JPH02501925A

JPH02501925A - ヒト　インターロイキン‐３　蛋白質

Info

Publication number: JPH02501925A
Application number: JP63502770A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，ダーク・エム; コスマン，デービッド・ジェイ; プライス，ヴァージニア・エル
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1987-01-20
Filing date: 1988-01-11
Publication date: 1990-06-28
Also published as: EP0342206A4; AU1496688A; WO1988005469A1; EP0342206A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒト　インターロイキン−３蛋白質発明の背景本発明は概ね、コロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）、そして特に、精製された組換えヒト　インターロイキン−３（ＩＬ−３）蛋白質組成物に関するものである。

造血細胞の分化及び増殖は集合的にコロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）として知られる、分泌型糖蛋白質によって制御されている。ネズミ類及びヒトの系ではこれらの蛋白質は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ８Ｆ）、これは正常骨髄から、顆粒球およびマクロファージの産生を促進し、また成熟、分化した顆粒球とマクロファージの活性を制御するらしいとも考えられている；を含む。

他のＣ５Ｆは、マクロファージの選択的増殖及びバースト促進活性（ＢＰＡ）；これは赤血球前駆細胞を、ヘモグロビン含有細胞に誘導する作用である；を上昇させる作用のあるマクロファージＣ５Ｆ（Ｍ−ＣＳＦ又はＣ５Ｆ−１）を含む。

さらに、初めネズミ類の系で単離され、更に最近ヒトの細胞由来で単離されたＣＳＦは、ＩＬ−３またはマルチ−Ｃ３Ｆ（ｍｕｌｔｉ−Ｃ３Ｆ）と命名されている。

ネズミ類ＩＬ−３は初めイール（ｌｈｌｅ）ら（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６：２１８４（１９８１））により、Ｔ細胞関連酵素である２０α−ハイドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ（２０ａ　−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現を誘導する因子として同定された。この因子は単一に精製され、早期造血系、及びリンパ球系前駆細胞の多くのサブクラスの増殖と分化を制御することが示された。ネズミ類ＩＬ−３に対応するｃＤＮＡクローンは、初めファン（Ｆｕｎｇ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３０７：　２３３（１９８４））及びヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：　１０７０（１９８４））によって分離された。テナガザル及びヒトのゲノムＤＮＡにおける、ネズミ類のＩＬ−３配列と相同な配列は、ヤン（Ｙａｎｇ）ら（Ｃｅｌｌ　４７　：３　（１９８６））によって開示された。

ヒトのＩＬ−３相同配列についても予想されたアミノ酸配列は、ネズミＩＬ−３に対して約２９％の相同性があフた。しかしながら生物学的活性はテナガザルの配列の転写産物のみにしか報告されていない。イール（Ｉｈｅｌ）とワインシュタイン（讐ｅｉｎｓｔｅｉｎ）は（Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３９：　１（１９８Ｂ））　Ｉ　Ｌ　−３の生物学的活性に関する発表の包括的な総説を示している。

様々な（血液）細胞減少症の治療薬としての臨床における実用可能性を考慮すると、血液学及び腫瘍学の見地からＩＬ−３に対する興味が持たれる。ヒトＩＬ− ３活性のある、治療組成物（治療薬）は伝染性の病原体に対する免疫反応性を高めるため、或はウィルス感染、放射線療法、化学療法等によって誘発された造血細胞の抑制の後に、正常血液細胞集団を再生する目的のために使われ得るであろう。

発明の概要本発明は微生物の系で高率に発現し、分泌されている組換えヒトＩＬ−３蛋白質に関するものである。また、本発明は、蛋白質をコードする核酸配列を構成する組換え発現ベクター、関連した微生物発現系及び微生物発現系を用いて蛋白質を作るプロセスにも関するものである。

図面の簡単な説明本発明は概ね、コロニー刺激因子（Ｃ８Ｆ）、そして特に、精製された組換えヒト　インターロイキン−３（ＩＬ−３）蛋白質組成物に関するものである。

造血細胞の分化と増殖は集合的にコロニー刺激因子（ＣＳ　Ｆ）として知られる分泌糖蛋白質によって制御されている。ネズミ及びヒトの系では、これらの蛋白質は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）も含み、これは正常骨髄からの顆粒球及びマクロファージの生産を促進し、また、成熟、分化した顆粒球とマクロファージの活性を制御するらしいとも考えられている。他のＣ３Ｆは、マクロファージの選択的増殖及びバースト促進活性（ＢＰＡ）；即ち赤血球前駆細胞を、ヘモグロビン含有細胞に誘導する作用；を上昇させる作用を有するマクロファージＣ３Ｆ（Ｍ−ＣＳＦ又はＣ３Ｆ−１）を含む。

初めネズミの系で単離され、更に最近ヒトの細胞から単離された更に別のＣ５Ｆは、ＩＬ−３またはマルチ−ＣＳ　Ｆ　（ｍｕｌｔｉ　−Ｃ３Ｆ）と名づけられた。

第１図は、成熟したポリペプチド中の８番の位置にプロリン残基をもつ、ヒトーＩＬ３蛋白質（ｈｌＬ−３（Ｐ８）と表す）の核酸配列及び対応するアミノ酸配列を示す。

のＴ−リンパ細胞（Ｐ　Ｂ　Ｔ）から分離されたポリアデニル化ＲＮＡを逆転写して調製された、ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ライブラリーを従来のＤＮＡハイブリダイゼーション法によってスクリーニングするために、天然ヒトゲノムＤＮＡ配列のＮ−末端及びＣ−末端領域と配列相同性のある合成オリゴヌクレオチドプローブが用いれらた。ＤＮＡはプローブとハイブリダイズしたクローンから抽出され、制限酵素切断、アガロースゲル電気泳動、そして更に、電気泳動されたフラグメントを含むハイブリダイゼーション実験（゛サザンプロット ″）を行うことによって解析された。それぞれのプローブとハイブリダイズしたいくつかのクローンを単離したのち、一つのｈＩＬ−３クローンのハイブリダイズした遺伝子セグメントがサブクローンされ、従来の方法により配列決定された。このセグメントもまた、イン◆ビトロでＲＮＡに転写され、この情報ＲＮＡにキャップ構造をつけ、ポリアデニル化してアフリカッメガエルの卵に注入された。この結果生成した卵内の翻訳産物は、以下に示すようなヒト骨髄中で造血細胞の増殖促進能を定量する方法で検査された。

ＰＢＴライブラリーから単離されたいくつかのクローンを配列決定したところ、それぞれのクローン共に、成熟したｈＩＬ−３配列の８番目の位置にプロリン残基が存在することが示された。ｈＩＬ−３配列の一つをある特定のプロモーターの制御下にある、酵母発現ベクターに挿入した。このベクターを適当な酵母の発現株中に形質転換して、酵母プロモーターの脱抑制を促進する条件で増殖させた。その結果得られたイーストの培養上清には、高レベルのｈｌＬ−３（Ｐ８）が産生されていることが確認された。

定　義 “ヒト　インターロイキン−３“及び“ｈＩＬ−３″とは、顆粒球、マクロファージの増殖を促し、そして多能性造血幹細胞集団から赤血球の前駆細胞を分化させる作用のある、ヒト内因性分泌蛋白質を示す。明細書に用いられているように、この語はＩＬ−３の生物学的活性を持ち、先に第１図で示した配列に実質的な相同性を持つ蛋白質を意味する。“実質的な相同性″とは核酸とアミノ酸配列の双方に当てはまるが、ある特定の目的配列、例えばミュータント（変異）配列が、比較すべき配列と一つ或いはそれ以上の置換、欠失、挿入によって異なり、しかし全体の機能としては、目的配列と比較される配列とで異なることがないことを言う。本発明の目的においては９０％以上の相同配列があり、同等の生物学的活性を有し、同等の発現特性を持つものを実質的に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）という。相同性の程度がそれよりは低く、しかし匹敵する生物活性があり、同等の発現特性をもつものは”同等（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）　’という。

“ミュータント（変異）アミノ酸配列′とは、意図的に天然の配列から変異させた核酸配列にコードされたポリペプチドを指す。″ミュータント蛋白質″或いは ”ミューティン（ｍｕｔｅｉｎ）”とは、ミュータンドアミノ酸配列を構成する蛋白質を意味する。“天然配列”とは、遺伝子や蛋白質の野生型或いは天然型と同一のものを指す。“ＫＥＸ２プロテアーゼ認識サイト″及び“Ｎ−グリコジル化サイト″は以下に定義されている。本発明の特定の観点を定義するために使われている“不活性化”という語は、ある選ばれたＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位をサツカロミセス中セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２プロテアーゼによる切断を遅延或いは阻害するために変化させること、及びまた、ある特定のアミノ酸残基へのオリゴ糖成分の共有結合を阻害するために、Ｎ−グリコジル化部位を変異させることを言う。

組換え体″とは、ここで使われているように、蛋白質が組換え微生物（例えばバクテリア、細菌）発現系由来であることを示す。遺伝子生産物については、この語はヒト蛋白質が実質的に天然の内因性物質の混入していない状態であり、且つ天然のグリコジル化は受けていない状態を定義する。バクテリアで発現された蛋白質は多糖類を結合していない。酵母で発現された蛋白質は、哺乳動物細胞で発現される蛋白質とは異なるグリコジル化のパターンを示す。“未精製の酵母培養上清”とは、酵母培養びんから採取した培地で、濃縮や精製操作を行っていないものを言う。この明細書中に用いられている“精製された”とは、組換え蛋白質が蛋白質組成物の形で、ヒト骨髄増殖試験で少くとも１×１０６単位／ｍｇの比活性を持つ状態を言う。この明細書中に開示する微生物発現系は、定量的な精製をするために充分量のヒトＩＬ−３を発現する程度の効率を持つ。１０７から１０８単位／＋ｎｇの比活性は、最終的な産物を表わす基準と考えられる。

“ＤＮＡセグメント（断片）″とは、独立したフラグメント（断片）の形のＤＮＡポリマーを指すか、或いはもっと大きなりＮＡ組成物の一部という形で、少なくとも一回は実質的に精製された状態（つまり、標準的な生化学的手法で、例えばクローニング・ベクターを用いて同定、操作、セグメントやその構成ヌクレオチド配列の回収ができる程度の質と濃度）でＤＮＡから抽出されたＤＮＡポリマーのことを言う。“ヌクレオチド・シーフェンス（核酸配列）″とは、デオキシリボ核酸のヘテロポリマーを言う。“組換え発現ベクター”とは、（１）プロモータ、エンハンサ−等のように遺伝子発現を調節する働きのある遺伝因子の１つもしくはそれ以上及び（２）ｍＲＮＡに転写され、蛋白質に翻訳される構造配列或いはコーティング配列が集合してなり、転写ユニットを構成するプラスミドを言う。

転写ユニットは、宿主細胞で翻訳された蛋白質の細胞外への分泌を可能にするリーダー配列を持つことが望ましい。“組換え発現系°とは、発現ベクターと適当な宿主微生物との組み合わせを言う。酵母の発現系、好ましくはサツカロミセス・セレビシェを用いた系が本発明における蛋白質産生に用いられている。

ｈＩＬ−３の生物学的活性検査法ｈＩＬ−３の生物学的活性を測定するためのアッセイ方法が以下に示されている。

１、ヒト骨髄増殖アッセイ新しく調製されたヒト骨髄細胞は、５０単位／ｍｌペニシリン、５０■／ｍｌストレプトマイシン及び３００Ｒ／ｍｌの新しいし一グルタミンを含む、あらかじめ加温、加ガス（５％Ｃ０２）された無血清ＲＰＭ１１６４０培地（Ｇｉｂｅｏ社、　Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ、　ＯＨ，ＬＩＳＡの製品）（以後″アッセイ（検査）培地”と呼ぶ）の入った組織培養フラスコ中、１ｍｌあたり２Ｘ１０６細胞となるようにして、３７℃、５％Ｃ０２下で２時間、前培養（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）された。

前培養ののち、非接着性細胞は、フラスコの表面を培地で穏やかにピペッティングすることによって除いた。

非接着性細胞を４℃にて１０００回転で１０分間遠心分離することによって集め、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む少量のアッセイ（検査）培地に再懸濁し、トリバンブルー染色で生存率、タークス（Ｔｕｒｋｓ）染色で白血球の回収率をカウントした。

細胞はアッセイプレートに注入されるまで１０％ＦＢＳを含むアッセイ培地中、約４℃で保存された。

９６穴平底組織培養プレートのそれぞれのウェル（穴）に、５０μＱのアッセイ培地を加えた。それぞれの列の最初のウェルにアッセイ培地で希釈されたサンプルを５０μＱ加え、通常の方法でそれぞれの列について連続希釈を行った。

１００μΩに懸濁した１、２５Ｘ１０’の骨髄細胞をそれぞれのウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２下、乾燥を避けるため滅菌蒸留水を入れたプラスチック箱内で４日間培養した。

４日目に５％ＦＢＳ及び８μＣ１／ｍｌの（３Ｈ）−チミジン（８０キユ一リー／ミリモル（Ｃ１／ｍｍｏＮ　）　）を含むアッセイ（検査）培地２５μｇを各ウェルに加え、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２下５時間プラスチック箱内で培養した。培養後、細胞をグラスフィルター上に集め、洗浄し、シンチレーションカウンターによって取り込まれた放射活性を測定した。ｈＩＬ−３の活性の単位は、チミジンの最大取り込み量の５０％を起こすようなｈｌＬ−３の量に対して計算した。例えば、１００μｇのサンプル（検体）が１：２０の希釈でチミジンの最大取り込みの１／２　（の取り込み）を引き起こすとすれば１ユニツト（単位）は１００μｇの１／２０あるいは５μｇ中に含まれる活性と定義される。故にサンプル（検体は）１ミリリツトルあたり、１０００割る５、即ち２００ユニツト（２００Ｕ／ｍｌ）のｈＩＬ−３活性を持つことになる。

２、ヒト骨髄コロニー検査（アッセイ）この検査では５０μｇのサンプル（検体）をｆＬｏｇ−２希釈系列によって、それぞれのウェルに注入した。１．４％寒天懸濁液は沸騰湯浴中で加熱して調整し、使用まで４０℃に保持した。インキュベーション培地は７容の栄養培地〔ビタミン類、２８．５％ＦＢＳ、０．７Ｘ１０’Ｍの２−メルカプトエタノール、０．１２ｍｇ／ｍｌのアスパラギン、０．７＋ｎｇ／ｍｌのグルタミン、１５０Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１５０Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したα最少必須培地（α−ＭＥＭ））に、３容の寒天懸濁液を混合して調製し、３７℃に保温した。パーコール処理した骨髄細胞は、３７℃に加温し、最終濃度約１ＸＩＯ５細胞／ｍｌとなようにインキュベーション培地に加えた。この混合物は各ウェルに２５０μｇずつ注入する間、３７℃ に保温した。プレートは寒天が固化するまで約２３℃に置き、そののち乾燥防止のため蒸留水を加えたプラスチック箱内で３７℃で培養した。

５０個またはそれ以上の細胞を含むコロニー数は、それぞれ７または１０日と１４日後に数えた。早い時期の計数は顆粒球コロニーに良く、遅い時期の計数はマクロファージコロニーや混合コロニーに良い。それぞれのアッセイに於いてバックグラウンドのコロニー数を得るため、いくつかのウェルは造血系成長因子検体を入れずに培養された。１ミリリツトルあたりのコロニー形成ユニット（“ＣＦＵ／ｍ１″）として表されるｈｌＬ−３活性は、１×１０５骨髄細胞から形成される最大コロニー数の１／２を得るサンプル（検体）希釈に、最大の半分の場合に得られたコロニー数を乗じたものと定義される。コロニー中の細胞種は、個々の細胞を０．６％オルセインと６０％酢酸から成る染色液で染めることによって判別された。

天然ｈＩＬ−３の配列以下に示すようにして単離されたｈＩＬ−３ｃＤＮＡの核酸配列及びそれから推定されるアミノ酸配列は第１図に示されている。第１図では成熟天然蛋白質のＮ末端のアラニンに対応するＧＣＴコドンから始まるように、核酸に番号がつけられている。同様にアミノ酸はこのアラニン残基から番号づけされている。天然のポリペプチドは成熟蛋白質を分泌する過程で切断されるリーダー配列を含む。

ｈＩＬ−３のアミノ酸配列を含む組換えＤＮＡセグメント（断片）は、適当なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、或いは人工的に合成されたオリゴヌクレオチドの組み合わせによって得られる。選択の問題として、成熟蛋白質配列の第８番の位置にプロリン或いはセリンを指定するコドンを取り込んだｈＩＬ−３配列は合成可能である。

組換えイースト（酵母）の系に於ける蛋白質発現本発明の組換え蛋白質の発現にイーストの系が用いられ得る。望ましい発現ベクターは、セレクション（選択）と配列（Ａｐｖ　（アンピシリン耐性）遺伝子と複製開始点）を含み、かつグルコース−抑制性アルコールデヒドロゲナーゼ２　（ＡＤＨ２）プロモーターの入ったイーストＤＮＡ配列を含む、ｐＢｃ１０２　・Ｋ２２　（ＡＴＣＣ６７、２５５）より得られる。

ＡＤＨ２プロモーターは、Ｊ、　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５８：　２６７４（１９８２）にＲｕ５ｓｅｌ　ｌ　らによって、またＮａｔｕｒｅ　３００：　７２４（１９８２）にＢｅｉ　ｅｒらによって記載されている。プラスミドｐ　Ｂ　Ｃ１０２・Ｋ２２はまた、選択可能なマーカーとしてＴｒｐＩ遺伝子を、そしてイースト（酵母）２μ複製開始点を持つ。プロモーター近傍にはイースト（酵母）宿主の蛋白質とは異種の蛋白質の分泌を可能にするイーストα−因子のリーダー配列が存在する。α−因子のリーダー配列は、他の遺伝子への融合を容易にするために、その３′端近傍にＡｓｐ７１８（Ｋｐｎ　ＩとＡｓｐ７Ｌ８はイソ制限酵素（アイソシゾマー）である）制限酵素切断部位を含むように修飾しである。

ＢｒａｋｅらによってＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８１：　４６４２（１９８４）に記載されたように、分泌蛋白質の効率的なプロセッシングを行なうために、グルタミン酸−アラニン−グルタミン酸−アラニン（Ｇｕｌ　−Ａｌａ−Ｇｕｌ　−Ａｌａ）のアミノ酸をコードする配列は削除された。

他の発現ベクターは、α−因子のプロモーターを含むイースト（酵母）のベクター、例えば野生型のヒ）ＧＭ−Ｃ８Ｆ遺伝子を含むｐＹａＨｕＧＭ　（ＡＴＣＣ５３１５７）である。他のものは、技術に熟練した人たちに知られている。ｐＹａＨｕＧＭの構造は公開されたヨーロッパ特許出願第１８３．３５０号（公開番号第８５３０６８２．７号）に記載されており、この参照によってその開示内容は、本明細書に含まれているものとする。

形質転換に適当なイースト（酵母）株は、選択可能なマーカー及びベクターのその他の性質によって決定される。

ｐ　Ｂ　ＣｌＯ２−Ｋ２２又はｐＹａＨｕＧＭから得られる発現ベクターによる形質転換に適当なＳ　、　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ａ　ｔｒｐｔｇａＨａｄｅｌ　ｈｆｓ２；　Ｊ１７　（ＡＴＣｏ　５２６８３；　ａ　ｈ１ｓ２　ａｄｅｌｔｒｐｌ　ｍｅｔ１４　ｕｒａ３）　；の遺伝子型を持ち、Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎ、ｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ、　ＵＳＡ　［下記参照］より購入可能なＸ２１８１−　Ｉ　Ｂ株、そしてＩＬ１６６− ５Ｂ株（ＡＴＣＣ４８１８３；ａ　ｈｌｓＬ　ｔｒｐｌ）を含む。特にｐＢｃ１０２−に２２．　ＸＶ２１８１と一緒に使うために望ましい、発現株は、Ｘ２１８１−　Ｉ　ＢというＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｅｓ　ａｎｄＭｅｄｌｃａｌ　Ｐｈｙｓｌｃｓ、　Ｌ］ｎ１ｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ９４７０２、　ＬＩＳＡより購入可能な一倍体株と、ＸＶ６１７−１−３ＢというＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ワシントン大　遺伝学部門）　５ｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ９８１０５．ＵＳＡ　、或いはＩｍｏ＋ｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　５１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ、　５ｅａｔｔｌｅ、　ＷＡ９８１０１、　ＵＳＡから購入可能な一倍体株の２つの株を接合させることによって作られた二倍体である。形質転換の適当なプロトコールは、ＨｉｎｎｅｎらによってＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５：゛　＋１９２９（１９７ｇ＞に記載されたもので、Ｔｒｐ　となった形質転換体を０．６７％イースト窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０■／ｍｌアデニン及び２０ｇ／ｍｌウラシルの選択培地で選択する方法である。

ＡＤＨ２或いはα−因子プロモーターを持つベクターによって形質転換された宿主株は、発現のため１％イースト抽出液、２％ペプトン、１％グルコースから成り、８０ｕｇ／ｍｌアデニン、８０ｑ／ｍｌウラシルを加えた富栄養培地中で培養した。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は培地中のグルコースの消費によって起こる。

未精製のイースト培養上清は、濾過によって集められ、更に精製するまで、凍結成いは４℃で保存された。

ＩＬ−３の精製イースト株の発酵によって得られる組換えヒトＩＬ−３は、Ｌｌｒｄａｌ　らによってＪ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、　２９６：　１７１（１９８４）に、またＧｒａｂｓｔｅｉｎらによってＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３：　１４５０（１９８８）に報告された方法に類似の手順、即ち分取用ＨＰＬＣカラムによる、 −回或いは連続的な逆相ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーで精製され得る。

゛　例えば、ｈＩＬ−３を含むイースト培養上清は、０．４５μフイルターを通し、１０〜２０μ逆相シリカを充てんした５ｃｍＸ３０ｃｍカラム（Ｖｙｄａｃ社、　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐｅｒｌａ、　ＣＡ、　ＩＪＳＡ）に、流速１００ｍ１／ｗｉｎでポンプを用いて流される。カラムはイースト培養上清添加前に、０．１％トリフルオロ酢酸／水（溶液Ａ）で平衡化し、培養上清添加後、流出液の２８０ｎｍにおける吸収がベースライン値に近づくまで同溶液で流すことができる。

この操作後、０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（溶液Ｂ）のグラジェントを適用できる。このグラジェントは、溶液Ｂを０から６０〜１００％まで１分あたり１〜２％で変化させ、流速を１００ｍ１／ｗｉｎで行ない得る。グラジェント開始後、適当な時間（１０〜２０分）ののち、−分ずつのフラクションを集め、それぞれのフラクションについてポリアクリルアミドゲル電気泳動及びフルオレスカミン蛋白質定量法により、蛋白質含量を測定する。必要に応じて、ｈＩＬ−３を含む複数フラクションをプールし、濃縮し、０．９Ｍ酢酸−ピリジン、　ｐＨ４，０中、同様のＨＰＬＣカラムに再添加し、それを０．９Ｍ酢酸−ピリジン（ｐＨ４，５）と６０％ｎ−プロパツールのグラジェントで溶出して、更に精製することができる。

カラムから流出するフラクションは、フルオレスカミン分析で蛋白質濃度が、そして適当なアッセイ（検査）法によってｈｌＬ−３活性が測定されうる。指示された場合、更にＨＰＬＣの過程を組み込むことができる。

ＫＥＸ２の作用サイトの不活性化ネイティブ（天然）ｈｌＬ−３蛋白質は、５２番にアルギニン−アルギニンの対、そして１０６番目からアルギニン−アルギニン−リジンの３アミノ酸対を持ち、この部分がすしカロミセス・セレビシェのＫＥＸ２プロテアーゼで切断されると考えられる。

部位特異的突然変異誘発の手法を用いて、アルギニン−アルギニン、アルギニン −リジン、リジン−アルギニンといった塩基性の残基が隣接する組み合わせを削除、挿入、或いは置換によって除去し、ＫＥＸ２プロテアーゼ切断位置を不活性化することができる。リジン−リジンのベアはＫＥＸ２の切断をかなり受けにくく、アルギニン−リジン或いはリジン−アルギニンをリジン−リジンに変えることは、ＫＥＸ２サイトを不活性化するための保存的で且つ望ましい方法である。

この結果得られるミューティン（突然変異蛋白）は、分泌の際の切断が予定されたイーストα−因子リーダーシークエンス以外の部分ではＫＥＸ２プロテアーゼによる切断を受けにくくなっている。

Ｎ−グリコジル化部位の不活性化多くの分泌型蛋白質は、しばしば翻訳の後、アスパラギン側鎖にＮ−グリコシド結合によってオリゴ糖鎖が結合した形で、共有結合で結合した炭水化物部分を得る。個々の分泌蛋白質に結合されたオリゴ糖部分は、その形及び数に於いて変化に富み、結果的に一つの糖蛋白質が幅広い見かけの分子量を持つことになる。ｈＩＬ−３はこのような型の分泌糖蛋白質である。この変化に富む糖質成分に起因する不均一性のため、組換え系における糖蛋白質発現の試みは、複雑になり得る。例えばヒトやネズミの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）のような糖蛋白質の組換え体温合物を精製したものは、重量にしてＯから５０％の糖質を持つ。ミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）らは、グリコジル化を除去して酵母発現産物の不均一性を減らすため、Ｎ−グリコジル化部位に突然変異を誘起し、組換えネズミＧＭ−Ｃ８Ｆを発現する方法をＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　５；　１１９３（１９８Ｂ）に報告している。

組換え分泌糖蛋白質に変化に富む蛍の結合糖質が存在することは、精製手順を複雑にし、その結果収率を低下させる。更にこの糖蛋白質が治療薬として用いられた場合、受容者が酵母の糖質部に対しアレルギー反応を起こし、治療を中断せざるを得なくなる可能性がある。このような理由から生物学的活性をもち、免疫調節糖蛋白質の糖質部が除かれた均一な類縁体（以下、アナログと呼ぶ）が治療上必要とされている。

不活性化されたＮ−グリコジル化部位をもつ、ｈＩＬ−３の活性ミュータントアナログは、以下に示すような、オリゴヌクレオチド合成及びライゲーション（結合）或いは部位特異的突然変異誘発の手法を用いて製造できる。これらアナログ蛋白質は酵母発現系を用いて、均一で糖質が減少した形で高収率に得られる。本発明はネイティブ（天然型）ｈＩＬ−３の配列と相同なアミノ酸配列を持ち、少くとも一箇所のＮ−グリコジル化部位を不活性化するような一つ以上のアミノ酸の置換、削除、挿入を含む、ヒトＩＬ−３のアナログに関するものである。

真核細胞の蛋白質のＮ−グリコジル化部位は、Ａｓｎ−Ａｌ−Ｚという３つ組のアミノ酸で特徴づけられる；ここで、Ａ１はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｚはセリン又はスレオニンである。この配列に於いてはアスパラギンが糖鎖の共有結合のための側鎖アミノ基を供与する。このような部位は、アスパラギン或いはＺ残基を他のアミノ酸と置換したり、アスパラギン或いはＺを欠失させたり、或いはＡ１とＺの間にＺでないアミノ酸を又はアスパラギンとＡ１間にアスパラギン以外のアミノ酸を挿入することによって除去されうる。なるべく置換は保存的に行われる、即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、置換される残基と似た物理化学的性質を持つものである。同様に、欠失または挿入法が用いられる場合、生物学的活性に対する欠失や挿入の持つ影響も考慮されねばならない。

故に、Ｎ−グリコジル化部位を欠＜ｈｌＬ−３のアナログは第１図で示された、天然型配列と実質的に相同性のある、変異アミノ酸配列を含んだ蛋白質であり、天然型配列中の少くとも一つのＡｓｎ−Ａ’Ｚの配列がＡｓｎ−Ａ２−ＹまたはＸ−Ａ２−Ａ３の変異配列に置換されている。ここで、ＡＩ、Ａ２及びＡ３は同じことも異なることもあり、任意のアミノ酸であっても良く；Ｘはアスパラギン以外のアミノ酸であり；ＹはＺ以外のアミノ酸であり；そしてＺはセリン或いはスレオニンである。

天然型配列の全てのＡｓｎ−Ａ’−Ｚ配列が、変異配列中でＡｓｎ−Ａ２−Ｙ或いはＸ−Ａ２−Ａ３に置換されていることが望ましい。第１図に示されたｈｌＬ −３の配列を参照すると、この天然型配列は１５番から始まるＡｓｎＣｙｓＳｅｒ及び６８番残基より始まるＡｓｎＡ　ｌａｓ　ｅｒの三箇所の推定上のＮ−グリコジル化部位を持つことが分かる。Ａｓｎの適当な保存的置換アミノ酸は、Ａｓｐ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及びＴｈｒであり、中でもＡｓｐ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｕが望ましい。ＺがＳｅｔの場合、適当な置換は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｔ、　Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｎであり、特にＭｅｔ、Ｌｕｅ、Ｉｌｅ及びＶａｌが望ましい。Ｎ−グリコジル化部位を欠く蛋白質を得るために、他の保存的なアミノ酸置換も用いられうる。

いは一部を含む数多くのＤＮＡ構成物が、更に有用な制限酵素切断部位を含むオリゴヌクレオチドカセットと共に、都合良く調製できる。この系で産生されたｈｌＬ−３変異体と共に、上記発現ベクター及び上記のような構成物を構成するシステムも本発明の範囲内である。

天然型配列のフラグメントとライゲーション（結合）できるように、制限酵素切断部位を両端につけた変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の部位に変異を導入できる。ライゲーション（結合）に続いて、結果として得られる再構成された配列は、必要なアミノ酸の挿入、置換、或いは欠失を含む変異体をコードする。

別法として、オリゴヌクレオチドを対象とする部位特異的変異導入を、必要な置換、欠失、挿入による特定の変異コドンをもつ変異遺伝子を提供するために使用することも可能であ及び米国特許第４．５１８．５８４が適当な方法を開示しており、それらの内容も参照により本明細書に記載されていることとする。

どの方法に於いても、通常のオリゴヌクレオチド合成法、例エステル合成法が、適当である。

部位特異的変異導入に於いては、変異を受けるべき遺伝子に対応する、センス或いはアンチセンス鎖を構成する一本鎖（ＳＳ）、ＤＮＡを提供するため、変異対象の遺伝子鎖が、Ｍ２Ｓ一本鎖ファージ、或いは他の適当なベクターに組み込まれる。このＤＮＡはその後、変異させるコドン周辺の配列に相補的であるが、置換すべき部位に新しいアミノ酸を指定するコドン（或いは、そのようなコドンに相補的なアンチセンスコドン）を含むオリゴヌクレオチドブライマーにハイブリダイズされる。欠失が必要な場合、プライマーは正しいリーディングフレームを保ちながら、欠失すべきアミノ酸を指定するコドンを欠くものを用いる。挿入が必要な場合、プライマーは挿入すべきアミノ酸を指定する新しいコドンを配列の適切な位置に含む。置換コドン、欠失コドンまたは挿入コドンは、オリゴヌクレオチドの中央付近にあることが望ましい。

使用されるオリゴヌクレオチドブライマーの大きさは、変異部位で安定かつ特異的なハイブリダイゼーションを起こす条件を最適化するように決められており　５Ｚ　３／端はエキソヌクレアーゼによる変異への影響を避けるために充分な長さになっている。故に、本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、通常１５から２５塩基を含む。これ以上の大きさのオリゴヌクレオチドは不要である。

好ましい方法（Ｗａｌｄｅｒら参照；上記）に於いては、得られるオリゴヌクレオチド／ＳＳベクターハイブリッドは、直接酵母中に形質転換される。その代りに、変異源となるプライマーを、変異させる遺伝子を含む一重鎖テンプレートセグメントの入った、ギャップのある二量体にハイブリダイズさせる方法もある。

後者の場合、プライマーはテンプレート（鋳型）上をＤＮＡポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、又は他の適当なりＮＡポリメラーゼとの反応によって伸長されて二重鎖ＤＮＡが形成され、これを更に環化して適当な宿主株をトランスフェクト（感染）するために使われる。どちらの場合に於いても、重工によるヘテロデユーブレックス（異種二量体）の複製のため、両方の（ＤＮＡ）鎖が受け継がレオチドに対応する、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて、スクリーニングされた。酵母を直接形質転換する場合、形質転換体を集め、ＤＮＡを抽出して、Ｅ、ｃｏｌｉに形質転換した。その結果得られるコロニーは、ハイブリダイゼーションによって、分離された。変異ＤＮＡにプライマーが優先的にハイブリダイズするが、宿主鎖にはしないような最適条件が用いられた。変異遺伝子を含むＤＮＡを抽出して、適当な発現ベクターに組み込み、そのベクターを宿主株を形質転換するために用いた。この宿主株をアナログ蛋白質を得るために培養する。

融合蛋白質の構成本発明の一つの態様として、成熟ｈｌＬ’−３のアミノ酸配列を、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）のペプチドをコードするヌクレオチドから成る、Ｎ端厳合体を介して、酵母のα− 因子リーダー配列と結合した。この配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）は抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体と可逆的に結合するエピトープを供与する。その結果、発現された組み換え蛋白質の迅速な検出と容易な精製が可能になる。この配列はまた、Ａｓｐ−Ｌｙｓの組の直後において、ウシ粘液エンテロキナーゼによって特異的に切断される。更に、このペプチドのついた蛋白質は分泌前の細胞内における分解に対して抵抗性である。

実施例：ｈＩＬ−３をコードするｃＤＮＡの単離と活性蛋白質のイースト（酵母）内における発現ｈＩＬ−３遺伝子の選ばれた５′端、３′端配列と相補性の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。ｈＩＬ−３リーダー（配列）の一部をコードする配列と相補する５′端プローブの配列は、５’−ＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＡＧ−３’であった。成熟蛋白質のアミノ酸１２３−１３０残基をコードする領域に対応する３′端プローブの配列は、５’−ＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＣＧＧＡＧＣＧＣＴＡＧ−３’であった。合成の方法は、５ｏｏｄらによってＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｃｌｓ　Ｒｅｓ。

４：　２５５７（１９７７）に、またＨｌｒｏｓｅらによりＴｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２８：　２４４９（１９７８）に発表された方法と実質的に同様の方法である、標準的な自動トリエステル法であった。合成ののち、オリゴヌクレオチドから保護基をはずし、分取用ゲル電気泳動を用いて精製した。スクリーニングのためのプローブとして用いるため、オリゴヌクレオチドは、ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２）によって記載されたものと似た方法を用い、末端を３２Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射線ラベルした。

ｃＤＮＡライブラリーは、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びホルボール・１２−シリステート・１３−アセテート（ＰＭＡ）によって刺激された、ヒト末梢血Ｔ細胞（ＰＢＴ）から抽出された全ＲＮＡより抽出された、ポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａを逆転写することによって構築された。このｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩを用いて二重鎖にし、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼによってプラントエンドにし、ｃＤＮＡ中のＥｃｏＲＩ切断部位を保護するためにＥｃｏＲＩメチラーゼによってメチル化し、ＥｃｏＲＩリンカ−にライゲート（結合）した。この結果得られた構築物は、ｃＤＮＡの各端のコピーのリンカ−を除く全てのリンカ− を除去するために、ＥｃｏＲＩで消化し、バクテリオファージλｇｔｌＯ（ＨｕｙｎｈらによりＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｇｌｏｖｅｒ、　ｅｄ、、Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、　４９− ７８に記載されている）のＥｃｏＲＩ切断して脱リン酸化したアームにライゲート（結合）した。

ライゲートされたＤＮＡは、組換え体ライブラリーを作るためにファージ粒子にパッケージした。５００．０００の組換え体をＥ、ｃｏｌｉ株Ｃ８００ｈｆｌ− にまき、標準的なプラークハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。両方のプローブにハイブリダイズしたライブラリーから１１のクローンが単離された。これらをプラーク精製してバクテリオファージＤＮＡを調製するために使用し、これをＥｃｏＲＩで消化した。切断産物はアガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルター上にプロットし、再びハイブリダイゼーションを確認した。一つのクローンはＥｃｏＲＩによって部分消化し、分取用アガロースゲル電気泳動にかけ、特異的ＥｃｏＲＩサイト、ＢａｍＨＩサイトその他の多（の特異的酵素切断部位を持つポリリンカーを含んだ、標準的なりローニングベクターｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−切断誘導体（ｐＧＥＭＢＬ）にサブクローンした。このような型の典型的なベクターはＤｅｎｔｅらによって、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１１　：　１６４５（１９８３）に記載されている。

制限酵素地図によって以前ヒトｒＬ−３について報告されたものと対応する制限酵素切断部位の存在が示された。配列決定の結果、成熟蛋白質の８番の位置にプロリンをコードするコドン（ＣＣＣ）の存在が示された。別の３つのクローンから抽出された対応するｃＤＮＡ配列決定の結果、ＹａｎｇらによってＣｅ１ｌ　４７：　３（１９８Ｂ）に報告された配列からの変異が確認された。Ｘｅｎｏｐｕｓ　（アフリカッメガエル）の卵母細胞に、ｈＩＬ−３と思われる配列から転写されたＲＮＡを注入したところ、骨髄増殖アッセイにおいて有意な活性の発現が見られた。

酵母の発現ベクターは、ｐ　Ｂ　Ｃ１０２・Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）をＡｓｐ７１ｇ及びＳ　ｐｅ　Ｉで分解し、ヒトＧ−Ｃ３Ｆの成熟配列を含むフラグメントを除き、このベクターフラグメントに、以下のオリゴヌクレオチド・ポリリンカーをライゲート（結合）することによって作られた：Ａｓｐ７１８　！Ｎｃｏｌ　＋５ｔｕｌこの結果得られるベクターはｐＢｃ１１５と命名された。

ｈｌＬ−３をコードするｃＤＮＡをｐＧＥＭＢＬクローニングベクターよりＨｐａＩ及びＢａｍＨＩ消化によって切り出し、成熟ｈＩＬ−３の１４番目のアミノ酸残基からコード配列の下流迄を含むフラグメントを得た。

複数のオリゴヌクレオチドを合成して集成し、（１）酵母α−因子す−ダーベブチドのＣ末端５アミノ酸残基であって、Ａ　５ｐ７ＨＩサイトから始まりＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位で終わる配列、（２）合成Ｎ末端“フラッグ認識ペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；上述）をコードする８コドン配列、及び（３）成熟ｈＩＬ−３蛋白質のＨｐａＩプラントエンドまでを含むＮ末端１４アミノ酸残基をコードする短かい配列；をコードする一本のフラグメントを作製した。このフラグメントはそれぞれ約４０ヌクレオチドから成る４つのオリゴマーから構成された８４塩基対のＫｐｎＩ−ＨｐａＩフラグメントであり、その配列は以下に示されている。

５’−ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＣ；Ａ　ＧＡＣＴＡＣＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＧＡＴ　ＧＡＣＡＡＧ−ＧＡ　ＡＡＣＣＴＡ　ｍ　ＴＣＴ　ＣＴｃＡＴＧ　ＴＴＣｉ　ｉ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＴＴＣ−Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ−ＧＣＴ　ＣＣＣＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＣＣＣ’ＩＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＧＧ　ＧＴＴ−３゜−ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＴＡＣ蒋頁π℃ＮツＡ圓晶Ｃ奮冗Ｇ肛ＡＣＣＣＡＡＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｕｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｔドー−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−ｈ　Ｉ　Ｌ　−３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−＞前述のフラグメントｐＢｃ１１５由来のＡｓｐ　７１８−　ＢａｍＨＩベクターフラグメント及びＨｐａｒ− ＢａｍＨＩ・ｈｌＬ−３７ラグメントを互いにライゲーション（結合）し、ｐ　Ｂ　Ｃ１２５と名づけられた発現プラスミドを作製した。

ｐ　Ｂ　Ｃ１２５ベクターを含むＥ、ｃｏｌｉクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、酵母株ＸＶ２１８１を形質転換してｈＩＬ−３遺伝子産物を発現させるために使用した。形質転換された酵母株は、ＡＤＨ２プロモーターが脱抑制されるような条件下で振とう培養した。酵母培養上清を遠心操作により集め、骨髄増殖促進活性を調べた。これらの実験でｈＩＬ−３蛋白質の高レベルの発現が示された。

ＦＩＧ、　１：　Ｍｕ工Ｌ−３ノ凸己動」入【９へｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　１２０補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成元年２月Ｙ日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿ＰＣ’ｒ／ＵＳ８８１０００１１、発明の名称ヒト　インターロイキン−３蛋白質３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国ワシントン用９８１０２．　シアトル。

ユニバーシティ・ストリート５１．イミュネックス・ビルディング名　称　イミュネックス・コーポレーション４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正書の提出日請求の範囲１、　Ｎ末端を基準にして、アミノ酸配列の第８位にプロリン残基を持つ、成熟ヒトＩＬ−３蛋白質をコードする、単離されたＤＮＡ配列。

２、　Ｎ−グリコジル化部位を不活性化するような、一箇所以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を持つ変異アミノ酸配列を特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。

３、全てのＮ−グリコジル化部位が不活性化された変異アミノ酸配列を特徴とする請求項２記載のＤ　Ｎ　Ａ配列。

４、天然型蛋白質のアミノ酸配列の１５及び６８番のＡｓｎ（アスパラギン）残基が、Ａｓｐ　（アスパラギン酸）、Ｇｌｎ（グルタミン）又はＧｌｕ（グルタミン酸）残基に置換された変異アミノ酸配列を特徴とする請求項３記載のＤＮＡ配列。

５、天然型蛋白質のアミノ酸配列の１５及び６８番のＡｓｎ　（アスパラギン）残基が、Ａｓｐ　（アスパラギン酸）残基に置換された変異アミノ酸配列を特徴とする請求項４記載のＤＮＡ配列。

６、請求項ユないし５のいずれか１項記載のＤＮＡ配列及びこのＤＮＡ配列の酵母細胞内での発現を可能にするための一つ或いはそれ以上の制御要素を含む、組換え発現ベクター。

７、酵母宿主細胞及び請求項６記載の組換え発現ベクターより成る、組換え発現系。

８、組換え酵母細胞中における、請求項１ないし５のいずれか１項記載のＤＮＡ配列の発現によって得られたポリペプチド。

９、感染性の病原体に対する免疫反応性を高める薬剤を調製するだめの、請求項８記載のポリペプチドの使用。

１０．造血細胞抑制状態の後に、正常血液細胞集団を回復させる薬剤を調製するための、請求項８記載のポリペプチドの使用。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．精製された組換えヒトインターロイキン−３（ｈＩＬ−３）。
２．ｈＩＬ−３を蛋白質濃度で１．０μｇ／ｍｌ以上含む未精製の酵母培養上清。
３．ｈＩＬ−３を少くとも１０μｇ／ｍｌの蛋白質濃度で含む、請求項２記載の粗精酵母培養物上清。
４．第１図に示されるアミノ酸配列に実質的に相同なアミノ酸配列から成る、請求項１記載の蛋白質。
５．Ｎ−グリコシル化部位又はＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位を不活性するような、１箇所以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含むアミノ酸配列より成る、請求項４記載の蛋白質。
６．ｈＩＬ−３をコードするＤＮＡ断片を含む、組換え発現ベクター。
７．請求項５記載の蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含む、組換え発現ベクター。
８．請求項６記載の酵母組換え発現ベクター。
９．請求項８記載の酵母組換え発現ベクター、ｐＢＣ１２５。
１０．請求項６記載のベクターを含む、組換え発現系。
１１．請求項７記載のベクターを含む、組換え発現系。
１２．請求項８記載のベクターを含む、組換え発現系。
１３．請求項９記載のベクターを含む、酵母組換え発現系。
１４．発現を促進する条件下で請求項１０記載の系を培養することよりなる、精製されたｈＩＬ−３又はその類縁体を製造する方法。
１５．発現を促進する条件下で請求項１１記載の系を培養することよりなる、精製されたｈＩＬ−３又はその類縁体を製造する方法。
１６．発現を促進する条件下で請求項１２記載の系を培養することよりなる、精製されたｈＩＬ−３又はその類縁体を製造する方法。
１７．発現を促進する条件下で請求項１３記載の系を培養することよりなる、精製されたｈＩＬ−３又はその類縁体を製造する方法。