CZ424098A3 - Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a nukleární rekonstrukce cytoplazmatické samčí sterility - Google Patents

Description

Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza a nukleární rekonstrukce cytoplazmatické samčí sterility.

• « · · · · · · ··« • · « · · · ' ·· ··· ·· ···· ··

Oblast techniky

Vynález se týká ukazatele nukleární rekonstrukce cytoplazmatické samčí sterility zvláště pak je-li takovým markrem komplementární DNA glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázy. Vynález také popisuje gen pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility, zvláště pak použití formy genu kódující glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázu, která se vytvořila za tímto účelem. Vynález se týká produkce restaurátora, který vzniká genetickou transformací rostlin uvedeným genem.

Dosavadní stav techniky

Hybridy různých odrůd plodin mohou vykazovat výtěžky, které jsou významně vyšší než je tomu u rodičovských linií. Tento jev je znám jako vitalita hybridu. Tiby se dosáhlo hybridního růstu, je nezbytné mít způsob dostupný pro prevenci samoopylení jedné nebo obou rodičovských linií při hybridním křížení. Při uskutečnění uvedeného záměru se mohou použít mechanické, chemické a genetické metody. Zavedený genetický způsob zahrnuje rys cytoplazmatické samčí sterility (CMS). Genetické determinanty CMS, což znamená neschopnost produkovat životaschopný pyl, která se přenáší z matky, se nachází na mitochondriálním genomu. Protože u rostlin s CMS jsou samci sterilní, všechny semena, které na nich vznikají budou nezbytně hybridní. Vzhledem přenosu CMS z matky, budou u F1 hybridů za normálních podmínek samci také sterilní a proto nebudou schopni se sami oplodnit a produkovat semena. Aby došlo k vyřešení uvedeného problému, mohou se do opylujícího se rodiče hybridního křížení vnést specifické nukleární geny, které potlačují fenotyp savčí sterility. Tyto geny se nazývají restaurátory plodnosti (Rf) . Genotypy, které způsobují samčí • · · · · « » · · » · · · · • · cytoplazmatickou sterilitu se nazývají „udržovatelé, zatímco genotypy, které nesou geny Rf se nazývají restaurátoři; geny pro udržování a normalizaci CMS se považují za rozdílné alely (rf a Rf) na stejném lokusu.

Nedokonalá současná řešení.

Za účelem produkovat odlišnou sadu hybridů za použití CMS, musí být dostupný adekvátní počet linií restaurátorů, které obsahují geny Rf, stejně jako linií „udržovatelů, které jsou sterilizovány CMS cytoplazmou. Použití takových linií při produkci hybridní plodiny je znázorněno na obrázku č. 1. Vývoj uvedených linií prostřednictvím klasické genetiky je pomalý proces, který vyžaduje minimálně několikaleté úsilí, a současně hlavní překážkou je tvorba hybridů založených na CMS u řady plodin, které zahrnují také řepku typu canola, což je hlavní kanadská užitková plodina. Aby došlo k vytvoření nové restaurátorské linie, je nezbytné nejdříve generovat hybrid mezi existujícím kmenem restaurátoru, který je donorem genu Rf, a recipientního kmene; pak se uskuteční série zpětných křížení na recipi4|^n^í kmen, aby došlo k začlenění genu Rf, aniž se změní ostatní požadované charakteristiky kmene. Tento proces se nazývá introgrese. Dokonce po dobu mnoha generací se uchovává některá donorová DNA, která je spojena s genem Rf na donorové DNA, tento jev se nazývá „linkage drag; tato donorová DNA může nést škodlivé jevy a ohrožuje kvalitu recipientního kmene (Jean, M. et al., 1993, Current Topics in Molecular Genetics, 1: 195-201).

Tento proces může být urychlen prostřednictvím obecného procesu nepřímé selekce u potomstva rostlin se nejdříve hledají genetické markéry spojené s genem restaurátora, spíše než samotný gen restaurátora. Tyto markéry se vybraly tak, že se jejich přítomnost může testovat ve velmi ranném stádiu vývoje rostlin. To obchází finančně náročný postup vzniku řady dospělého potomstva rostlin a může znatelně zrychlit proces ·· · *·· • · · · · · • ·

introgrese. Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) reprezentuje typ markerové DNA, která je vhodná pro tento účel. RFLP (mezi dvěma fenotypy) se liší v paternech restrikčních fragmentů, které se detekuji za použiti specifických sond DNA. Sondy, které detekuji rozdíly paternu fragmentů mezi liniemi normalizátorů a udržovatelů a které kosegregují s genem Rf se mohou použít při nepřímé selekci genu restaurátora v programu šlechtění rostlin. Získalo se několik sond, které se spojují s Rfpl, což je gen restaurátora Polima nebo s pol CMS, což je jedna ze dvou forem CMS v řepce typu canola (B. napus), která se v současné době používá při produkci hibridních semen. Žádný z těchto markérů není zcela spojen s genem. To vnáší jisté nejasnosti do jejich použití při nepřímé selekci; přítomnost libovolného jednoho markéru v rostlině neznamená, že ve stejné rostlině je také přítomen gen restaurátora. Proto je nezbytné použít při nepřímé selekci rostlin obsahujících gen restaurátora řadu markérů.

Je nutné vytvořit markér, který je perfektně spojen s nukleární normalizací cytoplazmatické savčí sterility.

Tento proces se může dále urychlit zavedením klonovaného genu restaurátoru. Věří se, že identifikovaná sonda, která vykazuje perfektní spojení s Rfpl je schopna detekovat samotný gen restaurátora.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je vytvořit markér pro nukleární rekonstrukci spojenou s cytoplazmatickou savčí sterilitou.

Dále vynález popisuje použití komplementární DNA glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, jako uvedeného markéru restaurátora.

Dále vynález popisuje schopnost použít tento gen při produkci linií restaurátorů přímo prostřednictvím genetické transformace.

0« «« » 0 0 0 » « « « «00 « « « • · 0 · 0 · • 0 · · 0 · • 0 0·0 ·· · ·

Vynález dále popisuje sondu specifickou pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické savčí sterility rostlin, která obsahuje cDNA glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, nebo sekvence genomová DNA,’ její hybridizující fragment nebo od ní odvozené libovolné sekvence DNA, které se mohou použít jako primery při amplifikaci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy, přičemž uvedená sekvence DNA nebo její hybridizující fragment hybridizuje za omezených podmínek se specifickými fragmenty DNA, jenž jsou charakteristické pro rostliny mající gen nukleárního restaurátora.

Vynález také popisuje gen pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility u rostlin, který obsahuje sekvenci DNA kódující glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu a okolní sekvence.

Okolní sekvence se mohou nacházet na 3' konci a/nebo na 5' konci vzhledem k sekvenci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy a mohou obsahovat přibližně 50 kb.

V souladu s vynálezem se popisuje způsob produkce linie restaurátorů, které obsahují geneticky transformované rostliny s nukleární normalizací genu cytoplazmatické samčí sterility podle vynálezu.

Aby gen restaurátoru podle vynálezu v rostlinných druzích odpovídal specifické formě GAPC, může se použít libovolný rostlinný druh.

Takové specie zahrnují bez omezení Brassica napus, jiné druhy Brassica, kukuřici (Zea mays), rýži (Oryza sativum) slunečnice (Helianthus annuum) a proso (Sorghum bicolor).

Pokračovalo se v analýze genetického křížení, při kterém vznikly populace rostlin, ve kterých byl segregován gen restaurátora (uvedeno na obrázku č. 2). V každém případě podstata křížení byla taková, že v případě spojených markérů většina sterilních individuí potomstva bude vykazovat RFLP charakteristický pro sterilního samčího rodiče, zatímco většina savčího plodného potomstva rostlin bude vykazovat RFLP

0000 • 0 • · · · • · ·· • « 0 · • 0 0 · ••Φ 000

0 0 0 · · charakteristický pro plodného rodiče. Zjistilo se, že nový markér označený cRFl, je perfektně spojen s tímto genem. Zvláště ze 175 testovaných jedinců ve dvou křížení všichni plodní potomci nesou alelu (nebo formu) plodného rodiče, zatímco všechny sterilní rostliny mají alelu sterilního rodiče (Tabulka č. 1). Markér cRFl proto reprezentuje zvláště silný nástroj pro nepřímou selekci genu restaurátora.

Tabulka č. 1

Ko-segregace Rfpl-specifické RFLP alely detekovatelné sondou cRFl (GAPC) s rekonstrukcí samčí fertility ve 2 zpětně křížených populacích Brassica napus.
Křížení	Plodní potomci	Sterilně potomci
	S Rfplspecifickou cRFl alelou	Bez Rfplspecifické cRFl alely	S Rfplspecifickou cRFl alelou	Bez Rfplspecifické cRFl alely
Westar x Westar-Rf	30	0	0	34
Karat x Westar-Rf	56	0	0	55
Celkem	86	0	0	89

Rozdílné body při srovnání s předchozími řešeními

Vzhledem k perfektnímu spojení mezi cRFl a Rpfl se eliminovaly nejasnosti při použití této sondy při nepřímé selekci genu restaurátora.

Navíc se nepodařilo izolovat žádný gen restaurátora pro Polima nebo pro systém pol CMS a proto není možná produkce linií restaurátorů přímo prostřednictvím genetické transformace. To vede k podstatnému snížení nákladů na použití nepřímé selekce ve vývoji nových linií restaurátora (obr. č. 4) .

Sonda DNA, která detekovala tento polymorfismus, je komplementární DNA B. napus (cDNA), to znamená DNA komplementární s molekulou mediátorové RNA (mRNA). Stanovila *r 99

9 9 9

9 9

9 9

9 9

9999 /·· 9999 ··

9 999

9 9 9

9 9

9 999

99

9 * 9 « 9 9 9 • 999 999

9

9 ·9 se sekvence DNA této cDNA. Analýza databáze nukleotidových sekvencí indikuje, že sekvence cDNA je z 99 % podobná sekvenci cytoplazmatické formy glykolytického enzymu z Arabidopsis thaliana, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (obr. č. 3A a 3B), která je kódována genem GAPC (Shih, M. -C. et al., 1991, Gene, 104: 133-138). Perfektní spojení mezi genem restaurátora a polymorfismem GAPC podporuje myšlenku, že gen restaurátora je pravděpodobně specifická forma GAPC.

Provedl se podobný typ analýzy na populaci BC1, kde systém genu restaurátoru pro různý B. napus CMS, nap, byl segregován a zjistilo se, že nap restaurátor byla jednoduše odlišná alela stejného genetického lokusu. Pak odlišné formy GAPC odpovídají dvěma různým genům nukleární normalizace plodnosti v B. napus. To vede k dalšímu návrhu, že jiné geny restaurátorů mohou odpovídat izoformám GAPC a že vztah mezi GAPC a geny restaurátora může přesahovat do jiných systémů CMS v jiných rostlinných druzích. Dříve se nenaznačoval žádný vztah mezi GAPC a geny restaurátorů.

Tyto geny lze proto použít při konstrukci linií restaurátorů v jednom kroku za použití genetické transformace za účelem zavedení restaurátor-specifického genu GAPC do genotypu „udržovatele (genotyp, který přirozeně nezahrnuje restaurátor). Vzhledem k tomu, že tato skutečnost eliminuje řadu kroků v procesu šlechtění rostlin nezbytných při vývoji takových linií, extrémně snižuje náklady. V případě, že asociace mezi GAPC a geny restaurátorů je rozšířena na jiné druhy plodin, bude reprezentovat obecnou metodu izolace genů restaurátorů a vývoje linií restaurátorů u mnoha plodin.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena schématická reprezentace použití cytoplazmatické samčí sterility (CMS) při produkci hybridních semen;

• · • 4»

• · · · • · · ·· · • · · * ·

Π · · · ·

Na obrázku č. 2 jsou zobrazeny křížení používaná pro identifikaci markéru zcela spojeného s restaurátorem Rpfl genu plodnosti;

Na obrázcích č 3A až 3E je zobrazeno porovnání cDNA Brassica napus klonu cRFl (SEQ ID NO: 1) s cDNA cytoplazmatické glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPC) z Sinapis alba (SEQ ID NO: 2) a Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3); a

Na obrázku č. 4 je zobrazen gel polymorfizmu detekovaný sondou cRFl v Brassica napus v genetické populaci segregující gen Rfpll.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Použití sondy GAPC jako nepřímého selekčního markéru při produkci nové restaurátorské buněčné linie.

Uvažují se tři rostlinné genotypy:

A linie CMS;

B mužská plodná linie, které chybí gen restaurátora a která zahrnuje savčí plodnou cytoplazmu; a

R savčí plodná linie, která zahrnuje gen restaurátora a samčí sterilní cytoplazmu.

Předpokládá se, že hybridy mezi liniemi A a B, které vznikají manuálním genetickým křížením, vykazují podstatný hybridní růst; přičemž hybridy mezi A a R tento růst nevykazují. Protože linie B nenese gen restaurátora, není možné použitím CMS vytvořit samčí plodné hybridy těchto dvou linií. Jestliže se však může gen restaurátora přenést z linie R do linie B, aniž se jinak změní charakteristiky linie B, je možné za použití CMS získat mezi liniemi savčí plodné hybridy A a B. Tradičním způsobem lze tento záměr provést postupem, který se nazývá introgrese. Linie R se kříží jako samčí pohlaví s linií B za vzniku samčího plodného hybridu Fl linie • ·

A- a Β , který obsahuje samčí sterilní cytoplazmu (cytoplazma hybridu je zcela odvozena ze samičího rodiče), ale samčí pohlaví je plodné, protože hybrid získal jednu kopii genu restaurátora z rodičovské linie R. Druhé křížení (které se nazývá zpětné křížení) se pak uskutečnilo mezi hybridem (vystupuje jako samičí pohlaví) a linií B. Velké množství vyrostlých potomků jsou na poli. Očekává se vznik stejného počtu plodných a neplodných jedinců, přičemž plodní jedinci nesou gen restaurátora. Jeden nebo více plodných jedinců se pak používá jako samičí pohlaví při druhém zpětné křížení s linií B; izolují se plodné rostliny a kříží se po třetí jako samičí pohlaví s linií B. Tento proces se opakuje v mnoha generacích. V každé nové generaci se očekává, že potomstvo se stává stále podobnější linii B (s tou výjimkou, že bude zahrnovat gen restaurátora). V každé generaci se stanoví různé charakteristiky spojené s linií Β. V podstatě vzniká nová restaurátorská linie se všemi nebo s většinou požadovaných charakteristik linie B. Tato linie se pak použije pro produkci hybridů mezi liniemi A a B ve velkém měřítku.

Sonda GAPC usnadňuje tento proces, protože v rostlinném potomstvu umožňuje odhadnout přítomnost genu restaurátora už ve stádiu semene. DNA se extrahuje z malého množství materiálu pocházejícího z listů, štěpí se restrikční endonukleázou, jako je Hind III (použil se na obr. č. 4), a analyzuje se za použití sondy GAPC. Přítomnost charakteristiky restrikčních fragmentů genu restaurátora indikuje, že semenáče nesou gen restaurátora. Velký počet rostlin se testovalo ve stádiu semenáčů, což je méně nákladné než produkce dospělých rostlin na poli. Navíc samčí plodný fenotyp je ovlivněn řadou podmínek a testování přítomnosti genu testem pro ideálně spojený polymorfizmus spolehlivěji detekuje přítomnost genu během procesu introgrese.

Příklad 2: Produkce nových restaurátorských buněčných linií prostřednictvím zavedení formy genu restaurátora GAPC transformací.

V souladu s touto procedurou se uvažují tři rostlinné genotypy z příkladu 1.

V tomto příkladu je problém zcela stejný jako v příkladu

1. Problémem je přenos genu restaurátora z linie R do linie B, aniž se jinak změní charakteristika linie Β. V tomto případě se však předpokládá, že se izolovala forma genu GAPC, která reprezentuje gen restaurátora, a je dostupná jako klonovaný segment DNA ve vhodných bakteriích Agrobacterium tumefaciens v transformačním vektoru, jako je pRD400 (Datla RSS, Hammerlindl JK, Panchuk, B, Pelcher LE and Keller W. (1992) Gene 211: 383384). Místo rozvleklého programu zpětného křížení, který se popisuje v příkladu 1, se gen GAPC transformuje do linie B transformací prostřednictvím bakterií Agrobacterium.

Kvůli tomuto příkladu se také předpokládá, že linie A, B a R jsou linie Brassica napus a že klonovaný gen restaurátora je stejný jako ten v linie R. Při postupu, který se popisuje v publikaci Moloney, M., Walker, J. and Sharma, K. (1989) Plant Cell Rep. 8: 238-242), se pro inokulaci děloh semenáčů kmene B používá kmen Agrobacterium nesoucí gen ve vektoru prRD400. Bakterie Agrobacterium se eliminují aplikací antibiotik a výsledná rostlinná tkáň se umístí do média, které obsahuje antibiotikum kanamycin. Vektor pRD400 obsahuje gen, který způsobuje rezistenci na kanamycin, a proto buňky, které rostou v přítomnosti uvedeného antibiotika, nesou pravděpodobně gen kanamycinu spolu s genem restaurátora, který je klonován v pRD400. Přítomnost genu restaurátora v těchto rostlinách se pak odhaduje přímo testováním přítomnosti restrikčních fragmentů v rostlinných formách, které jsou charakteristické pro restaurátora, za použití sondy GAPC. Očekává se, že tyto rostliny budou plodné, jestliže obsahují samčí sterilní cytoplazmu, a že potomstvo F1 pocházející

ΊΟ ···· ·· ·· z křížení linie A (vystupuje jako samičí pohlaví) a nové transgenní linie bude také vystupovat jako plodné samičí pohlaví.

Tento způsob má dvě výhody: je daleko rychlejší a levnější ve srovnání s běžnými přístupy šlechtění rostlin. Pro vývoj této linie se nevyžadují roky, ale pouze několik měsíců. Navíc přítomnost genu restaurátora je jediný rozdíl mezi genomem linie B a genomem nové restaurátorské linie. Pak je méně pravděpodobné, aby byla ohrožena integrita charakteristik linie B.

Ačkoli shora uvedený popis se vztahuje na specifické rostlinné druhy Brassica napus, vynález se může aplikovat také na jiné druhy, přičemž gen restaurátora ve specie odpovídá specifické formě GAPC. V takových případech se může způsob transformace lišit od toho způsobu, který se popisuje shora v textu.

φ φ · • φ ··'*

SEKVENACNI PROTOKOL (1)

Údaje k SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1207 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

TCTCGATCTC ATCGACACCC TCTGATATCG AAATGGCTGA CAAGAAGATT AAGATCGGAA 60 TCAACGGTTT CGGAAGAATC GGTCGCTTGG TGGCTAGAGT TATCCTTCAG AGGAACGATG 120 TTGAGCTCGT CGCTGTTAAC GACCCCTTCA TCACCACCGA GTACATGACG TACATGTTTA 180 AGTATGACAG TGTTCACGGT CAGTGGAAGC ACAACGAGCT CAAGGTTAAG GATGAGAAGA 240 CACTTCTCTT CGGTGAGAAG CCTGTCACTG TTTTCGGCAT CAGGAACCCT GAGGATATGC 300 CCATGGGGTG AGGCTGGAGC TGACTTTGGG GTTGAGTCTA CTGGTGTCTT CACCGACAAG 360 GACAAGGCTG CTGCTCACTT GAAGGGTGGT GCGAAGAAAG TTGTCATCTC TGCACCAAGC 420 AAAGATGCTC CCATGTTCGT TGTTGGTGTC AATGAGCATG AGTACAAGTC TGATCTCAAC 480 ATTGTTTCCA ACGCTAGTGC ACCACTAACT GCCTTGCTCC ACTTGCCAAG GTTATCANCG 540 ACAGGTTTGG AATTGTCGAG GGACTCATGA CCACCGTCCA CTCTATCACT GCAACTCAGA 600 AGACAGTTGA TGGTCCATCA ATGAAGGACT GGAGAGGTGG AAGAGCCGCT TCCTTCAACA 660 TCATTCCCAG CAGCACCGGA GCTGCCAAGG CTGTCGGAAA GGTTCTTCCA CAGCTCAACG 720 GAAAGCTGAC CGGTATGTCC TTCCGTGTTC CCACCGTTGA TGTTTCAGTT GTTGACTCAC 780 GGTTAGACTC GAGAAAGCTG CAACCTACGA TGAAATCAAG AAGGCTATCA AGGAGGAATC 840 TGAGGGCAAG CTAAAGGGAA TCCTTGGTTA CACAGAGGAT GATGTTGTCT CAACCGACTT 900 CGTTGGTGAC AACAGGTCGA GCATTTTTGA CGCAAAGGCT GGAATCGCGT TGAGTGACAA 960 CTTTGTGAAG CTGGTGTCGT GGTACGACAA CGAATGGGGT TAGAGTACCC GTGTGGTCGA 1020 CTTGATCATT CACATGTCCA AGGCCTAAGT CGATGAAGAT CTCGAGTGAT GTAATGGTGT 1080 TTTTAAATTG TTGTTTTTAT CGAATAAATT TTCTTGGGTT TTGAAACCTT TATGGTTTTG 1140 GCGAATTCTC TACTTTCACG TGACGTGATA AGAAGTTTGT AGACCGGTTG TTTTTTATTT 1200 TTACTGA 1207

(2) Údaje	k SEQ	ID NO: 2:
(iii)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(E)	DÉLKA: 1091 párů baží
	(F)	TYP: nukleová kyselina
	(G)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(H)	TOPOLOGIE: lineární
(iv)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 2:

• · • · ··· · · · • · · · · • ·

TTTCGAAATG GCTGACAAGA TTTGGTGGCT AGAGTTATCC CTTCATCACC ACCGAGTACA GAAGCACAAT GAGCTCAAGG CACTGTTTTC GGCATCAGGA TGTTGTTGAG TCTACTGGTG TGGTGCCAAG AAAGTTGTCA TGTCAATGAG CATGAGTACA TAACTGCCTT GCTCCACTTG CATGACTACT GTCCACTCTA GGACTGGAGA GGTGGAAGAG CAAGGCTGTC GGAAAGGTGC TGTTCCCACC GTTGATGTTT CTACGATGAA ATCAAGAAGG TGGTTACACA GAGGATGATG CTTTGACGCC AAGGCTGGAA TGACAACGAA TGGGGTTACA CTAAAACGCT GAAGATCTAC ATTTCTTTGG G

AGATTAAGAT CGGAATCAAC TTCAGAGGAA CGATGTTGAG TGACGTACAT GTTTAAGTAT TGAAGGATGA GAAAACACTT ACCCTGAGGA TATCCCATGG TCTTCACTGA CAAGGACAAG TCTCTGCACC AAGCAAAGAT AGTCTGATCT CAACATTGTT CCAAGGTTAT CAACGACAGG TCACTGCTAC TCAGAAGACA CCGCTTCCTT CAACATCATT TTCCACAGCT CAATGGAAAA CAGTTGTCGA CCTCACGGTT CTATCAAGGA GGAGTCTCAG TTGTCTCAAC TGACTTCGTT TCGCATTGAG TGACAACTTC GTACCCGTGT GGTCGACTTG AATGATGTAA TGGTGTCTTA

GGTTTCGGAA GAATCGGTCG CTCGTCGCTG TTAACGATCC GACAGTGTTC ATGGTCAGTG CTCTTCGGAG AGAAGCCTGT GGTGAGGCCG GAGCTGACTT GCTGCTGCTC ACTTGAAGGG GCTCCTATGT TCGTTGTTGG TCCAACGCTA GTTGCACCAC TTTGGAATTG TCGAGGGACT GTTGATGGTC CATCAATGAA CCCAGCAGCA CCGGAGCTGC TTGACCGGAA TGTCCTTCCG AGACTCGAGA AAGCTGCAAC GGCAAGCTAA AGGGAATCCT GGTGACAACA GGTCGAGCAT GTGAAGCTGG TGTCGTGGTA ATCATTCATA TGTCCAAGGC ATTTGTGGTT TTCGAATAAG

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1091

(3)	Údaje	k SEQ	ID NO: 3:
	(v)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		. (I)	DÉLKA: 1295 párů baží
		(J)	TYP: nukleová kyselina
		(K)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
		(L)	TOPOLOGIE: lineární
	(vi)	DRUH	MOLEKULY: cDNA
	(xi)	Popis	sekvence: SEQ ID NO: 3:

CTCATCTTCA ACCTCTCTCT AGGATCGGAA TCAACGGATT AGGGACGATG TTGAGCTCGT TACATGTTCA AGTACGACAG GATGAGAAGA CCCTTCTCTT GAGGATATCC CATGGGCCGA ACTGACAAAG ACAAGGCTGC GAACCCAGGA AAGACGCTCC GACCTTGACA TTGTCTCCAA GTTATCAATG ACAGATTTGG GCTACTCAGA AGACTGTTGA TCATTCAACA TTATTCCCAG GCTCTTAACG GAAAGTTGAC GTTGACCTTA CTGTCAGACT AAGGAGGAAT CCGAAGGCAA TCAACTGACT TCGTTGGCGA TTGAGCGACA AGTTTGTGAA CGTGTGGTCG ACTTGATCGT GATAGGGAGT GGAAAGTCAT ATAAAATTTC TTTGAACTTG TGAGGTGATG GGAGTTTGTA ATATATTGAG TTAACGTTAT

AACTCTCGTT TTCGATTCTA CGGAAGAATT GGTCGTTTGG CGCTGTCAAC GACCCCTTCA TGTTCACGGT CAATGGAAAC CGGTGAGAAG CCAGTCACTG GGCTGGAGCT GACTACGTTG AGCTCACTTG AAGGGTGGTG AATGTTTGTT GTTGGTGTCA CGCTAGCTGC ACCACTAACT AATTGTTGAG GGTCTTATGA TGGGCCTTCA ATGAAGGACT CAGCACTGGA GCTGCCAAGG TGGAATGTCT TTCCGTGTCC CGAGAAAGCT GCTACCTACG ACTCAAGGGA ATCCTTGGAT CAACAGGTCG AGCATTTTTG ATTGGTGTCA TGGTACGACA CCACATGTCA AAGGCCTAAG CTGTTCATCC CCTTTTATGG GAACTTTTTT TTTTTTTGGT GACCGATGTT TTACTGGAAG GGTTTTAAAA AAAAA

CAATGGCTGA CAAGAAGATT TTGCTAGAGT TGTTCTCCAG TCACTACTGA GTACATGACC ACAATGAACT GAAGATCAAG TTTTCGGCAT CAGGAACCCT TTGAGTCTAC TGGTGTCTTC CCAAGAAGGT TGTTATCTCT ACGAGCACGA ATACAAGTCC GCCTTGCTCC CCTTGCCAAG CTACAGTCCA CTCAATCACT GGAGAGGTGG AAGAGCTGCT CTGTCGGAAA GGTGCTTCCA CAACCGTTGA TGTCTCAGTT AAGAAATCAA AAAGGCTATC ACACCGAGGA TGATGTTGTC ACGCCAAGGC TGGAATTGCA ACGAATGGGG TTACAGTTCC CTAAGAAGCA GATCTCGAAT TCTGAATTTG TCGTTTTCGA TTTCTTAATT CTCATTCATG CCCTTTGTTT TTGGCTTTTG

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1295

Claims (14)

1. Sonda specifická pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu nebo její hybridizační fragment, přičemž uvedená sekvence DNA nebo její hybridizační fragment hybridizují za omezených podmínek se specifickými fragmenty DNA typickými pro rostliny, které mají gen nukleárního restaurátoru.

2. Sonda specifická pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1.

3. Sekvence DNA primeru odvozená od sondy podle nároku 1 nebo 2.

4. Způsob detekce přítomnosti genu restaurátora v jaderné genomové DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje

i) hybridizaci uvedené jaderné genomové DNA za omezených podmínek se sondou specifickou pro nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin, přičemž uvedená sonda obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázu a uvedená sekvence nukleové kyseliny hybridizuje za omezených podmínek se specifickými fragmenty DNA typickými pro rostliny, které mají gen nukleárního restaurátoru; a ii) detekci hybridizace uvedené sondy s uvedenou jadernou genomovou DNA, přičemž hybridizace uvedené sondy s uvedenou jadernou genomovou DNA indikuje uvedenou jadernou genomovou DNA obsahující gen restaurátora.

» · ·· β « · • fcfcfc • fc ·· • fcfc · • · · · • · · · · · fcfc · fc

5. Způsob detekce přítomnosti genu restaurátora v jaderné genomové DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje:

i) amplifikaci uvedené jaderné genomové DNA za vhodných podmínek se sekvencí DNA primeru podle nároku 3; a ii) detekci amplifikace uvedené jaderné genomové DNA s uvedenou sekvencí DNA primeru, přičemž amplifikace uvedené jaderné genomové DNA indikuje uvedenou jadernou genomovou DNA obsahující gen restaurátora.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že sonda obsahuje nukleovou kyselinu uvedenou v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že sonda obsahuje nukleovou kyselinu uvedenou v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3.

8. Gen nukleární rekonstrukce cytoplazmatické samčí sterility rostlin, který obsahuje sekvenci DNA kódující glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu a okolní sekvence a který se detekuje způsobem podle nároku 4, 5, 6-nebo 7.

9. Gen podle nároku 8, kde okolní sekvence se nacházejí na 3' a/nebo 5' konci sekvence glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenázy.

10. Způsob produkce rekonstrukční linie, vyznačující se tím, že zahrnuje rostliny geneticky se transformující genem nukleární rekonstrukce cytoplazmatické samčí sterility podle nároku 8.

11. Použití sondy podle nároku 1 při nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin.

• 9

12. Použití sondy podle nároku 2 při nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin.

13. Použití podle nároku 11, kde sonda obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 3.

14. Použiti sekvence DNA primerů podle nároku 3 při nukleární rekonstrukci cytoplazmatické samčí sterility rostlin.