JP2000512153A

JP2000512153A - グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素および細胞質性雄性不稔の核性回復

Info

Publication number: JP2000512153A
Application number: JP10501998A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，グレゴリー・ジー; ランドリー，ブノア; ジャン，マルティンヌ
Original assignee: マクギル・ユニヴァーシティ
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 2000-09-19
Also published as: WO1997049831A1; AU732094B2; EP0954604A1; CN1228126A; PL330793A1; HUP9904008A3; CA2258561A1; HUP9904008A2; CZ424098A3; CA2258561C; AU3085797A

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞質性雄性不稔の核性回復のためのマーカー、および特にそのようなマーカーとしてのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素cDNAに関する。細胞質性雄性不稔の核性回復のための遺伝子、および特にその目的のためのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子のある形態の利用が提供される。最後に、そのような遺伝子による植物の遺伝的形質転換を通した、直接的な回復用系列の生産法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素および細胞質性雄性不稔の核性回復発明の背景 (a)発明の分野本発明は、細胞質雄性不稔の核性回復のためのマーカーに関し、特にこのようなマーカーの一つとしてのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素相補性DNAの使用に関する。本発明は、また細胞質雄性不稔の核性回復のための遺伝子に関し、特にこの目的のためのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする遺伝子の一形態の使用に関連する。最後に、本発明はこのような遺伝子による植物の遺伝的形質転換を直接的に用いた稔性回復因子の系の生産に関する。 (b)背景技術異なる品種の穀物の雑種は、親の系よりもはるかに大きい生産高を示す。この現象は雑種強勢として知られている。雑種強勢の使用に手段を与えるには、異種交雑において親の系の一つまたは両方の自家受粉を妨げるために有効な方法を手に入れる必要がある。機械的、化学的および遺伝学的方法が、これを達成するために有効である。確立された遺伝学的方法の一つは、細胞質雄性不稔(CMS)の特性を含む。CMSの遺伝学的決定因子、母系的に転移された、生存できる花粉を生産する不能は、ミトコンドリアのゲノムに存在する。CMS植物は雄性不稔なので、それらの植物上に形成する全ての種子は雑種形成を必然とする。しかしながら、CMSの母系伝達のために、このようなF1雑種もまた正常に雄性不稔になり、この故に自家受精できず種子を生産することができない。この問題に取り組むために、稔性回復因子(Rf：restorers of fertility)と名付けられた、雄性不稔の表現型を抑圧する特異的核性遺伝子を異種交雑の受粉側の親に組込むことができる。雄性不稔の細胞質が不稔性を授与する遺伝子型は維持因子（maintainers）と名付けられ、一方、Rf遺伝子を持つ遺伝子型は回復因子（restorers）と名付けられる。CMSの維持と回復のためのこれらの遺伝子は同じ遺伝子座の異なる対立遺伝子(各々rfおよびRf)と見なされることができる。現在の解決法の欠点 CMSを用いた種々の雑種を生産するためには、適切な数の、Rf遺伝子を含む回復因予の系（restorers lines）およびCMS細胞質によって不稔化される維持因子の系（”maintainers”lines）が入手可能でなければならない。雑種穀物生産におけるこのような系の使用は図１に概説されている。慣用的遺伝学によるこれらの系の開発は、最低でも数年の努力を要するゆっくりとした過程であって、且つカナダの主要な商品作物（cash crop）であるcanolaを含む多くの穀類におけるC MSに基づく雑種の生産に主要な障害を現在提示するゆっくりとした過程である。例えば、新たな回復因子系を創造するためには、まず第一に、Rf遺伝子を与える、すでに存在している回復株と受容株との間に一つの雑種を生産することが必要であり；ついで受容株への一連の戻し交雑がその株の他の望まれる性質を変えることなくRf遺伝子を組込むために実施されるが、この過程は遺伝質浸透と名付けられる。多くの世代を経た後でさえ、ドナーDNA上でRfに連鎖したいくつかのドナーDNAは残る。この現象は連鎖牽引（introgression）と名付けられる。このドナーDNAは有害な特性を持ち、受容株の特性を損なう可能性がある(Jean,M．ら、 .,1993,Current Topics in Molecular Genetics，１:195-201)。この過程は間接的選択の一般的な作業によって促進されることができる。すなわち、子孫の植物はまず初めに、回復遺伝子そのものよりはむしろ回復遺伝子に連鎖した遺伝マーカーに関してスクリーニングされる。これらのマーカーは、それらが植物発生の非常に初期の段階でスクリーニングされることができるように選択される。これは、多くの子孫植物を成熟へと成長させるという費用のかかる作業を迂回することになり、遺伝質浸透の過程をかなり加速することができる。制限酵素断片長多型(RFLPs)はこの目的に理想的に適したDNAマーカーの一タイプを示す。RFLPは特異的DNAプローブによって検出される制限酵素断片パターンが（二つの遺伝子型の間で）異なる。回復および維持因子系の間で異なる断片パターンを検出し、Rf遺伝子と共分離するプローブ群は、植物改良プログラムにおける回復遺伝子の間接的な選択に用いられることができる。我々は、目下雑種種子の生産に用いられているcanola(B．napus)におけるCMSの二つの形態の一つであるPolimaまたはpol CMSの回復因子であるRfplに連鎖したいくつかのプローブを獲得している。これらのマーカーのいずれもが、この遺伝子に完全には連鎖していない。このことは，これらを間接的選択へ使用することに不確定要素を一つ導入し一植物中のいかなるマーカーの存在もこの植物における回復遺伝子の存在を保証しない。それゆえ、回復遺伝子を含む植物の間接的選択のためには沢山のマーカーを用いることが必要である。細胞質雄性不稔の核性回復に完全に連合したマーカーが提供されることが、非常に望ましいはずである。この過程は、単離された回復遺伝子の直接的導入によってさらに促進されうる。我々は、我々が同定したプローブは、Rfplと完全な連鎖をしているので、回復遺伝子そのものを検出することができると信じる。発明の概要本発明の目的の一つは、細胞質雄性不稔に関する核性回復のためのマーカーの一つを提供することである。本発明のもう一つの目的は、このような回復因子マーカーとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素相補DNAの使用を提供することである。本発明のもう一つの目的は、この遺伝子を遺伝学的形質転換によって直接的に回復因子系を生産するのに使用することを可能にすることである。本発明に従えば、植物の細胞質雄性不稔の核性回復のために特異的なプローブが提供されるが、該プローブはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素cDNAまたはゲノムDNA配列、そのハイブリダイズする断片（hybrldizing fragment）またはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素の増幅のためのプライマーとして使用されるためにそれらから得られるすべてのDNA配列を含み、前記のDNA配列またはそのハイブリダイズする断片はストリンジェントな条件下で核性回復遺伝子を所有する植物に特有の特異的DNA断片とハイブリダイズする。本発明に従えば、植物における細胞質雄性不稔の核性回復のための遺伝子も提供される。その遺伝子は、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素およびその周囲の配列をコードするDNA配列を含む。この周囲の配列はグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素の配列に対して3’ 末端および／または5’末端に位置しており、約50kbであってよい。本発明に従えば、回復因子系の生産方法をも提供される。その方法は、本発明の細胞質雄性不稔遺伝子の核性回復によって植物を遺伝学的に形質転換する方法を含む。本発明に従えば、植物種における回復遺伝子がGAPCの特異的形態に対応するならば、いかなる植物種も使用することができる。このような植物種は、制限なしに、Brassica napus、他のBrassica種、トウモロコシ(Zea mays)、コメ（Oryza sativum)、ヒマワリ（Helianthus annum）およびサトウモロコシ（Sorghum bico lor)を含む。図面の簡単な説明図1は、雑種種子生産における細胞質雄性不稔(CMS)の使用の略図である。図2は、稔性回復遺伝子Rfp1に完全に連鎖したマーカーを同定するために用いられた交雑を示す。図3Aから3Eは、Brassica napusのcDNAクローンcRF1(配列番号１)の、Sinapisa lba(配列番号２)およびArabidopsis thaliana(配列番号３)由来の細胞質グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(GACP)のcDNAsとの比較を示す。図4は、Rfp1遺伝子について分離した遺伝学的集団におけるBrassica napusにおけるcRF1プローブによって検出された多型を示すゲルを示す。発明の詳細な説明我々は、回復遺伝子が分離してくる集団を生み出す遺伝学的交雑の分析を続けた(図２に概説してある)。いかなる場合においても、交雑の性質は、連鎖したマーカーに関しては、ほとんどの不稔の子孫の個体は交雑の雄性不稔の親に特異的なRFLPを示すのに対して、ほとんどの雄性稔性子孫植物は稔性の親に特徴的なRF LPを示すというものであった。cRF1と命名された新たなマーカーは、この遺伝子に完全に連鎖することがわかった。特に、二つの交雑において試験された175個体のうち稔性の子孫は全て稔性の親の対立遺伝子（または形態）を所有するのに対して、不稔の植物は全て不稔の親の対立遺伝子を持つことがわかった(表1)。c RF1は、ゆえに、回復遺伝子の間接的選択のためのとりわけ強力な道具であることを示す。表１以前の解決法との差異 cRF1とRfp1との完全な連鎖により回復遺伝子の間接的選択のための本プローブの使用における不確定性は実質的には除外された。さらに、Pollmaまたはpol CMS系のためのいかなる回復遺伝子も単離されず、それ故、直接的に遺伝学的形質転換による回復系の生産は可能ではない。このことは、新たな回復因子系（図４）を発生させる際に間接的な選択法をとることによる費用の大幅な削減をもたらすべきである。この多型を検出したDNAプローブはB．napus相補DNA(cDNA)、すなわち、メッセンジャーRNA分子（mRNA）に相補的なDNAである。このcDNAのDNA配列を決定した。ヌクレオチド配列のデータベースの分析は、cDNAの配列が99％Arabldopsis th aliana由来の解糖酵素の細胞質の形態、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素の配列に類似していることを示した(図3Aから3B)。この配列はGAPC遺伝子によりコードされている(Shih，M.-C.et al.，1991，Gene，104:133-138)。回復遺伝子とGAPC多型との間の完全な連鎖は、回復遺伝子はGAPCの特異的形態であるらしいことが考えられる。我々は、異なるB.napusCMS（nap遺伝子）系に関する回復遺伝子が分離したBC1 集団についても同じ種類の分析を実施し、そしてnap回復因子が同じ遺伝子座の異なる対立遺伝子であるにすぎなかったことがわかった。すなわち、GAPCの異なる二つの形態はB.Napusの異なる二つの核性稔性回復遺伝子に対応している。この結果はさらに、他の回復遺伝子がGAPCのイソ型に対応し、GAPCと回復遺伝子の間の関係は他の植物種の他のCMS系に拡張することができることを示唆している。いかなる植物種におけるGAPCと回復遺伝子の間のいかなる関係も、以前に提案されてはいない。ゆえに、この遺伝子により、回復因子特異的GAPC遺伝子を維持因子遺伝子型（回復因子を本来持たない遺伝子型）に導入する遺伝学的形質転換を用いて、単一過程において回復系を構築することが可能になる可能性がある。それはこのような系の発生に必要な植物育成過程における多くの過程を省くので、きわめて費用において効果的なはずである。もしGAPCと回復遺伝子の間の連携が他の穀物種にも拡張されれば、このことは多くの穀類における回復遺伝子の単離と回復因子系の発生への普遍的方法を示す。本発明は以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるだろう。これらの実施例は本発明の範囲を制限するよりはむしろ本発明を例証するために与えられる。実施例Ｉ新たな回復細胞系列の生産における間接的選択マーカーとしてのGAPCプローブの使用三つの植物遺伝子型が考察される。即ち、 A CMS細胞系 B 回復遺伝子を欠き雄性稔性細胞質を含む雄性稔性系 R 回復遺伝子および雄性不稔細胞質を含む雄性稔性系。現有の遺伝学的交雑により生産された系Aと系Bの間の雑種は大きな雑種強勢を示し、AとRの間の雑種は雑種強勢を示さないことが推定される。系Bは回復遺伝子を欠いているため、CMSを用いてこれら二つの系から雄性稔性雑種を生産することは不可能である。しかしながら、もし回復遺伝子が系Rから系Bへ系Bの特性を変質させずに転移されることができれば、CMSを用いて系Aと系Bの間の雄性稔性雑種を獲得することが可能なはずである。伝統的には、このことは遺伝質浸透と呼ばれる方法により実施される。系Rは雌として系Bと交雑され、AとBの間の雄性不稔のF1雑種を生じ、そのF1雑種は雄性不稔細胞質を含み(雑種の細胞質は独占的に雌の親から由来する)、しかしまた雄性稔性でもある。なぜならこのF1雑種は系Rの親から回復遺伝子の単コピーを受容しているからである。ついで第二の交雑（戻し交雑と呼ぶ）が雑種（雌としての）と系Bの間で実施される。成長した多数の子孫が栽培地に存在し、そして同数の不稔と稔性の子孫が期待され、稔性のものは回復遺伝子を有する。一つかそれ以上の稔性子孫が、ついで系Bとの第二の戻し交雑に雌として使用される。稔性の植物が回収され雌として三度目の系Bとの戻し交雑を行われた。この過程は何世代にもわたって繰り返された。新たな個々の世代とともに子孫はより系Bに相似するようになることが期待される(それらが回復遺伝子を所有する以外は)。個々の世代において、系Bに関連する様々な性質が評価されることになる。結局、系Bの望ましい性質を全てまたはほとんどそなえた新たな回復系が生産されることになる。この系は、大規模な系AとBの間の雑種生産に用いられることになる。 GAPCプローブはこの過程を容易にするが、なぜならこれは苗木の段階の子孫植物における回復遺伝子の存在の評価を考慮に入れるからである。DNAが少量の葉の材料から抽出され、HindIII（図４で使用される）などの制限エンドヌクレアーゼによって消化されGAPCプローブを用いて分析される。回復遺伝子に特異的な制限酵素による断片の存在は、実生（seedling）が回復遺伝子を持つことを示唆している。実生の段階にある非常に多数の植物が、栽培地で同じ植物を成熟まで成長させるのに必要な費用より非常に低い費用でスクリーニングされる。さらに、雄性稔性表現型は多くの異なる条件により影響を受け、完全に連鎖した多型に関するスクリーニングによる遺伝子の存在に関するスクリーニングは、この遺伝質浸透の作業により遺伝子の存在をより確実に検出する。実施例II GAPCの回復遺伝子形態の形質転換を介した導入による新たな回復細胞系の生産実施例Ｉの三つの植物遺伝子型が、この方法に従って考察される。この実施例において、課題は正確に実施例Ｉのそれとまったく同じである。すなわち、系Bの特性を改変することのない、系Rから系Bへの回復遺伝子の転移である。この場合においては、しかしながら、我々は回復遺伝子を代表するGAPC遺伝子の形態は単離されており、そして適当な植物であるAgrobacterium tumefaci ensの形質転換ベクターpRD400の中に単離されたDNA断片として入手可能であると推定する(Datla RSS，Hammerlindl JK，Panchuk B，Pelcher LE & Keller W．（ 19 92）Gene 211:383-384)。実施例Ｉで記述された時間のかかる戻し交雑プログラムの代わりに、GAPC遺伝子はAgrobacteriumを介した形質転換によって系Bに転移される。この実施例のために、我々は、系A、BおよびRがBrassica napus系であること、および単離された回復遺伝子が系Rのものと同一であることも推定する。Molon eyら(Moloney，M.，Walker，J．& Sharma，K．(1989)Plant Cell Rep.8:238-242 )によって記載された方法を用いることにより、prRD400ベクターに遺伝子を有するAgrobacterium株が株B実生由来の子葉を接種するのに用いられる。このAgroba cteriumは抗生物質処理により除去され、得られた植物繊維は抗生物質カナマイシンを含む培地に植えられる。pRD400はカナマイシンへの耐性を与える遺伝子を含んでおり、それ故にこの抗生物質培地に成長した細胞群は、おそらくpRD400の中に単離された回復遺伝子と一緒にカナマイシン遺伝子を獲得した。ついで、これらの植物における回復遺伝子の存在が、植物を直接検定し、GAPCプローブを用いた回復因子に特異的な制限断片の存在によって検定された。三つの植物が、もし雄性不稔細胞質を含めば稔性になること、および、系A（雌としての）と新たな形質転換した系との交雑から生じたF1子孫もまた雄性稔性になることが期待される。この方法は二つの異なる利点を持つ：この方法はこの系を開発するのに数年かかるのに対して数ケ月だけしか必要としないため、慣用的な植物改良実験よりもはるかに速く費用もかからない。さらに、回復遺伝子の存在は系Bのゲノムと新たな回復系のゲノムの差異でしかない。すなわち、系Bの特性の完全性は、おそらく、より損なわれにくい。上記の記載は特殊な植物種Brassica napusに関するものであるとはいえ、本発明は、その穀物種の回復遺伝子がGAPCの特異的形態に一致するかぎり他の種にも応用しうる。そのような場合には、形質転換の技術が上記のものと異なる可能性もある。本発明の特定の態様について記載したが、さらなる改変が可能であり、本出願は、本発明のいかなる変形、用途、適用をも含むことを意図していることは理解されようし、そして一般には本発明の原理に従い、また本発明が属する分野における既知のまたは慣用的な実施の範囲にあり、且つ前記の本質的な特性に応用されてよいものとして、そして付属の請求の範囲に従うよう、本発明の開示からの発展を包含する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月２４日（１９９８．７．２４）【補正内容】日本語明細書第12頁を次のとおり補正する（請求の範囲を差し替える）『請求の範囲１．グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする核酸配列またはそのハイブリダイズする断片からなる、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的なプローブであって、上記のDNA配列またはそのハイブリダイズする断片は、ストリンジェントな条件下での核性回復遺伝子を有する植物に特徴的な特異的DNA 断片にハイブリダイズする、前記プローブ。２．配列番号１の核酸を含む、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的なプローブ。３．請求項１または２記載のプローブに由来するプライマーDNA配列。４．核ゲノムDNA中の回復遺伝子を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：ｉ）グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードする核酸配列からなる、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的なプローブであって、上記のDNA配列またはそのハイブリダイズする断片は、ストリンジェントな条件下での核性回復遺伝子を有する植物に特徴的な特異的DNA断片にハイブリダイズする、前記プローブを、ストリンジェントな条件下で核ゲノムDNA配列とハイブリダイズさせ；そして ii）プローブと核ゲノムDNAのハイブリダイゼーションを検出するが、但し、プローブと核ゲノムDNAのハイブリダイゼーションが回復遺伝子含有核ゲノムDNA の指標であることからなる。５．核ゲノムDNA中の回復遺伝子の存在を検出する方法であって、該方法は、以下の工程：ｉ）請求項３記載のプライマーDNA配列を用いて適切な条件下で核ゲノムDNAを増幅し；そして ii）上記プライマーDNA配列を用いて核ゲノムDNAを検出するが、但し、核ゲノムDNAの増幅が回復遺伝子を含有する核ゲノムDNAの指標であることことからなる。６．プローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の核酸からなる、請求項４記載の方法。７．プローブが配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載の核酸からなる、請求項５記載の方法。８．グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードするDNA配列および周辺配列からなり、そして請求項４、５、６または７記載の方法により検出される、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための遺伝子。９．周辺配列がグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素配列に対して３'および／または５'に位置する、請求項８記載の遺伝子。 10．請求項８記載の細胞質性雄性不稔の核性回復により遺伝学的に植物を形質転換することからなる、回復因子系列の生成方法。 11．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項１記載のプローブの使用。 12．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項２記載のプローブの使用。 13．プローブが配列番号２または配列番号３に記載の核酸配列からなる、請求項11記載の使用。 14．植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための、請求項３記載のプライマー DNA配列の使用。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジャン，マルティンヌカナダ国ケベックジー１ブイ・３エックス３，サント―フイ，デラージュ 877 ニュメロ３

Claims

【特許請求の範囲】 1.グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素増幅のためのプライマーとして使用するための、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素cDNAまたはゲノムDNA配列、そのハイブリダイズする断片、またはそれに由来するあらゆるDNA配列からなる、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復に特異的なプローブであるが、但し、上記のDNA配列またはそのハイブリダイズする断片は、ストリンジェントな条件下での核性回復遺伝子を有する植物に特徴的な特異的DNA配列にハイブリダイズする、前記プローブ。 2.グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素をコードするDNA配列および周辺配列からなる、植物の細胞質性雄性不稔の核性回復のための遺伝子。 3.周辺配列がグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素配列に対して3'および/ または5'に位置する、請求項2の遺伝子。 4.周辺配列が約50kbである、請求項3の遺伝子。 5.請求項2の細胞質性雄性不稔の核性回復遺伝子により、遺伝的に植物を形質転換することからなる、回復用系列の生産法。