JPH03504013A

JPH03504013A - Ｔ細胞ヘルパー活性を有するペプチド

Info

Publication number: JPH03504013A
Application number: JP1506291A
Authority: JP
Inventors: ヘブナー、ジョージ; ゴールドスタイン、ギデオン; オーディア、タパン
Original assignee: イムノバイオロジー・リサーチ・インスティチュート、インコーポレイテッド
Priority date: 1988-05-19
Filing date: 1989-05-08
Publication date: 1991-09-05
Also published as: HU205142B; EP0342962B1; GR3017451T3; AR246352A1; EP0342962A2; AU3745589A; DK14890D0; EP0602003A1; DE68923401T2; FI94350C; EP0602004A1; PT90596A; KR900701296A; US5298490A; FI900267A0; WO1989011289A1; NZ229004A; RU2060998C1; DE68923401D1; EP0342962A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の名称〕Ｔｍ胞ヘルパー活性を有するペプチド［出願の関イ系コこの出願は、１９８８年５月１９日に出願した係属中の米国特許出願番号０７／１９６．１３８号の一部ｇ続出願である。

「発明の分野］本発明は、一般にヘルパーＴ細胞活性（ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ　ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙ）を刺激することのできる合成ペプチドに関する。さらに詳細には、本発明のペプチドは、サイスプレニン分子を基礎とするテトラペプチドおよびペンタペプチドである。

［発明の背景〕免疫調整（ｉｍｍｕｎｏｎ＋ｏｄｕｌａｔｏｒｙ）タンパク質であるサイモポイエチンおよびサイスブレニン（以前は”スブレニン”と呼ばれていた）は、牛とヒトの脚線および肺臓から各々単離されたものである。さらにサイモポイエチンの生物活性をまねた小ペプチドが化学合成されており、酵素活性に対する抵抗性などの追加の性質をそなえるように修飾されている。例えば米国特許４．５０５．８５３参照。

現在このようなタンバグ質と合成ペプチドに関する数多くの論文と特許が発行されている。米国特許４．　ｌ！３０．６４６には、サイモポイエチンの活性部位であり、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒの配列をもつペンタペプチドであるサイモベンチン、ならびに種々の基がペンタペプチドのアミノ及び／またはカルボキシ末端上で置換されたペプチド組成物が開示されている。サイモポイエチンとサイモベンチンの両者は２種のヒトＴ細胞である（ＪＭとＭＯＬＴ−４における生物学的変化を誘起し、これによ）てＴ、Ｉｌｌの生物活性を刺激する役割を担っていることがホ唆されている。

また、ペンタペプチド（配列中の５個のアミノ酸）よりも短いサイモベンチンのいずれの類似体（ａｎａｌｏｇ）も、（ＪＭＡｌ［ｌ胞において活性を示さないことが見出された。

本出願人の係属中の米国特許用［Ｎｏ、５３１８６には、ヒト胛臓かも分離された４８アミノ酸免疫調整タンパク質であるスブレニン（以下°°サイスプレニン “と呼ぶ、）が記載されている。牛のサイスブレニンはマウスにおいてｉｎｖ　ｉ　ｔｒｏでヘルパーＴ細胞活性を刺激する。従って、ヒトサイスブレニンはヒトにおいても同様な生物活性を示すことが予想される。上記の特許出願には、ヒトサイスプレニンはヒトＴ細胞系ＭＯＬＴ−４において細胞内ｃＧＭＰの上昇を誘起すると記載されている。５Ｐ−５と呼ばれる牛すイスブレニンの活性部位は、その３２−３６番目のアミノ酸残基にあたり、　Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒの配列を持っている。

出願第５６．１８６号には、ヒトの配列の活性部位はＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ− Ｖａｌ−Ｔｙｒであることが開示されている。

サイスプレニンは、サイモポイエチンとは違ってＣＥＭ細胞の生物活性に変化を引き起こさない、従って、サイスブレニンはＴ＃Ｉ胞サプレッサー活性ではなく、Ｔ細胞ヘルパー活性を刺激することに関係している１例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　　Ｇ、　　Ｎａｔｕｒｅ　　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２４７：１ｌ−１４（１９７４）；Ｂａ５ｃｈ、　　Ｒ，Ｓ、　　ａｎｄ　　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　　Ｇ、、　　ｈ」ｌ１Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ　ｊｌ、ｓ　Ａ　　−７１：１４７４−１４７８（１９７４）；　　５ｃｈｅｉｄ、　　Ｍ、　　Ｐ、　　ｅｔａｌ、、−Ｊ、　　ＥＸＪｌ！、Ｍ史し工１４７：１７２７−１７４３（１９７８）；　　５ｃｂｅｉｄ、　　Ｍ。

１’、　　ｅｔ　ａｌ、　　５ｃｉｅｎｃｅ　　１９０：１Ｚ１１−１２１３（１９７５）；　　Ｒａｎｇｅｓ、　　Ｇ。

Ｋ、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ　　Ｅｘ　　　Ｍ　　　　１６：１０５７−１０６４（ｌｌＪ８２）；　　Ｔ。

Ａｕｄｌ＋ｙａ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｉ■ｏｃｌ＋ｅ＋ｅ、ＪＪｌ：６１９５− ６２００（１９８１）；　　Ｖｅｎｋａ−ｔａｓｕｂｒａｍａｎｉａｕ、　　Ｋ、、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｐｒ　　　　Ｎａｔ　　Ａｃ　ｄ　　Ｓｃｉ　　Ｕ’ ｑＪ　　　＋１３：３１”７ｌ−３１７４（１９８６）；　Ｍａｌａｉｓｅ　Ｍ、　　Ｇ、　　ｅｔ　ａｌ、　　ｉｎ　”ＩＩ＋１ｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　　ＵＣＬＡ　　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　　ｏｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　　Ｃａ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、　　ｅｄｓ、　　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、　　Ｇ、、　　ｅｔ　ａｌ（Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９８６）；　　５ｕｎｓｈｉｎｅ、Ｇ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　　　　Ｉｍａｕｎｏｌ。

１ｉ：１５９４−１５９９（１９７８）　ａｎｄ　Ｅ、　　Ｒｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ、　　耐重り−Ｇ　ｅ　ｓｓ１對ｄ１１ム「玉切り一旦１Ｊ０；１１３−１１８（１９４８）、　モ参照、　米Ｅ特許４．１９０．６４６；４．２６１．８８（ｉ；４．３６１．６７３；４．４２０．４２４；及び４゜６２９、７２３も参照０本発明に包含されるその他の背景や生物学的方法の議論については、上記の特許、特許出願及び論文を参照されたい。

１９８４年１月３１日に発行されたＫ１５ｆａｌｕｄｙらによる米国特許Ｎｏ、　４．４２８．９３８は、免疫調節（ｉｍ＋＊ｕｎｏ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に作用する成る種のペプチドが開示されている。このようなペプチドの中には、次のテトラペプチドがある。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＶａｌＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｕ−ＶａｌＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＡｌａＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＴｉｅＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＶａｌＧｌｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ゛９３８特許は、一般に、これらの配列の塩、アミド、低級アルキルエステル及び保護された銹導体、並びに脚線欠損による免疫病の治療のために、これらの配列を用いる方法を含んでいる。この特許においては、これらのペプチドは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏＥロゼツトアッセイ（ｒｏｓｅｔｔｅ　ａｓｓａｙ）により活性が調べられた。

同じ研究者等は、Ｋ１５ｆａｌｕｄｙ　ｅｔ　ａｔ、　Ｈｏｏｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓＺ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、　Ｂ、　Ｄ、　３６４．３．９３３−９４０（１９８３）にこのようなテトラペプチドを報告している。その論文では、Ａｒｇ−１，ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌの配列がｉｎ　ｖｉｔｒｏＥロゼツト試験において高活性の類似体であり、Ａｒｇ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｖａｌと＾ｒｇ −Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌの配列は著しく低下した活性を有することが報告されている。

種々のＴ細胞欠損状態に対してヒト免疫系の刺激に役立つ追加のペプチドの必要性が、この分計には残されている。

［発明の概要］本発明は、Ｍｏｌ、？−４Ｔ細胞系において生物活性を誘起することができる一連のサイスブレニンベブチド類似体である。以前に報告されたサイモペンチン類似体と異なり、５アミノ酸より短い鎖長を持っている。サイスブレニンに関連するペプチドは、本明細書に記載するサイスブレニンのペンタペプチド類似体と同様にＭＯＬＴ−４細胞においてＴ細胞ヘルパー活性を誘起する活性がある。

−面において、本発明は、次式％式％［式中Ｒは水素、低級アルキル、アセチル、ホルミル又は低級アルカノイルであり、ＸはＰｒｏ　、デヒドロ−ｒ’ｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、　ａ− メチルアラニン（Ａｉｂ）またはＬｙｓであり、ＹはＡｌａ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ、　Ｇｉｎ、　Ａｓｎ、ベーター＾ｓｐ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ又はＩｌｅから選ばれたＤ−又はＬ−アミノ酸であり、２はａｎｙ或いはＶａｌ、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ又はＩｌｅから選ばれたＤ−又はＬ−アミノ酸であり、Ｒ１はＯＨあるいはＮＲ”　Ｒ”であり、ここにＲ２及びＲ３は水素、または炭素数１〜６の直鎖状または分校状のアルキルまたはアルケニル（これはアリールにより置換されていてもよい）、或いはハロゲン又は炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキルまたはアルケニルで置換されたアリールであり、或いはＲ２とＲ３は一緒になって炭素数３〜７の環状メチレンであり、但し、Ｘが■、ｙｓで２がＶａｔのときはＹはＡｓｐ、　Ａｓｎ、　Ａｌａ。

Ａｓｕ又はＧｌｕ以外のものであり、ＸがＬｙｓのときはＹはＡｓｐ以外のものであり、ＸがＡｌａでＺがＶａｌのときはＹはＡｓｐ以外のものである］で表わされる、一連のテトラペプチド、或いはその薬剤的に受容できる酸付加塩又は塩基付加塩に関する。

本発明は、さらに、他の面においては、ヒトＴ細胞系ＭＯＬＴ−４においてｃＧＭＰ活性を増加する能力を有し、次式％式％［式中Ｒ２は水素、低級アルキル、アセチル、ホルミル、低級アルカノイルまたはデス−アミノであり、ＸｏはＰｒｏ　１デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、　Ｄ−Ｌｙｓ。

Ａｊｂ又はＬｙｓであり、Ｙ゛はＶａｔ、　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、　Ｌｙｇ、　Ａｌａ、　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ又はＧｌｎから選ばれたＤ−又はＬ−アミノ酸であり、Ｚ゛はＴｙｒ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｈｉｓ、Ａｌａ又はＴｒｐから選ばれたＤ−又はＬ−アミノ酸であり、Ｒ″はＯＨ或いはＮＲ’　Ｒ’であり、ここにＲ４およびＲ′は水素、或いは炭素数１〜６の直鎖状または分枝状のアルキルまたはアルケニル（これはアリールにより置換されていてもよい）、或いはハロゲン又は炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキルまたはアルケニルで置換されたアリールであり、或いはＲ４とＲＢは一緒になって炭素数３〜７の環状メチレンである。］で表わされる新規なペンタペプチド、或いはその薬剤的に受容できる酸付加塩または塩基付加塩に関する。

これらのペプチド及びこれを含有する組成物は、驚くべきことにヒトサイスブレニンの生物活性を保持している。これらの数多くのペプチドは、消化管や血清において、エンドペブチター″ゼやエキソベブチターゼ或いはトリブシン等の酵素による攻撃に対して抵抗性が高められていることによっても特徴づけられる。故に、これらのペプチドは、免疫不全の治療に重要な利点をもたらす。

特に、Ｘ或いはＸ′がＰｒｏ又は＾ｉｂである本発明のテトラペプチド又はペンタペプチドは、血清ペプチダーゼのような酵素による分解に対して驚くべき抵抗性を有する。

さらに本発明は、他の側面において、これらのペプチドを含有する組成物、並びに免疫調節を必要とする様々な状態又は病気を治療ためにこれらのペプチドを使用する方法を包含する。

本発明の他の特色および利点は、現在での好ましい態様の例を含む以下の詳細な説明に記載される６［図面の簡単な説明］第１図はＭＯＬＴ−４ｃＧＭＰバイオアッセイのｃＧＭＰ　（ｐｇ／ｍｌ）に対するペプチド濃度（μｇ／ａ＋１）をプロットしたグラフであり、サイモペンチン（Ｔ１１−５）と本発明のペプチドの活性を対照に対して比較したものである。

第２図はＭＯＬＴ−４ｃＧＭＰバイオアッセイのｃＧＭＰレベル（ｐｇ／ｍｌ）に対するペプチド濃度（μｇ／ｎ＋１．）をプロットしたグラフであり、サイモペンチン（ＴＰ−５）と本発明のペプチドアセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− Ａｌａ−Ｎ　Ｈ２の活性を比較したものである。

を意味するものである。

［発明の詳細な説明］本発明は次式；％式％で表わされる一連のテトラペプチド、或いはその薬剤的に受容できる（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）酸付加塩又は塩基付加塩を提供する。この式中Ｒ，Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ１は前記定義のものであり、但し、ＸがＬｓｙでＺがＶａｉのときはＹはＡｓｐ、　Ａｓｎ、　Ａｌａ、　Ａｓｕ又はＧｌｕ以外のものであり、ＸがＬｙｓのときＹはＡｓｐ以外のものであり、ＸがＡｌａ″ｃＺがＶａｌであるときＹはＡｓｐ以外のものである。

本発明はまた、次式：（ＩＩ）　Ｒ”　−Ａｒｇ−Ｘ’　−Ａｌａ−Ｙ’　−Ｚ’−Ｒ３（式中Ｒ”　、Ｘ’　、Ｙ’　、Ｚ’及びＲ１は上記定義のものである。

）で表わされる、ＭＯＬＴ−４細胞において活性を誘起する能力を有することを特徴とする一連のペンタペプチド、或いはその薬剤的に受容できる酸付加塩又は塩基付加塩を提供する。

この明細書で用いられる場合、゛低級アルキル゛という用詣は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ペンチル、ヘキシルその他の炭素数１〜６をもつ分枝状及び直鎖状の飽和炭化水素を含み、一方、゛°低級アルカノイル°゛という用語は、次の低級アルキルアセチルＡｒｇ−Ａｉｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｎ　Ｈｚチルアミン、ジメチルアミン）及び任意に置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジェタノールアミン）等があり、これに限定されるものでない。

本発明のペプチドは、一般に、既知の技術によって調製することができる０本発明によるポリペプチドの合成は、ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄのＪＡ、Ｃ，３，ＦｉＸｌ；２１４９−２１５４（１９６３）で報告された固相合成法によると便利である。この技術はよく知られており、ペプチド製造のための従来の方法である。固相合成法は、保護アミノ酸を、固相樹脂粒子に共有結合によって結合した伸長するペプチド鎖に段階的に付加することを伴う、この操作によって試薬と副産物は濾過により除去され、従って、中間体を精製する必要が除かれる。固相ポリマーに共有結合によって鎖の第１＃目のアミノ酸を結合させる点がこの方法の一般的な考え方である０次いで、保護アミノ酸を一度に或いは小量ずつ所望の配列が組立てられるまで段階的に添加する。最終的には、保護されたペプチドは固相樹脂支持体から除去されて、保護基が開裂される。

アミノ酸は樹脂として適当な任意のポリマーに結合される。樹脂は第１番目のアミノ酸が共有結合でしっかりと連結できる官能基を有していなければならない、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタアクリレートやポリスチレンなどの種々のポリマーがこの目的ために適する。この合成に有用な適当な保護基は、ｔ−ブチルオキシ、カルボニル（ＢＯＣ）　、ベンジル（ＢＺＬ）、ｔ− アミルオキシカルボニル（ＡＯＣ）、トシル（ＴＯ３）、ｏ−ブロモフェニルメトキシカルボニル（ＢｒＺ）、２．６−シグロロベンジル（ＢＺＬＣ１２）及びフェニルメトキシカルボニル（Ｚ又はＣＢＺ）である、他の保護基については、上記の論文、並びにＪ、ＦＪ。

ＭｃＯｍｉｏ、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ″。

Ｐｌｅｎｕ＋＊　　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７３に明らかにされている」両文献をここに引用して明細書の一部とする。

本発明によるペプチドの調製の一般的手法は、まず保護されたＣ−末端アミノ酸を樹脂につなげることを含む。

連結後、樹脂を濾過し、洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸のα−アミノ基上の保護基（し−ブチルオキシカルボニル基が望ましい）を除去する。この保護基の除去はもちろん、アミノ酸と樹脂間の結合を破壊することなく行われるべきである０次いで、生じた樹脂ペプチドに、Ｃ−末端保護アミノ酸を結合させる。この結合は、第２のアミノ酸の遊離カルボキシル基と樹脂に結合した第１のアミノ酸のアミノ基との間でアミド結合が生成することにより行われる。この連続した操作は、すべてのアミノ酸が樹脂に連結されるまで後続のアミノ酸を用いて繰り返される。

最終的に保護されたペプチドが、樹脂から切り出され、保護基が除去されて、希望のペプチドが生成する。樹脂からペプチドを分離し、保護基を除去するために用いる開裂技術は、樹脂と保護基の選び方に依存し、そしてペプチド合成の技術の専門家に公知である。

ペプチド合成の別法は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙらによる”ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”第二版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、１９７６に記載されている０例えば、本発明のペプチドは、標準的な溶液ペプチド合成法を用いて合成することもでき、これはアミド結合形成の化学的或いは酵素的方法を用いて、アミノ酸またはペプチド断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）を段階的に或いはブロックで結合することを含む、この液相合成法はこの技術分野でよく知られたものである。　゛本発明のペプチドは、当業者に既知の他の技術によっても製造できるものである。例えば、遺伝子工学技術によっても製造できる０例えばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの１ＪＪ友隻りば−ｏｉｎ　　　Ｌｂｒ　　ｏｒ　　Ｍｎ　　、コールドスプリングハーバ−研究所、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク（１９８２）を参照。

本発明のペプチドは、前に引用した米国特許出願と論文に開示されているように、ヒトサイスブレニンに類似の生物活性を示すことが見い出された。この生物活性は、ヒトサイスブレニン及びヒトサイモベンチンと比較して、ヒトＴ細胞系ＭＯＬＴ−４でサイクリックＧＮＰの産生の誘起を測定する検査法によって最初に証明される。この検査法において本発明のペプチドによるｃＧＭＰ産生の誘起は、そのペプチドが細胞上のヒトサイスブレニン受容体部位に結合し、ヒトサイスブレニン等の生物活性を誘起する能力があることを示す。

本発明のテトラペプチド及びペンタペプチドの多くは、ヒトのサイスブレニンよりもさらに優れた利点を提示する０本発明の多くのペプチドは消化器系或いは血清中の酵素による酵素分解に対する抵抗性を示すことによって特徴づけられる。

従って、これらのペプチドは、生物学的対象に注入投与すると、ｉｎ　ｖｉｖｏで延長された半減期を示す、これらの多くのペプチドのもうひとつの利点は、経口で投薬できることである。ヒトのサイスプレニン自体は、効率よく経口投与するにはあまりにも大きすぎる分子であり、そして胃腸管で消化されるであろう。

本発明のペプチドをテストする以前には、同じ生物学的特異性をもつヒトサイスブレニンのテトラ又はペンタペプチド類似体が調製できるとは予想されなかった。なぜならば、牛ペンタペプチドＳｐ−５（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ− Ｔｙｒ）のヒト類似体であるＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒが、ＦＩＯＬＴ−４細胞上で不活性であるからである。このように、不活性なヒトサイスブレニン分子と同じ生物活性が実証されたヒトサイスブレニンのペンタペプチド及びテトラベブチ及びおそらく動物の治療において有用である。なぜならば、これらのものは、体内での免疫応答に関与できるＴ細胞の分化と成熟化を誘起できるからである。その結果として、本発明のペプチドは多種の治療上の用途を有すると考えられる。

本発明のペプチドは、細胞免疫の治療刺激を増大又は補助するであろうという点で、体内の集合免疫の補助に役立つと考えられる。これにより、これらのペプチドは、慢性感染、例えば、菌類或いはマイコプラズマの感染による結核、らい病、急性及び慢性のウィルス感染その他を含む病気の治療に有用である。

本発明のペプチド或いはこのペプチド又は酸性若しくは塩基性塩を浮遊する医薬組成物は、細胞免疫が問題であるところのすべての領域において、とくに免疫に欠陥がある場合に有用であると一般に考えられる。不均衡化されたＴ細胞による過剰の抗体産生がある場合は、本発明のペプチドはＴ細胞の機能を刺激することにより、この状態を直すことができる。従って、これらのものは、障害のある抗体が産生されるある種の自己免疫病、例えば、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、その他において、治療掌上有用であると期待される。

本発明のペプチド或いはこれを含む薬剤的組成物は、その最も広い適用において、対象であるヒトや動物の免疫系を調節するために、この種の調節が必要なときに役立つ、ここで用いられている゛′調節゛という用語は、本発明の化合物が、免疫系を異常な病的状態から正常なバランスのとれた状態に戻すことを意味する。この調節は、免疫不全（たとえばディ・ジョルジュ症候群）の修復にも大きな用途があるが、過度な免疫活性（例えば、自己免疫疾患）の状態の修復にも応用することができる。

それ故に、本発明は、免疫系を調節するためにペプチドの少なくとも１種を病気のヒト又は動物に、免疫系の調節における有効量で投薬することから成る、そのような調節を必要とされるヒトまたは動物の免疫系を調節する方法、ならびにこの方法を実施するための薬剤的組成物を包含する。

本発明はまた、本発明のペプチドの少なくとも１種を治療的に効果的な量で対象に投薬することから成る、特にＴ細胞ヘルパー機能において、対象の免疫系の相対的又は絶対的な欠陥から生じる状態の治療法を提供する。

ここで用いｂれる場合、°°治療的に効果的な量゛という用語は、上記の状態を治療するために効果のある藍を意味する０本発明はまた、本発明のペプチドの少なくとも１種を有効誘起量で対象体に投薬することから成るＴ細胞の分化及び成熟化を誘起させる方法を提供する。

本発明はさらに、これらの方法を実施するための薬剤的組成物を提供する０本発明の薬剤的組成物を調製するためには、本発明のペプチドを有効成分として、従来の薬剤配合技術に従って、医薬用キャリアーと緊密な混合物として組合わセる。このキャリアーは投薬、例えば経口、舌下、直腸、鼻又は腸管への投与のために所望の形態に応じて様々な形状を取ることができる。

好ましい経口投与形の組成物の調製において、普通の製剤用媒体を用いることができる。経口用の液状調製物（例えば、懸濁液、エリキシル及び溶液）のために、例えば、水、油、アルコール、芳香剤、保存剤、着色剤などを含む媒体を使用することができる。スターチ、糖、希釈剤、顆粒剤、潤滑剤、結合剤、崩解剤などのキャリアーを、経口用の固形状薬（例えば、粉末、カプセル及び錠剤）の製造に使用できる。コントロールされた放出形態を用いることもできる。その投薬が容易なため、錠剤とカプセルは最も有利な経口投与形であり、この場合明らかに固体の製薬用キャリアーが使われる。もし望むならば、錠剤は標準的な方法で被覆または腸溶（ｅｎｔｅｒｉｃ）被覆することができる。

非経口用製剤には、キャリアーは通常は滅菌水を含むが、例えば溶解性を向上させるため、或し−は保存の目的のため他の成分も含まれる。注射可能な懸濁液も製造することができ、この場合は適当な液体キャリアー、懸濁剤などを使用できる。

本発明のテトラペプチド或いはペンタペプチドは、約１μｇ／Ｋｇ体重以上の量で好ましくは約０．００１〜１０ｍｇ／Ｋｇ体重の量で投薬されたとき、一般に活性である。一般番こ、免疫不全を治療する場合に、上記の病気又は状態の治療のために同じ範囲の投与量を使用できる。より多量（たとえば約１０−１００ｍｇ／Ｋｇ体重）のものは、過剰な免疫活性を抑えるために有用である。

下記の実施例により本発明を説明するが、本発明は特にそれに限定されない、実施例及び明細書全般に亘り、１部」は指摘がなければ、重量部である。実施例では、次の省略語が用いられる。ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、ＨＯＡｃは酢酸、ＣＨ２Ｃｌ、ｚは塩化メチレン、ＣＨ。

ＣＮはアセトニトリル、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＮＨ４０Ａｃは酢酸アンモニウム、ＮＨ４０Ｈは水酸化アンモニウム、ｎ　−Ｐ　ｒ　ＯＨはｎ−プロパツール、ｎ−ＢｕＯＨはｎ−ブタノール、Ｐｙｒはピリジン、ＤＣＣはジシクロへキシルカルボジイミド、ＨＯＢｔは１−ヒドロキンベンゾトリアゾール、ＤＭＡＰはジメチアミノビリジン、ＨＦはフッ化水素、ＴＣＡはトリグロロ酢酸、ＢＨＡはベンズヒドリルアミン、Ｍ　ｅ　ＯＨはメタノールである。

支　　１−−べ　・′″　　　：　セ　ルーＡ　−ｒ−社ａ−Ｖａ辷瓦且り以上に述べたテトラペプチドは９段階的結合反応を経て固相合成によって合成された。すべてのアミノ酸はそのα−アミノ基がｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基で保護された。トシル（ＴＯ３）はＡｒｇの側鎖を保護するために用いられた。保護されたアミノ酸は樹脂の置換基の各等址に対して２．５等址過剰用いた。すべてＤＭＦに溶解したＡｒｇを除いて、塩化メチレンに溶解した。

洗浄、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）および結合のステップは以下に示す通りである。

１、　　ＣＨ，Ｃ１２Ｘ　　　３＋＋＋ｉｎ２．５０％　　ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃ１ □　　　　ＬＸ　　　３ｍ１ｎ３、　　ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃ１，ｌ　　Ｘ　　３０ｍ１ｎ４、　　ＣＨ２Ｃ１ｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌ　　Ｘ　　　３＋＋ｉｎ５　、４０　％　　イソフ”ｎへ°ノールＣＨ２Ｃｌ、　　　　２Ｘ　　　３ｍ１ｎ６、ＣＩ、Ｃ１２２Ｘ　　　３ｍ１ｎ７　、　　ｌ　Ｏ％　　シ゛イソブｐビルエチルアミン　　　　　　　　２　× 　１０■ｉｎ８、　　ＣＨ２Ｃ１２１Ｘ　　　３ｍ１ｎ９、アミノ酸　　　　　　　　　　　　　ＩＸ　　３■１ｎ１０、　　ＨＯＢｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　　Ｘ　　　３ｍ１ｎ１１、　　Ｄ　ＣＣＩ　　Ｘ　１２０＋＋＋１ｎ１７、　　ＣＨ２Ｃｌ　　ｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　Ｘ　　　３ｓｉｎ１３．４０　％イソツブｔｌＡ ”ノール−ＣＩ、　　Ｃ１，２Ｘ　　　３ｍ１ｎ１４、　　ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　　Ｘ　　　３＋ａｉｎ１５、　　ＣＨａ　　Ｃｌ　　ｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　Ｘ　　　３ｍ１ｎａ　、　鯨保護されたペプチドは、ベックマンモデル０９０ペプチドシンセサイザーを用いて合成された。その結果得られたテトラペプチド樹脂は、０．６７ａ＋ｅｇ／ｇであり、合成は５゜０ｇ（３，３５ｍｍｏｌ）の樹脂から始めた。得られたテトラペプチドは、次いで、樹脂を以下のものによって処理してアセチル化した。

１、　ＣＨ２Ｃ１２２Ｘ　　３ｍ１ｎ２．５０％　ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃｌ　、　　　Ｉ　Ｘ　　３ｍ１ｎ３．５０％　ＴＦＡ−ＣＨ，ＣＩ。　　Ｉ　Ｘ　３０ＩＩＩｉｎ４、　ＣＨ２Ｃ１ｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＸ　　　３ｍ１ｎ５　、４０　％　　イソフ’Ａ” ＥＩノールＣＨ２Ｃｌ２　　　２Ｘ　　　３ｍ１ｎ６、　　ＣＨ２Ｃ１２２Ｘ　　　３ｉ＋ｉｎ７　、　１０　％　　シイツブ８、　　ＣＨ　２　Ｃ１．　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　　Ｘ　　　３ｍｉｎ９、５０％無水酢酸−Ｃ　Ｈ．　Ｃ　１　、　　　ｌ　Ｘ１２０ｍｉｎＤＭＡＰ　　触媒量１０、’　　ＣＨ２　　Ｃ　　ｌ　　２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　Ｘ　　　３ｓｉｎ１１、４０　％イソフ００八０ノー％−ＣＨ．Ｃ１　　□　　　２Ｘ　　　３ｓｉｎ１２、　　ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　　Ｘ　　　３ｓｉｎ１３、　　ＣＨｚ　　Ｃｌｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２　　Ｘ　　　３＋＋＋ｉｎペプチド樹脂はエタノール（２Ｘ５０■ｌ）で洗浄後、減圧下で乾燥した。

ｂ．■Ｌ皿１粗製テトラペプチドはＨ　Ｆ　（２５腸ｌ）とアニソール（ｚｓｍｌ）を用いる０℃で４時間の樹脂−ペプチド開裂により得られた．ＨＦは減圧下で除去された．ジエチルエーテル（１５０ｍｌ）が混合物に加えられた．この溶液は攪拌され、ガラス濾過器に移され、追加のジエチルエーテル（３Ｘ　１００ｉｅｌ）で洗浄された。ペプチドを樹脂から１０％ＨＯＡｃ（３Ｘ　１００＋ａｌ）で抽出し水溶液を凍結乾燥して１．　２０ｇを得た。

ｃ．ｔｓｒ生成物は分取用高速液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）により以下の条件で精製された；ワットマンカラムＰａｒｔｉｓｉｌ　Ｍ２Ｏ　１０１５０　０ＤＳ３；３００ｍｇサンプル、１５％　ＣＨａ　ＣＮ／．　ＯＩＭ　Ｎｌ１４０Ａｃシステム（ｐＨ５に酢酸で調製）のイソカルチツク（ｉｓｏｃａｒｔｉｃ）を使用；流速１５ｍｌ／ｓｉｎ　；検出波長２　２　０　ｎｍ，すべての純粋な分画が集められた。誘起溶媒を蒸発させ、水溶液を凍結乾燥して２５８ｍｇの白色固体を得た。

アミノ酸分析：　Ｐｒｏ，　１．００；Ａｌａ，　１．　００；Ｖａｔ，　１．　００；Ａｒｇ，　１．　Ｏｆ　；ペプチド；８３％。

薄層クロマトグラフィー（シリカ６０／Ａｎａ　Ｉｔｅｃｈ）Ｒｆ（　Ｉ　）　＝０．５０　（ブタノール：酢酸：水／３：１：１　）Ｒｆ（　ＩＪ　）　＝０．５９　（ブタノール：ピリジン：酢酸：水／４：１：１：２　　）Ｒ４　（　ｍ　）　＝０．２９　（ブタノール：酢酸：水：酢酸エチル／１：１：１：１　　）２　　−　　ラベ」ムチ」ζ　　　　　二　　セ　ルニ］工［ヱＵと■Ｕ二人月ＬーＮ旦」− ａ．ｆｆｉ成このテトラペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａペプチドシンセサイザーを用いて調製された．ＷＡ準内的１サイクル操作法（製造業者のバージョン１．４０）を用い、ダイマーカップリングしたＢＯＣ−Ｔｏｓ−Ａｒｇを除いて、各アミノ酸を１回結合した。この合成には、次の予めバッグされた出発物質を用いた。

反応剤　　　　　　製造光　＋ｍ＋ａｏ　ｌｃｓ　　　　量ｐーメチル−　ＢＨＡ　−　樹脂　　　　ＡＢＩ　　　　０．５０　　　　７８０　■ＢＯＣーＴＯＳーＡｒｇ　　ＡＢＩ　　２．０　　　８５７ｍｇＢＯＣ−Ｐｒｏ　　　　　　　　　ＡＢＩ　　　２．０　　　　　４３０＋ｎｇＢＯＣ−Ｖａｌ　　　　　　　　　ＡＢＩ　　　２．０　　　　　４３４ｍｇＢＯＣ−Ａｌａ　　　　　　　　　ＡＢＩ　　　２．０　　　　３７８ｍｇアルギニンのＢＯＣ基が除去し、ペプチド樹脂を中和して洗浄後、その化合物は４−ジメチルアミノピリジンの存在下（　２０ｍｇ　）　Ｃ　Ｈ　２　Ｃ　ｌ□　（１５＋ｓｌ）中の１０％無水酢酸を用いてアセチル化した。６０分後にペプチドがニンヒドリンテストにより完全にアセチル化されたのを確かめた．ペプチド樹脂をＣ　Ｈｚ　Ｃ　ｌ　２　　（３　Ｘ１５璽ｌ）で洗浄し真空乾燥（室温）し、１．０ｇの物質を得た。

ｂ．比■■玉ペプチドを１．５１のアニソールの存在下で１０１のＨＦを用いて、樹脂から開裂させた．この混合物を０℃で１。

５時間攪拌した後、Ｉ−Ｉ　Ｆを減圧下に除去した．この混合物をＥ　ｔ　ｚ　Ｏ　（３　Ｘ　５０ｍｌ）で洗浄し、風乾した．ペプチド／樹脂の混合物を２５％酢酸水溶液（３　ｘ　５０ｍｌ）で抽出した。

ｃ．ｔ！Ｌｊ１１水性濾液を凍結乾燥したところ、２４０■の粗製物が得られた．この物質を水中でアンバーライトＩＲＡ６８　　（アセテートを）イオン交換樹脂に通した。ペプチドを含んだ分画を合わせたのち、凍結乾燥した（２２０　ｍｇ）　、ペプチドを、ワットマンＰａｒｔｉｓｉｌ　２０Ｍ　１０　０ＤＳ−３（２２ｍＸ５０ａｍ）カラムで溶出溶媒として１５％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）と０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて精製した（１０．０ｓｌ／＋＊ｉｎ）　、溶出はＨＰＬＣでモニターし、適当な分画を合わせ減圧下で溶媒を除去した。

その残留物を水に溶がし、２回凍結乾燥して全収率５０％の１６７　ｍｇの生成物を得た。

アミノ酸分析：　Ａｒｇ　、　１．０４；　Ｐｒｏ　、　１．２０；　Ｖａｌ　、　１．００；Ａｌａ　、　１．０１；ペプチド７２％。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧＦ２５０μｍプレート）：Ｒｒ　　（Ｉ）＝０．３７（ｎ−ＢｕＯＨ：酢酸：水／３二１：ｌ　’）Ｒｒ　　（１１）＝０．１５（ＣＨＣＩｓ　　：ＭｅＯＨ：ＨＯＡｃ／６０：３５：５　）Ｒｒ　　（Ｉｎ）　＝０．４８　（ｎ　　ＢｕＯＨ：　ＨＯＡ　ｃ　：　Ｈａ　Ｏ：Ｅ　ｔ　ＯＡ　Ｃ／１：１：１：１　）−−べ　　　ゝ　　　　　・　　セ　　ローＡｒ−ｒ−Ａ−Ｖｌ−ＮＨａ、１戎この標題化合物は自動ベックマンシンセサイザーモデル９９０を用いて標準固相合成により合成した０合成は５．０ｇＢＨＡ樹脂（０，６７＋＊ｅｇ／ｇ　）から開始した。ＢＯＣ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）の結合が完結した後、ｔ−ブチルオキシカルボニル保護基をＣＨ，Ｃ１，中の５０％ＴＦＡを用いて除去し、ペプチド樹脂を触媒量のＤＭＡＰ存在下にＣＨ２Ｃｌ　ａ中の５０％無水酢酸でアセチル化した。ペプチド樹脂をエタノール（２Ｘ５０＋＊ｌ）で洗いＨＦ開裂に先立って減圧下に一晩乾燥した。乾燥ペプチド樹脂は重さ６．５ｇであった。

ｂ、ＨＦＪＪＬＭ粗製テトラペプチドは、６．５ｇの樹脂ペプチドをＨＦ（２５１）とアニソール（２Ｅ＋ｓｌ）を用いて０℃で４時間開裂させることにより得られた。ＨＦを減圧下に蒸発させ、ジエチルエーテル（１５０■ｌ）を反応混合物中に加えた。

粗製ペプチドと樹脂をガラス濾過器に移し、ジェチルエーテａｔ　（３Ｘ１００ｍ１　）　ｔ’洗った。ペプチドを１０％ＨＯＡｃ　（３Ｘ１００ｍ１　）で抽出し水溶液を凍結乾燥して９００■の白色固体を得た。

Ｃ，ｕ粗製物（ＨＰＬＣによれば９８％純粋）を溶出液として１ｏ％ｔ（ＯＡｃを用いてセファデックスＬＨ−カラム（１００ｇ、　２．５ａｎ　Ｘ　８９ａｎ　）上で脱塩した。凍結乾燥後、生成物は白色の綿毛状の固体で、白色固体は８００■ の重量であった。

アミノ酸分析：　Ａｒｇ、０．（１９；　Ｖａｌ、１．００；　Ｐｒｏ、１．０５；Ａｓｐ、　１．０１薄層クロマトグラフィー（シリカ６０／　Ｍｅｒｃｋ、　２５０Ｆ）Ｒｒ　　（１）＝０．５１　（ｎ−ＢｕＯＨ：　ＨＯＡｃ　：　Ｈａ　Ｏ／３：１：１　）Ｒ，（ＩＩ）＝０．６０（ｎ−ＢｕＯＨ：　ＨＯＡｃ　：　Ｈｚ　Ｏ：Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ　／１：］：１：１　）Ｒｒ　　（ｎｌ）　＝０．５９（ｎ−ＢｕＯＨ：ビリジン：　ＨＯＡ　ｃ：　Ｈ２０／４：１：１：２　）ＬＬｆＥＩＬ４．ｈＬ−」：」すＬ”　ｌｚ二Ａｒ　−ｒ　−Ａｓ　−Ｖ　ｌのスパー　ルーバ１ンーベン？゛レエスーＰｋ８０ｍｌのＣＨｚＣｌｚに３．２３ｇのＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−ベンジル−Ａｓｐと３．９７ｇのＶａｔ−ベンジルエステル−ｐ−トシレートを溶かした。ジイソプロピルエチルアミン（１，７４ｍ１）を加え、溶液を５℃にした。この混合物に２．０６ｇのＤＣＣを加えた。この混合物は５°で３θ分攪拌した後、室温でさらに２時間攪拌した。沈殿物を濾別し、濾液を水と１０％クエン酸溶液と飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。溶媒を除去すると油状物質が得られ、これを塩化メチレン−メタノール９７：３を用いてシリカゲル６０上のクロマトグラフィーにより精製した。生成物は油状物質で、３．４６ｇの重量であった。

ｂ、Ｎ−ｔ−−ル　　？　ルハニローブロＩ　ロー　−べ゛パ１ルー　スパー　リーバ１ンーベン２′ルエスール上記生成物３．４１ｇを６０ｍ１のＣＨ，Ｃ１ｚ　−ＴＦＡ　（２：ｌ）で３０分脱保護させると、トリフルオロアセテート塩が油状物質として得られた。その遊離アミンは、飽和炭酸ナトリウム溶液での中和＼、及びＣＨｚ　Ｃｌ　ｇへの抽出により得られた。この抽出物を蒸発により容積を減らしたのち、１．０５ｇのＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｐ　ｒ　ｏに加えた０次に２＋＋＋ｌのＤＭＦ中の０．７３ｇのＨＯＢｔの溶液を加えた後、０．９９ｇのＤＣＣを加えた。この混合物を２．５時間攪拌したのち濾過した。濾液を水、１０％クエン酸溶液および２回の飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。乾燥後、溶媒を除去すると油状物質が残った。この生成物をシリカゲル６０上でＣＨｘ　Ｃ１ｘ　　ＣＨ３ＣＮ９：１を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。主成分を含む分画から２．３１ｇの無色油状物質が得られた。ＩＲスペクトル：　１７４０ａｎ−’、　１６９５ａｎ−’及び１６７５ａｎ−’。

ｃ、Ｎ−α−バ２　し〜Ｎ’　　−ニ　ロー　　し　ニレ＝９１　ロー　−べ゛ＳＳルー−スパ　　レーバーゝ−べ゛・ニル≦≦ノ」たＪイ２、２３ｇの上記生成物を６０ｍ１のＴ　ＦＡ、　　ＣＨａ　Ｃｌ　ａ　　（２：１）を加え、この溶液を３０分攪拌し、次いで溶媒を減圧下除去すると、ワックス状の固体が残り、これを石油エーテルで洗浄した。Ｎ−α−ホルミル−Ｎ− −ニトロ−アルギニン０．７２ｇとＮ−メチルモルフォリン０，３３■ｌを１５＠ｌのＤＭＦに溶かした。この溶液を−２０１に冷却し、０、４０ｇのイソブチルグロロホルメートを滴下した。この混合物を−２０〜−１０℃で２０分攪拌した後、２０ｍ１のＤＭＦ中のプロリル−β−ベンジル−アスパラチル−バリン− ベンジルエステル−トリフルオロアセテートの冷却溶液と０．３３＋ｓｉのＮ〜メチル−モルホリンを加えた。この混合物を一１５℃で２０分攪拌した後、冷却浴を取り除き、室温で２時間攪拌を続けた。溶媒の殆どを減圧下に除去した。

この残留物を５０ｍ１のＣＨａ　Ｃｌ　２に溶かし、水、１０％りエン酸溶液と飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。有機層を乾燥し、溶媒を留去すると、２．０８ｇの物質が得られた。

薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＣＦ）：Ｒｒ　　（Ｉ　）　””０．５６　（ＣＨ２Ｃｌ　ｚ　　：　Ｍｅ　ＯＨ／９：１　）Ｒｒ　　（ＩＩ　）　＝０．７２　（ＣＨＣｌ　ｎ　　：　Ｍｅ　ＯＨ：　ＨＯＡ　ｃ／脱保護は３０１の５％ギ酸−ギ酸アンモニウムを用いてパラジウムブラック上でトランスファー水素化することにより行った０反応混合物を風船ストッパー付きフラスコ中で１８時間攪拌した。セライトを通して混合物を濾過したのち、溶媒を減圧下に除去した。残留物を水に溶解して凍結乾燥した。生成物を１，６　Ｘ６０ｃａ＋のＤＥＡＥ−セファデッグス力うム上で精製した。溶出はｐＨ８，５の０．０２Ｍ重炭酸アンモニウムを用いて始め、１５０滴の分画を集めた。５２分画を集めた後、２１にわたり０．０２から０．２０Ｍの重炭酸アンモニウム勾配を開始した。溶出されたグロマトグラムの最大ピークは分画８８が中心であった０分画７５〜１００を合わせ、凍結乾燥して綿毛状不定形固体を得た。　ＨＰＬＣ：　ｒｔ＝９．４＠ｉｎ、　ｐＨ５の１０％Ｍ　ｅ　ＯＨ−０，０ＩＮＮ　１（４０Ａ　ｃ　％流速１．５ｍｌ／ｌ１ｉｎ　、　Ｂｏｎｄａｐａｋ−ＣＩ８ｓ薄層クロマトグラフィー（シリカゲル６０）；Ｒｒ　　（Ｉ）＝Ｏ，１６（ｎ−ＢｕＯＨ：　：　ＨＯＡｃ　：Ｈｉ　Ｏ／３：１：１　　）Ｒｔ　　Ｃｎ　）　　＝０．２７　（ｎ　　　Ｂ　ｕＯＨ：　ＨＯＡ　ｃ　：　Ｈｚ　　Ｏ：ｐ　ｙ　ｒ　／　１５：３：１２：１０）Ｒｒ　　（Ｉ［Ｉ）＝０．４２（ＥｔＯＡｃ　　：　　ｐｙｒ　　：ＨＯＡｃ　：Ｈ，Ｏ１５：５：ｌ：３　　）アミノ酸分析：　Ａｓｐ、０．９１’ｌ；　Ｐｒｏ、０．９７；　Ｖａｌ、１．０５；　Ａｒｇ、ｌ。

００；ペプチド３８％。

Ｌこのペプチドは、ＢＯＣ−（ＢＺＬＣｌｚ　）−Ｔｙｒ樹脂エステル（４，４ｇ、　０．４０ｍｅｇ／ｇ　）がら出発して固相合成法によって合成された。この樹脂に順次にＢＯＣ−Ｖａｌ。

ＢＯＣ−Ａｌａ、　ＢＯＣ−ＰｒｏとＣＢ　Ｚ　ａ　　Ａｒｇを各々３当量ずつ結合させた。結合剤は４：ｌのＣＩＩｚ　Ｃｌ　ａ　：　ＤＭＦ中のＤＣＣとＨＯＢＴであった。樹脂をアニソール（５■ｌ）中のＨＦ　（４０ａｌ）を用いて０℃で４５分間切り出した。固体残留物をＨＯＡｃ’ｔ’ＩＯ回抽出し、濾過し、水溶液を凍結乾燥して１．５６ｇの粗製ペプチドを得た。

精製はセファデックス５ＰＣ２５カラム（２，６Ｘ　９０ａｎ）を用いるクロマトグラフィーによって行い、以下のＮＨ４０ＡＣの段階的勾配で溶出した：　０．０５Ｍ、　ｐＨ５（２１）、　０．１５Ｍ、　ｐ）１５　　（１１）　、　０．１５Ｍ、　ｐＨ６，７（２１）　；ｉ。

Ｏ＋＋＋ｌ／ｈｒ溶出速度、　１２．５１ずつ分画２８０ｎｍで検出０分画１９８−２０７を単離すると、標題のペプチドが無色の固体として１．１３ｇ得られた。

薄層クロマトグラフィ−（シリカゲルＧ、　２５０　）　　：Ｒｒ　　（Ｉ　）　＝０．２４　（ｎ　　Ｐ　ｒ　ＯＨ：　ＮＨ４０Ｈ／８４：３７）Ｒｒ　　（ＩＴ）　＝０．６４（トリフルオロエタノール：ＮＨ，ＯＨ／７８：２２　）Ｒｒ　　（ＩＩＩ）　＝０．５８　（ｎ−ＢｕＯＨ：　ＨＯＡ　ｃ　：　Ｈ２０：］’　ｙ　ｒ　／　１５：３：１２：１０）アミノ酸分析：　Ａｒｇ、１．００；　Ａｌａ、０．９６；　Ｐｒｏ、０．９７；　Ｖａｌ。

１．０３；　　Ｔｙｒ、１．０１ペプチド６７％。

支鳳ＵＧよ−Ｌ潅」１性」−丈」！久」−・・グ′ＭＰのこの測定は、ヒトサイスブレニン及びヒトサイモペンチンのように、本発明のペプチドが無傷のＭＯＬＴ−４細胞の細胞膜レセプターへ結合する能力およびサイクリックＧＭＰの生産を選択的に刺激する能力を測定するものである。

ＭＯＬＴ−４細胞系はＲｏｃｋｖｉ　ｌ　Ｉｓ、　Ｍｄ、のアメリカン・タイブーカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より得た。　ＭＯＬＴ−４細胞を新たに植え付け、モしてＴ、　ＡｕｄｈｙａらＡｒｃｈ　　Ｂｉｏｃｈ　ｍ影■１瓦か、　　２３４：１６７−１７７（１９８４）に記載のように収穫しながら３日間成長させた。この細胞をＰＢＳで３回洗い、ＲＰＭ１１６４０中に１．ＯＸＩＯ’細胞／細胞７濃ｌで再浮遊させ、試験テトラペプチドおよびペンタペプチド（２５μｍ）および対象ペプチドを加える前に３７℃で３０分間平衡化させた。

培養を４〜５分振盪水浴中で進行させ、１ｍｌの氷冷ＴＣＡ（１０％）を添加して終結させた。ＴＣＡ中の細胞をホモジナイズし、サイクリックヌグレオチドを遊離させるために超音波処理した。この懸濁液を３０００Ｘ　ｇで４℃で２０分間遠心分離した。生じた沈殿物を０．ｌＮＮａＯＨに溶かして蛋白含量を決定した。ＴＣＡを５　ｍ　ｌ水飽和ジエチルエーテルで４回抽出することにより上清の分画かも除去した。最後の抽出の後、残存する痕跡量のエーテルを１０分間５０℃の水浴中で加熱して除去した。凍結乾燥後、サンプルをサイクリックＧＭＰのラジオイムノアッセイに供するため５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，２）に溶解した。

第１図は、　ＭＯＬＴ−４細胞において、活性なペプチドであるアセチル−Ａｒｇ−ｒ’ｒｏ−β−Ｄ　−Ａｓｐ−Ｖａｔ−Ｎ　Ｈ、、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ −Ｖａｌ−Ｔｙｒ及びアセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｎ　Ｈ２について、サイモペンチン及び不活性なペプチドであるアセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｎ　ＩＩ　２　、　Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ及びＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＶａｉＮ　Ｈ、と比較して１〜１０００μｇ／ｌで評価した典を的な投薬一応答（ｄｏｓｅ−ｒθ５ｐｏｎｓｅ）曲線を示す、第２図は、ＭＯＬＴ−４細胞において、活性なペプチドであるアセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｎ　Ｈ２について、サイモペンチン基準物質と比較して１〜１００μｇ　／　ｍ　］で評価した投薬一応答曲線を示す。

活性閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）をそれぞれの試験ペプチドについて測定した。この値は、対照に対して２倍の標準偏差値より大きいサイクリックＧＭＰの細胞内濃度を誘起した試験ペプチドの最低濃度として定義される。

対照は、０．５ピコモル／ｍｌ（平均上標準偏差）より小さい細胞内サイクリックＧＭＰ濃度を有した。試験結果は、サイクリックＧＭＰの濃度が平行測定したネガティブ対照値の２倍（２標準偏差）より大きい場合にポジティブとされた。

サイクリックａ　Ｍ　Ｉ−’測定の結果を第１図及びそれに対応する第１表、並びに第２図及びそれに対応する第■表に示す、その際、本発明の代表的ペプチドが、サイモベンチン（＾ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）及び対照へブチドと比較して測定された。これらの結果は、　ＭＯＬＴ−４においてサイモベンチン（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）と比較された。何故ならば、ヒトサイスブレニンーペンタブチベド゛３Ｐ−５°゛（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ）はＭＯＬＴ−４において不活性であるためである。これらの結果は、ＭＯＬＴ−４細胞中でのＴ細胞ヘルパー活性の刺激において、本発明のペプチドが生物活性を有することを実証している。

第工表コノ　− ペプチド濃度　　　　　　　。

Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　６＋４　　　　１８．３　　　　２０．８　　　　　２１．９λｒｃｌ−Ｐｒｏ−Ｍｐ− Ｖａｌ−ＮＨ２０，Ｌ　　　　　　ｌフ、１　　　　　１９．：ｌｏ　　　　　　２４．８７ｉｙチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍｐ−Ｖａｌ−ＮＨ２４，５５８，９９１９，６２２４，０９アセチル−Ａｒｑ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖ！１ｌ−ＮＨ，４，７９，４１１６，７６２５，００アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＮＨ２７，１１４，６１９，１２４，５アセチル−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｇｌｕ −Ｖａｌ−ＮＨ２３，７１１，０１フ、７　　　　２４．９アセチル−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−ＮＨ２１Ｂ、７５　　２９．６８　　　３４．９８　　　４０．２３アセチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　　　　　　　　４．１　　　１１．９　　　　　フ、９　　　　３０．８７セチル−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＮＨ２１Ｂ　、　７８　　３０．４５　　　コロ、１７　　　３９．４８７セチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｂ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ２６，６１４，３２０，５２５，０７セチル−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｂ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ −ＮＨ２２０，５６：１１．８３　　　３６．６６　　　３４．９５Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＮＨ，Ｏ，コ３　　　　　０．３１　　　　　　０．コ４　　　　　　０．ココＩ、ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ４ａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，４４Ｇ、４コ　　　　　　０．４４　　　　　　０．３９人ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｍｐ−５＠ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，７１０，５Ｇ　　　　　　０．６８　　　　０．５８Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ　　　　　　　　　　Ｏ，０９１６，４１２７，９０３７，１４Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２３，７１１４，１５１２，８３１２＋５７７セチル−Ａｒｇ−Ｌｙ１！づｄａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ２コ、００　　　　Ｂ、８６　　　１２．８３　　　１８．４３ペプチド対照はＯ−０，３ｐｇ／ｍｌで変化する。

第１Ｉ表ペプチド濃度　　　　　　　　　・入ｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　３．５５　　　１３．５６　　　　１８．７０　　　２４＋ａ５アセチル−人ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ２７，７フ　　　１フ、コ９　　　２４．イア　　　　　−一注：バックグラウンドは０．１９ピコモルｄ？ＩＰ／＋ｓｌである。

実１１肚ニーー醒　　− 腸管内及び血清中の酵素による分解に対する本発明ペプチドの安定性を示すため、実施例としてのペプチド（アエチルーＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｎ　Ｈ、）をラット腸分泌液及びヒト血清中で３７℃で１２０分まで培養した。比較のために、テトラペプチドＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｍａｌ及びサイモンベンチンを同様に処理した。　ＨＰＬＣによれば、Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌは２５秒後に全て分解された。サイモベンチンは約２０秒で５０％が分解された０本発明のペプチドは、血清中及び腸液中の両者において、少なくとも１２０秒間は実質的に分解されずに残った。

上記の実施例は例示の目的のためにのみ示したもので、下記の請求の範囲に記載する本発明の範囲を制限するものではない。

Ｆ／に、　／／　　　　　　　　　ｔｏ　　　　　　　　ｔｏｏ　　　　　　　ｔｏｏ。

ペプチド濃度（マイクログラム／乱）Ｆ／に、　２ペプチド濃度（マイクログラム／糺）国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．次式Ｒ−Ａｒｇ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１［式中Ｒは水素、低級アルキル、アセチル、ホルミル又は低級アルカノイルであり、ＸはＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｉｂ又はＬｙｓであり、ＹはＡｌａ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，べ−ターＡｓｐ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ又はＩｌｅから選ばれたアミノ酸のＤ−形又はＬ−形であり、ＺはＧｌｙ或いはＶａｌ，Ａｌａ，Ｌｅｕ又はＩｌｅから選ばれたアミノ酸のＤ−形又はＬ−形であり、Ｒ１はＯＨ或いはＮＲ２Ｒ３であり、ここにＲ２及びＲ３は水素、または炭素数１〜６の直鎖状または分枝状のアルキルまたはアルケニル（これはアリールにより置換されていてもよい）、或いはハロゲン又は炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキルまたはアルケニルで置換されたアリールであり、或いはＲ２とＲ３は一緒になって炭素数３〜７の環状メチレンであり、但し、ＸがＬｙｓでＺがＶａｌのときはＹはＡｓｐ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ａｓｕ又はＧｌｕ以外のものであり、ＸがＬｙｓのときはＹはＡｓｐ以外のものであり、ＸがＡＩａでＺがＶａｌのときはＹはＡｓｐ以外のものである］で表わされるテトラペプチド、或いは、その薬剤的に受容できる酸付加塩又は塩基付加塩。
２．ヒトＴ細胞系ＭＯＬＴ−４においてｃＧＭＰ活性を増加する能力を有する、請求の範囲第１項記載のペプチド。
３．ＸがＰｒｏ，ＹがＡｓｐ，Ａ１ａ，Ｃｌｕ，Ｄ−ベーターＡｓｐ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ又はＡｌｅ、ＺがＶａｌ又はＡｌａである、請求の範囲第１項記載のペプチド。
４．次の【配列があります】【配列があります】ホルミル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】アセチル【配列があります】からなる群から選ばれる、請求の範囲第１項記載のペプチド。
５．固相或いは液相化学合成法により製造された、請求の範囲第１項記載のペプチド。
６．アセチル【配列があります】である、請求の範囲第１項記載のペプチド。
７．次式【配列があります】［式中Ｒ２は水素、低級アルキル、アセチル、ホルミル、低級アルカノイルまたはデス−アミノであり、Ｘ１はＰｒｏ、デヒドロ−Ｐｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｉｂ又はＬｙｓであり、Ｙ１はＶａｌ，ＩＩｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓから選ばれたアミノ酸のＤ−形又はＬ−形であり、Ｚ′はＴｙｒ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｈｉｓ，Ａｌａ又はＴｒｐから選ばれたアミノ酸のＤ−形又はＬ−形であり、Ｒ３はＯＨ或いはＮＲ４Ｒ５であり、ここにＲ４およびＲ５は水素、或いは炭素数１〜６の直鎖状または分枝状のアルキルまたはアルケニル（これはアリールにより置換されていてもよい）、或いはハロゲン又は炭素数１〜６の直鎖状又は分枝状のアルキルまたはアルケニルで置換されたアリールであり、或いはＲ１とＲ５は一緒になつて炭素数３〜７の環状メチレンである］で表わされるヒトＴ細胞系においてｃＧＭＰ活性を増大する能力を有することを特徴する、ペンタペプチド、或いはその薬剤的に受容できる酸付加塩又は塩基付加塩。
８．Ｘ′がＰｒｏである、請求の範囲第７項記載のペプチド。
９．Ｙ′がＶａｌである、請求の範囲第８項記載のペプチド。
１０．次の【配列があります】【配列があります】アセチル【配列があります】からなる群から選ばれる、請求の範囲第７項記載のペプチド。
１１．固相或いは液相化学合成により製造された、請求の範囲第７項記載のペプチド。
１２．薬剤的に受容できる調製物中に請求の範囲第１項記載のテトラペプチドの少なくとも１種又は請求の範囲第７項記載のペンタペプチドの少なくとも１種を治療的に効果的な量で含有する薬剤組成物。
１３．経口投薬に適する、請求の範囲第１２項記載の組成物。
１４．感染を有する対数の免疫系の調節に適する薬剤組成物を製造するための、請求の範囲第１項又は第７項のペプチド或いはその薬剤的に受容できる塩の用途。
１５．対象におけるＴ細胞機能の欠乏又は過剰の調節に適する薬剤組成物を製造するための、請求の範囲第１項又は第７項記載のペプチド或いはその薬剤的に受容できる塩の用途。
１６．請求の範囲第１項又は第７項記載のペプチド或いはこれに対する抗体を含有する診断薬。