CZ55199A3 - Stabilní, nehygroskopická krystalická forma N- [N-[N(4-piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylgIycyl]ových derivátů - Google Patents

Abstract

Stabilní, nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4- piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]ových derivátů, která má antithrombické účinky, zahrnující inhibici shlukování destiček a vytváření thrombu u savců a je užitečná při prevenci a léčení thrombosis spojené s chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, onemocnění periferních arterií a roztroušené intravaskulámí koagulace.

Description

*> Stabilní, nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]ových derivátů

Oblast techniky * Vynález se týká nehygroskopické stálé krystalická formy

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-aspa ragyl]-(L)-β-cyk1ohexy1 a 1aninamidu obecného vzorce I

OH (!) který má antithrombické účinky, zahrnující inhibici shlukování destiček a vytváření thrombu u savců a je užitečná při prevenci a léčení thrombosis spojené s chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, onemocnění periferních arterií a roztroušené intravaskulární koagulace.

^b Kromě toho se vynález týká způsobu přípravy krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl3 — (L) — * asparagyl ]-(L)-3-cyklohexylalaninamidu obecného vzorce I, farmaceutických prostředků, které ho obsahují a meziproduktů pro jejich přípravu.

Dosavadní stav techniky f \

Hemostasis, biochemie krevní srazíívost i, je neobyčejně složitýn jevem, při kterém normální plná krev a tělesná tkáň spontánně zastaví krvácení z poraněných žil. Efektivní hemostasis vyžaduje kombinovanou aktivitu cévních, destičkových

9 ♦ * ·* * * · » · • 9 9 9 999 9999

9 9 9999 9999

9 9 * · 99999 9 999 999

999 ··· · ·

9 9 · · ·· · ·· · · a plasmatických faktorů stejně jako řídicí mechanismus k zabránění nadměrné srážlivosti a trombotických následků. Poruchy, nedostatečnost nebo nadměrnost kterékoli z těchto tří složek mohou vést k hemoragickým a thrombotickým důsledkům.

Ulpívání destiček, rozptylování a agregace extrabuněčných matric jsou ústředními ději při vytváření thrombu. Tyto děje zprostředkovává rodina adhesivních glykoproteinů, tedy fibrinogenu, fibronektinu a Wi11ebrandova faktoru. Fibrinogen je spolupracujícím činitelem při agregaci destiček, zatímco fibronektin podporuje připoutávání destiček a rozptylové reakce a von Willebrandův faktor je významný při připoutávání destiček a rozptylování na subendothe1iální matrice. Poloha vazebních míst fibrinogenu, fibronektinu a Wi1lebrandova faktoru byla lokalizována na proteinový komplex destičkových membrán, známý pod jménem glykoprotein Ilb/IIIa.

Adhesivní glykoproteiny, jako fibrinogen, se nespojují s normálně klidovými destičkami. Jsou-li však destičky aktivovány agonistem, jakým je například thrombin nebo adenosindifosfát, změní destičky svůj tvar, pravděpodobně k zajištění dostupnosti vazebních míst GPIIb/IIa pro fibrinogen. Sloučenina podle vynálezu blokuje fibrinogenní receptor a má tudíž shora uvedené antithrombické účinky.

Zjistilo se, že přítomnost Arg-Gly-Asp (RGD) ve fibrinogenu, fibronektinu a von Wi11ebrandově faktoru je nutnou podmínkou pro jejich interakci s receptorem povrchu buněk (Ruoslahti E., Pierschbacher, Cell 44, str. 517 až 518, 1986). Zdá se, že i dvě další sekvence aminokyselin se podílejí na funkci fibrinogenu spojování destiček, jmenovitě sekvence Gly-Pro-Arg a sekvence dodekapeptidu His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Alaf

Gly-Asp-Val. Ukázalo se, že malé syntetické peptidy obsahující RGD nebo dodekapeptid se vážou na receptor GPIIb/IIIa destiček a konkurenčně zabraňují vazbě fibrinogenu, fibronektinu a von i

Wi 11 ebrandova faktoru stejně jako brání agregaci aktivovaných destiček (Plow a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 8057 až 8061, 1985; Ruggeri a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. str. 5708 až 5712, 1986; Ginsberg a kol.. J.Biol. Chem. 260, str. 3931 až 3936, 1985; a Gartner a kol., J. Biol. Chem. 260, 11, str. 89 až 94, 1987).

Tjoeng a kol. (americký patentový spis číslo 5 037 808 a 4 879 313) uvádí, že sloučeniny indolylu, obsahující asparagylové podíly guanidinoalkanoylu a guanonidinoalkenoylu, jsou inhibitory agregace destiček.

V ameickém patentovém spise číslo 4 992 463 (uděleném 12. února 1991) uvádí Tjoeng a kol., že řada arylových a aralkylových mimetických sloučenin guanidinoalkylového peptidu vykazuje inhibiční účinky vůči agregaci destiček a specificky popisuje řadu monomethoxyfenylpeptidových mimetických a dimethoxyfenylpeptidových mimetických sloučenin a mimetickou sloučeninu bifenylalkylpeptid.

V americkém patentovém spise číslo 4 857 508 (uděleném 15. srpna 1989) uvádí Adams a kol., že řada derivátů guanidinoalkylpeptidu, obsahující koncové aralkylové substituenty, vykazuje inhibiční působení na agregaci destiček a uvádí specificky řadu bifenylových a naftylových derivátů O-methy1tyrosinu obsahujících funkčnost koncového aminu.

Haverstick, D.M. a kol. (Blood 66 (4), str. 946 až 952, 1985) uvádí, že řada syntetických peptidů, včetně Arg-Gly-AspSer a Gly-Arg-Gly-Asp-Ser, je schopna inhibovat thrombinem vyvolanou agregaci destiček.

Plow, E.F. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, str. 3711 až 3715, 1982) uvádí, že tetrapeptid glycyl-L-prolyl-L-arginyl-Lprolin inhibuje vazbu fibrinogenu na lidské destičky.

• · · 0 · · · • · 0 · 0 · ·

0 0 00 00000 • 0 0 0 0 0

000 00 0 < Ve francouzské přihlášce vynálezu číslo 86/17507, podané

15. prosince 1986, se uvádí, že deriváty tetrapeptidu, penta·* peptidu a hexapeptidu, obsahující sekvenci -Arg-Gly-Asp-, jsou užitečnými antithrombickými činidly.

’ V americkém patentovém spise číslo 4 683 291 (uděleno 28.

července 1987) uvádí Zimmerman a kol., že řada peptidů, zahrnujících šest až čtyřicet aminokyselin, které obsahují sekvenci -Arg-Gly-Asp-, je inhibitorem vazby destiček.

V evropské přihlášce vynálezu číslo O 319 506, zveřejněné

7. Června 1989, se uvádí, že řada tetrapeptidových, pentapeptidových a hexapeptidových derivátů obsahujících sekvenci -Arg-Gly-Asp-, je inhibitorem agregace destiček.

Cyklické peptidové analogy, obsahující podíl Gly-Asp, jsou uváděny v americkém patentovém spise číslo 5 023 233 jako antagonisty fibrinogenového receptoru.

» Peptidy a pseudopeptidy obsahující amino-, guanidino-, imidazaloylové a/nebo amidinoalkanoylové a alkenoylové podíly, ' se uvádějí jako antithrombická činidla v amerických přihláškách vynálezu, které jsou dosud v řízení, číslo 07/677 006, podané 28.března 1991, číslo 07/534 385, podané 7.června 1990, * a 07/460 777, podané 4. ledna 1990, a v americkém patentovém spise číslo 4 952 562 a v mezinárodní přihlášce vynálezu číslo PCT/US90/05448 podané 25. září 1990, jejichž autorem je autor tohoto vynálezu.

Peptidy a pseudopeptidy obsahující podíly amino-, guanidino- alkylbenzoylové a alkenylbenzoylové, fenylakanoylové a fenylakenoylové se uvádějí jako antithrombická činidla v ameζ rické přihlášce vynálezu, která je dosud v řízení, číslo 07/ 475 043, podané 5.února 1990, a v mezinárodní přihlášce vynálezu číslo PCT/US91/O2471, podané 11. dubna 1991, zveřejněné

9 >

• « 9 9 • 99

9 9

9 9

9 9 9 9

99

9 9 9

9 9 99 jako mezinárodní přihláška vynálezu WO 92/13117 29.října 1992, jejichž autorem je autor tohoto vynálezu.

Jako inhibitory agregace destiček se uvádějí alkanoylové a substituované alkanoylové deriváty azacykloalkylformylasparagové kyseliny v americkém patentovém spise číslo 5 053 392, přihláška podaná 1. prosince 1989, stejným autorem a týkající se stejného problému jako předmětná přihláška vynálezu.

N-substituované deriváty azacykloalkylkarbonylové cyklické aminoacylasparagové kyseliny se uvádějí jako antithrombicky účinné látky v americkém patentovém spise číslo 5 064 814, podáno 5. dubna 1990, jehož autorem je autor tohoto vynálezu. Deriváty azacykloalkylformylglycylasparagové kyseliny se uvádějí jako antithrombické v americkém patentovém spise číslo 5 051 405, podáno 10. října 1989, jehož autorem je autor tohoto vynálezu.

V evropské přihlášce vynálezu číslo O 479 481, zveřejněné

8. dubna 1992, se uvádějí azacykloalkylalkanoylglycylasparagylaminokyse1iny jako antagonisty receptoru fibrinogenu.

V evropské přihlášce vynálezu číslo O 478 362, zveřejněné 1. dubna 1992, se uvádějí azacykloalkylalkanoylpeptidyl-p-alaniny jako antagonisty receptoru fibrinogenu.

Ve světové přihlášce vynálezu PCT číslo WO95/1O295 se uvádějí azacykloalkylalkanoylové peptidy a pseudopeptidy obecného vzorce II

O

NH-CH-C-Z

CH₂COOH (II) • · ·· »

Μ <· « · · · zejména N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycy1]-(L) asparagyl]-(L)-fi-cyklohexylalaninamid, které inhibují agregaci destiček a vytváření thrombu u savců a jsou užitečné při prevenci a léčení thrombosy. N-[N-[N-(4-(Piperidin-4-yl)butanoyl]N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalaninamid podle světového patentového spisu PCT číslo WO95/1O295, je amorfní, hygroskopický a je fyzikálně nestabilní, jelikož váže vodu. Světový patentový spis PCT číslo WO95/1O295 neuvádí nehygroskopickou stabilní krystalickou formu N-[N-[N-(4-(piperidin-4yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-p-cyklohexyla laninamidu.

Ve světovém patentovém spise PCT číslo WO95/1O295 se uvádí, že azacyk1oalky1 a 1kanoylové peptidy a pseudopeptidy se připravují obecně postupy synthesy peptidů v pevné fázi nebo v roztoku, přičemž se používá výchozích materiálů a/nebo snadno dostupných meziproduktů od společností dodávajících chemikálie, jako je Aldrich nebo Sigma (H. Paulsen, G. Merz, V. Weichart, So1 id-Phase Synthesis of Glycopeptide Sequences [Syntéza v pevné fázi glykopeptidových sekvencí] Angew. Chem. Int. Ed. Engl.27, 1988; H. Mergler, R. Tanner, J. Gosteli a P. Grogg, Peptide Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods I; A New Věry Acid-Labile Anchor Group for the Solid-Phase Synthesis of Fully Protected Fragments, [Peptidová syntéza kombinací způsobů v pevné fázi a v roztoku. Nová velice kyselinově labilní kotvicí skupina pro syntézu v pevné fázi plně chráněných fragmentů], Tetrahedron Letters 29, str.4OO5, 1988); Merrifield, R.B.Solid-Phase Peptide Synthesis after 25 Years: The Design and Synthesis of Antagonists of Glucagon [Syntéza peptidu v pevné fázi po 25. letech: Konstrukce a syntéza antagonistů glukagonu], Macromol. Chem. Macromol. Symp. 19, str. 31, 1988). Kromě toho se ve světovém pat tentovém spise PCT číslo WO95/1O295 uvádí, že amorfní a hygroskopická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-3~cyklohexylalaninamidu se připra·· · ·· ··

vuje sekvenční syntesou z aminokyseliny se zakončením C, jak patrno ze schéma I. Světový patentový spis PCT číslo WQ95/ 10295 neuvádí vytváření tetraazacykloalkylalkanoyylpeptidů a pseudopeptidů, zejména N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-Nethylglycyl]-(L)-asparagyl}-(L)-3-cyklohexylalaninamidu z centrálního di(pseudopeptidu nebo peptidu), přičemž N- a C-koncová zakončení centrálního di(pseudopeptidu nebo peptidu) jsou oba spojena s pseudoaminokyse1inami a/nebo s aminokyselinami k vytvoření tetraazacykloalkylalkanoylpeptidů a pseudopeptidů.

Schéma I θ Ζθ\ kopulace θ P /0\

P_rNH-CH-C-OH + HN—CH—^Cy—G'-►P₁-NH-CH-C —N—CH—lcy—G'

CH₂-C-OP₂ E' F ^Γ CH-j-C—OP, F ^r

O

CH₂-C-OP₂ F ii * odstranění OF /0\ O chrámci skupiny ιι i i ii i . . ii

-NH₂—CH—C ——N—-CH—(Cy—G' + P3N~^CH₂J—C—OH

CH₂-C-OP₂ F ^Γ B ^P ii *

O η kopulace -^:->²) odstranění chránící skupiny

H-N-fCMj-Č-NH-CH-C— N—CH-(č)— G' + Fr-CH^<j^:(R,2)m . ° b ^p Íh₂-c-op₂ 'r /-ΤΓ-(⁰^-ΟΗ

A*

O ^A

1) kopulace ²) odstranění chránící skupiny

RNm O O O E /0\ (CH₂)—C— N-^CH₂^-C—NH-CH-C — Ň—CH—4cJ— ^{B P} CH₂COOH é ^r

Přihláška vynálezu číslo WO 95/10295 se netýká vytváření tetraazacykloalkylalkanoylpeptidů a pseudopeptidů nebo zvláště N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl]-N-ethy1glycy13 -(L)-aspa ragyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu z centrálního di(pseudopeptidu nebo peptidu), přičemž N- a C- koncová zakončení centrálního di(pseudopeptidu nebo peptidu) jsou vždy kopulována s pseudoaminokyse1inami a/nebo s aminokyselinami za vytvoření

tetraazacykloalkylalkynoylpeptidů a pseudopeptidů.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je nehygroskopická stabilní krystalická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethy1glycy1](L)-asparagyl]-(L)-β-cyklohexy1 a 1aninamidu obecného vzorce I,

OH (i) která podle vynálezu má antithrombické účinky, včetně inhibice agregace destiček a vytváření thrombu u savců a je užitečná při prevenci a léčení thrombosis spojené s chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, onemocnění periferních arterií a roztroušené intravaskulární koagulace. Kromě toho se vynález týká způsobu přípravy nehygroskopické stabilní krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoy1-N-ethy1-glycyl ]-(L)asparagy1]-(L)-3-cyklohexylalaninamidu a farmaceutických prostředků, které ji obsahují a meziproduktů pro její přípravu.

Dále se vynález týká způsobu přípravy derivátu tetra-azacykloalkylkalkanoylpeptidu nebo pseudopeptidu obecného vzorce

(Π)

II

- 9 - ::

·· ·· k · · 4 » · » 4 kde znamená

A atom vodíku

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cyk1oa1ky1 a 1ky1ovou, alky 1 cyk1oa1ky1ovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

Z skupinu

COG

I \ ^CH I

E¹

E¹ atom vodíku,

E² α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující ct-aminokyseliny, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, heterocyklylovou, substituovanou heterocyklylovou, heterocyklylalkylovou, substituovanou skupinu heterocyklylalkylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, na které jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh,

G skupinu OR¹ nebo NR¹R²,

R¹a R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

R atom vodíku, skupinu alkylovou, arylovou nebo aralkylovou,

······ · · • · · ·· ·· · ·· ··

	m	číslo	1	až	5
-	n	číslo	0	až	6 a
	P	číslo	1	až	4,

a zejména nehygroskopické stabilní krystalické formy N-[N-[N[4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L) β-cyklohexylalaninamidu.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a připojené obrázky.

Přehled obrázků

Na obr. 1 je obrazec práškové rentgenové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-y1)butanoy1]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu připravené podle příkladu 13, způsob A.

Na obr. 2 je obrazec práškové rentgenové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoy1)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu připravené podle příkladu 13, způsob B (a).

Na obr. 3 je obrazec práškové rentgenové difrakce vzorku nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexy1 a 1aninamidu připravené podle příkladu 13, způsob B (b).

Na obr. 4 je obrazec práškové rentgenové difrakce vzorku hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalar ninamidu připravené podle příkladu 14.

Na obr. 5 je obrazec práškové rentgenové difrakce vzorku • · — · · · · ··· ···· • · · ···· · · · · « · · · · · ···· · ··· ··· • · · · · · ·· ·· ··· ·· · ·· ·· nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]- (L)-3~cyklohexylala ninamidu připravené podle příkladu 14.

Na obr. 6 je mikrokalorimetrický graf uvolněné energie jako funkce času pro tri různé pokusy, které byly provedeny podle popisu v příkladu 15. Pokusy byla sledována tepelná činnost různých krystalických forem N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyk1ohexy1 a 1aninamidu, vystavených působení par různých rozpouštědel. Stopa (A) na obr. 6 ukazuje, že byl-li hygroskopický N-[N-[N-(4-piperidin4-yl)-butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexyl alaninamid, připravený podle příkladu 5 nebo 11, vystaven působení 80% relativní vlhkosti (nasycený roztok chloridu draselného) po dobu 30 hodin při teplotě 40 °C, během níž exponovaná hygroskopická forma sloučeniny se promění na nehygroskopickou formu, dochází k silné exothermické reakci. Stopa (B) na obr. 6 ukazuje neexothermickou reakci, ke které dochází, je-li hydroskopický N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)-butanoyl)-N-ethylglycyl ]- (L)-asparagy 1 ]- (L)^-cykl ohexy 1 alaninamid, připravený podle příkladu 5 nebo 11, vystaven působení par methanolu při teplotě 40 ’C (rozpouštědla jiného než foda, ve které je sloučenina rozpustná) a methanol tedy nepodporuje mobilitu uvnitř krystalů této formy při konvezi na nehygroskopickou formu. Stopa (C) na obr. 6 ukazuje neexotermickou konversi, ke které dochází, když je nehygroskopický N-[N-[N-(4-piperidin-4yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyk1ohexy1 a laninamid, připravený podle příkladu 13, vystaven působení 80% relativní vlhkosti při teplotě 40 °C a nehygroskopická forma sloučeniny tedy nepodléhá za těchto podmínek konverzi, je tudíž stabilní formou.

Na obr. 7 je mikrokalorimetrický graf uvolněné energie jako funkce času pro tři různé pokusy, které byly provedeny podle popisu v příkladu 15. Pokusy sledují tepelnou činnost konverse hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yi)bu• 9

- .

9 · 9 · 9 9999 9 999 999

999 999 9 9

999 99 9 99 99 tanoyl]-N-ethylglycy1]-(L)-asparagyl]-(L)-3-cyklohexylalaninamidu na její nehygroskopickou formu, je-li vystavena působení par při 80% relativní vlhkosti při teplotách 40, 50 a 60 °C. čísla znamenají konversi trvající přibližně 24 hodin při teplotě 40 °C, 6,5 hodin při teplotě 50 ’C a 3 hodiny při teplotě 60 °C.

Na obr. 8 je mikrokalorimetrický graf uvolněné energie jako funkce času pro čtyři různé pokusy, které byly provedeny podle popisu v příkladu 15. Pokusy sledují tepelnou činnost konverse hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-3~cyklohexylalaninamidu na její nehygroskopickou formu, je-li vystavena při teplotě 60 ”C působení par při 60% až 65% relativní vlhkosti, 75% relativní vlhkosti, 80% relativní vlhkosti a 100% relativní vlhkosti. Význačná čísla na obr. 8 svědčí o tom, že vyšší relativní vlhkost produkuje rychlešjí konvezsi. Jiným význakem je, že konverse na nehygroskopickou formu sloučeniny nastává při 100% relativní vlhkosti při teplotě 60 °C bez zkapalnění, které se vyskytuje u hygroskopické formy při teplotě místnosti. Na základě těchto výsledků se očekává, že rychlost konverse na nehygroskopickou formu je značně rychlejší než rychlost zkapalnění hygroskopické formy při teplotě 60 °C.

Na obr. 9 je porovnání závislosti procentového přírůstku hmotnosti na procentové relativní vlhkosti prostředí pro hygroskopickou (_—) a nehygroskopickou (Q) formu N-[N-[N-(4-piperidin4-yl)-butanoyl]-N-ethylglycy1]-( L )-asparagyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu při teplotě 25 °C zjištěné při pokusu 16.Z obr. 9 vyplývá, že hygroskopická forma pohlcuje více vody než nehygroskopická forma při zvyšování relativní vlhkosti prostředí a výrazněji při relativních vlhkostech větších než 60 %. Kromě toho ukazuje obr. 9, že hygroskopická forma sloučeniny nedesorbuje vlhkost na své původní procento vlhkosti, zatímco nehygroskopická forma sloučeniny na své původní procento vlhkos··

- : ϊ • · ·· · > · · ·· ·· • · · · • · · ·· ti desorbuje.

Jednotlivé používané zkratky a výrazy mají následující význam:

BOC	terč.-butoxykarbony1
CBZ	benzyloxykarbonyl
Gly	glycin
Asp	asparagová kyselina
Obz 1	benzyloxy
TFA	trifluoroctová kyselina
Cha	β-cyklohexylalanin
EtOAc	ethylacetát
DMF	dimethy1 formamid
DCC	dicyklohexylkarbodi imid
HOBt	1-hydroxybenzot r i azo1
TBTU	(2-lH-benzot r iazol-1-y1)-1,1,3,3-tet rámethy1uroňium tetrafluorborát
Dl	deionizovaná voda
PNP	p-ni trofenol
PFP	pentafluorfenol
DCU	dicyklohexy1močovina
NMM	N-methylmorfolin
MTBE	methyl-terč.-butylet her
RH	relativní vlhkost
THF	tetrahydrf uran
PipBu	4-piperidinmáselná kyselina
PipBuen	(4-piperidin)buty1idenylkarboxylová kyselina vzorce

NH f

co₂h

Výrazem pacient se vždy míní člověk nebo jiný savec.

>· · «· ·· • · · · · · · • · · · · · · · • · · »··· · ··· ··· • · · · · • ·· · ·· ··

Výrazem farmaceuticky vhodná sůl se vždy míní sůl mateřské sloučeniny obecného vzorce I, která je poměrně neškodná pro pacienta, pokud se použije v terapeutické dávce, přičemž se příznivé farmaceutické vlastnosti mateřské sloučeniny obecného vzorce I nenarušují vedlejšími účinky, připisovanými protiiontu sloučeniny ve formě soli. Farmaceuticky vhodná sůl zahrnuje obojetný iont nebo vnitřní sůl sloučeniny obecného vzorce I.

Výrazem alkyl se vždy míní nascená alifatická uhlovodíková skupina s přímým nebo s rozvětveným řetězcem mající 1 až 20 atomů uhlíku. Rozvětvením se míní, že je nižší alkylová skupina, například skupina methylová, ethylová nebo propylová vázána na lineární alkylový řetězec. Výhodnými alkylovými skupinami s přímým nebo s rovětveným řetězcem jsou nižší alkylové skupiny, což jsou alkylové skupiny s 1 až 10 atomy uhlíku. Nejvýhodnějšími alkylovými skupinami jsou alkylové skupiny s 1 až 6 atomy uhlíku.

Výrazem cykloalkyl se vždy míní nascená karbocyklická skupina s jedním nebo s několika kruhy mající 3 až 10 atomů uhlíku. Jakožto výhodné cykloalkylové skupiny se uvádějí skupina cyklopropylová, cyk1 obuty 1ová, cyk1openty1ová, cyklohexylová, cykloheptylová a dekahydronaftylová skupina.

Výrazem cykloalkylalkyl se vždy míní alkylová skupina substituovaná cykloalkylovou skupinou. Jakožto výhodné cykloalkylalkylové skupiny se uvádějí skupina cyklopentylmethylová, cyklohexylmethylová, cyklohexylethylová, dekahydronaft-l-ylmethylová a dekahydronaft-2-ylmethylová skupina.

Výrazem a 1ky1cykloa1ky1 se vždy míní cykloalkylová skupina substituovaná alkylovou skupinou. Příkladně se uvádějí skupina 1-, 2-, 3- nebo 4- methylcyklohexylová nebo ethylcyklohexylová.

· · · i A AAAA A

A · A

A A A i i:

AAA 4 A

AA 4

Výrazem alkylcykloalkylalkyl se vždy míní alkylová skupina substituovaná alkylcykloalkylovou skupinou. Příkladně se uvádějí skupina 1-, 2-, 3- nebo 4- methylcyklohexylmethylová nebo ethylcyklohexylmethylová nebo 1-, 2-, 3- nebo 4- methylcyklohexylethylová nebo ethylcyklohexylethylová skupina.

Výrazem azacykloalkan se vždy míní nasycený alifatický kruh obsahující atom dusíku. Výhodné azacyk1oa1kanové skupiny zahrnují skupinu pyrolidinovou a piperidinovou.

Výrazem přírodně se vyskytující ct-aminokyse 1 ina se vždy míní glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, šeřin, threonin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, cystein, methionin, prolin, hydroxypro1in, kyselina asparagová, asparagin, glutamin, glutamová kyselina, histidin, arginin, ornithin a lysin.

Výrazem α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující α-aminokyse1ina se vždy míní podíl, který substituuje α-uhlíkový atom přírodně se vyskytující α-aminokyse1iny. Příkladně se jako α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující α-aminokyse1iny uvádí skupina isopropy1ová, methylová a karboxymethylová pro valin, alanin a asparagovou kyselinu.

Výrazem skupina chránící aminoskupinu se vždy míní snadno odstranitelná skupina, o které je známo, že chrání aminoskupinu před nežádoucími reakcemi v průběhu přípravy a která je selektivně oddělitelná. Použití skupin, chránících aminoskupinu, je v oboru ke chránění aminoskupiny před nežádoucími reakcemi v průběhu přípravy obecně známé (příkladně se uvádí T.H. Green a P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, John Walley & Sons, New Yourk, 1991). Jakožto výhodné skupiny ke chránění aminoskupiny se příkladně uvádějí f

skupina formylová, acetylová, chloracetylová, trichloracetylová, o-nitrofenylacetylová, o-nitrofenoxyacetylová, trifluoracetylová, acetoacetylová, 4-chlorbutyrylová, isobutyrylová, o-

•» | ·* · « • β · * « ♦ · · « « · · ····· e ··· ··· • * · · ·· Φ φ* 4-4 nitrocinnamoylová, pikolinoylová, acy1isothiokyanátová, aminokaproylová a benzoylová skupina a acyloxyskupiny, jako jsou skupina methoxykarbonylová, 9-fluorenylmethoxykarbonylová, 22,2-tri fluorethoxykarbony1ová, 2-tr imethy1s ily1ethoxykarbonylová, vinyloxykarbonylová, allyloxykarbonylová, terč.-butyloxykarbony lová (BOB), 1,l-dimethylpropinyloxykarbonylová, benzyloxykarbonylová (CBZ), ρ-nitrobenzyloxykarbony1ová a 2,4-dichlorbenzy1oxykarbonylová skupina.

Výrazem kyselá labilní skupina chránící aminoskupinu se vždy míní shora definovaná skupina chránící aminoskupinu, která se snadno odstraňuje kyselinou zatímco zůstává poměrně stabilní k působenení jiných činidel. Výhodnou kyselou labilní skupinou, chránící aminoskupinu, je terč.-butyloxykarbonylová skupina (BOB).

Výrazem k hydrogenaci labilní skupina chránící aminoskupinu se vždy míní shora definovaná skupina chránící aminoskupinu, která se snadno odstraňuje hydrogenaci zatímco zůstává poměrně stabilní k působenení jiných činidel. Výhodnou k hydrogenaci labilní skupinou chránící aminoskupinu je benzyloxykarbonylová (CBZ).

Výrazem skupina chránící kyselinovou skupinu se vždy míní snadno odstranitelná skupina, o které je známo, že chrání skupinu karboxylové kyseliny (-COOH) před nežádoucími reakcemi v průběhu přípravy a která je selektivně oddělitelná. Použití skupin, chránících karboxylovou skupinu, je v oboru ke chránění skupiny karboxylové kyseliny před nežádoucími reakcemi v průběhu přípravy obecně známé (příkladně se uvádí T.H. Green a P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydání, John Walley & Sons, New Yourk, 1991). Jakožto výhodné skupiny ke chránění skupiny karboxylové kyseliny se příkladně uvádějí skupina methoxymethylová, tetrahydropyranylová, benzyloxymethylová, substituovaná a nesubstituovaná skupina fena• 9

9 9 ϊ

«9 $ cylová, 2,2,2-trichlorethylová, terč.-butinylová, cinnamylová, substituovaná a nesubstituovaná skupina benzylová a skupina trimethylsilylová, a podíly amidů a hydrazidů, jako je skupina Ν,Ν-dimethylová, 7-nitroindolylová, hydrazidová a N-fenylhydrazidová.

Výrazem k hydrogenaci labilní skupina chránící kyselinovou skupinu se vždy míní shora definovaná skupina chránící kyselinovou skupinu, která se snadno odstraňbuje hydrogenaci zatímco zůstává poměrně stabilní k působenení jiných činidel. Výhodnou k hydrogenaci labilní skupinou chránící kyselinovou skupinu je benzylová skupina.

Výrazem aryl se vždy míní fenylová nebo naftylová skupina substituovaná jednou nebo několika substituenty arylových skupin, které jsou stejné nebo různé, přičemž se substituentem arylových skupin míní příkladně skupina alkylová, alkenylová, alkinylová, arylová, arylalkylová, hydroxylová, alkoxyskupina, aryloxyskupina, aralkoxyskupina, skupina hydroxyalkylová, acylová, formylová, karboxyskupina, skupina alkenylová, aroylová, atom halogenu, skupina trifluormethylová, kyanoskupina, skupina alkoxykarbonylová, aryloxykarbonylová, aralkoxykarbonylová, acy1aminoskupina, aroylaminoskupina, skupina karbamoylová, alkylkarbamoylová, dialkylkarbamoylová, arylkarbamoylová, aralkylkarbamoylová, a 1ky1su1fonylová, alkylsulfinylová, ary 1su1fony 1ová, ary 1 sulfinylová, aralkylsulfonylová, aralkylsulfinylová nebo skupina vzorce -NR_a Rb , kde znamená Ra a Rb na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, arylovou nebo aralkylovou.

Výrazem aralkyl se vždy míní alkylová skupina substituovaná arylovou skupinou. Jakožto výhodná aralkylová skuř pina se uvádí skupina benzylová, naft-l-yImethylová, naft-2ylmethylová a fenethylová skupina,,

» 1 *· • ·

Výrazem substituovaný aralkyl se vždy míní aralkylová skupina substituovaná v arylovém podílu jednou nebo několika substituenty arylových skupin.

Výrazem heterocyklyl se vždy míní přibližně 4- až 15-členný monocyklický nebo multicyklický kruhový systém, přičemž jeden nebo několik atomů kruhu je jiných než atom uhlíku, přičemž je to například atom dusíku, kyslíku nebo síry. Jakožto výhodné heterocyklylové skupiny se uvádějí skupina pyridylová, pyrimidylová a pyrrolidylová skupina.

Výrazem substituovaný heterocyklyl se vždy míní heterocykly lová skupina substituovaná jednou nebo několika substituenty arylových skupin.

Výrazem heterocyklylaiky1 a substituovaný heterocyklylalkyl se vždy míní alkylová skupina substituovaná heterocyklylovou skupinou nebo substituovanou heterocyklylovou skupinou.

Výrazem hygroskopicita se vždy míní sorpce množství nebo stavu vody dostatečné k ovlivnění fyzikálních nebo chemických vlastností látky (Eds. J. Swarbrick a J. C. Boylan, Encyclopedia of Pharmaceuti ca 1 technology, sv. 10, str. 33).

Výhodnou sloučeninou, připravenou způsobem podle vynálezu, je sloučenina obecného vzorce II, kde znamená E² atom vodíku, skupinu alkylovou, hydroxymethylovou, 1-hydroxyethylovou, merkaptomethylovou, 2-methylthioethylovou, karboxymethylovou, 2karboxyethylovou, 4-aminobutylovou, 3-guanidinopropylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, substituovanou skupinu aryr lovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, heterocyklylovou, substituovanou heterocyklylovou, heterocyklylalkylovou, substituovanou skupinu heterocyklylalkylovou, nebo E¹ .·Μ ι · · r * 4 · 4 4 · • · i a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, se kterými jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh, za podmínky, že heterocyklylalkylová skupina je jiná než skupina indo-3-ylmethylovu.

Výhodnější sloučeninou, připravenou způsobem podle vynálezu, je sloučenina obecného vzorce II, kde znamená E² atom vodíku, skupinu alkylovou, hydroxymethylovou, 1-hydroxyethylovou, merkaptomethylovou, 2-methylthioethylovou, karboxymethylovou, 2-karboxyethylovou, 4-aminobutylovou, 3-guanidinopropylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, se kterými jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh.

Ještě výhodnější sloučeninou, připravenou způsobem podle vynálezu, je sloučenina obecného vzorce II, kde znamená E² atom vodíku, skupinu alkylovou, hydroxymethylovou, 1-hydroxyethylovou, merkaptomethylovou, 2-methylthioethylovou, karboxymethylovou, 2-karboxyethylovou, 4-aminobutylovou, 3-guanidinopropylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, se kterými jsou vázány, tvoří 4-členný, 5členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh.

Další výhodnější sloučeninou, připravenou způsobem podle vynálezu, je sloučenina obecného vzorce II, kde znamená B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylalkylovou skupinu.

f

Obzvláště výhodnými jsou podle vynálezu sloučeniny obec ného vzorce Ila i

• · • · • 9 et ·

9 4 • 9 9 rt · ♦ • 9 9 9«

Γϋ

N{CH₂)—C— N^CH₂)-C-NH-CH-G-NH—CH-C-L ^P CH₂COOH J (Ha) kde znamená skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou a alkylaralkylovou, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalky lalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, substituovanou arylovou, aralkylovou, substituovanou aralkylovou, alkylarylovou a alkylaralkylovou, skupinu OR¹ nebo NR¹R²,

R¹ a R²na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nabo alkylaralkylovou, číslo 1 až 5, číslo 2 až 6 a číslo 1 nebo 2.

Obzvláště výhodnějšími jsou podle vynálezu sloučeniny obecného vzorce Ila, kde znamená skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylalkylovou, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cyklo* ·· · «· ·· φ « φ φ ♦ ·-·<»'· • · » φ ♦ φφφ· φ φ φ φ φφφφ · ··.· ··· φφφφ » φ <|· ♦-· !* ΦΦ φφ ι

alkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylaikylovou, číslo 3 a číslo 3 nebo 4

Obzvláště ještě výhodnějšími jsou podle vynálezu sloučeniny obecného vzorce Ila, kde znamená

B skupinu alkylovou,

J skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou,

R^l a R²na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylalkylovou, m čí s 1 o 3 , číslo 3 nebo 4 a p čí slo 1.

Především obzvláště výhodnou je podle vynálezu sloučenina obecného vzorce Ila, kterou je N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl ]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyk1ohexylalaninamid.

Vynález se týká také způsobu přípravy stabilní, nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-3-cyklohexylalaninamidu. Podle Vynálezu tato forma sloučeniny je schopná vyvinout stabilní prostředek sloučeniny podle vynálezu. Stabilní nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninámi22 »·«· ♦ · · «««· »· · a · · * · · · · . · · · · · ···· « »·· ··· ·,»» «·» « · - f.' «·» »· · ·· «· du má také vysokou teplotu tání a nemá sklon absorbovat vodu. Stabilní forma má také jedinečnou a neočekávanou odolnost proti vlhkosti a teplotě i při vyšších hodnotách, než jsou běžné při dopravě, výrobě dávkovačích forem nebo při dloutrvající dopravě nebo při dlouhodobém skladování. Tyto vlastnosti usnadňují výrobu dávkovačích forem. Konverze sloučeniny na stabilní formu nevede ke ztrátě materiálu nebo jeho čistoty a nemá nepříznivý vliv na vlastnosti částic.

Vynález zahrnuje všechny možné kombinace výhodných sloučenin, zvláště výhodných a obzvláště výhodných provedení shora uvedených.

Sloučenina podle vynálezu je užitečné ve formě volné zásady nebo kyseliny, podvojné soli nebo ve formě farmaceuticky vhodné soli. Vynález všechny tato provedení zahrnuje.

Pokud je sloučenina podle vynálezu substituovaná zásaditou skupinou, připravuje se adiční sůl s kyselinou, která je jednoduchou a běžnější formou pro použití. V praxi je častější použití soli než volné zásady. Kyselinou, které se může používat pro přípravu adiění soli s kyselinou, je s výhodou kyselina, která s volnou zásadou vytváří farmaceuticky vhodnou sůl, tedy sůl, jejíž aniont je pro pacienta netoxický ve farmaceutické dávce soli, takže příznivě inhibuje jev agregace destiček a vytváření thrombu jako volná zásada a nemá vedlejší vlivy, které by se připisovaly aniontu. Jakkoliv se dává přednost farmaceuticky vhodným solím volných zásad, jsou všechny adiční soli s kyselinou užitečné jako forma volné zásady, pokud je určitá sůl, jako taková žádoucí toliko jako meziprodukt, například, když se sůl připravuje pouze pro účely čištění a identifikace, nebo jestliže se jí používá jakožto meziproduktu pro přípravu farmaceuticky vhodné soli při iontové výměně.

f

Farmaceuticky vhodné soli, které spadají do rozsahu vynálezu, se příkladně odvozují od kyslin ze souboru, který zahrnuje minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, sírová, ·« « ·♦ · ·· ·» ···· * * * ♦··> • · · # · · * · * · · • 9 · > · ····♦· ··· ··· ·«··<* · · fosforečná a sulfamová a organické kyseliny, jako je kyselina octová, citrónová, mléčná, vinná, malonová, methansulfonová, ethansulfonová, benzensulfonová, p-toluensulfonová, cyklohexylsulfamová a chinová kyselina. Jakožto odpovídající adiční soli s kyselinou se uvádějí hydroha1ogeniny, například hydrochlorid a hydrobromid, sulfát, nitrát, sulfamát, acetát, citrát, laktát, vinan, malonát, methansulfonát, ethansu1fonát, benzensu1fonát, p-toluensulfonát, cyklohexylsulfamát a chinát.

Adiční soli s kyselinou sloučenin podle vynálezu se mohou připravovat reakcí volné zásady se vhodnou kyselinou o sobě známými nebo upravenými způsoby. Například se adiční sůl s kyselinou sloučenin podle vynálezu může připravovat rozpuštěním volné zásady ve vodně alkoholickém roztoku nebo v jiném vhodném rozpouštědle obsahujícím vhodnou kyselinu a izolací soli odpařením roztoku nebo reakcí volné zásady a kyseliny v organickém rozpouštědle, přičemž se sůl přímo oddělí nebo se může získat zahuštěním roztoku.

Volné sloučeniny podle vynálezu se mohou regenerovat ze solí použitím nebo přizpůsobením o sobě známých způsobů. Například se mateřské sloučeniny podle vynálezu mohou regenerovat ze svých adičních solí s kyselinou zpracování alkálií, například vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného nebo vodným amoniakálním roztokem.

Pokud je sloučenina podle vynálezu substituovaná kyselou skupinou, připravuje se adiční sůl se zásadou, která je jednoduchou a běžnější formou pro použití. V praxi je častější použití soli než volné kyseliny. Zásadou, které se může používat pro přípravu adiční soli se zásadou je s výhodou zásada, která s volnou kyselinou vytváří farmaceuticky vhodnou sůl, tedy sůl, jejíž kaniont je pro pacienta netoxický ve farmaceutické dávce soli, takže příznivě inhibuje jev agregace destiček a vytváření thrombu jako volná zásada a nemá vedlejší vlivy, • · '«] · · ·

9 9 9 9 · 9 9 «· · · · · ^ύ ♦ • 9 · 9 · «··»»· «» « · 9 9 9

99 9 9 9 9 *e

I 9 » · • · 9 které by se připisovaly kaniontu. Farmaceuticky vhodné soli zahrnují například soli s alkalickými kovy a s kovy alkalických zemin. Farmaceuticky vhodné soli, které spadají do rozsahu vynálezu, jsou soli odvozené příkladně od následujících zásad: hydrid sodný, hydroxid sodný, hydroxid draselný, hydroxid vápenatý, hydroxid hlinitý, hydroxid lithný, hydroxid hořečnatý, hydroxid zinečnatý, amonium, ethylendiamin, N-methy1glukamin, lysin, arginin, ornithin, cholin, N,N’-dibenzylethylendiamin, chlorprocain, diethanolamin, procain, N-benzylfenethylamin, diethylamin, piperazin, tris(hydroxymethy1)aminomethan a tet ráme t hy1amon i umhydroxid.

Kovové soli sloučenin podle vynálezu se mohou připravovat reakcí sloučeniny ve formě volné kyseliny se zásadou ze souboru zahrnujícího například hydrid, hydroxid, uhličitan a podobnou reaktivní sloučeninu zvoleného kovu o sobě známými nebo upravenými způsoby ve vodném nebo v organickém rozpouštědle. Vodným používaným rozpouštědlem může být voda nebo směs vody a organického rozpouštědla, s výhodou alkoholu, například methanolu nebo ethanolu, ketonu, například acetonu, alifatického etheru, například tetrahydrofuranu nebo esteru, například ethylacetátu. Takové reakce se zpravidla provádějí při teplotě místnosti, mohou se však provádět také za zahřívání.

Aminové soli sloučenin podle vynálezu se mohou připravovat reakcí sloučeniny ve formě volné kyseliny s aminem ve vodném nebo v organickém rozpouštědle. Vodným používaným rozpouštědlem může být voda nebo směs vody a organického rozpouštědla, s výhodou alkoholu, například methanolu nebo ethanolu, etheru, například tetrahydrofuranu nebo nitrilu, například acetonitrilu nebo ketonu, například acetonu. Amoniové soli sloučenin ve formě kyseliny se mohou připravovat podobným způsobem.

solí

Volné s použ i t í m loučeniny podle vynálezu se nebo přizpůsobením o sobě mohou regenerovat ze známých způsobů. Na25 ·· » ·· <► ·» ·· ί · «· · · · * · » · • C · · · · · 9 9 9 ·

9 9 9 · 9 9999 · ··· ··· ♦ >···· ·· *· »·· ·· · ·· ♦* příklad se mateřské sloučeniny podle vynálezu mohou regenerovat ze svých adičních solí se zásadou zpracováním kyselinou, například kyselinou chlorovodíkovou.

Jakkoliv jsou užitečné aktivní sloučeniny podle vynálezu jako takové, jsou soli sloučenin podle vynálezu užitečné pro účely čištění připravovaných sloučenin, za využívání například rozdílné rozpustnosti solí a mateřské sloučeniny, vedlejších produktů a/nebo výchozích látek osobě známými způsob pro pracovníky v oborou.

Sloučeniny podle vynálezu mohou obsahovat asymetrická centra. Tato asymetrická centra mohou být na sobě nezávisle v R nebo v S konfiguraci. Pracovníkům v oboru je zřejmé, že určité sloučeniny obecného vzorce I mohou vykazovat geometrický isomerismus. Geometrické isomery zahrnují cis a trans formy sloučenin podle vynálezu majících alkenylové podíly. Vynález zahrnuje individuální geometrické isomery a stereoisomery a jejich směs i.

Takové isomery se mohou oddělovat ze směsí použitím nebo přizpůsobením o sobě známých způsobů, jako jsou například chromatografické způsoby a překrystalovávání nebo se mohou připravovat odděleně ze vhodných isomerů nebo z jejich meziproduktů, například použitím nebo přizpůsobením shora popsaných způsobů.

Americké přihlášky vynálezu číslo 08/138 820 a 08/476 750 popisují způsoby přípravy amorfní sloučeniny obecného vzorce II a zvláště amorfní sloučeniny obecného vzorce I.

Nový způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce II a f

zvláště krystalické sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu objasňuje schéma II, přičemž B, E¹, E², G, R, m, nap mají shora uvedený význam a P¹ znamená při hydrogenaci labilní sku26 ·· 9 ► · * ► * · ·· * · · • » · pinu chránící kyselinovou skupinu, například skupinu benzylovou, P² labilní skupinu chránící aminoskupinu, například skupinu terč.-butoxykarbonylovou (BOC) a P³ při hydrogenaci labilní skupinu chránící aminoskupinu, například skupinu benzyloxykarbonylovou (CBZ.

Schéma II

O

P²-N-(CH₂)_p—COH i

B

O ,

II ⁺ h₂n-ch-coh ch₂co₂p¹ kopulační činidlo

P²-N-(CH₂)p B

TFA HN—(CH₂)pi

B

P²-N— (CH₂)_p kopulační činidlot

E² O

I I ii N—CH-C-G ch₂co₂p¹

TFA

O

1L

-omJÍ

HN—CH I kopulační činidlo p3· ,z

N*

O

II ¹¹ —^-HN—CH-CO₂H CH₂CO₂P¹

E¹ E² O I I ii -Ň-CH—C — G

CH₂CO₂P¹ I—(?^ίΗ>²) p3

NO

II

-(ch₂-|~c-oh

- o O E¹ E² O

ÍCH₂A—C—N—(CH₂)_p—IL-hn—CH——N-CH-C—G ' 'n i | ³ CH₂CO₂P¹ hydrogenace (např.plynná nebo chemickým přenosem ,fer)

RZ

L O O O E¹ E² O

-f-CHd—C—N— (CH₂)_p—1L_HN_CH—Π-Ň-Óh-C —G ' 'n ' I ^B CHoCOoH >

• » «· · « · 99 9 · « *

0 9 9 9 ' » · 9 ·· *·· tf

9 99

9 9

9 ·

999 999

V průběhu přípravy sloučenin obecného vzorce I nebo jejich meziproduktů může být žádoucí nebo nutné předcházet sesítující reakci mezi chemicky aktivními substituenty na přírodně se vyskytujících aminokyselinách nebo pseudoaminokyse1inách. Takové substituenty se mohou chránit o sobe známými chránícími skupinami, které se následně mohou odstraňovat nebo se mohou popřípadě ponechávat za použití o sobě známých způsobů k dosažení žádaného produktu nebo meziproduktu (například T.H. Green Protective Groups in Organic Synthesis, Walley New York, 1981) Selektivní zavádění a odstraňování chránící skupiny mohou být rovněž nutné nebo žádoucí k předcházení konverze nebo odstranění existujících substituentů nebo k umožnění následující reakce k dosažení žádaného produktu.

Způsob podle schéma II je příkladným způspobem přípravy sloučeniny obecného vzorce II, připomíná se však, že se sloučenina obecného vzorce I může rovněž tímto způsobem připravit za použití vhodných výchozích látek. Při přípravě sloučeniny obecného vzorce I způsobem podle schéma II znamená B skupinu ethylovou, E¹ atom vodíku, E² cyk1ohexylmethy1ovou skupinu, G aminoskupinu, R atom vodíku, m číslo 3, n číslo 3, p číslo 1, P¹ skupinu benzylovou, P² skupinu terč.-butoxykarbonylovou (BOC) a P³ skupinu benzyloxykarbonylovou (CBZ).

Alternativně se sloučenina obecného vzorce I způsobem podle vynálezu připravuje stejně jako podle schéma II s tou výjinkou, že se se použije sloučeniny obecného vzorce III _P3

OH (ΠΙ) kde má P³ vzorce IV shora uvedený význam, místo sloučeniny obecného • · · ·

(IV) kde znamená R atom vodíku, m číslo 3, n P³ znamená skupinu benzyloxykarbonylovou ziproduktu obecného vzorce V

HN·· ·♦ * · • · · · • · · · • · · * β · • · • · » · číslo 3 a p číslo (CBZ), za získání

O •oh-IL

I

E¹

I •NE² O I II •CH-C—G ch₂co₂p¹ a

me(V) kde znamená B ethylovou skupinu, E¹ atom vodíku, E² cyklohexylmethylovou skupinu, G aminoskupinu, o 1, P¹ benzylovou skupinu a P³ skupinu benzy1oxykarbonylovou (CBZ).

Způsob podle schéma II je pětistupňový způsob přípravy sloučenin podle vynálezu začínající vytvářením centrálního dipeptidového meziproduktu podle vynálezu obecného vzorce VI

Ώ

HN—CH—CO₂H j I .

B CH2CO2P¹ (ví) kde B, p, P¹ a P² mají shora uvedený význam. V případě přípravy sloučeniny obecného vzorce I je centrálním dipeptidovým meziproduktem podle vynálezu BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-OH. Centrální dipeptidový meziprodukt se připravuje bez chránění volného karboxylového kyselinového podílu.

Ve stupni 2 podle schéma II se může provádět kopulace za získání centrálního dipeptidu bud v dichlormethanu nebo v ethylacetátu v přítomnosti nebo v nepřítomnosti tetrahydrofuranu jakožto korozpouštědla a v přítomnosti organické zásady, «· * například N-methylmorfolinu, přičemž se reakce provádí přibližně za teploty místnosti až přibližně za teploty 40 ’C. Aktivace aminokyseliny nebo pseudoaminokyse1iny obecného vzorce

O

P²-N-(CH₂)_p- COH B kde B, P² a p mají shora uvedený význam, pro kopulaci se může provádět za použití neizolovaných aktivních esterů p-nitrofenolem, pantafluorfenolem a N-hydroxysukcinimidem přes dicyklohexylkarbodi imid . Doba kopulace je 1 až 20 hodin v závislosti na použitých aminokyse1iných nebo pseudoaminokyse1inách, které se mají kopulovat, na aktivačním činidle, na rozpouštědle a na teplotě. Centrální dipeptid jakožto produkt stupně 1 se neizoluje. Reakční směs se ve stupni 1 zpravidla promývá vodou nebo zředěnou vodnou kyselinou (například vodnou kyselinou chlorovodíkovou) a používá se přímo bez sušení ve stupni 2. V případě, kdy se použije aktivních esterů na fenolové bázi, extrahuje se centrální peptid do alkalického vodého prostředí z reakční směsi a posléze se reextrahuje po okyselení vodného roztoku zpět do organického rozpouštědla; roztok se nechává přímo reagovat jako ve stupni 2.

Dipeptidového meziproduktu obecného vzorce VI se používá pro přípravu tripeptidového meziproduktu obecného vzorce VII

P²-N—

Ž o

-1L u ΜΗΝ—CH I

-NE² O I II CH—C—G

CH₂CO₂P¹ (Vil) kde Β, E¹, E², F, G, P¹ a p mají shora uvedený význam a kde znamená P²’ skupinu P² nebo skupinu TFA.H-. Jestliže P²’ znamená skupinu TFA.H- , znamená symbol ”. disociaci trifluoroc99 9 99 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 ·9 9

9 999 9 999 99 9

9 9 ··

9 99 99

- 30 • 9 • 9 ' i f

tové kyseliny (TFA) na FsCCCU-a H⁺ , přičemž H+ protonuje koncový amin ve sloučenině obecného vzorce VII, to je vytvoření trif1uoracetátové soli obecného vzorce Vila

CF3CO2

H2N— (CH₂)_r B

HN—CH—“—N1

CH₂CO₂P¹

E² O I II CH—C—G (Vila)

V případě přípravy sloučeniny obecného vzorce I je tripeptidovým meziproduktem podle vynálezu P²⁵-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2.

Ve stupni 2 se kopulace aminokyseliny nebo pseudoaminokyseliny na centrální dipeptid může provádět bud v dichlormethanu nebo ve směsi ethylacetátu a dimethy1formamidu nebo tetrahydrofuranu přibližně za teploty místnosti nebo za nižší teploty než je teplota místnosti. Aktivace centrálního dipeptidu obecného vzorce p2._N-(CH2)|

I

B fi

HN—CH-CO2H ch₂co₂p¹ kde mají B, P¹, P² a p shora uvedený význam, pro kopulaci se může provádět za použití neizolovaných aktivních esterů pentafluorfenolu nebo N-hydroxysukcinimidu prostřednictvím dicyklohexylkarbodiimidu. Aktivace se také může provádět za použití isopropylchlorformátu. Doba kopulace je 1 až 20 hodin v závislosti na použitých aminokyselinách nebo pseudoaminokyse1inách, které se mají kopulovat, na aktivačním činidle, na rozpouštědle a na teplotě. Tripeptid jakožto produkt se neizoluje. Když se tripeptid neizoluje, promývá se reakční směs vodnou organickou zásadou například vodným roztokem N-methylmorfolinu a vodnou kyselinou (například vodnou kyselinou chlorovodíkovou)

ΑΑ · • A

AAA

A AAA

AAA

AA A ·· • A

A A

A A A A

A AAA A

A A

a nechává se reagovat ve stavu v jakém je ve stupni 3 po promytí vodou a bez sušení.

Ve stupni 3 podle schéma II se odstraňuje chránící skupina, například skupina BOC z tripeptidu, získaného ve stupni 2, například použitím roztoku trifluoroctové kyseliny v dichlormethanu nebo použitím směsi bromovodíku v kyselině octové a v ethylacetátu. Reakce se může provádět přibližně za teploty místnosti a vyžaduje přibližně jednu hodinu (v případě způsobu založeného na použití bromovodíku) a přibližně dvě hodiny (v případě způsobu založeného na použití trifluoroctové kyseliny). Sůl kyseliny produkovaného tripeptidu se izoluje odfiltrováním krystalické pevné látky bud přímo z reakční směsi (v případě způsobu založeného na použití bromovodíku) nebo po částečném odstranění rozpouštědla destilací a přidáním nepolárního rozpouštědla do zbytku.

Další způsob podle vynálezu je charakterizován jako jeden řetězený způsob rychlé a jednoduché přípravy TFA.H-N(Et)Gly(L)-Asp-(OBzl)-(L)-Cha-NH₂ z BOC-N(Et)Gly-OH, přičemž jde o reakci v jedné nádobě zahrnující první dva kopulační stupně podle schéma II a zpracování trifluoroctovou kyselinou, Jedinečně se získá TFA.HN(Et)Gly-(L)-Asp-(OBz1)-(L)-Cha-NH2, jelikož přímo vykrystaluje z roztoku řetězové reakce. Tento řetězový způsob vylučuje tři odpovídající oddělené reakční stupně podle schéma 2 a řeší problém přípravy jednoduchým způsobem šetřícím čas a náklady, výhodným pro živodní prostředí.

Schéma II znázorňuje konstrukci polypeptidu v obráceném pořádku, přičemž vychází z aminokyseliny, chráněné na atomu dusíku, a postupně se přidává na karboxylové zakončení na rozdíl od obvyklého pořádku, kdy se polypeptid kontruuje postupnou amidací na amonovém zakončení aminokyseliny s chráněným C-zakončením. Obrácený způsob syntézy podle vynálezu vyžaduje chránění atomu dusíku pouze na první aminokyselině za umožnění

-.

·· ♦ • * použití od tohoto bodu dopředu směřující postupné aminokyseliny bez chránící skupiny na bud aminovém nebo kyselinovém zakončení (s výjimkou funkčních skupin postrannícho řetězce). 0brácený způsob syntézy také racionalizuje výrobu sloučenin obecného vzorce II a zvláště sloučenin obecného vzorce I tím, že umožňuje použít kontinuálního způsobu výroby na rozdíl od přetržitého způsobu normálního pro peptidovou chemii v rpztokové fázi. Nový přístup snižuje náklady odstraněním opatřování aminokyselin chráněných na aminovém zakončení. Není zapotřebí žádných speciálních zařízení, reakčních činidel nebo analytických metod.

Jiným způsobem podle vynálezu je reprodukovatelný způsob přípravy nehygroskopické stálé krystalické formy N-[N-[N-(4(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-pcyklohexylalaninamidu novou konverzí v pevném stavu z hygroskopické krystalická formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl3-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu, připravené způsobem podle schéma II a uváděný jako alternativní reakční stupně.

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4y1)butanoy1]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-fi-cyklohexyla laninamidu je fyzikálně nestálá a převádí se působením vlhkosti a teploty na vysoce stálou nehygroskopickou krystalickou formu N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]—(L)— asparagyl]-(L)-fi-cyklohexylalaninamidu.

Obecné podmínky podle vynálezu pro konverzi z hygroskopická krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl] N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu na vysoce stálou nehygroskopickou krystalickou formu N-[N-[N-(4f (piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]—(L)—p— cyklohexylaíaninamidu se ovlivňují za statických a dynamických podmínek.

4 4· 4 · 44 444

4 4 4 4 4 4

4444 4444

4 4 4 4 4

444 44 4 ·· • 4 4 4 • · 4 ·

444 ·44 ·

Statický způsob podle vynálezu je popisován jako statická konverze, jelikož zahrnuje vystavení hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)~3-cyklohexylalaninamidu v nepohybující se nádobě, jako jsou lékovky nebo mísy za určitých podmínek působení teploty a vlhkosti v komoře seřízeným prostředím. Tato statická konverze se provádí za teploty přibližně 20 až přibližně 80 C, výhodněji za teploty přibližně 40 až přibližně 80 ’C a za realtivní vlhkosti přibližně 40% až 100%, s výhodou 65% až 80%.

Dynamický způsob podle vynálezu je popisován jako dynamická konverze, jelikož zahrnuje vystavení hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu inkubací za podmínek teploty a vlhkosti jako v případě statického modelu avšak za míchání včetně převracení hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycy1]-(L)asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu v rotační odpařovací baňce nebo ve válcové nádobě (ve vlhkostní pícce) s lopatkovým mícháním.

Následující příklad praktického provedení vynález blíže objasňují, nijak však vynález neomezují. Procenta a díly jsou míněny hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Pokud není uvedeno jinak míní se hodnotami hmotové spektrální analýzy výsledky nízko rozlišujícího bombardování rychlým atomem prováděného na zařízení VG 70SE s vypočtenými hodnotami (M+H)⁺. Hodnoty nukleárních rezonančních magnetických spekter jsou získány na zařízení Brucker ACF 300 v D2O. Blesková chromatografie se provádí na silikagelu. Vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC ) se provádí na C-18 reversních fázových sloupcích s částicemi o velikosti 8 až 15 pm.

« · · · 0 · · · 0 0 · • · · · · · ···♦ · ··· ♦·· 9 0 · · 9 · · ·

Pokud není uvedeno jinak jsou obrazce práškové rentgenové difrakce získány za použití difraktometru Siemens D5OOO s měděným zdrojem záření (1,8 kW, 45 kV a 40 mA). Vzorky se před měřením melou k eliminaci vlivu velikosti částic produktu na píkové intenzity. Přibližně 60 mg vzorku se vnáší do držáku vzorku 1,5 x 1 cm a odečítání se rpovádí v oboru 4 až 40° 2 theta (2 Θ) se stupněm 0,04° a při celkové expozici jedna sekuna na stupeň.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava B0C-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-0H (Stupeň 1, schéma II)

Do 3-hrdlé baňky s kulatým dnem se předloží 51 g (0,25 mol) BOC-N(Et)Gly-OH, 35 g (0,25 mol) PNP, 400 ml ethylacetátu a 100 ml dimethylformamidu. Směs se míchá do rozpuštění a ochladí se na teplotu 4 až 6 “C. Během 10 minut se přikape roztok 51,5 g (0,25 mol) dicyklohexylkarbodiimidu ve 125 ml ethylacetátu, přičemž se teplota udržuje na 5 C až přibližně 8 ’C. Když byl přidán veškerý dicyklohexylkarbodiimid, odstraní se chladicí lázeň a směs se míchá 1,5 hodiny, přičemž se zahřeje na teplotu místnosti (20 až 22 °C). Vytvoří se pevná sraženina DCU. Vytvoření esteru PNP se zjistí analytickou chromatografií HPLC (vymizení BOC-N(Et)Gly-OH). Reakční směs se zfiltruje a zbytek DCU se promyje 2 až 50 ml dávkami ethylacetátu a promývací kapalina se přidá k filtrátu. DCU se vyhodí .

Do míchaného zfi 11rovaného roztoku se přidá 67 g (0,3 f

mol) H2N-(L)-Asp(OBz)-0H v podobě suspense ve 150 ml (138 g, 1,36 mol) NMM. Směs se zahřeje na teplotu 38 až 40 °C a udržuje se na teplotě po dobu 41 hodin, což je doba, při které

44

4 4 4 4 4 4

444 4 44 4

444444 444 ···

4 4 4 4

4 44 44

9· 4 analytická HPLC ukáže úplné spotřebování BOC-N(Et)Gly-OPNP. Reakční směs se ochladí na teplotu 25 C a nezreagovaný H2N(L)-Asp(OBz)-OH se odfiltruje. Roztok se ochladí a znovu zfiltruje, čímž se získá dalších 1,2 g (21,7 g; 11,2 g představuje přidaný 20% přebytek a 10,5 g (0,047 mol) představuje nezreagovaný materiál).

Zfiltrovaný roztok se extrahuje ve 2 1 nálevce Squibb jedním dílem 500 ml deionizované vody, následované dvěma 250 ml dávkami. Spojený vodný roztok se extrahuje třemi 300 ml podíly roztoku 1:1 MTBE/EtOAc k odstranění zbývajícího PNP (analytická HPLC ukazuje pouze zbývající stopy), ochladí se na 5 °C a okyselí se z pH 8,9 na hodnotu pH 1,79 přikapáním 150 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Okyselený vodný roztok nevykazuje žádný žádaný produkt. Ethylacetátové extrakty se spojí, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltrují se a zkoncentrují se na rotační odparce při teplotě 35 °C. Výsledný bleděoranžový olej se přečerpá při teplotě 35 °C k maximálnímu odstranění zbylého rozpouštědla a k získání 85,68 g BOC-N(Et)-Gly-(L)Asp(0Bz)-0H v podobě oleje (21,3 mmol, 85,5% výtěžek nekorigovaný o zbylé rozpouštědlo).

Charakteristika:

NMR (250 Hz): 7,3 ppm (s), 5,1 ppm (s), 3,3 ppm (dq), 3,0 (dq), 1,4 ppm (s), 1,1 (t)

MS:M = 408; M+l = 409 nelezeno

HPLC: 9O,79A% (3,87A% ρ-nitrofeno1, neokorigováno na e)

Analysa: C20H28N207,

Η, N; C nalezeno 57,54, vypočteno 58,81

Příklad 2

Příprava B0C-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Stupeň 2 podle schéma II)

Způsob A: Isopropylchlorformátový způsob ·· · ·* ·· • · · · · · · • · · · ···· • ····*· ·· · · · · • · · · ♦

- .

• ·

Jeden ekvivalent BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-0H se rozpustí v ethylacetátu (6 až 8 objemů; 1:6,5 hmotnost/objem) a udržuje se na teplotě -15 až 0 °C. Přidá se NMM (1 ekvivalent) při udržování na teplotě -15 až asi 0 ’C. Do chráněného isopeptidového roztoku se při teplotě -15 až O ° přidá isopropylchlorformát (1 až 1,1 ekvivalent). Reakční směs se udržuje na teplotě -15 až asi 0 °C po dobu 2 až 5 minut. Do studeného dipeptidového roztoku, udržovaného na teplotě -15 až asi O ’C, se přidá roztok H2N-(L)-Cha-NH2 (1 ekvivalent) v THF (10 objemů; 1:10 hmotnost/objem). Reakce se sleduje kontrolními vzorky (HPLC) po 15 minutách, po jedné hodině a dvou 2 hodinách k hodnocení úplnosti reakce. (Reakce je ukončena, když množství pozorovaného peptidu je menší než 10 % na plochu analysou HPLC).

BOC-tripeptidový produkt se vysráží přímo z reakčního roztoku a z reakční směsi se odfiltruje, promyje se ethylacetát (2x,l objem; hmotnost/objem) a vysuší se ve vakuu. Obvyklý výtěžek je >60 % teorie, o čistotě >9OA%;<1A% epimerického diastereomeru asparagové kyseliny.

Novým suspendováním v ethylacetátu se získá konečný výtěžek přibližné 60 % teorie BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-ChaNH2 se zlepšenou čistotou >95A% při snížení obsahu diastereoisomeru na <0,5 %.

Specifický příklad isopropylchlorformátové metody, při zachování obecného postupu podle způsobu A a za použití 4,55 g (8,1 mmol) BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-0H poskytuje množství připraveného BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-(L)-Cha-NH2 3,26 g (97,9 A% čistého 0,3A% diastereomeru) při 70% teoretickém výtěžku .

f

Způsob B : Způsob za použití komplexu pentafluorofenoldicyklohexylkarbodiimidu ·· · • · ·· ··

I · · 4 » · · 4 ·· · ··4 • 4 ·· ··

V ethylacetátu se rozpustí pentafluorofenol (PFP, 2,9 ekvivalentu) a dicyklohexylkarbodiimidu (1 ekvivalent) (5 objemů, 1:5 hm/obj) při teplotě místnosti a ochladí se na teplotu -15 až 0’C. V ethylacetátu (6 objemů, 1:6 hm/obj) se rozpustí jeden ekvivalent BOC-N(Et)-Gly-(L)-Asp(OBz)-OH a smísí se s jedním ekvivalentem H2N-(L)-Cha-NH2, který byl předem rozpuštěn v dimethylformamidu (10 obj., 1:10 hm/obj). Do roztoku PFP a dicyklohexylkarbodiimidu se přikape roztok dipeptid/H2N(L)-Cha-NH2 a teplota se udržuje -15 až 0 ’C. Po dobu 5 až šestnáct hodin se reakční směs udržuje na teplotě 15 až 22 C a kontrolní vzorky (HPLC) se odebírají po 1, 2, 3, 4, a 16 hodinách k hodnocení úplnosti proběhnutí reakce. (Reakce je ukončena, když množství pozorovaného dipeptidu je menší než 2 % na plochu analysou HPLC).

Reakční směs se zfiltruje a filtrační koláč (DCU) se promyje ethylacetátem (2x 0,5 objemů, hm/obj). Filtrát se zpracuje vodou, (10 obj, 1:10 hm/obj) a vodná vrstva se odstraní. Vrstva ethylacetátová se promyje vodou (lx, 5 objemů, 1:5 hm/ obj). Vrstva ethylacetátová se ochladí k vysrážení produktu, který se promyje ethylacetátem (2x 0,4 objemy; 1:0,4 hm/obj). Izolované molární zisky jsou >60 % v obvyklé čistotě >90A%, s 1-4A % epimerního diastereomerů asparagové kyseliny.

Novým suspendováním v ethylacetátu se získá konečný výtěžek přibližné 60 % teorie BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-ChaNH2 se zlepšenou čistotou >99A% při redukci diastereoisomeru na <0,5 %.

Specifický příklad způsobu za použití pentafluorofenoldicyklohexylkarbodiimidu komplexu při zachování obecného postupu podle způsobu B a za použití 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)Gly(L)-Asp(OBz1)-OH poskytuje množství připraveného BOC-N(Et)Gly(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 8,15 g (99 A% čistého, O,49A % diastereomeru) při 59% teoretickém výtěžku.

-?

• · ···· ·· *·

I · · · » · · · ·· · ··· • · ·· ··

Způsob C: Způsob založený na použití systému hydroxybenzotriazol (HOBT)/2-(lH-benzotriazol-l-y1-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborát (TBTU)

V dimethylformamidu se rozpustí jeden ekvivalent BOCN(Et)-Gly-(L)-sp(OBzl)-OH (9 až 10 objemů; 1:10 hm/obj) a udržuje se na teplotě místnosti. Do tohoto roztoku se přidá IÍ2 N-(L)-Cha-NHž , (jeden ekvivalent) a hydroxybenzotr iazol (HOBT, 1 ekvivalent). Výsledný roztok se ochladí na přibližně O až 10 °C a přidá se NMM (1 až 1,1 ekvivalent). Kopulační činidlo, TBTU (1—1,1 ekvivalent) se rozpustí v dimethylformamidu (4-5 objemů, 1:5 hm/obj) a přidá se do roztoku chráněného dipeptidu při teplotě přibližně O až 10 °C. Tento roztok se míchá přibližně 3 hodiny při teplotě přibližně 10 °C až přibližně 25 °C, dokud HPLC neukáže ukončení reakce (méně než 2 % výchozího materiálu na plochu). Do míchané směsi 5% vodného roztoku chloridu sodného (přibližně 4 objemy na reakční objem) se přidá reakční směs a ethylacetát (přibližně 2 objemy na reakční objem). Fáze se oddělí a vodná fáze se extrahuje další dávkou ethylacetátu (přibližně 1,5 objemů na reakční objem). Organické fáze se spojí a promyjí se postupně 0,5 N vodným roztokem kyseliny citrónové (přibližně 0,6 až 0,7 objemů na objem organické fáze), 10% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (dvakrát, přibližně 0,6 až 0,7 objemů na objem organické fáze) a 25% roztokem chloridu sodného (přibližně 0,3 až 0,4 objemů na objem organické fáze). Výsledná organická fáze se zkoncentruje na přibližně čtvrtinu až polovinu objemu za sníženého tlaku při teplotě přibližně 30 až 50 °C a do tohoto teplého roztoku se přidá stejný objem heptanu. Směs se míchá a ochladí se na teplotu O ° až přibližně 20 “C k vysrážení žádaného tripeptidu. Tato pevná látka se odfiltruje a smísí se s ethylacetát a heptanem a vysuší se. Obvyklý výtěžek je >60 % f

teorie s obvyklou čistotou >95,7A % epimerního diasteromeru asparagové kyseliny <2A %.

• · ···· ·· — · * · • · ·· ·· • · · · • · · · ··· ··· ·· ··

Jako specifický příklad způsobu založeného na použití systému HOBT/TBTU, při sledování obecného způsobu C, se použije 10 g (24,5 mmol) BOC-N(Et)-Gly-(L)-Asp(OBz1)-0H a pak se připraví 9,3 g BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp-(OBz1)-(L)-Cha-NH2 při teoretickém výtěžku 67,7% (96,IA % čistého, 1,77A % diastereomeru při Asp).

Hmotové spektrum: M 560,7 vypočteno; M+l 561 nalezeno teplota tání 182,17 °C (DSC) ¹ HNMR (delta vs TMS,D6 DMSO); (dt,2H), 1,15 (m,2H), 1,06 až 1,74 (m,6H), 2,65 (m,lH), (d,2H),4,2 (S,1H), 4,66 (d,lH (d,lH), 7,36 (s,5H), 7,88 (dd

0,89 (m, 1H), 0,94 (m, 1H), 1,0

1,3 (m,4H), 1,36 (d,9H), 1,4 až

2,85 m(lH), 3,18 (m,2H), 3,75 , 5,08 (s,2H), 7,02 (s,lH), 7,18 1H), 8,24 (dd,lH).

Příklad 3

Příprava TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NHz (Stupeň 3, schéma II)

V dichlormethanu (hmotnostně přibližně 1:12) se rozpustí BOC-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-(L)-Cha-NH2 a při teplotě místnosti se do roztoku přidá TFA. Roztok se míchá, dokud HPLC neukáže ukončení reakce (tři až pět hodin). Roztok se zkoncentruje na přibližně polovinu objemu při teplotě 40 až 45 ’C. Do tohoto teplého roztoku se při udržování teploty >40 ’C přidá MTBE (přibližně 1:10 hm/obj. proti B0C-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-(L)Cha-NH2). Směs se ochladí pomalu na teplotu přibližně 5 °C a míchá se jednu hodinu k zajištění úplné krystalizace. Výsledná pevná látka se odfiltruje a ochladí se MTBE. Pevná látka se vysuší za sníženého tlaku a analyzuje se ke zjištění obsahu TFA.N(Et)G1y-(L)-Asp(OBz1)-(L)-Cha-NH2 (test HPLC hm/hm). Výtěžek je obecně téměř kvantitativní, čistota >95A %.

f

Hmotové spektrum: M 460 (volná zásada) vypočteno; M+l 461 nalezeno

Analysa: C26H37N4O7F3 N,H,F, C 54,35 vypočteno 53,82 nalezeno ·

9999 9 99 9 • 9 9 · 9 99 9

9999 99 99 999 99 99 *HNMR (m, 1H) (s, 2H) (s, 1H) (delta vs TMS,D⁶ DMSO) : 0,9 (m, 2H) , 1,16 (t,6H), 1,5 , 1,5 až 1,8 (m,6H), 2,65 (dd,lH), 2,9 (m,3H), 3,7 , 3,9 (m,2H), 4,2 (m,lH), 4,75 (m,lH), 5,1 (s,2H), 7,0 , 7,15 (s,lH), 7,2 (s,5H), 8,13 (d,lH), 8,7 až 8,8 (m,3H) ¹³CNMR(vyčnívájící signály, delta vs 25,49, 25,68, 25,96, 31,66, 33,07, 41,88, 47,02, 49,40, 50,47, 65,71, 165,10, 169,34, 173,79

TMS, D6 DMSO): 33,36, 36,25,

127,81-128,34,

10,76, 38,59,

135,82,

Specifické příklady odstraňování chránící skupiny jsou v tabulce A.

Tabulka A

Lab

Příklad

Množství reakční škály (BOC-N(Et)Gly-(L) -Asp(OBsl) (L)-Cha-NHs)

Výtěžek a čistota A% (TFA.N(Et)Gly(L)-Asp(OBzl)- (L)-Cha-NHs)

7, 5 g (13,3 mmol)

6,53 g (11,6 mmol)

7,4 g (12,9 mmol) 97% výtěžek 98,8 A% čistý

6,4 (11,1 mmol) 97% výtěžek 98,47A% čistý

Příklad 4

Příprava CBZ-PipBu-N(Et)G1y-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NHs (Stupeň 4, schéma II)

Připraví se suspense přibližně ekvimolárních množství (TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBsl)-(L)-Cha-NHs, CBZ-PipBu a TBTU v systému ethylacetát,dimethylformamidu a voda (objemově 100= 8 = 4, přibližně 114 obj/hm proti TFA.N(Et)G1y-(L)-Asp(OBsl)41..9 · · · » · (L)-Cha-NH2. Tato suspense se ochladí na teplotu 0 až 10 “C a přidají se přibližně 3 až 4 ekvivalenty NMM. Směs se nechá ohřát na teplotu místnosti, a míchá se tak dlouho až je podle HPLC reakce ukončena (jednu až tři hodiny, během té doby se objeví roztok). Přidá se voda (2 až 3 X původního přidaného množství) a fáze se nechají oddělit. Vodná fáze se uchová a organická fáze se promyje dvěma dalšími dávkami vody. Tyto spojené vodné promývací kapaliny se zpětně extrahují ethylacetátem a spojené organické fáze se promyjí 25% vodným roztokem chloridu sodného. Organická fáze se zkoncentruje za sníženého tlaku na přibližně polovinu objemu a přidá se MTBE (objemově přibližně polovina vůči objemu roztoku). Směs se nechá vykrystalovat (několik hodin) a pevná látka se vysuší za sníženého tlaku. Obsah CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-(L)-ChaNH2 se analyzuje HPLC, test hmotnost/hmotnost. Výtěžek je zpravidla >80 % teorie, čistota >95A %.

Specifický příklad přípravy při zachování obecného postupu stupně 4, poskytuje 7,25 g TFA.N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)Cha-NH2 7,9 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBz1)-(L)-Cha-NH2 (>99A % čistého 0,08A% diastereomeru při Asp), teoretický výtěžek 84 % teorie.

Hmotové spektrum: M 747 vypočteno ; M+l 748 nalezeno

Analysa: C4iHs7NsOs H,N,C 65,84 vypočteno 65,38 nalezeno teplota tání 101,6 C (DSC) ¹ HNMR (delta vs TMS,CDC1₃): 0,88 (m, IH), 0,98 (m,lH) 1,13 (2H), 1,23 (m,6H), 1,4 (m,lH), 1,62 až 1,76 (m,8H), 1,86 (qd,lH), 2,35 (t,lH), 2,74 (dd,2H), 3,25 (dd,lH), 3,47 (q,2H), 3,7 (d,lH), 3,84 (d,lH), 4,15 (ds,2H), 4,5 (qd,lH), 4,68 (dt, IH), 5,07 (d,lH), 5,14 (bd,2H), 5,16 (d,lH), 7,28 až 7,39, (m, 10H), 7,57 (dd,lH).

¹³CNMR (delta vs TMS,CDC1₃):(vyčnívající píky) 66,93 (oba benzylové_fuhlíky), 127,78 až 128,64 (oba fenylové kruhy), 155,249, 170,00, 170,24, 171,69, 174,27, 175,21 (všechny karbonylové uhlíky).

- 42 .** • · • · • φ • φ φ

Příklad 5

Příklad hygroskopické krystalické formy N-[N-(4-piperidin-4yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyk1ohexy1alaninamid (Stupeň 5, schéma II)

Připraví se směs obsahující CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2, formát amonný a 1O % palladium na uhlí ve 20:1 systému alkohol/voda (10:1 obj/hm vs. CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2). Tato směs se zahřeje na teplotu 40 až 50 °C a míchá se až do chvíle, kdy je podle HPLC reakce ukončena (1 až 2 hodiny). Směs se ochladí na teplotu místnosti a zfiltruje se k odstranění katalyzátoru. Výsledný roztok se zahřeje na teplotu 40 až 50 ’C a přidá se aceton (přibližně objem vs. zfiltrovaný roztok), roztok se nechá vychladnout na teplotu 35 až 40 °C. Do směsi se naočkuje N-[N[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1] (L)-3-cyklohexyl-alaninamid a z něho vykrystaluje hygroskopická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl](L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexyl-alaninamidu při ochlazení na teplotu místnosti (několik hodin). Pevné látky se izolují odfiltrováním v prostředí dusíku a promyjí se acetonem. Pevné látky se vysuší za sníženého tlaku a analyzují se ke zjištění obsahu krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)N-ethylglycy1]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyk1ohexy1-alaninamidu (HPLC hm/hm). Výtěžek je obvykle >85 % teorie, čistota >95A %.

Specifický příklad přípravy při zachování obecného postupu podle stupně 5 poskytuje 5 g CBZ-PipBu-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 3,1 g hygroskopické krystalické formy N-[N[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl] (L)-3-cyklohexylalaninamidu v podobě bílé pevné látky (čistota 99,6A %) ve stechiometrickém výtěžku 89,4 % teorie.

Jakožto další sloučeniny připravené podle příkladů 1 až 5, avšak při použití příslušných výchozích látek se uvádějí: N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]valin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]D-valin,

N-[N-[N-(3-(piperidin-4-yl)propanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1] valin,

N-[N-[N-(5-(piperidin-4-y1)pentanoy1)-N-ethylglycylJasparagyl] valin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]L-a-cyklkohexylglycin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]norleucin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyljasparagyl]L-α-(2,2-dimethy1)prop-3-y1-gycin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]L-p-dekahydronaf t-l-yl-alanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethy1glycy1]asparagy1]L-a-2-cyklohexylethy1)glycin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]fenylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]L-p-naf t-l-yl-alanin,

N-[N-[N-(4-(piper idin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]L-p-naf t-2-y1-alanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1 ΙΕ- β-cyklohexylalaninethylester,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]L-p-cis-dekahydronaf t-2-ylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]α-aminocyklohexankarboxylová kyselina, f

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]β-cyklohexy1-D-alanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagy1]• ·

- 44.’-.

>·· · ··· . · » ·· β-dekahydronaf t-l-yl-alanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]asparagyl ]β-cyklohexylalaninethylamid,

Ν-[Ν-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagylJβ-cyklooktylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-cyklohexyImethy1 a laninámid,

Ν-[Ν-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-adamant-l-ylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagylJβ—(1,2,3,4)-tetrahydronaf t-5-ylalanin,

Ν-[Ν-[N-(4-(piper idin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-(4-cyklohexy1)cyklohexylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-cykloheptylalanin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-cyklooktylalaninamid,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagylία-cyklohexy lpropy1glycin,

N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-cyklooktyImethylalanin,

Ν-[Ν-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagyl]β-cyklopentylalanin a

Ν-[Ν-[N-(4-(piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycylJasparagylJβ-cyklohexyImethylalaninethy1 ester.

Příklad 6

Příprava 4-N-CBZ-piperidonu

Směs 40 kg N-(benzyloxykarbony1)sukcinimidu a 26 kg (175 mol) 4-piperidon.kyseliny chlorovodíkové.H2O ve 38,8 kg vody a f

kg tetrahydrofuranu se míchá 2,5 hodiny při teplotě 15+5 ’C až do konce rozpouštění (přibližně 15 minut). Do míchané (exothermické) směsi se přidá NMM (22,8 kg) při udržování teploty • ·

- 45 .«··. • · • · • .· °C nebo nižší. Lázeň se míchá 2,5 hodiny při teplotě 15+5 °C až do chvíle, kdy je podle HPLC reakce ukončena. Směs se zředí na 115,2 kg MTBE a 38,8 kg vody a míchá se 5 minut při teplotě 20+5 °C. Míchání se ukončí, vrstvy se nechají oddělit a vodná (nižší) vrstva se odstraní a vyhodí se. Organická vrstva se promyje 2x 129,6 kg vody (míchá se 5 minut, fáze se oddělí a vodná (nižší) vrstva se odstraní a vyhodí se. Organická vrstva se promyje 5,2 kg chloridu sodného 46,8 kg vody (míchá se úět minut, fáze se oddělí a vodná (nižší) vrstva se odstraní a vyhodí se. Organická fáze se zpracuje 11,5 kg síranem hořečnatým za míchání po dobu jedné hodiny, načež se směs zfiltruje. Reaktor se vypláchne 8 kg MTBE (roztokse zfiltruje a spojí se s hlavním filtrátem; celkový obsah vody ve filtrátu je 0,52 %). Objem směsi se sníží na polovinu destilací za sníženého tlaku při teplotě 30 °C. Vakuum se zruší dusíkem a zbytek se ochladí na teplotu 20 °C (obsah vody zbytku: 0,43 %). Zbytek se zředí 57,6 kg MTBE, pak se objem směsi znovu zmenší na polovinu ve vakuu při teplotě 30 °C (obsah vody zbytku: 0,25 %). To se opakuje 5x. Konečný obsah v reaktoru se zředí 28,8 kg MTBE a míchá se 5 minut, načež se zjistí obsah vody a obsah 4-N-CBZ-piperidonu; (voda 0,05 %; hmotnost/hmotnost 4-N-CBZ-piperidonu: hmotnostně 22,66 %, 35,36 kg, 155 mol, 88,6 % stechiometrického výtěžek).

Příklad 7

Příprava PipBu

Za probubláváni dusíku a při míchání se připraví roztok 53,5 kg 3-karboxypropyltrifenylfosfoniumbromidu ve 230,1 kg 1,2-dimethoxyethanu. Během 35 minut se přidá systém terc.-butoxid draselný/tetrahydrofuran (20 hm.%, 141,8 kg roztoku) při f

udržování teploty 24 až 28 °C. Směs se míchá půl hodiny při této teplotě až do ukončení reakce podle HPLC. Míchaná směs se ochladí na teplotu 10+2 °C, pak se do směsi přidá 96,45 kg

- 46.*-·.

(titr: 1,15 molární eq.vs.) 4-CBZ-piperidonu v MTBE během 40 minut, tak aby teplota zůstala 12+2“C. Směs se míchá při této teplotě 10 minut, pak se zahřeje na teplotu 20+2 ^eC a míchá se dvě hodiny při této teplotě. Do míchané směsi se přidá roztok 22,5 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovdíkové ve 245,6 kg vody za udržení teploty 2O+2°C; konečná hodnota pH je 0,5. Směs se extrahuje za míchání 214,0 kg methyl-terc.-butyletheru . Míchání se ukončí, fáze se nechají oddělit a vodná vrstva (spodní) se odstraní a vyhodí. Organická fáze se promyje 133,75 kg vody (míchá se 5 minut, rozdělí se, vodná vrstva (spodní) se odstraní a vyhodí pak se promyje 10,7 kg 50% roztoku hydroxidu sodného ve 126 kg vody (míchá se 10 minut, vrstvy se oddělí a vyhodí se organická (horní) vrstva). Vodná vrstva se extrahuje 2x 123,05 kg ethylacetátu (míchá se 5 minut, vrstvy se oddělí a vyhodí se organická (horní) vrstva). Do míchané vodné vrstvy se přidá 13,1 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové do hodnoty pH 2,5 až 3,5 (konečná hodnota pH 2,82), pak se směs extrahuje 123,05 kg ethylacetátu (míchá se pět minut a vodná vrstva (spodní) se odstraní a vyhodí. Roztok ethylacetátu se promyje 133,75 kg vody (míchá se pět minut, vrstvy se oddělí a vodná vrstva (spodní) se odstraní a vyhodí, pak se zjišíuje (hm/hm) obsah CBZ-PipBuen (celková hmotnost:194,86 kg, 17,05 % CBZ-PipBuen [33,22 kg, 108 mol, 87,9 % stechiometrického výtěžku).

Do tlakové nádoby z nerezavějící oceli se za míchání vnese roztok PipBuenu v ethylacetátu spolu se 6,6 kg 5% palladia na uhlí (hm. 50 % vody) a směs se zahřeje na teplotu 55 +2°C. Do směsi se přidá formát draselný (38,2 kg), rozpuštěný v 66,4 kg vody při udržování teploty 55 +2 °C (přibližně 30 minut). Směs se míchá dvě hodiny při teplotě 55 ±2 °C a reakce se ukončí (HPLC). Do reaktoru se přidá 6,6 kg celitu a 33,2 kg voí dy, směs se zamíchá a zfiltruje. Reaktor se vypláchne 33,2 kg vody, zfiltruje se a přidá se k hlavnímu filtrátu. Filtrát se přelije do nové nádoby, ochladí se na teplotu 20 až 25 °C, • · · · • · · ···· • · ·

vrstvy se nechají oddělit a organická vrstva se vyjme a vyhodí Vodná vrstva se okyselí 52,1 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové na hodnotu pH 2 až 3 (konečná hodnota pH je 2,82), pak se extrahuje 4x 129,5 kg methylenchloridu (míchá se pět minut, vrstvy se oddělí, odstraní a zahodí se organická vrstva). Vodná fáze se nastaví za míchání na hodnotu pH 6,1 přísadou 17,85 kg vodného 50% roztoku hydroxidu sodného. Směs se zfiltruje, čímž se získá 224 kg roztoku obsahujícího 17,6 kg (103 mol) 4-(3'-karboxypropyl)piperidinu.

Příklad 8

Příprava CBZ-PipBu

Roztok 224 kg 4-(3'-karboxypropyl)piperidinu ve vodném roztoku hydroxidu sodného se smíchá s 55,3 kg tetrahydrofuranu a směs se za míchání ochladí na teplotu 8+2 °C. Při udržování teploty na nižší než 10 °C se přidá NMM (20,9 kg). Po ukončeném přidávání se teplota nastaví na 8 +2 C a během 1 hodiny se přidá 25,7 kg l-(benzyloxykarbonyl)sukcinimidu, rozpuštěného ve 49,8 kg tetrahydrofuranu, při udržování teploty nižší než 15 °C. Reakce se ukončí (podle HPLC) po třech hodinách při teplotě 1O až 15 °C. Přidá se koncentrovaná vodná kyseliny chlorovodíkové (29,9 kg) k nastavení hodnoty pH na 2,5 až 3,5 (konečná hodnota pH 3,3), pak se do směsi přidá 61,4 kg MTBE a směs se míchá 5 minut. Míchání se ukončí a vrstvy se nechají oddělit a vodná (spodní) vrstva se oddělí jako odpad. Vrstva MTBE se promyje 3 dávkami po 83,1 kg vody (míchání 10 minut, 5 minut a 5 minut); vodná fáze se nechá oddělit a v každém případě se odstraní. Bez míchání se přidá 8,3 kg 50% vodného hydroxidu sodného ve 95,7 kg vody a po ukončené přísadě se směs míchá přibližně 5 minut. Míchání se ukončí, fáze se nechají oddělit anorganická (horní) vrstva se oddělí a vyhodíse. Vodná vrstva se vrátí do reaktoru a extrahuje se 2x 38,4 kg methylterc.-butyletheru (míchá se pět minut, vrstvy se oddělí a organické vrchní vrstvy se vyjmou/vyhodí). Tato operace se opa48 kuje za použití 18,5 kg methyl-terc.-butyletheru. Vodná vrstva, vrácená do reaktoru se okyselí na hodnotu pH 2,5 až 3,5 (konečná hodnota pH je 3,37) 9,9 kg koncentrované vodné kyseliny chlorovodíkové. Směs se extrahuje 76,4 kg methy1-terc.butyletheru (míchá se pět minut, vrstvy se oddělí a vodní (dolní) vrstva se vyjme/vyhodí). Organická vrstva se promyje (za pětiminutového míchání) roztokem 1,1 kg hydrogenuhličitanu sodného ve 12,4 kg vody (míchá se 5 minut, vrstvy se oddělí a vodná (dolní) vrstva se vyjme/vyhodí) a pak 41,5 kg vody (míchá se pět minut, vrstvy se oddělí a vodná (dolní) vrstva se vyjme/vyhodí). V reaktoru se vytvoří podtlak a těkavá rozpouštědla se odstraní při teplotě 55 °C až do ukončení odtékání destilátu. Přidá se toluen (32,4 kg) a směs se destiluje za tlaku okolí až do ukončení odtékání destilátu, přičemž teplota stoupne na 90 až 95 °C. Směs se pak ochladí na 30 až 35 °C, do reaktoru se přidá (ve dvou fázích) heptan (56,85 kg), směs se zahřeje na teplotu 90 až 95 °C (jedna fáze). Směs se pak znovu ochladí na teplotu 38 až 42 °C. Přidají se očkovací krystaly CBZ-PipBu a produkt během jedné hodiny ze směsi vykrystaluje. Pevná látka se odfiltruje a promyje se 19,35 kg směsi toluen/ heptan 1:2 a pak 33,4 kg heptanu. Filtrační koláč se vysuší ve vakuu při teplotě 40 °C (0,13% ztráta při analyse sušení), čímž se získá 22,4 kg (72,96 mol, 42 % stechiometrického výtěžku vztaženo na 4-piperidon) CBZ-PipBu.

Příklad 9

Příprava CBZ-PipBuenu

Do suspense 82 g 3-karboxypropyltrifenylfosfoniumbromidu ve 407 ml 1,2-diethoxyethanu se při teplotě 14 °C přidá během 25 minut 220 g hmotnostně 20% terc.-butoxidu draselného v tetf rahydrofuranu při udržování teploty reakční směsi 24 až 28 ’C. Směs se míchá jednu hodinu, ochladí se na 10 °C, načež se přidá během 30 minut za stálého chlazení roztok 52,5 g 4-N····;.· · · • · · .· · ·· ·· ·· ··· ·* i

CBZ-piperidonu ve 246 ml terc.-butylmethyletheru. Po ukončení přísady se směs míchá 10 minut při teplotě 12 C, ohřeje se na 20 “C a míchá se dalších 30 minut. Reakční směs se zpracuje 10 minut 410 ml IN vodné kyseliny chlorovodíkové, zředí se 328 ml terc.-butylmethyletheru, načež se fáze oddělí. Organická fáze se promyje 205 ml vody, pak 210 ml IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Vrstva hydroxidu sodného, která obsahuje produkt, se shromáždí zvlášf, promyje se třikrát vždy 189 g ethylacetátu, okyselí se na hodnotu pH 3>48 koncentrovanou kyseliny chlorovodíkové a extrahuje se 189 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva se oddělí, promyje se 211 ml vody, suší se 30 minut 10 g síranem hořečnatým, zfiltruje se a zkoncentruje ve vakuu. Olejovitý zbytek (50,7 g) vykrystaluje ze systému toluen/heptan, čímž se získá celkem 29,46 g (výtěžek 50,9 % teorie přibližně 95%A čistého) CBZ-PipBuenu.

Hmotové spektrum: M 303 vypočteno, M+l 304 nalezeno ¹ HNMR (delta vs TMS,CDCla): 2,2 (t,2H), 2,25 (t,2H), 2,35 (m,4H), 3,45 (m,4H), 5,15 (s,2H), 5,2 (m,lH), 7,33 (2,5H).

¹³CNMR (delta vs TMS,CDCl3) 22,43, 28,2, 34,26, 35,66 44,88, 45,74, 67,20, 122,02, 127,83, 127,95 128,45, 128,69, 128,90,

136,17, 136,72, 155,34, 178,39

Příklad 10

Příprava CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(0Bz1)-(L)-Cha-NH2 Alternativní stupeň schéma II)

Do dvoupláštové baňky se vnese CBZ-PipBuen (70 g, 0,23 mol) a dimethy1formamidu (230 ml) a míchá se za chlazení na O “C, načež se najednou přidá TBTU (74,9 g, 0,23 mol). Teplota se udržuje O °C a započne se s přidáváním DIPEA (61,9 g, 0,61 mol). Po <45 minutách se přidá TFA-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)Cha-NH2 (138,7 g, 0,24 mol) v podobě roztoku v dimethy1formamidu (230 ml). Hodnota pH se nastaví na 7 až 8 přísadou DIPEA (45 ml) a směs se nechá dosáhnout teploty místnosti. Po dvou

50.«.

• · ·· · • · * • · · ·

·· ·· · · · · hodinách je reakce ukončena (podle HPLC). Směs se vlije do vody (2,5 1) a extrahuje se ethylacetát (1 1). Vodná fáze se extrahuje zpět ethylacetát (0,3 1). Organické vrstvy se spojí, promyjí se vodným roztokem citrónové kyseliny (hmotnostně 5%, 2x 1 1), promyjí se vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (hmotnostně 5%, 2x 1 1), a promyjí se vodou (2 1). Vrstva ethylacetátu se přelije do 2 1 baňky a přidá se heptan (500 ml) za míchání k navození krystalizace. Pevná látka se odsaje na Buchnerově nálevce, promyje se systémem ethylacetát/heptan (obj. 2:1, 11) a vysuší se na konstantní hmotnost, čímž se získá CBZ-PipBuen-N(Et)Gly-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NHa (143,2 g, 0,19 mol), výtěžek 83 % teorie).

Hmotové spektrum: M 745,91 vypočteno; M+l : 746 nalezeno Analysa: C41H55N5O7 C: vypočteno 66,02 nalezeno 65,53, Η, N.

‘HNMR (delta vs TMS,CDCl3): 0,86 (qd, IH), 0,98 (qd,lH) 1,16 (t,2H), 1,24 (dt,6H), 1,37 (m,IH), 1,64 až 1,78 (m,4H),

1,86 (qd,lH), 2,2 (bd,4H), 2,35 (m,lH), 2,4 (m,2H), 2,74(dd, IH) 3,07 (m,4H), 3,52 (d,lH), 3,85 (d,lH), 4,12 (q,lH), 4,49 (qd,lH), 4,68 (dt,lH), 5,07 (d,lH), 5,14 (s,lH), 5,16 (d,lH), 5,22 (t,2H), 6,45 (s,lH), 7,28 (d,IH), 7,26 (s,5H), 7,35, (s, 5H), 7,56 (d,lH).

¹³CNMR (delta vs TMS,CDCl3): 14,15, 22,68, 24,95, 25,61,

26,03, 26,45, 28,20, 31,71, 32,89, 33,80, 33,89, 34,00, 35,63, 38,37, 44,79, 45,13, 45,65, 50,23, 51,34, 60,40, 66,87, 67,06, 76,50, 77,13, 77,77, 122,46, 126,88, 127,80, 128,60,

135,15, 155,19, 170,11, 170,20, 171,61, 173,76, 175,35

Příklad 11

Příprava hygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin4-yl)butanoyl)-N-ethy1glycy1]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexy1alaninamidu (alternativní stupeň 5 schéma II)

« · • · ·· · ·· ·· » · · · > · · « ··· ··« • « ·· ··

Do 5-litrové opláštěné baňky se vnese CBZ-PipBuen-N(Et)Gly(L)-Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 (Í4O g, 0,19 mol), amoniumformát (61 g, 0,96 mol) a 10% paladium na uhlí (50% vlhký typ degusa, 28 g). Přidá se ethanol (200 proof [uznávaná jednotka lihovitosti], 1260 ml), isopropanol (70 ml) a voda (DI, 70 g). Směs se ohřeje na teplotu 40 až 50 °C a míchá se až do ukončení reakce podle HPLC (pět hodin). Směs se nechá vychladnout na teplotu místnosti, zfiltruje se a katalyzátor se odstraní. Výsledný roztok se zahřeje na teplotu 40 až 50 °C a přidá se aceton (přibližně stejný objem jako zfiltrovaný roztok) a směs se ochladí na 35 až 40 °C. Do směsi se naočkuje N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyk lohexylalaninamid a vykrystaluje hygroskopická forma N-[N-[N(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)β-cyklohexylalaninamidu za vychladnutí na teplotu místnosti (několik hodin). Pevná látka se odsaje na Buchnerově nálevce, v prostředí dusíku, filtrační koláč se promyje acetonem a vysuší se na vzduchu do konstantní hmotnosti, čímž se získá N[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-aspara gyl]-(L)-fi-cyklohexylalaninamid (84,3 g, 0,16 mol), výtěžek 84,8 % teorie, >95A %).

Příklad 12

Způsob seřetězené přípravy TFA-N(Et(Gly)-(L)-Asp(0Bz1)-(L)ChaNH2 (alternativní stupně 1 až 3 schéma II)

Do baňky o obsahu 500 ml, opatřené teploměrem, se vnese B0C-N(Et)-Gly (20,3 g, 0,1 mol), N-hydroxysukcinimid (11,5 g, 0,1 mol) a dichlormethan (200 ml). Směs se míchá střední rychlostí a do výsledného roztoku se přidá dicyklohexylkarbodiimidu (20,6 g, 0,1 mol) najednou jako pevná látka. Roztok se míF chá jednu hodinu za mírně exotermické reakce (teplota se zvýší ze 20 na 28 °C) a DCU se vysráží. Výsledná suspense se vakuově zfiltruje na Buchnerové nálevce opatřené filtračním papírem • · ·· ·

• · · · ··· ··· • · • · · »··· » • · ·

Whatman #1. Filtrační koláč se promyje dichlormethanem (2x 25 ml). Filtráty se vrátí do původní 500 ml baňky a pak se postupně přidá (L)Asp(OBzl) (22,3 g, 0,1 mol), NMM (33,8 ml, 0,3 mol) a dimethylformamidu (80 g, 1,01 mol). Po dvouhodinovém míchání při teplotě místnosti je vytvoření BOC-N(Et(Gly-(L)Asp(OBzl) ukončeno (podle HPLC). Reakční směs se vlije do extrakční nálevky obsahující ledovou vodu (100 mml). Směs se okyselí kyselinou chlorovodíkovou (36%, 25 ml) na hodnotu pH 1. Vrstvy se rozdělí a dichlormethanová vrstva se promyje ledovou vodou (ÍOO ml) a fáze se oddělí (vodná fáze má hodnotu pH 3 až 4). Dichlormethanová vrstva se vrátí do původní 500 ml baňky, do které se postupně přidá NH2-(L)-Cha-NH2 (17 g, 01 mol), Nhydroxysukcinimid (11,5 g, 0,1 mol) a dicyklohexylkarbodiimidu (20,6 g, 0,1 mol) najednou vždy v podobě pevné látky. Po dvouhodinovém míchání při teplotě místnosti, je vytvoření BOCN(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)(L)-Cha-NH2 ukončeno (podle HPLC) a DCU se vakuově zfiltruje na Buchnerově nálevce opatřené filtračním papírem Whatman #1. Filtrační koláč se promyje deionizovanou vodou (200 ml) obsahující N-methylmorfolin (15 ml, hodnota pH 8 až 9). Fáze se oddělí a dichlormethanová vrstva se opět promyje vodou (DI 2x 150 ml). Dichlormethanová fáze se promyje 150 ml IN kyselinou chlorovodíkovou (hodnota pH 1). Fáze se oddělí a dichlormethanová vrstva se opět promyje deionizovanou vodou (200 ml, hodnota pH 3). Dichlormethanový roztok BOCN(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)-(L)-Cha-NH2 se vrátí k vyčištění do 500 ml baňky a přidá se TFA (100 ml). Po 2-hodinovém míchání při teplotě místnosti je vytvoření TFA.HN(Et)G1y-(L)Asp(OBz1)-(L)Cha-NH2 ukončeno (podle HPLC). Reakční směs se destiluje ve vakuu k odstranění dichlormethanu a většiny TFA, pak se přidá očkovadlo a MTBE (500 ml) k zahájení krystal izace. Směs se vakuově zfiltruje na Buchnerově nálevce opatřené filtračním papírem Whatman #1. Filtrační koláč se promyje MTBE (2x 25 ml) a po vysušení na vzduchu se získá TFA.HN(Et)Gly-(L)Asp(OBzl)(L)-Cha-NH2 (46,8 g, 81,5 % teorie) v podobě bílé pevné látky (>97A% čisté, <0,2A% D-Asp diast.).

• · « ··

Příklad 13

Příprava stabilní nehygroskopické krystalické formy

N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)asparagy1]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu

Způsob A - statická konverze

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)~3-cyklohexyla laninamidu (7,45 kg) se rozemele v kladivovém mlýně. Výsledná pevná látka 7,35 kg se umístí na vysoušeči mísu (90x28 cm) a mísa se překryje perforovanou hliníkovou fólií. Mísa se pak utěsněně vloží do vhkostní pece (LUNARIRE Humidity Cabinet model No. CEO 941W-3). Pec se udržuje utěsněná po dobu konversního procesu, kromě odebrání vzorků k analyse. Pec se nastaví na 40% relativní vlhkost (RH) a teplotu 60 °C na í hodinu. Pak se vlhkostní pec nastaví na 80% RH/60 °C s prodlevou 12 hodin. Vzorek se vyjme po 18 hodinách při 80 RH/60 “C a rentgenovou práškovou difrakcí se posoudí konverse na nehygroskopickou krystalickou formu N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-Nethylglycyl]-(L)-aspartyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu. Vlhkostní pec se znovu utěsní a nastaví se na 40% RH/60 ’C s prodlevou 2 hodiny. Pec se znovu nastaví na podmínky okolí a mísa se pak z pece vyjme a získá se nehygroskopická, krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)aspartyl]-(L)-3-cyklohexylalaninamidu (7,2 kg, výtěžek 96,6 % teorie). Konverse je potvrzena obrazcem rtg. difrakce (obr. 1). Rentgenová prášková difrakce je také uvedena v tabulce jako funkce rostoucího řádu úhlu difrakce (2 theta) odpovídajícího mezivrstvové vzdálenosti (d) krystalu v nanometrech čtení za sekundu (Cps) a relativní pík intenzity (v %) (tabulka I, N znamená číslo).

• 0 0» • c 0 • i <

• 00

0 00 0

0 0 ·0 ·»

0« 0 0 0 0

000 · 00 0

00000 « 000 000 0 0 0 · »

0 ♦ 0 0 ·0

Tabulka I

-N- 2Θ —d— —Cps—

11 12

21 22

5.065

6,323

7,518

8,163

8.780 10,383 11 351 12,596 13,858 15,191 16,476 16,745 17,980 18,572 18,799 19,147 19,619 20,200 20,466 20,870 21.625 22,088 22,840 23,947 24,569 25,608 27,015 27,837 27,967 29,255 29,689 30,665 31,318 31,894 33,370

33.562

33,919

840 35,789

940

36.780 37,042 37,959 39,017

1,74314 1,39672 1,17489 1,08222 1,00633 0,851-x 0,77886 0,70218 0,63852 0.58274 0,53759 0.52901 0,49294 0.47735 0,47165 0,46315 0,45211 0.43924 0,43360 0,42528 0,41061 •0,40210 0,38903 0,37129 0,36203 0,34757 0,32978 0,32022 0,31877 0,30502 0,30066 0,29130 0,28538 0,28036 0,26829

0,26679

0,26407

0,25730

0,25069

0,24967

0,24416

0,24249

0,23684

0,23066

86,00 248,00 221,00 496,00 155,00 218,00 112,00 999,00 316,00 1338,00 481,00 556,00 679,00 1079,00 1230,00 1229,00 1380,00 1246,00 1478,00 1088,00 584,00 891,00 613,00 597,00 680,00 506,00 1100.,00 420,00 400,00 536,00 603,00 518,00 451,00 533,00 518/00

552/)0 581.00 561,00 559,00 560,00 740,00 736,00 683 00 643,00

5.82 16,78

14.95 33,56 10,49 14,75 7,58 67,59 21,38

90.53

32.54 37,62

45.95 73,00 83,22 83,15 93,37

84.30 100.00 73,ól

39.51 60,28 41,47 40 39 46,01 34,24

74.42

28.42 27,06 36,27 '

40.80 35,05

30.51 36,06 35,05

37,35

39.31 37 96

37.82 37,89 5007

49.80 46,21 43,50

Způsob B. Dynamické podmínky

a. Konverse formy

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4yl )butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)- β-cyklohexyl 55 • a • ♦ * » • '« ♦ « • 9 a» c a * a ♦ © · 9 9 9 9 · · · a ·· a • aaaaa a ··· aaa aaa a a • a a a a ·· alaninamidu (50 g) se vnese do 400 ml odměrného válce (výška 6 cm) na kruhové podložce a opatří se mechanickým míchadlem. Přístroj se umístí do pece s řízenou vlhkostí (LUNARIRE Humidity Cabinet model č. CEO 941W-3). Otáčky míchadla se naštvi na 275/min a teplota 60 °C a relativní vlhkost 40% se ustaví během 30 minut. Sloučenina se udržuje za těchto podmínek po dobu jedné hodiny, načež se podmínky během 45 minut změní na 80% RH/60 ’C. Sloučenina se udržuje za těchto podmínek po dobu 16 hodin než se znovu podmínky upraví na 40% RH/60°C na dobu 3,2 až 5 hodin. Sloučenina se nechá vychladnout na teplotu místnosti (výška 4 cm), pak se z odměrného válce vyjme, čímž se získá nehygroskopické krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4-y1)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklo hexylalaninamidu (výtěžek >95 % teorie). Konverse se potvrzdí obrazcem rentgenové difrakce (obr. 2). Rentgenová prášková difrakce je také uvedena v tabulce jako funkce rostoucího řádu úhlu difrakce (2 theta) odpovídajícího mezivrstvové vzdálenosti krystalu (d) v nanometrech čtení za sekundu (Cps) a relativní pík intenzity (v %) (tabulka II, N znamená číslo).

Tabulka II —Cps......%—

-Ν- 20 —d—

1	5,186	1,70268
2	6,371	1,38615
3	7,570	1,16689
4	8,232 8,817	1,07323
5	1,00206
6	10,428	0,84761
7	11,377	0.77714
8	11,600 12,667	0,76223
9	0,69828
10	13,913 14,398	0,63599
11	0,61468
12	15,226 16,538	0,58440
13	0,53557
14	16,773	0,52814
15	18,019 r 18 672	0,49190
16	0,47483
17	18 815 19 204	0,47125
18	0,46178

196,00 8,43

722,00 31,07

516,00 22,20

1094,00 47,07

257,00 11 06

365,00 15 71

129,00 5,55

117,00 5,55

1805,00 77,67

551,00 23,71

178,00 7,66

2285,00 98,32

861,00 37 05

929,00 39,97

1132,00 48,71

1871,00 80,51

2052,00 88,30

2071,00 89 11 β c · • · · · « » · • » · • ♦ · • 4 · ♦ β • · « • * · • * ® · • · · · * · · • « * ·· « • · ·· • * » · · 9 · • 99 9 999

9

9 9 9

21 22

19,654 0,45132

20.237 0,43845

20,523 0,43240

20,934 0,42400

21,691 0,40938

22,143 0,40112

22,910 0,38786

24,007 0,37037

24.642 0,36097

25.642 0,36097

27,070 0,32913

27,855 0,32002

29,497 0,30258

29,497 0,30013

30,751 0,29051

31,916 0,28017

33,982 0,26360

35,200 0,25475

36,001 0,24926

36,927 0,24322

38,389 0,23429

2226,00 1939,00 2324,00 1656,00 923,00 1411,00 994,00 964 00 991,00 991,00 1687,00 688 00 843 00 878,00 809,00 821,00 882,00 865,00 841,00 1106,00 968 00

95,78

83,43

100,00

71.26 39,72 60,71

42.77 41,48 42 64

42.64

72.59

29.60

36.27

37.78 34 81 35,33 37,95 37,22 36,19 47,59

41.65

b. Konverse formy

Hygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4y1)butanoy1)-N- ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-p- cyklohexylalaninamidu (370 g) se vnese do 2 1 rotační odparkové baňky. Baňka se umístí do rotační odparky (Heidolph UV 2002) a spustí se do předehřáté (58 °C) lázně (Heidolph MR 2002). Pomocí vakuové vývěvy se upraví tlak na 6000 Pa (Divatrion DVÍ), načež se vakuum zruší řízeným způsobem k vytvoření vlhkého prostředí v oddělené, vyhřívané baňce obsahující vodu. Přívod vlhkého prostředí se řídí přístrojem regulujícím vlhkost (Vausalo Humiditique and Temperature Traumettor) k dosažení RH 79% uvnitř přístroje (vnitřní tlak 13000 aaž 18000 Pa). Nádoba rotační odparky se pak otáčí během pěti hodin 145 až 160 otáčkami za minutu, přičemž se vyhřívací lázeň udržuje na teplotě přibližně 60 °C a RH se udržuje na 71 až 79 %. Vakuum se zruší dusíkem, nádoba i její obsah se nechají vychladnout na teplotu okolí a produkt se vyjme, čímž se získá nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu. Podobně se zpracuje druhá dávka 317 g hygroskopické krystalické formy N[N-[N-(4- p'iperidin-4-y 1 )butanoyl )-N- ethylglycy1]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu za získání nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-4-(piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethyl57 aA A »· · • · · · · « ·

A · A A A * O • · · A A A A A A A ♦ · · A A · •A A·· *· A ř AA A A A «•A A A 4

A 4 glycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu . Konverse se potvrdí obrazcem rtg. difrakce (obr.3). Obě dávky dají dohromady 667 g nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-pcyklohexylalaninamidu (celkový výtěžek 97 % teorie). Konverse se potvrdí obrazcem rentgenové difrakce (obr.3). Rentgenová prášková difrakce je také uvedena v tabulce jako funkce rostoucího řádu úhlu difrakce (2 theta) odpovídajícího mezivrstvové vzdálenosti (d) krystalu v nanometrech čtení za sekundu (Cps) a relativní pík intenzity (v %) (tabulka III, N znamená číslo). ) .

Tabulka III

-N- 2Θ — d— —Cps— —%—

11 12

21 22

5,124 6,328 7,574 8,191 8,797 10,398 12,628 13,871 15,218 15,723 16,538 16,751 18,024 18,640 18.809 19 191 19,659 20,865 20,495 20,865 21,616 22,113 22 950

117 24,618

644

297

052 27 960 29,640, 30744 33 465 33 840 35,812 36,811 37,076 38,185 39,622

1,72309

1,39565

1,16623

1,07851

1,00432

0,85004

0,70040

0,63791

0,58172

0,56317

0,53558

0,52882

0,49175

0,47563

0,47141

0,46210

0,45120

0,44064

0,43299

0,42539

0,41077

0,40166

0,38719

0,36871

0,36132

0,34709

0,33862

0,32934

0,31885

0,30115

0,29058

0,26755 '

0,26467

O,25053

0,24396

0,24228

0,23549

0,22728

180,00 408,00 305,00 556,00 166.00 244.00 1198 00 353 00 1543,00 187,00 589 00 621,00 869,00 1156,00 1241 00 1521 00 1413,00 1303,00 1770,00 1120,00 683,00 919,00 697,00 659,00 716,00 662,00 486,00 1270,00 518,00 705/00 695,00 697,00 76400 736,00 858,00 919,00 870' 882,00

10.17 23,05

17.23 31,41

9.38 13,79 67-68 19,94

87.18 10.56 33Í28 35,08

49.10 65,31

70.11 85,93

79.83 73,62 100,00 63,28 38.59 51 92

39.38

37.23

40.45 37;40

27.46 71,75 29 27 39 38 3927 39 38 43 16 41,58

48.47 51,92 49,15

49.83 »· · • · • 4 · • · 9 · « • · · » • · · O · • · · · «· ♦·· ··

Příklad 14

Grafy rentgenová práškové difrakce vzorku N-[N-[N-(4-piperidin4-yl)butanoyl)- N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-£-cyklohexylalaninamidu v hygroskopické krystalické formě a jeho konvertovaná nehygroskopická krystalická frorma

Připraví se vzorek hygroskopické krystalické formy N-[N[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]—(L)— asparagyl](L)-p-cyklohexylalaninamidu stejně jako podle příkladu 5 nebo 11 a převede se na odpovídající nehygroskopickou krystalickou formu způsobem podle příkladu 13. Graf rentgenové práškové difrakce hygroskopické krystalické formy je na obr. 4 a nehygroskopické krystalické formy je na obr. 5. Rentgenová prášková difrakce je také uvedena v tabulce jako funkce rostoucího řádu úhlu difrakce (2 theta) odpovídajícího mezivrstvové vzdálenosti krystalu (d) v nanometrech čtení za sekundu (Cps) a relativní pík intenzity v % (tabulka IV a V, N znamená číslo).).

Tabulka IV

-N- 2Θ d— —Cps— —%—

11 12

21 22

5.073

6,451

7,837

8.491

9,699

10,488

11,570

12,550

13,576

15,327

15,790

16,179

16,770

17,085

17,750

18,151

18,504^f

19,323

19.714

20,545

21.388

22,381

1,74037 1,36905 1,12712 1,04049 0,91119 0,84278 0,76423 0,70474 0,65168 0,57763 0,56080 0,54739 0,52824

0.51856

0,49927

0,48835

0,47909

0,45897

0,44996

0,43194

0,41510

0,39691

1487,00

447,00

411,00

602,00

00

421,00

92,00

411,00

760,00

606,00

456.00

346,00

938,00

685,00

924,00

741,00

593,00

930,00

792,00

1719,00

897,00

373,00

86,50

26,00

23,91

35,02

5,41

24.49 5,35 23,91 44,21 35,25 26,53 20,13 54,57 39,85 53,75 43 11

34.50 54,10 46,07 100,00 52.18 21.70

W ·· « ♦· 9· • · · · 0 · · · · • · ··· · · · · • O « · ···· » ··· «·· • · · · · · «·· ·· · ·9 ·*

22Í87O 23,640 23,841 24048 24,746 25 200

792

266 26,959 27,426 27,967 29,020 29,922 30970 31,552 33,338 34,838 35,873 36,107 37,162 38_r509 39,701

0,38852

0,37604

0,37292

0,36976

0,35949

0,35311

0,34513

0,33901

0,33045

0,32494

0,31876

0,30744

0,29837

0,28851

0,28332

0,26854

0,25731

0,25012

0,24855

0,24174

0,23359

0,22684

258Í00 563,00 680,00 623,00 338,00 366,00 590,00 731,00 555,00 769,00 528 00 771 00 491,00 384,00 510,00 627,00 520,00 653,00 639 00 683,00 775,00 784,00

01 32,75

39.56

36.24

19.66 21,29 34,32 42,52 32 29 44,74 3072 44,85

28.56 22,34

29.67 36,47

30.25 37,99 37 17 39,73 45,08 45,61

Tabulka V

-N1

11 12

21 22

5,152 6,386 7,580 8 225 8,801 10,408 12,660 13,914 15,251 16,541 16,771 18,047 18,676 18,902 19,182 19,697 20,240 20 568 29.933 21,684 22,122 22,970 24 080 24,218

694

680

400 _f

105 27,929 29,360 29 724 30,340 30,693 —d— 1,71371 1,38287 1,16540

1,07410

1,00390

0,84928

0,69863

0,63594

0,58047

0,53548

0,52818

0,49112

0,47472

0,46910

0,46231

0,45035

0,43838

0,43147

0,42403

0,40951

0,40150

O,3§685

0,36927

0,36720

0,36023

0,34662

0,33732

0,32871

0,31920

0,30395

0,30031

0,29435

0,29105 —Cps— 123,00 483,00 389 00 752,00 180,00 276,00

1399,00

391,00

1675,00

608,00

652.00

775,00

1078,00

1099,00 1151,00 1164100 1049,00 1403,00 1024/00 569,00 746j00 564,00 546,00 556,00 618,00 510,00 403,00 1093,00 450,00 555,00 595,00 429,00 552,00 —%—

7.34 28,84 23,22

44.90

10.75

16.48

83.52

23.34 100,00 36,30 38,93 46,27 64,36 65,61 68 72

69.49 62,63

83.76

61.13 33 97 44,54 33.67

32.60 33,19

36.90 30.45 2406 65 25 26,87

33.13

35.52

25.61 32,96 ·· · • · • · · · · · · ···«· ·» · · · ··· • · · · · • · · · · · ·

31.‘35 3 31,822 32,006 32 885 33,508 34,040 34,839 35,998 36,680 36,948 37,197 39,602

0,28507

0,28098

0,27940

0,27213

0,26722

0,26316

0,25730

0,24928

0,24480

0,24309

0,24152

0,22739

476(00

531,00

545,00

485,00

547,00

606,00

580,00

596,00

629,00

727,00

703,00

697,00

28,42

31,70

32.54

28.96 32,66 36,18 34,63 35,58

37.55 43,40

41.97 41,61

Příklad 15

Isotermické mikrokalorimetrické testy hygroskopické a ne- hygroskpopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-y1)butanoy1)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-p-cyklohexylalaninamidu

Isotermické mikrokalorimetrické testy hygroskopické a nehygroskpopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoy1)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-(L)-β-cyklohexylalaninamidu se provádějí na přístroji Thermometric® Thermal Activity Monitor (TAM). Konverse v tuhém stavu různých krystalických forem se studují tím, že se vystaví formy působení různých vlhkostí nebo par rozpouštědel a různých teplot. Použitými nasycenými roztoky k dosažení různé vlhkosti jsou: chlorid draselný (80% RH), chlorid sodný(75% RH) a bromid sodný(65% RH). Přibližně 1OO mg množství se odváží ve skleněné ampuli TAM a mikrohygrostat obsahující nasycený solný roztok (s nadbytkem pevné látky) nebo organické rozpouštědlo se vnese do ampule. Ampule se utěsní, vyrovná se na teplotu pokusu a spustí se do měřicí polohy v TAM. Stejný systém obsahující promytý mořský písek místo zkoušené formy se umístí na referenční stranu. Měří se výkon (gW) v závislosti na čase (obr. 6 až 8).

f

Příklad 16

Isothermy sorpce vlhkosti hygroskopické a nehygroskopické

·· · ·· ·· • · 9 9 9 9 9 « « · 9 · ·· · • ······ · · · 999

9 9 9 9

9 99 99 krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-ylJbutanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyklohexylalaninámidu

Isothermy sorpce vlhkosti hygroskopické a nehygroskopické krystalické formy N-[N-[N-(4-piperidin-4-yl)butanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-^-cyklohexylalaninamidu se získají na váze vlhkosti VTI MB3OOG. Pokusy se provádějí bud tak, že se vystaví 15 mg příslušné krystalické formy prostředí se vzrůstající a klesající relativní vlhkostí a sleduje se nárůst hmotnosti (v každém rovnovážném stupni) jako funkce procenta relativní vlhkosti (obr.9), nebo při udržování příslušné krystalické formy při konstantní vlhkosti a sledováním nárůstu hmotnosti v závislosti na Čase.

Sloučeniny obecného vzorce II vykazují užitečné farmakologické účinky a začleňují se proto do farmakologických prostředků a používá se jich k léčení pacientů trpících určitými pathologickými stavy.

Vanález se týká také způsobu léčení pacientů trpících stavy, které mohou být zmírněny i preventivním podáváním inhibitoru agregace destiček zabraňováním vazbě fibrinogenu na aktivované destičky a jiné adhesivní glykoproteiny podílející se na agregaci a srážení krve. Kromě toho se vynález týká způsobu prevence nebo léčby thrombosy, spojené s určitými chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, choroba vnějších arterií a roztroušená intravaskulární koagulace u lidí a jiných savců.

Léčením se zde vždy míní jak profylační terapie tak ošetřování ke zlepšení stavu.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují farmaceuticky vhodné množství alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I spolu s farmaceuticky vhodným nosičem a

excipientem.

V praxi se mohou sloučeniny podle vynálezu podávat jakýmkoli vhodným způsobem, například zevně, inhalací, parenterálně, rektálně nebo orálně, s výhodou však orálně.

Sloučeniny obecného vzorce II se předkádají ve formách umožňujících podávání nejvhodnější cestou a vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu, která je vhodná k použití v humánní a veterinární medicíně. Tyto prostředky se mohou připravovat o sobě známými způsoby způsoby za pomoci jednoho nebo několika farmakologicky vhodných pomocných činidel nebo excipientů. Mezi pomocná činidla patří mimo jiné ředidla, sterilní vodná media a různá netoxická organická rozpouštědla. Prostředky mohou být podávány ve formě tablet, pilulek, kapslí, granulí, prášků, vodných roztoků nebo suspensí, injektovatelných roztoků, eliksírů, a sirupů a mohou obsahovat jedno nebo několik činidel volených ze souboru zahrnujícího sladidla, ochucovače, barviva, stabilizátory nebo konzervační prostředky k získání farmaceuticky přijatelných prostředků.

Volba nosiče a obsah účinné látky v nosiči se stanoví zpravidla podle rozpustnosti a chemických vlastností produktu, podle příslušného způsobu podání podle zvyklostí farmaceutické praxe. Například excipienty jako je laktosa, citrát sodný, uhličitan vápenatý, dikalciumfosfát a desintegrační činidla, jako škrob, alginové kyseliny a určité komplexní silikagely kombinované s mazadly, jako je stearát hořečnatý, natriumlaurylsulfát a mastek mohou být použity k přípravě tablet. K přípravě kapslí se s výhodou používá laktosy a polyethylenglykolů o vysoké molekulové hmotnosti. Použije-li se vodných suspensí, f

mohou obsahovat emulgátory nebo činidla usnadňující suspendování. Stejně jako jiných materálů lze použít ředidel, jako jsou sacharosa, ethanol, polyethylenglykol, propylenglykol, — - ·♦ · ·· ·

Vj ···· ««· « · « · · · · • · 9 9 9 ······

9 9 9 9 9

9 999 9 9 9

glycerol a chloroform něho jejich směsi.

K parenterálnímu podávání se používá emulsí, suspensí nebo roztoků sloučenin podle vynálezu v rostlinném oleji, například v sezamovém oleji, v podzemnicovém oleji, v olivovém oleji nebo ve vodo-organickém roztoku jako je voda a propylenglykol, injektovatelné organické estery, jako je ethyloleát, stejně jako sterilní vodné roztoky farmaceuticky přijatelných solí. Roztoky solí produktů podle vynálezu se také hodí k podávání intramuskulárním nebo subkutánním injektováním. Vodné roztoky, také zahrnující roztoky solí v čisté destilované vodě, mohou také sloužit k intravenosnímu podávání za předpokladu že jejich hodnota pH je vhodně upravena, že jsou správně pufrovány a isotonicky upraveny s dostatečným množstvím glukosy nebo chloridu sodného a že jsou sterilizovány teplem, zářením a/nebo mikrofi 11raci.

K zevnímu podávání se hodí gely (na bázi vody nebo alkoholů), krémy nebo masti obsahující sloučeniny podle vynálezu. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také začleněny do gelů nebo matric k aplikaci jako náplasti, které umožňují řízené uvolňování sloučenin transdermální bariérou.

Prostředky v pevném stavu k rektálnímu podávání zahrnují čípky formulované známými postupy obsahující alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce II.

Procento aktivní složky v prostředcích podle vynálezu se může měnit tak, aby tvořilo podíl vhodné dávky. Případně může být současně podáno více dávek. Použitá dávka může být určena lékařem nebo kvalifikovanou lékařskou osobou a závisí na žádaném terapeutickém účinku, cestě podání a trvání léčby a na stavu pacienta. Dávkovači režim při způsobu podle vynálezu zaručuje maximální terapeutickou odezvu dokud nedojde ke zlepšení a potom minimální účinnou hladinu, která přináší úlevu. Ob64 vykle může být orální dávka 0,1 mg/kg až přibližně 100 mg/kg, s výhodou přibližně 0,1 mg/kg až 20 mg/kg a nejvýhodněji přibližně 1 mg/kg až 20 mg/kg a i.v. dávka přibližně 0,1 pg/kg až přibližně 100 pg/kg, s výhodou přibližně 0,1 mg/kg až 50 mg/kg. V každém jednotlivém případě se dávky určují v souladu s určujícími faktory pro léčeného pacienta, jako je věk, celkový zdravotní stav a jiné charakteristiky, které mohou ovlivnit účinnost prostředku podle vynálezu.

Kromě toho může být sloučenina obecného vzorce II podávána tak často jak je potřeba k dosažení žádoucího terapeutického účinku. Někteří pacienti mohu rychle reagovat na vyšší nebo nižší dávku a mohou shledávat podstatně slabší udržovací dávky za přiměřené. U jiných pacientů může být nutné dlouhodobé léčení 1 až 4 dávkami denně, s výhodou jednou až dvakrát denně, podle fyziologických požadavků každého jednotlivého pacienta. Obvykle může být účinný produkt podáván orálně 1 až 4x za den. U jiných pacientů může být ovšem nutné nepředepisovat více než jednu až dvě dávky za den.

Sloučenina obecného vzorce II vykazuje výrazné farmakologické účinky podle testů popsaných v literatuře, přičemž se má zato, že výsledky testů jsou v korelaci s farmakologickou činností u lidí a jiných savců. Následující výsledky farmakologických testů in vitro a in vivo jsou typické pro sloučeninu obecného vzorce II.

Následující farmakologické testy vyhodnocují inhibiční působení sloučeniny obecného vzorce II na fibrinogenem zprostředkovanou agregaci destiček, vazbu fibrinogenu na thrombinem stimulované destičky a inhibici ex vivo agregace destiček vyvolané ADP a výsledky těchto testů jsou v korelaci s inhibičními vlastnostmi sloučeniny obecného vzorce II in vivo.

Zkouška agregace destiček je založena na zkoušce popsané • 4 4 44 4 ·4 44

4444 444 4444 • 4 4 4 4 4 4 · 4 4 4 • · 4444 4444 4 444 444

444 444 4 4 • 4 444 44 4 44 44 v literatuře (Blood 66 (4), str. 946 až 952, 1985). Zkouška fibrinogenové vzby je v podstatě zkouškou, kterou popsal Z. M. Ruggeri a kol., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, str. 5708 až 5712, 1986) a E. F. Plow a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 8057 až 8061 (1985). Zkouška inhibice agregace destiček vyvolané ADP ex-vivo je založena na zkoušce, kterou popsal Zucker, Platelet Aggregation Measured by the Photoeletric Method Methods in Enzymology 169, str. 117 až 133 (1989).

Zkouška agregace destiček

Příprava fixně aktivovaných destiček

Destičky se izolují z lidských koncentrátů destiček technikou gelové filtrace, jak ji popsal G. A. Margueri a kol. (J. Biol. Chem. 254, str. 5357 až 5363, 1979) a Z. M. Ruggeri a kol., (J. Clin. Invest. 72, str. 1 až 12, 1983). Destičky se suspendují v koncentraci 2xlO⁸ buněk/ml v modifikovaném Tyrodově pufru prostém vápníku, obsahujícím 127 mM chloridu sodného, 2 mM chloridu hořečnatého, 0,42 mM dinatriumhydrogenfosforečnanu, 11,9 mM hydrogenuhli či tanu sodného, 2,9 mM chlorid draselný, 5,5 mM glukosy, 10 mM HEPES při hodnotě pH 7,35 a 0,35 % lidského albuminového séra (HSA). Tyto promyté destičky se aktivují přidáním lidského a-thrombinu v konečné koncentraci 2 jednotky/ml, následovaným inhibitorem thrombinu 1-2581 v konečné koncentraci 40 μΜ. Do aktivovaných destiček se přidá paraformaldehyd v konečné koncentraci 0,50 % a inkubují se 30 minut při teplotě místnosti. Fixované aktivované destičky se získají 15 minutovým odstřelováním při 650xg. Pelety destiček se promyjí čtyřikrát uvedeným Tyrodovým pufrem - 0,35% HSA a resuspendují se na 2xlO⁸ buněk/ml v témže pufru.

Zkouška agregace destiček

Fixované aktivované destičky se inkubují s volenou dávkou testované sloučeniny z hlediska zabránění agregaci destiček po ·· 9

9999 9 dobu jedné minuty a agregace se zahájí přísadou lidského fibrinogenu v konečné koncentraci 250 pg/ml. K záznamu agregace destiček se použije profileru agregace destiček model ΡΑΡ-4. Rozsah inhibice agregace se vyjadřuje jako procento pozorované míry agregace v nepřítomnosti inhibitoru. Pro každou sloučeninu se pak vypočte ICso, což je množství inhibitoru potřebné ke snížení míry agregace o 50% (například E. F. Plow a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 8057 až 8061, 1985).

Zkouška vazby fibrinogenu

Destičky se zbaví zbytků plasmy technikou gradientu hustoty albuminu, kterou popsal Ρ. N. Walsh a kol. (Br. J. Haematol. str. 281 až 296, 1977), jak ji modifikovali V. TrapaniLombardo a kol., (J. Clin. Invest. 76, str. 1950 až 1958, 1985). V každé pokusné směsi se destičky stimulují v Tyrodově pufru ( Z.M. Ruggeri a kol., J. Clin. Invest. 72, str.l až 12, 1983) lidským a-thrombinem 10 minut při teplotě 22 až 25 °C (3,125 xlO¹¹ destiček na litr thrombinu při 0,1 NIH jednotek/ ml). Přidá se pak Hirudin ve 25-násobném přebytku (jednotka/ jednotka) pět minut před přidáním izotopem ^12SJ značeného fibrinogenu a testované sloučeniny. Po těchto přísadách je konečný počet destiček ve směsi lxlO¹¹/litr. Po inkubaci dalších 30 minut při teplotě 22 až 25 °C se vázaný a volný ligand oddělí odstředěním 50 μΐ směsi až 300 μΐ 20% sacharosy při 12000 x g v trvání 4 minut. Peleta destiček se oddělí od zbytku směsi ke zjištění radioaktivity, vázané na destičky. Ve směsích obsahujících nadbytek neznačeného ligandu se měří nespecifická vazba. Jsou-li křivky vazby analyzovány Scatchardovou analysou, odvozuje se nespecifická vazba jako parametr z vazební isothermy pomocí počítačového programu (P. J. Munson, Methods. Enzynol. 92, str. 542 až 576 (1983). Ke zjištění koncentrace f

každé sloučeniny potřebné k inhibici 50 % fibrinogenové vazby na thrombinem stimulované destičky (ICso) se testuje každá sloučenina při alespoň šesti koncentracích fibrinogenu znače• · »· · • · • · · • 9 · · « • · něho ¹²⁵J drženého na 0,176 pmol/l (60 gg/ml). Hodnota ICso se odvodí z vynesení vazby zbytkového fibrinogenu v závislosti na logaritmu koncentrace sloučenin ve vzorku.

Inhibice agregace destiček vyvolané ADP ex-vivo

Experimentální protokol

Kontrolní krevní vzorky se získají 5 až 10 minut před podáním testované sloučeniny psům mongrel o hmotnosti 10 až 20 kg. Sloučenina je podána intragastrikálně vodnou dávkou nebo orálně v želatinové kapsli. Vzorky krve (5 ml) se odebírají ve 30-minutových intervalech po dobu tří hodin a pak 6, 12 a 24 hodin po dávce. Každý vzorek krve se získá z mozkové žíly a odebere se přímo do plastové injekční stříkačky obsahující jeden díl 3,8 % trinatriumcitrátu na 9 dílů krve.

Agregace psích destiček ex-vivo

Krevní vzorky se odstředují po dobu 10 minut při otáčkách 1000/min k získání plasmy bohaté na destičky (PPR). Po odstranění PRP se vzorek odstředuje dalších 10 minut při otáčkách 2000/min k získání plasmy chudé na destičky (PPP). Počet destiček v PRP se zjistí pomocí čítače Coulter (Counter Electronic, Hialeah, FL). J—1 i koncentrace destiček v PRP větší než 300 000 destiček/μΐ, zředí se PRP pomocí PPP k nastavení počtu destiček na 300 000 destiček/μΐ. Podíly PRP (250 μΐ) se pak umístí do si1ikonizovaných skleněných kyvet (7,25x55 mm, Bio/ Data Corp., Horsham, PA). Přidá se Epinephrin (konečná koncentrace 1 μΜ) do PRP, která se inkubuje jednu minutu při teplotě 37 ’C. Do PRP se přidá stimulátor agregace destiček, ADP na konečnou koncentraci 10 μΜ. Agregace destiček se sleduje spektrofotometr i cky za použití aggregometru v průchozím světle (Bio/Data Plated Aggregation Profiler, model PAP-4, Bio/Data Corp., Horsham, PA). K testování sloučeniny se zaznamenává • 4

· dvojitě rychlost změny (sklon) průsvitnosti a maxima průsvitnosti (maxima agregace). Data agregace destiček jsou vyjádřena jako procento poklesu (průměr + SEM) ve sklonu nebo se maximum agregace porovnává s hodnotami získanými z kontrolní PRP, která je připravena z krevních vzorků, získaných před podáním testované sloučeniny.

Sloučenina obecného vzorce II vykazuje výraznou aktivitu v uvedených testech a považuje se za užitečnou v prevenci a k léčení thromosy spojené s některými chorobnými stavy. Antithrombické působení při zkoušce agregace psích destiček ex vivo je předpokladem takového působení u lidí (například J. L. Catalfamo a W.Jean Dodds, Isolation of Platelets from Laboratory Animals Methods Enzymol. 169, část A, 27, 1989). Výsledky zkoušek sloučeniny obecného vzorce II uvedenými způsoby jsou shrnuty v tabulce VI. V téže tabulce jsou také výsledky porovnávacích zkoušek pro 4,4-(piperidy1)butanoylglycylasparagy1tryptofan, tedy sloučeniny podle zveřejněného evropského patentového spisu číslo EP 0 479 481. (V následující tabulce jsou v prvním řádku výsledky zkoušek sloučeniny podle příkladu 15 a ve druhém řádku pro porovnání výsledky testu uvedené sloučeniny podle evropského patentového spisu číslo EP O 479 481).

Tabulka VI

Inhibice agregace Dávka fixované destičky (ICso μΜ) (mg/kg)

Inhibice agregace destiček vyvolané ADP ex-vivo procento inhibice ex vivo agregace destiček po orálním podání

0,097

0,047 hodiny

1	3	6	12	24
ÍOO	100	100	98	50
53	<20

• · • · · ·· · ···· · ··· ··· • · • · · ·

Pracovníkům v oboru shora uvedené příklady vynález a jeho přednosti dostatečně objasňují a znova se připomíná, že není záměrem, aby vynález v nějakém smyslu omezovaly.

Průmyslová využitelnost

Stabilní, nehygroskopická krystalická forma N-[N-[N-(4-(piperidin-4-ylJbutanoyl]-N-ethylglycy1]ových derivátů která má antithrombické účinky, zahrnující inhibici shlukování destiček a vytváření thrombu u savců pro výrobu farmaceutických prostředků pro prevenci a léčení thrombosis spojené s chorobnými stavy, jako je infarkt myokardu, mrtvice, onemocnění periferních arterií a roztroušené intravaskulární koagulace.

Claims (24)

1. β-Benzylester N-(N-terc.-butoxykarbonyl-N-ethylglycyl](L)-asparagové kyseliny.

2. (L)-β-Cyk1ohexy1 a 1aninamid N-[N-[N-[4-[N-benzyloxykarbonylpiperidin-4-ylJbutanoyl]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy1]-βbenzytesteru

3. 4-(4-Piperidin)buty1idenylkarboxylová kyselina.

4. (L)-fi-Cyklohexylalaninamid N-[N-[N-[3-[N-benzyloxykarbony1-4-piperidin)propylideny1karbony1]-N-ethylglycyl]-(L)-asparagy 1]-β-benzy1 esteru.

5. Nehygroskopický krystalický N-[N-[N-(4-(piperidin-4-yl)butanoyl]-N-ethylglycyl]—(L)-asparagyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamid nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl.

6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje β-benzylester N-(N-terc.-butoxykarbony1-Nethylglycyl]-(L)-asparagové kyseliny podle nároku 1 a farmaceutický nosič.

7. Způsob přípravy nehygroskopickéhpo krystalického N-[N[N-(4-(piperidin-4-ylbutanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl] (L)-3-cyklohexylalaninamidu ,vyznačující se t í m , že se na hygroskopický krystalický N-[N-[N-(4-(piperidin-4-ylbutanoyl)-N-ethylglycyl]-(L)-asparagyl]-(L)-β-cyklohexylalaninamid působí prostředím o přibližně 40 až 100% realativní vlhkosti o teplotě přibližně 20 až 80 °C.

f

8. Způsob podle nároku 7,vyznačující se t í m, že se působí prostředím o přibližně 65 až 80% real^tivní vlhkost i.

9 0 9

9 0 9 ·

9. Způsob podle nároku 7,vyznačující se t í m, že se působí prostředím o přibližně 40 až 80% reaktivní vlhkost i.

10. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t í m, že se působí za statických podmínek.

11. Způsob podle nároku 7,vyznačující se t í m, že se působí za dynamických podmínek.

12. Způsob přípravy soli sloučeniny obecného vzorce

O O Ε¹ E² O

TFA· HN-(CH₂)_P—IL-hn—ch—u—N CH—C—G ^B CH₂CO₂P¹ kde znamená

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alky 1 cykloalkylovou , alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

E¹ atom vodíku,

E² α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující a-aminokyseliny, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylal kýlovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, heterocyklylovou, substituovanou heterocyklylovou, heterocyklylalkylovou, substituovanou skupinu heterocyklylalkylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, na které jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh,

9 9

G skupinu OR¹ nebo NR¹ R² ,

R¹a R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alky1cykloa1ky1ovou, alky 1 cykloalkyl alky lovou , arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou, p číslo 1 až 4,

P* skupinu chránící kyselou skupinu, vyznačující se tím, že se kopuluje sloučenina obecného vzorce

O

P²-N-(CH₂)_p—COH B kde znamená P² skupinu chránící aminoskupinu labilní za kyselých podmínek, první meziprodukt obecného vzorce

P²-N-(CH₂)_p·

I

B

HN—-CH—CO₂H CH₂CO₂P¹ se kouluje se sloučeninou obecného vzorce

Ε¹ E² O

I I II

HN-CH-C-G ’ » a druhý meziprodukt obecného vzorce

O

HN—CH

B l II CH-C-G

CH₂CO₂P¹ ·· · »· ** • · ♦ <· » · « · · ♦ » · · • · ·· · » ·· · ···

9 9 · · •e » 99 99

I se nechává reagovat s trifluoroctovou kyselinou k odstranění chránící skupina P².

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se t í m , že P¹ znamená při hydrogenaci labilní skupinu chránící kyselou skupinu.

14. Sloučenina obecného vzorce

HN—CHI

-NCH₂CO₂P¹

E² O

I //

CH-C—G kde znamená

P³ skupinu chránící aminoskupinu,

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

P* skupinu chránící kyselou skupinu,

E¹ atom vodíku,

E² α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující a-aminokyseliny, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alky1cykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, heterocyklylovou, substituovanou heterocyklylovou, heterocyklylalkylovou, substituovanou skupinu heterocyklylaikylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, na které jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-členný azacykloalkanový kruh, «? ·

Ur » · · « • · e> « » « • · · · · · · • « · · · 9 ··· · · · • · ς · » · «ο · ·

G skupinu OR¹ nebo NR¹ R² ,

R¹ a R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou, p číslo 1 až 4.

15. Sloučenina podle nároku 14, kde P¹ znamená při hydrogenaci labilní skupinu chránící kyselou skupinu a P³ při hydroge naci labilní skupinu chránící aminoskupinu.

16. Sloučenina podle nároku 15, kde znamená

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alky 1 cykloalkylovou , alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

E¹ atom vodíku,

E² atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylal kýlovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou nebo substituovanou skupinu aralkylovou,

L skupinu OR¹ nebo NR^XR² ,

R¹a R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou a f

p číslo 1 nebo 2.

17.

Sloučenina podle nároku 16, kde znamená * 9 <>«··· »

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alky lcykloa 1 kýlovou nebo alkylcykloalkylalkylovou,

E² atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylalkylovou.

18. Sloučenina podle nároku 17, kde znamená

B skupinu alkylovou,

E² skupinu alkylovou, cykloalkylovou nebo cykloalkylalkylovou,

R^la R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou nebo alkylcykloalkylalkylovou, p číslo 1.

19. Sloučenina podle nároku 18, kde znamená

P³ skupinu benzyloxykarbonylovou,

B skupinu ethylovou,

P¹ skupinu benzylovou,

E² skupinu cyklohexyImethylovou,

G skupinu NH2.

20.

Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce

CH-C—G

ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ • Φ Φ φφφφ φ φ Φ « Φ ΦΦ Φ

Φ Φ Φ Φ φ Φ φ ΦΦΦ ΦΦΦ

ΦΦΦ · · φ Φ Φ Φ Φ Φ ·

4 « kde znamená

Ρ³ skupinu chránící aminoskupinu,

B skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylaikylovou, alky 1 cykloalkylovou , alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou,

P’ skupinu chránící kyselou skupinu,

E¹ atom vodíku,

E² α-uhlíkový postranní řetězec přírodně se vyskytující a-aminokyseliny, atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylaikylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylal kýlovou, arylovou, substituovanou skupinu arylovou, aralkylovou, substituovanou skupinu aralkylovou, heterocyklylovou, substituovanou heterocyklylovou, heterocyklylalkylovou, substituovanou skupinu heterocyklylalkylovou, nebo E¹ a E² spolu s atomem dusíku a uhlíku, na které jsou vázány, tvoří 4-členný, 5-členný, 6-členný nebo 7-ělenný azacykloalkanový kruh,

G skupinu OR¹ nebo NR^!R²,

R¹ a R² na sobě nezávisle atom vodíku, skupinu alkylovou, cykloalkylovou, cykloalkylalkylovou, alkylcykloalkylovou, alkylcykloalkylalkylovou, arylovou, aralkylovou, alkylarylovou nebo alkylaralkylovou, p číslo I, až 4, vyznačující se tím, že se kopuluje derivát 4-piperidin)butylidenkarboxylové kyseliny obecného vzorce

- 77 • 4 • 4

4 4 • 4 44

444 4 4 4 • 4 » 4 4· s tripeptidem obecného vzorce θ 8 í ^{£2 0}

H-N— (úH₂)_p II hn—CH —U—N-CH -C—G ^B CH₂CO₂P¹ nebo s jeho adiční solí s kyselinou, přičemž jednotlivé symboly mají shora uvedený význam.

21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že P¹ znamená při hydrogenaci labilní skupinu chránící kyselou skupinu a P³ při hydrogenaci labilní skupinu chránící aminoskupinu.

22. Sloučenina obecného vzorce kde znamená

P³ skupinu chránící aminoskupinu.

23. Sloučenina podle nároku 22, kde P³ znamená při hydrogenaci labilní skupinu chránící aminoskupinu.

24. Sloučenina podle nároku 23, kde P³ znamená benzyloxykarbonylovou skupinu.