CZ55099A3

CZ55099A3 - Antitrombotické azacykloalkylalkanoylové peptidy a pseudopeptidy

Info

Publication number: CZ55099A3
Application number: CZ1999550A
Authority: CZ
Inventors: Scott I. Klein; Bruce F. Molino; Mark Czekaj; Charles J. Gardner
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1997-08-15
Publication date: 2000-06-14

Abstract

Stabilní krystalická forma antitrombotické sloučeninyN-[N- [N-(4-piperid-4-yl)butanoyl-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]- (L)-p-cyklohexylalaninamidu, způsoby přípravy této stabilní krystalické formy, meziprodukty a farmaceutické prostředky sjejich obsahema též způsoby ameziprodukty pro přípravu sloučeniny obecného vzorce II, ve kterémΛ B, Z, E1, E2, G, R, m, n a p majísoecifický význam.

Description

Antitrombotické azacykloalkylalkanoylové peptidy a pseudopeptidy

Oblast techniky

Tento vynález se týká nehygroskopické stabilní krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)~N-ethylglycyl] - (L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu obecného vzorce I.

(I)

Tato sloučenina vykazuje antitrombotické působení »

♦ včetně inhibice agregace krevních destiček a vytváření trombů u savců a je použitelná při prevenci a léčbě trombózy spojené s chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, periferní arteriální onemocnění a disseminovaná intravaskulární koagulace.

Navíc se tento vynález týká způsobu přípravy krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl] - (L)-β-cyklohexylalaninamidu, jeho farmaceutických prostředků a meziproduktů.

Navíc se tento vynález týká meziproduktů použitelných pro přípravu tetraazacykloalkylalkanoylových peptidových či pseudopeptidových sloučenin.

Hemostáza, biochemie srážení krve, je mimořádně složitým jevem, při které normální celková krev a tělesná tkáň spontánně zastavují krvácení z poraněných cév. Účinná hemostáza vyžaduje společné působení cévních, destičkových a plazmatických faktorů stejně tak jako kontrolních mechanismů bránících nadměrnému srážení. Závady, nedostatečná množství či nadměrná množství kterékoliv z těchto složek mohou vést k hemoragickým či trombotickým následkům.

Adheze destiček, rozprostírání a agregace na extracelulárních matricích jsou ústřední děje při vytváření trombu. Tyto děje se zprostředkovávají skupinou adhezivnich glykoproteinů, to jest fibrinogenu, fibronektinu a von Willebrandova faktoru. Fibrinogen je kofaktorem agregace destiček, zatímco fibronektin podporuje připojení destiček a rozprostírání a von Willebrandův faktor je důležitý při připojování destiček a jejich rozprostírání na subendoethelových matricích. Místa vazby pro fibrinogen, fibronektin a von Willebrandův faktor jsou na bílkovinném komplexu membrány destiček známém jako glykoprotein Ilb/IIla.

Adhesivní glykoproteiny, jako je fibrinogen, se neváží na normální destičky ve stavu klidu. Avšak jakmile se destička aktivuje agonistou, jako je trombim nebo adenosindifosfát, destička mění svůj tvar a tím pravděpodobně zpřístupňuje vazebné místo GPIIb/IIIa pro fibrinogen. Sloučeni·* ©· · · © © · © • * © • · © ©· ···· na, která je předmětem tohoto vynálezu, blokuje fibrinogenový receptor a proto vykazuje výše popsanou antitrombotickou účinnost.

Tato přihláška je částečným pokračováním současně projednávané US přihlášky č. 08/476 750 registrované 7. června 1995, která je pokračováním přihlášky současně projednávané US přihlášky č. 08/628 648 registrované 17. října 1994, která je částečným pokračováním současně projednávané US přihlášky US č. 08/138 820 registrované 15. října 1993, od které se nyní upouští.

Dosavadní stav techniky

Bylo pozorováno, že přítomnost Arg-Gly-Asp (RGD) je nezbytná pro fibrinogen, fibronektin a von Willebrandův faktor při jejich interakci s receptorem buněčného povrchu [E. Ruoslahti, Pierschbacher, Cell, 44. 517-518 (1986)].Zdá se, že funkce fibrinogenu při připojování destiček se též účastní další dvě aminokyselinové sekvence, jmenovitě sekvence Gly-Pro-Arg a dodekapeptidová sekvence His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val. Ukázalo se, že krátké syntetické peptidy obsahující RGD nebo dodekapeptid váží destičkový receptor GPIIb/IIIa a inhibují kompetitivně vazbu fibrinogenu, fibronektinu a von Willebrandova faktoru a rovněž inhibují agregaci aktivovaných destiček [Plow a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 8057-8061 (1985), Ruggeri a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 5708-5712 (1986), Ginsberg a kol., J. Biol. Chem., 260, 3931-3936 (1985) a Gartner a kol., J. Biol. Chem., 260. 11, 891-894 (1987)].

Tjoeng a kol. popisují v US patentech č. 5 037 808 » « · · · · · · · · · «·« · < * * · » ·· · «· !« * · ··.: * · ♦ f · © ··· · · · · ··« 9 9 '»9 9 999 9 9 9 9 a 4 879 313, že indolylové sloučeniny obsahující guanidinoalkanoylové a guanidinoalkenoyl-aspartylové zbytky jsou inhibitory agregace destiček.

US patent č. 4 992 463 (Tjoeng a kol.), vydaný 12. února 1991, zveřejňuje genericky, že řada arylových a aralkylguanidinoalkylových peptidových mimetických sloučenin vykazuje inhibici agregace destiček a uveřejňuje specificky řadu mono- a dimethoxyfenylových peptidových mimetických sloučenin a bifenylalkylových peptidových mimetických sloučenin.

US patent č. 4 857 508 (Adams a kol.), vydaný 15. srpna 1989, uveřejňuje genericky, že řada guanidinoalkylových peptidových derivátů obsahujících terminální aralkylové substituenty vykazuje inhibici agregace destiček a tento patent specificky uveřejňuje řadu O-methyltyrosinových, bifenylových a naftylových derivátů obsahujících terminální amidovou funkční skupinu.

D. M. Haverstick a kol. popisují v Blood 66 (4), 946-952 (1985), že řada syntetických peptidů včetně arg-gly-asp-ser a gly-arg-gly-asp-ser je schopná inhibice agregace destiček indukované trombinem.

E. F. Plow a kol. uvádějí v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79. 3711-3715 (1982), že tetrapeptidový glycyl-L-prolyl-L-arginyl-L-prolin inhibuje vazbu fibrinogenu na lidské destičky.

Francouzská patentová přihláška č. 86/17507 registrovaná 15. prosince 1986 uveřejňuje, že tetra-, penta- a hexapeptidové deriváty obsahující sekvenci -arg-gly-asp- jsou

použitelné jako antitrombotické prostředky.

US patent č. 4 683 291 (Zimmerman, a kol.), vydaný 28. července 1987, uveřejňuje, že peptidy obsahující šest až čtyřicet aminokyselin zahrnujících sekvenci -arg-gly-aspjsou inhibitory vazby destiček.

Publikace evropských patentových přihlášek č.

319 506, vydaná 7. června 1989, uveřejňuje, že několik tetra-, penta- a hexapeptidových derivátů obsahujících sekvenci -arg-gly-asp- jsou inhibitory agregace destiček.

Cyklické peptidové analogy obsahujíc! zbytek Gly-Asp se uvádějí jako antagonisté receptorů fibrinogenu v US patentu Č. 5 023 233.

Peptidy a pseudopeptidy obsahující aminové, guanidinové, imidazoloylové a/nebo amidinoalkanoylové a alkenoylové zbytky se popisují jako antitrombotické prostředky v projednávaných přihláškách US č. 07/677 006, 07/534 385 a 07/460 777 registrovaných 28. března 1991, 7. června 1990 a 4. ledna 1990 stejně tak jako v US patentu č. 4 952 562 a v mezinárodní přihlášce č. PCT/US90/05448 registrované 25. září 1990, které všechny přísluší stejnému přihlašovateli jako tento vynález.

Peptidy a pseudopeptidy obsahující aminové, guanidinoalkylové a alkenylbenzoylové, fenylalkanoylové a fenylalkenoylové zbytky se popisují jako antitrombotické prostředky v podané přihlášce US č. 07/475 043, registrované 5. února 1990 a v mezinárodní přihlášce č. PCT/US91/02471, registrované 11. dubna 1991, publikované jako mezinárodní publikace č. WO 92/13117 vydaná 29. října 1992, příslušející stejnému • «» * · · · · · • · Φ *· · · · '♦ tt · · « ··· ·· 4 · » · » »« · Μ · ♦ ί·' · · 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 i 9 9 99 9 99 99 přihlašovateli jako tento vynález.

Alkanoylové a substituované alkanoylové a substituované alkanoylazacykloalkylformylové deriváty kyseliny aspartové se uvádějí jako inhibitory agregace destiček v US patentu č. 5 053 392 registrovaném 1. prosince 1989 příslušejícím stejnému přihlašovateli a stejnému vynálezci jako tento vynález.

N-substituované azacykloalkylkarbonylové cyklické deriváty kyseliny aminoacylaspartové se uvádějí jako antitrombotika v US patentu č. 5 064 814 registrovaném 5. dubna 1990 od stejných vynálezců, který přísluší stejnému přihlašovateli jako tento vynález. Deriváty kyseliny azacykloalkylformylglycylaspartové se uvádějí jako antitrombotika v US patentu č. 5 051 405 registrovaném 10. října 1989 a příslušejícím stejnému přihlašovateli jako tento vynález.

Evropská patentová přihláška 0 479 481 publikovaná 8. dubna 1992 uveřejňuje azacykloalkylalkanoylové glycylové aspartylové aminokyseliny jako antagonisty fibrinogenových receptorů.

Evropská patentová přihláška 0 478 362 publikovaná 1. dubna 1992 uveřejňuje azacykloalkylalkanoylové peptidylové β-alaniny jako antagonisty fibrinogenových receptorů.

Publikace patentové přihlášky PCT č. W095/10295 uveřejňuje azacykloalkylalkanoylové peptidy a pseudopeptidy obecného vzorce II i :

• * φφφ φ φ ♦ ’ . !

• φ φ φφ φ «#

ο ιι

-NH-CH-C-Z ι

CH₂COOH (ΐΐ) zejména Ν-[Ν-[Ν-(4-piperid—4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamid, které inhibují agregaci destiček a vytváření trombů u savců a jsou použitelné při prevenci a léčbě trombózy. N-[N-[N-(4-piperid-4-yl) butanoyl) -N-ethylglycyl ]-(L) -aspartyl ]--(L) -B-cyklohexylalaninamid připravený podle publikace patentové přihlášky PCT č. WO95/10295 je amorfní, hygroskopický a je fyzikálně nestabilní, neboť absorbuje vlhkost. Publikace patentové přihlášky PCT č. W095/10295 neuveřejňuje nehygroskopickou stabilní krystalickou formu N-[N-[N-(4-piperíd-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu.

Publikace patentové přihlášky č. WO95/10295 též popisuje, že azacykloalkanoylové peptidy a pseudopeptidy se obecně připraví standardním způsobem syntézy peptidu v pevné fázi či v roztoku s použitím výchozích materiálů a/nebo přímo dostupných meziproduktů od společností dodávajících chemikálie, jako je Aldrich nebo Sigma [H. Paulsen, G. Merz, V. Weichart Solid-Phase Synthesis of O-Glycopeptide Sequences, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27 (1988), H. Mergler, R. Tanner, J. Gosteli a P. Grogg Peptide Synthesis by a Combi♦ » ·» · · · ·

nation of Solid-Phase and Solution Methods I: A New

Acid-Labile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments. Tetrahedron letters, 29, 4005 (1988), Merrifield, R. B., Solid Phase Peptide Synthesis after 25 Years: The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon, Makromol. Chem. Macromol. Symp., 19, 31 (1988)]. Dále publikace patentové přihlášky PCT č. W095/10295 uveřejňuje přípravu amorfní a hygroskopické formy N~[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu sekvenční syntézou C-terminální aminokyseliny, jak ukazuje schéma I.

Schéma I

O

II spojem

P.-NH-CH-C-OH + HN¹ i i ch₂-c-op₂

O

E'

CH i

F

G'·

O

II

E'

Ρ,-NH-CH-C —N—CH

CH₂-C-OP₂ F ii O —ξθχ.......G

O E' deprotekce II I —-NH₂-CH-C—N— CH

CH₂-C-OP₂ F ii O

O . .

, ₄ II 1) spojeni

P₃*N—tCH₂j— c-OH -:-)

I ' ' p ₂) deprotekce

B

O

II

H-N-{CH^-C -NH-CH-C B ^P '

E'

NCH i ch₂-c-op₂ f ii *

A'

N-^CH₂J—C -OH

1) spojení

2) deprotekce

R· _AZ

NO O O E ^CH₂)—C— N-^CH₂)- C - NH -CH - C — N^Π B ^P CH₂COOH •CH ·

• «I »· >' · ♦ · · • 4 4

4· 4 4 4 • · 4

4 ··· ·

4 4 4 • · 4 4 • 4 4 · • · · 4 • 4 · 4 • 4 «·

Publikace přihlášky PCT č. WO95/10295 neuveřejňuje tvorbu tetraazacykloalkylalkanoylových peptidů a pseudopeptidů ani konkrétně N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)~N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu z centrálního di(pseudopeptidu či peptidu), kde Να C-terminální konce centrálního di(pseudopeptidu či peptidu) jsou oba připojeny na pseudoaminokyseliny a/nebo aminokyseliny s vytvořením tetraazacykloalkyl-alkanoylových peptidů a pseudopeptidu.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká nehygroskopické stabilní krystalické formy N-[N- [N-( 4-piper.id~4-yl) butanoyl) -N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu obecného vzorce I.

(I)

Tato sloučenina vykazuje antitrombotické působení včetně inhibice agregace destiček a vytváření trombů u savců a je použitelná při prevenci a léčbě trombózy spojené s cho- 10 « * · · · r · · · · • · « « » * · 9 9 • · · « • · * · * · · • · 9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 « · · · · • · · · 9

99 9 9 9 99 robnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, periferní arteriální onemocnění a disseminovaná intravaskulární koagulace. Tento vynález se též týká farmaceutického prostředku obsahujícího nehygroskopickou stabilní krystalickou formu N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)-butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexyl- alaninamidu a meziproduktů této sloučeniny.

Tento vynález se též týká způsobů přípravy tetraazacykloalkylalkanoylpeptidových nebo pseudopeptidových sloučenin obecného vzorce II

O

II

NH-CH-C-Z i

ch₂cooh (II) ve kterém

A je atom vodíku,

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina.

r · ♦ * * · ♦ · « ι : :,: : .· _e: .. , ·«· · · · ···· • · · · * · · · · · · · · «φ

COG

CH ^Xc2

3θ

Ε^χ je atom vodíku,

Ε² je boční řetězec přirozené α-aminokyseliny připojený na uhlík a, atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina nebo Ε^Ί a E² spolu s atomy dusíku a uhlíku, ke kterým jsou připojeny, vytvářejí azacykloalkanový 4-, 5-, 6- nebo 7-členný kruh,

G je skupina OR¹ nebo NR^XR²,

R¹ a R² jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina,

R je atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina nebo aralkylová skupina, m je 1 až 5, ··· ο» · · · · · • · · » · · · 9» · ·· · ·«· · · · · · · » • · · · · * · · «·· · » « 9 η je 0 až 6 a p je 1 až 4 a konkrétně pro přípravu nehygroskopické stabilní krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)-butanoyl)-N-ethylglycyl]~

-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu.

Tento vynález se týká sloučeniny obecného vzorce

Π θ E¹ E² O

P²'-,^(CH₂)p-JL_HN_c_HJl_^-CH-C-G ^B CH₂CO₂P¹ (VII) ve které

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina,

E¹ je atom vodíku,

E³ je boční řetězec přirozené α-aminokyseliny připojený na uhlík a, atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina,

·· ·· ·· ·· • * · * » ♦ ♦ · • · · · · · · • «* · 9 · ♦ · · • · · ♦ · ♦ · ·· · ·· · «· «· alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylakylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina nebo E^xa E² spolu s atomy dusíku a uhlíku, ke kterým jsou připojeny, vytvářejí azacykloalkanový 4-, 5-, 6- nebo 7-členný kruh,

G je skupina 0R^x nebo NR^XR², ri _a j_sou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina, p je 1 až 4,

P^x je skupina chránící kyselinu labilní při hydrogenaci a

P² ’ je P² nebo TFA.H- a

P² je skupina chránící amin labilní v kyselém prostředí.

Přehled obrázků ve výkresech

Obr. 1 představuje záznam rentgenové práškové difrakce pro vzorek nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu připraveného v přík14

• 9 99» 9 » φ

9 9 9 9 9 ·

999« 99 9 9 ladu 13, způsob A.

Obr. 2 představuje záznam rentgenové práškové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl] - (L) -β-cyklohexylalaninamidu připraveného v příkladu 13, způsob B(a) .

Obr. 3 představuje záznam rentgenové práškové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl] — f L) — -β-cyklohexylalaninamidu připraveného v příkladu 13, způsob B(b).

Obr. 4 představuje záznam rentgenové práškové difrakce vzorku hygroskopické krystalické formy Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]—(L)— -aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu připraveného podle popisu v příkladu 14.

Obr. 5 představuje záznam rentgenové práškové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu připraveného podle popisu v příkladu 14.

Obr. 6 představuje isotermický mikrokalorimetrický záznam tepelného výkonu jako funkce času pro tři různé pokusy provedené podle popisu v pokusu 15. Pokusy sledují tepelnou aktivitu různých krystalických forem N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu při expozici různým parám rozpouštědel. Stopa (A) na obr. 6 ukazuje, že při expozici hygroskopického • 99 • · 99··

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl] - (L) -aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu připraveného podle příkladů 5 až 11 80% relativní vlhkosti (nasycený roztok chloridu draselného) při teplotě 40 °C po dobu 30 h dochází k silně exotermnímu ději, při kterém se hygroskopická forma sloučeniny převádí na její nehygroskopickou formu. Stopa (B) na obr. 6 ukazuje, že nedochází k žádnému exotermnímu konverznímu ději při expozici hygroskopického N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl] - (L) -β-cyklohexylalaninamldu připraveného podle přikladu 5 až 11 parám methanolu při 40 °C (jiného rozpouštědla než je voda, ve kterém je tato sloučenina rozpustná), a že tedy methanol nepodporuje mobilitu v rámci krystalů umožňující převedení na nehygroskopickou formu. Stopa (C) na obr. 6 ukazuje, že nenastává žádná exotermní konverze při expozici nehygroskopického N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu připraveného podle příkladu 13 při 80% relativní vlhkosti a 40 °C, takže nehygroskopická forma této sloučeniny se nepodrobuje za těchto podmínek konverzi, to jest je stabilní formou.

Obr. 7 znázorňuje isotermní mikrokalorimetrický záznam tepelného výkonu jako funkce času pro tři různé pokusy provedené podle popisu v pokusu 15. Pokusy sledují tepelnou aktivitu konverze hygroskopické krystalické formy

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu na jeho nehygroskopickou formu při expozici 80% relativní vlhkosti při teplotě 40 °C, 50 °C a 60 °C. Tento obrázek ukazuje, že konverze probíhá zhruba po dobu 24 h při teplotě 40 °C po dobu 6,5 h při teplotě 50 °C a po dobu 3 h při teplotě 60 °C.

Obr. 8 představuje isotermní mikrokalorimetrický graf • φ • · • · ► 4 9·· tepelného výkonu jako funkce času pro čtyři různé pokusy provedené podle popisu pokusu 15. Pokusy sledují tepelnou aktivitu konverze hygroskopické krystalické formy Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu na jeho nehygroskopickou formu při expozici 65% relativní vlhkosti, 75% relativní vlhkosti, 80% relativní vlhkosti a 100% relativní vlhkosti při teplotě 60 °C. Význačným rysem obr. 8 je, že vyšší relativní vlhkosti poskytují rychlejší konverzi. Dalším význačným rysem je, že konverze na nehygroskopickou formu této sloučeniny nastává při 100% relativní vlhkosti a teplotě 60 °C bez přechodu na kapalnou fázi, který nastává u hygroskopické formy při teplotě místnosti. Na základě těchto výsledků se očekává, že konverze nehygroskopické formy je mnohem rychlejší než přechod hygroskopické formy na kapalnou fázi při 60 °C.

Obr. 9 představuje srovnání procentických hmotnostních přírůstků proti procentické relativní vlhkosti vynesených pro hygroskopickou (_H) a nehygroskopickou (.) formu N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu při 25 °C při procesu probíhajícím podle popisu v pokusu 16. Obr. 9 znázorňuje, že hygroskopické forma vychytává více vody než nehygroskopické forma se vzrůstající relativní vlhkostí a s výraznějším účinkem při relativních vlhkostech převyšujících 60 %. Dále obr. 9 ukazuje, že u hygroskopické formy sloučeniny nedochází k desorbci na její původní hmotnostní procento, zatímco u nehygroskopické formy sloučeniny k takové desorbci dochází .

Následuje podrobný popis vynálezu.

• · · · · · Μ • · · ♦ · · 9 φ • · · · 9 · · • · · ♦ · 9 · · • · · « · · · ·· · ·· * · » 9 9

Následující pojmy tak, jak se užívají výše i v celém textu tohoto vynálezu, mají následující význam, pokud se neuvádí jinak.

Následující zkratky, které se zde používají, zahrnují:

BOC (terc.butyloxykarbonyl), CBZ (benzyloxykarbonyl), Gly (glycin), Asp (kyselina aspartová), Obzl (benzyloxy), TFA (kyselina trifluoroctová), Cha (β-cyklohexylalanin), EtOAc (ethylacetat), DMF (dimethylformamid), DCC (dicyklohexylkarbodiimid) , HOBT (hydroxybenzotriazol), TBTU (2-lII-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat), DI (deionizovaná voda), PNP (p-nitrofenol), PFP (pentafluorfenol), DCU (dicyklohexylmočovina), NMM (N-methylmorfolin), MTBE (methyl-terč.butylether)), RíI (relativní vlhkost), THF (tetrahydrofuran), PipBu (kyselina 4-pipe.ridinmáselná) a PipBuen [kyselina (4-piperidin)butylidenylkarboxylová] je sloučenina vzorce

co₂h

Pojem pacient zahrnuje člověka i jiné savce.

Farmaceuticky přijatelná sůl znamená formu soli mateřské sloučeniny obecného vzorce I, která je pro pacienta poměrně neškodná, podává-li se v terapeutických dávkách, takže prospěšné farmaceutické vlastnosti mateřské sloučeniny I nejsou narušeny vedlejšími účinky, které by se daly při18 • 9« *9 99 99 99

9 9 · 9 9 9 9 99 9

999 99 9 9999

9 * 9 9 9 99 99 9

999 999 9999

999 99 99 9999 99 99 psát přítomnosti iontu této formy soli. Farmaceuticky přijatelná sůl též zahrnuje zwitterion nebo vnitřní sůl sloučeniny obecného vzorce I.

Alkylová skupina znamená nasycenou alifatickou uhlovodíkovou skupinu, která může být přímá či rozvětvená a může mít zhruba 1 až zhruba 20 atomů uhlíku v řetězci. Rozvětvená znamená, že se k lineárnímu alkylovému řetězci připojuje nižší alkylová skupina, jako je methylová skupina, ethylová skupina či propylová skupina. Preferovanými přímými či rozvětvenými alkylovými skupinami jsou nižší alkylové skupiny, což jsou alkylové skupiny majicí od 1 do zhruba 10 atomů uhlíku. Nejpreferovanější nižší alkylové skupiny mají od 1 do zhruba 6 atomů uhlíku.

Cykloalkylová skupina znamená nasycenou karbocyklickou skupinu mající jeden či více kruhů a zhruba 3 až zhruba 10 atomů uhlíku. Preferované cykloalkylové skupiny zahrnují cyklopropylovou skupinu, cyklobutylovou skupinu, cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, cykloheptylovou skupinu a dekahydronaftylovou skupinu.

Cykloalkylalkylová skupina znamená alkylovou skupinu substituovanou cykloalkylovou skupinou. Preferované cykloalkylalkylové skupiny zahrnují cyklopentylmethylovou skupinu, cyklohexylmethylovou skupinu, cyklohexylethylovou skupinu, dekahydronaft-l-ylmethylovou skupinu a dekahydronaft-2-ylmethylovou skupinu.

Alkylcykloalkylová skupina znamená cykloalkylovou skupinu substituovanou alkylovou skupinou. Příklady alkylcykloalkylových skupin zahrnují 1-, 2-, 3- nebo 4-methylnebo ethyl-cyklohexylovou skupinu.

Alkylcykloalkylalkylová skupina znamená alkylovou skupinu substituovanou alkylcykloalkylovou skupinou. Příklady alkylcykloalkylových skupin zahrnují 1-, 2-, 3- nebo 4-methyl- nebo ethylcyklohexylmethylovou skupinu nebo 1-,

2-, 3- nebo 4-methyl- nebo ethylcyklohexylovou skupinu.

Azacykloalkan znamená nasycený alifatický kruh obsahující atom dusíku. Preferované azacykloalkany zahrnují pyrolidin a piperidin.

Přírodní α-aminokyseliny znamenají glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, serin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, cystein, methionin, prolin, hydroxyprolin, kyselinu aspartovou, asparagin, glutamin, kyselinu glutamovou, histidin, arginin, ornithin a lysin.

α-uhlíkový boční řetězec přírodních a-amínokyselin znamená zbytek, který substituuje α-uhlík přírodní α-aminokyseliny. Příklady α-uhlíkových bočních řetězců přírodních α-aminokyselin zahrnují isopropylovou skupinu, methylovou skupinu a karboxymethylovou skupinu pro valin, alanin respektive kyselinu aspartovou.

Termín skupina chránící amin znamená snadno odstranitelnou skupinu, o které je v oboru známo, že chrání aminoskupinu proti nežádoucí reakci během syntézy a kterou lze selektivně odstranit. Použití skupin chránících amin je v oboru dobře známo pro ochranu skupin proti nežádoucím reakcím v průběhu syntézy a mnohé z těchto chránících skupin jsou známé například z monografie T. H. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydáni,

John Wiley & Sons , New York (1991), které se zde zahrnuje

formou odkazu. Preferované skupiny chránící amin jsou acylová skupina včetně formylové skupiny, acetylové skupiny, chloracetylové skupiny, trichloracetylové skupiny, o-nitrofenylacetylové skupiny, o-nitrofenoxyacetylové skupiny, trifluoracetylové skupiny, acetoacetylové skupiny, 4-chlorbutyrylové skupiny, isobutyrylové skupiny, o-nitrocinnamoylové skupiny, pikolinoylové skupiny, acylisothiokyanatové skupiny, aminokaproylové skupiny, benzoylové skupiny a podobně a acyloxyskupina včetně methoxykarbonylové skupiny, 9-fluorenylmethoxykarbonylové skupiny,

2,2,2-trifluorethoxykarbonylové skupiny, 2-trimethylsilylethoxykarbonylové skupiny, vinyloxykarbonylové skupiny, allyloxykarbonylové skupiny, terc.butyloxykarbonylové skupiny (BOC), 1,1-dimethylpropinyloxykarbonylové skupiny, benzyloxykarbonylové skupiny (CBZ), p-nitrobenzyloxykarbonylové skupiny, 2,4-dichlorbenzyloxykarbonylové skupiny a podobně.

Pojem skupina chránící amin labilní v kyselém prostředí znamená skupinu chránící amin, jak se definuje výše, kterou lze snadno odstranit zpracováním kyselinou, avšak vůči jiným činidlům zůstává relativně stabilní. Preferovanou skupinou chránící amin labilní v kyselém prostředí je terč.butoxykarbonyl (BOC).

Pojem skupina chráníc! amin labilní při hydrogenaci znamená skupinu chránící amin, jak se definuje výše, kterou lze snadno odstranit hydrogenaci a přitom je relativně stabilní vůči jiným činidlům. Preferovanou skupinou chránící amin labilní při hydrogenaci je benzyloxykarbonylové skupina (CBZ).

Pojem skupina chránící kyselinu znamená snadno • ♦· ·· ·· AA Α· • A A A A A A · A A A ·

AAA · · · AAAA

A · AAA A A AA AA A AAA AAA AAAA

AAA AA AA AAAA AA AA odstranitelnou skupinu, o které je v oboru známo, že chrání karboxylovou skupinu (-CO__H) proti nežádoucí reakci v průběhu syntézy a kterou lze selektivně odstranit. Použití skupin chránících karboxylovou skupinu je v oboru dobře známo a jsou známé mnohé takové chránící skupiny uvedené například v T. H. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, John Wiley & Sons, New York (1991), které se zde zahrnují formou odkazu. Příklady skupin chránících karboxylovou kyselinu zahrnují estery, jako je methoxymethylester, methylthiomethylester, tetrahydropyranylester, benzyloxymethylester, substituovaný a nesubstituovaný fenacylester, 2,2,2-trichlorethylester, terc.butylester, cinnamylester, substituovaný a nesubstituovaný benzylester, trimethylsilylester a podobně a amidy a hydrazídy včetně Ν,Ν-dimethylamidu, 7-nitroindolylamidu, hydrazidu,

N-fenylhydrazidu a podobně.

Termín skupina chránící kyselinu labilní při hydrogenaci znamená skupinu chránící kyselinu, jak se definuje výše, kterou lze snadno odstranit hydrogenací a přitom zůstává relativně stabilní při působení jiných činidel. Preferovanou skupinou chránící kyselinu labilní při hydrogenací je benzylová skupina.

Arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo naftylovou skupinu.

Substituovaná arylová skupina znamená fenylovou skupinu nebo naftylovou skupinu substituovanou jedním nebo více substituenty arylové skupiny, které mohou být stejné nebo rozdílné, kde substituent arylové skupiny zahrnuje alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, aralkylovou skupinu, hydroxylovou skupinu, alkoxyskupinu, aryloxyskupinu, aralkoxyskupinu, hydroxyalkylovou skupinu, acylovou skupinu, formylovou skupinu, karboxyskupinu, alkenoylovou skupinu, aroylovou skupinu, atom halogenu, nitroskupinu, trihalomethylovou skupinu, kyanoskupinu, alkoxykarbonylovou skupinu, aryloxykarbonylovou skupinu, aralkoxykarbonylovou skupinu, acylaminoskupinum, aroylaminoskupinu, karbamoylovou skupinu, alkylkarbamoylovou skupinu, dialkylkarbamoylovou skupinu, arylkarbamoylovou skupinu, aralkylkarbamoylovou skupinu, alkylsulfonylovou skupinu, alkylsulfinylovou skupinu, arylsulfonylovou skupinu, aralsulfinylovou skupinu, aralkylsulfonylovou skupinu, aralakylsulfinylovou skupinu nebo skupinu -NR^R^, kde R_& a R_te jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, arylová skupina nebo aralakylová skupina.

Aralkylová skupina znamená alkylovou skupinu substituovanou arylovým radikálem. Preferované aralkylové skupiny zahrnují benzylovou skupinu, nafth-l-ylmethylovou skupinu, naft-2-ylmethylovou skupinu a fenethylovou skupinu.

Substituovaná aralkylová skupina znamená aralkylovou skupinu substituovanou na arylové části jedním nebo více substituenty arylové skupiny.

Heterocyklylová skupina znamená 4- až 15-členný monocyklický nebo multicyklický kruhový systém, ve kterém jeden nebo více atomů v kruhu je jiným prvkem než uhlík, například atom dusíku, kyslíku či síry. Preferované heterocyklylové skupiny zahrnují pyridylovou skupinu, pyrimidylovou skupinu a pyrrolidylovou skupinu.

Substituovaná heterocyklylová skupina znamená heterocyklylovou skupinu substituovanou jedním nebo více substi23 • ·· «< ·· 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 99 99 tuenty arylové skupiny.

Heterocyklylalkylová skupina” a substituovaná heterocyklylalkylová skupina znamená alkylovou skupinu, která je substituovaná heterocyklylovou skupinou respektive sub* stituovanou heterocyklylovou skupinou.

- Hygroskopičnost znamená sorpci se získáním množství či stavů vody dostatečných pro ovlivnění fyzikálních a chemických vlastností látky (red. J. Swarbrick a J. C. Boylan, Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, sv. 10, str. 33).

Dále se popisují preferovaná ztělesnění tohoto vynálezu.

Preferovanou sloučeninou připravenou podle tohoto vynálezu popisuje vzorec II, ve kterém E² je atom vodíku, alkylová skupina, hydroxymethylová skupina, 1-hydroxyethylová skupina, merkaptomethylová skupina, 2-methylthioethylová skupina, karboxymethylová skupina, 2-karboxyethylová skupina, 4-aminobutylová skupina, 3-guanidinopropylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklyl ová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylakylová skupina, substituovaná heterocyklyalkylová skupina nebo E¹ a E² spolu s atomy dusíku a uhlíku, kterými jsou E¹ a E² připojeny, vytvářejí 4-, 5-, 6- nebo 7-členný azacykloalkanový kruh s podmínkou, že heterocyklylalkylová skupina je jiná než indol-3-ylmethylová skupina.

Preferovanější sloučeninu připravenou podle tohoto «000 vynálezu popisuje obecný vzorec II, ve kterém E² je atom vodíku, alkylová skupina, hydroxymethylová skupina,

1- hydroxyethylová skupina, merkaptomethylová skupina,

2- methylthioethylová skupina, karboxymethylová skupina,

2- karboxyethylová skupina, 4-aminobutylová skupina,

3- guanidinopropylová skupina, cykloakylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, kterým jsou připojeny, vytvářejí 4-, 5-, 6- nebo 7-členný azacykloalkanový kruh.

Ještě preferovanější sloučenina připravená podle tohoto vynálezu se popisuje v obecném vzorci II, ve kterém E²je atom vodíku, alkylová skupina, hydroxymethylová skupina,

1- hydroxyethylová skupina, merkaptomethylová skupina,

2- methylthioethylová skupina, karboxymethylová skupina,

2- karboxyethylová skupina, 4-aminobutylová skupina,

3- guanidinopropylová skupina, cykloakylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupin nebo E¹ a E² spolu s atomy dusíku a uhlíku, kterými jsou připojeny, vytvářejí 4-, 5-, 6- nebo 7-členný azacykloalkanový kruh.

Další preferovaná sloučenina připravená podle tohoto vynálezu se popisuje v obecném vzorci II, ve kterém B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina nebo alkylcykloalkylalkylová skupina.

Zvláštní případ sloučeniny připravené podle tohoto vynálezu se popisuje v obecném vzorci Ila.

* · · 9i • · β · · · · · 4 4 · • * · » 4 4 r• β · « · · • · · * · · · ····

II II

NH-CH-C-NH—CH-C i I

CH₂COOH J (Ila) ve kterém

J je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina nebo substituovaná aralkylová skupina,

L je skupina OR¹ nebo NR^R²,

R¹ a R² jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, ♦ · * · · · e · · · 4 » · · t ft ·· 9 · · · · ♦ · · G · · · « · « ♦ * * · * · · · f ·· ř ♦ · · ··· i··· ··· ·· *♦ ···· >9 »· alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina, m je 1 až 5, n je 2 až 6 a p je 1 nebo 2.

Preferovanějším zvláštním ztělesněním je sloučenina připravená podle tohoto vynálezu popisovaná obecným vzorcem IIa, ve kterém

B je alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina nebo alkylcykloalkylalkylová skupina,

J je atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina nebo alkylcykloalkylalkylová skupina, m je 3 a n je 3 nebo 4.

Dalším preferovaným zvláštním ztělesněním je sloučenina připravená podle tohoto vynálezu popsaná obecným vzorcem Ha, ve kterém

B je alkylová skupina,

J je alkylová skupina, cykloalkylová skupina nebo cykloalkylalkylová skupina,

R^x a R² jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina nebo alkylcykloalkylalkylová skupina, m je 3, n je 3 nebo 4 a p je l.

Dalším preferovaným zvláštním ztělesněním je sloučenina připravená podle tohoto vynálezu popsaná obecným vzorcem Ha, která je N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamid.

Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je vytvoření stabilní nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu. Podle tohoto vynálezu lze tuto sloučeninu použít pro vývoj stabilního prostředku obsahujícího tuto sloučeninu. Stabilní nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu má též vysokou teplotu tání a nevykazuje žádnou snahu absorbovat vodu. Stabilní forma též vykazuje jedinečnou a neočekávanou stabilitu vůči vlivům vlhkosti a teploty, které jsou nadměrné ve srovnání s vlivy, se kterými se setkáváme při přepravě, přípravě dávkové formy nebo dlouhodobé dopravě či skladování. Tyto vlastnosti též umožňují přípravu dávkové formy. Převedení na stabilní formu též nevede ke ztrátě materiálu či jeho čistoty a neovlivňuje nepříznivě vlastnosti částic.

’ ^{w w} » » 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 ♦ »·· · · 9 9 9 9 · « · 999 I 9 9 i * ·« ·· 9999 *4 9«

Preferovaným ztělesněním podle tohoto vynálezu je sloučenina obecného vzorce VII, ve kterém je alkylová skupina,

E⁰ je atom vodíku,

Eje cykloalkylalkylová skupina, je NR^R²,

R¹ a R² jsou atomy vodíku a

Dalším preferovaným ztělesněním podle tohoto vynálezu je sloučenina obecného vzorce VII, ve kterém je ethylová skupina, je atom vodíku,

Eje cyklohexylmethylová skupina, je NR^aR²,

R¹ a R² jsou atomy vodíku a je 1.

Dalším preferovaným ztělesněním podle tohoto vynálezu je sloučenina obecného vzorce VII, ve kterém • * » · ···» « f ' ' » » · · · · i » · » < * * · 9 9 i · · ₉ » · · 9 · · 9 9 9

9» 9 999 99 99

B

E^x

E²

G

R¹

P

P^x

P² je

B

E¹

E²

G

R¹

P

P³je ethylová skupina, je atom vodíku, je cyklohexylmethylová skupina, je NR^XR², a R² jsou atomy vodíku, je 1, je benzylová skupina a je skupina TFA.H-.

Dalším preferovaným ztělesněním podle tohoto vynálezu sloučenina obecného vzorce VII, ve kterém je ethylová skupina, je atom vodíku, je cyklohexylmethylová skupina, je skupina NR^XR², a R² jsou atomy vodíku, je 1/ je benzylová skupina a

P² je terč.butoxykarbonylová skupina.

Je třeba uvažovat, že tento vynález pokrývá všechny kombinace preferovaných sloučenin, preferovaných ztělesnění a zvláštních ztělesnění, jak se zde definují.

Sloučenina podle tohoto vynálezu je použitelná ve formě volné báze nebo kyseliny, jeji zwitteriontové soli nebo ve formě její farmaceuticky přijatelné soli. Veškeré formy spadají do rámce tohoto vynálezu.

Pokud je sloučenina podle tohoto vynálezu substituovaná bázickým zbytkem, vytvoří se kyselá adiční sůl, která je vhodnější pro použití a v praxi použiti této soli odpovídá použiti formy vhodné báze. Kyselina, kterou lze použit pro přípravu kyselé adiční soli, přednostně zahrnuje takovou kyselinu, která v kombinaci s volnou bází poskytuje farmaceuticky přijatelnou sůl, to jest sůl, jejíž aniont je netoxický pro pacienta při farmaceutických dávkách soli, takže prospěšné inhibiční účinky na agregaci destiček a vytváření trombů, které jsou charakteristické pro volnou bázi, nejsou porušeny vedlejšími účinky, které lze přisoudit aniontu.

I když se preferují farmaceuticky přijatelné soli těchto bázických sloučenin, lze použít veškeré kyselé adiční soli jako zdroje formy volné báze dokonce i když se daná sůl jako taková požaduje pouze jako meziprodukt, například když se sůl tvoří pouze pro účely čištění a identifikace nebo když se používá jako meziprodukt při přípravě farmaceuticky přijatelné soli způsoby iontové výměny. Farmaceuticky přijatelné soli v rámci tohoto vynálezu jsou ty, které se odvozují od následujících kyselin: minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná

Α· ♦ * ~ 31 ί. :

► »· *» · • · * · · 9 · · «

I ι a kyselina sulfamová a organické kyseliny jako je kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina vinná, kyselina malonová, kyselina methansulfonové, kyselina ethansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina cyklohexylsulfamová, kyselina chinová a podobně. Odpovídající kyselé adiční soli zahrnují následující: hydrohalidy, například hydrochlorid a hydrobromid, sulfáty, fosfáty, nitráty, sulfamaty, acetaty, citráty, laktaty, tartaraty, malonaty, oxalaty, salicylaty, propionaty, sukcinaty, fumaraty, maleaty, methylen-bis-B-hydroxynaftoaty, gentisaty, mesylaty, isothionaty a di-p-toluoyltartratmethansulfonaty, ethansulfonaty, benzensulfonaty, p-toluensulfonaty, cyklohexylsulfamaty a chinaty.

V souladu s další vlastností tohoto vynálezu se kyselé adiční soli sloučeniny podle tohoto vynálezu připraví reakcí volné báze s příslušnou kyselinou použitím či adaptací známých metod. Adiční soli sloučeniny podle tohoto vynálezu se například připraví rozpuštěním volné báze ve vodném či vodnoalkoholovém roztoku nebo v jiných vhodných rozpouštědlech obsahujících příslušnou kyselinu a izolací soli odpařením roztoku nebo reakcí volné báze a kyseliny v organickém rozpouštědle a v tomto případě se sůl separuje přímo nebo se může obdržet odpařením roztoku.

Kyselé adiční soli sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou regenerovat se solí s použitím či adaptací známých metod. Například lze mateřské sloučeniny podle tohoto vynálezu regenerovat z jejich kyselých adičních solí zpracováním bázickými prostředky například vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného nebo vodným roztokem amoniaku.

Je-li sloučenina podle tohoto vynálezu substituovaná

• «« • © ·	• · · © • · · *	©· ♦ © «
• · ©	• © ·	• · ·
• » * ©	© · · · · ·	* ·

kyselým zbytkem, mohou se vytvořit bázické adiční soli, které představují jednoduchou a vhodnější formu pro použiti a v praxi použití této formy soli odpovídá použití formy volné kyseliny. Báze, které lze použít pro přípravu těchto bázických adičních solí, zahrnují přednostně ty, které v kombinaci s volnou kyselinou poskytují farmaceuticky přijatelné soli, to jest soli, jejichž kationty jsou netoxické pro živočišný organismus ve farmaceutických dávkách soli, takže prospěšné inhibiční účinky na agregaci destiček a vytváření trombu charakteristické pro volnou kyselinu, nejsou narušeny vedlejšími účinky, které lze připsat kationtům. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnující například soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin v rámci tohoto vynálezu jsou soli odvozené od následujících bází: hydrid sodný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hlinitý, hydroxid lithný, hydroxid hořečnatý, hydroxid zinečnatý, hydroxid amonný, ethylendiamin,

N-methyl-glukamin, lysin, arginin, ornithin, cholin,

N,N'-dibenzylethylen-diamin, chloroprokain, diethanolamin, prokain, N-benzylfenethylamin, diethylamin, piperazin, tris(hydroxymethyl)-aminomethan, tetramethylammoniumhydroxid a podobně.

Kovové soli sloučenin podle tohoto vynálezu se mohou obdržet stykem hydridu, hydroxidu, karbonátu či podobné reaktivní sloučeniny zvoleného kovu ve vodném či organickém rozpouštědle s formou vodné kyseliny sloučeniny. Použitým vodným rozpouštědlem může být voda nebo směs vody s organickým rozpouštědlem, přednostně s alkoholem, jako je methanol či ethanol, ketonem, jako je aceton, alifatickým etherem jako je tetrahydrofuran nebo esterem, jako je ethylacetát. Tyto reakce se normálně provádějí při teplotě prostředí, avšak v případě požadavku se mohou provádět při zahřívání.

•		0 »		9 9	0 9		• »
9 0 *	9	•		• 0	9	•	• ·
* 0	0	•	0	9	9	•	0. 0

0 0 9 0 9- 0 9	0	» « ·	0	* • · 9 0	« ♦ ·	•	0 9 0 9

Aminové soli sloučenin podle tohoto vynálezu se mohou obdržet stykem aminu ve vodném či organickém rozpouštědle s formou vodné kyseliny sloučeniny. Vhodným vodným rozpouštědlem je voda a směsi vody s alkoholy, jako je methanol či ethanol, ethery, jako je tetrahydrofuran, nitrily, jako je acetonitril nebo ketony, jako je aceton. Soli aminokyselin se mohou připravit podobným způsobem.

Bazické adiční soli sloučenin podle tohoto vynálezu se mohou regenerovat ze solí aplikací či adaptací známých metod. Například se může mateřská sloučenina podle tohoto vynálezu regenerovat ze své bázické adiční soli zpracováním kyselinou, například kyselinou chlorovodíkovou.

Soli sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou kromě svého použití jako vlastních aktivních sloučenin využít pro čištění sloučenin, například s použitím rozdílů v rozpustnosti mezi solí a mateřskou sloučeninou, vedlejším produktem a/nebo výchozími materiály způsoby dobře známými tomu, kdo má zkušenost v oboru.

Sloučenina podle tohoto vynálezu může obsahovat asymetrická centra. Tato asymetrická centra mohou být nezávisle na sobě v konfiguraci R nebo S. Pro toho, kdo má zkušenost v oboru, bude též zřejmé, že určité sloučeniny obecného vzorce I mohou vykazovat geometrickou isomerii. Geometrické isomery zahrnují formy cis a trans sloučenin podle tohoto vynálezu s alkenylovými zbytky. Tento vynález zahrnuje jednotlivé geometrické isomery a stereoisomery a jejich směsi .

Tyto isomery lze separovat ze směsí použitím či • * ’ » · t · · φ · • · * * « * · · · 9 « 9 » · · · · * «·«« • · · * *· · * «· · · · * · · · · » »··« ♦ *· ·· »· «··· φ · «» adaptací známých metod, například chromatografických způsobů a rekrystalizačnich způsobů, nebo se mohou připravit odděleně z příslušných isomerů svých meziproduktů, například aplikací či adaptaci zde popsaných způsobů.

Patentové přihlášky US č. 08/138 820 a 08/476 750, které se zde zahrnují formou odkazu, popisují způsoby přípravy amorfní sloučeniny obecného vzorce II a zejména amorfní sloučeniny obecného vzorce I.

Nový způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce II a zejména krystalické sloučeniny obecného vzorce I podle tohoto vynálezu se popisuje syntézou ukázanou ve schématu II, ve kterém

B, E¹, E², G, R, m, n a p se definují výše a

P¹ je skupina chránící kyselinu labilní při hydrogenací, jako je benzylová skupina,

P² je skupina chránící amin v labilním kyselém prostředí, jako je terc.butoxykarbonylová skupina (BOC) a

P³ je skupina chránící amin labilní při hydrogenací jako je benzyloxykarbonylová skupina (CBZ).

Schéma II

RP³'

R- 35 O O

P2-N-(CH₂)_P—COH + H₂N—CH-COH

CH2CO2P

Spojovací prostředek

O

JL

HN♦ · · » A A AAA* ♦ A · · A 9 I · A

P²-N—(CH₂)_pB

TFA HN-(CH₂)_P

B

O

JL

O

JL

Spojovací prostředek _P2._N_(CH₂)pB

Spojovací prostředek.

E² O I l II

-N —CH—C —G

O

II

-ch-co₂h

I ch₂co₂p¹

HN— CHI

CH₂CO₂P¹TFA

HN— CHI

O

JL

E¹ E² O I I 11

-N— CH—C —G ch₂co₂p¹ (—{<?<M

O

II p3

N_^CH₂-^—C — OH _x S 5}

CHz^—C —N— (CH₂)_p—ΜI-(9^<n>=) m

NΗΝ—CHO E¹

E² O

I II

-CH-C—G

CH₂CO₂P¹ hydrogenace (například plynným vodíkem nebo chemickým přenosem)

O

II ^CH₂j—C-N-(CH₂)_P ^Π B

O

J-HN—CHI

O

IL

E¹ E² O

I I II

N-CH-C—G

CH₂CO₂H

• · · · • · > ·

9 9 9

Během přípravy sloučeniny obecného vzorce II nebo jejího meziproduktu může být též žádoucí či nezbytné zabránění křížové reakci mezi chemicky aktivními substituenty přírodních aminokyselin nebo pseudoaminokyselin. Tyto substituenty lze chránit standardními blokujícími skupinami, které lze následně odstranit či zachovat podle požadavku způsoby známými pro obdržení žádaných produktů či meziproduktů (viz například Green Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, 1981). Selektivní protekce či deprotekce může být též nezbytnou či žádoucí pro umožnění přeměny či odstranění existujících substituentů nebo pro umožnění následné reakce pro získání konečného žádaného produktu.

Způsob schématu II je vyložen na příkladu přípravy sloučeniny obecného vzorce II, avšak je třeba uvažovat, že s použitím příslušných výchozích materiálů se připraví sloučenina obecného vzorce I. Při přípravě sloučeniny obecného vzorce I podle schématu II je B ethylová skupina, E je atom vodíku, F je cyklohexylmethylová skupina, G je aminoskupina, R je atom vodíku, m je 3, n je 3, p je 1, P^x je benzylová skupina, P³ je BOC a P³ je CBZ.

Alternativní způsob podle tohoto vynálezu pro přípravu sloučeniny obecného vzorce I je stejný jako ve schématu II kromě toho, že se použije sloučenina obecného vzorce III, ve které se P³ definuje výše,

OH (III) * ·· ·· ·· ·· • · · 4 4 · · 4 4 ·· · • · · · · · 4 4 · 4 • 4 · · · 4 4 · · · · « • · · · · 4 · · · · «·» 4· ·· ··«· ·· 44 místo sloučeniny obecného vzorce IV, ve které je atom vodíku, je 3, je 3, jela

ZJe

(IV)

CBZ s obdržením meziproduktu obecného vzorce V, ve kterém

B je ethylová skupina,

E^x je atom vodíku,

Φ φ φ φφφ « · • * φ · φ φ φφφ » φ φ φ φφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ • · φ φ φ φ φ φ • φ φ φ • · φ φ • φ φ φ

Ε² je

Ρ³— Ν — ΝI

Β •(θΗ₂)ρΟ

JL

Ε¹

I

-με² ο

I II

-CH-CG

CH₂CO₂P¹ (V) cyklohexylmethylová skupina,

G je aminoskupina,

Ρ ϊθ 1,

P¹ je benzylová skupina a

Pⁿ je CBZ.

Schéma II ukazuje způsob o pěti krocích pro přípravu sloučeniny podle tohoto vynálezu počínaje vytvořením centrálního dipeptidového meziproduktu podle tohoto vynálezu obecného vzorce VI, ve kterém

Β, ρ, P² a

P²-N—(CH₂)p· fi

(VI) se definují výše.

V případě přípravy sloučeniny obecného vzorce I je centrálním dipeptidovým meziproduktem podle tohoto vynálezu BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-0H. Centrální dipeptidový meziprodukt se připraví bez ochrany volného zbytku karboxylové kyseliny.

V kroku 2 schématu II se může připojení s vytvořením centrálního dipeptidu provést buď v dichlormethanu nebo ve směsích ethylacetatu s nebo bez dimethylformamidu jako pomocného rozpouštědla - a organických bází, jako je NMM a může se uskutečnit při teplotách od teploty místnosti zhruba do 40 °C. Aktivace aminokyseliny nebo pseudoaminokyseliny následujícího vzorce pro spojení se může uskutečnit s použitím υ

II p2__N_(CH₂)p--COH

B neizolovaných aktivních esterů s p-nitrofenolem, pentafluorfenolem a N-hydroxysukcinimidem působením dicyklohexylkarbo40 *· ♦· 00 00 • » · 0 0 «· 0 • · · 0 0 0 0

9 9 ·»00 •0 0000 00 00 diimidu. Doby spojováni se pohybuji od 1 do zhruba 20 h. v závislosti na aminokyselinách či pseudoaminokyselinách, které se mají spojovat, aktivačním činidlu, rozpouštědlu a teplotě. Centrální dipeptidový produkt kroku 1 se nemusí izolovat. Reakční směs kroku 1 se obvykle promývá vodou či zředěnou vodnou kyselinou (například vodnou kyselinou chlorovodíkovou) a poté se používá přímo bez sušení v kroku 2.

V případu použití aktivních esterů na bázi fenolu se centrální dipeptidový produkt extrahuje do alkalické vody z reakční směsi, poté se reextrahuje z okyseleného vodného roztoku zpět do organického rozpouštědla a roztok reaguje přímo jako v kroku 2.

Dipeptidový meziprodukt obecného vzorce VI se použije k přípravě tripeptidového meziproduktu podle tohoto vynálezu vzorce VII, ve kterém B, E¹ , E^:?, G, pa

P²'

-N—(^CH₂)^ B

JI

ΜΙΜΟ E¹ E² O

II ^{1 1 11}

CH—^u—N-CH-C—G

CH₂CO₂P’ (VII)

P¹ se definují výše a P² * je P² nebo TFA.H-. Pokud P^2- je TFA.H-, potom symbol ”. představuje disociaci kyseliny trifluoroctové (TFA) s vytvořením F CCO ~ a H', při které H' protonuje terminální amin ve sloučenině obecného vzorce • · ·

VII, to jest poskytuje sůl kyseliny trifluoroctová obecného vzorce Vila. V případě přípravy sloučeniny

CF3CO2

H₂N-{CH₂)pB •HNE¹

I

-ΜΕ²

I

CH· CH₂CO₂P¹

O

II • CH—C—G (Vila) obecného vzorce I je tripeptidovým meziproduktem podle tohoto vynálezu P² ’ -N(Et)Gly-(L) -Asp(OBz.l) -(L) -Cha-NH^ .

V kroku 2 lze připojení aminokyseliny nebo pseudoaminokysel.iny k centrálnímu dipeptidu uskutečnit buď v dichlormethanu nebo ve směsi ethylacetatu a dimethylformamidu nebo tetrahydrofuranu při teplotě místnosti nebo při nižší teplotě. Aktivace centrálního dipeptidu následujícího vzorce pro spojování p2„N_(CH₂)p

HN—CH—CO2H I . CH2CO2P¹ • · 9 99 99 99 99 · · 9 « 9 9 · · 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9 9 9 9 «99 999 9999

999 99 99 9999 99 9 9 se může uskutečnit s použitím neizolovaných aktivních esterů pentafluorfenolu nebo N-hydroxy-sukcinimidu působením dicyklohexylkarbodiimidu. Aktivace se též může uskutečnit s použitím isopropylchlorformiatu. Reakční doby se mění v závislosti na aminokyselinách či pseudoaminokyselinách, které se mají spojovat, na aktivačním činidlu, rozpouštědlu a teplotě a pohybují se od 1 do 20 h. Tripeptidový produkt se nemusí izolovat. Když se tripeptidový produkt neizoluje, promyje se reakční směs vodnou organickou bází, jako je vodný N-methylmorfolin a vodnou kyselinou, jako je vodný roztok kyseliny chlorovodíkové, a reaguje jako takový způsobem kroku 3 po vodném promytí a bez sušení.

V kroku 3 schématu II se může odstranění chránící skupiny, jako je BOC, z tripeptidového produktu kroku 2 uskutečnit s použitím roztoku kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu nebo s použitím směsi kyseliny bromovodikové v kyselině octové a ethylacetátu. Reakce může probíhat zhruba při teplotě místnosti a reakce vyžaduje trvání 1 h (způsob s kyselinou bromovodíkovou) a zhruba 2 h (způsob s kyselinou trifluoroctovou). Produkt kyselé soli tripeptidu se izoluje filtrací jako krystalická pevná látka buď přímo z reakční směsi (způsob s kyselinou bromovodíkovou) nebo po částečném odstranění rozpouštědla destilací a přídavkem nepolárního rozpouštědla ke zbytku v reakční nádobě.

Další způsob podle tohoto vynálezu se popisuje jako jednoduchý zřetězený způsob pro rychlou a jednoduchou příprávu TFA.H-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH^ z BOC-N(Et)Gly-OH, což je reakce prováděná v jedné nádobě zahrnující první dva spojovací kroky ve schématu II a zpracováni kyselinou trifluoroctovou. Obdrží se jednotlivě TFA.HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂, neboť krystalizuje • *· ·· ·· ·· · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · 9 9 9

9 ·· 99 9 999

99

9 9 9

9 9 9 přímo z roztoku zřetězené reakce. Zřetězený způsob se vyhýbá odpovídajícím třem odděleným reakcím ve schématu II a řeší problém pro obdržení jednotlivé časově a cenově účinné syntézy, která je použitelná při výrobě.

Schéma II ukazuje tvorbu polypeptidu v opačném pořadí počínaje aminokyselinou s chráněnou aminoskupinou s následným postupným přídavkem ke karboxylovému konci oproti konvenčnímu pořadí, kterým se tvoří polypeptid následnými amidacemi na aminovém konci aminokyseliny s chráněným uhlíkovým koncem. Tento reverzní syntetický způsob podle tohoto vynálezu požaduje ochranu dusíku pouze u první aminokyseliny s umožněním použití od tohoto místa následných aminokyselin nemajících žádnou ochranu na konci s aminovou či karboxylovou skupinou (kromě funkčních skupin bočního řetězce). Tyto reverzní syntetické metody rovněž usměrňují tvorbu sloučeniny obecného vzorce II a zejména sloučeniny obecného vzorce I tím, že umožňuji použiti proudového způsobu výroby oproti vsádkovému typu normálně požadovanému v chemii peptidů. Nový přístup snižuje výrobní náklady odstraněním požadavků na nákup aminokyselin chráněných na aminovém konci. Nepožadují se žádná zvláštní vybavení, činidla či analytické způsoby.

Dalším způsobem podle tohoto vynálezu je tvorba stabilního nehygroskopického krystalického N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-D-cyklohexylalaninamidu obdrženého reprodukovatělně novou přeměnou v pevné fázi z hygroskopického krystalického N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu připraveného způsobem popsaným ve schématu II a v uvedených alternativních reakčních krocích.

• 99 99 99 ··

9 · 9 9 99 9 9 99 9

999 99 9 9999 ·· 999 9 9 99 99 9

9 9 999 9999

999 99 99 9999 99 99

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu je fyzikálně nestabilní a převádí se expozicí podmínkám vlhkosti a teploty na vysoce stabilní nehygroskopickou krystalickou formu N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu.

Obecné podmínky podle tohoto vynálezu pro převedení hygroskopická krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu na vysoce stabilní nehygroskopickou krystalickou formu N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu se zajišťují za statických a dynamických podmínek.

Statický způsob podle tohoto vynálezu se popisuje jako statická konverze, neboť zahrnuje expozici hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklo- hexylalaninamidu umístěné do nepohyblivé nádoby, jako jsou lahvičky či misky, určitým podmínkám teploty a vlhkosti v kontrolované klimatické komoře. Statická” konverze se provádí při teplotách a relativních vlhkostech pohybujících se.od zhruba 20 °C do zhruba 80 °C, v preferovaných případech při zhruba 40 °C až zhruba 80 “C a při 40 až 100 % relativní vlhkosti, přednostně při zhruba 65 až zhruba 80 % relativní vlhkosti.

Dynamický způsob podle tohoto vynálezu se popisuje jako dynamická konverze, neboť zahrnuje expozici hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu při hladinách vlhkosti a teploty jako ve

9* 99 99 99 • 9 9999 9999

99 9 9999

999 9 9 99 99 9

999 9999

99 99 9999 99 99 statickém modelu, avšak za podmínek míchání včetně promíchávání hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu v rotační odpařovací baňce nebo v cylindrické nádobě (v komoře s vlhkostí) za mícháni pomocí vrtulky.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží pro ilustraci a nemají omezovat rozsah tohoto vynálezu.

Pokud není uvedeno jinak, pocházejí údaje o hmotnostní spektrální analýze z provedení bombardování rychlými atomy s nízkým rozlišením na VG 70SE s vypočtenými hodnotami (M+H)·*·. Spektrální údaje nukleární magnetické resonance (NMR) se obdrží na Brucker ACF 300 v D_aO. Mžiková chromatografie se provádí na silikagelu. Vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC) se provádí na sloupcích s reverzní fázi C-18 s rozměrem částic mezi 8 a 15 μιη.

Pokud není uvedeno jinak, pocházejí grafy rentgenové práškové difrakční analýzy od použití difraktometru Siemens D5000 s radiačním zdrojem Cu (1,8 kw, 45 kV a 40 mA) pro snímání práškových vzorků. Vzorky se před měřením melou pro eliminaci účinku velikosti částice na intenzity píků. Do držáku vzorku 1,5 x 1 cm se umístí zhruba 60 mg vzorku a snímá se v rozmez! 3 až 40° 2 theta s velikostí kroku 0,04° a celkovou expozici 12 s na krok.

Příklad 1

Příprava BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH • · · 9 9 ·· ·· · · • · · · · · · · · 9 9 9 • 9 · ·· · ···· • · · · · · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 99 99 99 9999 99 99 (Krok 1 schématu II)

Do baňky s kulatým dnem se třemi hrdly o obsahu 1 litr se umístí 51 g (0,25 mol) BOC-N(Et)Gly-OH, 35 g (0,25 mol) PNP, 400 ml ethylacetátu a 100 ml dimethylformamidu. Směs se míchá pro obdržení roztoku a ochladí na 4 až 6 °C.

Po kapkách se přidává roztok 51,5 g (0,25 mol) dicyklohexylkarbodiimidu ve 125 ml ethylacetátu po dobu 10 min při udržování teploty od zhruba 5 °C do zhruba 8 °C. Po přidání veškerého dicyklohexylkarbodiimidu se chladící lázeň odstraní a směs se míchá po dobu 1,5 h a přitom se ohřeje na teplotu místnosti (20 až 22 °C). Během této doby se vytváří DCU ve formě pevné sraženiny. Úplnost tvorby esteru PNP se stanoví analytickou vysokovýkonnou kapalinovou chromatografil [vymizení BOC-N(Et)Gly-OH]. Reakční směs se zfiltruje a zbytek DCU se promyje podíly 2 až 50 ml ethylacetátu a podíly prošlé filtrem se přidají k filtrátu. DCU se odstraní.

K míchanému zfiltrovanému roztoku se přidá 67 g (0,3 mol) H₂N-(L)-Asp(OBzl)-OH ve formě suspenze ve 150 ml (138 g, 1,36 mol) NMM. Směs se zahřívá na 38 až 40 °C a udržuje při této teplotě po dobu 41 h, což je doba, po které analytická vysokovýkonná kapalinová chromatografie ukazuje na úplnou spotřebu BOC-N(Et)Gly-OPNP. Reakční směs se ochladí na 25 °C a nezreagovaný H₂N-(L)-Asp(OBzl)-0H se odfiltruje. Roztok se ochladí a znovu zfiltruje pro obdržení dalších 1,2 g [21,7 g zpětného získání, 11,2 g představuje přidaný 20% přebytek a 10,5 g (0,047 mol) představuje nezreagovanou látku].

Zfiltrovaný roztok se extrahuje ve Squibbově nálevce o obsahu 2 litry s jedním podílem 500 ml deionizované vody a následujícími dvěma podíly 250 ml. Spojený vodný roztok se ·· • ·# *· ·· ·<

·· · · ···· <*··· » · · · · · ···· • · ··· · · ·· · · · • · · ··· ···· ··· ·· ·· ·«·· ·· ·· extrahuje 3 podíly po 300 ml směsi MTBE/ethylacetat pro odstraněni zbytkového PNP (1:1) (analýza vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií vykazuje pouze stopové zbytky).

Poté se ochladí na 5 °C a okyselí z pH 8,9 na pH 1,79 přidáváním 150 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po kapkách. Okyselený vodný roztok se extrahuje dvěma podíly 200 ml ethylacetátu. Analýza pevné fáze vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií nevykazuje žádný zbytkový žádaný produkt. Ethylacetatové extrakty se spojí, vysuší síranem horečnatým, zfiltrují a odpaří na rotační odparce při 35 °C. Výsledná světle oranžová olejovitá kapalina se čerpá při 35 °C pro maximální odstraněni zbytkového rozpouštědla se získáním 85,68 g BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH ve formě olejovité kapaliny (21,3 mmol, výtěžek 85,5 %, bez korekce na zbytkové rozpouštědlo).

Charakterizace:

NMR (250 MHz): 7,3 ppm (s), 5,1 ppm (s), 3,3 ppm(dg), 3,0 (dq), 1,4 ppm (s), 1,1 (t)

MS: M = 408, M+l - 409 pozorOV.

Vysokovýkonná kapalinová chromatografie: 90,79A % (3,87A % p-nitrofenol, bez korekce na e)

Elementární analýza: C H NO:H,N,C 57,54,

-² 20 28 2 Ύ ' ' Π&.2.&Ζ . ' '

C 58,81.

Příklad 2

Příprava BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Krok 2 schématu II)

4 4«	• 4	44	44	4«
·· 4 4	4	4	4 4	4	4	4 4
• · 4	4	4	4	4	4	4 4

4 4 4	4	4	4	4	4	4 4
444 44	• 4		4444	44		44

Způsob A

Isopropylchlorformiatový způsob

Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH se rozpustí v ethylacetátu (6 až 8 objemů, 1:6,5 hm:obj) a udržuje se při teplotě mezi -15 až 0 °C. Přidá se NMM (1 ekvivalent) při udržování při teplotě zhruba od -15 °C do zhruba 0 °C. Isopropylchlorformiat (1 až 1,1 ekvivalentu) se přidá do roztoku chráněného dipeptidu při teplotě mezi -15 a 0 °C. Reakční směs se udržuje při teplotě mezi -15 °C a 0 °C po dobu 2 až 5 min. Roztok H₂N-(L)-Cha-NH₂ (1 ekvivalent) v tetrahydrofuranu (10 objemů, 1:10 hm:obj) se přidá k ochlazenému roztoku dipeptidu s udržováním teploty při zhruba -15 °C až zhruba 0 °C. Reakční směs se sleduje vzorky odebranými v průběhu procesu pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie v době 15 min, 1 h a 2 h pro vyhodnocení úplnosti reakce. (Reakce je úplná, pokud množství pozorovaného dipeptidu je menší než 10 % na základě vyhodnocení plochy při analýze vysokovýkonnou kapalinovou chromátograf ií) .

BOC-tripetidový produkt se sráží přímo z reakčního roztoku a oddělí se filtrací z reakční směsi, promyje se ethylacetátem (2x, 1 objem, hm:obj) a suší ve vakuu. Obvyklé výtěžky jsou vyšší než 60 % s čistotami více než 90A %, <1A % epimerního diastereoisomeru kyseliny aspartové.

Resuspenzace v ethylacetátu poskytuje konečné výtěžky okolo 60 % BOC-N-(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₃ a zlepšuje čistotu na >95A % se snížením diastereoisomeru na <0,5 %.

• «· * · ·· · 4 4 4

4 4 · · 4 4 4 · · · 4

4 4 «4 · 4444 • » · »·« 2··· ·»· ·· ·· ···· ·3 ··

Pro specifický případ isopropylchlorformiatového způsobu, při kterém se postupuje podle obecného způsobu příkladu A s použitím 4,55 g (8,1 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH je množství připraveného BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ 3,26 g (čistota 97,9A %, 0,3A % diastereoisomeru), teoretický výtěžek 70 %.

Způsob B

Způsob komplexu pentafluorfenol-DCC

Pentafluorfenol (PFP, 2'9 ekvivalentů) a dicyklohexylkarbodiimid (1 ekvivalent) se rozpustí v ethylacetátu (5 objemů’ 1:5 hm:obj) při teplotě místnosti a ochladí na teplotu mezi -15 a 0 °C. Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH se rozpustí v ethylacetátu (6 objemů, 1:6 hm:obj) a smísí s jedním ekvivalentem H_aN-(L)-Cha-NH^, který se předtím rozpustí v dimethylformamidu (10 objemů, 1:10 hm:obj). Roztok dipeptid/H₂N-(L)-Cha-NH_a se přidává po kapkách do roztoku pentafluorfenolu a dicyklohexylkarbodiimidu s udržováním teploty mezi -15 a 0 °C. Reakční směs se udržuje při teplotě mezi 15 a 22 °C po dobu 5 až 16 h s kontrolou vzorků v průběhu procesu pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie odebraných v časech 1, 2, 3, 4al6h pro vyhodnoceni skončeni reakce. (Reakce je skončena, pokud je množství pozorovaného dipeptidu nižší než 2 % na základě analýzy plochy vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií.

Reakční směs se zfiltruje a filtrační koláč (DCU) se promyje ethylacetátem (2x 0,5 objemů, hm:obj). Filtrát se zpracuje vodou (10 objemů, 1:10 hm:obj) a vodná vrstva se odstraní. Ethylacetatová vrstva se promyje vodou (lx 5 objemů: 1:5 hm:obj). Ethylacetatová vrstva se ochladí pro vysrá50

* • * ·	• · ♦	• » •	©	• © • ·	• · ©	♦	•	4 ·	•
• ·	•	•	•	•	«	•	•		•
									<
• ·	•	•	©	•	©	•	•		a
·· «	• ·	• ·		• · · ·	« ·			• ©

žení produktu, který se filtruje a promyje ethylacetátem (2x 0,4 objemy, 1:0,4 hm:obj). Izolované molární výtěžky >60 % s obvyklou čistotou >90A %, s 1 až 4A % epimerního diastereomeru kyseliny aspartové.

Resuspenzace ethylacetátu poskytuje konečné výtěžky okolo 60 % BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₃ a zlepšuje čistotu na >99A % se snížením diastereomeru na <0,5 %.

Při specifickém případu způsobu komplexu pentafluorfenol-DCC s použitím obecného způsobu B a 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH je množství připraveného BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ 8,15 g (čistota 99A %, 0,49A % diastereomeru), teoretický výtěžek 59 %.

Způsob C

Způsob hydroxybenzotriazolu (HOBT)/2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorboratu (TBTU)

Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-OH se rozpustí v dimethylformamidu (9 až 10 objemů, 1:10 hm:hm) a udržuje se při teplotě okolí. K tomuto roztoku se přidá H₂N-(L)-Cha-NH₂ (1 ekvivalent) a hydroxybenzotriazol (HOBT, ekvivalent). Výsledný roztok se ochladí na zhruba 0 °C až zhruba 10 °C a přidá se NMM (1 až 1,1 ekvivalentu).

Spojovací prostředek, 2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborat (1 až 1,1 ekvivalentu) se rozpustí v dimethylformamidu (4 až 5 objemů, 1:5 hm:hm) k roztoku chráněného dipeptidu při teplotě 0 °C až zhruba 10 °C. Tento roztok se míchá při zhruba 10 °C až zhruba 25 °C po dobu zhruba 3 h tak dlouho, až analýza vysokovýkonnou • · « * · ·> · · · ·

9 9 9 9 0 0 0 9 9 ft · 9 9 9 0 9 · 9

V 9 9 9 9 ti 0 0 0 9 0 · 0 9 9 0 9 9 9 • ·» ·· » ·· · · « · · kapalinovou chromatografii ukazuje skončení reakce (méně než 2 % výchozího materiálu podle plochy). Reakční směs se přidá k míchané směsi 5% vodného roztoku chloridu sodného (zhruba 4 objemy proti objemu reakční směsi) a ethylacetátu (zhruba 2 objemy proti objemu reakční směsi). Fáze se oddělí a vodná fáze se extrahuje dalším podílem ethylacetátu (zhruba 1,5 objemu proti objemu reakční směsi). Organické fáze se spojí a postupně promyjí vodným 0,5 N roztokem kyseliny citrónové (zhruba 0,6 až 0,7 objemů proti objemu organické fáze), 10% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2x 0,6 až 0,7 objemu proti objemu organické fáze při každém promytí) a 25% vodným roztokem chloridu sodného (zhruba 0,3 až 0,4 objemu proti objemu organické fáze). Výsledná organická fáze se odpaří na zhruba 1/4 až 1/2 objemu za sníženého tlaku při zhruba 30 až 50 °C a k tomuto teplému roztoku se přidá stejný objem heptanu. Směs se míchá a ponechá ochladit na zhruba 0 °C až zhruba 20 °C pro vysrážení žádaného tripeptidu. Tato tuhá látka se zfiltruje, promyje směsi ethylacetátu a heptanu a vysuší. Obvyklý výtěžek je větší než 60 % s obvyklou čistotu větší než 95,7A % a hladinami epimernlho diastereomeru kyseliny aspartové < 2A %.

Při použití specifického příkladu způsobu HOBT/TBTU, kdy se dodržuje obecný postup s použitím 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bzl)-OH se připraví 9,3 g BOC-N(Et)-Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (čistota 96,IA %, 1,77A % diastereomeru Asp), 67,7 % teoretického výtěžku.

Hmotnostní spektrometrie: M 560,7, M+l 561 vyp pozor*

Teplota tání 182,17 (DSC) ¹H NMR (δ proti TMS, D6 DMSO): 0,89 m (IH), 0,94 • «· «· ·· ·* ·· • · · « 9 9 9 9 · · · « φ φ φ 9 9 9 9 9 9 9

9 · · * 9 · · · · · · • 9 · 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 ·9 ·· m (1Η), 1,0 dt (2H), 1,15 m (2H), 1,06-1,3 m (4H), 1,36 d (9H), 1,4-1,74 m (6H), 2,65 m (1H), 2,85, m (1H), 3,18, m (2H), 3,75, d (2H), 4,2, S (1H), 4,66, d (1H), 5,08, s (2H), 7,02, s (1H), 7,18, d (1H), 7,36, s (5H), 7,88, dd (1H), 8,24, dd (1H).

Příklad 3

Příprava TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Krok 3 schématu II)

BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ se rozpustí v dichlormethanu (zhruba 1:12 hm/hm) a k roztoku se přidá kyselina trifluoroctová při teplotě okolí. Roztok se poté míchá tak dlouho, až vysokovýkonná kapalinová chromatografie ukazuje ukončení reakce (3 až 5 h). Roztok se odpaří zhruba na jednu polovinu objemu při 40 až 45 °C. K tomuto teplému roztoku se přidá MTBE [zhruba 1:10 hm/hm proti BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂] při udržování teploty větší než 40 °C. Směs se pomalu ochladí zhruba na 5 °C a míchá po dobu 1 h pro zajištění úplné krystalizace. Výsledná tuhá látka se zfiltruje a promyje ochlazeným MTBE. Tuhé látky se vysuší za sníženého tlaku a analyzují na obsah TFA.-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (HPLC analýza hm/hm). Výtěžek je obecně téměř kvantitativní, čistota vyšší než 95A %.

Hmotnostní spektrometrie: 460 (volná báze),

M+l : 461 pozor

Elementární analýza: Η, N, F, C 54,35, nalez. 53,82.

·

• ·· • 4	4	• 4 4	4	4 4 4 ?	4 4 4	4	4
• «.	4	σ	«	♦)	• 4	4	4
• 4	4	•	4	4	4	4	4
• · 4 «V		• 4		• 4 4 4	4 4

^XH NMR (5 proti TMS), D⁶ DMSO): 0,9, m (2H), 1,15, t (6H), 1,5, m (1H), 1,5-1,8, m (6H) , 2,65, dd (1H), 2,9 , m (3H), 3,7, S (2H), 3,9, m (2H), 4,2, m (1H), 4,75, m (1H), 5,1, s (2H), 7,0, s (1H), 7,15, S (1H), 7,2, s (5H), 8,13, d (1H), 8,7-8,8, m (3H).

^X3C NMR (význačné signály, S proti TMS, D6 DMSO): 10,76, 25,49, 25,68, 25,96, 31,66, 33,07, 33,36, 36,25, 38,59, 41,88, 47,02, 49,40, 50,47, 65,71, 127,81-128,34, 135,82, 165,10, 169,34, 173,79.

Specifické příklady deprotekce ukazuje tabulka A.

Tabulka A

Lab. Množství Výtěžek a čistota A % příklad (BOC-N(Et)Gly-(L)- (TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂) -Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH^)

Příklad 7,5 g (13,3 mmol) 1

7,4 g (12,9 mmol) 97% výtěžek, čistota 98,8A %

Příklad

6,53 g (11,6 mmol) 6,4 g (11,1 mmol) 96% výtěžek, čistota 98,47A %

Příklad 4

Příprava CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH^ (Krok 4 schématu II)

Připraví se suspenze zhruba ekvimolárních množství TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂, CBZ-PipBu a TBTU v ethylacetátu, dimethylformamidu a vodě (100:8:4 obj/obj, zhruba 11:1 celkový obj/hm proti TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂). Tato suspenze se ochladí na 0 až 10 °C a přidají se zhruba 3 až 4 ekvivalenty NMM. Tato směs se ponechá ohřát na teplotu místnosti a míchá se tak dlouho, až HPLC ukáže skončení reakce (1 až 3 h, během této doby se objeví roztok). Přidá se voda (2- až 3násobek původního množství přidané vody) a fáze se ponechají oddělit. Vodná fáze se zachová a organická fáze se promyje dvěma dalšími podíly vody. Kombinované vodné podíly z promytí se zpětně extrahují ethylacetátem a kombinované organické fáze se promyjí 25% vodným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se odpaří za sníženého tlaku na zhruba 1/2 objemu a přidá se MTBE (zhruba 1/2 obj/obj proti roztoku objemu). Tato směs se ponechá krystalizovat (několik hodin) a tuhé látky se oddělí filtrací, promyjí ochlazenou směsí ethylacetátu a MTBE. Tuhé látky se vysuší za sníženého tlaku. Obsah CBZ-PipBu.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ se analyzuje vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii hm/hm. Výtěžek je obecně vyšší než 80 %, čistota vyšší než 95A %.

Při specifickém případu výše popsané přípravy s dodržováním obecného způsobu kroku 4 s použitím 7,25 g TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ se získá 7,9 g CBZ-PipBu.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (čistota vyšší než 99A %, 0,08A % diastereomeru při Asp), teoretický výtěžek 84 %.

Elementární analýza: C Η N O ^χ 41 57 S nalez. 65,38.

Η, N, C, 65,84,

Hmotnostní spektrometrie: M 747, M+l 748.

vyp pozor

Teplota tání: 101,6 °C (DSC).

^H NMR (S proti TMS, CDC1₃): 0,88, m (1H), 0,98, m (1H), 1,13 (2H), 1,23, m (6H), 1,4, m (1H), 1,62-1,76, m (8H), 1,86, qd (1H), 2,35, t (1H), 2,74, dd (2H), 3,25, dd (1H), 3,47, q (2H), 3,7, d (1H), 3,84, d (1H), 4,15, ds (2H), 4,5, qd (1H), 4,68, dt (1H), 5,07, d (1H), 5,14 bd (2H), 5,16, d (1H), 7,28-7,39, m (10H), 7,57, dd (1H).

¹³C NMR (í proti TMS, CDC1₃): [význačné píky] 66,93 (oba benzylové uhlíky), 127,78-128,64 (oba fenylové kruhy), 155,249, 170,00, 170,24, 171,69, 174,27, 175,21 (všechny karbonylové uhlíky).

Příklad 5

Příprava hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyk1ohexyla1an inamidu (Krok 5 schématu II)

Směs CBZ-PipBu.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂, formiatu amonného a 10% palladia na uhlíku ve směsi alkoholu a vody 20:1 [10:1 obj/hm proti CBZ-PipBu.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH_a] se připraví. Tato směs se zahřívá na 40 až 50 °C a míchá se tak dlouho, až HPLC ukazuje skončení reakce (1 až 2 h). Směs se ochladí na teplotu místnosti a zfiltruje pro odstranění katalyzátoru. Výsledný roztok se zahřívá na 40 až 50 °C a přidá se aceton (objem zhruba rovný objemu filtrovanému roztoku) a roztok se ponechá ochladit na • ·· ···· ·· 99 • · · 9 · «· 9 9 9 · 9

999 99 9 99·· • 9 ··· 9 · ·· ·· ·

999 999 9 · 9 ·

999 99 99 ···· · · ·· až 40 °C. Směs se naočkuje N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl )-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidem a při teplotě místnosti (několik hodin) krystalizuje hygroskopická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu.

Tuhá látka se oddělí filtraci pod vrstvou dusíku a promyje acetonem. Dále se tuhá látka vysuší za sníženého tlaku a analyzuje na obsah hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu (analýza vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii hm/hm). Výtěžek je obecně větší než 85 %, čistota vyšší než 95A %.

Při specifickém případu výše popsané přípravy s dodržením obecného způsobu kroku 5 a s použitím 5 g CBZ-PipBu.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ se získá 3,1 g hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu ve formě bílé tuhé látky (čistota 99,6A %) se stechiometrickým výtěžkem 89,4 %.

Ostatní sloučeniny připravené podle příkladů 1 až 5 výše, avšak s použitím příslušných výchozích materiálů zahrnují následující:

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-valin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-D-valin,

N-[N-[N-(3-piperid-4-yl)propanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-valin, • φ φ ·» φ φ φ φ · φ φφφφ φφ»» φφφ» φφφ φφ φ φφφφ φφφ φφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ

Ν-[Ν-[Ν-(5-piperid-4-yl)pentanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-valin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-a-cyklohexylflycin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-norleucin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-α-(2,2-dimethyl)prop-3-yl-glycin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-B-dekahydronafth-l-yl-alanin

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-α-(2-cyklohexylethyl)glycin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-fenylalanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-B-naft-l-yl-alanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-B-nafth-2-yl-alanin, ethylester Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl ]aspartyl]-L-B-cyklohexylalaninu,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-L-B-c i s-dekahydronaft-2-yl-alanin, • ·· ·♦ · · · · ·# ·· · t · * » · · · t « • · · · · · ···· • · ··· · · · · · · · • · * · · · ···· ··· *« *· ···· ·· «· kyselina Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-a-aminocyklohexankarboxylová

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cyklohexyl-D-alanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-dekahydronaft-l-yl-alanin, ethylamid Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl ]aspartyl]-β-cyklohexylalaninu,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cyklooktylalanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cyklohexylmethylalaninamid,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-adamant-l-yl-alanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-(1,2,3,4)-tetrahydronafth-5-yl-alanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-(4-cyklohexyl)cyklohexylalanin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cykloheptylalanin,

Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cyklooktylalaninamid, • · · · · ·· ·· ·· • · · · · ·· · · « · · • · · ·· · · · · · • · ··· · · < · · · · • · · · · · · · · · ··· ·« ·· ···· ·· ··

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-α-cyklohexylpropylglycin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-β-cyklooktylmethylalanin,

N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]aspartyl]-B-cyklopentylalanin a ethylester N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl ]aspartyl]-β-cyklohexylmethylalaninu.

Příklad 6

Příprava 4-N-CBZ-piperidonu

Směs 40 kg N-benzyloxykarbonyloxysukcinimidu a 26 kg (175 mol) 4-piperidon.HCI.H^O v 38,8 kg vody a 88 kg tetrahydrofuranu se míchá při 15 °C ± 5 °C do úplného rozpuštění (zhruba po dobu 15 min). NMM (22,8 kg) se přidá k míchané směsi (exotermní reakce) při udržování teploty při nebo pod 20 °C. Směs se míchá při 20 °C ± 5 °C po dobu 2,5 h a po této době ukazuje vysokovýkonná kapalinová chromatografie na ukončeni reakce. Směs se zředí 115,2 kg MTBE a 38,8 kg vody a míchá se při 20 °C ± 5 °C po dobu 5 min. Míchání se zastaví, vrstvy se ponechají oddělit a vodná (spodní) vrstva se odstraní do odpadu. Organická vrstva se promyje 2x 129,6 kg vody [míchejte po dobu 5 min, oddělte fáze, odstraňte do odpadu vodnou (spodní) fázi]. Organická vrstva se promyje 5,2 kg chloridu sodného v 46,8 kg vody [míchejte po dobu 5 min, oddělte fáze, odstraňte do odpadu vodnou (spodní) vrstvu]. Organická vrstva se zpracuje 11,5 kg síranu hořečnatého při míchání po dobu lha poté se směs zfiltruje. Reakční

nádoba se promyje 8 kg MTBE (zfiltruje, filtrát se spojí s hlavním filtrátem, celkový obsah vody filtrátu: 0,52 %). Objem směsi se sníží na polovinu destilací při sníženém tlaku při teplotě 30 °C. Vakuum se nahradí atmosférou vodíku a zbytek se ochladí na 20 °C (obsah vody zbytku v nádobě: 0,43 %). Zbytek se zředí 57,6 kg MTBE, poté se objem směsi opět sníží o polovinu destilací za sníženého tlaku při 30 ^CTC. Vakuum se nahradí atmosférou dusíku a směs se ochladí na 20 °C (obsah vody zbytku v nádobě: 0,25 %). To se opakuje ještě 5x. Konečný zbytek v nádobě se zředí 28,8 kg MTBE a míchá po dobu 5 min a poté se zjišťuje obsah vody a obsah 4-N-CBZ-piperidonu (voda: 0,05 %, 4-N-CBZ-piperidon rozbor hm/hm: 22,66 hmotnostních procent, 35,36 kg, 155 mol, stechiometrický výtěžek 88,6 %).

Příklad 7

Příprava PipBu

Za podmínek promývání dusíkem a míchání se připraví roztok 53,5 kg 3-karboxypropyltrifenylfosfoniumbromidu v 230,1 kg 1,2-dimethoxyethanu. Během 35 min se přidává kalium-terc.butoxid/tetrahydrofuran (20 hmotnostních procent, 141,8 kg roztoku) při teplotě 24 až 28 °C. Směs se míchá při této teplotě po dobu 0,5 h a po této době ukazuje vysokovýkonná kapalinová chromatografie na ukončení reakce. Míchaná směs se ochladí na 10 °C ± 2 °C, poté se ke směsi přidá 96,45 kg (titr: 1,15 M) 4-CBZ-piperidonu v MTBE během 40 min, takže teplota směsi zůstává při 12 °C ± 2 °C. Směs se míchá při této teplotě po dobu 10 min, poté se zahřívá na 20 °C + 2 °C a míchá při této teplotě po dobu 2 h. K míchané směsi se přidá roztok 22,5 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové ve 245,6 kg vody tak, aby se směs udržovala

• 9 9 9	99 ♦	• 9 9	9	9 9 9	9	9 9 9	9	9	9 9 9
• 9	9	9	9		9	9	9	•	9
									1
• 9	9	9	9	9		9	9	9	«
9 9 9	9 9	9 9		9 9 9	9	99			9 9

při teplotě 20 °C ± 2 °C, konečné pH je 0,5. Směs se extrahuje za míchání 214,0 kg methyl-terc.butyletheru. Míchání se zastaví, vyčká se oddělení fází a vodná vrstva (spodní) se odstraní do odpadu. Organická fáze se promyje 133,75 kg vody [míchejte po dobu 5 min, oddělte, odstraňte do odpadu vodnou (spodní) vrstvu], poté 10,7 kg 50% roztoku hydroxidu sodného ve 126,8 kg vody [míchejte po dobu 10 min, oddělte vrstvy, odstraňte do odpadu organickou (svrchní) vrstvu]. Vodná vrstva se promyje 2x 123,05 kg ethylacetátu [míchejte po dobu 5 min, oddělte vrstvy, odstraňte do odpadu organickou (svrchní) vrstvu]. K míchané vodné vrstvě se přidá 13,1 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové do dosažení pH 2,5 až 3,5 (konečné pH 2,82) a směs se extrahuje 123,05 kg ethylacetátu [míchejte po dobu 5 min, oddělte vrstvy, odstraňte do odpadu vodnou (spodní) vrstvu). Ethylacetatový roztok se promyje 133,75 kg vody [míchejte po dobu 5 min, oddělte vrstvy, odstraňte do odpadu vodnou (spodní) vrstvu], poté analyzujte (hm/hm) na obsah CBZ-PipBuen [celková hmotnost: 194,86 kg, 17,05 % CBZ-PipBuen [(33,22 kg, 108 mol) stechiometrický výtěžek 87,9 %].

Ethylacetatový roztok PipBuen spolu s 6,6 kg 5% palladia na uhlíku (50 hmotnostních procent vody) se naplní za míchání do tlakové nádoby z nerezivějící oceli, poté se směs zahřeje na 55 °C ± 2 °C. Přidá se formiat draselný (38,2 kg) rozpuštěný v 66,4 kg vody tak, aby teplota reakční směsi zůstávala na 55 °C ± 2 °C (zhruba v průběhu 30 min). Směs se míchá při 55 °C ± 2 °C po dobu 2 h, což je doba, po které je reakce ukončena (zjištění na základě vysokovýkonné kapalinové chromatografie). Do reakční nádoby se přidá 6,6 kg celitu a 33,2 kg vody, směs se míchá a poté zfiltruje. Reakční nádoba se promyje 33,2 kg vody (zfiltruje a přidá se do hlavního filtrátu). Filtrát se umístí do nové nádoby,

9 9 9 9 9 · 9 • 9 9 9 9 9 9 ·· 9999 99 99 ochladí na 20 až 25 °C, vyčká se do oddělení vrstev a organická vrstva se odstraní do odpadu. Vodná vrstva se okyselí 52,1 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové na pH 2 až 3 (konečné pH 2,82), poté se extrahuje 4x 129,5 kg methylenchloridu [míchejte po dobu 5 min, oddělte vrstvy, odstraňte do odpadu organickou (spodní) vrstvu]. Vodná fáze se upraví na pH 6,1 přídavkem za míchání 17,85 kg 50% vodného hydroxidu sodného. Směs se zfiltruje s obdržením 224 kg roztoku obsahujícího 17,6 kg (103 mol) 4-(3¹-karboxypropyl)piperidinu.

Příklad 8

Příprava CBZ-PipBu

224 kg roztoku 4-(3'-karboxypropyl)piperidinu ve vodném hydroxidu sodném se spojí s 55,3 kg tetrahydrofuranu a směs se ochladí za míchání na 8 °C ± 2 °C. Přidá se NMM (20,9 kg) při udržování teploty menší než 10 °C. Po přidání se teplota upraví na 8 °C ± 2 °C, poté se přidá 25,7 kg l-(benzyloxokarbonyl)sukcinimidu rozpuštěného ve 49,8 kg tetrahydrofuranu v průběhu 1 h při udržování teploty na méně než 15 °C. Reakční směs se ukončí (kontrola analytickou vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií) po 3 h při 10 až 15 °C. Přidá se koncentrovaná vodná kyselina chlorovodíková (29,9 kg) pro úpravu pH na 2,5 až 3,5 (konečné pH 3,3) a poté se přidá 61,4 kg MTBE a směs se míchá po dobu 5 min. Míchání se ukončí, vyčká se do oddělení vrstev a vodná (spodní) vrstva se oddělí (odpad). Vrstva MTBE se promyje třemi podíly 83,1 kg vody (10 min, poté 5 min a 5 min míchání), vodná vrstva se ponechá oddělit a odstraní se (odpad) v každém případě. Roztok 8,3 kg 50% vodného hydroxidu sodného v 95,7 kg vody se přidá bez míchání, po skončení přidává» ·· · 9 • •9 ·· • 9 ···· ní se směs smíchá po dobu zhruba 5 min. Míchání se ukončí, vyčká se do oddělení fází a organická (vrchní) fáze se oddělí a odloží do odpadu. Vodná vrstva se vrátí do reakční nádoby a extrahuje 2x 38,4 kg methyl-terc.butyletheru [míchání 5 min, oddělení vrstev, odstranění organické (vrchní) vrstvy do odpadu]. Tento krok se opakuje s použitím 18,5 kg methyl-terč.butyletheru. Vodná vrstva se vrátí do reakční nádoby, okyselí na pH 2,5 až 3,5 (konečné pH 3,37) 9,9 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové. Směs se extrahuje 76,4 kg methyl-terč.butyletheru [míchání 5 min, oddělení vrstev, spodní (vodná) vrstva se oddělí do odpadu]. Organická vrstva se promyje (5 min míchání) roztokem 1,1 kg hydrogenuhličitanů sodného ve 12,4 kg vody [míchání 5 min, oddělení vrstev, odstranění vodné (spodní) vrstvy do odpadu], poté 41,5 kg vody (míchání 5 min, oddělení vrstev, odstranění vodné (spodní) vrstvy do odpadu]. Reakční nádoba se umístí pod snížený tlak a těkavá rozpouštědla se odstraňují při 55 °C do skončení proudu destilátu. Přidá se toluen (32,4 kg) a směs se destiluje za atmosferického tlaku do ukončení proudu destilátu, zatímco teplota vsádky stoupá na 90 až 95 °C. Poté se směs ochladí na 30 až 35 °C, do reakční nádoby se přidá heptan (56,85 kg) (dvě fáze), směs se zahřívá na 90 až 95 °C (jedna fáze) potom se znovu ochladí na 38 až 42 °C. Naočkují se krystaly CBZ-PipBu a produkt krystalizuje ze směsi v průběhu 1 h. Pevná látka se oddělí filtrací a promyje 19,35 kg směsi toluen/heptan 1:2 a poté 33,4 kg heptanu. Filtrační koláč se vysuší ve vakuu při 40 °C (do ztráty sušením 0,13 %) s obdržením 22,4 kg (72,96 mol, stechiometrický výtěžek z 4-piperidonu 42 %) CBZ-PipBu.

Příklad 9

Příprava CBZ-PipBuenu

K suspenzi 82 g 3-karboxypropyl-trifenylfosfoniumbromidu ve 407 ml 1,2-diethoxyethanu se při 14 °C přidává v průběhu 25 min 220 g 20% (hm) kalium terc.butoxid v tetrahydrofuranu při udržování teploty reakční směsi 24 až 28 °C. Směs se míchá po dobu 1 h, ochladí na 10 °C, poté se přidává v průběhu 30 min roztok 52,5 g 4-N-CBZ-piperidonu ve 246 ml terc.butyl-methyletheru při pokračujícím chlazení. Po skončení přidávání se směs při teplotě 12 °C po dobu 10 min, poté se ohřeje na 20 “C a míchá se po dobu dalších 30 min. Reakční směs se zpracuje 410 ml 1 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové po dobu 10 min, zředí 328 ml terc.butyl-methyletheru a poté se oddělí fáze. Organická fáze se promyje 205 ml vody, poté 210 ml 1 N vodného roztoku hydroxidu sodného. Vrstva hydroxidu sodného, která obsahuje produkt, se sbírá odděleně, promyje 3 podíly po 189 g ethylacetátu, okyselí na pH 3,48 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a poté se extrahuje 189 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva se oddělí, promyje 211 ml vody a poté se suší po dobu 30 min 10 g síranu horečnatého, zfiltruje a odpaří ve vakuu. Olejovitý zbytek (50,7 g) se krystalizuje ze směsi toluen/heptan s obdržením celkového množství 29,46 g CBZ-PipBuenu (výtěžek 50,9 %, čistota zhruba 95A %).

Hmotnostní spektrometrie: M 303, M+l 304.

vyp ^XH NMR: (S proti TMS, CDC1₃) 2,2, t (2H), 2,25, t (2H), 2,35, m (4H), 3,45, m (4H), 5,15, s (2H), 5,2, m (1H), 7,33, 2 (5H).

^X3C NMR (6 proti TMS, CDCl_a) 22,43, 28,2, 34,26,

35,66, 44,88, 45,74, 67,20, 122,02, 127,83, 127,95, 128,45, 128,69, 128,90, 136,17, 136,72, 155,34, 178,39.

• ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · * · · • · · ·· · · · · · • · · · · · ···· ··· ·· «* ···« ·* ··

Příklad 10

Příprava CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH^ (Alternativní krok 4 schématu II)

CBZ-PipBuen (70 g, 0,23 mol) a dimethylformamid (230 ml) se přidá do plášťové baňky o obsahu 1 litr a míchá se při chlazení na 0 °C, poté se najednou přidá TBTU (74,9 g, 0,23 mol). Teplota se udržuje na 0 °C a započne přidávání diisopropylethylaminu (61,9 g, 0,61 mol). Po 45 min se přidá TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (138,7 g, 0,24 mol) ve formě roztoku v dimethylformamidu (230 ml). pH se upraví na 7 až 8 přídavkem diisopropylethylaminu (45 ml) a směs se ponechá ohřát na teplotu okolí. Po 2 h je reakce ukončena (ověřeno analýzou pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie). Směs se nalije do vody (2,5 litru) a extrahuje ethylacetatem (1 litr). Vodná fáze se zpětně extrahuje ethylacetatem (0,3 litru). Organické vrstvy se spojí, promyjí vodným roztokem kyseliny citrónové (5 hmotnostních procent, 2x 1 litr), promyjí vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5 hmotnostních procent, 2x 1 litr) a promyjí vodou (2 litry) . Ethylacetatová vrstva se přenese do baňky o obsahu 2 litry a přidává se heptan (500 ml) při míchání pro ovlivnění krystalizace. Pevná látka se získá odsáváním na Buchnerově nálevce, promyje směsí ethylacetat/heptan (2:1 obj/obj, 1 litr) a vysuší do konstantní hmotnosti s obdržením CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (143,2 g,

0,19 mol, výtěžek 83 %).

Elementární analýza: C Η N 0 , ·* 4 X 55 5 *7 nalez. 65,53, Η, N.

C: vypočteno 66,02 • ·> ·· ·· ·· ·· • · · · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 « · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 ·· «··· ·· 99

Hmotnostní spektrometrie: M 745,91, M+l 746.

^VYP pozor· ^LH NMR (S proti TMS, CDC1 ): 0,86, qd (1H), 0,98, qd

(1H) ,	1,16,	t	(2H), 1,24, dt	(6H),	1,37,	m (1H),
m (4H)	, 1,86		qd (1H), 2,2 bd (4H)	, 2,35	, m (1H)
(2H) ,	2,74,	dd	: (1H), 3,07, m	(4H),	3,52,	d (1H),
(1H),	4,12,	q	(1H), 4,49, qd	(1H),	4,68,	dt (1H)
(1H),	5,14,	s	(1H), 5,16, d	(1H) ,	5,22,	t (2H),
(1H),	7,28,	d	(1H), 7,26, s	(5H) ,	7,35,	s (5H),
(1H).	^X3C NMR (S proti TMS,	CDC1 3	): 14,	15, 22,6
25,61,	26,03	r	26,45, 28,20,	31,71,	32,89	, 33,80,
34,00,	35,63	r	38,37, 44,79,	45,13,	45,65	, 50,23,
60,40,	66,87	f	67,06, 76,50,	77,13,	77,77	, 122,46

7,56, d

127,80-128,60, 135,15, 155,19, 170,11, 170,20, 171,61, 173,76, 175,35.

Příklady 11

Příprava hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu (Alternativní krok 5 schématu II)

CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (140 g, 0,19 mol), formiat amonný (61 g, 0,96 mol) a 10% palladium na uhlíku (50 % vlhkosti, typ degussa, 28 g) se přidá do plášťové baňky o obsahu 5 litrů. Přidá se ethylalkohol (200°, 1260 ml), isopropanol (70 ml) a voda (deionizovaná, 70 g). Tato směs se zahřívá na 40 až 50 °C a míchá se • 9

99 9· 99 9«

999 9 9 99 9 9 99 ·

999 99 9 9999

999 9 9 99 99 9

999 999 999· • 99 99 ·· 9999 99 VI tak dlouho, až vysokovýkonná kapalinová chromatografie ukazuje na ukončení reakce (5 h). Směs se ochladí na teplotu místnosti a zfiltruje pro odstraněni katalyzátoru. Výsledný roztok se zahřívá na 40 až 50 °C a přidá se aceton (zhruba stejný objem proti filtrovanému roztoku) a roztok se ponechá ochladit na 35 až 40 °C. Směs se naočkuje N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJ — (L)-aspartyl] - (L)-β-cyklohexylalaninamidem a z ní krystalizuje hygroskopická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklo- hexylalaninamidu při ochlazení na teplotu místnosti (několik h). Pevná látka se oddělí sáním na Buchnerově nálevce pod vrstvou dusíku, koláč se promyje acetonem a vysuší na vzduchu do konstantní hmotnosti s obdržením N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-Ν-ethylglycyl ]-(L) -aspartyl ]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu (84,3 g,

0,16 mol, výtěžek 84,8 %, větší než 95A %).

Příklad 12

Zřetězená příprava TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (Alternativní kroky 1 až 3 schématu II)

Baňka o obsahu 500 ml s připojeným čidlem teploty se naplní BOC-N(Et)-Gly (20,3 g, 0,1 mol), N-hydroxysukcinimidem (11,5 g, 0,1 mol) a dichlormethanem (200 ml). Směs se míchá při mírné rychlosti a do výsledného roztoku se přidá dicyklohexylkarbodiimid (20,6 g, 0,1 mol) v jednom podílu ve formě tuhé látky. Tento roztok se míchá po dobu 1 h, přičemž se zaznamenává mírný exotermní průběh (teplota vzrůstá z 20 ^OC na 28 °C) a vysráží se DCU. Výsledná suspenze se filtruje ve vakuu s použitím Buchnerovy nálevky a filtračního papíru Whatman 1. Koláč se promyje dichlormethanem (2 x 25 ml).

«· ·

Filtráty se vrátí do původní baňky o obsahu 500 ml a poté se postupně přidává (L)Asp(OBzl) (22,3 g, 0,1 mol), NMM (33,8 ml, 0,3 mol) a dimethylformamid (80 g, 1,01 mol). Po míchání po dobu 2 h při teplotě místnosti je vytváření BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl) ukončeno (sledování pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie). Reakční směs se vylije do extrakční nálevky obsahující ledovou vodu (100 ml) Směs se okyselí kyselinou chlorovodíkovou (36%, 25 ml) do dosažení pH 1. Vrstvy se rozdělí a dichlormethanová vrstva se promyje ledovou vodou (100 ml) a fáze se rozdělí (pH vodné fáze 3 až 4). Dichlormethanová vrstva se vrátí do původní baňky o obsahu 500 ml, která se postupně naplní NH₂-(L)-Cha-NH₂(17 g, 0,1 mol), N-hydroxysukcinimidem (11,5 g, 0,1 mol) a dicyklohexylkarbodiimidem (20,6 g, 0,1 mol) v jednom podílu, každá látka v tuhé formě. Po míchání po dobu 2 h při teplotě místnosti je vytváření BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ ukončeno (sledování pomocí vysokovýkonné kapalinové chromatografie) a DCU se odfiltruje ve vakuu s použitím Buchnerovy nálevky s filtračním papírem Whatman 1. Filtrační koláč se promyje dichlormethanem (2 x 25 ml). Filtrát se přenese do extrakční nálevky a promyje deionizovanou vodou (200 ml) obsahující N-methylmorfolin (15 ml, pH 8 až 9). Fáze se rozdělí a dichlormethanová vrstva se opět promyje vodou (deionizovaná, 2 x 150 ml). Dichlormethanová fáze se promyje 150 ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové (pH 1). Fáze se rozdělí a dichlormethanová vrstva se promyje deionizovanou vodou (200 ml, pH 3). Dichlormethanový roztok BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ se vrátí do čisté baňky o obsahu 500 ml a poté se přidá kyselina trifluoroctová (100 ml). Po míchání po dobu 2 h při teplotě místnosti je vytváření TFA.HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ ukončeno (sledování vysokovýkovýkonnou kapalinovou chromatografii). Reakční směs se destiluje ve vakuu pro odstraněni dichlor• «Ε • · methanu a většiny kyseliny trifluoroctové. Potom se přidá MTBE (500 ml) a směs se naočkuje pro uskutečnění krystalizace produktu. Směs se filtruje ve vakuu pomocí Buchnerovy nálevky s filtračním papírem Whatman 1. Filtrační koláč se promyje MTBE (2 x 25 ml) a vysuší na vzduchu s obdržením TFA.HN(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ (46,8 g, výtěžek 81,5 %) ve formě bílé tuhé látky (čistota >97A %, <0,2A % diastereomeru D-Asp).

Příklad 13

Příprava nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu

Způsob A

Statická konverze

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu (7,45 kg) se mele v kladivovém mlýnu. Výsledná tuhá látka, 7,35 kg se umístí do misky sušárny z nerezavějící oceli (90 x 28 cm) a ta se zakryje perforovanou hliníkovou fólií. Miska se potom uzavře ve vlhkostní komoře (LUNAIRE Humidity Cabinet model, č. modelu CEO 941W-3) a komora se udržuje uzavřená v průběhu konverzního procesu kromě odebírání vzorků pro analýzu. Komora se nastaví na 40 % relativní vlhkosti a 60 °C a udržuje se na těchto hodnotách po dobu 1 h. Poté se komora upraví na 80 % relativní vlhkosti a 60 °C a udržuje se při těchto hodnotách po dobu 12 h. Odebere se vzorek po 18 h při 80 % při relativní vlhkosti a 60 °C a ověří se rentgenovou práškovou difrakční

4 · ·	• · »4	4 4	• 9
• 4 0	4 4 4 4	4 4	4 ·
4 · 4	4 4 «	« 4	4 ·

• · ·	4 4 4	4 4	4 4
4 4 44	4 4 4444	<4	4 4

analýzou pro zjištění konverze nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu. Vlhkostní komora se znovu uzavře a nastaví na 40 % relativní vlhkosti a 60 °C a udržuje se na těchto hodnotách po dobu 2 h. Komora se znovu nastaví na podmínky okolí, poté se miska vyjme z komory a nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu se obdrží v množství 7,2 kg (výtěžek 96,6 %). Ověření konverze se provede na základě rentgenového práškového difrakčního grafu (obr. 1). Výsledky rentgenové práškové difrakce jsou též v tabulce jako hodnoty vzrůstajícího úhlu difrakce (2Θ), odpovídající interplanární vzdálenosti krystalu (d) v jednotkách nm, impulsů za s (Cps) a relativní intenzity vrcholu (%) (tabulka 1).

• * • 4 *

• 44

- 71 4 4 4 ι ::

4 4 44 44

I

Tabulka 1

-N-	2Θ	---d---	---Cps---	— ·—’ ··“ ““ —“
1	5,065	1,74314	86,00	5,82
2	6,323	1,39672	248,00	16,78
3	7,518	1,17489	221,00	14,95
4	8,163	1,08222	496,00	33,56
5	8,780	1,00633	155,00	10,49
6	10,383	0,85125	218,00	14,75
7	11,351	0,77886	112,00	7,58
8	12,596	0,70218	999,00	67,59
9	13,858	0,63852	316,00	21,38
10	15,191	0,58274	1338,00	90,53
11	16,476	0,53759	481,00	32,54
12	16,745	0,52901	556,00	37,62
13	17,980	0,49294	679,00	45,95
14	18,572	0,47735	1079,00	73,00
15	18,799	0,47165	1230,00	83,22
16	19,147	0,46315	1229,00	83,15
17	19,619	0,45211	1380,00	93,37
18	20,200	0,43924	1246,00	84,30
19	20,466	0,43360	1478,00	100,00
20	20,870	0,42528	1088,00	73,61
21	21,625	0,41061	584,00	39,51
22	22,088	0,40210	891,00	60,28
23	22,840	0,38903	613,00	41,47
24	23,947	0,37129	597,00	40,39
25	24,569	0,36203	680,00	46,01
26	25,608	0,34757	506,00	34,24
27	27,015	0,32978	1100,00	74,42
28	27,837	0,32022	420,00	28,42
29	27,967	0,31877	400,00	27,06
30	29,255	0,30502	536,00	36,27
31	29,689	0,30066	603,00	40,80
32	30,665	0,29130	518,00	35,05
33	31,318	0,28538	451,00	30,51
34	31,894	0,28036	533,00	36,06
35	33,370	0,26829	518,00	35,05
36	33,562	0,26679	552,00	37,35
37	33,919	0,26407	581,00	39,31
38	34,840	0,25730	561,00	37,96
39	35,789	0,25069	559,00	37,82
40	35,940	0,24967	560,00	37,89
41	36,780	0,24416	740,00	50,07
42	37,042	0,24249	736,00	49,80
43	37,959	0,23684	683,00	46,21
44	39,017	0,23066	643,00	43,50

• · « • *

Způsob Β

Dynamické podmínky

a. Konverze formy

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu (50 g) se umístí do kalibrovaného válce 400 ml (výška náplně 6 cm) na kruhový držák vybavený mechanickou míchačkou. Přístroj se umístí do komory s řízenou vlhkostí (LUNAIRE Humidity Cabinet, model č. CEO 941W-3). Míchání se nastaví na frekvenci otáčení 275 min^-1a teplota a relativní vlhkost se upraví během 30 min na 60 °C a 40 %. Sloučenina se udržuje za těchto podmínek po dobu 1 h, poté se podmínky změní v průběhu 45 min na 80 % relativní vlhkosti/60 °C. Sloučenina se poté udržuje při těchto podmínkách po dobu 16 h před novým nastavením komory na 40 % relativní vlhkosti/60 °C a při těchto podmínkách se komora udržuje po dobu 3,25 h. Poté se umožní návrat sloučeniny k podmínkám okolí (výška náplně 4 cm), náplň se poté vyjme z válce s obdržením nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl ]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu (výtěžek >95 %). Ověření konverze se provede rentgenovou práškovou difrakčni analýzou (obr. 2). Výsledky rentgenové práškové difrakce jsou též v tabulce jako hodnoty rostoucího úhlu difrakce (2Θ), odpovídající interplanární vzdálenosti krystalu v jednotkách nm, četnosti impulsů za s (Cps) a relativní intenzity vrcholu (%) (tabulka 2) .

i · · h e>

• « · · « I < · · « · » · • a · 9 · · •99 99 99 9999

Tabulka 2

-N-	2Θ	____d	---Cps---	---%---
1	5,186	1,70268	196,00	8,43
2	6,371	1,38615	722,00	31,07
3	7,570	1,16689	516,00	22,20
4	8,232	1,07323	1094,00	47,07
5	8,817	1,00206	257,00	11,06
6	10,428	0,84761	365,00	15,71
7	11,377	0,77714	129,00	5,55
8	11,600	0,76223	117,00	5,55
9	12,667	0,69828	1805,00	77,67
10	13,913	0,63599	551,00	23,71
11	14,398	0,61468	178,00	7,66
12	15,226	0,5844	2285,00	98,32
13	16,538	0,53557	861,00	37,05
14	16,773	0,52814	929,00	39,97
15	18,019	0,49190	1132,00	48,71
16	18,672	0,47483	1871,00	80,51
17	18,815	0,47125	2052,00	88,30
18	19,204	0,46178	2071,00	89,11
19	19,654	0,45132	2226,00	95,78
20	20,237	0,43845	1939,00	83,43
21	20,523	0,43240	2324,00	100,00
22	20,934	0,42400	1656,00	71,26
23	21,691	0,40938	923,00	39,72
24	22,143	0,40112	1411,00	60,71
25	22,910	0,38786	994,00	42,77
26	24,007	0,37037	964,00	41,48
27	24,642	0,36097	991,00	42,64
28	25,642	0,36097	991,00	42,64
29	27,070	0,32913	1687,00	72,59
30	27,855	0,32002	688,00	29,60
31	29,497	0,30258	843,00	36,27
32	29,497	0,30013	878,00	37,78
33	30,751	0,29051	809,00	34,81
34	31,916	0,28017	821,00	35,33
35	33,982	0,26360	882,00	37,95
36	35,200	0,25475	865,00	37,22
37	36,001	0,24926	841,00	36,19
38	36,927	0,24322	1106,00	47,59
39	38,389	0,23429	968,00	41,65

b. Konverze formy

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu (370 g) se naplní do rotační odpařovací baňky o obsahu 2 litry. Baňka se umístí na rotační odparku (Heidolph UV 2002) a ponoří do lázně (Heidolph MR 2002) předehřáté na 58 °C. Aparatura se umístí do vakua 6 kPa (60 mbar) s využitím vakuového čerpadla (Divatrion DVÍ), potom se vakuum přeruší kontrolovaným způsobem pro umožněni vytvoření vlhké atmosféry do oddělené zahřívané baňky s obsahem vody. Spuštění vlhké atmosféry se kontroluje aparaturou pro kontrolu vlhkosti (Vausalo Humiditique and Temperature Traumettor) pro obdržení relativní vlhkosti v aparatuře 79 % [13 až 18 kPa (130 až 180 mbar) vnitřního tlaku]. Rotační odpařovací nádoba se poté otáčí při rychlosti otáčení 145 až 160 min^-1 po dobu 5 h při udržování lázně zhruba na 60 °C a relativní vlhkosti v nádobě 71 až 79 %. Poté se vakuum přeruší s vpuštěním dusíku, nádoba a její obsah se ponechá ochladit na teplotu okolí a produkt se odebere s obdržením nehygroskopické krystalické formy Ν-[Ν-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl ]—(L)-β-cyklohexylalaninamidu. Druhý podíl 317 g hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butano-yl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu se zpracuje podobně s obdržením nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu. Ověření konverze se provede rentgenovou práškovou difrakční analýzou (obr. 3). Tyto dva podíly spolu poskytují 667 g nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu (celkový výtěžek 97 %). Ověření konverze se provede rentge- 75

	• ·	• ·	··	« ·
• *» ·	•	•	• *	• ·	•	•
• · ·	•	•	•	• ·	•	•
						•
• · ·	•	•	•	• ·	•	•
« · · ·	•	•	·♦. ··	« ·	• 4

novou práškovou difrakční analýzou (obr. 3). Výsledky rentgenové práškové difrakce jsou též v tabulce jako hodnoty vzrůstajícího úhlu difrakce (2Θ), odpovídající interplanární vzdálenosti krystalu (d) v nanometrech (nm), četnosti impulsů za s (Cps) a relativní intenzity vrcholu (%) (tabulka 3).

• ·

Tabulka 3

-N-	2Θ	---a—	---Cps---	W. — —
1	5,124	1,72309	180,00	10,17
2	6,328	1,39565	408,00	23,05
3	7,574	1,16623	305,00	17,23
4	8,191	1,07851	556,00	31,41
5	8,797	1,00432	166,00	9,38
6	10,398	0,85004	244,00	13,79
7	12,628	0,70040	1198,00	67,68
8	13,871	0,63791	353,00	19,94
9	15,218	0,58172	1543,00	87,18
10	15,723	0,56317	187,00	10,56
11	16,538	0,53558	589,00	33,28
12	16,751	0,52882	621,00	35,08
13	18,024	0,49175	869,00	49,10
14	18,640	0,47563	1156,00	65,31
15	18,809	0,47141	1241,00	70,11
16	19,191	0,46210	1521,00	85,93
17	19,659	0,45120	1413,00	79,83
18	20,865	0,44064	1303,00	73,62
19	20,495	0,43299	1770,00	100,00
20	20,865	0,42539	1120,00	63,28
21	21,616	0,41077	683,00	38,59
22	22,113	0,40166	919,00	51,92
23	22,950	0,38719	697,00	39,38
24	24,117	0,36871	659,00	37,23
25	24,618	0,36132	716,00	40,45
26	25,644	0,34709	662,00	37,40
27	26,297	0,33862	486,00	27,46
28	27,052	0,32934	1270,00	71,75
29	27,960	0,31885	518,00	29,27
30	29,640	0,30115	705,00	39,38
31	30,744	0,29058	695,00	39,27
32	33,465	0,26755	697,00	39,38
33	33,840	0,26467	764,00	43,16
34	35,812	0,25053	736,00	41,58
35	36,811	0,24396	858,00	48,47
36	37,076	0,24228	919,00	51,92
37	38,185	0,23549	870	49,15
38	39,622	0,22728	882,00	49,83

• 9 · · · · ««

9 9 9 9 ··· • · · 9 9 9 · • 9 9 r · 99 ·

9 9 9 9 9 *

9999 99 99

Přiklad 14

Rentgenové práškové difrakční grafy vzorku N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu v jeho hygroskopické krystalické formě a po převedení na nehygroskopickou krystalickou formu

Vzorek hygroskopického krystalického N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu se připraví podle příkladu 5 nebo 11 a převede na odpovídající nehygroskopickou krystalickou formu podle způsobu příkladu 13. Grafy rentgenové práškové difrakce hygroskopické krystalické formy a nehygroskopické krystalické formy jsou na obr. 4 a 5. Výsledky rentgenové difrakce hygroskopické krystalické formy a nehygroskopické krystalické formy jsou též v tabulce jako hodnoty rostoucího úhlu difrakce (2Θ), odpovídající interplanární vzdálenosti krystalu (d) v nanometrech (nm), četnosti impulsů za s (Cps) a relativní intenzity vrcholu (%) v tabulkách 4 respektive 5.

A A Α· AA «Α • · « A A A A • · AAAA A * A A A A A • · A * A A

A* AAAA AA AA

Tabulka 4

-N- 2Θ

-d--- ---Cps---

1	5,073	1,74037
2	6,451	1,36905
3	7,837	1,12712
4	8,491	1,04049
5	9,699	0,91119
6	10,488	0,84278
7	11,570	0,76423
8	12,550	0,70474
9	13,576	0,65168
10	15,327	0,57763
11	15,790	0,56080
12	16,179	0,54739
13	16,770	0,52824
14	17,085	0,51856
15	17,750	0,49927
16	18,151	0,48835
17	18,504	0,47909
18	19,323	0,45897
19	19,714	0,44996
20	20,545	0,43194
21	21,388	0,41510
22	22,381	0,39691
23	22,870	0,38852
24	23,640	0,37604
25	23,841	0,37292
26	24,048	0,36976
27	24,746	0,35949
28	25,200	0,35311
29	25,792	0,34513
30	26,266	0,33901
31	26,959	0,33045
32	27,426	0,32494
33	27,967	0,31876
34	29,020	0,30744
35	29,922	0,29837
36	30,970	0,28851
37	31,552	0,28332
38	33,338	0,26854
39	34,838	0,25731
40	35,873	0,25012
41	36,107	0,24855
42	37,162	0,24174
43	38,509	0,23359
44	39,701	0,22684

1487,00	86,50
447,00	26,00
411,00	23,91
602,00	35,02
93,00	5,41
421,00	24,49
92,00	5,35
411,00	23,91
760,00	44,21
606,00	35,25
456,00	26,53
346,00	20,13
938,00	54,57
685,00	39,85
924,00	53,75
741,00	43,11
593,00	34,50
930,00	54,10
792,00	46,07
1719,00	100,00
897,00	52,18
373,00	21,70
258,00	15,01
563,00	32,75
680,00	39,56
623,00	36,24
338,00	19,66
366,00	21,29
590,00	34,32
731,00	42,52
555,00	32,29
769,00	44,74
528,00	30,72
771,00	44,85
491,00	28,56
384,00	22,34
510,00	29,67
627,00	36,47
520,00	30,25
653,00	37,99
639,00	37,17
683,00	39,73
775,00	45,08
784,00	45,61

♦

• · »· * · · ·

9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 · 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 9 99

Tabulka 5

-N-	2Θ	---d—	---Cps---	---%---
1	5,152	1,71371	123,00	7,34
2	6,386	1,38287	483,00	28,84
3	7,580	1,16540	389,00	23,22
4	8,225	1,07410	752,00	44,90
5	8,801	1,00390	180,00	10,75
6	10,408	0,84928	276,00	16,48
7	12,660	0,69863	1399,00	83,52
8	13,914	0,63594	391,00	23,34
9	15,251	0,58047	1675,00	100,00
10	16,541	0,53548	608,00	36,30
11	16,771	0,52818	652,00	38,93
12	18,047	0,49112	775,00	46,27
13	18,676	0,47472	1078,00	64,36
14	18,902	0,46910	1099,00	65,61
15	19,182	0,46231	1151,00	68,72
16	19,697	0,45035	1164,00	69,49
17	20,240	0,43838	1049,00	62,63
18	20,568	0,43147	1403,00	83,76
19	20,933	0,42403	1024,00	61,13
20	21,684	0,40951	569,00	33,97
21	22,122	0,40150	746,00	44,54
22	22,970	0,38685	564,00	33,67
23	24,080	0,36927	546,00	32,60
24	24,218	0,36720	556,00	33,19
25	24,694	0,36023	618,00	36,90
26	25,680	0,34662	510,00	30,45
27	26,400	0,33732	403,00	24,06
28	27,105	0,32871	1093,00	65,25
29	27,929	0,31920	450,00	26,87
30	29,360	0,30395	555,00	33,13
31	29,724	0,30031	595,00	35,52
32	30,340	0,29435	429,00	25,61
33	30,693	0,29105	552,00	32,96
34	31,353	0,28507	476,00	28,42
35	31,822	0,28098	531,00	31,70
36	32,006	0,27940	545,00	32,54
37	32,885	0,27213	485,00	28,96
38	33,508	0,26722	547,00	32,66
39	34,040	0,26316	606,00	36,18
40	34,839	0,25730	580,00	34,63
41	35,998	0,24928	596,00	35,58
42	36,680	0,24480	629,00	37,55
43	36,948	0,24309	727,00	43,40
44	37,197	0,24152	703,00	41,97
45	39,602	0,22739	697,00	41,61

Příklad 15

Isotermní mikrokalorimetrické experimenty na hygroskopické a nehygroskopické krystalické formě N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu

Isotermní mikrokalorimetrické experimenty na hygroskopickém a nehygroskopickém N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-B-cyklohexylalaninamidu se provádějí s použitím termometrického monitoru tepelné aktivity (TAM). Konverze různých krystalických forem v pevném stavu se studují expozicí těchto forem různým vlhkostem nebo parám rozpouštědla při různých teplotách. Používají se nasycené roztoky následujících solí pro obdržení různých vlhkostí: chlorid draselný (relativní vlhkost 80 %), chlorid sodný (relativní vlhkost 75 %) a bromid sodný (relativní vlhkost 65 %). Množství těchto forem zhruba 100 mg se naváží do skleněné ampule TAM a do této ampule se umístí mikrohygrostat obsahující roztok nasycené soli (přebytek tuhé látky) nebo organické rozpouštědlo. Ampule se uzavře, umožní se vyrovnání na teplotu experimentu a ponoří se do polohy měření v TAM. Na referenční straně se umístí stejný systém obsahující promytý mořský písek místo testovaného vzorku. Tepelný výkon (μϊΐ) se měří jako funkce času (obr. 6 až 8).

Příklad 16

Isotermy sorpce vlhkosti hygroskopické a nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu ·· » · · ♦ · · • · · · • ♦ · • ·

99

9 9 · • 9 9 9

9 9 9

Isotermy sorpce vlhkosti hygroskopické a nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperid-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspartyl] - (L)-B-cyklohexylalaninamidu se obdrží na vahách pro stanovení vlhkosti VTI MB 300G. Pokusy se prováděj! buď podrobením zhruba 15 mg krystalické formy vzrůstajícím a klesajícím krokům relativní vlhkosti v % a sledováním hmotnostního přírůstku (v každém rovnovážném kroku) jako funkce relativní vlhkosti v % (obr. 9) nebo udržováním vzorku krystalické formy při konstantní vlhkosti a sledováním hmotnostního přírůstku jako funkce času.

Sloučenina obecného vzorce II vykazuje užitečné farmakologické působení a v souladu s tím se používá jako složka farmaceutických prostředků při léčbě nemocných trpících určitými patologickými stavy.

Tento vynález se též zaměřuje na způsob léčby nemocného trpícího stavy, které lze zlepšit nebo kterým lze zabránit podáním inhibitoru agregace destiček inhibicí vazby fibrinogenu na aktivované destičky a dalších adhezivnich glykoproteinů, které se účastní agregace destiček a srážení krve. Dále se tento vynález zaměřuje na způsobe prevence či léčby trombózy související s určitými chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, periferní arteriální onemocnění a disseminovaná intravaskulární koagulace u lidí a jiných savců.

Pojem léčba je třeba zde chápat tak, že zahrnuje profylaktickou léčbu stejně tak jako léčbu stavů, které již nastaly.

• φ • Φ φφ φφ • φφφ φφφφ • · · φφφφ • · · φ φ φ φ φ· φφφφ φφ φφ

Rozsah tohoto vynálezu též zahrnuje farmaceutické složení obsahující farmaceuticky přijatelné množství alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I ve spojení s farmaceuticky přijatelnou nosnou látkou či pomocnou látkou.

V praxi se sloučeniny či prostředky pro léčbu podle tohoto vynálezu mohou podávat jakýmikoliv vhodnými způsoby, například místně, inhalací, parenterálně, rektálně či perorálně, avšak přednostně se podávají perorálně.

Sloučenina obecného vzorce II se může předkládat ve formách umožňujících podávání nejvhodnější cestou a tento vynález se též vztahuje k farmaceutickým složením obsahujícím alespoň jednu sloučeninu podle tohoto vynálezu, které jsou vhodné pro použití v humánním či veterinárním lékařství . Tyto prostředky se mohou připravovat konvenčními způsoby s použitím jednoho či více přijatelných adjuvantů či pomocných látek. Adjuvanty zahrnují mimo jiné rozpouštědla, sterilní vodná prostředí a různá netoxická organická rozpouštědla. Tato složení se mohou předkládat ve formě tablet, pilulek, tobolek, granulí, prášků, vodných roztoků či suspenzí, roztoků pro injekce, elixírů, sirupů a podobně a mohou obsahovat jednu či více látek zvolenou ze skupiny zahrnující sladidla, příchutě, barviva, stabilizátory či konzervační prostředky pro obdržení farmaceuticky přijatelných přípravků.

Volba vehikula a obsah aktivní látky ve vehikulu se obecně stanoví v souladu s rozpustností a chemickými vlastnostmi produktu a s konkrétním režimem podávání a opatřeními, která je třeba plnit ve farmaceutické praxi. Například pomocné látky, jako je laktóza, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dihydrát hydrogenfosforečnanu vápenatého a rozvolňo83 • * · · ♦ · · ·· 9 9 •9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 99 99 vadla, jako je škrob, kyselina alginová a určité komplexní křemičité gely spojené s mazivy, jako je stearát hořečnatý, laurylsulfat sodný a mastek se mohou použít pro přípravu tablet. Pro přípravu tobolek je výhodné použít laktózu a vysokomolekulární polyethylenglykoly. Při použití vodných suspenzi mohou obsahovat emulgačni prostředky či prostředky umožňující tvorbu suspenze. Lze též použít zřeďovadla, jako je sacharóza, ethanol, polyethylenglykol, propylenglykol, glycerol a chloroform nebo jejich kombinace, stejně tak jako jiné látky.

Pro parenterální podávání se používají emulze, suspenze či roztoky sloučenin podle tohoto vynálezu v rostlinném oleji, například sezamovém oleji, podzemnicovém oleji či olivovém oleji nebo vodně-organické roztoky, jako je voda a propylenglykol, organické estery, které lze podávat v injekci, jako je ethyloleat stejně tak jako sterilní vodné roztoky farmaceuticky přijatelných solí. Roztoky solí přípravků podle tohoto vynálezu lze též použít pro podávání v intramuskulární či subkutánní injekci. Vodné roztoky, které též zahrnují roztoky solí v čisté destilované vodě, se mohou použít pro intravenózní podávání s podmínkou, že se jejich pH vhodně upraví, že jsou rozumně pufrované a že je zaručená jejich izotonická koncentrace použitím dostatečného množství glukózy či chloridu sodného a že se sterilizují zahříváním, ozařováním a/nebo mikrofiltrací.

Lokální podáváni, gely (na bázi vody či alkoholu), krémy a masti obsahující sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou použít. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být též součástí gelu či matricové báze pro aplikaci náplasti, která by umožňovala řízené uvolňování sloučeniny pro přechod transdermální bariérou.

Pevné přípravky pro rektální podávání zahrnují čípky připravené v souladu se známými způsoby a obsahuji alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce II.

Procentický obsah účinné složky v prostředku podle tohoto vynálezu se může měnit takovým způsobem, že prostředek obsahuje podíl vhodné dávky. Obvykle lze podávat zhruba současně několik jednotkových dávkových forem. Požadovanou dávku může stanovit lékař či kvalifikovaný odborník a závisí na požadovaném léčebném účinku, způsobu podávání a trvání léčby a na stavu nemocného. Dávkový režim při provádění způsobu podle tohoto vynálezu je takový, který zajišťuje maximální terapeutickou odpověď v obdržení zlepšení a poté minimální efektivní hladinu poskytující úlevu. Obecně může být perorální dávka mezi zhruba 0,1 mg/kg a zhruba 100 mg/kg přednostně mezi 0,1 mg/kg až 20 mg/kg a nejlépe mezi 1 mg/kg a 20 mg/kg a intravenózní dávka zhruba 0,1 Mg/kg až zhruba 100 Mg/kg, přednostně mezi 0,1 mg/kg až 50 mg/kg.

V každém konkrétním případu lze dávky stanovit v souladu s faktory, které charakterizují pacienta, který se má léčit, jako je stáří, hmotnost, celkový zdravotní stav a další charakteristiky, které mohou ovlivnit účinnost sloučeniny podle tohoto vynálezu.

Dále lze podávat sloučeninu obecného vzorce II tak často, jak je třeba, pro obdržení požadovaného terapeutického účinku. Někteří nemocní mohou vykazovat rychlou odpověď na vyšší nebo nižší dávku a mohou shledávat mnohem slabší udržovací dávky jako přiměřené. Pro jiné nemocné může být nezbytným použít dlouhodobou léčbu při frekvenci 1 až 4 perorálních dávek denně, přednostně jednou až dvakrát denně v souladu s fyziologickými požadavky každého konkrétního pa85 · · · * 4 · 4 4 4 4

4··» 4 4 4 4 4444

444 44 4 4444

444 4 4 44 44 4

444 444 4444

444 44 44 4444 44 44 cienta. Obecně se může aktivní přípravek podávat perorálně jednou až čtyřikrát denně. Pro jiné pacienty bude ovšem nezbytné předepisovat ne více než jednu či dvě dávky denně.

Sloučenina obecného vzorce II vykazuje význačné farmakologické aktivity podle zkoušek popsaných v literatuře, jejichž výsledky lze uvažovat v korelaci s farmakologickou aktivitou u lidí a jiných savců. Následující výsledky farmakologických zkoušek in vitro a in vivo jsou typické pro charakterizaci sloučeniny obecného vzorce II.

Následující farmakologické zkoušky vyhodnocují inhibiční účinnost sloučeniny obecného vzorce II při agregaci destiček zprostředkované fibrinogenem, vazbu fibrinogenu na destičky stimulované trombinem a inhibici agregace destiček indukované ADP ex-vivo a výsledky těchto zkoušek korelují s inhibičnlmi vlastnostmi sloučeniny obecného vzorce II in vivo.

Test agregace destiček je založen na popisu v Blood 66 (4), 946-952 (1985). Test vazby fibrinogenu je v podstatě test, který popsali Z. M. Ruggeri a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83, 5708-5712 (1986) a E. F. Plow a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82, 8057-8061 (1985). Test inhibice agregace destiček indukované ADP ex-vivo je založen na způsobu Zuckera Platelet Inhibition Measured by the Photoelectric Method”, Methods in Enzymology 169. 117-133 (1989).

Test agregace destiček

Příprava fixovaných aktivovaných destiček

Destičky se izolují z koncentrátů lidských destiček

·· ·· • · · · • · ·

9· ·· • · · · • · · · • · · · ·· ·· s použitím způsobu gelové filtrace jak popisuje G. A. Marguerie a kol., J. Biol. Chem., 254, 5357-5363 (1979) a Z. M. Ruggeri a kol., J. Clin. Invest., 72, 1-12 (1983). Destičky se suspendují při koncentraci 2 x 10⁸ buněk/ml v modifikovaném pufru Tyrodeho bez vápníku obsahujícím koncentrace chloridu sodného 127 mM, chloridu hořečnatého 2 mM, hydrogenfosforečnanu sodného 0,42 mM, hydrogenuhličitanu sodného 11,9 mM, chloridu draselného 2,9 mM, glukózy 5,5 mM, HEPES 10 mM při pH 7,35 a 0,35 % lidského serumalbuminu (HSA). Tyto promyté destičky se aktivují přídavkem lidského a-trombinu při konečné koncentraci 2 jednotky/ml a poté inhibitoru trombinu 1-2581 při konečné koncentraci 40 μΜ. K aktivovaným destičkám se přidá paraformaldehyd do konečné koncentrace 0,50 % a směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 30 min. Fixované aktivované destičky se poté sbírají centrifugacl při 650 g po dobu 15 min. Pelety destiček se promyjí čtyřikrát Tyrodeho pufrem s 0,35 % HSA a resuspendují na 2 x 10^sbuněk/ml ve stejném pufru.

Agregace destiček

Fixované aktivované destičky se inkubují s vybranou dávkou sloučeniny, která se má zkoušet na inhibici agregace destiček, po dobu 1 min a agregace se zahájí přídavkem lidského fibrinogenu do konečné koncentrace 250 μg/ml. Zařízení pro profilaci agregace destiček model PAP-4 se používá pro zaznamenání agregace destiček. Rozsah inhibice agregace se vyjadřuje v procentech rychlosti agregace pozorované za nepřítomnosti inhibitoru. Poté se vypočítá IC , to jest množství inhibitoru požadované pro snížení rychlosti agregace o 50 %, pro každou sloučeninu /viz například E. F. Plow a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82, 8057-8061 (1985)/.

·· ·· > · · 1 ·· ···»

Test vazby fibrinogenu

Destičky se zbaví složek plazmy promytím na albuminovém gradientu hustoty podle P. N. Walshe a kol., Br. J. Haematol., 281-296 (1977) v modifikaci V. Trapani a Lombardo a kol., J. Clin. Invest., 76, 1950-1958 (1985). V každé experimentální směsi destiček v modifikovaném Tyrodeho pufru [Z. M. Ruggeri a kol., J. Clin. Invest., 72, 1-12 (1983)] se provádí stimulace lidským a-trombinem při 22 až 25 °C po dobu 10 min (3,125 χ 10¹¹ destiček na litr a trombin v koncentraci 0,1 jednotek NIH/ml). Přidá se hirudin v 25-násobném přebytku (jednotka/jednotka) v průběhu 5 min před přidáním fibrinogenu značeného ¹²⁵I a sloučeniny, která se má testovat. Po těchto přídavcích je konečný počet destiček ve směsi 1 x 10^i:L/litr. Po inkubaci po dobu dalších 30 min při 22 až 25 °C se oddělí vázané a volné ligandy centrifugací 50 μΐ směsi přes 300 μΐ 20% sacharózy při 12000 g po dobu 4 min. Peleta destiček se poté oddělí od zbytku směsi pro stanovení radioaktivity navázané na destičky. Nespecifická vazba se měří ve směsích obsahujících přebytek neznačeného ligandu. Při analýze vazebných křivek Scatchardovou analýzou se nespecifická vazba získává jako parametr zjištěný proložením z isotermy vazby pomocí počítačového programu [P. J. Munson, Methods Enzymol., 92, 542-576 (1983)]. Pro stanovení koncentrace každé sloučeniny potřebné k inhibici vazby 50 % fibrinogenu na destičky stimulované trombinem (ICso) se každá sloučenina testuje při 6 nebo více koncentracích s fibrinogenem značeným ¹²⁵I při 0,176 μιηοΐ/litr (60 μg/ml). ICso se získá vynesením zbytkové fibrinogenové vazby proti logaritmu koncentrace sloučeniny ve vzorku.

Inhibice agregace destiček indukované ADP ex-vivo • ·· *· ·· ·· ·· ·· · · · · · · ♦«·· • · · · · · · · · · ·· ··· · « · · · · · • · · · · · ···· ··· ·· ·· ···· ·· ··

Experimentální protokol

Kontrolní vzorky krve se obdrží 5 až 10 min před podáním zkoušené sloučeniny psím křížencům o hmotnosti 10 až 20 kg. Sloučenina se podává sondou do žaludku ve vodném prostředí nebo perorálně v želatinové tobolce. Poté se odebírají vzorky krve v 30-min intervalech po dobu 3 h a poté po 6, 12 až 24 h po podání. Každý vzorek krve se obdrží z vény na hlavě a odebere se přímo do plastikové injekční stříkačky obsahující jeden díl 3,8% roztoku citrátu sodného na devět dílů krve.

Agregace psích destiček ex vivo

Vzorky krve se centrifugují při frekvenci otáčení 1000 min^-1 po dobu 10 min pro obdržení krevní plazmy bohaté destičkami (PRP). Po odstranění PRP se vzorek centrifuguje po dobu dalších 10 min při frekvenci otáčení 2000 min^-1 pro obdržení plazmy chudé destičkami (PPP). Počítání destiček v PRP se provede s použitím Coulterova čítače (Coulter Electronics, Hialeah, FL). Pokud je koncentrace destiček v PRP vyšší než 300000 destiček/μΐ, potom se PRP zředí PPP pro úpravu počtu destiček na 300000 destiček/μΐ. Alikvoty PRP (250 μΐ) se poté umístí do silikonovaných skleněných kyvet (7,25 x 55 mm, Bio/Data Corp., Horsham, PA). Poté se k PRP přidá epinephrin (konečná koncentrace 1 μΜ) a provede se inkubace po dobu 1 min při 37 °C. Poté se k PRP přidá stimulátor agregace destiček ADP s konečnou koncentrací 10 μΜ. Agregace destiček se sleduje spektrofotometricky s použitím agregometru s transmisí světla (Bio/Data Platelet Aggregation Profiler, Model PAP-4, Bio/Data Corp., Horsham, PA). Pro testování sloučeniny se rychlost změny (směrnice) transmitance světla a maximální transmitance světla (maxi89 • ·· ·· ·· ·· ·· • ••4 44·· ···· ··· ·· · ·«·· • · ··· 4 * ·· ·· · ··· ··· ···· ··· ·· ·· ·«·€ ·· ·· mální agregace) zaznamená v duplikátních vzorcích. Údaje o agregaci destiček se uvedou jako pokles v procentech (střední hodnota ± SEM) směrnice nebo maximální agregace ve srovnání s údaji obdrženými z kontrolní PRP, která se připraví z krevních vzorků obdržených před podáním zkoušené látky.

Sloučenina obecného vzorce II vykazuje význačnou aktivitu v předchozích testech a uvažuje se za užitečnou při prevenci a léčbě trombózy v souvislosti s určitými chorobnými stavy. Antitrombotická aktivita v rozboru agregace psích destiček ex vivo je schopna předpovídat takovou aktivitu u lidí [viz např. J. L. Catalfamo a W. Jean Dodds Isolation of Platelets from Laboratory Animals, Methods Enzymol.,

169, díl A, 27 (1989)]. Výsledky testování sloučeniny obecného vzorce II výše popsanými způsoby se uvádějí v tabulce 6 níže. V tabulce se též uvádějí výsledky komparativních testů 4-4(piperidyl)butanoylglycylaspartyltryptofanu, to jest sloučeniny uveřejněné v publikaci evropské patentové přihlášky č. 0 479 481.

• · ·· · · · 0 «··· • · · · · « · 0 ·

Tabulka 6

Sloučenina příkladu

č.

Inhibice agregace fixovaných destiček (Ιϋ_5ομΜ) Dávka (mg/kg)

Inhibice agregace destiček indukované ADP ex vivo % inhibice agregace destiček ex vivo po perorálnim podání

0,097 (Sloučenina 0,047 EPA 481)

	lh	3h	6h	12h	24h
5	100	100	100	98	50
5	53	<20

Ten, kdo má zkušenost v oboru, snadno ocení, že tento vynález je dobře přizpůsoben svému záměru a obdržení zmíněných výsledků a výhod. Sloučeniny , prostředky a způsoby, které se zde popisují, se předkládají jako případy preferovaných ztělesnění nebo se zamýšlejí jako příklady a nejsou určeny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.

Claims

1. Sloučenina obecného vzorce VII

O O Ε¹ E² O

P²'-N—(CH₂)p—U—hn—CH—“—N CH—C—G

A i ^B ch₂co₂p' ve kterém

E^r je atom vodíku,

E² je alfa-uhlíkový boční řetězec přirozené alfa-aminokyseliny, atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, substituovaná arylová skupina, aralkylová skupina, substituovaná aralkylová skupina, heterocyklylová skupina, substituovaná heterocyklylová skupina, heterocyklylakylová skupina, substituovaná heterocyklylalkylová skupina nebo E¹ a E² spolu s atomy dusíku a uhlíku, ke kterým jsou E^x a E² připojeny, vytvářejí azacykloalkanový 4-, 5-, 6- nebo 7-členný kruh,

G je skupina OR¹ nebo NR^R²,

R¹ a R² jsou nezávisle na sobě atom vodíku, alkylová skupina, cykloalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylcykloalkylová skupina, alkylcykloalkylalkylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina, alkylarylová skupina nebo alkylaralkylová skupina, p je 1 až 4,

P¹ je skupina chránící kyselinu labilní při hydrogenaci a

P² * je P² nebo skupina TFA.H- a

P² je skupina chránící amin labilní v kyselém prostředí.

2. Sloučenina podle nároku 1, ve které

B je alkylová skupina,

E¹ je atom vodíku,

E² je cykloalkylalkylová skupina,

G je skupina NR^R²,

R^x a R² jsou atomy vodíku a p je 1.

3. Sloučenina podle nároku 2, ve které • · « φ · · «φφ φφ φφ φ φφφ φφφ φφφ · φφφ φφ φφ φφφφ φ ·

Β je ethylová skupina a

E² je cyklohexylraethylová skupina.

4. Sloučenina podle nároku 3, ve které p¹ je benzylová skupina a

P² je skupina TFA.H-.

5. Sloučenina podle nároku 3, ve které p¹ je benzylová skupina a

P² je terc.butoxykarbonylová skupina.