CZ505985A3 - Vektor zahrnující gen kódující bílkovinu GM-CSF primátů, hostitelská buňka, která je jím transformována, a způsob výroby bílkoviny GM-CSF primátů za jejího použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vektoru, který zahrnuje gen kódující bílkovinu GM-CSF primátů, hostitelské buňky, která je jím transformovaná, - a způsobu výroby bílkoviny GM-CSF..primázů za. jejího použití a rovněž cDNA, která odpovídá výše uvedenému genu.

..Dosavadní stav techniky

Různé typy buněk, které se nacházejí v krvi/ je možno všechny odvodit od základních buněk, které se mohou dále diferencovat. Tyto základní buňky mají dvě funkce: /1/ reprodukují samy sebe, takže udržují populaci základních buněk v těle a /2/ vytvářejí další buňky, které se diferencují do různých zralých typů krevních buněk. Buňka, která se diferencuje určitým způsobem, se nazývá progenitor. Progenitor pro lymfocyty T, lymfocyty B, granulocyty, červené krvinky, destičky a eosinofilní buňky, jakož i nezralé progenitory, které mohou-dávat vznik různým typům zralých buněk byly pokusně studovány jak in vivo, tak in vitro, jak je popsáno například v publikaci Dexter, T.M. 1983 J. Pathology 141 415 - 433. In vitro bylo možno prokázat, Že prolyferace a/nebo diferenciace každého typu progenitoru závisí na specifických faktorech”, které je možno odvodit z různých zdrojů. Například progenitory pro červené krvinky vyžadují přítomnost faktorů, který byl nazván erythropoietin. Faktory, kterých je zapotřebí pro přežití^, prolýferaci a diferenciaci myeloidních progenitorů pro tvorbu zralých neutrofilních granulocytů, monocytů a zralých makrofágů se nazývají faktory, které podporují tvorbu kolonií (CSF).

účinnost těchto faktorů byla velmi důkladně studována u myší. Většina orgánů dospělých myší produkuje látku s účinností CSF. Sloučeniny, ktez ré mají určitou účinnost tohoto typu byly získány z různých tkání a různými způsoby, tyto látky se však-, od sebe poněkud liší svými biochemickými vlastnostmi.

Z tohoto důvodu zůstává strukturní příbuznost různých faktorů zatím neznáma. Mimoto se zdá, že CSF působí pravděpodobně ve více než jednom stupni vývoje gra- 4 í<

nulocytů a makrofágů, přičemž opět není známo, zda z

je jediný faktor zodpovědný za všechny typy účinnosti nebo zda je zapotřebí, aby v každém stupni působil jiný faktor, jak je podrobněji popsáno v publikaci Burgess, A. a Metcalf, D. 1980 Blood 56 ........._ *

947-957.

Látka s účinností lidského CSP byla získána z placenty, některých ^ní plodu, z makrofágů a ze stimulovaných T—buněk. Linie T-buněk (Mo), která vytváří jednu nebo větší počet látek s účinností CSP byla získána z nemocného s leukémií,^ při níž byly zmnoženy určité varianty buněk T (Leukemická retikuloendothelliosa), jak bylo popsáno v publikaci Golde a další 1978 Blood 52 1068 - 1072.

Schopnost CSP stimulovat granulocyty a makrofágy znamená, že farmaceutické prostředky s touto účinností by byX možno klinicky použít v těch situacích, kdyby bylo zapotřebí zvýšit produkci buněk myeloidního typu. Někteří nemocní s velmi vysokými hladinami normálních granulocytů měli ve skutečnosti nádory, které produkovaly příliš veliké mnpžství CSP. V jednom případě došlo po chirurgickém odstranění nádoru k rychlému poklesu počtu granulocytů na normální hladíSuT^což^by^edlO^k^názoruj—------- 5 že tímto způsobem by bylo možno regulovat počet obí— '·-- bájících granulocytů. ..Tento, názor byl vysloven také v publikaci Hocking, W., Goodman, J., a Golde D.,

Blood 61 600 (1983). Farmaceutické prostředky s obsa- 3 hem CSP je možno užít klinicky při léčbě potlačení ;

dřeně, která je způsobena po ozáření nádorů nebo při chemické léčbě těchto nádorů, Mimoto farmaceutické prostředky s obsahem CSF by mohly být užitečné při léčbě těžkých infekcí, protože CSP může zvýšit počet granulocytů a/nebo monocytň a/nebo může tyto elementy aktivovat.

Z

Existují různé typy známé účinnosti

Z r

CSP, včetně granulocytární účinnosti (G-CSF), učiňz nosti na makrofágy (M-CSF), účinnosti na granulocyty z

i makrofágy (GM-CSF) a účinnosti na větší počet těchto buněk. Vynález se zvláště zabývá otázkou výroby GM-CSF. Bílkoviny tohoto typu již byly izolovány z různých živočišných zdrojů, vynález se však zvláště týká výroby CSP ^savců, zvláště člověka a opic.

„ .. ------ BiQiogxeké ^a^_ biochemické-studie látek s účinností CSF byly až dosud brzděny skutečností, že jednak bylo těchto látek k dispozici velmi milé množství, zvláště pokud jde o CSF lidí a/nebo dalších primátů, jednak byly tyto látky nečisté. Je zřejmé, že by bylo žádoucí přesně identifikovat bílkovinu t* z nebo bílkoviny, které jsou nositel,^ účinnosti CSF.

Dále by bylo žádoucí získat stálý zdroj CSF, s výhodou primátů a zvláště člověka, tak, aby bylo možno snadno získat tyto bílkoviny-ve větším množství a s čistotou, která je dostatečná pro zjištění biologických a biochemických vlastností těchto látek, aby Jí je pak bylo možno použít k léčbě.

V poslední době byla vyvinuta technika molekulárního klonování, která dovoluje klonovat sled nukleotidů, který je kádem pro bílkoviny a tak získat bílkovinu ve větším množství při vhodné volbě hostitele a vektoru, jak bylo popsáno v fcxiJa publikaci Maniatis, T. Molecular Cloning - Δ Laboratory Manuál Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν.Σ. 1982. Bílkovinu je možno izolovat a čistit běžnými způsoby. Způsoby klonování, které by-r ly až dosud použity je možno obecně rozdělit na tři skupiny: (1) způsoby, které jsou založeny na znalosti struktury bílkoviny, například na znalosti sledu aminokyselin, (2) způsoby, založené na identifikaci bilk koŤiny, jejíž expresi došlo při použití klonovaného genu použitím protilátky, specifické pro tuto bílkojr-inu-a—í-3-)—půsjohy-,, založené na identifikaci RNA,______ kterou je pak možno podrobit translaci za získání bílkoviny, pro niž je kódem uvedený gen. ·- Všechny tyto způsoby jsou velmi nesnadné v případě, že bílkovina, například CSP je k disposici ve velmi malém množství. Znamená to, že v případě, že je nesnadné získat dostatečné množství čištěné bílkoviny, je také nesnadné stanovit sled aminokyselin této bílkoviny nebo alespoň část toýČhoto sledu. Identifikace bílkoviny pi expresi vazbou na protilátku se s výhodou provádí při použití monospecifického polyklonálního antiséra s vysokým titrem. Toto antisérum však rovněž nelze získat bez většího množství čisté bílkoviny, kte% se užije jako angigen. Monoklonální protilátka poskytuje alternativní přístup, avšak požadovaná protilátka se také velmi nesnadno získává bez vhodného antigenů a mimo to monoklonální protilátka nemusí reagovat s bílkovinou ve formě, v níž u této bílkoviny došlo k expresi při dostupném systému hostitele a vektoru. Mimo to k translaci RNA - za získání- identifikovatelné bílkoví- - ny je zapotřebí, aby požadovaná RNA byla přítomna ve zdroji RNA v dostatečném množství, aby ji bylo z

možno oddělit. Relativní dostatek RNA, která je kódem pro určitou bílkovinu, jde obvykle ruku v ruce * e · • ·

ft s dostatkem proteinu, takže je možno říci, že protein vyskytující se v malém množství je obvykle kódován. mRNA, která se vyskytuje rovněž v malém množství.

Buněčná linie Mo byla užita jako výchozí materiál pro čištění lidského CSF a také pro identifikaci odpovídajících typů mRNA. Avšak i při použití tohoto poměrně dobrého zdroje CSF je nesmírně nesnadné izolovat dostatečné množství uvedené bílkoviny pro strukturální studie.

Podstata vynálezu

V

A.

Č í;

« Vynález překonává problémy dosavadního stavu techniky tím, že poskytuje dobrý zdroj bílkoviny s aktivitou CSF, za použití genového inženýrství. Pro klonování cDNA. kódující protein s aktivitou CSF lze použít nový způsob klonování, pro který je nutný,pouze test aktivity CSF. Vhodné metody pro měření CSF jsou popsány dále v příkladu 2.

Vynález tedy popisuje vektor zahrnující gen kódující bílkovinu GM-CSF primátů, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. I za šipkou pro CSF-Thr, CSF-Ile nebo CSF-G, nebo její aleiické nebo jiné funkční ekvivalenty, zachovávající si aktivitu GM-CSF v restu na lidské kostní dřeni, ve kterých je alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena nebo odstraněna. Vynález rovněž popisuje cDNA. kódující bílkovinu s aktivitou CSF (tedy CSF/cDNA), mikroorganismus nebo buněčnou.....linii .. (hostitelskou buňku) , transformovanou rekombinantním vektorem obsahujícím takovou CSF/cDNA a způsob výroby bílkoviny' GM-SCF primátů pomocí exprese CSF/cDNA., při kterém se kultivuje výše uvedený mikroorganismus nebo buněčná linie. Jelikož je tato bílkovina produkována buňkou podle vynálezu, je jisté, že se jedná o bílkovinu· vykazující aktivitu CSF. Vektor pro transformaci obsahující CSF/cDNA lze připravit a izolovat ná^rďdůjTcím způsobem, při kterém se:

r r ι* f

připraví RNA z buňka, která produkuje CSF;

z uvedené RNA se připraví polyadenylovaná mRNA;

z uvedené mRNA se připraví cDNA s jednoduchým řetězcem; tato cDNA s jednoduchým řetězcem se převede na cDNA s dvojitým řetězcem;

tato cDNA s dvojitým řetězcem se včlení do vektoru pro transformaci a tímto vektorem se transformují bakterie za vzniku kolonií;

spojí se vždy 200 až 500 kolonií a z každé skupiny kolonií se izoluje plasmidová DNA;

plasmidovou DNA se transfektují vhodné hostitelské buňky pro expresi bílkoviny CSF;

tpansfektované buňky se kultivují a u .supernatantu se testuje aktivita CSF; a vyberou se vzorky pozitivní na CSF a kolonie použité pro vytvoření pozitivních vzorků se zkoumají pro zjištění, která kolonie vykazuje aktivitu CSF.

Tyto bílkoviny CSF jsou růstové a diferenciační hormony pro buňky myeloidního systému. Jsou určeny například pro klinické použití pro léčení myelosuprese, zejména v případě (symptomatické) granuiocytopenie po chemické léčbě nádorů nebo léčbě nádorů ozařováním.

Popis obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje sled (sekvenci) DNA, který je kódem pro bílkovinu CSF. Úplná sekvence DNA kóduje lidský CSF; Změny“uvedené u lidského' sledu^-' jsou' rozdíly/ kzeré odlišují tento sled od sledu opice

- 11 Gibbon. Znázorněn je rovněž sled aminokyselin, který vzniká při použití uvedeného sledu SNA.

Na obr. 2 je schematicky znázorněn způsob výroby plasmidu pTPL z plasmidu pAdS26SVpA(3).

* __ Obr. 3 je schematický pokračováním v

ňbr. 2 a znázorňuje způsob výroby plasmidů p91023 z plasmidu pTPL.

I- . Obr. 4 je schematickým pokračováním v

obr. 3 a znázorňuje plasmid p91O23(B).

Sále bude uvedeno vysvětlení některých pojmů k usnadnění porozumění způsobu podle vynálezu. Pokud by se á* rozjísah definice odlišoval od běžného rozsahu v oboru, bude to dále uvedeno.

Amplifikace nebo pomnožení znamená * pochod, při němž buňka produkuje opakovaná; genu s vlastní chromosomální SNA.

CSF je látka s b^iogickým účinkem, í’ která je dále definována metodami stanovení.

Bílkovina CSP je bílkovina z primátů, která má účinnost CSP. Pro potřeby vynálezu je pojem CSP jako bílkovina užíván i pro modifikované bílkoviny CSP, alelave variace bílkoviny CSP a pro tuto bílkovinu i v případě, že je před její řetězec zařazen zbytek MET

Směrem dolů znamená směrem ke 3 -zakončení nukleotidového sledu.

Sled, podporující reakci je nukleotidový sled, který může způsobit potenciaci transkripce genu nezávisle na své poloze vzhledem k tomuto genu nebo na orientaci sledu.

Gen je sled deoxyribonukleotidů,

Z Z který je kódem pro danou bílkovinu. Pro účely vynálezu gen nemá obsahovat oblasti, které jsou pro translaci zbytečné, například signální sledy, póly adenylové řetězce, promotory nebo podpůrné sledy.

Vazba je způsob, při němž dochází z

ke tvorbě iosfodiesterové vazby mezi 5 -zakončením

Z .

a 3 -zakončením dvou řetězců DNA. Vazbu je možno provést několika známými způsoby při použití enzymů včetně T4 ligázy.

- ... Orientace je pořadínukleotidůve— sledu DNA. Převrácená orientace sledu DNA je takoZ z vá orientace, při níž je pořadí 5 - a 3 -zakončení jednoho sledu obráceno vzhledem k tomuto pořadí ve druhém sledu. Toto uložení je důležité pro

- 13 transkripci dalšího sledu DNA ve zdroji DNA nebo pro replikaci vektorů, které obsahují uvedený sled.

Transkripce je syntéza SNA z původní

DNA.

Transformace znamená změnu genotypu v v/ buňky tím* že buňka přijme cizorodou DNA. V některých případech je možno transformaci prokázat změnou v v fenotypu buňky. Transformované buňky se nazývají trans v >

formanty, buňky před transformací jsou původní buňky.

Translace je syntéza polypeptidů z mRNA.

z

Účinnost CSF je možno získat z velkého počtu buněčných zdrojů včetně prostředí, v němž v

se nacházejí mononukleární buňky periferní krve, z plicní a placentární tkáně, z kostní dřeně, z moči nemocných, který trpí chudokrevností, z krevního sera a z normálních a neoplastichých linií T-lymfocytů a monojáiukleárních fagocytů. Jednou buněčnou linií, která produkuje CSF je linie Mo. 6SF, produkované touto buněčnou linií je znám jako CSP pro granulocyty a makrofágy (GM-CSF), jde o lidský CSF.

Jeden zdroj CSF opice Gibbon je linie T-buněk, která je označena jako UCD MLA-144. Tato buněčná linie byla uložena ve sbírce ATCC, odkud je možno ji získat pod číslem uložení; =

Aby bylo možno izolovat klon CSP. podle vynálezu, bylo nutno použít nového způsobu, který vyžaduje zejména stanovení účinnosti CSP.

v

Nejprve je nutno identifikovat buňku, která produV · kuje CSP, například T-lymfocyty nebo jiné buňky, jak bylo uvedeno svrchu. Pak se izoluje mRNA této v

buňky. S výhodou se užívá T-lymfocytů. V tomto případě s mRNA, která je vázána na membránu a obsahuje ,bC>s ra-ENA pro lymfokiny/oddělí od volné mRNA v hunkách.

í

Tímto oddělením se obohatí izolovaná mRNA 5 až lOkrát o sled, který je nutný pro výrobu lymfokinů a tím se snižuje námaha, vynalezená na identifikaci příslušného klonu. Pak se připraví chromatografií na oligo dT celulosá polyadenylová mRNA.

Z mRNA še připraví skupina cDNA při použití vektoru, vhodného pro přenesení do hostitele z

k expresi požadované bílkoviny s účinností CSP.

Pák se připraví cDNA použitím standardních způsobů ze svrchu získané mRNA. Hybridní RNA/cDNA se pak převede na cDNA s dvojitým řetězcem a tento materiál je pak možno včlenit do vhodného vektoru .

- 15 Vhodný systém hostitele a vektoru pro isolaci klonu CSF je založen na expresi cDNA ve vhodném vektoru pro transformaci. Vhpdným vektorem pro transformaci může být vektor, získaný přechodným včleněním DNA do buněk Ssavců způsobem podle publikace Mellon, Ρ., V. Parker, Y. Gluzman,

T. Maniatis 1981 Cell 27 279 - 288. Aby bylo možno ( isolovat požadované transfořmanty CSP, není nutné, v

aby všechny buňky populace stabilně obsahovaly exogenní geny , které by bylo možno využít k expresi požadovaného CSF jako produktu. Je možné přechodně včlenit exogenní geny do subpopulace buněk tak, aby tato subpopulace produkovala požadovanou bílkovinu alespoň několik dnů. Protože není zapotřebí užít další látky k označení podle vynálezu, může dojít k tomu, že exogenní DNA se ztratí při buněčném růstu v průběhu jednoho až dvou týdnů. Avšak dva až tři dny pro přenesení do vhodných buněk ^savců je možno produkty nalézt a prokázat.

Systém hostitel a vektor, který je vhodný pro toto použití je buněčná linie opic CV-1, transformovaná působením defektwní molekuly DNA SV40 jak bylo popsáno v publikaci Gluzman, Y., Cell 23 lV5~-~l8^y—198l·.—Transf ormované-opiči_bunky.^CV-l_,_______

- 16 které obsahují defektwní SV-40 DNA jsou označovány COS (CV-1, defektwřní, SV40), tyto buňky neobsahují uplnou kopii genomu SV—40, avšak produkují vysokou urovefil velkého antigenu T a dochází u nich k replikaci SV40 DNA. Tyto buňky také podporují replikaci

SV40, které chybí na začátku některé části a bakteriálního plasmidu, který obsahuje SV40 podle publikace Myers, R.M. a Tjian, R. 1980 ENAS ££6491 - 6495.

Tento systém tedy představuje prostředek pro amplifikace přenesené exogenní DNA přes SV40 za zvýšení hladiny mRNA a bílkoviny,^ýejíž expresi dochází za přítomnosti exogenní DNA. Je však možno užít i podobné systémy.

Vekt/ojy, užité k expresi CSíý typi<

ky obsahují další pomocné části jako podpůrné slftdyu, promotory, introny, pólyadenylováná místa, 3 -nekod<£f oblasti a aktivátory translace, jak bude dále podrobněji vysvětleno.

, Vektory mphou obsahovat >e-dy. Podpůrné sledy se odlišují od promotoru, avšak mají s ním podobný účinek. Jejich funkce na buněčné úrovni není ještě dobře známa, avšak jejich jedinečnou vlastností je schopnost aktivace nebo potenciace transkripce bez závislosti na jejich poloze nebo

- 17 i

Μ t

e

1* p

Γ· *

orientaci. Promotory musí hýt uloženy směrem vzhůru, kdežto podpůrné sledy mohou být uloženy směrem vzhůru od 5 -zakončení promotoru, uvnitř genu jako intrnn nebo směrem dolů mezi genem a polyadenylováným místem nebo 3 —zakončením polyadenylovaného místa. Promotory s převráceným sledem nejsou funkční, avšak převráce_r /-ceně podpůrné sledy jsou účinné. -Podpůrné., sledy mají vliv na promotory pouze v tom případě, že jsou přítomny na tomtéž řetězci DNA. Jejich úloha je podrobněji vysvětlena v publikaci Khoury a další, Cell 33. 313 - 314 (1983).

Výhodné podpůrné., sledy/pro použití v buňkách/ Ssavců je možno získat z živočišných vitu, například z opičího viru 40, z viru polyomu, z viru papillomu skotu, z retroviru nebo adenovitu. Ideální ot je, aby podpůrný sled byl odvozen od viru, pro který v

je buňka hostitele propustná, t j. z viru, který normálně infikuje buňky tohoto hostitele. Pedpůxaé-_sle-dy z virů / je možno snadno získat z virů běžně dostupných ze sbírek. Oblasti podpůrných „sledů z některých virů, například z viru Rousova sarkomu a opičího vitu 40 jsou dobře známy, jak bylo popsáno v publikaci See Lučiv a další, Cell 33. 705 - 716 (1983) —Je rutinním-postupem -/-molekulárni^bielogie vyjmout

- 18 tyto oblasti podle známých map pro působení restrikčních enzymů pro jednotlivé viry a v případě potřeby _ modifikovat tyto oblasti, aby bylo možno včlenit podpůrnýsled do vektoru požadovaným způsobem. Tyto postupy jsou popsány například v publikacích Kaufman a další, J. Mol. Hbl., 159. 601 - 621 (1982) a Mol. Cell Biol. 2 (11), 1304 - 1319 (1982). Je také možno postupovát tak, že se podpůrný sled syntetizuje z údajů, které jsou o sledu známy. Jředpůmé sdedy z vitů obsahují obvykle méně než 150 párů baží a jsou dostatečně malé, aby je bylo možné syntetizovat.

Další součástí vektoru by měl být pólyadenylováný sled. Jde o sled DNA, který je uložen směrem dolů od přenášené oblasti genu, obvykle těsně pod místem, v němž se zastavuje transkripce. Přidává^ se obvykle adenin^ribonukleotid^čímž vzniká polyadenir nukleotidové zakončení na 3 -zakončení mENA. Polyadenylace je důležitá pro stabilizaci mBNA proti dev gradaci v buňce, která může snížit množství mBNA a “ tím také množství výsledné^- bílkoviny. ·—··—Eukaryátická polyadanilová zakončení jsou dobře známa. Hexanukleotid 5 -AAUAAA-3 se nachází lí až 30 nukleotidů od místa, v němž polyadenylace už začíná. Sledy DNA, které obsahují polyadenylo- 19 trvaný sled, je možno získat z virů podle fax publikovaných zpráv. Polyadenylovaný sled je možno získat například z -niéát-ho beta-globinu a z opičího viru 40, avšak polyadenylováná místa, izolovaná z virů jsou výhodnější. Protože tyto sledy jsou známé, je možno je syntetizovat in vitro a navázat na vektory běžným způsobem.

Sled, který odděluje polyadenylovaný sled od kodonu, v němž/ se zastavuje translace, je s výhodou no-přenášenjr-sied-DNÁ, například eukar^atický gén bez promotoru. Protože promotor není přítomen, k expresi sledu nedojde. Tento sled by měl být do4 statečně dlouhý, řádu až přibližně 1000 baží od kodonu pro ukončení translace k polyadenylovánému sledu. Tento 3 - afrpřeaášený sled má obvykle za následek zvýšení výtěžku výsledného produktu. Vektor může končit přibližně 30 párů baží směrem dolů od polyadenyl o váného sledu, je však výhodnější zachovat 3 -sledy, které se nachází směrem dolů od polyadenylovaného sledu v jejich původní formě. Jde o sle0 dy, které mají obvykle 200 až 600 pár^. baží smetem dolů od polyadenylováného sledu.

Přítomnosti intronů v nepřenášené-.

části vektoru může rovněž zvýšit výtěžky výsledného produktu. Tyto introny je možno získat i z jiných - zdrojů než-z buňky hostitele nebo z genjá/ýUe například možno užít hybridní intron, který se izoluje z adenoviru nebo z genu pro imunoglobulin, včleněného směrem dolů od místa pro počátek transkripce v adeno— viru, čímž je možno zvýšit výtěžek výsledného produktu.

Při výhodném provedení způsobu pro klonování CSP a pro konstrukci vektoru pro expresi je možno užít aktivačního genu pro translaci. Akt iz vátory translace jsou geny, které jsou kódem pro bílkovinu nebo pro SNA, které ovlivňují translaci požadované mRNA. Nejlepším příkladem je gen, který je spojený s xxxsn adenovirem (VAVAI), u tohoto genu dochází k transkripci a interakci se sledem v 5 -aepřená&ané oblasti mRNA adenovitu, jak bylo popsáno v publikaci Thimmappaya a další, 1982 Cell 3 543. Potřebné sledy pro aktivaci ttanslave působením VA RNA leží v oblasti vedoucího sledu mRNA adenoviru. Tento sled pochází . z genomu adenoviru a nachází se po transkripci v — z

blízkosti 5 -zakončení. VA RNA může aktivovat translaci mRNA. Vektory pro klonování a expresi cDNA tedy s výhodou obsahují tuto formu genů z genu adenoviru

VA.

Tyto vektory mohou být syntetizovány známým způsobem. Složky vektorů, například ' podpůrné- sledy, promotory a podobně je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat, jak bylo uvedeno svrchu. Zásadně v případě, že tyto složky je možno naípézt v DNA, kterou je možno získat ve velkém množství, například jako složku virů nebo je-li možné tyto složky snadno syntetizovat, pak je možno tyto složky snadno získat při použití restrikčních enzymů a tím získat i velká množství vektorů tak, že se pěstuje organismus, který je zdrojem DNA, DNA /se rozštěpí příslušnou endonukleásou, fragmenty se oddělí, fragment s obsahem hledaného sledu se identifikuje a izoluje. Obvykle se vektor pro transformaci získá v malém množství a pak se naváže na vhod¹ ný vektor pro syntézu, u něhož dochází k autonomní replikaci například, na pxokarycfcicky plasniid nebo na fág. Ve většině případů je možno užít plasmý pB322 jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Kaufmana a dalších.

Vektory pro syntézu jsou užity ke klonování vektorů pro transformaci běžným způsobem, například přenesením do prokaryotického organismu, replikací vektoru pro syntézu za získání vysokého počtu kopií s následnou izolací tohoto vektoru rozštěpením buněka izolací tohoto vektoru z buněčné drti.

4·

Vekt/ory s obsahem cDNA, připravené z buněk, které produkují látky s účinností CSF se pak přenesou do E. coli a pěstují na plot=· nách v Fetriho miskách v množství přibližně 2000 kolonií v misce. Pak se kolonie přenesou na nitrofl

Z Z V celulozovy filtr a filtr se přenese na novou plotnu, která se uchovává jako vzorek. Po vypěstování koýlonií se tyto kolonie pomnoží a srovnávají se z

s původními koloniemi tak, aby úseky filtrů bylo í možno identifikovat s odpovídající částí plotny, užité jako vzorek.

z

Každý filtr se rozřeže na úseky, které obsahují předem stanovené počty kolonií, s výhodou přibližně 200 až 500 kolonií na usek.

z

Kolonie z každého useku se přenesou do živného ,, *#· prostředí, například do L-bujonu, Jí bakterie se ¹ oddělí odstředěním a izoluje se plasmidová DNA. Plasmidová DNA z každého useku filtračního papíru se přenese do vhodného hostitele k dosažení exprese bílkoviny. Výhodným vektorem pro syntézu je

- 23 Á mutanta pXsmidu pBR322 z E. soli, v němž byly vyv nechány sledy, které poškozují eukaryotickó buňky, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené citaci Kaufmana a dalších. Při použití této mutanty odpadá potřeba i zničit zbytek plasmidu před přenesením. Po vypěsto-r vání buněk po transfekci se prostředí zkoumá na pří-kladnost látek s účinností 6SF. Positivní výsledek z

’ ukazuje na to, že ve zkoumaném useku filtru se nachází kolonie, která obsahuje CSP/cDNA.

Aby byli možno stanovit, který z klonů useku filtru obsahuje CSP/cDNA, je zapotřebí z

vypěstovat každý klon z useku filtru. Kultury se pak uloží do matrice a připraví se směs každé horizontál ní řady a každého vertikálního sloupce matrice. Z těchto směsí se připraví vzorky DNA a provede se transfekce do hostitelských buněk k dosažení exprese. Supernatanty, získané tímto způsobem se znovu z

zkoumají na účinnost CSP. V obvyklém případě má tuto účinnost jedna směs vertikálního sloupce a jedna směs horizontální řady. Společný klon pak obsahuje CSP/cDNA. V případě, že matrice obsahuje více než jeden pozitivní klon, je pozitivní více než jeden sloupec a více než jedna řada. V tomto případě je ft

zapotřebí dále roztřídit malé množství klonů, u nichž by přítomnost CSF/cDNA padala v úvahu.

CSF/cDNA se z klonu izoluje pomocí restrikčních enzymů a známým způsobem je možno zjistit sled. Je zřejmé, že popsaný postup je možno použít k získání CSF/cDNA. z jakéhokoliv zdroje. Úplný sled je znázorněn na obr. 1 současně s předpokládaným, sledem aminokyselin bílkoviny, která je produktem po translaci..

Sled DNA, který je kódem pro bílkovinu s účinností CSF, tak, jak je znázorněn na obr. 1, může být modifikován běžným způsobem, čímž je možno získat pozměněný výsledný protein CSF, který stále má požadovanou účinnost při testech. Je například možno jednu, dvě, tři, čtyři nebo pět aminokyselin nahradit jinými aminokyselinami. V belgickém patentovém spisu č. 898 016 se popisuje typický způsob náhrady cysteinu například serinem. t

CSF/cDNA podle vynálezu obsahuje úplný gen, kterému předchází kodon A.TG a CSF/cDNA, který je kódem pro aleiické variace bílkoviny CSF. Jedna aleia je znázorněna.na obr. 1. Další alela, která byla nalezena při práci na vynálezu má thymidinový zbytek v poloze 365 místo cytosinového zbytku, který je znázorněn na obr. 1. Bílkovina CSF, získaná podle vynálezu, zahrnuje také 1-methioninový derivát (Met-CSF) a aleiické variace bílkoviny CSF. Úplná bílkovina CSF, tak, jak je znázorněna sledem na obr. 1, začíná sledem Ala-Pro-Ala-Arg..., jehož začátek je označen šipkou po nukleotidu v poloze 66 na obr. 1. V případě Met-CSF začíná tato· látka sledem Met-Ala-Pro-Ala-Arg... . Aleiické variace, znázorněná na obr. 1, obsahuje Thr v poloze 100 (zbytek začíná u Ala za šipkou) a je možno ji označit jako CSF (Thr). Jiná variace má zbytek Ile v poloze 100 a je možné ji označit jako CSF (Ile) . Pro· úplnost zde uvádíme, že zde používaná zkratka CSF-G označuje GM-CSF gibona.

* i ♦

- 25 Γ -* · řř re r * * ♦ r * * * t · » ř« » * » » e e · *

Čištěná bílkovina CSF má specifickou účinnost (aktivitu) alespoň 10⁷ jednotek na mg bílkoviny a s výhodou alespoň 4xl0⁷ jednotek na mg bílkoviny, při provádění testu účinnosti na buňkách lidské kostní dřeně.

Systémy hostitel-vektor pro expresi CSF mohou být prokaryotické nebo eukaryotické, avšak vzhledem ke komplexnosti CSF je výhodnějším systémem pro expresi systém ze savce. Exprese se snadno dosáhne transformací prokaryotických nebo eukaryotických buněk vhodnýmvektorem pro CSF. .....

Sled DNA, získaný výše uvedeným způsobem, může být exprimován přímo v buňkách savce za řízení vhodným promotorem. Je možno užít heterologní promotory, které jsou v oboru dobře známy.

Aby bylo možno dosáhnout exprese CSF v prokaryotických buňkách nebo buňkách kvasinek, je nutno odstranit vedoucí sled (sled pro sekreci). Poloha kodonu pro N-zakončení úplného proteinu CSF je znázorněna na obr. 1. Jakmile se získá požadovaný klon CSF/cDNA, je možno užít příslušné známé prostředky k dosažení exprese bílkoviny CSF, například včlenění do příslušného vektoru, přenesení vektoru do příslušné buňky hostitele, selekce a transformace buněk a pěstování transformovaných buněk k dosažení exprese CSF.

Takto získaná bílkovina CSF může mít methioninový zbytek na N-konci bílkoviny (jde tedy o Met-CSF). Úplné maturované (zralé) bílkoviny, produkované prokaryotickými a eukaryotickými buňkami budou mít sled aminokyselin popřípadě totožný, avšak eukaryotické buňky mohou produkovat produkt, který bude do určité'míry jinak giykosylovaný než původní přírodní produkt.

Bílkovina CSF, k jejíž expresi došlo v příslušných prokaryotických nebo eukaryotických buňkách může být izolována a čištěna způsoby, které jsou v oboru známy. Dále je popsán nový způsob čištění, který umožňuje získat bílkovinu ňČsF^zTůre 1<οηΰ3ΊίΈΰΚΠΐΐούΓ~ί^pfírodurch~zdro j ů ve vyso-k-é----čistotě a s vysokou aktivitou.

26-28

Tento způsob odstraňuje problémy, dříve spojené s izolací a čištěním bílkoviny s účinností CSF. Bílkovina CSF, získaná tímto způsobem, má specifickou aktivitu alespoň lxlO⁷ jednotek na mg bíloviny, s výhodou alespoň 2xl0⁷ jednotek na mg bíloviny, zvláště 4xl0⁷ jednotek na mg bíloviny, při testování na buňkách lidské kostní 'dřeně.

Při práci uvedeným způsobem se bílkovina CSF čistí následovně: bílkovina se vysráží síranem amonným, přidávaným do vysycení na 80 %, čímž se získá peleta bílkoviny CSF, .

která se znovu suspenduje v roztoku pufru při pH 6 .až 8 a takto získaný roztok se nanese na vrchol chromatografického sloupce, sloupec se promývá pufrem s obsahem chloridu sodného a¹ odebírají se frakce s aktivitou CSF. Účinné frakce se slijí, nanesou se na sloupec C4 v reverzní fázi a sloupec se vyjímá postupně zvyšovaným množstvím acetonitrilu v koncentraci 0 až 90 % k získáni účinné frakce.

Popis čištění v souvislosti s vyobrazením

Na obr. 5 je znázorněna analýza čištěné bílkoviny CSF (SDS-PAGS) .'

Bílkovina CSF, která má být čištěna výše uvedeným způsobem, může být získána z libovolného z.přírodních zdrojů popsaných výše jako výchozí zdroje pro genové inženýrství. Jedná se o řadu buněčných zdrojů včetně kondicionovaného média, například buněčné linie Mo nebo buněčné linie UCD MLA-144 gibona.

...... -BiiKovina- -CSF- může - být - -produkována také --za- použití genového inženýrství, jak je popsáno výše.

Výše uvedeným způsobem lze tedy čistit bílkovinu CSF z jakéhokoliv zdroje. Postupuje se tak, že se prostředí s výhodou zahustí ultrafiltrací na koncentraci bílkoviny alespoň 0,1 mg bílko- 29 viny/ml. Bílkovina se pak vysráží přidáním síranu amonného do nasycení 80 Výsledná peleta se znovu uvede v suspenzi ve vodném roztoku pufru o pH 6 až

8. Příkladem vhodných pufrů mohou být Tris-HCl,

HEPES, citronan sodný a podobně.

Roztok v pufru se podrobí dělení chromatografií na sloupci. Vhodným materiálem pro v z použití v tomto sloupci je například oktylspharosa, DEAE-ultrogel, AcA44-ultrogel, AcA-54 ultrogel, a podobně. Je možno užít jeden nebo větší počet těchto materiálů po sobě k získání větší čistoty výsledné látkyv

Z každého sloupce se odebírají z

frakce a tyto frakce se zkoumají na účinnost CSP. Účinné frakce se slijí a zředí se kyselinou trifluoroctovou (TPA), kyselinou heptafluormáselnou (HPBA) a podobně, a materiál se nanese na sloupec z

C4 v reverzní fázi. Sloučenina s účinností CSP se pak vymývá při použití stoupajícího množství acetonjíitrilu od 0 do 90 % v TPA nebo HFBA, s výhodou v koncentraci 0,10 /o až 0,15 fy objemových, v závislosti na použité kyselině.

- 30 Frakce s/ účinností CSF se analyzují na SDS polyakrylamidovém gelu elektroforézou, užije se gel o koncentraci 13,5 %, jak bylo popsáno v publikaci Lammli, U. Nátuře 227. 680 (1970). Je možno užít ještě další postupy k dosažení homogennější v

bílkoviny CSF. Čištěná bílkovina CSF po frakoionaci elektroforéaou na SDS-polyakrylamidovém gelu poskytla heterogenní bílkovinu CSF s molekulovou hmotností v rozmezí 15 000 až 26 000 jednotek. Tato zjevná heterogenita je následkem veliké glykosylace bílkoviny a je běžnou vlastností glykoproteinu. Při frakcionaci méně čistého vzorku z buněk Mo stejným způsobem s analýzou bílkoviny prokázala přítomnost další bílkoz viny s účinností CSF, jejíž molekulová hmotnost byla 28 000 až 30 000 jednotek.

z

Látky s účinností CSF se váží a znov z P * vu uvolňují z oktylseyarp4y, DEAE ultrogelu a sloupce C4 v reverzní fázi. Přibližně 60 % účinnosti CSF se váže na Con-A sepharosu (40 % prochází bez zachyť X cení) a je možno tuto látku pak vymýt methylmannosidem.

Analýza molekulové hmotnosti rekombinantní CSF gelovou filtrací v prostředí s nízkým obsahem solí prokazuje, že přibližně 30 účinnosti i/ tvořené sloučeninou s molekulovou hmotností 19 000 je homogenní, avšak 70 % materiálu se chová jako dimer, takže se vymývá v poloze, která odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 38 000. V případě, že se do sloupce přidá chlorid sodný v koncentraci ÍM, vymývá se veškerá účinnost v širokém vrcholu, který odpovídá sloučenině s molekulovou hmotností přibližně 19 000 jednotek.

Čištěná bílkovina CSF je stálá alespoň 16 hodin při teplotě 4 °C a pH 7,4 v 4M guanidin hydrochloridu, v 10 mM ESTA, lOwM 2-merkaptoethanolu a v 30ýe (objemová procenta) ethanolu)** Látka s účinností CSF je stálá také v 0,lýo kyselině trifluoroctové při pH 2,0 a 0,lýo kyselině trifluoroctové s 25 % objemovými acetonitrilu.

Jak ji/ bylo uvedeno, bílkovina CSF, získaná způsobem podle vynálezu je určena pro použití k léčbě utlumu dřeně, například při (sympromatické)granulocytophenii, která může být způsobena léčbou nádorů chemicky nebo ozářením. Mimo to je možno bílkoviny CSF , vyrobené způsobem podle vynálezu použít k léčbě těžkých infekcí. K tomuto použití se užije dávka 200 až 1000 mikrogramů denně. Bílkovina

- 32 CSP se s výhodou podává nitrožilně’ spolu s vhodným farmakologickým nosičem. Příkladem vhodného nosiče může být roztok chloridu sodného a lidský sérový albumin v roztoku chloridu sodného.

Mimo to má bílkovina CSP, vyrobená způsobem podle vynálezu ještě další účinky a další použití. Bylo například prokázáno, že CSP myší aktivuje neutrofily. Bylo by možno očekávat, že CSP primátů, získaný způsobem podle vynálezu bude rovněž aktivovat neutrifily. Fyziologické funkce této bílkoviny j-sou tedy mnohotvárné. V kostní dřeni může tato látka podporovat vývoj a diferenciaci buněk, které zajištují obranu, na periferii pak aktivuje v

nové i existující buňky. Při místní imunologické reakci může CSP způsobit nahromadění nebo nepřítomnost neutrofilů v zanícené oblasti. Nevhodná lokalizace a/nebo aktivace neutrofilů může být jednou z příčin patofyziologie různých poruch imunologického systému, například reumatoidních arthritid.

......... ....... Vy_náie2 bude dále^- osvětlen v sou- vislosti s příklady, kteéé jsou určena pouze k osvět lení, nikoliv však k omezení způsobu podle vynálezu a znázorflují, jak je možno prakticky provádět způsob podfe vynálezu.

- 33 Pokud není uvedeno jinak, jsou všech ny teplotní údaje v příkladové části přihlášky uvedeny ve stupních Celsia.

Restrikční endonukleázy jsou užívány za podmínek a způsobem, který je doporučen jejich výrobcem. Reakce, při nichž dochází k vazbě, jsou přiváděny podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších na str. 245 až 6 při použití pufru, který je popsán na str. 246 uvedené publikace a koncentrace LNA v rozmezí 1 až 100/Mg/ml při teplotě 23 °C pro, DNA se slepými konci a 16 °C pro DNA s konci, které se na sel^á snadno váží. Elektroforéza se provádí na 0,5 až 1,5% agarozovém gelu s obsahem 90 mM Tris-boritanu a 10 mM SDTA. Všechna DNA, značená radioaktivně je značena 32P.

Pod pojmem rapid prep” se rozumí rychlá produkce DNA bakteriofágu nebo plasmidu v malém měřítku, tak, jak je popsána například ve svrchu uvedené publikaci Maniatise a dalších na str. 365 až 373.

- 34 Příklad A v

Stupen 1 Linie buněk Mo

Buňky Mo (ATCC CRL 8066) se běžně pěstují na prostředí alfa se 6 % oxidu uhličitého nebo prostředí podle Iscova s 10 % oxidu uhličitého a 8 obsahem 20 % fetálního telecího sera (FCS), mM glutaminu, 100 jednotek/ml streptomycinu a v

100 ^ug/ml penicilinu. Buňky je nutno přeočkovávat v

každé 4 až 5 dnů. Buňky se spočítají a pak se jimi očkují Palconovy T-175 lahve s obsahem 100 až 150 ml živného prostředí při hustotě 3 až 4 x 10^ buněk/ml. Počet buněk se zdvojnásobí za přítomnosti 20 % FCS za 4 až 7 dnů. Rychlost růstu není stálá a nikdy mor v

hou buňky zcela zastavit růst, načež se náhle rychle v

rozrůstají. Buňky Mo je možno pěstovat také v prostředí, které je prosté scíra. Přežívání buněk je v

mnohem lepší v případě, že se buňky při přenesení z FCS do prostředí, které je sera prosté nepromývaji. Optimální hustota v prostředí, které je prosté 5 ^v z sera (SF) je 5 i 10 buněk/ml. Buňky mírně rostou, v

nebo alespoň si zachovávají stejný počet buněk po tři dny v prostředí, které je prosté sera, pak je v

nutno přidat 20 % FCS po dobu alespoň 4 dnů. Toto

- 35 růstové schéma (3 dny SP), 4 dny 2P% FCS), je možno opakovat každý týden, je-li ppžadováno prostředí bez sera, a to po několik měsíců bez jakéhokol/iv zjevného poškození buněk.

Stupen 2 Zjištování účinnosti CSP

A. Stanovení s použitím kostní dřeně

Získá se čerstvá kostní dřen a odZ V straní se kostní úlomky, načež se dřen zředí v poměru 1 : 1 sterilním chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru (PBS) při teplotě místnosti a pak se dřen převrství Ficoll-Paque, přibližně 30 ml BM-PBS a 6 ml Picollu. Pak se směs odstředuje při 1500 otáčkách za minutu 40 minut při teplotě místnosti. Tuk a vrstva PBS se iaoluje a odloží. Pak se pipetou odebere zakalená vrstva, která se dvakrát promyje PBS a v

pak se spočítají buňky , kterfl se pak nanesou do prostředí RPMI (GIBCO, RPMI 1640) s 10ý= PCS, inaktivovaného tepla, (HIFCS) na 3 hodiny k odstranění lnoucích buněk.

v

Živné prostředí, které musí být čerstvé^—se—připraví—následujícím—způsobem:- 36 20 % FCS

0,3 ty- agaru, rozpuštěhého ve vodě, zchladí se na 40 °C,

2x Iscoves (objemový poměr 1 : 1 v agaru) ty P/S konečné koncentrace 100/Ug/ml streptomycinu a 100 jednotek/j»l penicilinu

M oc-thiůglycerolu ve 2x Iscoves ze zásobního roztoku o koncentraci 10 agar se zchladí na 40 % a přidají se další složky, ve vodní lázni se výsledná směs zchladí na 37 - 38 ⁰ a na této teplotě se udržuje.

v

Po 3 hodinách se buňky, které nelnou z z z ^V oddělí pipetou a materiál se odstředí a buňky se znovu spočítají. Přidá se 2 x 10 buněk/ml a prostředí se udržuje na vodní lázni při teplotě 37 - 38 °.

Pak se přidá vzorek, například prostředí z buněk po transfekci v množství obvykle 10 mikrolitrů do první řady vyhloubení mikrotitrační desky ve dvojím provedení. Pak se do každého vyhloubení přidá 100 mikrolitrů buněčné -suspenze a pak ještě dalších-50-mikrolitrů buněčné suspenze do každého vyhloubení první řady. Materiál ve vyhloubeních se důkladně promísí a 50 mikrolitrů roztoku z první řady se přenese do následující řady a pak se dále postupuje po celé

- 37 plotně, čímž se získá postupné ředění vždy 1:3.

...... „ r

Plotna za zabalí p do parafilmu a inkubuje 10 az '15 dnů v 10 % oxidu uhličitého při teplotě 37 °C ve vlhkém prostředí, načež se počítají kolonií”

Spočítá se celé množství kolonií v každém vyhloubení. V každém pokusu se užije několik vyhloubení bez vzorku, čímž se získá základní počet kolonií. Tento počet se odečte od počtu kolonií, které se nacházejí v každém vyhloubení s obsahem vzorku. Jedna jednotka CSF je to množství, které vyvolá tvorbu jedné kolonie nad základní počet kolonií na 10^ buněk z lidské kostní dřeně v případě, že se užije 10^ buněk v jednom mililitru, a to v případě, že koncentrace CSF je pod stupněm sycení. Tato koncentrace se stanoví zředěním a srovnáním poStu kolonií při různém ředění tak, aby bylo možno určit koncentraci těsně před hladinou nasycení.

Při tomto stanovení se počítají kolonie, které obsahují granulocyty, monocyty nebo oba typy kolonií. Typ buněk v koloniích se stanoví odebráním kolonie a barvením buněk.

B. Stanovení při použití buněk KG-1 v

Buňky KG-1, popsané v publikaci Blood, sv. 56, č. 3 (1980) se pěstují v prostředí v

podle Iscova s 10 % PCS, buňky se přeockovávají 2x 5 týdně, při každé pasáži se užije 2x 10 buněk/ml.

v

Buňky se užijí ke stanovení pouze s pasáží 30 až 35.

Stanovení je stejné jako při použití buněk kostní dřeně s tím rozdílem, že buňky KG-1 se pěstují v agav 3 rové směsi při použití 4 x 10 buněk/ml.

Počet ji kolonií, které rostou v každém vyhloubení se stanoví po odečtení základního počtu kolonií stejným způsobem jako při použití buněk z v

kostní dřeně. Jedna jednotka/ml pro tyto buňky při použití CSP je ta^ koncentrace CSP, která stimuluje polovinu maximálního množství kolonií buněk KG-1 k růstu (nasycení). Maximálního počtu kolonií je možno dosáhnout tak, že se do několika vyhloubení přidá CSP až do nasycení.

- 39 Stupen 3 Konstrukce vektoru p91023(B)

Vektorem, použitým pro transformaci, byl vektor pAdD26SVpA(3), který byl popsán v publikaci Kaufman a další, Mol. Cell Biol. 2 (11)

1304 - 1319 (1982). Tento vektor má strukturu, která je znázorněna na obr. 2. Tento plasmid obsahuje^gen pro dihydrofolát reduktásy myši (DHPR), který je pod transkripčním řízením hlavního promotoru adenoviru 2 (Ad2). Do adenoviru se přiřadí sled z genu pro imunoglobulin, který je přítomen mezi promotorem Ad2 a sledem DHFR a mění zakončení 5 a 3 . Místo pro polyadenylaci SV40 se nachází směrem dolů od sledu, který je kódem pro DHFR. Sled tohoto vektoru, který je odvozen od prokaryotických buněk, je vzat z pSVOd (Mellon, P., Parker, V., Gluzman, Y, a Maniatis, T., 1981, Cell 27« 279 - 288) a neobsahuje sledy z pBR322, v

které způsobují inhibici replikace v buňkách ^savců, jak bylo popsáno v publikaci Lusky, M., a Botchan, M,

1981, Nátuře (London) 293, 79 - 81.

to

Svrchu uvedený jiasraid se převede na plasmid pCVSVL2 způsobem, znázorněným na obr. 2 a na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) tak, že se vypustí jedno_ze dvou míst pro působení restrikční endonukleásy

- 40 Pstl v původním plasmidu. Tento způsob se uskuteční částečným rozštěpením uvedeným eneymem, čímž je možno získat subpopulaci linerizovaných plasmidů, v nichž je rozštěpeno pouze jedno místo pro působení enzymu Pstl, načež se působí Klenowovým fragmentem, který se naváže k recirkulisaci plasmidů, který se pak použije k transformaci E. coli a hledají se kolonie, kter$ mají rozštěpeno místo pro působení Pstl, z

které je uloženo poblíž zakončení 3 polyadenylováného sledu SV40.

Vedoucí sled adenavitu a geny, získané z virů (VA-geny) se včlení do plasmidu pAdD26SVpA(3) (d) způsobem, znázorněným na obr. 2. Postupuje se tak, že se uvedený vektor rozštěpí enzymem PvuII za získání otevřené lineární molekuly, z

která se otevírá v blízkosti zakončení 3 prvního ze tří elementů, které tvoří vedoucí sled. Pak se rozštěpí plasmid pJAV 43, popsaný v publikaci Zain a další, 1979, Cell 16 S51, působením enzymu Xhol, naváže seKlenowův fragment, materiál se. rozštěpí enzymem PvuII a fragment o 140 párech baží, který obsahuje druhý element a část třetího elementu vedoucího sledu se izoluje elektroforézou na ákrylamidovém gelu (6 % v trisborátovém pufru podle svrchu uvedené publikace Maniatise a dalších (1982).

Fragment o 140 párech baží se pak naváže na plasmid pAdD26SVpA(3) (d) po štěpení enzymem PvuII. Produkt této vazby se užije k transformaci E. coli za vzniku odolnosti tohoto mikroorganismu proti tetracyklinu, kolonie se sledují způsobem podle Grunsteina a Hognesse při použití 32p-značeného vzorku hybridisací na fragment o 140 párech baží. S kolonií s pozitivní hybritizací se připraví DNA, aby bylo možno zjistit, zda rekonstruované místo pro působení PvuII se nachází na zakončení 5 nebo 3 včleněného fragmentu o 140 párech baží, čímž je možno prokázat, zda hybridizace je specifická pro druhý nebo třetí element vedoucího sledu z adenovitu. Správná orientace místa pro působení uvedeného enzymu se nachází na 5 -zakončení včleněného sledu o 140 párech baží. Takto vytvořený plasmid se označuje pTPL a je znázorněn na obr. 2.

Fragment Ava II D SV40 s obsahem podpůrného sledu SV40 se získá tak, že se DNA SV40 štěpí enzymem Ava II, na zakončení se naváže Klenowův fragment po štěpení Pol I, na tyto fragmenty se ještě naváží spojovací sledy za použití enzymu Xho 1, pak se materiál štěpí enzymem Xho 1 při štěpení příslušného místa a čtyři nejdelší fragmenty (D) se izolují elektroforézou na gelu. Takto získané fragmenty se____

- 42 naváží na plasmid pTPL po štěpení enzymem Xho 1, ěímž se získá plasmid pCYSVL2-TPL. Orientace fragmentu SV40 D v tomto plasmidu je taková, že promotor SV40 má stejnou orientaci jako hlavní promotor adenovitu.

Aby bylo možno zavést geny, spojené s virem adenoviru (VA) do plasmidu pCVSVL2-TPL, ikonstruuje se nejprve plasmid pBB322, který obsahuje fragment adenoviru typ 2 Hind III B. DNA adenoviru typu 2 se rozštěpí enzymem Hind III a fragment B se izoluje elektroforézou na gelu. Takto získaný fragment se pak včlení do plasmidu pBR322, který byl předem rozštěpen enzymem Hind III. Po transformaci E. coli za získání odolnosti proti ampicilinu se rekombinantní kmeny vyhledávají tak, aby byl zjištěn kmen s fragmentem Hind III B a orientace tohoto fragmentu se stanový štěpením restrikčními enzymy. Plasmid pBR322 - Ad Hind III B obsahuje fragment adenoviru typ 2 Hfnd III B v orientaci, která je znázorněna na obr. 3.

Jak je zřejmé z obr. 3, geny VA je možno získat z plasmidu pBE322-Ad Hind III B štěpením pomocí enzymu Hpa I, po přidání sledů, napomáhajících k vazbě EcoRl s následným štěpením enzymem Eco Rl s isolací fragmentu o 1,4 kb. Fragment, který má zakončení po štěpení enzymem EeoRl ? · se pak naváže na místo v plasmidů pTJ&L, které bylo předtím rozštěpeno tímtéž enzymem. Po transformaci Ξ. coli HB101 a po selekci klonů odolných proti tetracyklicnu se kolonie podrobí zkoušce na hybridizaci na filtru při použití vzorku DNA, specifické pro geny $^VA, Pak se připraví DNA z klonů s pozitivní hybridižací a tento materiál se podrobí charakterizaci působením restrikčních endonukleáz. Produktem je plasmid, který se označuje p91023.

Obě místa pro štěpení enzymem E6oRl v plasmidů p91O23 se odstraní, takže se tento plasmid úplně rozštěpí enzymem ScoRl, čímž vzniknou dva fragmenty DNA, z nichž jeden obsahuje přibližně 7Kb a druhý přibližně 1,3 Kb s obsahem Jígenů VA. Zakončení obou fragmentů se vyplní při použití Elenowova fragmentu a enzymu Poli, a pak se oba fragmenty, tj. fragment o 1,3 Kb a o Kb znovu spojí. Plasmid p91023 (A), který obsahuje děny VA je podobný plasmidů p91023, avšak do místa pro působení enzymu EeoRl jsou v obou případech včleněny^ geny VA, jak je možno prokázat Grundsteinar-Hognessovou analýzou ár^ů¥bhehím^estrikcníchuenzymŮ7 ~— --- 44 Jediné místo pro působení enzymu Pstl v plasmidu p91023(A) se odstraní a nahradí se místem pro působení enzymu EcoRl. Pak se plasmid p91O23(A) úplně rozštěpí enzymem Pstl, a pak se naváže Klenowův fragment při použití Poli a na zakončení se naváží pomocné sledy tak, aby místo místa

A pro působení enzymu Pstl vzniklo místo pro působení enzymu EcoRl v plasmidu p91023(A). Lineární plasmid p91O23(A) s pomocnými sledy k vytvoření místa pro z

působení enzymu EcoRl se oddělí a úplně se rozštěpí enzymem EcoRl, načež se takto získané, fragmenty

B znovu naváží. Izoluje se plasmid p91023(^), jeho struktura se identifikuje a je možno prokázat, že běží o strukturu, podobnou plasmidu p91O23(A) až na to, že tento plasmid obsahuje místo pro působení enzymu EcoRl místo místa pro působení enzymu Pstl.

Stupen 4 Příprava skupiny· cDNA <

V

.......... Buňky Mo -se pěstují 16 až 20 hodin při použití ΡΗΔ a BIA ke stimulaci produkce lymphov kinů. Buňky se pak nanesou na plotny v množství 5 x 10 buněk/ml v prostředí podle Iscova s 20

- 45 FCS, 0,3 °Ja objemovými PHA a 5 ng/ml TPA. Buňky se ' v oddělí odstředěním. Takto oddělení?buňky se znovu uvedou do suspenze ve 20 mi hypotonického pufru pro rozrušení buněk, chlazeného ledem (RSB pufr: 0,01M Tris-HCl, pH 7,4, 0,01M KC1, 0,0015M MgCl₂, 1 ,ug/ml i/>V ' cykloheximidu, 50 jednotek/ml RNAsfii a 5mM dithiov threitolu). Buňky se nechají nabobtnat na ledu 5 minutý, načež se mechanicky rozruší ve skleněném homogenizátoru deseti zdvihy těsně lnoucího pístu. Homoge· nát se pak odstředí při 2000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J6) k odstranění jader a nerozrušených buněk. Supernatant se uloží v ledu a jádra se znovu uvedou do suspenze v 10 ml RS3 a pak se tento materiál znovu odstředí při malé rychlosti. Tento dru hý supernatant se spojí s prvním supernatantem a získaný materiál se znovu odstředí při malé rychlosti k odstranění zbylých jader a nerozrušených buněk. Super natant v tomto případě se smísí přidáváním 2M KC1 až na koncentraci 0,15M KC1 a pak se znovu odstředí 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu (rotor Beckman Sv 28), čímž se jako segment získají buněčné membrány Sediment buněčných membrán se opatrně promyje chladným RSB a pak se znovu uvede do suspenze ve 12 ml RSB s obsahem 2M sacharosy a 0,15M chloridu draselného.

- 46 Pak se ve zkumavkách do odstředivky (Beckman/ SV41) ý připraví diskontinuální gradient, tak, že se převrství 6 ml roztoku membrány ve 2M sacharose na 2 ml RSB s 2,5M sacbarosy a 0,15M KC1. Zkumavky se doplní

2,5 ml RSB s obsahem 1,3M sacbarosy a 0,15M KC1.

Tyto gradienty se pak odstředí 4 hodiny při 27 000 otáčkách za minutu (Beckman, rotor SW41) při teplotě 4 °C. Vrstva membrány, která se nachází na rozhraní mezi koncentrací 2,0M a 1,3M sacbarosy se opatrně odstraní se strany při použití ijekční stříkačky a jehly č. 18. Prakce membrány z obou gradientů se slijí a zředí jednám objemem destilované vody, načež se přidá do koncentrace 0,5 Triton X—100 a do koncentrace 0,5 % deoxycbolát. sodný, načdž se materiál extrahuje stejným objemem fenolu. Vodná vrstva se pak znovu extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1 a nakonec stejným objemem chloroform#. Pak se RNA, vázaná na membránu vysráží přidáním chloridu sodného do koncentraci 0,25M a 2,5 objemů chladného ethanolu, načež se směs inkubuje přes noc při teplotě -20 °C. Vysrážená RBA se oddělí odstředěním 10 minut při 4000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) a pak se materiál znovu uvede do suspenze v 1 ml destilovkné vody. Z množství 2 x 10^ buněk se získá přibližně 1 mg RNA. Pak se izoluje s celkového množství

- 47 SNA příslušné množství mSNA chromatografií na sloupci s obsahem 0,5 ml oligo dT-celulozy. Pak se RNA zahřeje na 5 minut na teplotu 70 °C, rychle se zchladí v ledu a pak se 5x ředí při teplotě místnostik pufrem pro vazbu, který obsahge 0,5M LiCl, 0,01M Tris-HCl, o pH 7,4, 0,002M EDTA a 0,1 % SDS. SNA v tomto pufru se pak nechá projít sloupcem oligo dT-celulozy v rovnovážném stavu ve stejném pufru při teplotě místnosti, Sloupec se promyje 5 ml pufru pro vazbu a pak 5yul 0,15M LiCl,0,01M Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA, a 0,1 % SDS. Nakonec se mRNA vymývá při použití 2 ml 0,01M Tris-HCl o pH 7,4, 0,002M EDTA a 0,1 SDS. Pak se mSNA vysráží přidáním chloridu sodného do koncentrace 0,25M a 2,5 objemjíů éthanolu a směs se ý inkubuje přes noc při teplotě -20 C. Vysrážen# mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 30 000 otáčkách za minutu (rotor Beckman 3V55). Supernatant se opatrně slije a peleta mRNA a znovu uvede v suspenzi v 50 ml vody. Tato suspenze se pak upraví na koncentraci O,25M chloridu sodného a pak se extrahuje směsí fenolu a chloroformu v poměru 1:1a pak třikrát chloroformem. Pak se mRNA vysráží přidáním 2,5 objemu éthanolu.

Směs se několikrát zmrazí a nechá roztát v lázni se —suchým—ledem _a_ethanolem a pak se 15 minut odstře- 48 v

duje v Eppendorfově odstředivce. Supernatant se opatrně slij e a peleta mRNA se znovu uvede do suspenze ve 20 /Ul destilované vody. Konečný výtěžek je přibližně 30 /Ug mRNA.

První řetězec cDNA se připraví při použití standardních metod. Postupuje se tak, že se 10 /Ug mRNA z membrán zředí 100/ul směsi pro vznik cDNA, která obsahuje 300 mmol Tris o nH 8,4, 140 mmol KC1, 10 mmol MgClg, 1θ mmol β-merkaptoethanolu, 500 / dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5/Ug oligo-dT (fosforylované při průměrném rozměru 12 — 18), dále 150 yuCi 32P dCTP (400 Ci/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleázy RNAsin. Reakce se spustí přidáním 100 jednotek reversní transkriptázy při inkubaci 30 minut při teplotě 42 °C. Pak se reakce zastaví přidáním EDTA ý do koncentrace 40 mmol a pak se RNA rozloží inkubací 20 minut v 65 °C v 0,2M hydroxidu dosného. Pak se baze neutralizuje přidáním 20/ul 2M Tris o pH 7,4. Reakční směs se pak extrahuje směsí fenolu a chloroformu a pak se provádí”zpětná extrakce při použití 50 /Ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA (TE) a vodné fáze se slijí. Pak se cDNA s jednoduchým řetězcem převede na cDNA s dvojitým řetězcem tak, že se směs inkubuje 12 hodin při teplotě 16 °C spolu se uM

- 49 40 jednotkami Klenowova fragmentu za přítomnosti DNA-polymerázy I ve 100/^ul reakcního prostředí, které obsahuje roztok 50 mmol fosforečnanu draselného o pH 7,4, 2,3 mmol DTT, 2-merkaptoethanok, 10 mmol

MgClg, vždy 150 /Umol jednoho ze čtyř deoxynukleo32 tidtrifosfátů a 25 /uCi P dCTP. Reakce se pak zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a nevčle— něné trifosfáty se odstraní průchodem vodné p fáze přes sloupec prostředku Sephadex-G·—50 o objemu 1 ml. Vyloučené frakce se slijí a vysráží se ethanolem.

Peleta cDNA se promyje chladným ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze v 200 /ul

20mmol třt* Tris o pH 8,0, 1 mmol EDTA, 80/umol S-adenosylmethioninu a 300 jednotek EcoRl-methylásy na 60 minut při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a methylovaná cDNA se isoluje vysráženým ethanolem.

Peleta cDNA se promyje 70/c ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 200 yul pufru Sl (Maniatis a další) a materiál se inkubuje s 200 jednotkami Sl-nukleásy při teplotě 30 °C celkem 30 minut. Pak se reakce zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.

- 50 Zakončení cDNA s dvojitým řetězcem se valní inkubací ve 100 yul 20 mmol Tris o pH 7,4, mmol chloridu sodného, 10 mmol 2-markaptoethanolu a 500/umol všech čtyř deoxynůkleotidtrifosfátu s 25 jednotkami Klenowova fragmentu při teplotě místnosti 30 minut. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a cDNA se isoluje vysrážením ethanolem.

Takto získané cDNA se podrobí vazbě v 50 /Ul pufru s obsahem T4-ligásy (Maniatis a další) za přítomnosti 500 pMol vazných řetězců Rl se sledem pCGGAATTCCG (New England Biolabs) při použití 2000 jednotek T4-ligásy přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví inkubací při teplotě 70 °C po dobu 20 minut, pak se reakční směs zředí na 300 mikrolitrů, takže konečná koncentrace solí je 0,1 mol NACI, 10 mmol MgCl2> 50 mmol Tris-HCl o pH 7,4. Pak se cDNA štěpí 2 minuty při teplotě 37 °C působením 7D0 jednotek enzymu EcoRI. Reakce se zastaví extrakcí směsí fe• nolu a nolem.

zul chloroformu a cDNA. se. isoluje- vysrážením etha, Získaná peleta se znovu uvede do suspense v

TE a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 5 ml C1-4B. Získané frakce se slijí a vysráží se ethanolem. Vysrážená cDNA se podrobí elektroforéze

- 51 na ljž> agarosovém gelu v Tris-acetátovém pufru za přítomnosti 1/Ug/ml ethidiumbromidu. Pak se cBNA o rozmetu 500 až 4000 párů baží isoluje z gelu při použití standardního postupu. Vyloučená cDNA se extrahuje směsí fenolu a chloroformu, vysráží se ethanolem a peleta (po opláchnutí ethanolem) se znovu uvede do suspenze v 50 /Ul TE. Konečný výtěžek byl 10 až 500 ng cDNA.

Dále bude popsána příprava vektoru pro expresi p91023(B). 500ng vektoru, rozštěpeného enzymem EcoRl a zpracovaného působením fosfatázy se podrobí vazbě se 100 ng cDNA ve 100yul reakč ního prostředí (standardní prostředí pro působení T4-ligásy) přes noc při teplotě 16 °C. Reakce se zastaví extrakcí směsí fenolu a chloroformu a pak se navázaná cDNA oddělí vysrážením ethanolem po přidání 5 /Ug / tRNA jako nosiče.

f

DNA, vysrážená ethanolem se promyje 70?ó ethanolem a pak se znovu uvede do suspenze ve 100/Ul TE. Tato DNA se pak užije v podílech o objemu 4 yUl k transformaci E. coli W1061 (4/ul pro transformaci v objemu lOOyUl. Každá z 25 transformovaných zkouěek se rozetře na Petriho.misku o průměru 150 mm s obsahem 1 agaru, v L-prostředí_

- 52 s 10ýe/ml tetracyklinu (Tet-plotna) a plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Na každé plotně se vyvine přibližně 2000 kolonií, výsledkem je tedy celkem přibližně 50 000 kolonií. Každá z těchto kolonií má průměr přibližně 0,5 mm. Každá z těchto kolonií se přenese na mikrocelulózový kotouč o průměru 137 mm tak, že se na povrch agaru opatrně uloží suchý filtr, který se pak opatrně sejme. Všechny kolonie zůstanou na filtru, který se pak uloží koloniemi směrem vzhůru na čerstvou Tet-plotnu. Kolonie se nechají růst několik hodin a pak se znovu rozdělí tak, že se přesně na původní filtr uloží čerstvý zvlhčený filtr, filtry se k sobě přitlačí, pak se oddělí a každý filtr se uloží na čerstvou Tet-plotnu a plotny se inkubují přes noc při teplotě 37 °C. Každá kopie se pečlivě označí, aby bylo možno uložení kolonií přesně srovnat s jejich uložením na původním filtru.

Stupen 5 Příprava směsi plasmidové DNA

Každá z 25 kopií filtrů se opatrně rozřeže skalpelem na osminy, přičemž se zaznamená orientace každé z těchto osmi ve srovnání s původním z

filtrem. Z každého useku se kolonie sejmou do 10 ml L-bujonu. Bakterie se oddělí odstředěním 10 minut při 3000 otáčkách za minutu (odstředivka Beckman J-6) a pak se znovu uvedou do suspenze v 0,6 ml 25% sacharozy s 50 M Tris-HCl o pH 8,5 a změní se na protoplasty přidáním 0,2 ml lysozymu o koncentraci 5 mg/ml jí s následnou inkubací v ledu na dohu 5 až 10 minut. Protoplasty se pak inkubují při teplotě místnosti 10 minut, přidá se 0,125 ml SDTA o koncentraci 0,5 molů a pak se buňky rozruší přidáním 0,12 ml 10% SDS v 50 mmol Trie-DCl o pH 8,0. Rozrušený materiál se opatrně promíchá, inkubuje se 15 minut při teplotě místnosti a pak se DNA bílkovin a chroraosomů vysráží přidáním 0,3 $áml 5M NaCl. Po inkubaci v ledu na dobu 15 minut se materiál odstředí na Eppendoffově odstředivce 30 minut za chlazení. Supernatant se opatrně odstra ní, čxqiž se získá viskozní peleta DNA a bílkoviny, která se zředí přidáním 2,5 ml vody. Směs se extrahuje 1 ml fenolu, vrstvy se oddělí odstředěním (10K po dobu 10 minut, rotor Sorvall SS-34) a vodná vrstva se oddělí do nové zkumavky. DNA se vysráží přidáním 0,5 ml 5M NAfil NaCl a 7,5 ml chladného ethanolu a směs se několikrát zmrazí v lázni ethanolu a suchého ledu. Vysrážený ^materiál se oddělí odstředěním (10K, _____ _____ _ __________ l minut, Sorvall SS-34), znovu se uvede do suspanze—

- 54 v 0,3 ml 0,3M octanu $. sodného a znovu se vysráží (v Eppendorfově zkumavce) přidáním 1 ml ethanolu.

Po 10 až 15 minutách v lázni se suchým ledem a ethanolem se vysrážená DNA oddělí odstředěním (5 minut v Eppendorfově odstředivce)^ výsledná peleta se znovu uvede do suspenze ve 100ριί. sterilního prostředí

TE (10 mmol Tris o pH 8, 1 mmol EDTA). Z typické /Ug zkoušky se získá 5 až 10 ag pbsmidové DNA. Každý vzorek obsahuje DNA z 200 až 500 kolonií původního filtru. Z 25 filtrů se připraví celkem 200 vzorků DNA.

Stupen 6 Isolace klonů CSP ’

Každý ze vzorků DNA ze stupně 5 se odděleně přenese do opičích buněk,M6 tak, jak bude dále popsáno.

Buňky M6 se běžně pěstují na modifikovaném Eaglově prostředí (Dulbecco, DME je možno -získat od Gibco) s obsahem 10 % fetálního telecího sera, inaktivovaného teplem (HIFCS), buňky se dvakrát týdně přeočkovávají při ředění 1 : 6. 24 ho v

din po dělení v poměru 1 : 6 jsou buňky M6 připravené pro transfekci. 24 hodin před transfekcí se

- 55 g

1,2 χ 10 buněk M6 naočkuje na plotnu (Cell Pactory, Ňunc) v 1,5 1 prostředí DME + 10 % HIPCS. Těsně před transfekci se plotny 2x promyjí 7 ml DME bez sera.(SP). DNA se rozpustí v 0,1 M Tris o pH 7,3 a přidá se k prostředí DME, které obsahuje 2mmol glutaminu, 100/Ug/ml strepromycinu, 100 jednotk/ml penicilinu a 0,20 mg/ml DEAE-dextránu, doplněno na 4 ml Tris-DNA roztokem.

v ml prostředí s obsahem rozpuštěné DNA se přidají v

k plotně s obsahem buněk M6 COS a buňky se 12 hodin inkubuj í.

v

Po inkubaci se buňky jednou nebo dvakrát promyjí 7 ml SP DME. Pak se 5 ml DME s 10 ty HIPCS, 100 jednotek/ml penicilinu, 100/Ug/ml streptomycinu, mmol glutaminu a 0,1 mmol chlorochinu přidá ke směv si a buňky se pak inkubují po dobu 2 1/2 hodiny.

v

Po inkubaci se buňky promyjí SP DME a přidá se 10 ml DME + 10 ty HIPCS na plotny. Po 30 hodinách se prostředí odsaje a přidá se 4 ml DME + 10 ty v

HIPCS na plotnu. Buňky se izolují odstraněním prostředí po 24 až 26 / hodinách další inkubace.

Prostředí z každého vzorku se zkoumá na účinnost CSP při použití zkoušky KG-1. Pro každý vzorek, jehož účinnost CSP je positivní, je nutno

- 56 vyhledat klon na původním filtru, který je příčinou této účinnosti. Například v případě positivní transfekce účinnosti CSF se odeberou všechny kolonie původního useku filtru, na němž byla nalezena tato ucin nost. Jde obvykle o přibližně 320 kolonií, které se odeberou do 3 ml L-prostředí s 10 /Ug/ml tetracyklinu

Kultury se pěstují přes noc. 320 kolonií se uloží do matrice 18 x 18. Z horizontálních řad a vertikálních sloupců matrice se připraví směsi (36 směsí, poslední horizontální řada měla pouze 14 klonů). Vzorky DNA se ťA připraví z každé směsi a užijí se k ýtánsfekci buněk o (CBS). Supernatanty z takto získaného materiálu se zkouší na účinnost. Byly získány dvě positivní zkoušky, jedna ve vertikálním sloupci, druhá v horizontální řadě. Kultury, spoleňná oběma směsím obsahovala z

klon s uřinností CSF.

Z kultury bylo isolováno celíkem dvanáct jednotlivých klonů a miniprep DNA pak byla » připravena z kultur o objemu 10 ml v L-prostředí, tak, jak bylo popsáno svrchu. Pak byly rozštěpeny vzorky 10 ^úlDNA z těchto zkoušek enzymem EcoRl a výsledné fragmenty DNA byly analyzovány elektroforézou na agarozovém gelu. Devět z dvanácti klonů mělo společný včleněný sled o přibližně 750 párů

- 57 baží. DNA ze čtyř z těchto klonů a ze zbývajících tří klonů byla přenesena do bunějk M6 COS svrchu uvedeným způsobem. Supernatanty z takto provedených transfekcí byly zkoumány zkouškou KG--1 stejně jako zkouškou s použitím hxxk buněk z kostní dřeně na j V ' - · — účinnost CSF. Čtyři klony měly 750 párů baží jako společný fragment, včleněný ve správném sledu, takže v

docházelo k expresi buňkami M6 COS ve vysokém stupni, jak bylo možno prokázat účinností CSF v obou uvedených zkouškách na rozdíl od zbývajících tří klonů. Znamená to,, že kodová oblast pro CSF musí být uložena ve včleněném sledu o 750 párech baží.

Sled DNA, který je kódem pro CSF byl odstraněn z vektoru pro transformaci v positivním klonu rozštěpením enzymem EcoRl a jeho sled byl stanoven při použití standardní metody po podrobení fragmentů klonování i ve vektorech M13, čímž byl prokázán sled, znázorněný na obr. 1. Plasmid p91023(B) -CSF, o němž bylo poprvé prokázáno, Že řídí expresi CSF v buňkách COS byl pak označen pCSF-1. Tento plasmid byl pak uložen ve sbírce American Type Culture Collection xxxxxxtacsxaxxž v kmenu E. coli MC1061 pod číslem ATCC 39754 2. července 1984.

- 58 v

Stupen 7 Exprese bílkoviny CSF

Opičí buňky M6 COS, transformované vektorem p91023(B) s obsahem CSP/cDNA, tak, jak byl tento materiál isolován ve stupbi 6, se pěstují způsobem popsaným ve stupni 6, čímž dochází k produkci bílkoviny CSF, která se pak nachází v živném prostře dí.

Postupuje se tak, že se js 1 mg této DNA (pCSP-1) rozpustí v 1 ml 0,1 M Tris o pH

7,3 a přidá se k 600 ml DME s obsahem 2 mmol glutaΛ minu, 100 jednotek/ml streptomycinu, 100 /U/ml penicilinu (P/S) a 0,25 mg/ml DEAE Dextranu s molekulovou hmotností 500 000 (Pharmacia). 600 ml roztoku v

SNA DEAE dextranu se přidá k buňkám M6 COS a směs se inkubuje 12 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci se buňky promyjí 900 ml SP DME a pak se inkubují

2,5 hodin v 600 ml DNA s obsahem 0,1 mmol cblorocbinu, 10 EIPCS, 2 mmol glutaminu a P/S. Prostředí s obsahem chloy^hinu se odstraní odsáváním, buňky se promyjí SP DME a pak se přidá 1500 ml DME s 10 ^a/a HIPCS. Po 30 hodinách se buňky promyjí SP DME, prostředí se nahradí 800 ml čerstvého prostředí SP DME v

pak se buňky pro transfekci inkubují 24 hodin při

- 59 teplotě 37 °C. Prostředí se pak odsaje a nahradí v

800 ml čerstvého prostředí SP DME. Buňky se pak inkubují v tomto prostředí 24 hodin, načež se prostředí odstraní. Jakmile je to možné, zahustí se vzorky prostředí 20x ultrafiltrací pod tlakem při použití komory Amicon o objemu 2,5 1 s membránou ΣΜ5, která odděluje sloučeniny do molekulové hmotnosti 5 000.

v v

Stupen 8 Čištění rekombinantního CSP

200 ml koncentrovaného prostředí ze 4 1 výchozího materiálu ze stupně 7 se na 30 ýa nasytí síranem amonným přidáním pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se oddělí odstředěním. Supernatant se na 80 % nasytí síranem amonným přidáním dalšího pevného síranu amonného a vysrážená bílkovina se opět oddělí odstředěním. Peleta se anovu uvede do suspenze v 5 ml 20 mmol citronanu sodného o pH 6,1 s obsahem 1 M NaCl. Rozpuštěná bílkovina se nanese na sloupec o rozměrech 1,6 x 100 cm s náplní Ultrogel AcA54 v rovnovážném stavu ve stejném pufru. Účinnoét CSP se vymývá ze sloupce při molekulové hmotnosti 19 k jednotek nebo přibližně po 90 ml

- 60 počátečního eluátu. Bylo pozorováno, že v případě, že se filtrace na gelu provádí při malé iontové síle, vymývá se látka s účinností CSP ze sloupce ve dvou polohách s molekulovou hmotností 19 a 38 k jednotek, z

což patrně znamená tvorbu dimerů. Účinné frakce se spojí a přidává se 10% TPA do koncentrace 0,15 % a pak se materiál nanese na sloupec prostředku Vydac C4 rozměru 0,46 x 25 cm v rovnovážném stavu v 0,1% TPA. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem acetonitrilu od 0 do 90 % v 0,1% TPA rychlostí 1 ml za z

minutu při celkovém množství 340 ml. Účinnost CSP se vymývá mezi 39 a 43 % acetonitrilu, frakce 16 až 20. Vzorek frakce 19 o objemu 20 yul hyl analyzován elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu (13,5% gel podle publikace Lammli, Nátuře 227. 680 (1970)). Bylo možno pozorovat jediný široký pás pro bílkovinu s molekulovou hmotností 18 až 26 k jednotek. Poněkud širší rozmezí pro molekulovou hmotnost CSP je běžnou vlastností giykoproteinů a patrně odráží velké, avšak měnící se množství uhlohydrátu. Bílkovina z frakce 19 byla podrobena Edmánóvě degradaci při použití zařízení pro stanovení sledu.Z přibližně 20 /Ug bílkoviny bylo možno určit sled prvních šestnácti aminokyselin jako A-P-A-R-S-P-S-P-S-T-Q-P-W -E-H. Vysoký -výtěžek tohoto jediného sledu napovídá,

- 61 že bílkovina CSP z frakce 19 byla vyčištěna až do homogenity. Biologická zkouška prokázala, že frakce 19 obsahovala 3 x 10 jednotek na jednotku absorbance &280* Protože typické bílkoviny ve vodném roztoku mají extinkční koeficient 0,8 až 1,2 jednotek absorbance Aggp* Na 1 mg bílkoviny,, specifická učin7 7 nost čištěného CSF je v rozmezí 1 x 10 až 4 x 10 jednotek/mg v případě, že se užije zkoušky s buňkami z lidské kostní dřeně.

v

Τ·

Příklad B

Klonování CSP Gibbona

Stupen 1

Příprava mRNA z T-buněk Gibbona

Vzorek linie T-buněk Gibbona, označený UCD-MLA 144 se pěstuje několik týdnů v prostře- .

dí REMI 1640 (Gibco) a 20^ fetálnímtelecím seru (PCS) Q v až do získání počtu 1 x 10 buněk. Tyto buňky byly zpracovávány tak, že byla indukována produkce vysoké hladiny CSF aktivací po 24 hodiny působením 10 ng/^m^ 12-0-ietradecanoylphorbol-13-acetátu (TPA v RPNI 1640

- 62 s 1 % FCS. Pak byly buňky isolovány odstředěním 5 minut při 1000 otáčkách za minutu, byly promyty chloridem sodným s fosfátovým pufrem (PBS) a pak byly opět isolovány odstředěním.

Z těchto buněk byla připravena mRNA polysomů, vázaných na membránu (MBP) způsobem, popsa ným v příkladu A pro přípravu RNA z buněk Mo.

Stupen 2 Reakce s cDNA Orvního řetězce yug MBP mRNA ze stupně'. 1 se zředí v reakční směsi pro přípravu cDNA v množství 50/ul, stejně jako bylo popsáno ve stupni 4 příkladu A a reakce se započne přidáním reversní transkriptázy. Směs se inkubuje 30 minut při teplotě 42 °C, pak se reakce zastaví přidáním EDTA do koncentrace 50 mmol a směs se zředí vodou na 100 /ul. Pak se směs extrahuje nejprve směsí fenolu a chloroformu a pak chloroformem. Hybridy cDNA/RNA se oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci s obsahem 2 ml Sepharose CL-4B. Vyloučená frakce se slijí a hybridy se vysráží ethanolem, výtěžek je 570 mg.

Pak se 10 ng cDNA s takto upraveným zakončením spojí s 50 ng plasmidu p5R322 se zakončeními G (NEN) v 10 yul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA a 100 mmol chloridu sodného. Výsledná reakční směs se inkubuje 10 minut při teplotě 68 °C a pak ještě 2 hodiny při teplotě 57 °C.

Stupen 5 Transformace bakterií

Kmen E. coli MC1061 se pěstuje v v

L-bujonu, pak se zchladí v ledu, buňky se pskyhxjx oddělí odstředěním a přidá se chlorid vápenatý k přípravě buněk pro transformaci. Pak se 5 yul rozí toku ze stupně 4 inkubuje s 200 /ul takto připravených bakterií. Tato transformace se opakuje 15x při použití veškerého množství cDNA z předchozího stupně a materiál se nanese na plotny o průměru 15 cm s ljí agarem v L-bujonu s obsahem 10 /Ug/ml tetracyklinu. Na každé plotně vyrostlo přibližně 1000 kolonií.

v

Stupen 6 Pěstování kopií

000 kolonií z transformací se jednotlivě vyjmou, přenesou se na čerstvé plotny

Stupen 3 Reakce s cDNA druhého řetězce

Peleta cDNA prvního řetězce ze stupně 2 se znovu uvede v suspenzi v 50 ml vody a provádí se syntéza druhého řetězce ve standardní^ reakční směsi při použití polymerázy I E. coli, ligázy E. coli a ribonukleázy H. Reakční směs se inkubuje přes noc při teplotě 16°C a pak hodinu při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví přidáýním EDTA a směs se extrahuje směsí fenoku a chloroformu. Pak se cDNA oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředku Sepharosa CL-4B,získané frakcer se slijí a cDNA se isoluje vysrážením etanolem.

Stupen 4

Příprava rekombinantní cDNA

Peleta cDNA ze stupně 3 se uvede znovu do suspenze v 75 /ul vody. Pak se přidají na konce cDNA homopolymerní zakončení tak, že se přidá 10 yul roztoku cDNA k 25 /Ul standardní reakční směsi s obsahem terminální transferázy a výsledná směs se .

inkubuje 5 minut při teplotě 30 C. Reakce se zastaví přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol a pak se směs inaktivuje teplem 10 minut při teplotě 68 °C.

- 66 minut při teplotě 37 °C se směs smísí s 1yul 10 x T4 pufru s DNA polymerazou, přidá se ještě 1 /ul 2 mmol roztoku dCTP, dTTP, dGTP a 10/Ul ³²P dATP (lO^uCi/^ul 3000 Ci/mmol) a 3 jednotky Tr DNA polymerázy. Pak se reakční směs inkubuje 20 minut při teplotě 37 °C, přidá se 1/ul 2 mmol dATP a reakční směs se inkubuje ještě 10 minut při teplotě 37 °C.

Nevčleněné trifosfáty se oddělí od značené cDNA chromatografií na sloupci prostředku Sephadex G100. Pak se připraví druhý vzorek ze syntetického oligonukleotidu se sledem

ATC TGG CTG CAC AG který je komplementární k zakončení oblasti, která je kódem pro CSF na té části, na níž se nachází aminoskupina. Tento oligonukleotid byl označen 32p . · < · dATP na 5 -zakončení při použití standardní reakce s polynukleotidkinásou.

Stupen 8 Isolace klonů CS(/ cDNA

Při zkouškách na standardní hybridizaci bylo možno prokázat tuto hybridizaci u 45 klonů při použití pCSF-1 cDNA, označené T4. Z tě)íchto klonů

- 65 v množství 500 kolonií na plotnu v mřížce a kolonie se pěstují přes noc při teplotě 37 °C. % Pak se kolonie oddělí od ploten přitlačením filtru ze suché

Z mikrocelulozy na povrch plotny. Z každého základního filtru se připraví dvě kopie. Původní filtiy se skladují při teplotě 4 °C a na kopie se působí zásadou a pak se za tepla suší, aby byly připraveny pro hybridisaci.

v

Stupen 7 Přeprava hybridisaSních vzorků, značených

Včleněný sled cDNA z pCSP-1 byl isolován rozštěpením restrikčním enzymem EcoRl s následnou elektroforézou na agarozovém gelu při použití Tris acetátového pufru a ethidiumbromidu. Pás, obsahující fragment cDNA byl z gelu vyříznut a čištěn obvyklým způsobem.

300 ng fragmentu cDNA bylo pak přidáno k 1 yul 10 x $ pufru pro působení T4 DNA polymerázy (0,33 M Trisacetát o pH 7,9, 0,66 M octan draselný, 0,1 M octan hořečnatý a 10 mmol dithiothreitolu) s 3 jednotkami T4 DNA polymeráty (New England Biolabs) a směs se zředí vodou na 10 yul. Po inkubaci 5 až 10

- 68 nut při 1000 otáčkách za minutu, pak byly promyty chloridem sodným s obsahem fosfátového pufru (PBS) a nakonec byly buňky odděleny odstředěním.

Pak byla připravena cytoplasmatická RNA opatrným v

rozrušením buněk tak, že buňky byly uvedeny do suspenze v 50 ml chladného pufru pro rozrušení buněk

X.

s obsahem Tritonu (pufr sestával ze 140 mmol NaCl,

1,5 mmol MgCl^» mmol Tris o pH 8,6 a 0,5 % Triton Σ-100) s 10 mmol dithiothreitolu (BTT) a 50 jednotkami/ml RNA sin (Bbtec). Materiál byl rozdělen na dvě stejné části a každá z těchto částí byla navrstvena na 10 ml tého pufru s obsahem 20 sacharosy. Buněčná jádra byla odstraněna odstředěním při teplotě 4 °C po dobu 5 minut při 400 otáčkách za mihutu. Horní vrstva, kterou tvořil cytoplasmatický extrakt byla opatrně odstraněna a byl přidán dodecylsulfát sodný (SDS) do konečné koncentrace 1 Je. ?ak byl roztok 2x extrahován týmž objemem směsi fenolu a chloroformu v poměru 1:1a RNA byla vysrážená přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená RNA byla oddělena odstředixýěním 15 minut při 4000 otáčkách za minutu a pak bylo znovu uvedeno do suspenze ve směsi 0,01 M Tris o pH 7,5, 1 mmol EDTA, 0,25 M NaCl (pufr ΤΣ s 0,25 M NaCl) a materiál byl znovu

- 67 hybridizovalo přibližně 20 klonů se vzorkem, který obsahoval značený oligonukleotid. Kodová oblast jednoho z těchto klonů byla podrobena analýze sledu, přičemž bylo zjištěno, že došlo k substituci většího počtu baží, některé tyto substituce vedly k rozdílným aminokyselinám v bílkovině, k jejíž expresi došlo. Prokázané rozdíly jsou znázorněny na obr. 1 nad sledem DNA pro gen lidského CSF, tak, jak byl klonován v příkladu A.

FříkladC

Klonování CSF z mRNA lymfocytů z periferní krve

V

Stupen 1 Příprava mRNA z lymfocytů z periferní krve

Lymfocyty z periferní krve byly připraveny z vedlejších produktů při výrobě plasmy v

(poskytl Červený kříž) frakciónací při použití gradientu Ficoll-Hypaque. Bylo získáno při pěstování v prostředí RFMI-1640 za přítomnosti 5 fetálního telecího sera, 0,17 % fytohemmagluti|řinu a 10 ng/ml BIA hustoty 2 x 10^ buněk/ml celkem bylo získáno 6 x 10 buněk. Buňky byly odděleny odstředěním 5 mi- 69 vysrážen přidáním 2,5 objemu chladného ethanolu. Nakonec byla RNA oddělena odstředěním a znovu uvedena do suspenze v 5 ml vody. Celkový výtěžek byl

7.5 mg.

Z celkové cytoplasmatické RNA byla izolována mRNA selekcí na 4ígo dT celulóze. Pak se

2.5 mg veškeré SNA zahřeje na 5 minut na teplotu 65 °C. Přidá se chlorid sodný do koncentrace 0,5 M a RNA se nechá zchladnout na teplotu místnosti a pak se nechá projít sloupcem s obsahem 1 ml oligo z

dT celulózy, v rovnovážném stavu v TS + 0,5 14 chloridu sodného (pufr pro vazbu). Nenavázaná RNA se oddělí důkladným promytím sloupce tímtéž pufrem-r Vázaná mRNA se pak vymývá 3 ml vody a vysráží se přidáním 0,2 ml 4 M chloridu sodného a 2,5 objemu chladného ethanolu. Vysrážená mRNA se oddělí odstředěním 30 minut při 25 000 otáčkách za minutu. Výsledná usazenina v množství přibližně 100/Ug se znovu uvede do suspenze v 50 ^1 vody,

Stupen 2 Reakce s prvním řetězcem cDNA

20/ug PBL mRNA se zředí v reakční směsi s obsahem 50’/um cDNA, která obsahuje 100 mmol

- 70 Tris o pH 8φ4, 140 mmol KOI, 10 mmol MgC^, 10 mmol

2-merkaptoethanolu, 400/umol dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 5 /Ug oligo-dT s průměrnou velikostí 12 — 18 a 25/uCi dCTP (400 /uCi/mmol) a 20 jednotek inhibitoru ribonukleásy RNAsin. Reakce byla spuštěna přidáním 60 jednotek reversní transkriptázy při teplótě 37 °C s následnou inkubací 30 minut při teplotě 42 °C.

Reakce pak byla zastavena přidáním ETDA do koncentrace 40 mmol s následnou extrakcí stejným objemem fenolu, nasyceného vodou. Fenolová fáze byla podrobena zpětné extrakci 50 /ummol pufru TE.. Vodné fáze byly slity a hybridy cDNA/RNA byly izolovány od nevčleněných trifosfátů tak, že slité vodné fáze prošly sloupcem s obsahem 5 ml prostředku Sepharose CL-4B (Sigma) v rovnovážném stavu s TE. Frakce, které prošly sloupcem, byly slity , doplněny na obsah 250 mmol chloridu sodného a nukleové kyseliny byly vysráženy přidáním 2,5 objemů chladného ethanolu. Hybridy byly odstředěny 30 minut při 40 000 otáčkách ® minutu. Výsledná usazenina 2,5 /Ug cDNA byla znovu uvedena do suspenze v 50/Ul vody.

- 71 v

Stupen 3 Reakce s druhým řetězcem cDNA

Druhý řetězec cDNA byl syntetizován současným půsoebním enzymu DNA polymerazy I,

DNA ligázy a RHAázy Η z E. coli. 50 /ul takto získané reakční směsi obsahovalo 20 mmol Iris o pH 8,0, mmol chlorido hořečnatého, 1,2 mmol EDTA, 25 /umol

NAD, vždy 100/Umol dATP, dGTP, dCTP a dTTP a 50/uCi 32

P dCTP o 3000 Ci/nmol. Reakce se spustí přidáním 3 jednotek DNA polymerazy I, 0,5 jednotky DNA ligázy, a 0,75 jednotek ribonukleázy H s následnou inkubací 18. hodin při teplotě 16 °C a pak hodinu při teplotě 37 °C, načež se reakce zastaví přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol a pak se extrahuje stejným objemem fenolu. Fenolová fáze se zpětně extrahuje 50/U.l TE, vodné fáze se slijí a cDNA se oddělí od nevčleněných trifosfátů chromatografií na sloupci prostředku

Sepharose CL-4B, tak, jak bylo popsáno svrchu v pří32 pádě prvního řetězce. V závislosti na včlenění P se první řetězec CDNA kvantitativně převedl do formy s dvojitým řetězcem.

- 72 Stupen 4 Příprava rekombinantní cDNA

Na zakončení cDNA byly navázány homopolymerní C-sledy opatrným zahřátím 400 ng cDNA v 50 /Ul reakční směsi, která obsahovala 1 mmol

2-merkaptoethanolu, 1 mmol chloridu kobaltnatébo a 9 jednotek terminální deoxynukleotidiltrasferázy minut při teplotě 30 °C. Pak byla reakce zastavena přidáním EDTA do koncentrace 40 mmol s následným zahřátím na 10 minut na teplotu 68 °C. Pak bylo 200 ng získáno cDNA navázáno na 500 ng pAT153 se zakončeními G (Amersham) v 100/ul 10 mmol Tris o pH 7,5, 1 mmol ETDA a 100 mmol chloridu sodného.

Vazba byla přxv prováděna 2 hodiny při teplotě 57 °C při 5 minutách předběžné inkubace při teplotě 68 °C.

Stupen 5 Transformace bakterií

Pi^-ukt, získaný vazbou cDNA byl přímo užit k transformaci kmene E. coli MC1061. ___

Čerstvá kolonie bakterií byla užita k naočkování 50 ml L-bujonu a·byla pěstována několik hodin tak dlouho, až optická hustota při ýř 550 nm byla 0,25.

v

Hynky byly zchlazeny v ledu a pak byly odděleny

- 73 odstředěním 10 minut při 2000 otáčkách za minutu. Získaná usazenina byla znovu uvedena do suspenze v 10 ml chladného 0,1 M chloridu vápenatého a pak byla ponechána v ledu po dobu 10 minut. Pak byly buňky odstředěny 5 minut/ při 2000 otáčkách za minutu, načež byly znovu uvedeny do suspanze v 2,5 ml 0,1 M chloridu vápenatého. Pak bylo 10/ul reakční směsi pro vazbu cDNA inkubováno s 200yul bakterií, na něž bylo působeno chloridem vápenatým nejprve 30 minut v ledu a pak 2 minuty při teplotě 37 °C, v

načež bylo přidáno 0,8 ml Ιί-bujonu a buňky byly inkubovány ještě 30 minut při teplotě 37 °C.

Bylo provedeno celkem 20 transformačních reakcí při využití veškerého množství navázané cDNA. Každá z transformač/ních směsí byla nanesena na plotny o průměru 15 cm, které obsahovaly L-bujon s obsahem 1> agaru a 10 yUg/ml tetracyklinu. Z 20 provedených transformací bylo připraveno 20 takto upravených ploten a tyto plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C.'Na každé plotně vyrostlo přibližně 1500 kolonií bakterií, což znamená celkem 30 000 knt klonů.

- 74 Stupen 6 Výroba kopií

Původní kolonie, rostoucí na každé plotně byly přeneseny na nitrocelulosové filtry o průměru 137 mm tak, že suchý filtr byl přitlačen na horní stranu plotny s koloniemi a pak byl opět sejmut. Z každého originálního filtru byly pak připraveny dvě totožné kopie běžným způsobem tak, aby bylo možno přesně označit části, které si odpovídají. Každý původní filtr byl opatrně úložen koloniemi vzhůru na sterilní filtrační papír (Vhatman 3 MM), nacházející se na skleněné desce.

Pak byl na tento filtr uložen předem zvlhčený nitrocelulosový filtr, tento filtr byl přikryt druhým z

já větším úsekem filtračního papíru a filtry pak byly k sobě přitlačeny druhou skleněnou deskou.

Piltry byly očíslovány a byly na třech nesýmetrických místech propíchnuty špendlíí kem tak, aby bylo možno je v budoucnosti znovu přesně přiložit. Pak - by la. kopí e oddělena_ od původního.fi1 trua byla ..........

uložena koloniemi vzhůru na novou plotnu s L-bujonem, agarem a tetracyklinem. Okamžitě bylo pak stejným způsobem přiložen další čistý filtr, čímž byla získána další kopie. Pak byl původní filtr navrácen

V

I

- 75 na agarovou plotnu a všechny plotny byly několik hodin inkubovány při teplotě 37 °C, po této době měly kolonie bakterií průměr přibližně 1 mm. Původní filtry byly skladovány při teplotě 4 °C k přípravě kopií, sloužících k hybridizaci svrchu uvedeným způsobem.

V z

Stupen 7 Úprava filtrů pro hybridizaci

Každá kopie původního filtru, získaná ve stupni 6 byla uložena koloniemi směrem vzhůru na filtračním papíre (Whatman 3 MM), který byl zvlhčen 0,5 M hydroxidem sodným a 1,5 M chloridem sodným na 7 minut. Filtry pak byly neutralizovány, zvlhčeny na 2 minuty já 1 M Tris o pH 7,5 s

1,5 M chloridem sodným, načež byly znovu neutralizovány 5 až 10 minut a pak byly uloženy na filtry, zvlhčené pufrem SSC na 5 minut (0,015 M citrát sodný, 0.15 M chlorid sodný, pH 7,4), pak se filtry usuší na vzduchu, načež se zahřívají 1 až 2 hodiny ve vakuu na teplotu 80 °C.

- 76 Stupen 8 Isolace klonů cDNA CSP

Kopie filtrů byly ve dvojím proc vedení uvedeny do styku s včleněnou cDNA pCSP—1 po radioaktivním označení, plasmid byl připraven způsobem podle příkladu B. S cDNA hybridizovalo 20 kolonií. 12 z těcjko kolonií bylo odděleno a pěstováno přes noc v L-bujonu pro další analýzu. Materií., který byl získán rozštěpením restrikčním enzymem rsi 1 z těcht o klonů byl poněkud nesourodý,. avšak tři z těchto klonů měly téměř plnou délku požadovaného sledu. U jednoho z těchto sledů byX, proveden z

podrobný rozbor celého sledu. Sled, který byl kódem pro CSP v tomto klonu byl totožný s odpovídajícím sledem plasmidu, pCSF—1, což znamená, že obsahoval

T v poloze 365-CSP(Ile).

Příklad D

Čištění CSP z buněčné linie Mo

1 prostředí z pěstování buněčné linie Mo se inkubuje 30 minut při teplotě 55 °C

- 77 k inaktivaci viru HTLV-II, spojeného s touto buněčnou linií. Pak se prostředí zahustí ultrafiltrací pod tlakem při použití zařízení Pellicon Casette 2 s membránou PTGC(l/6 m ), se schopností oddělit ±x látku do molekulové hmotnosti 10 000. Bílkovina se pak Α&ή dále koncentruje vysráženám síranem amonným do nasycení na 80 %. 800 mg výsledné bílkoviny se znovu uvede do suspenze ve 100 ml 20 mmol tris(hydroxymethy1)aminomethanhydrochloridu (Tris-HCl) o pH / 7,4 a materiál se pak dialyzuje proti témuž pufru celkem 3x vždy při použití 4 1 pufru. Dialyzovaná bílkovina se pak nanese na sloupec o rozměrech 2,5/ x 10 cm s obsahem DEAE (diethylaminoethyl)-ultrogelu, v rovnovážném stavu v tomtéž pufru. Sloupec se pak promývá 800 ml 20 mmol tris-HCl o pH 4 a pak 800 ml 20 mmol tris-HCl o pH 7,4 s obsahem 0^2 M z

chloridu sodného, čímž se počne vymývat látka s učiňz ností CSP. Odebere se řada frakcí po 10 ml, účinné frakce se slijí. Jde celkem o tři frakce, které se zahustí na 1/6 svého objemu, tj. na 5 ml ultrafiltrací pod tlakem při použití membrány Amicon ΣΜ5, která odděluje sloučeninu do molekulové hmotnosti 5000). Koncentrovaný vzorek z DEAE-sloupce se nanese na sloupec o rozměru 1,6 x 100 cm s obsahem

- 78 AcA44 ultrogelu (akrylamidagarosový ultrogel s frakci i onací do 10 až 130 k jednotek molekulové hmotnosti) sloupec je v rovnovážném stavu ve 20 mmol kyseliny N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonové (HEPES), o pH 7,4 s 50 mmol chloridu sodného a 0,01 Jo polyethylenglykolu (PEG-8000). Látka s účinností CSF, která byla vymývána ze sloupce měla molekulovou hmotz nost 30 k jednotek. Účinné frakce byly slity a byla k nim přidána kyselina trifluoroctová (TPA) do koncentrace 0,15 objemových procent přidáváním 10ýj roztoku této kyseliny, načež byla získaná směs nanesena na sloupec o rozměrech 1 x 25 cm s obsahem prsstředku Vydac C^ v reversní fázi. Sloupec byl vyvíjen lineárním gradientem 0 až 90 % acetonitrilu v 0,1 % objemovýhh TFA rychlostí 4 ml/min, bylo získáno celkem 1000 ml eluátu. Látka s účinností CSP se vymývá při koncentraci acetonitrilu přibližně 47 objemových.

z

Účinné frakce se slijí a upraví se na koncentraci 0,05 /£> objemových kyseliny heptafluormáselné (HFBA) přidáním 0,15$-j HFBA a získaný, materiál. se pak nanese na sloupec o rozměrech 0,46 x 25 cm s obsahem prostředku Vydac C^ v rovnovážném stavu ve HFBA o koncentraci 0,15 % objemových. Sloupec se vyvíjí lineárním gradientem 0 až 90 ^c/o objemových acetonitrilu

- 79 v 0,15 /o objemových HFBA rychlostí 1 ml/min, získá z

se celkem 340 ml eluátu. Látka s účinností CSF se vymývá při koncentraci aeetonitrilu přibližně 53 % objemových. Účinné jsou frakce 37 až 44, každá z nich měla objem 1 pl. 0,15 ml frakce 40 hylo zahuštěno na 1/4 objemu při použití koncentračního zařízení SAVANT Speed Vac a pak bylo přidáno 40/ul 2x SDS pufru (0,125 M Tris-HCl o pH 6,8, 4 % SDS, % glycerolu a 0,004 % bromfenolové modři). Tyto vzorky byly povařeny 2 minuty a pak byly naneseny na 13,5% SDS gel způsobem podle Jí publikace Lammli, U. Nátuře 227. 680 (1970), jak je znázorněno na obr. 2. Frakce 40 měla účinnost 110 000 jednotek/ml při použití buněk kostní dřeně. To odpovídá přibliž? 7 ně 3,0 x 10 jednotek na jednu jednotku absorbance ^280’ ^^ro^°^^e typické bílkoviny mají extinkení koeficienty v rozmezí 0,8 až 1,2 jednotek -^280 ^v ligramu, má čištěný CSF specifickou účinnost v rozmezí 1 x 10 až 4 x 10 jednotek/mg. Vzorek 1/Ug čištěného GM-CSF byl podroben Sdmanově degradaci při použití zařízení, Applied Biosystems Gas Phase Microsequenator. Sled mezi zbytky 3 až 5 byl Ala Arg Ser.

Příklad Ξ

Kotransformací a amplifikací sledu CSP v buňkách CHO byl včleněn plasmid p91023(B)-C3P do buněk DUKX-B11, které neobsahují DHPR CHO, jak bylo popsáno v publikaci Chasin a Urlaub PNAS z

zi, 4216 (1980), a to fúzí protoplastu, popsanou v publikaci Sandri-Goldin a další, Mol. Cell. Bio. 1, 743 - 752, 1981. Růst a udržování buněk CHO bylo popsáno v publikaci Kaufman a Sharp, J. Molx Bio

150. 601 - 621, 1981. Při provádění fuze protoplastů byl plasmid p91023(B)-CSP-l včleněn děr kmene

E. coli HB101 a baktenie byly pěstovány v 50'ml prostředí m9 s obsahem solí a 0,5 % aminokyselin kase inu, 0,4 glukosy, 0,012 °/a síranu hořečnatého, 5/Ug/ml thiaminu a 10/Ug/ml tetracyklinu do ádsorbance 0,6 při 600 nm. Chloramfenicol byl přidán do koncentrace 250/Ug/ml a kultura byla inkubo/vána při teplotě 37 °C k pomnožení kopií plasmidu. Pak byly buňky odstředěny při 3000 otáčkách/min po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a pak byly uvedeny do sus penze ve 2,5 ml chlazené 20a sacharosy v 50 mmol Tris-HCl o pH 8,0. Pak byl přidán lysozym, a to 0,5 ml roztoku o koncentraci 5 m$/ml v 0,25 M

- 81 Tris-HCl o pH 8,0 a směs se pak uloží do ledu na minut. Pak se přidá 1 ml 0,25 M SDTA o pH 8,0 a směs se uloží do ledu na dalších 5 minut a pak se přidá 1,0 ml' 0,05 M Tris-HCl o pH 8,0 a suspenze

4· se inkubuje 15 minut při teplotě 37 C, po této době se bakterie přemění na protoplasty. Pak se suspenze pomalu zředí 20 ml předehřátého prostředí, které obsahuje 10 Jó sacharosy a 10 mmol chloridu hořečnatého, načež se směs nechá stát 15 iainutjf při teplotě 37 °C. Pak se přidá roztok protoplastu (přibližně 10⁹/ml) k buňkám DUKX-B11 bez DHPR CHO v plotnách o šesti vyhloubeních v množství přibližně 1 x 10 buněk/vyhloubení v poměru přibližně 1 až 2 x 10 protopíastu/bunka a protoplasty se peletuv jí spolu s buňkami odstředěním 8 minut při 2000 ot/min při použití odstředivky IEC model K. Po odstředění se supernatant odsaje a přidají se 2 ml roztoku polyethylenglykolu (50 g PE0-1450, Baker Chem. Co. v 50 ml prostředí) do každého vyhloubení v

svrchu uvedené plotjcny. Pak se buňky znovu odstředí 90 sekund při 2000 ot/min, roztok polyethylenglykolu se odstraní a plotny se opláchnou 3x vždy 4 ml v

prostředí/vyhloubení, Pak se buňky zpracují působením trypsinu, uvedou se do suspenze v 10 ml pro- 82 středís obsahem 10 % fetálního telecího sera a pak se odstředí ve zkumavce (konické) při 500 ót/rain v v

běžné odstředivce. Peletované buňky ze tří vyhloubení se spojí a nanesou na plotnu o průměru 10 cm, ke každé plotně se přidá čerstvé prostředí, které obsahuje 100/Ug/ml kanamycinu, thymidinu, adenosinu, deoxyadenosinu, penicilinu a streptomycinu a 10 % dialyzovaného fetálního telecího séra. Kanamýcin se přidává k jí zamezení růstu jakýchkoliv bakterií, které by přetrvávaly při přěměně na protoplastv. Tft

Po dvou dnech byly buňky přeneseny v poměru 1 : 15 do prostředí a- s 10 % dialyzovaného fetálního tllecího sera, penicilinu a streptomyV činu, avšak bez nukleosidů. Pak bylo k buňkám přidáno totéž selektivní prostředí bez nukleosidů ještě po 4 až 5 dnech.

Kolonie se objevily po 10 až 12 dnech pěstování v selektixním prostředí. Pak byly prováděny dva pokusy na selekci působením methotraxatu (MTX) a pokus na amplifikaci. V první sérii pokusů byly izolovány jednotlivě nezávisle klonované transformanty podle exprese DHFR a každý klon

- 83 byl pěstován za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci počtu kopií cizorodé DNA, t j . při pouúžití stoupajícího množství methotrexátu. Při druhé sérii pokusů byla izolována směs nezávislých transformantů podle exprese DHFR a tato směs byla dále pěstována za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci cizorodé DNA, tj. při stoupající koncentraci methotrexátu. Pak byly izolovány jednotlivé klon_v a analyzovány na expresi GM-CSF. Klony, které vykazovaly z v nejvyšší úroveň exprese GM-CSF byly dále pěstovány za podmínek, při nichž dochází k amplifikaci cizorodé DNA, tj. při stoupající koncentraci methotrexátu v živném prostředí.

Při jednom z pokusů bylo spojeno sedm transform^ntů DHFR⁺ v prostředí a bea nukleov sidů. Tyto buňky pak byly pěstovány při stoupající koncentraci MTX od 0,02/umoi přes 0,1 a 0,5 až do

Z

2,0/umol. Při zkoumání na účinnost GM-CSF při použití buněk KG-1 bylo možno prokázat 3000 až 12 000 jed *

notek/ml. Tyto buňky pak byly klonovány v 0,5 a2,0 /umol MTX. Klony, které bjřly získány v 0,5 ^umol MTX (klony 010, D2 a B6) byly postupně podrobeny selekci na růst v 2,0/umol MTX. Při zkouškách na účinnost

GM-CSF při pokusu s buňkami KG-1 produkovaly klono- 84 váné buněčné linie 15 000 až 300 000 jednotek/ml, z v této účinnosti. GM-CSF, produkovaný buňkami při provádění způsobu podle tohoto příkladu má sled aminokyselin, uvedený pro CSF-Thr na obr. 1.

Příklad F

Exprese GM-CSF v Ξ. coli

Exprese GM-CSF bylo dosaženo v Ξ. coli při použití vektoru pTALC-195R, jde o materiál, který je znázorněn na obr. 6. Sled, který z

je kódem pro GM-SSF začíná syntetickým sledem ATG CCA CCA CCT CCT TCT CCA TCT CCA TCT ACT, který určuje počátečních jedenáct zbytků aminokyselin z z l úplného GM-CSF. Zbytek sledu, který je kódem pro ě ·

Gíl-CSF v pTALC-185R je totožný se sledem v pCSF-1, nukleotidy 97 - 447, načež přichází sled TAB TAS TAG. Pak ihned následuje terminační sled, sestávající ze tří částí a z navázaného sledu p-UC-18, Do genu pro CSF byl včleněn gen pro odolnost proti tetracyklinu z plasmidu pBR322 s orientací opačnou než je orientace genu pro CSF 100 baží směrem dolů od sledu pUC—18. Gen pro odolnost proti tetracyklinu

- 85 nese svůj vlastní promotor. Pak se ve směru opačném než je směr hodinových ručiček nachází gen pro β-laktamásu a pak sled z pUC-18 (CoLEl) pro počátek replikace.

Konečnou strukturou plasmidů před návratem ke sledu pro CSP je promotor PL. Tento promotor je v podstatě popsán v publikaci A. Skatzman a M. Rosenberg (v ”Molecular cloning, a laboratory manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 419). Exprese CSP je řízena promotorem PL po tepelné indukci ve vhodném kmenu Ξ. coli jako hostiteli.

Kmenem, použitým pro všechny tyto konstrukce byl kmen ¥3110 ΙηοΙθΣδ, popsaný v publikaci R. Brent a M. Ptashne PNAs 78 (1981) 4204 - 4208

Fragment AdNA ( -nukleotidy 34499 až 38214) byl integrován do chromosomu ¥3110 lacI^wL8 v místě lacZ. Integrace byla provedena při použití integračního vektoru, složeného ze sledů pBR325, nesoucích geny pro odolnost proti chloramfenikolu a ampicilinu a také počátek pro replikaci z pBR322, jak bylo popsáno v publikaci P. Bolivar Gene 4 (1978) 121 - 136. Fragment Λ DNA se včlení do genu lacZ, který je sám v plasmidů přítomen jako fragment, který zasahuje od místa BstEil v Lácí k místu TthillI

- 86 směrem dolů od lacZ.·}

Integrace «Λ DNA do £ chromosomální kopie % lacZ bylo dosaženo bomologní rekombinací a byly získány lac⁺, na ampicilin citlivé a proti chloramfenikolu odolné kolonie. K další rekombinaci, která vedla k odstranění všech přídatných sledů plasmidů při ponechání integrovaného fragmentu }[ DNA došlo na plotnách MacConkeyho s obsahem lak+ s ?

tosy. Počáteční fenotyp lac , amp , can se změnil — s s po druhé rekombinaci na fenotyp lac , amp , cam . Výsledný kmen byl nazván GL400 a měl vlastnosti -4* při teplotě 30 °C a A při teplotě 42 °C. Tento fenotyp prokazuje existenci funkční chromosomální kopie sůsůx alely 0Ιθ^_φ

Kmen GL400 byl převeden na Ion transdukcí PL z lysátu kmene SG20252 (lae Á ul69, ara A 139 rpsl Ion Δ 100::Tnl0). TnlO byl nalezen·}

S při testech na Tet na selektivních prostředích, jak bylo popsáno v publikaci S. Maloy, V. Nunn, J. Bacteriol.145 (1981) 1110 - 1112.

Výsledný hostitelský kmen byl nazván GI413 (lacl°L8, LacZ A . (Aci, REK, N), Ion Δ 100 pTALC-l85R byl transformován na GI413. Kultura tohoto kmene, která vyrostla přes noc,

- 87 byla pěstována při teplotě 30 °C v 5 ml indukčního prostředí s obsahem 7/Ug/ml tetracyklinu. Indukční prostředí obsahuje v 1 litru g aminokyselin kaseinu 6 g Na₂HP0₄.7H₂0 3 g KH₂P0₄

0,5g NaCl 1 g hh₄ci fy glycerolu mg vitaminu 3^ mg ¥aCl₂.2H^0 0,2 g MgCl₂.6H₂0 ml tohoto prostředí s obsahem 7yUg/ml tetracyklinu se naočkuje 125 yul svrchu uvedené kultury a kultura se dále pěstuje na vodní lázni při teplotě 30 °C za třepání tak dlouho, až živné prostředí dosáhne optické hustoty 0,5 při Α^θ. Pak se prostředí rychle přenese do vodní lázně o teplotě 40 °C a protřepává se další 2 hodiny k dosažení syntézy GM-CSF. Buňky se oddělí a prokazuje se v

obsah CSP v těchto buňkách elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu. Za těchto podmínek se GM-CSP nahromadí tak, že tvoří přibližně 5 fy buněčných bílkovin íříklad G

Exprese GM-CSF v Sažharomyces cerevisiae i

A. Konstrukce vektoru

Byl zkonstruován plasmid, který obsahoval gen pro enzym při biosyntéze uracilu (URA3) jako selekční gen při počátku replikace 2u. Plasmid byl odvozen od Ylp5, který byl popsán v publikaci Botstein a další, Gene 8, str. 17 - 24 (1979) při přidání fragmentu, obsahujícího počátek replikace z plasmidu kvasinek.

B. Isolace genu pro glyceraldehydfosfát

Dehydrogenása (GPDH)

Dva geny pro 8282 GPDH byly isolovány z kvasnic, jak bylo popsáno v publikaci Holland a Hó 11and, Journal o f Bi o 1o g ic a 1'Chemi s try' 255 ~ str. 2596 - 2605 (19S0). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaný z uveřejněného sledu byl užit k isolaci genu pro GPDH ze sestavy plasmidů DNA genomu kvasnis při použití standardních způsobů. Plasmid, — 89 — který obsahuje celý gen GAP491 byl již čLo sbírky uložen dříve pod č. A TCC č. 39777.

C. Příprava promotoru glvceraldehydfosfátdehvdroge-_ názv pro expresi heterologního genu

Byl zkonstruován plasmid, v němž se « udržuje přirozený odstup promotoru GPDH od začátku ^w požadovaného heterologního strukturálního genu. Tohoto cíle bylo dosaženo tak, že bylo včleněné místo pro působení enzymu KpnI bezprostředně ke kodonu pro methionin na počátku strukturálního genu pro GPDH.

Tato oblast byla pak včleněna do vektoru pro expresi YOpl leva sni c.

D. Isolace genů pro faktor cc

Gen pro faktor a (fenomon) byl rovněž isolován z kvasnic a byl popsán v publikaci Kurjan a Herskowitz Cell, sv. 30, str. 933 - 943 (1982). Vzorek oligonukleotidu, syntetizovaného z tohoto sledu byl' užit k isolaci genu ze sestavy plasmidů DNA genomu kvasaáe. známým způsobem.

- 90 E. Příprava plasmidu pro expresi CS?

Ze svrchu uvedených součástí a z lidského genu pro CS? byl běžným způsobem zkonstruován vektor pro expresi AJ14, znázorněný na obr.

1. V tomto vektoru byl odstraněn přírodní vedoucí sled CS? a byl včleněn sled, který je kódem pro úplný CS? v bezprostřední blízkosti sledu pro faktor a. Spojení mezi promotorem GPDH, pre-pro sledem pro faktor α a sledem pro úplný CS? je znázorněno dále a bylo potvrzeno tak, že byl analyzován sled dideoxynukleotidu.

AAATAAACAAAATG.CGTTTTCCTTCA .....AAA AGA GAG GCG GAA

GCT.GCA CCC GCC CGC TCG ...

z *

JVt

GM-CSF

Claims (23)

1. ./ y

   PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vektor zahrnující gen kódující bílkovinu primátů, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr.

   1 za šipkou pro CSF-Thr, CSF-Ile nebo CSF-G, nebo její alelické nebo jiné funkční ekvivalenty, zachovávající si aktivitu GM-CSF v testu na lidské kostní dřeni, ve kterých je alespoň jedna aminokyselina přidána, nahrazena nebo odstraněna.
2. 2. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na ’ obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, nebo její alelické nebo jiné funkční ekvivalenty, jak jsou definovány v nároku

   1.
3. 3. Vektor podle' nároku 1 nebo 2, přičemž funkční ekvivalenty GM-CSF primátů, pokud se vyčistí, mají v testu na lidské kostní dřeni aktivitu alespoň 1.10⁷ jednotek na mg bílkoviny.
4. 4. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Thr.
5. 5. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-Ile.
6. 6. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen kóduje bílkovinu, která má aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 1 za šipkou pro CSF-G.

   -------—
7. 7 Vektor p o dle - n á r o ku 4, 5 -neb o 6, - -kde—aminoky se- - - — linová sekvence bílkoviny, kterou kóduje uvedený gen, dodatkově zahrnuje na svém. N-konci signální sekvenci, která předchází šipce na obr. 1.
8. 8. Vektor podle nároku 4, 5 nebo 6, kde aminokyselinová sekvence bílkoviny, kterou kóduje uvedený gen, dodatkově zahrnuje na svém N-konci'methioninový zbytek.
9. 9. Vektor podle nároku 1, kde uvedený gen zahrnuje sekvenci uvedenou na obr. 1 pro CSF-Thr nebo CSF-Ile, začínající za šipkou a končící na kodonu odpovídajícím aminokyselině v poloze 127.
10. 10. Vektor podle nároku 1, kterým je plasmid p91023(B) deponovaný pod číslem ATCC 39754.
11. 11. Hostitelská buňka, která je transformována vektorem podle libovolného z nároků 1 až 10.
12. 12. Hostitelská buňka podle .nároku 11, transformovaná vektorem podle libovolného z nároků 2, 3, 4, 5, 9 nebo 10.
13. 13. Hostitelská buňka podle nároku 11 nebo 12, která je prokarvotická.
14. 14. Hostitelská buňka podle nároku 13, kterou je Escherichia coli.
15. 15. ^Hostitelská buňka podle nároku 11 nebo 12, která je eukaryotická.
16. 16. Hostitelská buňka podle nároku 15, kterou je kvasinková buňka.
17. 17. Hostitelská buňka podle nároku 15, kterou je savčí buňka.

    Γ Γ

    - 93
18. 18. Hostitelská buňka podle nároku 17, kterou je buňka vaječníku čínského křečka.
19. 19. Způsob výroby bílkoviny GM-CSF primátů, vyznačující se tím, že se kultivuje buňka podle libovolného z nároků 11 až 18 a izoluje se bílkovina GM-CSF.
20. 20. Způsob výroby bílkoviny GM-CSF primátů, podle nároku 19, vyznačující se tím , že se kultivuje buňka podle libovolného z nároků 12 až 18 a izoluje se bílkovina GM-CSF.
21. 21. cDNA, která odpovídá genu uvedenému v libovolném z nároků 1 až IC.
22. 22. cDNA podle nároku 21, která odpovídá genu uvedenému v libovolném z nároků 2, 3, 4, 5, 9 a 10.
23. 23. cDNA plasmidu p91023(B), který je deponován pod číslem ATCC 39754.

    / \ Obr. í. ž T £* .-n / 20 i 1 '' *1'·