři brzlíkové faktory. Jednalo se o thymopoietiny, sérový faktor thymu /STF/ a humorální faktor thymu /THF/·
Thymopoietiny /dříve nazývané thymin“/, jejich příprava a použití byly již popsány například v. práci Gideona Goldsteina, Nátuře 247, str· 11-14 /1974/ a US patentu č. 4055633, 4077949, 4120951 a 4124700· Thymopoietiny se: získávají z telecích brzlíků sekvenční dialýzou, molekulární vylučovací chromatografií a frakční chromatografií. Získají se dvě účinné látky, označované jako thymopoietin I a II»
Obě látkyjsou polypeptidy, mající 49 aminokyselinových zbytků· Liší se však ve struktuře zbytků v- poloze 1 a 43° US patent č· 4002740 uvádí syntézu tridekapeptidu, který má údajně mnoho podobných vlastností jako thymopoietin II. US patent č. 4369137 popisuje určité meziprodukty vhodné pro přípravu thymopoietinového pentapeptidu. US patenty č»
24190646, 4261886 a 4397842 popisují peptidy, mající aktivitu thymopoietinu.
Sérový faktor thymu, jaho příprava a vlastnosti byly popsány v práci J.F.Bacha a spol» v Nátuře 266, str. 55-57 /1977/ a US patentech: č. 4098777, 4133804 a 4148886. Získá se: z vepřové krve sekvenční defibrinací, dialýzou, zahuštěním ve vhodném filtru, frákcionací na molekulárním sítu, chromatografií na iontoměničových pryskyřicích, další. frakcionací chromatografií na tenké vrstvě a elektroforézou. Produkt, se jeví jako polypeptid, mající 9 aminokyselinových zbytků· Peptidy mají strukturu podobnou sérovému faktoru thymu, popsanému v US patentu č„ 4301065«
Thymosiny, kromě údajů v práci Comprehensive Therapy uve děné výše, byly popsány v US patentech; č. 4010148, 4079127, 4082737, 4116951, 4128637 a 4148788, US patent č. 4010148, popisuje například přípravu frakcí thymosinu ze zhomogenizovaného savčího thymu. Tento postup zahrnuje vícestupňový čistící proces, kde produkt, každého stupně; je označován jako “frakce”. Produkt získaný jednoduchým odstředěním homogenizóvaného thymu je tedy “frakce 1“. Produkt získaný po homogenizaci a odstředění s následným zahřátím a zpracováním s acetonem: a síranem amonným a s konečným ultraodstředěním sraženiny získané se síranem amonným při 4 °C při odsolení na koloně Sephadex G-25 /jemné/ j© “frakcí 5“. Nalší zpracování končí elektroforézou, kde první pík proteinový poskytuje “frakci 8“. Frakce 8 je polypeptidy obsahující 108 aminokyselinových zbytků. US patent č.
28637 vyjasňuje skutečnost;, že: těmito postupy lzeř získat různé polypeptidy, mající molekulovou hmotnost od 1200 do 4000 a lze je definovat jako “thymosiny”. US patent č.
4082737 popisuje výrobu pevného, stabilního přípravku prostého endotoxinů, obsahujícího směs polypeptidů, tvořících thy mosinovou frakci 5.
~3~
V Goldsteinově práci Comprehensive Therapjr je produkt popsaný výše popsáni z hlediska vlastností jednoho polypeptidu: označeného jako thymosin. OQzískaného z thymosinové frakce 5* Je uvedena, že. se jedná o polypeptid. o 28 aminokyselinových zbytcích, majících molekulovou hmotnost 3108 a izoelektrický bod při pH 4,2· To je taká popsáno a nárokováno v US patentu č. 4079127. Radioimunologické stanovení thymosinu je popsáno v US patentech: Č. 4264571 a č.
4339427'. Fragmenty thymosinu 0^ jsou popsány v US patentech č. 4442031 a č. 4470926. Bis-thymosin je popsán v US patentu: č. 4396605· Z thymosin faktoru 5 byly získány dva příbuzné polypeptidy označované jako thymosin.^ a thymosim β) První látka má 50 aminokyselinových zbytků, přičemž druhá látka má 43 aminokyselinových zbytků. To je po psáno v US patentu č. 4297276^» Fragmenty thymosinu a jsou popsány v US patentu č. 4395404. Thymosiny θ θ jsou popsány v US patentech č. 4388234 ač. 4389343·
Dalším produktem, který byl získán: z brzlíku, je obecně se vyskytující imunopoietický polypeptid /UB ΓΡ/ popsaný v US patentech č. 4002602 a 4167557 a vr Proceedings. of the? National Academy of Sciences 72, str. 11-15 /1975/. Má molekulovou hmotnost asi 8500 a obsahuje 74 aminokyselinových zbytků. Podobná peptidová látka je uvedena v US patentech č. 4215111 a 4190647.
Další extrakty byly popsány v US patentech č. 34^859, 3466367, 3657417, 4239498, 4377511 a 4394374, které popisují výrobu extraktů, ale nepopisuji výrobu daného polypeptidu.
US patent č.. 43 74828 popisuje extrakty thymu, mající specifický obsah aminokyselin, ale neuvádí žádnou sekvenci aminokyselin. V US patentu č. 4046877 je popsán lidský sérový prealbumin, mající vlastnosti podobné hormonům thymu. Tmu— nostimulační přípravek bakteriální RMA je popsán v US patentu č. 4389396. Peptidy vhodné pro užití v oblasti funkce thymu jsou popsány v US patentech č· 4250086, 4320118,
-44389342 a 4428938.
U všech těchto produktů byly uváděny určité účinky při. problémech imunodeficienc®. Jak však bylo uveden® vz Proceedings of th® Society for· Experimental Biology and Medicine 159, str. 195' až 200 /1978/, thymopoietin, UB IP a sérový faktor thymu nejsou účinné pro vyvolání pro vyvolání thymus-závislé imunokompetence významné u intaktních zvířat.
V žádném z dosavadních údajů z oboru není uvedeno nebo navrženo specifické peptidové složení podle vynálezu, mající humorální aktivitu thymu.
Humorální faktor thymu /THF/ byl popsán například v Journal, od Experimental Medicine, 132, str. 885-897 /1970/, Journal of Experimental Medicine, 138, str. 1521-1532 /1972/, Cellulan Immunology 19, str. 151-157 /1975/ a US patentu č. 4250084, kde jsou uvedeny úspěšné klinické výsledky u lidí. Další výsledkyrklinických studií byly uvedeny na setkání New York Academy of Sciences. , 26.2.
1979. Tento humorální faktor thymu se podle dosavadních znalostí označuje jako THF I.
K dosažení' klinicky vhodného THP I podle? výše uvedených postupů popsaných ve výše uvedených publikacích a v US patentu č. 4250084, každá účinná frakce, obsahující THF I, připravená purtfikačním způsobem byla zkoušena sedmi /7/ různými biologickými stanoveními a pouze frakce, které pozitivní výsledky byly podrobeny dalšímu čištění a použití. Nyní se však ukázalo, že k dosažení biologicky aktivních frakcí, které lze podávat klinicky, je nutné pouze stanovení účinnosti, v biologických stanoveních v cAMP, PHA, ConA a MLC.
ϊ ;ξ i v i
- !5 Η % / | ί ί ο ·· · Ο ί = ’ υ ’ ; , ... >: ·'
C7 στ cn
-jj)
Dosud se předpokládalo, že ' pří pravěk“’ ΤΗΓ ’ Í'/°výše popsaný například v US patentu č.4250084 je jednoduchý polypeptid, jelikož migruje ve tvaru jednoduché ninhydrin-pozitivní skvrny jak při chromatografi i na tenké vrstvě tak při papírové elekt.roíoréze při pH 3,5. Dále migruje jako jednoduchý pruh při izoelektrické fokusaci na polyakrylamidových gelech s isoelektrickým bodem 5,5 až 5,9. Ačkoliv žádná z aminokyselin není při přípravě aromatická, bylo zjištěno, že THF I absorbuje ultrafialové záření při 280 nm, což je typické pro aromatické látky. Tato vlastnost se také ukázala jako užitečná pro izolaci požadované THF I frakce. Také se předpokládalo, že přípravek THF I, tak jak je popsán například ve výše uvedeném US patentu, je v podstatě čistý polypeptid, mající molekulovou hmotnost asi 3200. Nepředpokládalo se, že tento již známý THF I by mohl být dále separován do frakcí, které by mohly mít molekulovou hmotnost menší než asi 3200 pomocí jednoduché gelové filtrace, nebo které by mohly mít nějaké frakce molekulové hmotnosti menší než asi 3200, které by měly zcela stejný profil biologických stanovení uvedených pro THF I.
Překvapivě pak bylo zjištěno, že uvedený humorálni faktor thyiTiu /THF 1/ není ve skutečnosti jednou sloučeninou a že podrobí-li se gelové specifické filtraci, dochází k separaci produktů a požadovaná biologická aktivita se jeví být omezena na určité frakce. Dále bylo zjištěno, že požadované biologicky aktivní frakce jsou ty, které nevykazují v podstatě žádnou absorpci ultrafialových paprsků při 280 nm. Předpoklad pro obsah aktivních produktů ve frakcích z gelové filtrace je, aby tyto frakce neměly významnou absorpci v ultrafialovém záření při 280 nm.
Předchozí přihláška č.Ser.i53644,která byla nahrazena pokračovací přihláškou č.Ser. 741753, na kterou byl udělen US patent č. 4521135,uvádí izolaci biolo-
-6gicky aktivní látky typu humorálního thymu /označené jako THF II/, vyznačující se zjevnou molekulovou hmotností nižší, než asi 1800, přičemž v podstatě u této látky neexistuje ultrafialová absorpce při 280 nm. a je prokázána biologická účinnost z hlediska biologických stanovení cJMP,
PHA, ConA a MLC© Tato předchozí přihláška také uvádí postup pro získání THF II, který zahrnuje zpracování THF I gelovou filtrací za použití media, majícího limit vylučování asi 1800 Daltonů, shromážděním frakcí, které nevykazují v podstatě žádnou absorpci při 280 nm a vykazují aktivitu při biologických stanoveních cAJP, MLC, PHA a ConA. Jedna z konkrétních látek pro gelovou filtraci, která se ukázala být aktivní pro požadovanou frakcionaci pro získání THF II je pryskyřice Biogel P2, což je pólyakrylamidový gel perličkového typu, mající vylučovací mez 1800 Daltonů· Tato pryskyřice je dostupná od fy Bio-Rad Laboratories of Richmond, Calif. 94.804·
Biologické stanovení cWSP použité při hodnoceni frakcí je popsáno například v pracích Kooka a Trainina, ď»Exp»Med. 139, str· 193 /1974/, Kooka a Trainina, J.Exp· Med. 139, str. 193 /1974/, Kooka a Trainina, J.Immunol.
114, str. 157 /1975/ a Kooka, Umiela a ALbala, Ann.N.Y. AcaďeSci. 249, str. 349 /1975/·
Biologická stanovení PHA a ConA, použitá při hodnoceni frakcí jsou popsána například v práci Rottera a Trainina, Cell.Immunol.16, str. 413 /1975/·
Biologické stanovení MLC použité při hodnocení frakcí je popsáno například v pracích Umiela a Trainina, Eur.J. Immuno.5, str»85 /1975/ a Kooka, Umiela a Albala, Ann.N.Y. &aď.ScÍ 249, str.349 /1975/.
Předchozí přihláška Ser.č. 227299,která byla nahrazena pokračovací přihláškou. č.Ser, 741753, na kterou byl udělen US patent č. 4621135 uvádí izolaci biologicky účinná látky humorálního typu thymu / značená jako THF III/ vyznačující se zjevnou molekulovou hmotností menší než asi 1500 a mající biologickou účinnost v biologických stanoveních cAMP, PHA, ConA a MLC. Tato předchozí přihláška také uvádí postup pro získání THF III, který zahrnuje adsorpci THF II na reverzní íázi ve vysokoúčinné kapalinové chromatografi i, eluci téchto látek z kolony a shromáždění frakcí, vykazujících aktivitu ve všech parametrech cAMP, PHA, ConA a MLC biologických stanoveních.
Předchozí přihlášky ser.č, 300330 a 394571, které byly nahrazeny pokračovací přihláškou č. Ser.741753, na kterou byl udělen US patent č. 4621135, uvádějí izolaci biologicky aktivního materiálu humorálního typu thymu / označeného jako THF-7/, vyznačujícího se zjevnou molekulovou hmotností asi 1500 nebo menší a majícího biologickou účinnost ve všech biologických stanoveních účinnosti cAMP, PHA, ConA a MLC. Tyto předchozí přihlášky také uvádějí způsob získání THF-7, který zahrnuje adsorpci na reverzní íázi pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatograíie za uvedení do rovnováhy pomocí pyridiníomiátu, s následující elucí z kolony směsí pyridiníormiátu a n-propanolu a shromážděním írakcí, vykazujících účinnost ve všech biologických stanoveních cAMP, PHA, ConA a MLC.
Předchozí přihlášky č.ser.475175 a 535539, které byly nahrazeny pokračovací přihláškou č.Ser.741753, na kterou byl udělen US patent č. 4621135, uvádějí další zpracování k přečištění THF-7 pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatograíie na reverzní íázi pro získání biologicky aktivní látky, označené jako gama frakce THF-8. Předchozí přihláška ser.č. 559393, která byla nahrazena pokračovací přihláškou č. Ser. 741753, na kterou byl udělen US patent č. 4621135, uvádí další separaci THF-8 gama frakce do několika biologicky
- TSL aktivních látek, označených jako gama 2, gama V téchto přihláškách byly rovněž uvedeny pro gama 5 a THF gama 4 sekvence aminokyselin, práce naznačily, že dříve uvedené sekvence THF gama 2a THF gama 4 byly chybné.
a gama 5.
THF gama 2, THF
Další analytické aminokyselin pro «•8*·
Podstata vynálezu
Postupem podle vynálezu se získají látky, mající humorální aktivitu thymu a vyberou se ze třídy peptidů, majících následující sekvence aminokyselin:
Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu,
His-Pro-Lett-Fro-Asp-Leu-Tyr a
Phe-Val-Leu.
Tyto látky mohou být izolovány z přirozených thymů nebo mohou být syntetizovány·
Výchozí THF I materiál pro výrobu látek podle vynálezu se obecně připraví postupem popsaným v US patentu č.
4250084 uvedeným výše, který je zde citován pro úplnost.
K přípravě THF Σ se zmrazený thymus, výhodně telecí thymus zhomogenizuje ve vhodném kapalném mediu jako je pufr nebo solný roztok, buněčné zlomky a další nežádoucí složky se odstraní ultracentrifugací /například při 90000 g až 150000g po dobu 2 až 5 hodin, a filtrací přes vhodný membránový filtr, například velikosti pórů 0,8 až 2,0 ^um tak, aby se získala tekutina prostá mikroorganismů, produkujících endotoxiny. Takto získaná sterilní tekutina se pak podrobí exhaustní dialýze a získaný produkt se pak lyofilizuje a opět rozpouští ve vhodném kapalném mediu.
^ialýza se obvykle provádí vůči většímu objemu vody, solného roztoku nebo solného roztoku fosfátového pufru /PBS/ za studená po dobu 24 až 60 hodin. Každá vhodná dialyzační membrána, které umožňuje průchod! látek o molekulové hmotnosti menši než 10000 může být použita. Vhodné membrány zahrnují celofánové dialyzační vaky. Lyofilizovaný dialyzát se pak rozpustí například’ v destilované vodě, v hydrogenuhličitanu amonném, v PBS nebo tris-pufru a zředí se na vhodnou koncentraci polypeptidů 1 až 15 mg/ml solventu.
9Výsledný roztok se pak podrobí gelové filtraci.
Použitá media a počet stupňů potřebných pro gelovou filtraci při přípravě výchozího THF I materiálu, pro tento vynález závisí v určitém rozsahu na způsobu předcházejícího čištění a zvláště na podstatě media použitého pro dialyzační stupeň. To může umožnit průchod pouze látek s relativně nízkou molekulovou hmotností a lze ták docílit minimální potřebu stupňů gelové filtrace?. V každém případě však bude butbé odstranit látky s nízkou molekulovou hmotností. To lze provést elucí a zadržením prázdného objemu na koloně?, mající vylučovací mez: několik set Daltonů, například na Sephadexu G-10 /Pharmacia/, který má vylučovací mez 700 Dal tonů.
Další frakcionace?k výrobě výchozího materiálu THF I se provádí gelovou filtrací za použití sorbentů pro gelovou filtraci, majících vylučovací mez. okolo 5000 Daltonů, jako je například: Sephadex G-25 /Pharmacia/. Kolona se obvykle eluuje roztokem uhličitanu amonného 10-¾ při pH 8,0. Aktivní frakce se hodnotí pomocí 4 biologických stanovení uvedených výše. Je-li to žádoucí., provede se další frakcionace například na DEAE-Sephadexu A-25 /Pharmacia/ za použití 0,1M tris-HCI nebo Q,1M NH^HCO^ při pH 8 a vyvíjením s lineárním koncentračním gradientem: NaCl. Soli lze odstranit filtrací sorbentem, majícím nízkou vylučovací mez z hlediska molekulové hmotnosti jako? je Sephadex G-10 a získáním prázdného objemu.
Tento připravený výchozí THF I se pak nechá projít přes gelový filtrační materiál, mající mez vylučování asi 1800 Daltonů podle popisu předchozí přihlášky ser.č. 153644. Zadržený materiál se pak eluuje vodou a eluovaný materiál se shromažďuje ve frakcích. U každé frakce se sleduje ultrafialová absorpce při 280 nm a u každé frakce se provádí biologické stanovení cAMP,. PHA, ConA a MLC. První frakce
10mají výraznou absorpci při 280 nm, ale nemají biologickou účinnost ve všech z výše uvedených biologických stanoveních. Další skupina frakcí v podstatě nevykazuje absorpci v ultrafialovém záření při 280 nm, ale má biologickou účinnost ve všech z výše uvedených biologických stanoveních® Následující skupina frakcí má výraznou absorpci v ultrafialovém záření při 280 nm, ale nemá biologickou účinnost ve všech z výše uvedených biologických stanoveních® Požadovaný materiál THF II, mající biologickou aktivitu ve všech čtyřech biologických stanoveních se nachází ve frakcích, majících poměr elučního objemu /Ve/ k prázdnému objemu /Vo/ filtračního media gelové filtrace od asi 1,1 do asi 1,4. Prázdný objem media gelové filtrace se stanoví známými způsoby. Jeden z postupů pro měření prázdného objemu používá Blue Dextran. 2000. Je to vysokomolekulární dextran, mající molekulovou hmotnost okolo 2000000, obsahující modré barvivo a je dostupné od Pharmacia Fine Chemicals lne. K mediu pro gelovou filtraci se přidá 0,1 procentní vodný roztok /hmotn./obj./ Blue Dextranu 2000 v množství, tvořícím 1 % obj.celkového objemu filtračního média gelové filtrace. Na kolonu se pak vnese voda a provádí se eluce rychlostí 0,95 ml/min. Shromažďují se eluované frakce objemu 5,75 ml. U každé frakce se sleduje absorpce světla při 600 nm. Celkový objem, zahrnující i frakci, mající maximum absorbance při 600 nm, představuje prázdný objem média gelové filtrace.
Biologicky aktivní frakce THF II připravené výše uvedeným způsobem se pak spojí a k dalšímu čištění se použije vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi. Adsorbované látky se pak eluují vhodným rozpouštědlem a získají se frakce, mající biologickou účinnost ve všech čtyřech výše uvedených biologických stanoveních. Takto získaný materiál se označuje jako THF III.
11Vhodnými chromatografickými medii použitelnými pro přípravu THP III jsou obchodně dostupné povrchově modifikované anorganické sorbenty, mající navázané oktyl/Cg/ nebo oktadecyl /C^g/fáze. Dále lze použít další navázané fáze hydrofobního charakteru, používané pro kapalinovou chromatografií na reverzních fázích jako je bifenyl nebo hexyl /Cg/ až oktadecyl /C^g/. hva vhodné materiály jsou obchodně dostupné pod chráněnými známkami Lichrosorb. RP-18 a Nucleosil C^g. Nucleosil C^g je dostupný v rozměrech, velikostí částic 5 a 10 mikrometrů od fy Macherey-^agel and Co», Duřen, SRN. ‘'alším vhodným sorbentem je kolona pro HPLC od fy ALtex Scientific lne., Berkeley, Calif.
Látku THP II lze aplikovat při výše uvedené chromatogra fii v jakékoliv^ vhodné koncentraci, ale je výhodné použít roztoku, připraveného lyofilizací roztoku THP II, který obsahuje asi 3 mg proteinu, kde lyofilizát se rozpustí v 1 ml destilované vody.
Vodné roztoky, vhodné pro eluci adsorbovaných látek THF III z výše uvedených chromatografických medií zahrnují soli, obsahující jako kation sodík, draslík nebo pyridinium a jako aniont acetát, fosfát nebo formiát, například v rozmezí hodnot pH. 3,5 až 7,5» Koncentrace soli je asi 50 mM až 300 mM. Tyto vodné roztoky se pak mísí se vhodnými organickými elučními činidly jako je n-propanol, isopropanol, ethanol nebo acetonitril, s lineárním nebo nelineárním gradientem v. rozmezí 0 až 20 % až 0 až 60 % organického rozpouštědla. K získání THF III je výhodný gradientový systém 0 až 50 % n-propanolu v 50 mM roztoku octanu sodného nebo amonného při pH 6,5.
Biologicky aktivní frakce THF III připravené výše uvedeným způsobem se pak spojí a dále se čistí metodou vysokoůčinné kapalinové chromatografie na reverzních fázích.
— 12—
Stejná chromatografická media vhodná pro výrobu THF III jsou vhodná pro separaci i získání THF 7- Chromatografické medium se výhodně předem1 uvede do rovnováhy pyridinium formiátem při koncentraci 0,3 mM a při pH 4,0» Látky adsorbované na koloně se pak výhodně eluují směsí pyridinium— formiátu a n-propanolu. Nejvýhodnější je gradient 7,5 až 25 % objemových n-propanolu. Eluovaná látka, mající biologickou účinnost ve všech čtyřech výše popsaných biologických stanoveních se označuje jako THF-7o
Biologicky aktivní frakce THF-? připravené výše uvedeným způsobem, se pak spojí a dále čistí pomocí vysokokapalinové chromatografie na reverzních fázích» Pro separaci a získání THF-8 jsou vhodné stejná chromatografická media jako pro přípravu THF-7. Výhodným sorbentem je Nucleosil Cjg /8 mikrometrů/. Medium se výhodně uvede předem do rovnováhy 0,1% /obj./ roztokem kyseliny trifluoroctové při pH 2,0. Látky, absorbované na koloně se výhodně eluují směsí kyseliny trifluoroctové a n-propanolu. Nejvýhodnější je použití gradientu; 8-35 % /obj./ n-propanolu. Eluovaný materiál, mající biologickou účinnost v biologických zkouškách PHA, ConA a MLC se označuje jako THF-8.
THF-8 je složen z několika peptidových látek. Tyto peptidy lze separovat na jednotlivé látky pomocí izokratické separace. To lze docílit separací výše uvedeného THF-8 pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na chromatografickém mediu stejného typu jaký byl užit pro získání THF-8. V tomt© případě, se uvedení do rovnovážného stavu provede směsí 0,1M roztoku chloristanu sodného, 0,1% kyseliny ortofosforečné a 22% acetonitrilu. Materiál adsorbovaný na koloně se výhodně eluuje rozpouštědlem^ stejného složení jaké má | rovnovážná směs. Frakce se charakterizují absorpcí UV záření při 211 nm. Frakce u kterých je patrné maximum absorbance —1 3při 210 nm se vyčleňují pro další hodnocení. Tyto frakce se také hodnotí na přítomnost peptidů a pouze frakce, obsahující peptidy se uchovávají pro další zpracování. Každá z výše uvedených frakcí, obsahujících peptidy, se pak jednotlivě odsolí pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na médiu, stejného typu použitého výše za uvedení do rovnováhy vhodným těkavým pufrem. Výhodným tlumivým systémem je 2 mM fiormiát amonný při pH 7,8 nebo 0,1% kyselina trifluoroctové v 5% acetonitrilu. Odsolený peptidi se pak eluuje z kolony vhodným těkavým pufrem a rozpouštědlem. Výhodné je použití formiátu amonného nebo trifluoracetátu za použití lineárního gradientu 5 až 50 % acetonitrilu» Eluce se sleduje pomocí absorpce při 210 nm· Sílené frakce jsou ty, které mají maximum absorbance při 210 nm. Výsledné odsolené peptidové frakce jsou testovány na biologickou aktivitu, ve stanoveních PHA, ConA a MLC.
^rakce THF-8, mající účinnost ve všech třech výše uvedených biologických stanoveních se označují jako THF gama 2, THF gama 4 a THF gama 5.
Výroba nových peptidů podle vynálezu ze žlázy thymu jez podrobněji popsána v následujících příkladech.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Biologicky aktivní frakce THF I připravené v souladu s příkladem US pat.č. 4250084 s tím rozdílem, že výchozí žlázy thymu byly zmrazený před počátkem produkce THF I, byly spojeny a byla získána směs, obsahující 1 mg proteinu. Tato kapalná směs pak byla lyofilizována. Lyofilizovaný materiál byl pak rozpuštěn v 5 ml destilované vody a aplikován na kolonu Bio Gel P-2, získanou od Bio-Rad Laboratories of Richmond, Calif. Kolona měla 2,9 cm v průměru a 130 cm výšky. Prázdný objem /Vo/ kolony byl předem stanoven; použitím Blue Dextranu 200 jako 270 ml. Obsah kolony pak byl eluováni dvakrát destilovanou, apyrogenní vodou při
-14průtokové rychlosti 0,95 ml/min a při 4 °C se sbírají frakce 5,75 ml· Pro každou frakci se sleduje ultrafialová absorpce při 230 a 280 nm. Každá frakce se také testuje na biologickou aktivitu v cAMP, PHA, ConA a 1V3LC buozkoušgéch. Byly pozorovány dva rozdílné a dobře rozlišené píky absorpce» První pík absorpce byl získán pro frakce eluované elučními objemy /Ve/ v rozmezí od 250 ml do 330 ml· /Ve/Vo poměry od 0,93 do 1,22/. Druhý absorpční pík byl získán pro frakce eluované v elučních objemech v rozmazí od 490 ml do 550 ml. /Ve/Vo poměry od 1,82 do 2,04/· Frakce,mající biologickou aktivitu ve všech čtyřech biozkouškách byly získány zásadně při elučních objemech:. 322 ml až 345 ml /Ve/Vo poměry od 2,29 do 1,28/» V podstatě všchny z těchto frakcí majících požadovanou biologickou aktivitu neměly absorpci při 180 nm. I když tento aktivní materiál byl napočátku zadržováni Bio Gelem P-2, majícím vylučovací me;z. asi 1800 paltonů, měl zjevnou molekulovou hmotnost větší než asi 1800. Aktivní materiál v těchto frakcích, byl označen jako THF II.
Frakce THF II připravené jak je popsáno výše byly spojeny a poskytly kapalnou směs, obsahující 3 mg proteinu· Tato kapalná směs pak byla lyofilizována· Lyofilizovaný materiál byl pak rozpuštěn v 1 ml destilované vody a aplikován na kolonu s reverzní fází pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografií /HPLC/ /Ο^θ/, získanou od ALtex Scientific: lne· of Berkeley, California. Kolona měla 4,6; mm v průměru a byla dlouhá 250 mm: a byla předem uvedena do rovnovážného stavu s 50 mM aeetátu sodného při pH 6,5·
Obsahy kolony byly eluovány průchodem 50 mM octanu sodného při pH 6,5 kolonou průtokovou rychlostí 48 ml/h. po 1 hodinu. Průtoková rychlost byla pak udržována stejná po 45 minut a byl přitom nahrazován roztok octanu sodného; n-propanolem. s lineárním gradientem', od 0 do 50% objemových· Frakce po 2 ml byly odebírány při teplotě okolí /asi 22 C/.
Eluáty z kolony byly monitorovány ultrafialovou absorpcí při 230 nm a fluorescenční detekcí primárních aminoskupin
-15/reakce po průchodu kolonou u podílů provedená s fluorescaminem při pH 9,5/· Každá frakce také byla testována na biologickou aktivitu v in vitro cMP, PHA, ConA a MLC biozkouškách·
0yly pozorovány dvě rozdílné a dobře oddělené plochy absorpce, které reagují, navíc, s fluorescaminem. První pík absorpce byl získán za použití jediného pufru a eluován elucí objemů 5-25 ml. Fluorescamin-pozitivní materiál byl eluovaný ve stejné ploše s elucí objemy v rozmezí 5 až 45 ml. Druhý pík ultrafialové absorpce, který byl také fluorescamin pozitivní, byl eluovárr následující operací lineárního gradientu propanolu s elucí objemy v rozmezí 4-10 ml /0—9 % propanolu/. Frakce, mající biologickou aktivitu ve všech výše uvedených biozkouškách byly získány pouze při elučních objemech 12 ml až 16 ml /10-16 % propanolu/. V podstatě^ všechny tyto frakce, mající požadovanou biologickou aktivitu měly určité absorpce při 230 nm, ale byly fluoréscamin negativní. Aktivní materiál v těchto frakcích byl označen jako THF III.
Frakce THF III připravené jak je popsáno výše byly spojeny a lyofilizovány. Lyofilizovaný materiál byl pak rozpuštěn v destilované vodě a aplikován na kolonu s reverzní fází pro vysoko tlakovou kapalinovou chromatografií popsanou výše, která byla předem uvedena do rovnovážného stavu. 0,3 M pyridinformiátu při pH 4,0. Obsahy kolony byly eluovány průchodem 0,3M pyridinformiátu při pH 4,0 kolonou při průtokové rychlosti 24 ml/h po 12 min. Průtoková rychlost pak byla udržována na téže rychlosti. 12 min za nahrazování pyridiniumformiátu n-propanolefci při lineárním gradientu} od 0 d© 7,5 % obj. Průtoková rychlost pak byla udržována na stejné rychlosti 54 mim při nahrazování určitého množství pyridinformiátuvého roztoku n-propanolem při lineárním gradientu od 7,5 do 25 % obj. Frakce 1 ml každá byly odebírány při teplotě okolí /asi 22 °C/. Každá frakce eluovaná
16s n-propanolem. pak byla analyzována na celkový obsah aminokyselin po hydrolýze a byla podrobena výše uvedených δ tyčenu biologickým zkouškám. Frakce, obsahující materiál eluovaný z kolony na použití 14-18½ obj. n-propanolu měly maximální celkový obsah aminokyselin, a také pozitivním výsledky ve výše uvedených čtařech biozkouškách. Aktivní materiál v těchto frakcích byl označen jako THF-7o
Vysokorychlostní gelová filtrace THF-7 na koloně TSK-GEL SW 2000 /adsorbent od Toyo Soda Mfg.Co:., Japonsko/ potvrdila zjevnou molekulovou hmotnost 1500 Daltonů nebo méně protože; 1500 Daltonů je nejmenší molekulová velikost, dělená v této koloně.
Frakce THF-7 připravené jak je popsáno výše byly spojeny a zahuštěny do sucha za sníženého tlaku. Sušený materiál byl pák rozpuštěn ve vodě a aplikován na kolonu s reverzní fází pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii za použití Nucleosilu C^g /5 mikrometrů/. Kolona byla 4,3 mnt v průměru, a 250 mm. dlouhá a byla předem uvedena do rovnováhy 0,1½ obj. kyseliny tfiifluoroctové /TFA/ při. pH 2,0. Obsahy kolony byly eluovány průchodem 0,1% TFA při pH 2,0 kolonou průtokovou rychlostí: 24 ml/h po 12 min. Průtoková rychlost pák byla udržována na stejné hodnotě po 12 minut a TFA byla z části, nahrazována n-propanolem při lineárním gradientu od 0 do 8 % obj. Průtoková rychlost pak byla udržována na stejné hodnotě po 86 min při nahrazování určitého množství TFA n-propanolem při lineárním gradientu od 8 do 35 % obj. Frakce po 1 ml byly odebírány při teplotě místnosti /asi 22 °C/. Každá frákce eluovaná n-propanolem byla pak analyzována na celkový obsah aminokyselin po hydrolýze a byla po<$-17robena in vitro biologickým zkouškám MLC, PHA a Con A.
*rákce, obsahující materiál eluovaný z kolony za použití 16-22 % obj. n-propanolu. měl maximální obsah aminokyselin a měl také pozitivní výsledky ve výše uvedených třech studiích. Aktivní materiál v těchto frakcích byl označen jako THF-8.
Frakce THF-8 připravené jak je popsáno výše byly vloženy na kolonu s reverzní fází pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografií /4,3 x 200 mm/, jako je Nucleosil Cjq /5 mikrometrů/, která byla předem uvedena do rovnováhy/ s roztokem 0,1 M chloristanu sodného, 0,1% kyselinou orthofosforečnou a 22 % acetonitrilu. Obsahy kolony byly eluovány roztokem výše uvedeného složení při průtokové rychlosti 1,5 ml/min. Frakce po 1 ml byly shírány při teplotě okolí /asi 25 °C/. Eluce byla sledována UV absorpcí při 210 nm. Frakce, mající zvýšené absorpční píky byly. zadrženy» Bylo takto izolováno šest hlavních frakcí. Tyto byly označeny jako THF-8 alfa, beta, gama, delta, epsilon a theta frakce. Podíly všech frakcí jiných než alfa byly kompletně štěpeny pronasou a byly alespoň částečně štěpeny proteinásou K. Toto indikuje, že alfa frakce, není peptid a ostatní frakce jsou zvela peptidy.
THF-8 beta, gama, delta, epsilon a theta frakce pak byly každá odděleně sušeny za sníženého tlaku, rozpuštěny ve vodě a odsoleny jejich aplikací na seperátní kolony s reverzní fází pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografií výše uvedeného složení, které byly předem uvedeny do rovnováhy se 2 mM mravenčanem amonným při pH 7,8 v 5% obj. acetonitrilu. Odsolený materiál byl eluován z každé kolony 2 mM mravenčanem amonným za použití lineárního gradientu 5-50 % acetonitrilu při průtokové rychlosti 1,5 ml/min. ^luce byla sledována absorpcí při 210 nm. Frakce po 1 ml byly sbírány. Frakce, mající zvýšené absorpční píky byly zadrženy. Beta frakce poskytla dvě separátní odsolené peptidové frakce, zatímco další frakce poskytly každá jednu odsolenou peptidovou
-18frakci. Výsledných šest odsolených peptidových frakcí bylo označeno jako THF-8 beta-1, beta-2, gama, delta, epsilon a theta. Každá z těchto odsolených peptidových frakcí by la odděleně sušena za sníženého tlaku a rozpuštěna ve vodě. Podíly každé z frakcí byly pak podrobeny aminokyselinové analýze po kyselé hydrolýze a in vitro MLC/thymus/, MLC /slezina/, PHA a ConA biozkouškám. THF-8 gama frakce byly nej aktivnější ve výše uvedených čtyřech zkouškách.
Biologická aktivita výše uvedené THF-8 gama frakce byla asi tisíckrát větší než THF-1. Toto je prokázáno skutečností, že výše uvedené biozkoušky mohly být provedeny pro THF-8 gama frakci za použití nanogramových hladin, zatímco- srovnatelné biozkoušky pro THF-I byly v mikrogramových hladinách.
Klinická vhodnost THF-8 gama frakce byla také demonstrována. Byla použita pro obnovení imunologické funkce T-buněk u lidského pacienta trpícího defektem epitelu thymu, způsobeným nezralostí T-buněk.
Výše připravený THF-8 gama materiál byl eluován z chromatografické kolony před odsolením při retenční době asi 20 minut. Výše uvedený postup pro přípravu gama frakce THF-8 vycházející z telecího thymu byl několikrát opakovány gama frakce z každé preparace eluované při retenční době asi 20 minut, byly|separátně shromažďovány a uchovány, ^yto. epebejaháJCrakce pak byly odděleně sušeny za sníženého tlaku, rozpuštěny/ve vodě a odsoleny výše popsaným postupem za použití systému vysokotlakové kapalinové chromatografie s reverzní fází. Sluce byla sledována při absorpci 210 nm. ±rakce, mající zvýšené absorpční píky byly zadrženy.
-19Takto byly připraveny tři separátní peptidy THF-8 gama frakce?. Tyto peptidy byly analyzovány na obsah aminokyselin a jejich aminokyselinové sekvence, Byly tako podrobeny MLC, PHA a ConA biozkouškám. Tyto peptidy byly označeny THP gama 2, THF gama 4 a THF gama 5. Výsledky jsou uvedeny dále.
THF gama 2 = Leu-Glu- Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu
THF gama 4 = His-Pro-Leu-Pro-Asp-Leu-Tyr
THF gama 5 = Phe-Val-Leu
Asp = aspartová kyselina
Glu = glutamová kyselina
Gly = glycin
His - histidin:
Leu = leucin
Lys = lysin
Phe = fenylalanin
Pro - prolin
Tyr = tyrosin
Val = valin
Všechny tyto nové peptidy měly biologickou aktivitu v každé z MLC, PHA a ConA bio zkoušek.
Syntetická příprava peptidů THF gamma 2, THF gama 4 a THF gama 5 z aminokyselinového surového materiálu je popsána v následujících příkladech.
Příklad 2
Za použití aminokyselinové sekvenční informace pro THF gama 2, THF gama 5 a THF gama 4 získané v příkladu 1 výše, byly připraveny syntetické formy těchto peptidů za použití modifikované Merrifieldovy techniky obecně popsané v J. An.Chem.Soc. 85, str. 2149-2154 /1963/. V každém případě byl karboxyterminální zbytek požadovaného peptidu, chráněný na aminoskupině terč.butyloxykarbonylem /Boc/, byl kopulován: ke chlormethylátovanému kopolymeru polystyrendivinylbenzen /1%/, 200-400 mesh /obsah chloru 0,7 mekv./g/ ve vroucím ethanolu pod refluxem po 72 hodin. Polymerni pryskyřice byla použita v množství 2-10 g a počáteční množství terč.-Boc-aminokyseliny bylo použito asi 0,7 mmol/g pryskyřice. Výtěžek kopulace byl 0,15 -0,3 mmol Boc-áminokyseliny/g polymeru. N-chráněná aminokyselinová pryskyřice byla postupně promývána 100 ml ethanolu, 100 ml obj.50% ethanolu v dichlormethanu a 100 ml dichlormethanu. Promytá N-chráněná aminokyselinová pryskyřice byla přemístěna do 250 ml teflonové nádoby a umístěna na míchadlo, třepačku nebo do syntetizátoru peptidů jako je Model 001 Peptider /Péninsula Laboratories; lne., Belmont, Calif./. Postupné syntézové stupně byly provedeny ve stejné nádobě. Všechny stupně syntézy byly prováděny při teplotě místnosti. Pro každou následující skupinu aminokyseliny přidávanou k peptidů byl proveden následující cyklus operací, vycházející z N-chráněná aminokyselinové pryskyřice: 1/ promytí třikrát 40 až 80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /2/ odstranění přítomné Boc chránící skupiny dvěma seperátními zpracováními se 40-80 ml 50% obj. kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu vždy po 15 min,/3/ promytí třikrát 40-80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /4/ promytí třikrát 40-80 ml 50% obj. ethanolu v dichlormethanu- pro každé promytí, /5/ promytí třikrát 40-80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /6/ neutralizace po 5 min vždy s dvěma 40-80 ml podíly 5% obj. diisopropylethylaminu v dichlormethanu, /7/ promytí šestkrát 40-80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /8/ přidání 3 ekvir· valentů další požadované Boc-chráněné aminokyseliny ve 48 ml dimethylformamidu a 3 ekvivalenty N.,N*-dicyklohexylkarbodiimidu ve 30-72 ml dichlormethanu a míšení po 2 hodiny, /9/ promytí třikrát 40-80 ml 50% obj. ethanolu v dichlormethanu pro každé promytí, /10/ promytí třikrát 40 -80 ml dichlormethanu pro každé promytí, /11/ opakování stupně /8/ výše přes noc, a /12/ promytí třikrát 40-80 ml 50 % obj. ethanolu v dichlormethanu pro každé promytí.
-21Výše uvedený dvanáctistupňový cyklus se opakuje v dostatečném poctu pro syntézu požadovaného peptidu, chráněn# peptidová pryskyřice se pak cykluje výše uvedenými stupni /1/ až /5/ a suší» Potom se zpracuje s kapalným HF /4 ml/g/, anisolem / 1 ml/g/ a thioanisolem /1,5 ml/g/ po 30 min při 0 °C pro odstranění chránících skupin a oddělení peptidu z pryskyřice. HF se pak odpaří. Surový peptid se vysráží přídavkem 100-200 ml diethyletheru při 0 °C. Sraženina se oddělí z etherového roztoku filtrací a suší se. Suchá peptidová sraženina se pak extrahuje 100300 ml 50% obj. vodné kyseliny octové a nerozpustné látky se odfiltrují. Rozpouštědlo se pak odpaří a výsledný zbytek se rozpustí ve vodě a nechá projít přes Sephadex G-15 nebo Biogel P-2 gelovou filtrační kolonu. Absorbovaný peptid se eluuje vodou a eluát se sleduje ultrafialovou absorpcí při 254 nm. Frakce, mající peptidový pík. při této absorpci vlnové délky se oddělí, ^yto peptidové; frakce se potom vloží na kolonu. Lichrosorb. s reverzní fází pro vysokotlakovou kapalinovou chromatografii /10 x 250 mm/, která byla předem uvedena do rovnovážného stavu s 0,1 M. chloristanem sodným a 0,1% obj. kyseliny fosforečné ve 23% obj. vodného acetonitrilu. Materiál se pak eluuje z kolony stejným rozpouštědlem za isokratických podmínek při průtokové rychlosti 5 ml/min. Eluce se sleduje při absorpci 210 nm. Odebírají se frakce po 7,5 ml. Zadrží se frakce, mající zvýšené absorpční píky. Frakce, obsahující požadovaný peptid se zahustí za sníženého tlaku, a nanesou na HPLC kolonu s reverzní fází /jak je popsána výše/, která byla předem uvedena do rovnováhy s 0,1 obj.% kyseliny trifluoróctové v 5 % obj. vodného acetonitrilu. Feptid pak byl eluován 0,1% obj. vodné kyseliny trifluoróctové za použití lineárního gradientu 5-50 % acetonitrilu při průtokové rychlosti 5 ml/min. Eluce byla sledována pbsorpcí při 210 nm. Frakce; po 7,5 ml byly odebrány, ^rákce, mající zvýšenou absorpci byly zadrženy, nebot obsahují požadovaný peptid. Čištěný peptid pak byl analyzován na obsah aminokyselin a byla ověřena struktura aminokyselinové sekvence.
Výše uvedený postup byl proveden pro přípravu syntetického THF gama 2 ve výtěžku 11 mol procent vztaženo na počáteční množství první aminokyselinové skupiny kopulované k pryskyřici. Během syntézy byly trifunkční aminokyseliny kyselina glutamová a aspartová dále chráněny benzylestery a lysin byl dále chráněn p-chlorbenzyloxykarbonylem. Výsledný syntetický peptiď: měl následující aminokyselinovou sekvenci:
Leu-Glu- Asp-Gly-Fro-iys.-Phe-Leu
Tento materiál byl biologicky aktivní v rozsahu 0,5 až 50 ng/ml v in vitro biozkouškách v rozmazí 1 až 80 ng/kg tělesné hmotnosti v biozkouškách in vivo. ín vivo biozkoušky opravňují k použití syntetického THF gama 2 při obnově zlepšených imunologických funkcích neonatálně thymektomizováných myši.
Příklad 3
Výše uvedený postup byl použit pro přípravu syntetického THF gama 4 ve výtěžku 24 mol procent, který měl· následující aminokyselinovou sekvenci:
His-Fro-Leu-Pro-Asp-Leu-Tyr
Během: syntetického postupu byla kyselina aspartová dále chráněna benzylesterem, a histidin byl dále chráněn. N-tosylimidazolem. Tento materiál byl biologicky aktivní v rozmezí 5-80 ng/ml v biozkouškách in vitro.
Příklad 4
Výše uvedený postup byl použit pro přípravu syntetického THF gama 5 ve výtěžku 35 mol. procent, který měl následující sekvenci aminokyselin:
Phe-V al-Leu<
-23Tento materiál byl biologicky aktivní v rozmezí 50250 ng/ml v biozkouškách in vitro a v rozmezí 20-1000 ng/kg tělesné hmotnosti v biozkouškách in vivo. In vivo bio zkoušky opravňují k použití syntetického THF gama 5 při obnově zlepšených, imunologických funkcí neonatálně thymektomizovaných myší.
Claims (4)
- Materiál, mající humorální thymovou aktivitu a vybraný ze skupiny, zahrnující peptidy, mající následu jící aminokyselinové sekvence:Leu-Glu- Asp-Gly-^ro-Lys-Phe-Leu,His-Pro-^eu-Pro—Asp-Leu-Tyr aPhe-Val-Leu·
- 2. Peptidový materiál, mající humorální thymovou aktivitu a mající následující aminokyselinovou sekvenci Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe~Leu.
- 3. Peptidový materiál, mající humorální thymovou aktiv vitu a mající následující aminokyselinovou sekvenci His-Pro-Leu-Pro- Asp-Leu-Tyre
- 4. Peptidový materiál, mající humorální thymovou aktivitu a mající následující aminokyselinovou sekvenci
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/741,753 US4621135A (en) | 1983-12-08 | 1985-06-06 | Novel THF compositions |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ419491A3 true CZ419491A3 (en) | 1993-03-17 |
Family
ID=24982034
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS914194A CZ419491A3 (en) | 1985-06-06 | 1991-12-31 | Novel thf preparations |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4621135A (cs) |
| EP (1) | EP0204328B1 (cs) |
| JP (2) | JPS6248698A (cs) |
| KR (1) | KR900003095B1 (cs) |
| AT (1) | ATE110389T1 (cs) |
| AU (1) | AU569193B2 (cs) |
| CA (1) | CA1270597A (cs) |
| CZ (1) | CZ419491A3 (cs) |
| DE (2) | DE3650035T2 (cs) |
| DK (1) | DK262986A (cs) |
| ES (6) | ES8801322A1 (cs) |
| HK (1) | HK195495A (cs) |
| IL (1) | IL78951A (cs) |
| NZ (1) | NZ216316A (cs) |
| SK (1) | SK419491A3 (cs) |
| ZA (1) | ZA863848B (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5807830A (en) * | 1987-12-30 | 1998-09-15 | Cytoven J.V. | Method for treatment of purulent inflammatory diseases |
| US5728680A (en) | 1987-12-30 | 1998-03-17 | Cytoven J.V. | Methods for normalizing numbers of lymphocytes |
| US5811399A (en) * | 1988-12-14 | 1998-09-22 | Cytran, Inc. | Pharmaceutical dipeptide compositions and methods of use thereof: immunodepressants |
| US5770576A (en) * | 1989-08-30 | 1998-06-23 | Cytran, Inc. | Pharmaceutical dipeptide compositions and methods of use thereof: systemic toxicity |
| US6100380A (en) * | 1991-10-28 | 2000-08-08 | Cytran, Inc. | Immunomodulating peptides and methods of use |
| US6066622A (en) * | 1991-10-28 | 2000-05-23 | Cytran, Inc. | Immunomodulating peptides and methods of use |
| IL106214A (en) * | 1993-07-01 | 1998-12-06 | Yeda Res & Dev | Thf-gamma2 analogs and pharmaceutical compositions comprising them |
| MX339762B (es) * | 2011-09-28 | 2016-05-27 | Univ Autonoma Del Estado De Morelos | Metalopeptidos inmunomoduladores (immp) y composiciones que los contienen. |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4881838A (cs) * | 1972-02-15 | 1973-11-01 | ||
| US4002602A (en) * | 1974-03-11 | 1977-01-11 | Gideon Goldstein | Ubiquitous immunopoietic polypeptide (UBIP) and methods |
| NL7502830A (nl) * | 1974-03-25 | 1975-09-29 | Jean Francois Bach En Dr Jean | Werkwijze voor het isoleren van een polypeptide hormoon. |
| IL47645A (en) * | 1975-07-04 | 1980-10-26 | Yeda Res & Dev | Substantially pure and uniform thymic hormone thf,its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| DE2732587A1 (de) * | 1976-09-22 | 1978-03-23 | Bach Jean Francois | Polypeptid mit thymischer wirksamkeit |
| US4079127A (en) * | 1976-10-28 | 1978-03-14 | Board Of Regents Of The University Of Texas | Thymosin alpha 1 |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| SE448605B (sv) * | 1980-10-27 | 1987-03-09 | Vtoroi Mo G Med I Imen | Terapeutiskt preparat for reglering av t-immunsystemet och forfarande for framstellning derav |
| US4374828A (en) * | 1980-11-17 | 1983-02-22 | Board Of Reagents, The University Of Texas System | Biologically active thymones from the thymus |
| IT1148005B (it) * | 1981-04-09 | 1986-11-26 | Leonida Grippa | Tripeptide nelle sue sei combinazioni amminoacide alania fenilalanina e leucina in particolare fenil-alanina-alanina-leucina (p-a-l) aventela proprieta' di esaltare l'immunita' antivirale ed antitumorale |
| US4505898A (en) * | 1982-04-21 | 1985-03-19 | Marks Robert E | Derivatives of acetylsalicylic acid and substituted phenylacetic acids and compositions containing them |
-
1985
- 1985-06-06 US US06/741,753 patent/US4621135A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-05-22 ZA ZA863848A patent/ZA863848B/xx unknown
- 1986-05-27 NZ NZ216316A patent/NZ216316A/xx unknown
- 1986-05-28 IL IL78951A patent/IL78951A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-06-04 DK DK262986A patent/DK262986A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-06-04 AT AT86107601T patent/ATE110389T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-06-04 DE DE3650035T patent/DE3650035T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-04 AU AU58336/86A patent/AU569193B2/en not_active Ceased
- 1986-06-04 EP EP86107601A patent/EP0204328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-06-04 DE DE198686107601T patent/DE204328T1/de active Pending
- 1986-06-05 KR KR1019860004468A patent/KR900003095B1/ko not_active Expired
- 1986-06-05 ES ES555737A patent/ES8801322A1/es not_active Expired
- 1986-06-05 CA CA000510940A patent/CA1270597A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-06-06 JP JP61130431A patent/JPS6248698A/ja active Granted
-
1987
- 1987-09-16 ES ES557736A patent/ES8801315A1/es not_active Expired
- 1987-09-16 ES ES557740A patent/ES8801308A1/es not_active Expired
- 1987-09-16 ES ES557739A patent/ES8801317A1/es not_active Expired
- 1987-09-16 ES ES557737A patent/ES8801307A1/es not_active Expired
- 1987-09-16 ES ES557738A patent/ES8801316A1/es not_active Expired
-
1988
- 1988-10-14 JP JP63257416A patent/JPH01156997A/ja active Granted
-
1991
- 1991-12-31 CZ CS914194A patent/CZ419491A3/cs unknown
- 1991-12-31 SK SK4194-91A patent/SK419491A3/sk unknown
-
1995
- 1995-12-28 HK HK195495A patent/HK195495A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ling et al. | Isolation, primary structure, and synthesis of human hypothalamic somatocrinin: growth hormone-releasing factor. | |
| Gurley et al. | Proteins in the fossil bone of the dinosaur, Seismosaurus | |
| van der Rest et al. | A comprehensive approach to the study of collagen primary structure based on high‐performance liquid chromatography | |
| JPH03504013A (ja) | Ｔ細胞ヘルパー活性を有するペプチド | |
| Powers et al. | Intrinsic photoaffinity labeling probes for cholecystokinin (CCK)-gastrin family receptors. D-Tyr-Gly-[Nle28, 31, pNO2-Phe33) CCK-26-33 | |
| Gaus et al. | Isolation and characterization of red-pigment-concentrating hormone (RPCH) from six crustacean species | |
| EP0349545A1 (en) | NEW CADIODILATIN FRAGMENT, PROCESS FOR THEIR PRODUCTION AND USE. | |
| CZ419491A3 (en) | Novel thf preparations | |
| Teh et al. | Determination of the effect of acetylation of specific lysine residues in human growth hormone on its affinity for somatogenic receptors by an affinity selection technique | |
| Rosenstreich et al. | A human urine-derived interleukin 1 inhibitor. Homology with deoxyribonuclease I. | |
| Albericio et al. | Convergent solid phase peptide synthesis. v. synthesis of the 1-4, 32-34, and 53-59 protected segments of the toxin ii of androctonus australis hector. | |
| Low et al. | [16] Thymosin β4 | |
| Low et al. | Solid-phase synthesis of thymosin. beta. 4: chemical and biological characterization of the synthetic peptide | |
| WO1994018233A1 (en) | Thymosin alpha-1 derivatives | |
| SCHWARTZ et al. | [12‐ASPARAGINE‐B] HUMAN INSULIN: An Analogue with Modification in the Hydrophobic Core of Insulin | |
| EP0087066A1 (en) | Process for purifying secretin | |
| Timpl et al. | Immunogenicity and specificity of collagen: VI. Separation of antibody fractions with restricted specificity from anticollagen sera using an immunoadsorbent technique | |
| Esch et al. | [5] Microisolation of neuropeptides | |
| JPH0137399B2 (cs) | ||
| Wong et al. | Synthesis of a fully active snake venom cardiotoxin by fragment condensation on solid polymer | |
| CA1234565A (en) | Heptadecapeptide | |
| Low et al. | Isolation and structural studies of porcine, ovine and murine thymosin β4 by high-performance liquid chromatography | |
| Knight et al. | Solvent systems for the countercurrent chromatography of hydrophobic neuropeptide analogs and hydrophilic protein fragments | |
| US4370312A (en) | Decapeptide | |
| ABIKO et al. | The effect of a synthetic thymosin α1 fragment on the inhibition of E-rosette formation by the serum of a patient with nephrotic syndrome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |