CZ562990A3 - Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje - Google Patents
Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ562990A3 CZ562990A3 CZ19905629A CZ562990A CZ562990A3 CZ 562990 A3 CZ562990 A3 CZ 562990A3 CZ 19905629 A CZ19905629 A CZ 19905629A CZ 562990 A CZ562990 A CZ 562990A CZ 562990 A3 CZ562990 A3 CZ 562990A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mutant
- dsm
- subsp
- bacillus thuringiensis
- strains
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title abstract description 56
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title abstract description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title description 14
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 claims abstract description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 24
- 241000193369 Bacillus thuringiensis serovar tenebrionis Species 0.000 claims description 20
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 14
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 claims 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 241000193367 Bacillus thuringiensis serovar san diego Species 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 238000001350 scanning transmission electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 4
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-TUNUFRSWSA-N (2R,3S,4S,5S)-2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@H]([C@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)C(O)=O)C(O)=O)[C@H](O)[C@H]1O OTLLEIBWKHEHGU-TUNUFRSWSA-N 0.000 description 1
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001124134 Chrysomelidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001692 EU approved anti-caking agent Substances 0.000 description 1
- 241001529716 Entomophaga Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N LPS with O-antigen Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O5)O)O4)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)NC(C)=O)O2)NC(C)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)OC([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H]([C@@H](O)COC2[C@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]([C@@H](O)CO)O2)O)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCCN)[C@@H]([C@@H](O)CO)OC([C@H]1O)O[C@H]1[C@H](O[C@]2(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@]3(O[C@@H]([C@@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OCCN)C3)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C2)[C@@H](O)CO)C(O)=O)C[C@](O[C@@H]1[C@@H](O)CO)(OC[C@H]1O[C@@H](OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O2)O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@H]([C@@H]1OP(O)(O)=O)OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O BFVQTKQTUCQRPI-YYEZTRBPSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256626 Pterygota <winged insects> Species 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000254105 Tenebrio Species 0.000 description 1
- 241000254107 Tenebrionidae Species 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N Thuringiensin Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical class [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940074152 thuringiensin Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000406 trisodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019801 trisodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010246 ultrastructural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje
Oblast techniky
Vynález se týká mutantu mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaného jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsobu jeho přípravy a pesticidního prostředku, který ho obsahuje.
Dosavadní stav techniky
Obchodní přípravky Bacillus thuringiensis jsou celosvětově používány pro biologický boj proti škodlivému hmyzu. Předností těchto bakteriálních insekticidů jsou vysoká selektivita pro velmi omezený obor ničeného škodlivého hmyzu a biologická odbouráte lnost .
Obchodní přípravky Bacillus thuringiensis se mohou aplikovat až do doby sklizně bez jakéhokoliv vedlejšího nepříznivého působení .
Bacillus thuringiensis je tyěinkovitá aerobní, sporotvorná bakterie, jedinečně charakterizovaná produkcí jedné nebo několika inkluzí při sporulačním procesu, označovaných jakožto parasporální krystaly. Tyto krystaly jsou tvořeny vysokomolekulárními bílkovinami, označovanými jakožto endotoxiny delta. Endotoxiny delta jsou účinnou látkou obchodně dosptupných přípravků Bacillus thur ingi ens i s.
Byly identifikovány mnohé kmeny Bacillus thuringiensis s různým spektrem hostitelského hmyzu. Klasifikují se na různé podruhy na základě svých antigenů. Zvláštní význam má
o ε poddruh kurstaki Bacillus thuringiensis a poddruh aizawai Bacillus thuringiensis pro potírání motýlů řádu Lepidoptera, bac illus thurigiensis poddruh israelensis pro potírání dvoun křídlého hmyzu a Bacillus thuringiensis, poddruh tenebrionis pouzíváný pro potírání brouků.
První izolace pro brouky toxického Bacillus thuringien— sis byla popsána v roce 1983 /A. Krieg a kol., Z. and. Ent.
96, str. 500 až: 508, evropský patentový spis číslo 0149162 A2/.
Isolát, označený jakožto Bacillus thuringiensis subs.p. tenebrionis, je uložený v německé sbírce German Collection oý Microorganisrns. pod číslem 1SM 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis byl izolován v roce 1982 z usmrcených kukel larvy potemníka moučného Tenebrio Mol.it,or /Tenebrionidae, Coleoptera/o Kmen produkuje, v každé buňce jedna sporu a jeden nebo několik inaekticidních parasporálních krystalů, které mají plochou, destičkovítou formu s délkou hrany přibližně 0,8 /um. až 1,5 /um. Patří k serotypu H8a,8b a pathotypu C Bacillu thuringiensis /Krieg a kol., System. Appl. Mic.robiol, 9, str. 138 až 141, americký patentový spis číslo 4 766203, 1988/.
Je toxický pouze k určitým larvám brouků /Chrysomelidae/ živicím se listy, je vsak neúčinný proti housenkám /Bepidoptera/, proti komárům /Diptera/ a proti dalšímu hmyzu.
Zjistilo se, že Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis je účinným prostředkem ‘proti larvám mandelinky bramboro-'' vé. Po požití krystalů a spor mikroorganismu Bacillus thurin- 3 giensis, subsp. tenebrionis nebo izolovaných krystalů larvami, a v určité míře dospělými jedinci, přestane mandelinka bramborová /Leptinotarsa decemlineata/přijímat potravu. Larvální stadium L1 - L3 hyne v průběhu í až 3 dnů /Schnettsr a kol., Fundamental and applied aspects of invertebrste pathology /základní a použitá patologie bezobratlých/, R.A. Samson a kol·., Proceedings of the 4th Int. colloquium of Invertebrate rathology, str. 555, 1986/.
i
Nejnověji se zjistilo, že Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis produkuje kromě aktivních krystalů proti broukům jiný parasporální krystal, který má vřetenový, kulovitý nebo destičkovitý tvar /A. M. Huger a A. Krieg, J. Appl. Ent., 108, str·. 490 až: 497, 1989/. Účinnost tohoto druhého krystalu dosud nebyla známa.
Byly vyvinuty čtyři obchodní přípravky Bacillus thuringiensis; subsp. tenebrionis pro potírání brouku; N0V0D0R spoft lačnosti. NovoNordisk A/S, TRIDENT společnosti Sandoz, DiTerra společnosti Abbottt Laboratories lne. a EOIL společnosti Ecogen
Izolace dalšího kmene Bacillus thuringiensis, toxického pro brouky, byla popsána v roce 1986 /Hernnstadt a kol., Bio/ Technology, ročník 4, str. 305 až 308, 1986, americký patentový spis číslo 4 764372, 1988/. Tento kmen, označený jako Bacillus thuringiensis subsp. san diego, M7, je uložen ve výzkumné laboratoři Northern Regional Research •‘'aboratory, USA pod číslem NRRL B-15939. Obchodní produkt na bázi mikroorganismu Bacillus thuringiensis subsp. san diego byl vyvinut společnosti Mycogen Corp.
- 4 Srovnávací studie Bacillus thuringiensis subsp. ^nebrio. il tí ms, DSN 2803 a Bacillus thuringiensis subsp. san diego, NRRLB 15939 včetně fenotypové charakterizace vegetativních buněk, charakterizace parasporálního krystalu a analyzy plasmidu DNA » w však ukázaly, že Bacillus thuringiensis subsp. san diego je zřejmě identický se dříve izolovaným kmenem DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis /Krieg a kol., J, Appl. Ent. 104, str. 417 až. 424, 1987/. Kromě toho nukleotidové sekvence a odvozené aminokyselinové sekvence proti broukům účinných genů endotoxinu delta mikroorganismu ^acillus thugingiensis subsp.
ii ... . ... zz .
tenebrionis a ^acxlluns thuringiensis subsp. san diego jsou ídentické.
^a stejných kultivačních podmínek shora uvedený typ krys1/ talů je také syntetizován mikroorganismem Bacillus thuringiensis subsp. san diego /A.M. Hunter a A. Krieg, J. Appl. Ent.,
10tí, str. 490 až 497, 1989/.
Podle autorů H. de Barjac a E. Frachon /Entomophaga 35/2/, str. 233 až 240, 1990/ isolát san diego’' je podobný izolátu tenebrionis a proto není možno považovat je za rozdílné poddruhy ·
Užitečnost kmene Bacillus: thuringiensis k potírání brouků závisí na účinnosti a ekonomické produkci toxinů účinných proti broukům a na potenci vyrobeného produktu. To je naopak závislé na množství endotoxinů delta, které se mohou produkovat f.ermentgECÍ kmenů Bacillus thuringiensis účinných při potírání brouků.
- 5 .Mikroorganismu fiacillus thuringiensis se může používat po mnoho let pro výrobu insekticidně účinné látky, avšak jakkoli. mutanty B. thuringiensis se zvýšeným výtěžkem endotoxinů delta by byly výhodné, nebyly dříve takové mutanty popsány. Mutanty produkující endotoxiny delta ve vyšších výtěžcích by umožňovaly účinnější a ekonomičtější produkci toxinů B. thuringiensis. a $ožnost. výroby produktů Bo thuringiensis se zvýšenou potencí za stejnou cenu, To by naopak bylo výhodné pro uživatele, jelikož by se skladovaly snížené objemy pesticidních prostředků a byla by nutná manipu^lace se sníženými objemy pro danou výměru. Kroí mě toho by uživatelé měl$ menší problémy s obaly a snížilo by se zatěžování životního prostředí těmito obaly.
' Zlepšení produkce endotoxinů delta mikroorganismem físcillus thuringiensin subsp. tenebrionis. mutací nebylo dosud popsáno.
«Jedním problémem, spojeným s použitím zvláště mikroorganismu B. thuringiensis subspecies tenebrionis při potírání larev brouků, je poměrně nízká potence nebo agresivnost přípravků, vyžadující použití poměrně velkého množství přípravku na ošetřovanou výměru, například 5 sž. 10 litrů/ha ve srovnání s 1 až 2 1/ha většiny jiných produktů B. thuringiensis a většiny jiných insekticidů. Proto se jeví potřeba nových produktů se zvýšenou účinností.
Jedním řešením tohoto problému je koncentrování přípravků.
To však značně zvyšuje výrobní náklady ve srovnání^ s úsporami dosaženými při skladování a při manipulaci s přípravky,,
Elegantnějším řešením je. vyvinutí mutantů existujících mikroorganismů kmenů B. thuringiensis, schopných produkce pod6 statně větších množství endotoxinu delta na buňku.
Vynález se tedy týká mutantu kmenů Bacillus thuringiensis, schopného produkce podstatně většího množství toxinů než jejich materský kmen.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, produkující alespoň dvakrát více insekticidních de1ta-endotoxinů než mateřský kmen.
Pesticidní prostředek pro boj se škodlivým hmyzem, zvláště ze souboru zahrnujícího motýly, dvoukřídlé a brouky a především pro boj s mandelinkou bramborovou, spočívá podle vynálezu v tom, že jako účinnou látku obsahuje mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, produkující alespoň dvakrát více insektici dních de1ta-endotoxinů než mateřský kmen. Tento pesticidní prostředek může přídavně obsahovat zemědělsky vhodná ředidla a/nebo nosiče a povrchově aktivní látku.
Způsob přípravy mutantu kmenů mikroorganismu Bacil lus thurigiensis a jeho selekce spočívá podle vynálezu v tom, že se mateřský kmen
i) zpracovává jakýmkoliv chemicky vhodným mutagenem, jako například N-methy1-N'-nitro-N-nitrosoguanidinem nebo ethylmethansu1fonátem, za působení elektromagnetického záření, jako jsou paprsky gama, rentgenový paprsky nebo ultrafialové záření , ii) takto zpracované mutanty se nechávají růst v modifikovaném živném sporulačním prostředí, obsahujícím fosfát a popřípadě doplňky modifikovaného živného sporulaěního prostředí, iii) oddělí se průsvitné kolonie a nechávají se růst v prostředí, které neztekucuje při zahřívání a iv) vyselektují se pravé asporogenní kmeny tepelným zpracováním kolonií v modifikovaném živném sporulačním prostředí, obsahujícím fosfát, doplněném chloridem hořečnatým a doplňky módi7 fikovaného živného sporulačního prostředí.
Takto oddělené kolonie nechávají růst na normálním produkčním prostředí a pak se dále provádí konečné oddělení kmenů, schopných zvýšení produkce delta endotoxinů.
Pesticidní prostředek je vhodný pro potírání škodlivého hmyzu, při kterém se na plochy, napadené škodlivým hmyzen, nanáší pesticidní prostředek podle vynálezu.
Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, který produkuje vysoká množství endotoxinů delta, byl deponován organizací Deutsche Sammlung von Mikroorganisměn und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg lb, D-33OO Braunschweig, Německo, pro účely patentového postupu na základě dále uvedených hodnot. DSM je mezinárodní depozitář podle mezinárodní Budapeštské dohody trvalého uložení podle odstavce 9 této mezinárodní dohody.
den uložení 10. srpna 1989 reference uložení NB 176—1 označení DSM DSM 5480
Mutant DMS 5480 se získá mutací mikroorganisrnu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, kmen DMS 5526, který je také deponován podle mezinárodní Budapeštské dohody, jak dále uvedeno: den uložení 14. září 1989 reference uložení NB 125 označení DSM DSM 5526
Obecně se vynález týká mutantů a variantů mikroorganismu Bacillus thuringiensis, produkujících vysoká množství endotoxinů delta ve srovnání se svým mateřským kmenem.
V této souvislosti se vysokým množstvím míní alespoň dvonásobnmé množství avšak spíše ještě větší množství.
Obecně avšak zvláště se vynález týká endotoxinů delta, produkovaných mutantem mikroorganismu Bacillus thuringiensis, který působí na stejné druhy škodlivého hmyzu jako endotoxiny delta mateřského mikroorganismu Bacillus thuringiensis, jakož také proti motýlům (mutanty mikroorganismu Bacillus thuringiensis susp. kurstaki a subsp. aizawai), dvoukřídlému hmyzu (mutanty mikroorganismu Bacillus thuringiensis susp. israelensis) nebo
- 74broukům (mutanty mikroorganismu Bacillus thuringiensis susp. tenebrionis).
Zvláště se vynález týká mikroorganismu Bacillus thuringiensis patřícího do podtrídy tenebrionis a endotoxinu delta, produkovaného tímto mikroorganismem a účinného proti broukům.
vletečKA zELtNi *
A PAj
120 00 P/ána2, Hálkcft i republika
Z tohoto hlediska se vynález zvláště týká mutantu nebo
a.
variantu mikroorganismu B. thuringiensis suhsp. ter^brionis, schopného produkovat více než trojnásobek endotoxinu delta ve; srovnání s kmenem DSM 2803.
kmenů
Vynález ae. dále týká variantu nebu mutantuímikroorganismu B, thuringiensis suhsp. tenebrionis, které jsou schopny produkovat parasporální krystal mající střední délku hrany alespoň 2 mikrometry.
Vynález se také týká variantu nebo mutantu kmenů B. thuringiensis subsp. tenebrionis, vykazujících frekvenci sporulace
6.
•40 až 100 krát nebo dokonce 4.0 krát nižší, než je frekvence sporulace. mateřského kmenu nebo kmenu DSM 2803*
Podle zvlášt výhodného provedení se vynález týká deponovaného mutantu B. thuringiensis subsp. tenebrionis, DSM 5480«,
Při.práci na tomto vynálezu byl izolován mutant mikroorganismu B. thuringiensis subsp. tenebrionis /DSM 5480/ s více než dvojnásobným. množstvím produkovaného endotoxinu delta ve srovnání s mateřským kmenem /DSM 5526/. Fázová kontratní mikroskopie, řádkovaní elektronová mikroskopie a transmisní elektronová mikroskopie dokládají, že vysoká produktivita tohoto mutantu je podmíněna změnami řízení produkce endotoxinu delta ve vztahu ke sporulaci, vedoucími k produkci krystalů bílkoviny, která je až více než pět krát vyšší než produkce krystalů kmeny existujícího mikroorganismu Bacillus. thuringiensis, který je účinný proti broukům» Tento úzký vztah mezi vytvářením krystalu a sporulaci se zdá býtoodstraněn a mutant produkuje vy9 soké množství endotoxinu delta před sporulací.
Vynález^se.. týká použití vará^nj^r^bo^mútantu kmenů podle vynálezu při prOd^kci insektícidních oroduktů na bázi mikroorgamsmu B. thuringie,n&i§j^přičemž se variant nebo mutant kmene B. thuringiensis kultivuje ve vhodírém-dsiiltivačním pro-
středí, obsahujícím zdroje uhlíku, dusíku a dalších složek, známých,,<p'racovníkům v oboru, po vhodnou dobu, načež sKjendotoxíhy delta izolují.
Vynález se také týká mikroorganismem B. thuringiensis· pro dukovaného endotoxinu delta, produkovaného shora uvedeným způsobem a používaného jakožto účinná látka v pesticidních prostředcích.
V takových prostředcích se endotoxiny delta mohou používat, buS samotné nebo ve směsi s jinými biologicky účinnými lát kami
Vynález se také týká takových pesticidních směsí nebo pro středků, které obsahují endotoxin delta, produkovaný mikroorganismem B. thuringiensis podle vynálezu ve směsi se zemědělsky vhodnými ředidly nebo nosiči.
Vynález se také týká takových pesticidních směsí nebo prostředků obsahujících endotoxin delta, produkovaný mikroorganismem B. thuringiensis, které v kapalné formě mají účinnost alespoň 15 000 BTTU/g, odpovídající alespoň hmotnostně 3 % bílkovinového krystalu insekticidního proti broukům nebo v suché formě mají účinnost alespoň 50 000 BTTU/g odpovídající alespoň hmotnostně 10 % bílkovinového krystalu insekticidního proti broukům.
Obzvláště se vynález týká pesticidních prostředků produkovaných DSM 5480, majících alespoň dvojnásobnou účinnost v.e srovnání s pesticidními prostředky produkovanými DSM 28Q3, nebo jinými kmeny Btt účinnými proti broukům
Prostředky podle vynálezu mohou mít jakoukoliv známou formu. z oboru agrochemikálií, například to mohou být suspenze, disperze, vodné emulze, popraše, dispergovatelné prášky, emulgovatelné koncentráty nebo granule. Kromě toho mohou být ve. vhodné formě pro přímé použití nebo ve formě koncentrátů hebo primárních prostředků, které vyžadují neředění vhodným množstvím vody nebo jiného ředidla před použitím.
Koncentrace insekticidních endotoxinů delta B. thuringiensis: v prostředcích podle vynálezu, používaných jako takových nebo ve: směsi, s jinými pesticidy, k nanášení na rostliny, je s výhodou hmotnostně 0,5 až přibližně 25 zvláště: hmotnostně 1 až 15 %·
Vynález se také týká způsobu boje proti škůdcům, přičemž se používá shora popsaných insekticidních prostředků na místa, napadené hmyzem.
Vynález se zvláště týká potírání motýlů, dvoukřídlého hmyzu a brouků a především se týká potíráni mandelinky bramborové · © výhodou se podle vynálezu používá 4,5 litrů na akr kapalného pesticidního prostředku neb.o přibližně 226 g na akr suchého pesticidního prostředku.
Aktivní přípravek B. thuringiensis nebo směs podle vynálezu se může nanášet přímo na rostlinu například nastříkáním nebo poprášením v době, kdy se; nežádoucí hmyz začne na rostlině vyskytovat. Výhodným způsobem nanášení je postřik. Obecně je důležité dosáhnout dobré kontroly škodlivého hmyzu v časných stadiích larválního vývoje, jelikož v takovém případě dochází k nejmenšímu poškození rostliny.
Způsob mutace kmenů Bacillus thuringiensis a selekce tapodstatně kových mutantů, které jsou schopny produkce^většich množství enčLotoxinů delta než mateřské kmeny, zahrnuje i/ zpracování mutagenem, ii/ takte zpracované mutanty se; nechávají růst na vhodném prostředí pro selekci asporogenních nebo oligosporogenních kmenů, iii/ oddělí se průsvitné kolonie a nechávají se růst v prostředí, které se neztekucuje při zahřátí a iv/ oddělí se skutečně asporogenní kmeny tepelným zpracováním kolonií.
Při takovém výhodném způsobu se takto oddělené kolonie nechávají růst v normálním produkčním prostředí a pak se provede konečné oddělení kmenů, které jsou schopny zvýšené produkce endotoxinu delta.
Při stupni /i/ shora uvedeného postupu, může být mutagenem jakýkoliv vhodný chemický mutagen, jako například TT-methylN'-nitro-N-nitrosoguanidin nebo ethylmethgmsulfonát nebo se mateřský kmen může zpracovat elektromagnetickým zářením, jako jsou ^“-paprstky, rentgenový paprsky nebo jako je ultrafialové záření*
Ve stupni /ii/ může být vhodným prostředím modifikované živné sporulační prostředí obsahující fosfát /prostředí NSMP/, které popsal Johns£on a kol. v publikaci Spores. VI, vyd.
P. Gerhard a kol., str. 248 až 254, 1975.
Ve stupni. /iv/ shora, popsaného způsobu může být vhodným prostředím prostředí NSMP doplněné chloridem hořečnatým a Gelm rite/, Keleo.
Jiným způsobem získání vysoce produktivních variantů nebo mutantů podle vynálezu může být růst mateřského kmene v ka/ fy palném prostředí a selekce spontaryích mutantů nebo variantů pa. rozprostření kultivační půdy na agarovém prostředí, vhodnén pro selekci, asporogenních. a/nebo oligosporogenních mutantů.
Může se použít také jiných způsobů oddělení vysoce produktivních variantů nebo mutantů podle vynálezu, jako je použití hmoty těchto mutantů přímo odstředěním, nebo jinými způsoby oddělování hmoty.
Příklad 1
Izoluje se mutn^t mikroorganismu B. thuringiensis subsp. tpnebrionia svíce než dvojnásobnou produkcí endotoxinu delta. Fázovou kontrastní mikroskopií, řádkovací elektronovou mikroskopií a transmisní elektronovou mikroskopií tohoto mutantu zjištěno, že vysoká produktivita tohoto mutantu je podmíněna změnami řízení ,produkce delta endotoxinu se: zřetelem na sporuláci., vedouc^ k produkci krystalů bílkoviny, která je až pětkrát vyšší než v případě krystalů produkovaných současnými, kmeny mikroorganismu Bacillus thuringiensis aktivními proti broukům. Úzký vztah mezi vytvářením krystalu a sporulací se zdá být odstraněn a mutant, produkuje vysoká množství .endotoxinu delta před sporulací.
Produkce vysokovýtěžkového mutantu
Spory mikroorganismu B. thuringiensis subsp. tenebrionis, kmen DSM 5526 se ozáří paprsky gamma v dávce 7 kGy. Ozářené spory se pak rozprostřou na NSMP agarové destičky /modifikované živné prostředí sporulační obsahující fosfát, popsané Johnsonem a kol., v publikaci Spores Yl, vyd. P. Gerhardt. a kol., str. 248 až 254, 1975/. Prostředí vhodné Í£do selekci asporogenní ch a/nebo oligosporogenních mutantů.
NSMP-agar.ové destičky se: inkubují při teplotě 30 °C po dobu dvou až tří dnů. Odeberou se: průsvitné kolonie a přenesou ae na NSMP gelritové destičky /NSMP prostředí, doplněné chloridem hořečnatým - 0,57 g/1 a Gelritem, Kelco - 20 g/1.
NSMP gelritové destičky se inkubují po dobu jedné hodiny při '-teplotě 90 °C a pak po dobu jednoho až dvou dnů při teplotě 30 °C.
Mutanty, které na NSMP gelritových destičkách dobře narostou, se· oddělí. Tímto/ způsobem se· oddělí všechny asporogenní mutanty, jelikož po tepelném zpracování nerostou.
Oddělené mutanty se nechají růst v třepačkách obsahujících obchodní prostředí. Množství produkovaného endotoxinu delta s.e stanoví imunologickými způsoby, jak bude dále popsáno.
Selektují se pouze mutanty produkující výrazně vyšší ijmožství delta endotoxinů než mateřský kmen.
Morfologie selektovaných mutantů ng pevném prostředí, a v kapalném prostředí se^ studuje fázovou kontrastní mikroskopií /zvětšní 2 500/ a řádkovací elektronovou mikroskopií a transmisní elektronovou mikroskopií. Sečte se počet spor a krystalů a stanoví se velikost bilkovinových krystalů.
Vedle získaných mutantů se selektuje mutant /DSM 5480/ pro vynikající schopnost produkovat endotoxin delta.
Množství endotoxinů delta, produkovaného mutantem DSM 5480, se. porovnává s množstvím produkovaným DSM 2803, původním izolátem z mikroorganismu Bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, kmen DSM 5526, používaným pro produkci prostředku N0V0D0R, Bacillus thuringiensis. subsp. tenebrionis., kmen KB 178, izolovaný ze Sanďozova ífí
Bacillus thuringiensis tenebrionis produktu TRIDENT z roku 1989 kmen NN' 198, izolovaný ze Sandozova B. thuringiensis. subs. tenebrionis. produktu TRIDENT z 1990, Bacillus thuringiensis subsp. san diego kmen NRRL-B-15939 a kmen NB 197, isolovaný ti v z Myeogenova B. thuringiensis subs. san diego produktu M-ONE' z 1990. Jak je uvedeno v tabulce I v příkladu 2, zlepšený mutant podle vynálezu produkuje 2 až 3,5 krát více endotoxinů delta fyž současně dostupné kmeny mikroorganismu Bcillus thuringiensis, účinné proti broukům.
Příklad 2
Porovnává se výtěžek endotoxinů delta mikroorganismu
Bacillus. thuringiensis suhspecies tenebrionis, mutant DSM 5480
- 15 s výtěžky endotoxinu delta mikroorganismu -scilius thuringiensis subspecies tenebrionis kmen^J DSM 2803 /původní isolát z mik roorganismu .^acillus thuringiensis subsp. tenebrionis/, DSM 5526 /produkční kmen společnosti Novo-Nordisk/ a NB 178 a NB. 198 /produkční kmeny společnosti Sandoz/ a''Bacillus thuringiensis subsp® san diego^, kmen NRRL-B 15939 a NB 197 /produkční kmeny společnosti Mycogen/ v obchodním prostředí. Každý z kmenů se nechává růst po dobu 17 hodin při teplotě 30 °C na skloněných agarech následujícího složení, vyjádřeného jakožto gramy na litr destilované vody:
Pepton, Difco 5 g Hovězí extrakt, Difco 3 g Agar, Difco 20 g Hodnota pH 7,0
Pak se. přenese 5 ml suspenze buněk z každého kmene do 100 ml produkčního prostředí v erlenmayerově baňce s přepážkovým dnem o obsahu 500 ml® Produkční prostředí sestává z následujících složek v uvedeném množství, vyjádřeném jakož to počet gramů na litr vodovodní vodys sojová moučka 50 g hydrolyzovaný škrob 40 g dihydrogenfosforečnan draselný 1,77 g monohydrogenfosforečnan draselný 4,53 g hodnota pfi 7,0
Naočkované baňky se inkubují při teplotě 30 °C za třepání /250/min/. Po 96 hodinách inkubace se kultivační půda zkouší na obsah, endotoxinu delta imunologickými způsoby®
Stanoví se množství produkovaného endotoxinů delta jednot livými kmeny stoupající imunoelektroforesou. /rocket immuno electrophoresis RIE/ a fotometrickou. imunozkouškou /PIA/ za použití protilátek proti, čištěným bílkovinovým krystalům mikroorganismu bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis.
Odváží se 400 mg každé kultivační půdy
Přidá se. 7 ml trojsodného fosforečnanového pufru. /0,125 M, hodnota pH 12/ do každého vzorku. Suspenze se pak protřepává po dobu jedné h diny k rozpuštění delta endotoxinových bílkovin.
Vzorky se. pak odstředí při počtu otáček 3 500/min v průběhu 15 minut., a zkouší se supernatant. na obsah endo toxinu RIE slektroforezou proti antiseru stoupajícímu proti čištěným bílkovinovým krystalům mikroorganismu fí. thugingiensiá. subsp. tenebrionis. Stanoví se množství endotoxinů delta se zřetelem na standard se známým obsahem krystalické bílkoviny.
Koncentrace krystalické bílkoviny se také stanoví fotometrickou imunozkouškou. Krystalické bílkoviny se rozpustí v alkalickém roztoku. Rozpuštěné bílkoviny se vysráží svými protilátkami. Míra této reakce se stanobí turbidimetricky. Množství endotoxinů delta se stanoví se zřetelem na standard sei známým obsahem krystalické bílkoviny.
Krystalické antigeny pro. produkci protilátek.,používaných, při zkouškách, se získají z krystalů izolovaných z mikroorganismu B. thuringiensis subsp. tenebrionis.
Polyplonální protilátky se zvyšují vstřikováním králíkům subkutánně každých 14 dní s 0,25 mg krystalického antigenu#
Získané výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách la a Ib. Výtěžky endotoxinu delta jsou vyjádřeny jakožto BTTU/g /jednotky na g kultivační půdy, stanovené elektroforezou. RIE nebo fotometrickou imonozkouškou PIA/. Použitá hodnota pro čistou krystalickou bílkovinu mikroorganismu B. thuringiensis subsp. tenebrionis, je 500 000 BTTU/g. Tato hodnota znamená v tabulce la střední hodnotu šesti až sedmi nezávislých fermentaci a v tabulce Ib střední hodnotu tří nezávislých fermentací.
Tabulka la
Produkce endotoxinu delta kmeny Bacillus thsiringiensis subsp. tenebrionis v třepačce.
Výtěžek endotoxinu delta stanovený způsober.
| RIE | PIA | |
| Kmen. | BTTU/g | BTTU/g |
| DSM 2803 | 676 | 1293 |
| NRRL-B. 15939 | 747 | 1126 |
| NB 178 | 986 | 1728 |
| DSM 5526 | 1097 | 1860 |
| DS.M 5480 | 2382 | 4169 |
Tabulka Ib
A
Produkce endotoxinu delta kmeny Bacillus thuringiensis subsp.
| tenebrionis v třepačce | |
| Kmen | Výtěžek endotoxinu delta stanovený způsob RIE BTTU/g |
| NE 197 | 1103 |
| NB 198 | 1237 |
| DSM 5480 | 2867 |
Z tabulky Xa a lb je zřejmé, že DSM 5480 produkuje více než trojnásobek endotoxinu delta ve. srovnání s původním kmenem. mikroorganismu Bacillus thááringiensins subsp. tenebrionis, DSM 2803 a “Bacillus thuringiensis subsp. san diego“, kmen NRRLB 15939 a více než dvojnásobné množství endotoxinu delta ve srov nání s kmeny dosud používanými pro výrobu obchodních produktů Bacillus thuringiensis subsp» tnebrionis.
Fázovou kontrastní mikroskopií, řédkovací elektronovou mikroskopií a transmisní elektronovou mikroskopii organismu Bac.illus: thuringiensis subsp. tenebrionis, mutant DSM 5480 se zjis tilo, že bílkovinové krystaly, produkované tímto mutantem, jsou mnohem větší než odpovídající bílkovinové krystaly, produkované mikroorhnismem Bacillus thuriéngiensis subsp. tenebrioVZ* nis, kmeny DSM 2803, DSM 5526-, NB 17.8 a NB 198 a “Bacillus thuringiensis subsp. san diego, kmeny NRRL-B 15939 a NB 197»
Kultivační prostředí mikroorganismu Bacillus thuringiensis. subsp. tenebrionis, mutant DSM 5480 se. zkoušelo na účinnost proti larvám mandelinky bramborové. Stanovilo se. zvýšené množství endotoxinu delta, produkovaného mutantem DSM 5480 j stanovení se provedlo imunologickými způsoby. Toto zvýšené produkované množství se projevuje v biologické účinnosti proti larvám mandelinky bramborové.
Příklad 3
Na pevném a' v kapalném prostředí se porovnává sporulace a parasporálni vytváření krystalu u mikroorganismů Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, kmeny DSM 2803, DSM 5526,
NB 178, NB 198 a mutant DSM 5480 a B. thuringiensis subsp. san diego”, kmeny NRRL-B 15939 a NB 197.
Každý z těchto kmenů se nechává růst po dobu dvou dnů při teplotě 30 °C na agarových destičkách při následujícím složení, vyjádřeném jakožt.o gramy na litr destilované vody: Pepton, Difco 5 g
Hovězí extrakt, Difco 3 g
Agar, Difco 20 g
Hodnota pH 7,0
Každý kmen se nechává růst v kapalném prostředí. Všechny kmeny se nechávají růst. po dobu 17 hodin při teplotě 30 °C na agarových skloněných destičkách. Pak se přenese 5 ml suspenze buněk z každého kmene do erlenmayerovy baňky se dnem s přepážkou o obsahu 500 ml, přičemž každá baňka obsahuje 100 ml prostředí.
Prostředí sestává z následujících složek v množství uváděném jakožto gramy na litr vodovodní vody:
kapalné prostředí: kvasnicový extrakt , 5,0 g tr.ypton 5,0 g glukóza 1,0 g dihydrogenfosforečnan. draselný 0,8 g hodnota pH 7,0
Naočkované baňky se inkubují při teplotě 30 °C za třepání /250/min/ po dobu 96 hodin.
Denně se studuje morfologie kmenů na pevném prostředí a v kapalném prostředí fázovou kontrastní mikroskopií /při zvět- 20 šerá 2500 násobném/. Počítá se množství spor a krystalů a stanovuje s.e rozměr parasporálních krystalů. Studuje se také několik vybraných vzorků řádkovací elektronovou mikroskopií a transmisní elektronovou mikroskopií.
Mikroorganismy B. thuringiensis subsp. tenebrionis, kmeny DSM 2803, DSM 5526, NB 17.8 a NB 198 a B. thuringiensis. subsp. san diego”, kmeny NRRL-B 15939 a NB 197 velmi sporuluj: v obou prostředích. Před lysí buňky obsahuje každá buňka sporu: a parasporální krystal. Velikost krystalu je 0,4 až 0,9 až 1,1 mikrometru, délky ve chvíli lyse buňky. Střední délka bílkovinových krystalů je 0,6 až 0,7 mikrometrů.
* Mutant DSM 5480 produkuje pouze, málo.spor /méně než 10 spor/ml/ na pevném prostředí a v definovaném kapalném prostředí. Před lysí buňky obsahuje většina buněk ohromný bílkovinový krystal av>^ak žádnou sporu. Délkový rozměr krystalů bílkovinových' je 0,4 až 0,7 mikrometrů až 5,0 mikrometrů, při čemž střední délkový rozměr bílkovinového krystalu je. 2,2 až 2,3 mikrometrů.
Ultrastrukturální analýza buněk z tohoto prostředí trans misní elektronovou mikroskopií ukazuje, že sporula^ční proces v mutantu se. nastartuje, neukončí se však v době buněčné lyse. Sporulační proces dosahuje různých stupnňů v různých buňkách. V buňkách, ve kterých sporulace dosáhla toliko stupně II /vytváření předsporového septa/ vyplňují bílkovino v é krystaly celé buňky.
V produkčním prostředí /příklad 2/ mutant produkuje větší počet spor /1Oř až 10 spor/ml/. V tomto prostředí je; sporulační frekvence mutantu 10 až 100 krát nižší než v případě mateřského kmene.
Tak si mutant ponechává své schopnosti produkovat normální spory. Avšak sporulační frekvence mutantu se zdá být silně závislá na prostředí. Délkový rozměr bílkovinových krystalů, produkovaných jednotlivými kmeny, je uveden v tabulce Ha a lib,
Tabulka Ha kffleny
Rczměr bílkovinových krystalů produkovaných současně dostupnýma^ mikroorganismu l B. thuringiensis účinnými proti broukům
Délka bílkovinových krystalů v mikrometrech
| minimální | maximální | střední | |
| kmen | hodnota | hodnota | hodnota |
| DSM 2803 | 0,4 | 0,9 | 0,7 |
| NRRL-B 15939 | 0,4 | 0,9 . | 0,7 |
| NB 17,8 | 0,5 | 0,9 | 0,7 |
| DSM 5526 | 0,4 | 0,9 | 0,7 |
| DSM 5480 | 0,7 | 5,0 | 2,3 |
Tabulka lib
Rozměr krystalů bílkovinových produkovaných sonpasně dostupnými kmeny mikroorganismu B. thuringiensis účinnými proti broukům
Délka bílkovinových krystalů v mikrometrech.
| minimální | maximální | střední | |
| kmen | hodnota | hodnota | hodnota |
| NB 19# | 0,4 | 0,7 | 0,6 |
| NB. 198 | 0,4 | 1,1 | 0,7 |
| DSM 548° | o,A | 4,2 | 2,0 |
Z tabulky Ha a lib je zřejmé, že mutant DSM 5480 produkuje mnohem větší bílkovinové krystaly než jakýkoliv dosud známý kmen B. thuringiensis, účinný proti broukům.
Na základě získaných hodnot se zdá, že řízení produkce , endotoxinu delta se zřetelem na sporulaci se v mutantu změnilo...
Zdá se, že mutant produkuje bílkovinové krystaly před vývov jem sper, čímž poskytuje buňkám delší dobu pro produkci endotoxinu delta a to vede k produkci mnohem větších, bílkovinových krystalů v době lyse buněk, ve srovnání s mateřským kmenem.
V závislosti na dostupných živinách a velikosti bílkovinových krystalů ve chvíli sporulace se vyline normální spora před dobou lyse.
Přiklad 4
Podle tohoto příkladu se používá vysokovýtěžkového Btt mutantu DSM 5480 k produkci'vysoce účinných produktů pro boj proti larvám mandelinky bramborové.
Na produkčním fermentačním prostředí, popsaném v příkladu 2, se fermentuje DSM 5480 v provzdušňované, míchané, produkční , fermentační nádobě. Po 96 hodinách se i <1. , v
získá živné prostředí kontinuálním odstředovaním.
Koncentrovaný krém, který obsahuje aktivní bílkovinové krystaly, se stabilizuje přidáním mikrobiálních konzervačních prostředků a nastavením hodnoty pH na 5,0.
Jeden díl koncentrovaného krému se suší rozprašováním a druhého se používá pro výrobu smáčitelného prášku. Zbytek koncentrovaného krému se používá přímo pro formulaci vodných, rozplývavých koncentrátů /FC/.
Smáčitelný prášek se formuluje jak charakterizováno v tabulce III. Formulace vodných rozplývavých koncentrátů je popsána v tabulce IV.
Tabulka III
Formulace smáčitelného prášku NOVODOlP^ /procenta hmotnostní/
Složka procenta koncentrovaný krém Btt sušený rozprašováním 40 detergenty 9 prostředek proti vytváření koláče 1 inertní plnidlo 50
Tabulka IV
| Formulace rozplýyavého vodného koncentrátu NO VOD 01c | FC . NOVODoá^FC % hmotnostní | |
| Složka | NOVODOlP FC 1 % hmotnostní | |
| koncentrovaný krém Btt | 80,00 | 55,00 |
| konzervační přísady | 4,00 | 4,00 |
| činidlo proti zamrzání | 9,10 | 19,00 |
| detergenty | 2,50 | 2,50 |
| regulátory hodnoty pH | 2,85 | . 2,85 |
| voda | 1 ,55 | 16,65 |
| 100,00 | 100,00 |
Jestliže se použije hodnoty 500 000 BTTU/g čisté; j krystalické bílkoviny, je obsah aktivní krystalické bílkoviny v přípravcích, následující:
NOVODOI^ WP
NOVODOk PC1 (Ů
NOVODOR^ PC2
| % Btt krystalické bílkoviny | |
| 70,8 KBTTU/g | 14,16 |
| 24,7 KBTTU/g | 4,94 |
| 14,2 KBTTU/g | 2,84 |
Detergenty se volí z širokého souboru pomocných přísad pro suspendování a smáčedel normálně používaných v zemědělských, pesticidních prostředcích. Jakožto činidla proti vytváření koláče se. používá hydrofilního oxidu křemičitého a jakožto inertního plnidla s.e. používá běžných inertních plnidel, jako jsou bentonity, anorganické soli nebo hlinky. Jakožto konzervačních přísoad do rozplývaných vodných koncentrátů se používá konzervačních přísad pro potravinářské a kosmetické výrobky. Prostředkem pro úpravu hodnoty pH je anorganická kyselina.
Příklad 5
Provádějí se polní zkoušky k potrvzení biologické účinnosti vysokovýtěžkov.ého Btt mutantu DSM 5480 na samčích larvách mandelinky bramborové. Srovnání se provádí se dvěma obchodními produkty Trident^ a M-one^ kulturní rostlinou jsou brambory,
Kulturní rostlina se postříká třikrát: 20. černá, 27. července a 3. srpna /2.generační larva/. Používané produkty a jejich dávkování je uvedeno v následující tabulce:
| Objem produktu na | Účinnost | Množství Btt bílko | |
| akr půdy | vínového krystalu v prostředku | ||
| litx’//akr | KBTTU/g | % | |
| M ·, R FC Novodor | 2 1 ,134 | 14,2 | 2f84 |
| 1 ,701 | 14,2 | 2,84 | |
| 2,835 | 1.4,2 | 2,84 | |
| 3,402 | 14,2 | 2,84 | |
| Trident^ | 4,536 | 5,5 | 1 ,10 |
| M-one^ | 2,268 | 8,9 | 1 ,78 |
Střední hodnota omezení larev mandelinky bramborové ve srov náni s neoše.třenými kontrolními rostlinami je uvedena v tabulce V. Napadení mandelinkou bramborovou bylo značně silné v případě neošetřených rostlin: 370 larev na 20 rostlin, h. srpna a 904 larev na 20 rostlin 8. srpna.
Tabulka V
| Ošetření | Objem produktu na | Procentové < | omezení |
| Tl | akr půdy litr/akr | 1. srpna | 8. srpna |
| NCVODOl·^ PC 2 | 1,134 | 99 | 99 |
| NOVODOlAc 2 | 1,701 | 95 | 1 00 |
| NOVODOÍ^ PC 2 | 2,835 | 98 | 99 |
| NOVODOR^ PC 2 | 3,402 | 100 | 100 |
| TŘÍDĚNÍ^ | 4,536 | 94 | 98 |
| M-oni® | 2,268 | 98 ’ | 98 |
| Výsledky | jasně dokládají, | že produkty s vy | sokovýtěžkovým |
| mutantem DSM | 5480 jsou účinné | pro ničení larev | mandelinky |
bramborové na polích. Krystalická bílkovina, produkovaná vysokovýtěžkovým kmenem ie plně účinná, jelikož přibližně 1,7 litrů na akr NOVODORu H FC poskytuje stejně dobré výsledky jako přibližně
4,5 litrů na akr Tridentu a stejně dobré jako přibližně 2,3 litrů na akr M-onu.
Průmyslová využitelnost
Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480 produkuje vysoké množství aktivních delta endotoxinůya je proto vysoce vhodný pro insekticidy k potírání motýlů, dvoukřídlého hmyzu a brouků, například mande1 i nky bramborové7?&C- ?(/tfuKc
Claims (6)
1. Mutant mikroorganismu Bacillus thurýgiensis deponovaný jako subsp. tenebriosis DSM 5480, produkující alespoň dvakrát více insekticidních de1ta-endotoxinů než mateřský kmen.
2. Pesticidní prostředek pro boj se škodlivým hmyzem, zvláště ze souboru zahrnujícího motýly, dvoukřídlé a brouky a především pro boj s mandě linkou bramborovou , vyznačuj ící se t í m , že jako účinnou látku obsahuje mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480, podle nároku 1, produkující alespoň dvakrát více insekticidních de1ta-endotoxinů než mateřský kmen.
3. Pesticidní prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, obsahuje přídavně zemědělsky vhodná ředidla a/nebo nosiče.
4. Pesticidní prostředek podle nároku 2a 3, vyznačující se tím, že obsahuje přídavně povrchově aktivní látku.
5 .
t hur i( s e i) ii)
Způsob přípravy mutantu kmenů mikroorganismu Bacillus /giensis podle nároku 1 a jeho selekce, vyznačující t í m, že se mateřský kmen zpracovává jakýmkoliv chemicky vhodným mutagenem, jako například N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinem nebo ethylmethansulfonátem, za působení elektromagnetického záření, jako jsou paprsky gama, rentgenový paprsky nebo ultrafialové záření , takto zpracované mutanty se nechávají růst v živném sporulačním prostředí, obsahujícím fosfát a popřípadě jako doplňky 0,57 g/1 chloridu hořečnatého a 20 g/1 gelritu, oddělí se průsvitné kolonie a nechávají se růst v prostředí, které neztekucuje při zahřívání a vyselektují se pravé asporogenní kmeny tepelným zpracováním iv) kolonií v modifikovaném živném sporulačním prostředí, obsahujícím fosfát, doplněném chloridem horečnatým a doplňky modifikovaného živného sporulacního prostředí.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se t í m , že se takto oddělené kolonie nechávají růst na normálním produkčním prostředí a pak se dále provádí konečné oddělení kmenů, schopných zvýšení produkce delta endotoxinů.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19905629A CZ286501B6 (en) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Mutant of Bacillus thuringiensis micro-organism deposited as subsp. tenebrionis DSM 5480, process of its preparation and pesticidal agent containing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19905629A CZ286501B6 (en) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Mutant of Bacillus thuringiensis micro-organism deposited as subsp. tenebrionis DSM 5480, process of its preparation and pesticidal agent containing thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ562990A3 true CZ562990A3 (cs) | 2000-01-12 |
| CZ286501B6 CZ286501B6 (en) | 2000-04-12 |
Family
ID=5468461
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19905629A CZ286501B6 (en) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Mutant of Bacillus thuringiensis micro-organism deposited as subsp. tenebrionis DSM 5480, process of its preparation and pesticidal agent containing thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ286501B6 (cs) |
-
1990
- 1990-11-14 CZ CZ19905629A patent/CZ286501B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ286501B6 (en) | 2000-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU647056B2 (en) | Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta endotoxin | |
| US5006336A (en) | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate | |
| US5382429A (en) | Bacillus thuringiensis protein toxic to coleopteran insects | |
| DE69227911T2 (de) | Neuer mikroorganismus und insektizid | |
| EP0202739A1 (en) | Novel micro-organism and its use for controlling pests | |
| US5080897A (en) | Novel bacillus thuringiensis strains, and related insecticidal compositions | |
| JPH0829075B2 (ja) | 或る種の鱗翅類害虫に対して改良された活性を有するバチルス・スリンギエンシスの株の製法及びそれにより製造さた新規株 | |
| JPH10504451A (ja) | 新規の双翅類活性化合物及びバチルス チューリングエンシス株 | |
| US5279962A (en) | Mutants or variants of Bacillus thuringiensis producing high yields of delta endotoxin | |
| US5422106A (en) | Method of controlling coleotera using Bacillus thuringiensis strains MG P-14025 and LMG P-14026 | |
| EP0522836A2 (en) | Novel bacillus strain and insect pest controlling agent | |
| JPH0358904A (ja) | 新規なバシラス・スリンギエンシス分離体 | |
| EP0309145A1 (en) | Bacteriophage-resistant strain of Bacillus Thuringiensis Var. San Diego | |
| CZ562990A3 (cs) | Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje | |
| HRP920198A2 (en) | Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta toxin | |
| PL166479B1 (pl) | Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL PL | |
| WO1993003619A1 (en) | Multi-targeted bacillus thuringiensis bioinsecticide | |
| Jayaraman et al. | Active against Lepidopteran Agricultural Pests, by the Use of Continuous Culture Studies | |
| IL86242A (en) | Transconjugant bacillus thuringiensis strains, insecticidal compositions containing them and method for their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20021114 |