PL166479B1 - Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL166479B1 PL166479B1 PL28780690A PL28780690A PL166479B1 PL 166479 B1 PL166479 B1 PL 166479B1 PL 28780690 A PL28780690 A PL 28780690A PL 28780690 A PL28780690 A PL 28780690A PL 166479 B1 PL166479 B1 PL 166479B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- thuringiensis
- strain
- mutant
- agent according
- product
- Prior art date
Links
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title claims description 7
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 49
- 241000193369 Bacillus thuringiensis serovar tenebrionis Species 0.000 claims description 39
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 36
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 27
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 claims description 20
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 14
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 241000255925 Diptera Species 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 241000193365 Bacillus thuringiensis serovar israelensis Species 0.000 claims description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000905957 Channa melasoma Species 0.000 claims 2
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 claims 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 claims 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims 2
- 241000193363 Bacillus thuringiensis serovar aizawai Species 0.000 claims 1
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 claims 1
- 230000002072 anti-mutant effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 abstract description 15
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 241000193367 Bacillus thuringiensis serovar san diego Species 0.000 description 11
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 6
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 4
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000382353 Pupa Species 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000254179 Sitophilus granarius Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 1
- 241000254107 Tenebrionidae Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
1 . Srodek owadobójczy zawierajacy substancje czynna pochodzaca od B.thuringiensis oraz znane adjuwanty, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera produkt wytwa- rzany przez B.thuringiensis zawierajacy 8-endotoksyne, wytwarzany przez mutanta lub wariant szczepu B.thuringiensis stanowiacy wyselekcjonowany metoda selekcji wariantów lub naturalnych mutantów, szczep B.thuringiensis zdolny do wytwarzania znacznie wiekszej ilosci 8-endotoksyn niz ich szczepy macierzyste, sam lub w polaczeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podloza hodowlanego, w mieszaninie z rozcienczalnikiem lub nosnikiem dopuszczalnym do stosowania w rolnictwie. PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest środek owadobójczy zawierający substancję czynną pochodzącą od B.thuringiensis i znane adjuwanty.
Znane i szeroko stosowane są handlowe preparaty Bacillus thuringiensis do biologicznego zwalczania szkodników. Zaletą tego insektycydu jest wysoka selektywność w stosunku do wąskiego zakresu owadów i podatność na rozkład biologiczny. Handlowe preparaty Bacillus thuringiensis mogą być stosowane do czasu zbiorów bez niekorzystnych efektów.
Bacillus thuringiensis jest aerobową, sporującą bakterią w kształcie walca, wytwarzającą w czasie sporulacji jedną lub więcej inkluzji zwanych ciałami parasporalnymi. Te kształty składają się z białek o wysokiej masie cząsteczkowej, zwanych δ-endotoksynami. δ-endotoksyny są czynnym składnikiem dostępnych w handlu preparatów Bacillus thuringiensis.
Zidentyfikowano wiele szczepów B.thuringiensis aktywnych w różnych grupach owadzich gospodarzy. Dzielą się one na różne podgatunki w oparciu o ich antygeny rzęskowe. Szczególnie interesujące są Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki i subspecies aizawa, stosowane do zwalczania szkodliwych motyli Bacillus th^^r^^n5i^nsis subspecies israelensis stosowany do zwalczania szkodliwych muchówek i Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis stosowany do zwalczania chrząszczy.
O pierwszej izolacji bakterii Bacillus thurmgiensis toksycznej dla chrząszczy doniesiono w 1983 roku (A. Krieg i inni, Z and Ent., 96, 500 - 508, opublikowane europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 149 172 A2).
Wyizolowana bakteria, oznaczona Bacillus thurmgiensis subspecies tenebrionis została złożona w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerem dSm 2803. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wyizolowano w 1982 roku z martwej poczwarki wołka zbożowego. Tenebrio molitor (Tenebrionidae (Wołkowate), Coleoptera). Szczep wytwarza w każdej komórce jeden kryształ parasporalny, który jest płaski, w kształcie płytki i ma długość krawędzi od około 0,8 pm do 1,5 pm. Należy do serotypu H8a, 8b i fenotypu C laseczki Bacillus thuringiensis (Krieg i inni, System Appl. Microbiol., 9, 138 - 141, 1987, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 766 203, 1988).
Szczep ten jest toksyczny tylko dla kilku larw chrząszczy zjadających liście (Chrysomelidare, Stonkowate), ale nieskuteczny przeciw gąsienicom motyli, komarom (Diptera) i innym owadom.
Bacillus thurmgiensis subspecies tenebrionis jest skuteczny w zwalczaniu larw stonki ziemniaczanej. Po pobraniu kryształu i sporów Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis lub izolowanych kryształów, larwy i niektóre przeobrażone formy dorosłe stonki ziemniaczanej (Leptinotarsa decemlineata) przestają jeść. Stadia larwalne L1-L3 giną w ciągu 1 - 3 dni (Schnetter i inni, w Fundamental and Applied Aspects of invertebrate pathology, ed. R. A. Samson i inni, Proceedings of the 4th Int. Colleguium of Invertebrate Pathology, str. 555, 1986).
Ostatnio wykazano, że Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis oprócz toksycznych dla chrząszczy kryształów wytwarza także inne ciała parasporalne, które są wrzecionowate, kuliste lub płytkowate (A. M. Huger i A. Krieg, J. Appl. Ent., 108, 490 - 497, 1989). Aktywność tego drugiego kryształu nie jest obecnie znana.
Do zwalczania szkodliwych chrząszczy stosuje się cztery dostępne w handlu preparaty Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis. NOVODOR firmy Novo Nordisk A/S, TRlDENT firmy Sandoz, Di Terra firmy Abbott Laboratories Inc., i Foil firmy Ecogen.
O izolowaniu innych, szkodliwych dla chrząszczy szczepów Bacillus thuringiensis doniesiono w 1986 roku (Hernnstadt i inni., Bio/Technology, t. 4, 305 - 308, 1986, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki 4 764 372,1988). Szczep ten oznaczony Bacillus thuringiensis subsp. san diego, H7, został zdeponowany w Northern Regional Research Laboratory, USA pod numerem NRRL B-15939. Handlowy produkt oparty na Bacillus thuringiensis subsp. san diego został opracowany przez firmę Mycogen Corp.
Porównawcze badania Bacillus thuri^j^^^nsis subsp. tenebrionis, DSM 2803 i Bacillus thuringiensis subsp. san diego, NRRL B-15939, obejmujące charakterystykę fenotypową komórek wegetatywnych, charakterystykę toksycznych ciał parasporalnych i analizę zawartego plazmidowego DNA wykazały, że Bacillus thuringiensis subsp. san diego jest identyczny z wcześniej wyizolowanym szczepem DSM 2803, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg i inni, J. Appl. Ent., 104, 417 - 424, 1987). Co więcej, sekwencja nukleotydowa genu, przewidywana sekwencja aminokwasowa aktywnej przeciw chrząszczom δ-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis i Bacillus thuringiensis subsp. san diego są identyczne.
W takich samych warunkach hodowli Bacillus thurmgiensis subsp, san diego wytwarza także wspomniany wyżej drugi typ kryształów. (A. M. Huger i A. Krieg, J. App. Ent., 108,490- 497, 1989).
Według H. de Barjac, E. Frachon (Enthomophaga, 35/2), 233 - 240, 1990) szczep san diego jest podobny do tenebrionis i nie może być uważany za odrębny podgatunek.
Użyteczność szczepów Bacillus thuringiensis do zwalczania szkodliwych chrząszczy zależy od wydajności i ekonomiki wytwarzania toksyn aktywnych przeciw chrząszczom i od siły działania wytworzonego produktu. Te z kolei zależy od ilości δ-endotoksyny, która może być wytworzona przez fermentację szczepów Bacillus thuirngiensis aktywnych przeciw chrząszczom.
B. thuringiensis stosuje się od wielu lat do produkcji insektycydów, i chociaż korzystnie byłoby otrzymać mutanta B. thuringiensis wytwarzającego większą ilość δ-endotoksyny, jak dotąd nie otrzymano takiego mutanta. Mutant wytwarzający większą ilość 8-endotoksyny zapewniałby większą wydajność i zwiększyłby ekonomikę produkcji toksyn B. thuringiensis, co pozwoliłoby na wytwarzanie preparatów B. thuringiensis o większej sile działania przy tych samych kosztach. To z kolei byłoby korzystne dla użytkownika, bo umożliwiałoby zmniejszenie objętości składowanych pestycydów, stosowanych na danym obszarze. Ponadto użytkownik stosowałby mniej pojemników, co miałoby wpływ na środowisko.
Dotychczas nie opisano wytwarzania δ-endotoksyny Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis przez mutacje.
Jednym z prot^l^i^<5w związanych z zastosowaniem B. thuringiensis subsp. tenebrionis do zwalczania larw chrząszczy jest stosunkowo mała skuteczność preparatów, co wymaga podawania stosunkowo dużych dawek preparatu na traktowane obszary, takich jak δ do 10 litrów/ha w porównaniu do 1do 2 litrów/ha innych preparatów B.thuringiensis i innych insektycydów.
Istnieje więc zapotrzebowanie na produkty o zwiększonej sile działania. Jedną z dróg rozwiązania problemu jest wytwarzanie stężonych preparatów. Jednakże powiększa to koszty produkcji w stosunku do oszczędności uzyskanych na przechowywaniu i transporcie. Znacznie lepszym rozwiązaniem byłoby wytworzenie mutanta szczepu B.thuringiensis zdolnego do wytwarzania większej ilości 8-endotoksyny na komórkę.
Przedmiotem wynalazku jest środek szkodnikobójczy zawierający jako substancję czynną produkt wytworzony przez wyselekcjonowanego mutanta szczepu B.thuringiensis zdolnego do wytwarzania znacząco większych ilości toksyny niż szczep wyjściowy.
Środek owadobójczy zawierający substancję czynną pochodzącą z B.thuringiensis oraz znane adjuwanty charakteryzuje się tym, że jako substancję czynną zawiera produkt wytwarzany przez B.thuringiensis, zawierający 8-endotoksynę, wytworzony przez mutanta lub wariant szczepu wyselekcjonowanego metodą selekcji wariantów lub naturalnych mutantów, szczep B.thuringiensis zdolny do wytwarzania znacznie większej ilości 8-endotoksyn niż ich szczepy macierzyste, sam lub w połączeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podłoża hodowlanego, w mieszaninie z rozcieńczalnikiem lub nośnikiem dopuszczalnym do stosowania w rolnictwie.
166 479
Sposób mutagenizacji szczepów Bacillus thuringiensis i selekcji mutantów zdolnych do wytwarzania znacznie większych ilości produktów zawierających 8-endotoksyny niż szczep wyjściowy, które to produkty stanowią substancję czynną środków według wynalazku, polega na tym, że szczepy wyjściowe traktuje się mutagenem, wytworzone mutanty hoduje się na pożywce odpowiedniej do selekcji szczepów niesporujących lub sporujących sporadycznie, półprzezroczyste kolonie selekcjonuje się i hoduje się na pożywce nieupłynniającej się po podgrzaniu, i prawdziwie niesporujące kolonie selekcjonuje się poddając je ogrzewaniu. Korzystnie, wyselekcjonowane kolonie hoduje się w normalnej pożywce hodowlanej i poddaje się końcowej selekcji w celu znalezienia mutanta wytwarzającego dużą ilość 8-endotoksyny.
Jako mutagen stosuje się każdy odpowiedni chemiczny mutagen, taki jak N-metylo-N’nitro-N-nitrozoguanidyna lub ester etylowy kwasu metanosulfonowego, albo szczep wyjściowy poddaje się działaniu promieniowania elektromagnetycznego, takiego jak promieniowanie y, X lub UV.
Odpowiednią pożywkę modyfikuje się pożywką do sporulacji zawierającą fosforan (pożywka NSMP) tak jak opisał Johnson i współpracownicy Spores VI, ed. P. Gerhadt i wsp., str. 248-254, 1975.
Jako odpowiednią pożywkę stosuje się pożywkę NSMP wzbogaconą MgCk oraz Gelrite firmy Kelco. Niekiedy, w celu wytworzenia mutanta wytwarzającego dużo 8-endotoksyny, szczep wyjściowy hoduje się w pożywce płynnej i selekcjonuje się spontaniczne mutanty po dodaniu kultur bulionowych do podłoża agarowego, odpowiedniego do selekcji mutantów niesporujących lub sporadycznie wytwarzających zarodniki.
Inny sposób szukania mutanta wytwarzającego dużo δ-endotoksyny obejmuje stosowanie bezpośrednio dużej ilości mutantów, przy użyciu odwirowania lub innych sposobów izolowania odpowiednich dla dużych ilości.
Produkt wytwarzany przez B.thuringiensis zawierający δ-endotoksyny, stosowany jako substancja czynna środka według wynalazku, wytwarza się w ten sposób, że mutanta lub wariant szczepu B.thuringiensis, wyselekcjonowany jak opisano wyżej, hoduje się w odpowiedniej pożywce, zawierającej źródło węgla, azotu i inne składniki znane fachowcom, w ciągu odpowiedniego okresu czasu, po którym wykrywa się δ-endotoksyny, odzyskuje się ten produkt, sam lub wraz z komórkami i/lub zarodnikami z podłoża hodowlanego.
W celu szczegółowego opisania wynalazku zmutowany szczep B.thuringiensis subsp. tenebrionis wytwarzający duże ilości δ-endotoksyny zdeponowano dla celów postępowania patentowego w Deutsche Sammulung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmhH, Mascherrodorweg 16, D-3300, Braunschweig, Federal Republic of Germany w dacie wskazanej niżej. DSM będąca depozytariuszem międzynarodowym na mocy Traktatu Budapesztańskiego, zapewnia ciągłość depozytu w zgodzie z regułą 9 tego traktatu.
Data depozytu: 10 sierpnia 1989
Znak deponenta: NB 176-1
Oznaczenie DSM: DSM 5480
Mutant DSM 5480 otrzymano przez mutację Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, szczep DSM 5526, który także zdeponowano na mocy Traktatu Budapesztańskiego, jak wykazano niżej:
Data depozytu: 14 września 1989
Znak deponenta: NB 125
Oznaczenie DSM: DSM 5526
Jak wspomniano poprzednio środki według wynalazku zawierają produkt wytwarzany przez mutanta szczepu Bacillus thuringiensis wytwarzającego duże ilości aktywnej δ-endotoksyny w porównaniu do szczepu wyjściowego.
W tym kontekście, określenie duża ilość korzystnie oznacza ilość co najmniej dwa razy większą lub jeszcze większą.
W korzystnej postaci, środek według wynalazku zawiera, jako substancję czynną, produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis, zdolnego do wytwarzania dwukrotnie większej lub ponad dwukrotnie większej ilości owadobójczych 8-endotoksyn, w porównaniu ze
166 479 szczepem wyjściowym, zwłaszcza produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis należący do patotypu C B.thuringiensis.
W innej korzystnej postaci środek według wynalazku zawiera produkt zawierający 8-endotoksyny, wytworzony przez mutanta lub wariant B. thuringiensis wykazującego działanie przeciwko tym samym szkodnikom co δ-endotoksyny wytwarzane przez wyjściowy szczep B.thuringiensis, takim jak łuskoskrzydłe (mutanty B.thuringiensis subsp, kurstaki i/lub subsp. aizawai), dwuskrzydłe (mutanty B.thuringiensis subsp. israelensis) lub chrząszczom (mutanty B.thuringiensis subsp. tenebrionis).
W jednej ze szczególnych postaci wynalazku środek zawiera produkt wytwarzany przez B.thuringiensis należący do podgatunku tenebrionis i wytwarzający 8-endotoksyny działające przeciw chrząszczom.
Szczególnie korzystny jest środek, zawierający produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis tenebrionis zdolnego do wytwarzania 8-endotoksyny w ilości ponad 3-krotnie większej w porównaniu ze szczepem DSM 2803.
W innej postaci wynalazku, środek szkodnikobójczy zawiera produkt, wytwarzany przez mutanta lub wariant B .thuringiensis subsp. tenebrionis zdolnego do wytwarzania parasporalnych kryształów o średniej długości krawędzi co najmniej dwukrotnie większej niż średnia długość krawędzi kryształu parasporalnego, wytwarzanego przez szczep wyjściowy, korzystnie o średniej długości krawędzi wynoszącej 2 pm lub więcej.
Środek według wynalazku może także zawierać produkt, wytwarzany przez mutanta lub wariant B.thuringiensis subsp. tenebrionis, wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 106 razy niższą niż częstotliwość sporulacji szczepu wyjściowego lub częstotliwość sporulacji szczepu DSM 2803.
W szczególnej postaci, środek według wynalazku zawiera produkt, wytwarzany przez zdeponowanego mutanta B.thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480. Zdeponowany mutant B.thuringiensis subsp. tenebrionis (DSM 5480) wykazuje więcej niż dwukrotny wzrost produkcji 8-endotoksyny w porównaniu ze szczepem wyjściowym (DSM 5526). Mikroskopia kontrastowo-fazowa, skaningowa i prześwietleniowa mikroskopia elektronowa tego mutanta wykazała, że wysoka produktywność wynika ze zmian regulacji wytwarzania 8-endotoksyny w stosunku do sporulacji, co powoduje wytwarzanie kryształów białka ponad pięć razy większych, niż kryształy wytwarzane przez znane, aktywne przeciw chrząszczom szczepy Bacillus thuringiensis. Dzięki opisanemu sposobowi mutacji i selekcji szczepów usunięto bliską korelację pomiędzy wytwarzaniem kryształów i sporulacją. Mutant wytworzony tym sposobem wytwarza duże ilości δ-endotoksyny przed sporulacją.
Środek według wynalazku może zawierać jako substancję czynną 8-endotoksynę wytwarzaną przez B.thuringiensis, samą lub w połączeniu z innymi substancjami czynnymi biologicznie, zwłaszcza substancję czynną, wytwarzaną przez B.thuringiensis, o aktywności ponad dwa razy większej od aktywności szczepu wyjściowego.
Wynalazek obejmuje także kompozycje i preparaty pestycydowe zawierające 8-endotoksyny B.thuringiensis, których skład pestycydowy w postaci ciekłej ma moc działania przynajmniej 15 000 BTTU/g odpowiadającą zawartości przynajmniej 3% wagowych szkodliwego dla chrząszczy białka krystahcznego lub których skład pestycydowy w postaci stałej ma moc działania przynajmniej 50 000 BTTU/g, odpowiadającą zawartości przynajmniej 10% wagowych szkodliwego dla chrząszczy białka krystahcznego.
Wynalazek obejmuje także środek szkodnikobójczy, zawierający jako substancję czynną produkt wytworzony przez szczep B.thuringiensis DSM 5480 o mocy działania dwukrotnie przewyższającej moc działania produktu aktywnego przeciw chrząszczom, wytwarzanego przez szczep DSM 2803 lub inne, aktywne przeciw chrząszczom szczepy Btt.
Środki według wynalazku mogą mieć postać znaną fachowcom, na przykład być w postaci zawiesiny, dyspersji, emulsji wodnych, pyłów, proszków do dyspergowania, koncentratów lub granulek. Ponadto, mogą one mieć postać odpowiednią do bezpośredniego użycia, lub postać koncentratu pierwotnej kompozycji, który przed zastosowaniem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub znanego rozcieńczalnika.
166 479
Stężenie owadobójczo aktywnej δ-endotoksyny B.thuringiensis w kompozycji według wynalazku, stosowanej osobno lub w połączeniu z innym pestycydem, nanoszonej na rośliny, korzystnie wynosi od około 0,5 do około 25% wagowych, zwłaszcza od 1 do 15% wagowych.
Środki według wynalazku stosuje się na obszarach zaatakowanych przez te szkodniki.
W szczególnym przypadku, niszczone szkodniki obejmują motyle, muchówki i chrząszcze, szczególnie chrząszcze, takie jak stonka ziemniaczana.
Szkodniki można zwalczać, stosując ciekłą kompozycję pestycydową w dawce 2,8 litra/ha, lub suchy środek w dawce 0,56 kg/ha.
Aktywny środek według wynalazku nanosi się bezpośrednio na rośliny, na przykład przez rozpylanie cieczy lub pyłów w czasie, gdy na roślinach zaczynają pojawiać się szkodniki. Korzystnie rozpyla się ciecz. Ogólnie ważne jest skuteczne niszczenie szkodników we wczesnych stadiach rozwoju larwalnego, ponieważ w tym okresie rośliny są narażone na największe uszkodzenia.
Przykład I. Wyizolowano mutanta B.thuringiensis subsp. tenebrionis wytwarzającego dwa razy więcej δ-endotoksyny. Mikroskopia kontrastowo-fazowa, skaningowa i prześwietleniowa mikroskopia elektronowa tego mutanta wykazała, że wysoka produktywność wynika ze zmian regulacji wytwarzania δ-endotoksyny w stosunku do sporulacji, co powoduje wytwarzanie kryształów białka ponad pięć razy większych niż kryształy wytwarzane przez znane, aktywne przeciw chrząszczom szczepy B.thuringiensis. Wydaje się, że usunięto bliską korelację pomiędzy wytwarzaniem kryształów a sporulacją w wyniku czego mutant wytwarza duże ilości 8-endotoksyny przed sporulacją.
Wytwarzanie wysokowydajnego mutanta
Zarodniki szczepu DSM 5526 B.thuringiensis subsp. tenebrionis napromieniowano promieniowaniem y dawką 7 kGy. Napromieniowane zarodniki wysiano na płytki agarowe z podłożem NSMP (zmodyfikowana pożywka do sporulacji zawierająca fosforan, jak opisał Johnson i inni, Spores VI, ed. P. Gerhartt i inni, str. 248 - 254, 1975), która jest odpowiednia do selekcji mutantów bakterii niesporujących lub sporujących sporadycznie.
Płytki agarowe z NSMP inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 2 - 3 dni. Wybrano półprzezroczyste kolonie i przeniesiono je na podłoże NSMP gelrite (NSMp wzbogacone MgCk (0,57 g/l) i Gelrite, Kelco (20 g/l)).
Płytki agarowe z NSMP gerlite inkubowano w temperaturze 90°C w ciągu 1 godziny, a następnie w ciągu 1 - 2 dni w temperaturze 30°C.
Selekcjonowano mutanty dobrze rosnące na płytkach NSMP gelrite. W ten sposób odrzucono wszystkie niesporujące kolonie, które nie rosną po ogrzaniu.
Wyselekcjonowane mutanty hodowano na wytrząsarce w butelkach zawierających pożywkę dostępną w handlu. Ilość wytworzonej δ-endotoksyny określono metodą immunologiczną opisaną niżej.
Selekcjonowano tylko mutanty wytwarzające ilości δ-endotoksyny znacząco większe niż szczep wyjściowy.
Cechy morfologiczne wyselekcjonowanych mutantów na podłożu stałym i płynnym określono przy pomocy mikroskopii kontrastowo-faz.owej (x 2500) i skaningowej i prześwietleniowej mikroskopii elektronowej. Liczono liczbę zarodników i kryształów i określano wielkość kryształów białkowych.
Jeden z otrzymanych mutantów (DSM 5480) został wybrany ze względu na swoją zdolność do wytwarzania δ-endotoksyny.
Ilość δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480 jest porównywalna z DSM 2803, oryginalnie wyizolowanego Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, szczep DSM 5526, stosowanego do wytwarzania NOVODOR, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, szczep NB 178, wyizolowany z produktu Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis TRIDENT firmy Sandoz, Bacillus thuringiensis tenebrionis TRIDENT z roku 1989, szczep ND 198, wyizolowany z produktu TRIDENT, firmy Sandoz, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis firmy Sandoz, Bacillus thuringiensis subsp. san diego, szczep NRRL-B15939 i szczep NB 197 wyizolowany z produktu M-ONE Bacillus thuringiensis subsp. san diego firmy Mycogen z 1990 roku. Jak pokazano w tabeli 1 w przykładzie II, mutanty
166 479 poprawiono sposobem według wynalazku wytwarzają 2 - 3,5 razy więcej δ-endotyksyny niż aktywny przeciw chrząszczom, dostępny obecnie szczep Bacillus thuringiensis.
Przykład II. W tym przykładzie porównano wydajność wytwarzania δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, z wydajnością wytwarzania δ-endotoksyny przez Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis szczep DSM 2803 (oryginalnie wyizolowany Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis), DSM 5526 (szczep produkcyjny firmy Nrayo-Nordisk,), NB 178 i NB 198 (szczepy produkcyjne firmy Sandoz), Bacillus thuringiensis subsp. san diego, szczep NRRL-B 15939 i NB 197 (szczepy produkcyjne firmy Mycogen) w podłożu dostępnym w handlu. Każdy ze szczepów hodowano 17 godzin w temperaturze 30°C na skosach agarowych o następującym składzie, wyrażonym w gramach na litr wody destylowanej:
Pepton, Difco 5 g/litr
Ekstrakt mięsny, Difco 3 g/litr
Agar, Di fco 20 g/llir pH 7,0 ml zawiesiny komórek każdego szczepu przeniesiono następnie do 100 ml pożywki produkcyjnej w 500 ml kolbie Erlenmeyera z przegrodzonym dnem. Pożywka produkcyjna składała się z następujących skład^kówe (w gramach na litr wody).
mąka sojowa 50 g/litr hydrolioatskrobiowy 40 g/litr KH2POz l,77g/litr
K2HPO4 4,53 g/htr pH 7,0
Zaszczepione kolby inkubowano w temperaturze 30°C na wytrząsarce (250 obr/min). Po 96 godzinzchinyubartiim munoiyglczy w oereCiooo Ποέ3 wytwononej δ-rndotoksysy w bul ioriiegodow'^ ym.
IloSćO-ehdoίQksyny, wytwarzanej przez poszczególne szczepy określono metodą immunoelektroforeen ryktrtkowej SIrSE) z OosSu immucyfotometwezncgo (PLk.) pron yhheIo przhciw biyS powytyłych pazeeiwko jczyszczonym hrhszbOotn metkownm Baoillus rhuringiensis zubsp. teoeCyonio.
Odważono 400 mg bulionu z każdej hodowli i do każdej próbki dodano 7 ml buforu fosforanu soótsodowegm g 0J25 M , pH 12S- Kywtoslnę wykiąiej o w cłągu 1 nod7 imy w cdu ryzpuoztneniaSyałeOδ-yndotoksyny. Próbki wirowano nwstępnie w ciwgnlS πΐπ^ι sby 1^^^ 3.5OO obrotów SπOnut8,sodyryrianttestowrnw mySodą RtA w οό^^εΐ suΓOwton odporbkycinwkj powstatcj pmebiw0o oczyszoot nem OraoyrWom bllZkowp m B.tOośin co bsd.tenebriy- ois. nowe O-anPoioksony okyeziano o stosunto do o znaDin 23031^11 ksys0Ssłów
WiCkowy εδ.
Określano także stężenie kryształów białkowych metodą immunofotometryczną. Kryształy bial/owe roo,ρtoorczcnowror)worze alkailcryom. Rhzpy2ąchcwe Otcyty wytryckoo prrocżwcirbnoH 0:sy3yośn iejyoakoSi yZro.ylono trobtdomhtryzyzie. Hoso U-endHtsWoo3y okyeś)keow btosohkn Sowrorea j znorcj n.ywastośty kn3szuyhw 3tbikowycy.
AuS2yeoz kbystailoone do oooOykcSł 3tczrOwoiab atosowahych w tych testach otrzymano z kryształńw wotzriowonyz0 z B. CI)U2lnkiancis scSsbitecebripnio.
Poli01onaiye oroooiκc.ia1a pows/aSo po nasirzubiwaylu podskórnym co dwa tygodnie królików dawkąO^pmg aptygonckscrtaticcyebo.
Otrzymane wyni^ pokozeou h tabolach ea^ lb. Wydajności δ-endotoksyny wyrażono w BTTU/g ijohnobSnOoa .sam oo kś ΙιοΙκμ^κϊ okseśloodmbtodą immunołotezy sSt)iotybwoS
BIE, lug mutodą immg3ofoiomotrrs w^:ąt PIAy Wrrtośydta czo2tych hryszty)Uw 3lrłkowoca ΖΐΖυΓ^ΐϋ^ suWsw teny0riheir wynosi 500 WOr BTTUOg. WartaSri ts tobeli S sHιypwih wartursi ίη^^ηίη zb -7 nioeaieyoych Óeomn irtacj 10 0 w Babelllb z 3 niezbteOnyoh fermenOoctl.
166 479
Tabela 1a
Wytwarzanie δ-endotoksyny przez szczepy Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis na wytrząsarce
| Szczep | Ilość δ-endotoksyny (BTTU/g) | |
| RIE | PIA | |
| DSM 2803 | 676 | 12931 |
| NRRL-B ^^<939 | 747 | 1128 |
| NB 178 | 986 | 1728 |
| DSM 5526 | 1097 | 1860 |
| DSM 5480 | 2382 | 4169 |
Tabela lb
Wytwarzanie δ-endotoksyny przez szczepy Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis na wytrząsarce
| Szczep | Ilość δ-endotoksyny, RIE (BTTU/g) |
| NB 197 | 1103 |
| NB 198 | 1237 |
| DSM 5480 | 2867 |
Z tabeli 1a i 1b wynika, że szczep DSM 5480 wytwarza ponad trzy razy więcej 8-endotoksyny niż wyjściowy szczep B.thuringiensis subsp. tenebrionis DSM 2803 Bacillus thuringiensis subsp. san diego, szczep NRRL-B 15939 i ponad dwa rasy więcej niż szczepy stosowane obecnie do przemysłowej produkcji preparatów Bacillus thurmgiensis subsp. tenebrionis.
Mikroskopia kontrastowo-fazowa i skaningowa oraz prześwietleniowa mikroskopia elektronowa mutanta DSM 5480 Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis wykazała, że wytwarzane przez niego kryształy białkowe są dużo większe niż odpowiednie kryształy białkowe wytwarzane przez Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178, NB 198 i Bacillus thurmgiensis subsp. san diego, szczepy NRRL-B 15939 i NB 197.
Pożywkę bulionową mutanta DSM 5480, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis poddano testowi na aktywność przeciw larwom stonki ziemniaczanej. Zwiększona ilość δ-endotoksyny wytwarzanej przez mutanta DSM 5480 określona metodami immunologicznymi znalazła odbicie w aktywności biologicznej przeciw larwom stonki ziemniaczanej.
Przykład III. W tym przykładzie porównano sporulację i wytwarzanie kryształów parasporalnych przez B.thuringiensis subsp. tenebrionis, szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178, NB 198, mutant DSM 5480 i B.thuringiensis subsp. san diego, szczepy NRRL-B 15939 i NB 197 w podłożu stałym i płynnym.
Każdy szczep hodowano 2 dni w temperaturze 30°C na płytkach agarowych o następującym składzie wyrażonym w gramach na litr destylowanej wody:
Pepton, Difco 5 g/litr
Ekstrakt mięsny, Difco 3 g/liUr
Agar, Di fco 20 g/litr pH 7,0
Każdy szczep hodowano także na pożywce płynnej. Wszystkie szczepy hodowano w ciągu 17 godzin w tcmpraturze no°C na skosżch agarowych. 5 p^zewicziny komórakkażdegu szczepu pkzzniesiono do e00 ml kol bErtsęmcgcra wy przegrodzonzm nyem, zawieraSncyca szc ml ppżywkL
PożywZa składała się z następujących składników w podanych niżej ilościach: (wyrażonych wancmashna lic wcęfy)
166 479
Pożywka płynna
Ekstrakt drożdżowy 5 g/lltr
Trypton 5 ggll^
Glukoza 1 g/lltr
KH2PO4 0,8 g/litr pH 7,0
Zaszczepione kolby inkubowano w temperaturze 30°C na wytrząsarce (250 obrotów/minutę) w ciągu 96 godzin.
Morfologię szczepów na podłożu stałym i płynnym badano codziennie metodą mikroskopii kontrastowo-fazowej (x 2500). Liczbę przetrwalników i kryształów liczono oraz określano wielkość kryształów parasporalnych. Kilka wyselekcjonowanych próbek badano także metodą skaningowej i prześwietleniowej mikroskopii elektronowej.
Wszystkie szczepy B.thuringiensis subsp. tenebrionis, szczepy DSM 2803, DSM 5526, NB 178 i NB 198, B.thuringiensis subsp. san diego, szczepy NRRL-B 15939 i NB 197 przetrwalnikują dobrze w obu pożywkach. Przed lizą komórek każda komórka zawierała przetrwalnik i kryształ parasporalny. Kryształ miał długość od 0,4 do 0,9 -1,1 pm, do czasu lizy komórki. Średnia długość wynosiła 0,6 - 0,7 pm.
Mutant DSM 5480 wytwarzał tylko niewiele przetrwalników (< 106 przetrwalników/ml) w podłożu stałym i podłożu płynnym. Przed lizą komórek większość komórek zawierała długi kryształ białkowy, ale nie zawierała przetrwalników. Wielkość kryształów białkowych wynosiła od 0,4 - 0,7 pm do 5,0 pm, średnia długość wynosiła 2,2 - 2,3 pm.
Uhrastrukturalna analiza komórek z tych podłóż metodą prześwietleniowej mikroskopii elektronowej wykazała, że sporulacja mutanta rozpoczynała się, ale nie była całkowita do czasu lizy komórki. Sporulacja w różnych komórkach osiągała różne stadium. W komórkach, w których sporulacja osiągnęła zaledwie II etap (tworzenie przesłony presporalnej), kryształ białkowy wypełniał wnętrze komórki.
W pożywce produkcyjnej (Przykład II) mutant wytwarzał większą liczbę sporów (107 108/ml). W tym podłożu częstość sporulacji mutanta była 10-100 razy niższa niż w przypadku szczepu wyjściowego.
Tak więc mutant zachowuje zdolność do wytwarzania normalnych przetrwalników, jednakże zależy ona w dużej mierze od podłoża.
Wielkość kryształów białkowych wytwarzanych przez poszczególne szczepy pokazano w tabelach 2a i 2b.
Tabela 2a
Wielkość kryształów białkowych wytwarzanych przez aktywne przeciw chrząszczom dostępne obecnie szczepy B.thuringiensis
| Szczep | Długość kryształu białego (pm) | ||
| minimum | maksimum | średnia | |
| DSM 2803 | 0,4 | 0,9 | 0,7 |
| NRRL-B 15939 | 0,4 | 0,9 | 0,7 |
| NB 178 | 0,5 | 0,9 | 0,7 |
| DSM 5526 | 0,4 | 0,9 | 0,7 |
| DSM 5480 | 0,7 | 5,0 | 2,3 |
166 479
Tabela 2b
Wielkość kryształów białkowych wytworzonych przez aktywne przeciw chrząszczom dostępne obecnie szczepy B.thuringiensis
| Szczep | Długość kryształu białkowego (pm) | ||
| minimum | maksimum | średnia | |
| NB 197 | 0,4 | 0,7 | 0,6 |
| NB 198 | 0,4 | 1,1 | 0,7 |
| DSM 5480 | 0,4 | 4,2 | 2,0 |
ZTabel 2a i 2b wynika, że mutant 5480 wytwarza dużo większe kryształy białkowe niż wszystkie znane obecnie szczepy B.thuringiensis aktywne przeciw chrząszczom.
Z uzyskanych danych wynika, że w szczepie zmutowanym, zmieniała się regulacja produkcji δ-endotoksyny w stosunku do sporulacji.
Mutant wydaje się wytwarzać krystaliczne białko zanim rozwinie spory, dając w ten sposób komórkom dłuższy czas na wytwarzanie δ-endotoksyny i w rezultacie komórki produkują dużo więcej krystalicznego białka zanim nastąpi liza, niż w szczepie wyjściowym. W zależności od dostępnych składników odżywczych i rozmiarów kryształów białkowych w komórkach do czasu sporulacji, przed lizą komórek rozwijają się normalne spory.
Przykład IV. W tym przykładzie zastosowano bardzo wydajnego mutanta Btt DSM 5480 do wytwarzania produktu o dużej mocy działania do zwalczania larw stonki ziemniaczanej.
Szczep DSM 5480 fermentowano w produkcyjnym podłożu fermentacyjnym opisanym w przykładzie II, z napowietrzaniem i wstrząsaniem w produkcyjnym tanku fermentacyjnym. Po 96 godzinach pożywkę odzyskano przez odwirowanie na wirówce o działaniu ciągłym
Stężony krem, który zawierał aktywne białko krystaliczne, stabilizowano przez dodanie środków konserwujących i doprowadzono pH do 5,0. Jedną część stężonego kremu suszono rozpyłowo, a następnie zastosowano do wytwarzania zwilżalnego proszku. Resztę stężonego kremu zastosowano bezpośrednio do wytwarzania dwóch wodnych płynnych koncentratów. Zwilżalny proszek miał skład podany w tabeli 3.
Skład dwóch preparatów FC podano w tabeli 4.
Tabela 3
Skład zwilżalnego proszku NOVODOR
| Składnik | % wagowy |
| Wysuszony rozpyłowo, stężony krem Btt | 40 |
| Detergenty | 9 |
| Środek zapobiegający zlepianiu | 1 |
| Obojętny wypełniacz | 50 |
Tabela 4
Skład preparatu NOVODOR
| Składnik | NOVODORFC1 % wagowe | NOVODOR FC2 % wagowe |
| Stężenie krem Btt | 80,00 | 55,00 |
| Konserwanty | 4,00 | 4,00 |
| Środki przeciw zamarzaniu | 9,10 | 19,00 |
| Detergenty | 2,50 | 2,50 |
| Regulator pH | 2,85 | 2,85 |
| Woda | 1,55 | 16,55 |
| 100,00 | 100,00 |
166 479
Dla wartości 500 000 BTTU/g czystego krystalicznego białka zawartość aktywnego białka krystalicznego wynosiła:
% krystaHcznego białka Btt
NOVODOR WP -70,8 KBTTU/g 14,18
NOVODOR FC1 -24,7 KBTTU/g 4,94
NOVODOR FC2 -14,2 KBTTU/g 2,84
Detergenty wybrano z dużej grupy pomocniczych środków rozpraszających i środków zwilżających zwykle stosowanych do produkcji rolniczych pestycydów. Jako środek zapobiegający zlepianiu zastosowano krzemionkę hydrofilową, ajako obojętny wypełniacz zastosowano zwykle stosowane obojętne wypełniacze takie jak bentonity, sole nieorganiczne lub materiały ilaste. Konserwanty do FC wybrano z grupy konserwantów do żywności i kosmetyków. Jako regulator pH zastosowano kwas nieorganiczny.
Przykład V. Prowadzono próby polowe w celu udowodnienia działania biologicznego wysoko wydajnego mutanta Btt DSM 5480 w stosunku do głównego docelowego szkodnika larwy stonki ziemniaczanej. Porównano dwa handlowe produkty Trident i M-one. Obiektem uprawnym były ziemniaki.
Obiekt uprawny opryskano 3 razy: 20 lipca, 27 lipca i 3 sierpnia (druga generacja larw). Zastosowano produkty i dawki, jak w tabeli 3.
T a b e l a 5
| Objętość produktu/ha | Moc działania KBTTU/g | % krystalicznego białka w preparacie | |
| NOVODOR FC2 | 2,8 litra | 14,2 | 2,84 |
| 4,2 litra | 14,2 | 2,84 | |
| 7,0 litra | 14,2 | 2,84 | |
| 8,4 litra | 14,2 | 2,84 | |
| TRIDENT | 11,2 litra | 5,5 | 1,10 |
| M-one | 5,6 litra | 8,9 | 1,78 |
Średni procent zwalczania larw CPB w porównaniu ze zwalczaniem larw, nie poddanych działaniu preparatu przedstawiono w tabeli 6. Napór stonki ziemniaczanej na terenie nie traktowanym preparatami był bardzo duży: 370 larw na 20 roślin w dniu 1 sierpnia i 904 larwy na 20 roślin w dniu 8 sierpnia.
T a b e l a 6
| Środek | % zwalczania | ||
| 1 sierpnia | 8 sierpnia | ||
| NOVODOR FC2 | 2,8 litra | 99 | 99 |
| NOVODOR FC2 | 4,2 litra | 95 | 100 |
| NOVODOR FC2 | 7,0 litra | 98 | 99 |
| NOVODOR FC2 | 8,4 litra | 100 | 100 |
| TRIDENT | 11,2 litra | 94 | 98 |
| M-one | 5,6 litra | 98 | 98 |
Wyniki te jasno dowodzą, że produkty otrzymane z wysoko wydajnego mutanta DSM 5480 są skuteczne do zwalczania larw stonki ziemniaczanej na polach. Krystaliczne białko wyprodukowane przez wysokowydajny szczep jest całkowicie aktywne i w ilości 4,2 litra FC NOVODORu daje równie dobre rezultaty jak Trident w objętości 11,2 litra i jak M-one w objętości 5,6 litra.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 1,00 zł .
Claims (15)
- Zastrzeżenia patentowe1. Środek owadobójczy zawierający substancję czynną pochodzącą od B.thuringiensis oraz znane adjuwanty, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera produkt wytwarzany przez B.thuringiensis zawierający δ-endotoksynę, wytwarzany przez mutanta lub wariant szczepu B.thuringiensis stanowiący wyselekcjonowany metodą selekcji wariantów lub naturalnych mutantów, szczep B.thuringiensis zdolny do wytwarzania znacznie większej ilości 8-endotoksyn niż ich szczepy macierzyste, sam lub w połączeniu z komórkami i/lub zarodnikami z podłoża hodowlanego, w mieszaninie z rozcieńczalnikiem lub nośnikiem dopuszczalnym do stosowania w rolnictwie.
- 2. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis zdolny do wytwarzania co najmniej dwa razy większej ilości owadobójczych 8-endotoksyn w porównaniu ze szczepem wyjściowym.
- 3. Środek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis należący do patotypu C B.thuringiensis.
- 4. Środek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis wykazującego działanie przeciwko tym samym szkodnikom co δ-endotoksyny wytwarzane przez wyjściowy B.thuringiensis wybranych z grupy obejmującej łuskoskrzydłe (mutanty B.thuringiensis subsp. kurstaki i/lub subsp. aizawai), dwuskrzydłe (mutanty B.thuringiensis subsp. israelensis) lub chrząszcze (mutanty B.thuringiensis subsp. tenebrionis).
- 5. Środek według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera produkt wytworzony przez mutanta lub wariant B.thuringiensis tenebrionis zdolnego do wytwarzania 8-endotoksyny w ilości ponad 3-krotnie większej w porównaniu ze szczepem DSM 2803.
- 6. Środek według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera produkt wytwarzany przez mutanta lub wariant B. thuringiensis subsp. tenebrionis zdolnego do wytwarzania parasporalnych kryształów o średniej długości krawędzi co najmniej dwukrotnie większej niż średnia długość krawędzi kryształu parasporalnego wytwarzanego przez szczep wyjściowy.
- 7. Środek według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera produkt wytwarzany przez mutanta lub wariant B.thuringiensis subsp. tenebrionis zdolnego do wytwarzania kryształu paraspondnego o średniej długości krawędzi wynoszącej 2 μ m lub więcej.
- 8. Środek według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że zawiera produkt wytwarzany przez mutanta lub wariant B.thuringiensis subsp. tenebrionis, wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 106 razy niższą , niż częstotliwość sporulacji szczepu wyjściowegp.
- 9. Środek według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera produkt wytwarzany przez mutanta B.thuringiensis subsp. tenebrionis wykazującego częstotliwość sporulacji 10 do 100 lub nawet 1 OB razy niższą niż częstotliwość sp orulacji szczepu DSM 2803.
- 10. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera produkt wytwarzany przez zdeponowanego mutanta B.tauringiensis subsp. tenebrionis DSM 5480.
- 11. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera substancję czynną wytwarzaną przez B.thuringiensis o aktywności ponad dwa razy większej od aktywności substancji czynnej wytwarzanej przy zastosowaniu szczepu wyjściowego.
- 12. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że ma postać płynną i jako substancję czynną zawiera produkt zawierający 8-endotoksynę o mocy działania wynoszącej co najmniej 15.000 BTTU/g, odpowiadającej zawartości co najmniej 3% wagowych krystahcznego białka owadobójczego przeciw chrząszczom.
- 13. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że ma postać stałą i jako substancję czynną zawiera produkt zawierający 8-endotoksynę o mocy działania wynoszącej co najmniej 50.000 BTTU/g, odpowiadającej zawartości co najmniej 10% wagowych krystalicznego białka owado bejczego przeciw chrząszczom.166 479
- 14. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera produkt wytwarzany przez szczep DSM 5480 o mocy działania co najmniej 2-krotnie przewyższającej moc działania produktu aktywnego przeciw chrząszczom, wytwarzanego przez szczep DSM 2803 lub inne szczepy Btt.
- 15. Środek według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera rozpuszczalnik lub nośnik w postaci stałej lub ciekłej ewentualnie w połączeniu ze środkiem powierzchniowo czynnym.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK580589A DK580589D0 (da) | 1989-11-17 | 1989-11-17 | Mutant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL287806A1 PL287806A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL166479B1 true PL166479B1 (pl) | 1995-05-31 |
Family
ID=8145376
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL30094090A PL166417B1 (pl) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Sposób selekcji wariantów lub mutantów spon t a nicznych szczepy Baciiius thuringiensis PL PL PL PL PL PL |
| PL30093990A PL166433B1 (pl) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringlensis PL PL PL PL PL PL |
| PL28780690A PL166479B1 (pl) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL PL |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL30094090A PL166417B1 (pl) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Sposób selekcji wariantów lub mutantów spon t a nicznych szczepy Baciiius thuringiensis PL PL PL PL PL PL |
| PL30093990A PL166433B1 (pl) | 1989-11-17 | 1990-11-16 | Sposób wytwarzania owadobójczego produktu wytwarzanego przez B. thuringlensis PL PL PL PL PL PL |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DK (1) | DK580589D0 (pl) |
| PL (3) | PL166417B1 (pl) |
-
1989
- 1989-11-17 DK DK580589A patent/DK580589D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-11-16 PL PL30094090A patent/PL166417B1/pl unknown
- 1990-11-16 PL PL30093990A patent/PL166433B1/pl unknown
- 1990-11-16 PL PL28780690A patent/PL166479B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL166417B1 (pl) | 1995-05-31 |
| DK580589D0 (da) | 1989-11-17 |
| PL287806A1 (en) | 1991-12-16 |
| PL166433B1 (pl) | 1995-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2138950C1 (ru) | Мутантный штамм бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis dsm 5480 - продуцент дельта-эндотоксина, способ получения препарата на основе дельта-эндотоксина, пестицидная композиция, содержащая дельта-эндотоксин, способ борьбы с вредными сельскохозяйственными насекомыми, способ получения мутантных штаммов бактерий bacillus thuringiensis subsp, tenebrionis - продуцентов дельта-эндотоксина | |
| US5006336A (en) | Novel coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate | |
| EP0178151A2 (en) | Preparation of strains of bacillus thuringiensis having an improved activity against certain lepidopterous pests and novel strain produced thereby | |
| CA1328239C (en) | Bacillus thuringiensis strain, method for their isolation and related insecticidal compositions | |
| EP0202739A1 (en) | Novel micro-organism and its use for controlling pests | |
| EP0612217B1 (en) | Bacillus thuringiensis isolates active against cockroaches and genes encoding cockroach-active toxins | |
| US5211946A (en) | Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides | |
| US5279962A (en) | Mutants or variants of Bacillus thuringiensis producing high yields of delta endotoxin | |
| JPH0515364A (ja) | 新規なバシラス菌株及び害虫防除剤 | |
| JP3017799B2 (ja) | バシラススリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の新株、その製造法及び、昆虫の制御ならびに昆虫の攻撃からの植物の保護におけるその利用 | |
| PL166479B1 (pl) | Srodek owadobójczy PL PL PL PL PL PL | |
| EP0309145A1 (en) | Bacteriophage-resistant strain of Bacillus Thuringiensis Var. San Diego | |
| HRP920198A2 (en) | Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta toxin | |
| CZ562990A3 (cs) | Mutant mikroorganismu Bacillus thuringiensis deponovaný jako subsp. tenebrionis DSM 5480, způsob jeho přípravy a pesticidní prostředek, který ho obsahuje | |
| Jayaraman et al. | Active against Lepidopteran Agricultural Pests, by the Use of Continuous Culture Studies | |
| IL86242A (en) | Transconjugant bacillus thuringiensis strains, insecticidal compositions containing them and method for their use |