CZ62198A3 - Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními a/nebo antagonními aktivitami - Google Patents

Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními a/nebo antagonními aktivitami Download PDF

Info

Publication number
CZ62198A3
CZ62198A3 CZ98621A CZ62198A CZ62198A3 CZ 62198 A3 CZ62198 A3 CZ 62198A3 CZ 98621 A CZ98621 A CZ 98621A CZ 62198 A CZ62198 A CZ 62198A CZ 62198 A3 CZ62198 A3 CZ 62198A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
carbons
compound
formula
alkyl
group
Prior art date
Application number
CZ98621A
Other languages
English (en)
Inventor
Elliott S. Klein
Alan T. Johnson
Andrew M. Standeven
Richard L. Beard
Tien T. Duong
Sunil Nagpal
Vidyasagar Vuligonda
Min Teng
Roshantha A. Chandraratna
Samuel J. Gillett
Original Assignee
Allergan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Allergan filed Critical Allergan
Publication of CZ62198A3 publication Critical patent/CZ62198A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D335/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D335/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D335/06—Benzothiopyrans; Hydrogenated benzothiopyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/78—Benzoic acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C245/00—Compounds containing chains of at least two nitrogen atoms with at least one nitrogen-to-nitrogen multiple bond
    • C07C245/02—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides
    • C07C245/06—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C245/10—Azo compounds, i.e. compounds having the free valencies of —N=N— groups attached to different atoms, e.g. diazohydroxides with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with nitrogen atoms of azo groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/38—Amides of thiocarboxylic acids
    • C07C327/48—Amides of thiocarboxylic acids having carbon atoms of thiocarboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C57/00—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C57/46—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing six-membered aromatic rings and other rings, e.g. cyclohexylphenylacetic acid
    • C07C57/50—Unsaturated compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms containing six-membered aromatic rings and other rings, e.g. cyclohexylphenylacetic acid containing condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/33—Polycyclic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/33—Polycyclic acids
    • C07C63/49—Polycyclic acids containing rings other than six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/66—Polycyclic acids with unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/68—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen
    • C07C63/72—Polycyclic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C63/00—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C63/68—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen
    • C07C63/74—Compounds having carboxyl groups bound to a carbon atoms of six-membered aromatic rings containing halogen having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/01—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C65/19—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups having unsaturation outside the aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/21—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C65/28—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/32—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups
    • C07C65/38—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing keto groups having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/612—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to an acyclic carbon atom and having a six-membered aromatic ring in the acid moiety
    • C07C69/618—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to an acyclic carbon atom and having a six-membered aromatic ring in the acid moiety having unsaturation outside the six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/84—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/90—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring with esterified hydroxyl and carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/94—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of polycyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D213/55—Acids; Esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/30—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/16—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/0803—Compounds with Si-C or Si-Si linkages
    • C07F7/081—Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/02—Systems containing two condensed rings the rings having only two atoms in common
    • C07C2602/04—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring
    • C07C2602/10—One of the condensed rings being a six-membered aromatic ring the other ring being six-membered, e.g. tetraline

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Compounds Containing Sulfur Atoms (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Quinoline Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká nových sloučenin s retinoidními negativními hormonálními a/nebo retinoidními biologickými aktivitami podobnými antagonním (antagonist-like). Přesněji, vynález se týká 4-aryl substituovaného benzopyranu, 4-aryl substituovaného benzothiopyranu, 4-aryl substituovaného 1,2-dihydrochinolinu a 8-aryl substituovaných
5,6-dihydronaftalenových derivátů, které mohou být též substituovány 3-oxo-1pro^enylovou substituční skupinou. Tyto nové sloučeniny mají retinoidní aktivitu podobnou antagonní (antagonist-like) a jsou použitelné pro léčbu nebo prevenci toxicity vyvolané retinoidem, vitaminem A a prekurzorem vitaminu A u savců a jako doplněk při léčbě savců retinoidy jako prevence nebo pro potlačení nepotřebných nebo nežádoucích vedlejších účinků. Vynález se dále týká použití retinoidních negativních hormonů pro zvýšení biologických aktivit jiných retinoidů a steroidních hormonů a inhibici základní aktivity neobsazených receptorů pro kyselinu retinovou.
Dosavadní stav techniky
Sloučeniny s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like) jsou již známy a jsou mnohokrát popsány v patentech Spojených států a v jiných patentech a vědeckých publikacích. Za obecně známé se již považuje to, že aktivita podobná retinoidní (retinoid-like) je využitelná pro léčbu savců, zahrnujících člověka, pro léčbu nebo zmírnění symptomů spojených s mnoha chorobami a stavy.
Retinoidy (vitamin A a jeho deriváty) jsou známy svým širokým spektrem aktivit, zahrnující účinky na buněčnou proliferaci a diferenciaci v různých biologických systémech. Pro tuto aktivitu jsou retinoidy využitelné pro léčbu různých onemocnění, zahrnujících kožní choroby a nádory. Bylo již vyvinuto velké množství sloučenin s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like) a existuje spousta obsáhlých patentů a chemické literatury, popisující tyto sloučeniny. Patentová literatura týkající se tohoto problému zahrnuje patenty Spojených států s čísly 4,980,369, 5,006,550, 5,015,658, 5,045,551, 5,089,509, 5,134,159, 5,162,546, 5,234,926, 5,248,777, 5,264,578,
5,272,156, 5,278,318, 5,324,744, 5,346,895, 5,346,915, 5,348,972, 5,348,975,
5,380,877, 5,399,561, 5,407,937, (převedeny na stejného nabyvatele jako tato * * • · · · 9 ♦· • 9 99
- * * t «♦ * přihláška) a patenty a publikace v nich uvedené, které částečně popisují, nebo se týkají chromanu, thiochromanu a 1,2,3,4-tetrahydrochinolinových derivátů s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like). Navíc některé přihlášky, které jsou v řízení, jsou převedeny na stejného nabyvatele a týkají se dalších sloučenin s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like).
Patenty Spojených států s čísly 4,740,519 (Shroot a kol.), 4,826,969 (Maignan a kol.), 4,326,055 (Loeliger a kol.), 5,130,335 (Chandraratna a kol.), 5,037,825 (Klaus a kol.), 5,231,113 (Chandraratna a kol), 5,324,840 (Chandraratna), 5,344,959 (Chandraratna), 5,130,335 (Chandraratna), publikovaná evropská patentová přihláška č.O 176 034 A (Wuest a kol.), 0 350 846 A (Klaus a kol.), 0176 032 A (Frickel a kol.), 0 176 033 A (Frickel a kol.), 0 253 302 A (Klaus a kol.), 0 303 915 A (Bryce a kol.), UK patentová přihláška GB 2190378 A (Klaus a kol.), německá patentová přihláška č. DE 3715955 A1 (Klaus a kol.), DE 3602473 A1 (Wuest a kol.), a články J. Amer. Acad. Derm. 15: 756-764 (1986) (Sporn a kol.), Chem. Pharm. Bull. 33; 404-407 (1985) (Shudo a kol.), J. Med. Chem. 31 ;2182-2192 (1988) (Kagechika a kol.), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids CRC Press lne. 1990, str. 334-335, 354 (Dawson a kol.), popisují nebo se týkající sloučenin zahrnujících tetrahydronaftylovou skupinu a s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like). Patent Spojených Států číslo 4,391,731 (Boiler a kol.) popisuje tetrahydronaftalenové deriváty, které jsou využitelné ve sloučeninách tekutých krystalů.
Článek Kagechika a kol. v J. Med. Chem. 32:834 (1989) popisuje jisté 6-(3-oxo1-profenyl)-1,2,3,4-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaftalenové deriváty a s nimi související flavonové sloučeniny s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like). Článek Shudo a kol. v Chem. Pharm. Bull. 33:404 (1985) a Jetten a kol. v Cancer Research 47:3523 (1987) popisuje nebo se týká dalších 3-oxo-1-profenyl derivátů (chalkonových sloučenin) a jejich aktivity podobné retinoidní (retinoid-like).
Sloučeniny s aktivitou podobnou retinoidní (retinoid-like) mají bohužel také při terapeutických dávkách řadu vedlejších účinků, včetně bolestí hlavy, teratogeneze, mukokutánní toxicity, muskuloskeletální toxicity, dyslipidemie, dráždění pokožky a hepatotoxicity. Tyto vedlejší účinky omezují přijatelnost a použití retinoidů pro léčbu chorob.
Je již obecně známo, že u savců (a jiných organismů) existují dva hlavní typy retinoidních receptorů. Tyto dva hlavní typy nebo rodiny receptorů se označují jako • « » * » « - <· ···· “ϊ . . · · · » · ·» •J · ······« » · · · · ·
- * . · -»· ·· ·«
RAR a RXR. V každém typu existují subtypy: v rodině RAR se subtypy označují RAR-a, RAR-β a RAR-γ, u RXR subtypů RXR-α, RXR- β a RXR-γ. Obě rodiny receptorú jsou transkripčními faktory, které se mohou navzájem odlišit na základě svých vazebných specifit pro ligand. Všechny -trans -RA (ATRA) vážou a aktivují třídu receptoru kyseliny retinové (RAR), která zahrnuje RAR-a, RAR-β a RAR-γ. Na RAR a členy retinoidní X receptorové (RXR) rodiny se vážou a aktivují je různé ligandy, 9-c/s -RA (9C-RA).
Bylo již také zjištěno, že výskyt dvou hlavních retinoidních receptoru a některých jejich subtypů není stejný v různých tkáních a orgánech savčích organismů. Dále je rovněž známo, že mnoho nežádoucích vedlejších účinků retinoidů je zprostředkováno jedním nebo více RAR receptorovými subtypy. Vzhledem k tomu, sloučeniny s aktivitou na retinoidních receptorech podobnou antagonní (antagonist-like), specifitou nebo selektivitou pro jeden z hlavních typů nebo rodin a stejně tak specifitou nebo selektivitou pro jeden nebo více subtypů z receptorové rodiny, jsou žádané vzhledem k farmakologickým vlastnostem.
Relativně nedávno byly vyvinuty sloučeniny, které se vážou na RAR receptory bez spuštění reakce nebo reakcí, které spouští antagonisté téhož receptoru. Sloučeniny nebo činidla, která se vážou na RAR receptory bez spuštění “retinoidní” reakce jsou proto schopné blokovat (snížit nebo zvýšit rozsah) aktivity RAR antagonistů v biologických měřeních a systémech. Přesněji, vzhledem k vědecké a patentové literatuře v této oblasti, publikovaná PCT přihláška WO 94/14777 popisuje jisté heterocyklické deriváty karboxylové kyseliny, které se vážou na RAR retinoidní receptory a v přihlášce se uvádí jako využitelné pro léčbu určitých onemocnění nebo stavů, jako je akné, psoriáza, revmatoidní artritida a virové infekce. Podobné zjištění je také uvedeno v článku Yoshimury a kol. J. Med. Chem. 38: 3163-3173 (1995). Kaneky a kol. Med. Chem. Res. 1:220-225 (1991); Apfela a kol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7129-7133 Augusty 1992 Cell Biology, Eckhardta a kol. Toxicology Letters 70:299-308 (1994); Keidela a kol. Moleculara Cellular Biology 14:287-298 (1994); a Eyrolles a kol. J. Med. Chem. 37: 1508-1517 (1994) popisují sloučeniny s antagonist like aktivitou na jednom nebo více RAR retinoidních subtypech.
Jako další nežádoucí vedlejší účinek léčby retinoidními sloučeninami se občas objevuje i řada klinických stavů, jejichž příčinou je předávkování vitaminem A nebo prekurzorem vitaminu A, vyplývající buď z nadměrného příjmu vitaminových doplňků nebo požitím jater určitých ryb a zvířat, které obsahují velké množství tohoto vitamínu.
Chronické nebo akutní toxicity, projevující se syndromem hypervitamiózy A, včetně bolesti hlavy, loupání kůže, kostní toxicity, dyslipidemie a podobně. Podle posledních let se zdá, že toxicity způsobené analogy vitaminu A, jako jsou retinoidy, obzvláště syndrom hypervitaminózy A , mají stejnou biologickou příčinu, kterou je aktivace RAR. U těchto toxicit se nyní provádí další měření a zabrání se expozici příčinného činidla, jestliže jde o játra, vitaminové doplňky nebo retinoidy. Zatímco některé toxicity časem vymizí, jiné (například předčasné uzavření epifýz plochých kostí) jsou trvalé.
Obecně řečeno, specifické protiléky jsou nejlepší léčbou při otravě farmakologickými činidly, ale pouze asi dvacet chemikálií nebo nebo tříd chemikálií z tisíců existujících mají známé specifické protiléky. Specifické protiléky by měly pro léčbu hypervitaminózy A a retinoidní toxicity velkou cenu. Se zvyšujícím se množstvím klinicky využívaných retinoidú by specifické protiléky při otravě retinoidy mohly skutečně zachránit život.
Podstata vynálezu
Vynález zahrnuje sloučeniny vzorce 1
kde X je S, O, NR’, kde R’ je H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky, nebo
X je [C(Ri)2 ]n, kde Ri je nezávisle H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky a n má hodnotu 1 až
R2 je vodík, nižší alkyl s 1 až 6 uhlíky nebo alkylthio s 1 až 6 uhlíkovými atomy;
R3 je vodík, nižší alkyl s 1 až 6 uhlíkovými atomy nebo F;
m je celé číslo o hodnotě 0-3;
o je celé číslo o hodnotě 0-3;
Z je -0 = 0-,
-N=N-N=CRi -,
-CR=N,
-(CRi=CRi)n· - kde rť je celé číslo o hodnotě 0-5,
-CO-NR, -,
-CS-NR, -,
-NR! -CO,
-NRí -CS,
-COO -,
-OCO -;
-CSO -;
-OCS -;
Y je fenylová nebo naftylová skupina nebo heteroaryl ze skupiny sestávající z pyridylu, thienylu, furylu, pyridazinylu, pyrimidinylu, pyrazinylu, thiazolylu, oxazolylu, imidazolylu a pyrrazolylu, fenylové a heteroalylové skupiny jsou volitelně substituovány jednou nebo dvěma R2 skupinami nebo pokud Z je -(CRi=CRi)n- a n’ je 3, 4 nebo 5, pak Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou skupinou (CR2=CR2 )n· a B;
A je (CH2)q , kde q je 0 - 5, nižší rozvětvený alkylový řetězec s 3 až 6 uhlíky, alkenyl s 2 až 6 uhlíky a s 1 nebo 2 dvojnmi vazbami, alkynyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 trojných vazbách;
B je vodík, COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, COOR8 , CONR9R10, CH2OH, CH2ORh, CH2OCORh , CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7ORi3O nebo tri- nižší alkylsilyl, kde R7 je alkylová, cykloalkylová nebo alkenylová skupina s 1 až 5 uhlíkovými atomy nebo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo R8je fenyl nebo nižší alkylfenyl, R9 a Ri0 je nezávisle vodík, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo fenyl nebo nižší alkylfenyl, Rn je nižší alkyl, fenyl nebo nižší alkylfenyl, R12 je nižší alkyl a R13 je divalentní alkylový radikál o 2 - 5 uhlících a
R14 je (Ris)r -fenyl, (Ri5)r -naftyl nebo (R15)r - heteroaryl, kde heteroarylová skupina obsahuje 1 až 3 heteroatomy vybrány ze skupiny sestávající z O, S a N, r je celé číslo o hodnotě 0 - 5 a
R15je nezávisle H, F, Cl, B, I, NO2, N(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, fluorem substituovaná alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, alkenylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 dvojných vazbách, alkynylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 trojných vazbách nebo trialkylsilylová nebo trialkylsilyloxy skupina, kde alkylové skupiny obsahují nezávisle 1 až 6 uhlíků.
Vynález dále zahrnuje sloučeniny vzorce 101
kde X je S, O, NR’, kde R’ je H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky, nebo
X je [C(Ri)2 ]n, kde Ri je nezávisle H nebo alkyl o 1 až 6 uhlících a n je celé číslo od 1 do 2;
R2 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících nebo alkylthio o 1 až 6 uhlících, F, Cl, Br, I, CF3, fluorem substituovaný alkyl o 1 až 6 uhlících, OH, SH, alkoxy o 1 až 6 uhlících nebo alkylthio o 1 až 6 uhlících;
R3 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících nebo F;
m je celé číslo o hodnotě 0-3;
o je celé číslo o hodnotě 0-3;
Y je fenylová nebo naftylová skupina nebo heteroaryl ze skupiny sestávající z pyridylu, thienylu, furylu, pyridazinylu, pyrimidinylu, pyrazinylu, thiazolylu, oxazolylu, imidazolylu a pyrazolylu, fenylové a heteroalylové skupiny jsou volitelně substituovány jednou nebo dvěma R2 skupinami; nebo
A je (CH2)q , kde q je 0-5, nižší rozvětvený alkylový řetězec o 3-6 uhlících, cykloalkyl o 3-6 uhlících, alkenyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 dvojných vazbách, alkynyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 trojných vazbách;
B je vodík, COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, COORe , CONRgRw, CH2OH, CH20Ru, CH20C0Ru , CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR?0Ri30 nebo o tri-nižší aíkylsilyl, kde R7 je alkylová, cykloalkylová nebo alkenylová skupina o 1 až 5 uhlících, R8 je alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo trimethylsilylalkyl, kde má alkylová skupina 1 až 10 uhlíků, nabo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo R8 je fenyl nebo nižší alkylfenyl, R9 a Rw je nezávisle vodík, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo • » .: -....:. • - r ♦ * ♦ » ---- · · · r · · > · “ fenyl nebo nižší alkylfenyl, Rn je alkyl, fenyl nebo nižší alkylfenyl, R12 je nižší alkyl a
R13 je divalentní alkylový radikál o 2 - 5 uhlících a
R14 je (Ris)r -fenyl, (Ris)r -naftyl nebo (R15)r - heteroaryl, kde heteroarylová skupina obsahuje 1 až 3 heteroatomy vybrány ze skupiny sestávající z O, S a N, r je celé číslo o hodnotě 0-5 a
Risje nezávisle H, F, Cl, B, I, NO2, NfRaJCORe, NR8CON(R8)2, OH, OCORs, OR8, CN, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, fluorem substituovaná alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, alkenylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 dvojných vazbách, alkynylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 trojných vazbách nebo trialkylsilylová nebo trialkylsilyloxy skupina, kde alkylové skupiny obsahují nezávisle 1 až 6 uhlíků;
Ri6 je H, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících;
Říz je H, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících, OH nebo OCORn, a p je 0 nebo 1 s tou výhradou, že pokud p je 1, pak substituenční skupina R17 není přítomna a m je celé číslo o hodnotě od 0 do 2.
Sloučeniny podle vynálezu jsou využitelné jako prevence určitých nežádoucích vedleších účinků retinoidů, které se podávají při léčbě nebo prevenci určitých onemocnění nebo stavů. Pro tento účel se sloučeniny vynálezu mohou podávat současně s retinoidy. Sloučeniny vynálezu jsou také využitelné pro léčbu akutní nebo chronické toxicity jako výsledek předávkování nebo otravy retinoidními léky nebo vitaminem A.
Vynález se navíc týká použití RAR antagonistů pro blokování všech nebo některých RAR receptářových míst v biologických systémech, včetně savců, pro prevenci nebo zeslabení účinku RAR antagonistů na uvedených receptářových místech. Přesněji, vynález se týká použití RAR antagonistů pro (a) prevenci a (b) léčbu retinoidní (včetně vitamínu A nebo prekurzoru vitamínu A) chronické nebo akutní toxicity a vedlejších účinků retinoidní léčby.
Z hlediska vynálezu je zde uveden způsob léčby patologických stavů u savců.
Podmínky léčby souvisí s aktivitou receptoru pro kyselinu retinovou. Tento způsob zahrnuje podávání retinoidního antagonisty savcům nebo negativního hormonu schopného vazby na jeden z následujících subtypů receptoru pro kyselinu retinovou:
RARa , RARP, RARY. Antagonista nebo negativní hormon je podán ve farmaceuticky účinném množství pro žádaný terapeutický výsledek proti patologickému stavu u savců.
Jako protilék proti akutní nebo chronické otravě retinoidy nebo vitaminem A mohou být RAR antagonisté podány savcům enterálné, to znamená intragastickou sondou nebo jako přídavek do potravy nebo parenterálně, např. inraperitoneálné, intramuskulárně, subkutánně, lokálně atd. Jedinou podmínkou pro způsob podání je aplikace do cílového orgánu. RAR antagonista může být formulován samostatně nebo v kombinaci na nosiči. RAR antagonista nemusí být v roztoku v konečném stavu, například v případě enterálni aplikace.
Jako doplněk léčby retinoidy a jako prevence jednoho nebo více vedlejších účinků podání retinoidového léčiva může být RAR antagonista podobně podán enterálné nebo parenterálně. RAR antagonista a RAR agonista nemusí být podány stejnou cestou. Důležité je, aby bylo v cílové tkáni zajištěno dostatečné množství RAR antagonisty během vystavení vlivu RAR agonisty. Pro prevenci retinoidní toxicity je nejlepší, když se RAR antagonista podává současně nebo před léčbou RAR agonistou. V mnohých případech je třeba podat RAR antagonistu jinou cestou než agonistu. Například nežádoucím kožním efektům enterálné podaného retinoidu může se může předejít nebo mohou být zmírněny lokálním podáním RAR antagonisty.
Dalším aspektem vynálezu je způsob identifikace retinoidních negativních hormonů. Tento způsob zahrnuje následující kroky: získání transfektovaných buněk obsahujících reportní gen transkripčně zodpovědný za vazbu na rekombinantní retinoidní receptor, rekombinantní retinoidní receptor má nejméně proteinových domén umístěných na C-konci k DNA vazebné doméně intaktního retinoidního receptorů při měření základní hladiny exprese reportního genu u nezreagovaných transfektovaných buněk, nezreagované transfektované buňky se množí v nepřítomnosti přidaného retinoidu, transfektované buňky reagují s retinoidní sloučeninou pro otestování negativní hormonální aktivity, měří se hladina exprese reportního genu zreagovaných buněk a srovná se měření hladiny exprese reportního genu u zreagovaných a nezreagovaných buněk a zjišťuje se, zda dávka retinoidních negativních hormonů retinoidních sloučenin způsobuje nižší hladinu exprese reportního genu u zreagovaných buněk ve srovnání se základní hladinou exprese reportního genu měřené u nezreagovaných buněk. V určitých doporučených postupech je intaktním receptorem RAR-a, RAR-β nebo RAR-χ subtyp. U jiných postupů je intaktním receptorem RXR-a, RXR-β nebo RXR-χ subtyp. Rekombinantním receptorem může být také RAR nebo RXR receptor. U některých postupů je rekombinantním receptorem chimemí retinoidní receptor s konstitutivní transkripčně aktivátorovou doménou. Takováto konstitutivní transkripčně aktivátorové doména může obsahovat množství aminokyselin s celkovým negativním nábojem nebo aminokyselinovou sekvencí virové transkripčně aktivátorové domény, jako je například transkripčně aktivátorové doména viru herpes simplex VP-16. V postupech, kde má určitá doména aktivátoru transkripce celkový negativní náboj, může být retinoidní receptor rekombinantní s delecí DNA vazebné domény jako je DNA vazebná doména specifická pro cis-regulační oblast jinou než je oblast odpovídající kyselině retinové. Tyto oblasti zahrnují oblast odpovídající estrogenu. Transfektovaná buňka se nejprve rozmnožuje v růstovém médiu zcela bez endogenních retinoidů, jako je například sérum extrahované aktivním uhlím. Při tomto způsobu může být reportním genem luciferázový gen, a měřící kroky tak mohou zahrnovat luminometrii. Reportním genem může být také gen pro β- galaktosidázu, v tomto případě mohou měřící kroky zahrnovat měření β-galaktosidázy. Transferovanou buňkou může být savčí transfektovaná buňka, jako například buňka zelené opice nebo lidská buňka.
Jiným hlediskem vynálezu je způsob zvýšení farmakologické aktivity agonisty receptoru steroidních superrodiny, které jsou přítomny u savců. Tento způsob zahrnuje podání sloučeniny agonisty receptoru ze superrodiny steroidního receptoru obsahující farmaceuticky účinnou dávku retinoidního negativního hormonu pro zvýšení farmakologické aktivity agonisty receptoru steroidních superrodiny. Farmakologické aktivita je měřitelná u sledovaného genu pomocí frans-aktivačního měření in vitro, například měření anti-AP-1 aktivity. Farmakologické aktivita se může zvýšit zvýšením antiproliferativní aktivity jako například aktivity měřitelné v epitelu retinálního pigmentu. Agonistou receptoru ze steroidní superrodiny může být: agonista retinoidního receptoru, agonista receptoru pro vitamín D, agonista receptoru pro glukokortikoid, agonista receptoru pro thyroidní hormon, peroxizom proliferator-activovaný receptorový agonista nebo agonista receptoru pro estrogen. Agonistou retinoidního receptoru může být RAR agonista, jako je kyselina all-frans -retinová nebo kyselina 13cis retinová. Agonistou retinoidního receptoru může být také RXR agonista. Výhodným agonistou receptoru pro vitamín D je 1,25-dihydroxyvitamín D3. Výhodným agonistou receptoru pro glukokortikoid je dexamethazon. Výhodným agonistou receptoru pro thyroidní hormon je 3,3’,5-trijodthyronin. Retinoidním negativním hormonem je RARspecifický retinoidní negativní hormon, který má disociační konstantu výhodně nižší než přibližné 30 nM. Příkladem RAR- specifického retinoidní negativního hormonu je
AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 a AGN 193871. Sloučenina obsahuje farmakologicky účinnou dávku retinoidního negativního hormonu, která se může podat současné s agonistou steroidní superrodiny a obě složky se mohou před podáním smíchat. Je možné je také podat jako samostatné sloučeniny.
Pro účely vynálezu je RAR antagonista definován jako chemikálie, která se váže na jeden nebo více RAR subtypů s Kd méně než 1 mikromolární (Kd < 1 μΜ), ale která výrazně nepůsobí na transkripčni aktivaci RAR-subtypy regulovaných genů v receptor kotransfekčním měření. Antagonisté jsou běžně chemická činidla, která inhibují aktivity agonistů. Aktivita receptorového antagonisty se proto běžně měří podle schopnosti inhibovat aktivitu agonisty.
RAR agonista je definován jako chemikálie, která se váže na jeden nebo více RAR subtypů s Kd méně než 1 mikromolární (Kd < 1μΜ) a způsobuje transkripčni aktivaci RAR-subtypy regulovaných genů v receptor kotransfekčním měření. Spojení “RAR agonista” zahrnuje chemikálie, které se mohou vázat a/nebo aktivovat jiné receptory kromě RAR, například RXR receptory.
Negativní hormon nebo inverzní agonista se užívá ve smyslu ligandu nebo receptoru, který způsobí inaktivní stav receptoru vzhledem k základnímu stavu v nepřítomnosti ligandu. Proto zatímco antagonista může inhibovat aktivitu agonisty, negativní hormon je ligandem, který může měnit konformaci receptoru v nepřítomnosti ligandu. Tato teorie negativního hormonu nebo inverzního agonisty byla zkoumána Bondem a kol. v Nátuře 374:272 (1995). Přesněji, Bond a kol. předpokládali, že β2 adrenoreceptor bez ligandu existuje ve vyváženém stavu mezi inaktivní konformaci a spontánní aktivní konformaci. Agonisté pravděpodobně stabilizují receptor v aktivní konformaci.Inverzní antagonisté by naopak měly stabilizovat inaktivní konformaci receptoru. Zatímco má antagonista takovou aktivitu, že inhibuje agonistů, negativní hormon tak může být navíc aktivní v nepřítomnosti agonisty za inhibice spontánní konverze receptoru bez ligandu do aktivní konformace. Jen malá skupina antagonistů působí jako negativní hormony. Jak zde bylo uvedeno, AGN 193109 je současně antagonistou i negativním hormonem. Dodnes nejsou znýmy jiné retinoidy s negativní hormonální aktivitou.
Jak se zde užívá, současné podání farmakologicky aktivních sloučenin znamená podání dvou různých chemických složek in vitro nebo in vivo. Současné podání znamená dávku dvou různých činidel; současnou dávku směsi činidel; stejné jako dávku jednoho činidla s následnou dávkou druhého činidla. Ve všech případech současně podaná činidla na sebe vzájemně působí.
Výraz alkyl znamená a zahrnuje jakoukoli a všechny skupiny, které jsou známé jako normální alkyl, alkyl s rozvětveným řetězcem a cykloalkyl. Výraz alkenyl znamená a zahrnuje normální alkenyl, alkenyl s rozvětveným řetězcem a cykloalkenylové skupiny, které mají jedno nebo více nenasycených míst. Podobně, výraz alkynyl znamená a zahrnuje jakoukoli a všechny skupiny, které jsou známé jako normální alkynyl, alkynylové skupiny s rozvětveným řetězcem s jednou nebo více trojnými vazbami.
Nižší alkyl znamená podle výše uvedené široké definice alkylové skupiny o 1 až 6 uhlících v případě normálního nižšího alkylu a 3 až 6 uhlíků pro nižší rozvětvený řetězec a cykloalylové skupiny. Nižší alkenyl je definován podobně, 2 až 6 uhlíků pro nižší alkenylové skupiny a 3 až 6 uhlíků pro rozvětvený řetězec a nižší-cyklo alkenylové skupiny. Nižší alkynyl je též definován podobně, 2 až 6 uhlíků pro nižší alkynylové skupiny a 4 až 6 uhlíků pro rozvětvený řetězec nižších alkynylových skupin.
Pojem “ester” , který se zde užívá, znamená a zahrnuje jakoukoli sloučeninu odpovídající klasické definici organické chemie. Zahrnuje organické a anorganické estery. Pokud B (vzorec 1 nebo vzorec 101) je -COOH, pak tento pojem zahrnuje produkty odvozené z reakce této skupiny s alkoholy nebo thioly, výhodně s alifatickými alkoholy o 1-6 uhlících. Pokud je ester odvozen od sloučenin, kde B je -CH2OH, pak tento pojem zahrnuje sloučeniny odvozené od organických kyselin schopných tvorby esterů, zahrnující kyseliny na bázi kyseliny fosforečné a sírové, nebo sloučeniny vzorce -CH2OCOR11 , kde Rn je jakýkoli substituovaná nebo nesubstituovaná alifatická, aromatická, heteroaromatická nebo alifatickoaromatická skupina, výhodně o 1-6 uhlících v alifatických částech.
Jak je uvedeno na mnohých místech přihlášky, výhodné estery jsou odvozeny od nasycených alifatických alkoholů nebo kyselin o deseti nebo méně uhlíkových atomech nebo cyklických nebo nasycených alifatických alkoholů a kyselin o 5 až 10 uhlíkových atomech. Zvláště výhodné alifatické estery jsou odvozeny od nižších alkylových kyselin a alkoholů. Výhodné jsou také fenyl nebo nižší alkylfenylové estery.
Amidy jsou míněny klasicky podle definice organické chemie. V tomto případě zahrnují nesubstituované amidy a všechny alifatické a aromatické mono- a di12 substituované amidy. Jak je uvedeno na mnohých místech přihlášky, výhodné mono- a di- substituované amidy jsou odvozené od nasycených alifatických radikálů o 5 až 10 uhlíkových atomech. Zvláště výhodné amidy jsou odvozeny od substituovaných a nesustituovaných nižších alkylových aminů. Výhodné jsou také mono- a disubstituované amidy odvozené od substituovaného a nesubtituovaného fenylu nebo nižších alkylfenylových aminů. Nesubstituované amidy jsou také výhodné.
Acetaly a ketaly zahrnují radikály vzorce -CK, kde K je (-OR)2. Zde je R nižší alkyl. K může být -OR7O-, kde R7 je nižší alkyl o 2-5 uhlíkových atomech, nerozvětveném nebo rovětveném řetězci.
Farmaceuticky přijatelné soli se mohou připravit ze sloučenin vynálezu, které jsou funkčně schopné tvořit soli, například kyselá funkčnost. Farmaceuticky přijatelná sůl je jakákoli sůl, která uchovává aktivitu původní sloučeniny a nemá žádné škodlivé nebo nepotřebné účinky na objekt, kterému je podána, a v souvislosti s tím, komu je podána.
Farmaceuticky přijatelné soli se mohou být odvozeny od organických a anorganických bází. Sůl může být mono nebo polyvalentní iont. Z tohoto hlediska jsou výhodné anorganické ionty, sodíku, draslíku, vápníku a hořčíku. Organické soli se mohou připravit s aminy, zvláště amonné soli, jako jsou mono-, di- a trialkyl aminy nebo ethanolaminy. Soli se mohou připravit také s kofeinem, tromethamin a podobnými molekulami. Dusík musí být dostatečně bazický, aby byl schopen tvorby dalších kyselích solí, které se mohou připravit s jakýmikoli anorganickými a organickými kyselinami nebo alkylačním činidlem, napříkald methyljodid. Výhodné soli se tvoří z anorganických kyselin, například kyselina chlorovodíková, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná. Může se použít také jakákoli jednoduchá organická kyselina, například mono-, di- a tri- kyselina.
Některé sloučeniny podle vynálezu mohou mít trans a cis (E a Z) izomery. Navíc, sloučeniny vynálezu mohou obsahovat jedno nebo více chirálních center, a proto mohou existovat v enantiomemích a diastereomerních formách. Záměrem vynálezu je pokrýt všechny takové izomery samy o sobě a také směsi cis a trans izomerů, směsi diastereomerů a racemické směsi enantiomerů (optické izomery). Pokud není jinak specifikována konfigurace (cis, trans nebo R a S) sloučenin (nebo asymetrický uhlík) v přihlášce, pak je míněna směs takovýchto izomerů nebo jeden z těchto izomerů.
Aryl substituovaný benzopyran, benzothiopyran, 1,2-dihydrochinolin a 5,6dihydronaftalenové deriváty s retinoidní biologickou aktivitou podobnou antagonní (antagonní-like)
Vzhledem k symbolu Y ve vzorci 1, výhodné sloučeniny vynálezu jsou takové, kde Y je fenyl, pyridyl, thienyl nebo furyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Y je fenyl nebo pyridyl a nejlépe, pokud Y je fenyl. Co se týká substituce na Y (fenyl) a Y (pyridyl) skupinách, výhodné sloučeniny mají fenylovou skupinu 1,4 (para) substituovanou Z a A-B skupinami a pyridinový kruh je 2,5 substituován Z a A-B skupinami. (Substituce na 2,5 pozicích v “pyridinové” nomenklatuře odpovídá substituci na 6-pozici v nomenklatuře “kyseliny nikotinové”). Ve výhodných sloučeninách vynálezu buď není volitelný R2 substituent na Y skupině, nebo volitelným R2 substituentem je fluor (F).
A-B skupina výhodných sloučenin je (CH2)n -COOH nebo (CH2)n -COOR8, kde n a R8 jsou definovány výše. Výhodnější je, pokud n je nula a B je COOH nebo jejich farmaceuticky přijatelná sůl.
Ve většině výhodných příkladů sloučenin vynálezu je X - [C(Ri)2]n, kde n je 1. Nicméně sloučeniny, kde n je nula (indenové deriváty) a kde X je S nebo O (benzothiopyranové a benzopyranové deriváty), jsou také výhodné. Pokud X je [C(Ri)2]n a n je 1, pak R: je výhodně alkyl o1až 6 uhlících, ještě výhodněji methyl.
R2 skupinou připojenou k aromatické části tetrahydronaftalenové, benzopyranové, benzothiopyranové nebo dihydrochinolinové části sloučenin vzorce 1 je výhodně H, F nebo CF3. R3 je výhodně vodík nebo methyl, ještě výhodněji vodík.
Ke skupině Z ve sloučeninách vynálezu a znázorněných vzorcem 1 - v mnoha výhodných příkladech Z představuje acetylenovou vazbu (Z = -C=C-). Avšak “vazebnou skupinou“ Z je výhodně také diazo skupina (Z= -N=N-), stejně jako olefinová nebo polyolefinová skupina (Z = -(CRi =CRi)n·), esterová (Z = -COO-), amidová (Z = CO-NR2) nebo thioamidová (Z = -CS-NR2) vazba.
Ke skupině R14 - výhodné sloučeniny jsou takové, kde R14 je fenyl, 2-pyridyl, 3pyridyl, 2-thienyl a 2-thiazolyl. Skupinou R15 (substituent skupiny R14) je výhodně H, nižší alkyl, trifluormethyl, chlor, nižší alkoxy nebo hydroxy skupina.
Nejlepší sloučeniny vynálezu jsou uvedeny v Tabulce 1 s odkazy na vzorec 2, vzorec 3, vzorec 4, vzorec 5 a vzorec 5a.
vzorec 2 vzorec 3 ,
vzorec 4 vzorec 5,
vzorec 5a
TABULKA 1
Slouč. č. Vzorec Ru*
Z R2* Ra*
1 2 4-methylphenyl -CsC- H Et
1a 2 phenyl -c=c- H Et
2 2 3-methylphenyl -c=c- H Et
3 2 2-methylphenyl -C = C- H Et
4 2 3,5-dimethylphenyl -c = c- H Et
5 2 4-ethylphenyl -c=c- H Et
6 2 4-t-butylphenyl -CsC- H Et
7 2 4-chlorophenyl -c=c- H Et
8 2 4-methoxyphenyl -CsC- H Et
9 2 4-trifluoromethylphenyl -CsC- H Et
10 2 2-pyridyl -c=c- H Et
11 2 3-pyridyl -c=c- H Et
12 2 2-methyI-5-pyridyl -c=c- H Et
13 2 3-hydroxyphenyl -CsC- H Et
14 2 4-hydroxy phenyl -c=c- H Et
15 2 5-methyl-2-thiazolyl -c=c- H Et
15a 2 2-thiazolyl CsC· H Et
16 2 4-methyl-2-thiazolyl -CsC- H Et
17 2 4,5-dimethyl-2-thiazolyl •CsC- H Et
18 2 2-methyl-5-pyridyl -CsC- H H
19 2 2-pyridyl c=c- H H
20 2 3-methylphenyl -CsC- H H
21 2 4-ethylphenyl -c=c- H H
22 2 4-methoxyphenyl -CsC- H H
23 2 4-trifluoromethylphenyl -c = c- H H
24 2 3,5-dimethylphenyl •CsC· H H
25 2 4-chlorophenyl -CsC- H H
26 2 3-pyridyí -c=c- H H
27 2 2-methylphenyl -C^c- H H
28 2 3-hydroxyphenyl -CsC- H H
29 2 4-hydroxyphenyl -CsC- H H
30 2 5-methyl-2-thiazolyl -c=c- H H
30a 2 2-thiazolyl -CsC- H H
31 2 4-methyl-2-thiazolyl •CsC· H H
32 2 4,5-dimethyl-2-thiazolyl CbC· H H
33 2 5-methyl-2-thienyl -CsC- H Et
33a 2 2-thienyl -C = C- H Et
34 2 5-methyl-2-thienyl -CsC- H H
34a 2 2-thienyl •c = c· H H
35 2 4-methylphenyl -CONH- H Et
36 2 4-methylphenyl -CONH- H H
37 2 4-methylphenyl -C00- H Et
38 2 4-methylphenyl -coo- H (CH2)2Si(CH3)
39 2 4-methylphenyl -coo- H H
40 2 4-methylphenyl •CONH- F Et
41 2 4-methylphenyl •CONH F H
42 2 4-methylphenyl •CSNH· H Et
43 2 4-methylphenyl -CSNH- H H
44 2 4-methylphenyl CH-CH· H Et
45 2 4-methylphenyl -CH-CH- H H
46a 2 4-methylphenyl -N-N· H Et
46b 2 4-methylphenyl •N-N- H H
47 3 4-methylphenyl -CsC- H Et
48 3 4-methylphenyl -C = C- H H
49 4 4-methylphenyl C = C· H Et
50 4 4-methylphenyl C = C· H H
51 5 4-methylphenyl • - Et
52 5 4-methylphenyl • H
60 2 4-methylphenyl -CsC- H H
60a 2 phenyl -CsC- H H
61 2 4-t-butylphenyl -CsC- H H
62 2 4-methylphenyl -CSNH F Et
63 2 4-methylphenyl •CSNH F H
64 5a 4-methylphenyl — - Et
65 5a 4-methylphenyl .... • H
66 2 2-furyl -CsC- H Et
67 2 2-furyl -c=c- H H
Aryl a (3-oxo-1-profenyl)-substituovanv benzopyran, benzothiopyran, dihydrochinolin a
5,6-dihydronaftalenové deriváty s retinoidní biologickou aktivitou podobnou antagonní (antagonist-like)
K symboluY ve vzorci 101 - u výhodných sloučenin vynálezu je Y fenyl, pyridyl, thienyl nebo furyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Y je fenyl nebo pyridyl, nejlépe pokud Y je fenyl. Vzhledem k substitucím na Y (fenyl) a Y (pyridyl) skupinách jsou výhodné ty sloučeniny, kde je fenylová skupina 1,4 (para) substituována -CRi6=CRi7 a A-B skupinami, a kde je pyridinový kruh 2,5 substituován -CR16=CRi7 a A-B skupinami. (Substituce na 2,5 pozicích v “pyridinové “ nomenklatuře odpovídá substituci na 6-pozici v nomenklatuře “kyseliny nikotinové”). Výhodné sloučeniny vynálezu nemají volitelný R2 substituent na Y skupině.
A-B skupina výhodných sloučenin je (CH2)n -COOH nebo (CH2)n -COOR8, kde n a R8jsou definovány výše. Ještě výhodnější je, pokud n je nula a R8 je nižší alkyl nebo n je nula a B je COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
V uvedených výhodných příkladech sloučenin vynálezu X znamená [C(Ri)2]n, kde n je 1. Nicméně sloučeniny, kde X značí S nebo O (benzothiopyran a benzopyranové deriváty) jsou také výhodné. Pokud X značí [C(Ri)2]n a n je 1, pak R!
je výhodněji alkyl o 1 až 6 uhlících, nejlépe methyl.
R2 skupinou připojenou k aromatické části tetrahydronaftalenu, benzopyranu, benzothiopyranu nebo dihydrochinolinové části sloučenin vzorce 101 je výhodně H, F nebo CF3. R3 je výhodných vodík nebo methyl, ještě výhodněji vodík.
Ke skupině R14 - výhodné jsou sloučeniny, kde R14 je fenyl, 2-pyridyI, 3-pyridyl, 2-thienyl a 2-thiazolyI. Skupinou R15 (substituent skupiny Ri4) je výhodně H, nižší alkyl, trifluormethyl, chlor, nižší alkoxy nebo hydroxy skupina.
Vhodné sloučeniny vynálezu jsou uvedeny v tabulce 2 s odkazem na vzorac 102.
(125)
Tabulka 2
sloučenina «15* «8*
101 ch3 H
102 ch3 Et
103 H H
104 H Et
Biologická aktivita, způsoby podávání
Jak je výše uvedeno, sloučeniny podle vynálezu jsou antagonisté jednoho nebo více RAR receptorových subtypů. To znamená, že sloučeniny vynálezu se vážou na jeden nebo více RAR receptorových subtypů, ale nespouští odezvu, která je způsobena antagonisty stejného receptoru. Některé sloučeniny vynálezu jsou antagonisty všech tří
RAR receptorových subtypů (RAR-a, RAR-β a RAR-γ) a tyto jsou označovány jako “RAR pan antagonisté”. Některé jiné jsou antagonisté jen jednoho nebo dvou receptorových subtypů. Některé sloučeniny jsou v rozsahu vynálezu částečně antagonisté jednoho nebo dvou RAR receptorových subtypů a antagonisté zbývajících subtypů. Sloučeniny vynálezu se navážou na RXR receptory, proto nejsou agonisty ani antagonisty RXR.
V závislosti na místě a podstatě nežádoucích vedlejších účinků, u nichž je žádoucí, aby byly potlačeny nebo vyloučeny, sloučeniny použité v souladu s vynálezem mohou být částečně antagonisty jednoho nebo dvou RAR receptorových subtypů. Některé sloučeniny použité v souladu s vynálezem mohou být částečně agonisty jednoho nebo dvou RAR receptorových subtypů a antagonisty zbývajících subtypů. Takové sloučeniny jsou, obecně řečeno, použitelné v souladu s vynálezem, pokud antagonní efekt je na RAR receptorovém subtypu (nebo subtypech), který je (jsou) převážně zodpovědný za předávkování jedem nebo za nežádoucí vedlejší účinek nebo vedlejší účinky. Obecně řečeno, v této souvislosti je důležité to, že sloučenina je považována za antagonistu určitého receptorového subtypu, pokud v níže popsaném ko-transfekční měření sloučenina nezpůsobuje výraznou transkripční aktivaci receptorem regulovaného reportního genu, ale nicméně se váže na receptor s hodnotou nižší než přibližné 1 μΜ.
Jestliže je sloučenina RAR antagonistou, a proto může být použita v souladu s vynálezem, může být otestována následujícím měřením.
Transaktivační měření chimerního receptoru, který je testem antagonist-like aktivity u RAR- a, RAR-β, RAR-γ, RAR-a receptorových subtypů, a které je založeno na práci publikované Feignerem P. L. a Holmem M. Focus Vol 11, No. 2 (1989), detailně popsané v PCT přihlášce číslo WO94/17796, publikované 18. srpna 1994. Posledně jmenovaná publikace je PCT doplňkem U.S. přihlášky pořadového čísla 08/016,404, doplněné 11. února, 1993, vydané jako U.S. patent číslo 5,455,265. Sloučenina by neměla v tomto měření významně ovlivnit aktivaci reportního genu přes určitý receptorový subtyp (RAR- a, RAR-β, RAR-γ) za účelem zjištění, jak je RAR antagonista ve vynálezu použitelný.
Holoreceptorové transaktivační měření a měření vazby ligandu, které měří aktivitu podobnou antagonní/agonní (antagonist/agonist like) aktivitu sloučenin vynálezu, nebo respektive jejich schopnost vazby na některé subtypy retinoidních receptorů, jsou popsána v publikované PCT přihlášce číslo WO 93/11755 (zejména na stranách 30-33 a 37-41) publikované 24. června 1993. Popis holoreceptorového transaktivačního měření je také uveden níže.
Holoreceptorové transaktivační měření
CV1 buňky (5,000 buněk/jamku) se transfektovaly s RAR reportním plazmidem MTV-TREp-LUC (50 ng) s jedním z RAR expresních vektorů (10 ng) v automatizovaném 96-jamkovém provedení postupem pomocí fosforečnanu vápenatého podle Heymana a kol. Cell 68: 397-406. Pro RXR- a a RXR^y transaktivační měření, RXR odpovídající reportní plazmid CRBPII-tk-LUC (50 ng) spolu s vhodným RXR expresním vektorem (10 ng) se použil přesně podle postupu Heymana a kol.- výše a Allegretta a kol. J. Biol. Chem. 268:26625-26633. Pro RXR-β transaktivační měření se použil RXR odpovídající reportní plazmid CPRE-tk-LUC (50 mg) a RXR-β expresní vektor (10mg), jak je popsáno výše. Tyto reportry obsahují DRI oblasti z lidského CRBPII a respektive určité části promotoru (viz Mangelsdorf a kol. Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, s. 319-349, Raven Press Ltd., New York a Heyman a kol, citováno výše). Jako interní kontrola při transfekcích pro normalizaci změn v transfekční efektivitě byl použit β-galaktosidázový expresní vektor (50 ng). Buňky se během 6 hodin transfektovaly trojnásobně za následné 36 hodinové inkubace s retinoidy a u extraktů se měřila luciferázové a β-galaktosidázová aktivita. Podrobný experimentální postup holoreceptorové transaktivace byl popsán Heymanem a kol. výše a v Allegrettem a kol., citováno výše. Výsledky získané tímto měřením jsou vyjádřeny v EC50 hodnotách a stejně tak u měření chimerní receptářové transaktivace. Výsledky měření vazby ligandu jsou vyjádřeny v Kq hodnotách. Viz Cheng a kol. Biochemical Pharmacology 22: 3099-3108.
Sloučeniny by neměly v holoreceptorovém transaktivačním měření výrazně aktivovat reportní gen přes určitý receptorový subtyp (RAR- a, RAR-β, RAR-γ) za účelem zjištění využití RAR antagonisty ve vynálezu. Konečně, ale ne v poslední řadě, sloučeniny by se měly vázat na nejméně jeden z RAR receptářových subtypů při měření vazby ligandu s Kq nižším než přibližně 1 mikromolární (Kd < 1 μΜ) pro schopnost a funkčnost antagonisty vázat receptorový subtyp za předpokladu, že stejný receptorový subtyp není sloučeninou výrazně aktivován.
Níže uvedená tabulka 3 ukazuje výsledky holoreceptorového transaktivačního měření a tabulka 4 uvádí účinnost (v procentech) měření testované sloučeniny vzhledem k all trans retinové kyselině pro určité sloučeniny podložené příklady vynálezu. Tabulka 5 ukazuje výsledky měření vazby ligandu pro určité sloučeniny podložené příklady podle vynálezu.
TABULKA 3
Holoreceptorové transaktivační měření
Sloučenina č.
EC50 (nanomoly)
RXR-γ RAR-a RAR-β RAR-γ RXR-a RXR-β
18 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
19 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
20 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
21 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
22 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
23 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
24 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
25 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
26 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
27 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
28 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
29 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
30 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
31 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
32 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
34 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
39 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
41 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
45 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
46b 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
52 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
60 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
61 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
63 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
101 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
103 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
0.0 v tabulce 3 znamená, že sloučenina má v tomto měření méně než 20 % aktivitu (účinnost) než all trans retinová kyselina.
TABULKA 4
Měření účinnosti transaktivace (% RA aktivity)
Sloučenina č.
RAR- a RAR-β RAR-/ RXR-a RXR-β RXR-γ
18 4.00 1.00 0.00 2.00 10.00 1.0
19 0.00 5.0 3.0 0.0 9.0 4.0
20 3.0 4.0 0.00 4.00 0.00. 3.0
21 2.00 2.00 2.00 3.00 0.00 3.00
22 0.00 0.00 2.00 1.00 0.00 2.00
23 0.00 6.00 3.00 1.00 0.00 4.00
24 3.00 7.00 4.00 1.00 0.00 3.00
25 2.00 3.00 3.00 5.00 0.00 3.00
26 1.00 6.00 0.00 2.00 0.00 3.00
27 9.00 14.00 6.00 2.00 0.00 4.00
28 2.00 10.00 2.00 2.00 0.00 3.00
29 0.00 6.00 11.00 0.00 6.00 2.00
30 3.00 5.00 1.00 0.00 9.00 3.00
31 4.00 14.00 2.00 1.00 8.00 6.00
32 0.00 2.00 2.00 1.00 0.00 2.00
34 3.00 5.00 2.00 1.00 0.00 3.00
36 1.00 5.00 0.00 1.00 7.00 2.00
39 1.00 7.00 9.00 2.00 0.00 1.00
41 3.00 5.00 6.00 1.00 0.00 3.00
45 2.00 0.00 7.00 3.00 8.00 0.00
46b 4.00 5.00 3.00 2.00 0.00 4.00
52 0.00 15.00 3.00 0.00 0.00 10.00
60 0.00 1.00 4.00 3.00 0.00 3.00
61 2.00 2.00 0.00 1.00 0.00 3.00
63 2.00 2.00 7.00 1.00 0.00 1.00
101 0.00 4.00 2.00 1.00 0.00 3.0
103 4.00 12.0 7.0 0.00 0.0 2.0
TABULKA 5
Měření vazby liqandu
Sloučenina č. Ka (nanomoly)
RARa RARB RARy RXRa RXRB RXRy
18 24.00 11.00 24.00 0.00 0.00 0.00
19 565 210 659 0.00 0.00 0.00
20 130.00 22.0 34.00 0.00 0.00. 0.00
21 16 9 13 0.00 0.00 0.00
22 24.0 17.0 27.0 0.00 0.00 0.00
23 32.00 25.00 31.00 0.00 0.00 0.00
24 699 235 286 0.00 0.00 0.00
25 50 17 20 0.00 0.00 0.00
26 40.00 31.00 36.00 0.00 0.00 0.00
27 69.00 14.00 26.00 0.00 0.00 0.00
28 669 77 236 0.00 0.00 0.00
29 234 48 80 0.00 0.00 0.00
30 683 141 219 0.00 0.00 0.00
31 370 52.00 100.00 0.00 0.00 0.00
32 0.00 89.00 169.00 0.00 0.00 0.00
34 52.00 30.00 17.00 0.00 0.00 0.00
36 13.00 550.00 0.00 0.00 0.00 0.00
39 67.00 38.00 113.00 0.00 0.00 0.00
41 5.1 491 725 0.00 0.00 0.00
45 12.0 2.80 17.0 0.00 0.00 0.00
46b 250 3.70 5.80 0.00 0.00 0.00
52 60.00 63.00 56.00 0.00 0.00 0.00
60 1.5 1.9 3.3 0.00 0.00 0.00
61 96 15 16 0.00 0.00 0.00
63 133 3219 0.00 0.00 0.00 0.00
101 750 143 637 0.00 0.00 0.00
103 301 273 261 0.00 0.00 0.00
0,0 v tabulce 5 znamená hodnotu větší než 1000 nM.
Jak je zřejmé ze shrnutí výsledků v tabulkách 3, 4 a 5, testované sloučeniny podložené příklady podle vynálezu jsou antagonisty RAR receptorových subtypů, ale nemají afinitu k RXR receptorovým subtypům. (Jiné sloučeniny vynálezu mohou být antagonistou některého, ale ne všech RAR receptorových subtypů a agonisty zbývajících RAR subtypů). Díky této vlastnosti se mohou sloučeniny podle vynálezu použít k blokování aktivity RAR agonistů v biologických měřeních. U savců, zahrnujících člověka, se mohou sloučeniny podle vynálezu podávat současné s RAR agonisty a pomocí farmakologické selektivity nebo lokálně-specifického podání mohou výhodně předcházet nežádoucím účinkům RAR agonistů. Sloučeniny podle vynálezu se mohou také použít pro léčbu předávkování vitamínem A, akutního nebo chronického, způsobeného nadměrným příjmem doplňků vitamínu A nebo požitím jater určitých ryb a zvířat, která obsahují velké množství vitamínu A. Navíc, sloučeniny podle vynálezu se mohou také použít pro léčbu akutní nebo chronické toxicity, způsobené retinoidními léčivy. Je již známo, že toxicity projevující se syndromem hypervitaminózy A (bolest halvy, loupání kůže, toxicita kostí, dyslipidémie), jsou podobné nebo shodné s toxicitami, pozorovanými u jiných retinoidů, naznačující společnou biologickou příčinu, kterou je RAR aktivace. Poněvadž sloučeniny podle vynálezu blokují RAR aktivaci, jsou vhodné pro léčbu uvedených toxicit.
Sloučeniny podle vynálezu jsou schopny významně zabránit kožnímu podráždění, vyvolanému RAR agonními retinoidy, jestliže se sloučenina vynálezu aplikuje lokálně pod kůži. Podobně, sloučeniny podle vynálezu mohou být aplikovány lokálně pod kůži pro zabránění kožnímu podráždění u pacientů nebo zvířat, kterým se RAR agonní sloučeniny podávají soustavně. Sloučeniny podle vynálezu mohou urychlit zotavení z předchozí retinoidní toxicity, mohou zabránit hypertriglyceridémii způsobené současně podávanými retinoidy a mohou zabránit kostní toxicitě indukované RAR agonistou (retinoid).
Obecně řečeno, pro terapeutické použití u savců, v souladu s vynálezem, antagonní sloučeniny se mohou podat vnitřně nebo lokálně jako protilék vitamínu A, prekurzorů vitamínu A nebo jako protilék retinoidní toxicity, způsobené předávkováním nebo prodlouženou expozicí, po přerušení příjmu vyvolávajícího faktoru (prekurzoru vitamínu A nebo jiného retinoidů). Antagonní sloučeniny se mohou v souladu s vynálezem podat také s retinoidními léčivy v situacích, kdy má retinoid terapeutický účinek, a kdy současně podaný antagonista zmírňuje nebo aodstraňuje jeden nebo více nežádoucích účinků retinoidů. U tohoto typu použití se může antagonista aplikovat na specifické místo, například jako lokálně použitý krém nebo pleťová voda, zatímco retinoid se může současně podat vnitřně.
Pro terapeutické využití se vzhledem k vynálezu antagonní sloučeniny začlení do farmaceutických sloučenin, jako tabletky, pilulky, kapsle, roztoky, suspenze, krémy, masti, gely, pleťové vody a podobně, za použití farmaceuticky přijatelných nosičů a prostředků, které jsou samy o sobě již známy. Například přípravy lokálních forem jsou dobře popsány v Reminqton’s Pharmaceutical Science, 17. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Pro lokální použití se mohou antagonní sloučeniny podat také ve formě prášku nebo spreje, zejména ve formě aerosolu. Pokud se léčivo musí podávat dlouhodobě, může být v podobě prášku, pilulky, tablety, sirupu nebo jako tinktura vhodná pro orální užití. Pro intavenózní nebo intraperitoneální podání se antagonní sloučenina připraví jako roztok nebo suspenze vhodná pro injekční podání. V určitých případech může být užitečné připravit antagonní sloučeniny jako injekci. V určitých případech může být užitečné připravit antagonní sloučeniny ve formě čípku nebo jako podkožní depotní formu postupně se vstřebávající nebo jako intramuskulární injekci.
Antagonní sloučeniny se podají v terapeuticky účinné dávce v souladu s vynálezem. Terapeutická koncentrace je taková koncentrace, která zlepší určitý stav (jako je toxicita vyvolaná retinoidem nebo vitamínem A nebo vedlejšími účinky retinoidního léčiva), nebo potlačí jeho projev. Je třeba pochopit, že pokud se podají antagonní sloučeniny pro zablokování retinoidem indukované toxicity nebe vedlejších účinků v souladu s vynálezem, antagonní sloučeniny se použijí jako prevence vzniku určitého stavu, jako je kožní podráždění.
Použité léčebné a preventivní koncentrace se liší v závislosti na podmínkách a v určitých případech se mohou lišit podle léčeného stavu a pacientovy citlivosti na léčbu. Proto se nepoužívá standardně jedna koncentrace, ale její uzpůsobení závisí na určité chronické nebo akutní retinoidní toxicitě nebo léčeném stavu. Takové koncentrace se získají na základě praktických zkušeností. Přesto se předpokládá, že látka obsahující 0,01 až 1,0 miligram antagonní sloučeniny na mililitr léčiva je dostačující koncentrací pro terapeutický účinek u lokálního použití. Pokud se podává dlouhodobě, terapeutický účinek se očekává u denního množství 0,01 a 5 mg na kg tělesné hmotnosti.
Podstatou použití RAR antagonistů pro prevenci a léčbu RAR agonistou indukované toxicity je kompetetivní inhibice aktivace RAR receptorů RAR agonistou. Hlavní rozdíl u těchto dvou použití RAR antagonistů je přítomnost nebo nepřítomnost již existující retinoidní toxicity. Většina níže popsaných příkladů se týká použití retinoidů pro prevenci retinoindí toxicity, ale základní metody zde popisované jsou použitelné také pro léčbu již existující retinoidní toxicity.
Popis příkladů vysvětlujících použití RAR antagonistů pro prevenci nebo léčbu retinoidní toxicity a/nebo vedlejších účinků retinoidních léčiv.
Příklad 1: Kožní podráždění způsobené lokálně aplikovaným agonistou léčené lokálně aplikovaným antagonistou
Sloučenina 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaftalen-2-yl)propen1-yljbenzoová kyselina, označená jako AGN 191183 je již známa jako potenciální agonista (viz například popisná část a obrázek 2b v patentu Spojených Států číslo 5,324,840). (Označení “AGN” se s libovolné navrženým referenčním číslem používá pro společné označení a identifikaci sloučenin vynálezu).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(fenyl)-2-naftalenyl)ethinyl]benzoová kyselina (AGN 192869, označovaná také jako sloučenina 60a) je sloučenina, jejíž příprava je popsána níže. Tato sloučenina je RAR antagonistou
Kožnímu podráždění, vyvolanému RAR agonistou AGN 191183, použitému lokálně, se u bezsrsté myši může zabránit RAR antagonistou AGN 192869, podanému též lokálně.
V semikvantitativním měřítku s denním subjektivním vyhodnocením se měřilo zejména kožní podráždění podle loupání kůže a zdrsnění. První číslo, výsledek lokálního podráždění shrnuje kožní podráždění vyvolané u zvířat v průběhu experimentu. Lokální podráždění se vypočetlo následovně. Výsledek lokálního podráždění byl algebraickým součtem celkového loupání a celkového zdrsnění. Celkový součet byl pro loupání a zdrsnění v rozmezí 0-9 a 0-8 a bral se v úvahu maximální rozsah, čas vzniku a průměr rozsahu zjištěného loupání a zdrsnění.
Rozsah loupání se určil pomocí 5 bodového měřítka, rozsah zdrsnění pomocí 4 bodového měřítka, vyšší počet bodů znamená větší rozsah. Maximální rozsah složky celkového složení je nejvyšší denní rozsah u určitého zvířete během pozorování.
Doba projevu složky celkového složení se pohybuje od 0 do 4, jak je označeno níže:
Objevení se loupání nebo zdrsnění v rozsahu 2 nebo větším
TABULKA 6 (dny)
Čas hodnocení projevu
6-7
3-4
1-2
Průměrný rozsah složky celkového složení byl součtem denního výsledku loupání a zdrsnění dělený počtem dnů sledování. První den léčby se nezapočítával, protože sloučenina léčiva neměla možnost účinkovat v období počátku léčby.
K celkovému výsledku loupání a zdrsnění se sečetl průměrný rozsah a čas celkového projevu a podělil se 2. Výsledek se přidal k maximálnímu výsledku rozsahu. Výsledek loupání a zdrsnění byl pak součtem, který udával celkové lokální podráždění. Každé zvíře mělo určitou hodnotu celkového lokálního podráždění a hodnoty se vyjádřily jako průměrná hodnota ± SD individuálního výsledku skupiny zvířat. Hodnoty se zaokrouhlily na nejbližší celé číslo.
Samice bezsrstých myší [Crl:SKH1-hrBR] (8-12 týdnů staré, n=6) byly vystaveny lokálnímu působení acetonem, AGN 191183, AGN 192869 nebo některou kombinací AGN 192869 a 191183 po dobu 5 po sobě následujících dnů. Dávky sloučenin jsou uvedeny v tabulce 7. Léčiva se aplikovala na dorzální kůži v celkovém množství 4 ml/kg (přibližně 0,1 ml). Myši se denně sledovaly a loupání a zdrsnění se vyhodnotilo tři dny po poslední léčbě, to je 8.den.
TABULKA 7
Experimentální rozvržení a výsledky, příklad 1
Dávka AGN 191183 Skupina Dávka AGN 192869 (mg/kg/d) Molární poměr (192869:191183) (mg/kg/d) Lokální podráždění výsledek
A 0 0 0±0
0,025 0 8±2
C 0,025 0,06 2:1 5±2
D 0,025 0,30 10:1 2±1
E 0,025 1,5 50:1 1 ±0
F 0 1,5 0±0
Výsledky celkového lokálního podráždění z příkladu 1 jsou uvedeny v tabulce 7. Ani aceton (rozpouštědlo) 25 ani AGN 192869 (antagonista) v dávce 1,5 mg/kg/d (skupina F) nevyvolali pozorovatelné lokální podráždění. AGN 191183, RAR agonista, způsobuje mírné lokální podráždění v dávce 0,025 mg/kg/d. Avšak, AGN 191183, vyvolávající lokální podráždění, byl inhibován v závislosti na dávce AGN 192869 s úplným vymizením podráždění v přítomnosti 50 násobného molárního přebytku AGN 192869. Toto dokazuje, že lokální antagonista RAR zabraňuje kožnímu podráždění vyvolanému lokálním RAR agonistou. Úplného zabránění RAR antagonistou vyvolaného kožního podráždění může být dosaženo nižším molárním poměrem antagonisty k agonistu, pokud je RAR antagonista silnější, například 4-[(5,6-dihydro5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl) ethinyl] benzoová kyselina (AGN 193109, v přihlášce také označována jako sloučenina 60).
Příklad 2: Kožní podráždění indukované orálně podaným agonistou zabraňuje lokálně aplikovaný antagonista
V tomto příkladu se použil silný RAR agonista AGN 191183 (4-[(E)-2-(5,6,7,8tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaftalen-2-yl)propen-1-yl]benzoová kyselina a silný RAR antagonista 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenyl)ethinyl]benzoová kyselina (AGN 193109, sloučenina 60) a jako ukazatel t · dlouhodobého vlivu RAR agonisty se použila celková hmotnost experimentálních zvířat (myš).
Skupiny samic bezsrstých myší (stáří 8-12 týdnů, n=6) podstoupily intragastickou sondou reakci s kukuřičným olejem nebo AGN 191183 (0,26 mg/kg) rozsuspendovanou v kukuřičném oleji (5 ml/kg). Na dorzální kůži myší současně lokálně působilo rozpouštědlo (97,6% aceton/2,4% dimethylsulfoxid) nebo roztok AGN 193109 v nosiči (6 ml/kg). Specifické dávky použité pro různé pokusné skupiny jsou uvedeny v tabulce 8. Pokus probíhal denně po 4 za sebou následující dny. Myši se vážily a denně se hodnotilo lokální podráždění, jak je uvedeno v příkladu 1, zahrnujícím jeden den po posledním působení. Procenta změny hmotnosti se vypočítala odečtením konečné hmotnosti (5. den) od počáteční hmotnosti (1. den), podělila počáteční hmotností a vynásobila 100%. Hodnota lokálního podráždění se vypočetla podle popisu v příkladu 1.
Hodnota lokálního podráždění a ztráta hmotnosti u různých skupin je uvedena v tabulce 8. Kombinované působení lokálních a orálních rozpouštědel, tzn. acetonu a kukuřičného oleje nevyvolává žádné lokální podráždění nebo ztrátu hmotnosti. Podobně, kombinované působení orálního rozpouštědla a lokálního antagonisty AGN 193109 nevyvolává žádné lokálního podráždění nebo ztrátu hmotnosti. Samostatně orálně podaný AGN 191183 vyvolával podstatnou ztrátu hmotnosti a kožní podráždění. Kožní podráždění vyvolané AGN 191 183 se podstatně snížilo ve spojení s nižší dávkou AGN 193109 a zcela vymizelo při vyšší dávce AGN 193109. Ztrátě hmotnosti vyvolané AGN 191183 zabránila určitá lokální dávka AGN 193109, ale zabránění nepůsobilo zcela. Lokální AGN 193109 tak přednostně brání kožní toxicitě AGN 191183. Předpokládá se, že nízké hladiny AGN 193109 se postupně vstřebaly a tak částečně bránily úbytku hmotnosti vyvolanému AGN 191183. Avšak takovéto vstřebání bude menší v případech méně propustné kůže, jako je lidská. Inhibice ztráty hmotnosti vyvolaná AGN 193109 může být zapříčiněna zablokováním AGN 191183 vyvolávající kožní podráždění.
Skupina Dávka lokální AGN 193109 (mg/kg/d) Dávka orální AGN 191183 (mg/kg/d) hmotnostní % nárůst nebo ztráta Hodnota lokálního podráždění
A 0 0 1 ±2 0±0
B 0 0,26 (21 ±6) 8±1
C 0,12 0,26 9±5 1 ±1
D 0,47 0,26 3±5 0±1
E 0,47 0 3±3 0±0
Příklad 2 ukazuje, že RAR antagonisté se mohou podat lokálně a výhodně tak zabránit kožnímu podráždění vyvolanému RAR agonistou podaným orálně.
Příklad 3: Lokálně aplikovaný antagonista urychluje zotavení z již projevené retinoidní toxicity
V tomto příkladu se ztráta hmotnosti vyvolala lokálním působením RAR agonisty AGN 191183 a pak se na zvířata lokálně působilo rozpouštědlem nebo RAR antagonistou AGN 193109.
Na samice bezsrstých myší (stáří 8-12 týdnů, n=5) se lokálně působilo AGN 191183 (0,13 mg/kg/d) v rozpouštědle (97,6% aceton/ 2,4% DMSO, 4 ml/kg) denně po dobu dvou dnů. Na skupinu těchto stejných myší (n=5) se pak lokálně působilo rozpouštědlem nebo AGN 193109 v rozpouštědle (4 ml/kg) denně po dobu 3 po sobě následujících dnů počínaje 3. dnem. Myši se zvážily 1-5. den a 8. den. Hmotnost se vyjádřila jako průměrá hodnota ± SD. Průměrné hodnoty se statisticky srovnaly za použití nepárového dvoukoncového t-testu. Za výrazné rozdíly byly považovány hodnoty P < 0,05.
TABULKA 9
Výsledky, příklad 3
Působení Tělesná hmotnost (g)
(3.-5. den) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 8. den
rozpouštědlo 24,6 ±1,5 23,9 ±1,2 21,4 ±1,2 20,3 ±1,7 21,0 ±1,4 24,7 ± 1,0
AGN 193109 23,9 ±1,0 23,5 ±1,2 21,4 ±0,6 22,2 ± 0,7 22,8 ±0,8 25,0 ±1,1
Časové úseky vážení v příkladu 3 jsou uvedeny v tabulce 9. Tělesná váha obou skupin myší se paralelně snížila 2. a 3. den jako výsledek působení AGN 191183 1. a
2. den. Tělesné hmotnosti v obou skupinách se 1., 2. nebo 3. den výrazně nelišily. Působení AGN 193109 však výrazné zvýšilo tělesnou hmotnost vzhledem k působení rozpouštědla 4. a 5. den. Tyto výsledky ukazují, že navrácení původní hmotnosti z AGN 191183 vyvolané ztráty hmotnosti se urychlilo následným působením AGN 193109. Tělesná hmotnost nebyla 8. dne výrazně rozdílná mezi oběma skupinami myší, což dokazuje, že za dostatečnou dobu je možné dosáhnout původního stavu. RAR antagonisté jsou tak účinní pro zmírnění RAR agonistou vyvolané toxicity, zvlášť pokud RAR agonistou vyvolaná toxicita předchází RAR antagonní působení, to znamená u otrav RAR agonisty.
Příklad 4: Orálně aplikovaný antagonista zabraňuje hypertriglyceridémii indukované současné orálně aplikovaným retinoidním agonistou.
5-[( E)-2-(5,6,7,8, -tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaftalen-2-yl )propen-1 -y l]-2thiofenkarboxylová kyselina, známá jako RAR/RXR pan-agonista (viz patent Spojených států číslo 5,324,840, sloupec 32) a označována jako AGN 191659. Tato sloučenina se orálně použila pro vyvolání akutní hypertriglyceridémie u krys a současně byla orálně podána AGN 193109, sloučenina 60, pro zabránění hypertriglyceridémie, vyvolané AGN 191659.
Samci Fischerových krys (stáří 6-7 týdnů, n=5) byly vystaveny pomocí inrtagastické sondy působení kukuřičného oleje (nosič), AGN 191659, AGN 193109 nebo kombinaci AGN 191659 a AGN 193109. AGN 191659 a AGN 193109 byly podány jako jemné suspenze v kukuřičném oleji. Experimentální rozvržení, zahrnující dávky, je uvedeno v tabulce 10.
Krev byla odebrána z dolní duté žíly pod narkózou oxidu uhličitého. Sérum se oddělilo od krve nízkootáčkovou centrifugací. Celkové triglyceridy v séru (trigliceridy a glycerol) se měřily standardním spektrofotometrickým endpoint měřením, komerčně dostupným jako kit a upraveným na 96 jamkové provedení. Hladina triglyceridů v séru se vyjádřila jako průměrná hodnota ± SD. Průměrné hodnoty se porovnaly statisticky jednosměrnou analýzou pomocí Dunnettova testu, pro nalezení významných rozdílů. Rozdíly se považovaly za významné při P< 0,05.
Jak je uvedeno v tabulce 10, samotná AGN 191659 způsobí výrazné zvýšení triglyceridů v séru vzhledem k působení nosiče. Samostatná AGN 193109 výrazně nezvyšuje hladinu triglyceridů v séru. Důležité je, že kombinace AGN 193109 a AGN 191659 v molárních poměrech 1:1 a 5:1 snižuje hladiny triglyceridů v séru, které se výrazně neliší od kontroly.
TABULKA 10
Experimentální rozvržení a výsledky, příklad 4
Skupina Působení (dávka) Triglyceridv v
A nosič 55,0 ±3,1
B AGN 193109 (19,6 mg/kg) 52,4 ±6,3
C AGN 191659 (3,7 mg/kg) 122,5 ±27,6
D AGN 193109 (3,9 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 55,7 ±14,7
E AGN 193109(19,6 mg/kg) + AGN 191659 (3,7 mg/kg) 72,7 ±8,9
séru (mg/dl)
Příklad 4 ukazuje, že RAR antagonista se může použít jako prevence hypertriglyceridémie vyvolané současně podaným retinoidem.
Příklad 5: Parenterálně použitý antagonista zabraňuje toxicitě kostí vyvolané současně parenterálně podaným retinoidním agonistou.
Příklad 4 ukazuje, že RAR antagonista se může použít jako prevence hypertriglyceridémie vyvolané současně podaným retinoidem.
Příklad 5: Parenterálně použitý antagonista zabraňuje toxicitě kostí vyvolané současně parenterálné podaným retinoidním agonistou.
Příklad 5 ukazuje, že RAR antagonisté mohou bránit kostní toxicitě vyvolané RAR agonistou. V tomto příkladě se použije AGN 193109 pro zabránění předčasného uzavření epifýz plochých kostí vyvolanému současným podáním RAR agonisty, AGN 191183 u quinejských prasat.
Skupině samců Hartleyských morčat (stáří asi 3 týdny, n=4) byly intraperitoneálně implantovány nosiče pomocí osmotických pump obsahujících nosiče (20% dimethylsulfoxid/ 80%polyethylen glykol-300), AGN 191183 (0,06 mG/ml) nebo AGN 191183 (0,06 mg/ml) v kombinaci s AGN 193109 (0,34 mg/ml). Tyto osmotické pumpy byly výrobci navrženy pro dodávku asi 5 μΙ roztoku za hodinu kontinuálně po dobu 14 dnů.
Zvířata byla usmrcena zadušením oxidem uhličitým 14. den po implantaci. Levá holenní kost se odstranila a naložila do 10% pufrovaného formalinu. Holenní kosti se dekalcifikovaly pomocí roztoku kyselina mravenčí/ formalin po dobu 3-4 dnů a připravily se parafinové řezy. Řezy se obarvily hematoxylinem a eosinem standardními metodami. Epifyzální části proximální holenní kosti se prozkoumaly a vyhodnotily jako zavřené. Uzavření epifyzálních částí se pro tento účel definuje jako přerušení spojitosti epifyzálníc části chrupavky, to znamená nahrazení kostí a/nebo fibroblastickou tkání.
U žádného ze čtyř morčat, na která se působilo nosičem se na konci experimentu, neprokázalo uzavření epifyzálních částí. Toto se předpokládalo, protože proximální tibial epifyzální části morčat nejsou normálně uzavřená do 10 měsíců stáří zvířat. Všechna čtyři morčata vystavená vlivu AGN 191183 vykazovala částečné nebo úplné uzavření epifyzální části. Avšak žádné z morčat vystavených vlivu kombinace AGN 191183 a AGN 193109, neprokázalo uzavření epifyzální části. AGN 193109 tak v 5 násobném molárním přebytku zcela zabraňuje AGN 191183 vyvolané toxicitě kostí, pokud se sloučeniny podávají parenterálně.
RAR antagonní sloučeniny
Sloučeniny 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl) ethinyl] benzoová kyselina (AGN 193109, sloučenina 60) a 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8(fenyl)-2-naftalenyl) ethinyl]benzoová kyselina (AGN 192869, sloučenina 60a) jsou příklady RAR antagonistů, které se použily ve výše popsaných pokusech na zvířatech pro zablokování RAR receptoru v souladu s vynálezem. Sloučeniny následujícího vzorce (vzorec 1) skýtají jiné a obecné příklady dalších RAR antagonních sloučenin pro použití v souladu s vynálezem.
Ve vzorci 1, X je S, O, NR’, kde R’ je H nebo alkyl o 1 až 6 uhlících, nebo
X je [C(Ri)2]n, kde Ri je H nebo alkyl o 1 až 6 uhlících a n je celé číslo od 0 do 1;
R2 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících, F, CF3, fluorem substituovaný alkyl o 1 až 6 uhlících, OH, SH, alkoxy o 1 až 6 uhlících, nebo alkylthio o 1 až 6 uhlících;
R3 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících nebo F;
m je celé číslo od 0 do 3;
o je celé číslo od 0 do 3;
Z je -C =C-,
-N=N -N=CRi
-CRi=N -,
-(CR^CROn·, kde n’ je celé číslo od 0 do 5;
-CO-NR, -,
-CS-NRi -,
-NRi -CO,
-NR! -CS,
-COO-,
-OCO-,
-eso-,
-OCS-,
Y je fenylová nebo naftylová skuypina nebo heteroaryl vybraný ze skupiny sestávající z pyridylu, thienylu, furylu, pyridazinylu, pyrimidinylu , pyrazinilu, thiazolylu, oxazolylu, imidazolylu a pyrazolylu, s tím, že fenylová a heteroarylové skupiny jsou volitelně substituovány jedou nebo dvěma R2 skupinami nebo pokud Z je -(CRi= CRi )n - a n’ je 3, 4 nebo 5, pak Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou (CRi= CRi )n· skupinou a B;
A je (CH2)q , kde q je 0-5, nižší rozvětvený alkylový řetězec o 3-6 uhlících, cykloalkyl o 3-6 uhlících, alkenyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 trojných vazbách;
B je vodík, COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, COORs, CONRgR™, CH2OH, CH2ORu, CH2OCORu, CHO, CH(OR12)2, CR7OR13O, nebo tri - nižší alkylsilyl, kde R7 je alkyl, cykloalkyl ebo alkenylová skupina o 1až 5 uhlících, R8 je alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo trimethylsilylalkyl, kde má alkylová skupina 1 až 10 uhlíků, nebo cykloalkylová skupina o 5-10 uhlících, nebo Rs je fenyl nebo nižší alkylfenyl, R9 a R10 je nezávisle vodík, alkylová skupina o1až 10 uhlících, nebo cykloalkylová skupina o 5-10 uhlících nebo fenyl nebo nižší alkylfenyl, Ru je nižší alkyl, fenyl nebo nižší alkylfenyl, R12 je nižší alkyl a R13 je divalentní alkylový radikál o 2-5 uhlících a
Ru je (Ris)r -fenyl, (Ris)r -naftyl nebo (R15)r -heteroaryl, kde heteroarylová skupina má 1 až 3 heteroatomy vybrány ze skupiny sestávající z O, S a N, r má hodnotu 0-5 a
R15 je nezávisle H, F, Cl, Br, I, NO2, N(R8)2, N(Rs)CORs, NRsCON(R8)2 , OH, OCOR8, ORs, CN, alkylová skupina o1 až 10 uhlících fluorem substituovaná alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, alkenylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 dvojných vazbách, alkynylová skupina o1 až 10 uhlících a 1 až 3 trojných vazbách nebo trialkylsilyl nebo trialkylsilyloxy skupina, kde mají alkylové skupiny nezávisle 1 až 6 uhlíků.
Metody syntézy-aryl substituovaných sloučenin
Příkladové RAR antagonní sloučeniny vzorce 1 se mohou připravit syntetickými chemickými cestami, jak je zde vysvětleno. Chemik syntetéz jistě ocení, že v podmínkách zde uvedených jsou specifické postupy, které mohou být zobecněny pro jakoukoli a všechny sloučeniny charakterizované vzorcem 1.
Reakční schéma 1
vzorec 16
vzorec 9
Reakční schéma 1 (pokračování)
vzorec 9
homology a deriváty
R14ZnCI Pd(PPh3)4
THF/50*C
homology a deriváty
Reakční schéma 1 zobrazuje syntézu sloučenin vzorce 1, kde skupinou Z je ethylnylová funkce (-C = C-), a X je [C(Ri)2]n, kde n je 1. Jinými slovy, reakční schéma 1 zobrazuje syntézu ethinyl substituovaných dihydronaftalenových derivátů vynálezu. V souladu s tímto schématem, sloučenina tetrahydronaftalen-1-on vzorce 6 je substituovaná bromem za vzniku bromderivátu vzorce 7. Sloučeniny vzorce 6 již nesou žádané Rí , R2 a R3 substituenty, které jsou definovány výše v souvislosti se vzorcem 1. Výhodným příkladem sloučeniny vzorce 6 je 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naftalenon, který je popsán v chemické literatuře (Arnold a kol. J.Am. Chem. Soc. 69: 2322 - 2325 (1947)). Výhodná cesta syntézy této sloučeiny z 1-brom-3-fenylpropanu je též popsána v experimentální části přihlášky.
Sloučeniny vzorce 7 reagují s (trimethylsilyl)acetylenem za vzniku (trimethylsilyl)ethinyl-substituovaných 3,4-dihydro-naftalen-1(2H)-on sloučenin vzorce 8. Reakce s (trimethylsilyl) acetylenem se provádí běžně za vysoké teploty (přibližně 100°C) v přítomnosti jodidu měďného a vhodného katalyzátoru, běžně vzorce Pd(PPh3)2CI2 a kyselého akceptoru (například triethylamin) v atmosféře inertního plynu (argon). Reakce trvá běžně asi 24 hodin. (Trimethylsilyl)ethinyl-substituované 3,4dihydro-naftalen-1 (2H)-on sloučeniny vzorce 8 pak reagují s bází (hydroxidem draselným nebo uhličitanem draselným) v alkoholovém rozpouštědle, jako je methanol, za vzniku ethinyl substituované 3,4-dihydro-1-naftalen-1(2H)-sloučenin vzorce 9. Sloučeniny vzorce 9 se pak smíchají s aromatickým nebo heteroaromatickým činidlem X1 - Y(R2)-A-B’ (vzorec 10) v přítomnosti jodidu měďného a vhodného katalyzátoru, běžně Pd(PPh3)2CI2 a kyselého akceptoru, jako například triethylamin, v atmosféře inertního plynu (argon). Případně, zinečnatá sůl (nebo jiná vhodná sůl kovu) sloučenin vzorce 9 se může sloučit s činidly vzorce 10 v přítomnosti Pd(PPh3)4 nebo podobného komplexu. Slučovací reakce s činidlem X! - Y(R2)-A-B’ (vzorece 10) běžně probíhá při pokojové nebo o něco vyšší teplotě. Obecně řečeno, slučovací reakce mezi ethinylarylovám derivátem nebo jeho zinečnatou solí a halogen substituovanou aryl nebo heteroarylovou sloučeninou, jako například činidlo vzorce 10, je popsána v patentu Spojených států číslo 5,264,456. Sloučeniny vzorce 11 jsou prekurzory příkladových sloučenin vynálezu nebo jejich derivátů chráněných na B’ skupině, z kterých se může chránící skupina jednoduše odstranit obecně známými reakcemi. Sloučeniny vzorce 11 se mohoju také přeměnit na další prekurzory příkladových sloučenin pomocí reakcí a transformací, které jsou již známy. Takové reakce jsou uvedeny v reakčním schématu 1 při přeměně na “homology a deriváty”. Jednou takovou přeměnou, která je součástí syntézy některých příkladových sloučenin, je saponifikace esterové skupiny (pokud B a B’ je ester) za vzniku volné karboxylové kyseliny nebo její soli.
Halogenem substituované arylové nebo heteroarylové sloučeniny vzorce 10 se mohou obecně získat již známými reakcemi. Příkladem takové sloučeniny je ethyl-4jodobenzoát, který se může připravit například esterifikací 4-jodobenzoové kyseliny. Jiným příkladem je ethyl 6-jodonikotinoát, který je možno získat reakcí halogenové výměny na 6-chlornikotinové kyselině za následné esterifikace. Nejobecněji řečeno, s ohledem na odvozování sloučenin vzorce 11 a/nebo syntézu arylových nebo heteroarylových sloučenin vzorce 10, které pak mohou reagovat se sloučeninami vzorce 9, se použije již známých a publikovaných základních principů a syntetických metod.
Karboxylové kyseliny se běžně esterifikují refluxem kyseliny v roztoku odpovídajícího alkoholu v přítomnosti kyselého katalyzátoru, jako například chlorovodíku nebo chloridu thionylu. Karboxylové kyselina může také kondenzovat s odpovídajícím alkoholem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu a dimethylaminopyridinu. Ester se získá a přečistí standardními metodami. Acetaly a ketaly se mohou snadno připravit metodou popsanou v March, Advanced Organic Chemistry, 2. vydání, McGraw-Hill Book Company, strana 810). Alkoholy, aldehydy a ketony mohou být chráněny tvorbou etherů a esterů, acetaly nebo ketaly pomocí známých metod, jak je popsáno v McOmie, Plenům Publiching Press, 1973 a Protecting groups, Ed. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
Pro zvýšení hodnoty n ve sloučeninách vzorce 10 jsou před slučovací reakcí podle schématu 1 (kde takové sloučeniny odpovídající vzorci 10 nejsou dostupné z komerčních zdrojů) aromatické nebo heteroaromatické karboxylové kyseliny podrobeny homologaci běžnou reakcí za Arndt-Estertových podmínek nebo jiným homologizačním postupům. Deriváty jiné než karboxylové kyseliny mohou být též homologizovány pomocí odpovídajících postupů. Homologizované kyseliny se pak mohou esterifikovat obecným postupem uvedeným v předchozím odstavci.
Sloučeniny vzorce 10 (nebo jiné meziprodukty příkladových sloučenin), kde A je alkenylová skupina o jedné nebo více dvojných vazbách, se mohouy připravit například podle známých schémat syntézy používaných v praxi organického chemika; například Wittigovou a podobnými reakcemi, nebo zavedením dvojné vazby eliminací halogenu z alfa-halo-arylalkyl-karboxylové kyseliny, esteru nebo karboxylaldehydu. Sloučeniny vzorce 10 (nebo jiné meziprodukty příkladových sloučenin), kde skupina A má trojnou (acetylenovou) vazbu, se mohou připravit reakcí odpovídajícího aromatického methyl ketonu se silnou bází, jako je diizopropylamid lithia, reakcí s diethyl chlorofosfátem a následným přídavkem diizopropylamidu lithia.
Kyseliny a soli odvozené od vzorce 11 (nebo jiné meziprodukty příkladových sloučenin) se mohou snadno získat z odpovídajících esterů. Bazickou saponifikací s bází alkalického kovu vznikne kyselina. Například ester vzorce 11 (nebo jiné meziprodukty příkladových sloučenin) se může rozpustit v polárním rozpouštědle jako například v alkanolu, výhodně v inertní atmosféře při pokjojové teplotě s přibližně trojnásobným molárním přebytkem báze, například hydroxidu lithného nebo hydroxidu draselného. Roztok se delší dobu míchá, asi 15 až 20 hodin, zchladí, okyselí a hydrolyzát se zpracuje běžným způsobem.
Amid se může připravit odpovídající amidací již známými metodami z odpovídajících esterů nebo karboxylových kyselin. Jednou z možností přípravy takových sloučenin je přeměna kyseliny na chlorid kyseliny a pak reakce této sloučeniny s hydroxidem amonným nebo odpovídajícím aminem.
Alkoholy se mohou připravit konverzí odpovídající kyseliny na chlorid kyseliny s chloridem thionylu nebo jiným způsobem (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2, vfydání, McGraw-Hill Book Company), pak redukcí chloridu kyseliny s tetrahydridoboritanem sodným (March, llbid, strana 1124), za vzniku odpovídajícího alkoholu. Estery se také mohou redukovat tetrahydridoboritanem lithným za snížené teploty. Alkylací těchto alkoholů s odpovídajícími alkyl halogenidy za podmínek Williamsonovy reakce (Matech, llbid, str. 357) vznikají odpovídající ethery. Tyto alkoholy se mohou přeměnit na na estery reakcí s odpovídající kyselinou v přítomnosti kyselého katalyzátoru nebo dicyklohexylkarbodiimidu a dimethylaminopyridinu.
Aldehydy se mohou připravit z odpovídajícího primárního alkoholu za použití slabých oxidačních činidel jako například pyridinium dichromanu v methylenchloridu (Corey, E. J., Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979) nebo dimethyl sulfoxid/oxalylchloridu v methylenchloridu (Omura, K., Swemm, D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)).
Ketony se mohou připravit z odpovídajícího aldehydu reakcí aldehydu s alkyl
Grignardovým činidlem nebo podobným činidlem za následné oxidace.
Acetaly nebo ketaly se mohou připravit z odpovídajícího aldehydu nebo ketonu metodou popsanou v March, llbid, s. 810.
Sloučeniny vzorce 10 (nebo jiné meziprodukty nebo příkladové sloučeniny), kde B je H, se mohou připravit z odpovídající halogenovaných aromatických nebo nebo heteroaromatických sloučenin, zejména kde halogenem je I.
Opět k reakčnímu schématu 1, sloučeniny vzorce 11 reagují s bis(trimethylsilyl)amidem sodným a 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5chloropyridinem v etherovém inertním typu rozpouštědla, jako například v tetrahydrofuranu, při nízkých teplotách (-78°C a 0°C).To je zobrazeno v reakčním schématu 1, kde obvykle neizolovaný produkt sodné soli je uveden v závorkách jako vzorec 12. Výsledek reakce trifluormethylsulfonyloxy derivátů je vyjádřen vzorcem 13. (Tf = SO2CF3). Sloučeniny vzorce13 se pak přeměňují na příkladové sloučeniny vynálezu vyjádřené vzorcem 14 reakcí s organokovým derivátem odvozeným z arylové nebo heteroarylové sloučeniny R14H, jako například vzorec organokovového derivátu R14Met (Met značí monovalentní kov), nejlépe R14Li. (Ri4 je definován v souvislosti se vzorcem 1). Reakce s organokovovým derivátem, výhodně lithným derivátem vzorce R14Li se obvykle provádí v etherovém inertním typu rozpouštědla (jako například v tetrahydrofuranu) v přítomnosti chloridu zinečnatého (ZnCI2 ) a tetrakis(trifenylfosfin)paladia (Pd(PPh3)4). Pokud není organolithné činidlo R14Li komerčně dostupné, může se připravit ze sloučeniny Ri4H (nebo jejího halogenderivátu Ri4Xi, kde X1 je halogen) v etherovém inertním typu rozpouštědla podle již známého postupu. Teplotní rozmezí reakce mezi činidlem R14Li a sloučeninami vzorce 13 se běžně pohybuje v rozmezí 78°C až 50°C. Sloučeniny vzorce 14 se mohou přeměnit na další homology a deriváty podle výše uvedených reakcí.
Meziprodukt 7-brom-tetrahydronaftalen-1-on sloučeniny vzorce 7 uvedené v reakčním schématu 1 se mohou též přeměnit s Grignardovým činidlem vzorce R14MgBr (R14 je definováno v souvislosti se vzorceml) za vzniku terciálního alkoholu vzorce 15.
Terciální alkohol se dehydratuje reakcí s kyselinou za vzniku 3,4-dihydro-741 bromnaftalenových derivátů vzorce 16, které jsou meziprodukty pro syntézu dalších sloučenin vynálezu (viz reakční schéma 6, 7 a 8).
BrC(R3)2C(R3)2CO2H vzorec 18
Reakční schéma 2
HO,^
K2CO3
MeOH
X^RJ-A-B1
PdC12(PPh3}2 Cul/Et3N/70*C
THF/50* C
RliZnCl Pd(PPh3)4 vzorec 10
homology a deriváty
K reakčnímu schématu 2, cesta syntézy těchto sloučenin je uvedena s odkazem na vzorec 1, X je S, O nebo NR’ a skupina Z je ethinylová funkce (-C =C~). Výchozí surovinou pro tuto reakci je bromfenol, bromthiofenol nebo bromanilín se strukturou vzorce 17. Z důvodu zjednodušení této specifikace, se za X může v následujícím popisu považovat primární síra jako pro přípravu benzothiopyranových derivátů. Avšak je třeba si uvědomit, že uvedené schéma je též vhodné v takových modifikacích, které jsou podobné již známým modifikacím, pro přípravu benzopyranových (X = O) a dihydrochinolinových (X = NR’) sloučenin vynálezu. Sloučenina vzorce 17, výhodně para bromthiofenol, para bromfenol nebo para bromanilín reaguje za bazických podmínek s 3-brom karboxylovou kyselinou vzorce 18. V tomto reakčním schématu mají symboly stejný význam jako u vzorce 1. Příkladem reaktantu vzorce 18, kde R3 je vodík, je 3-brompropionová kyselina. Reakcí s 3-bromkarboxylovou kyselinou vzorce 18 vzniká sloučenina vzorce 19. Později cyklizuje reakcí s kyselinou za vzniku 6bromthiochroman-4-on derivátu (pokud X je S) nebo 6-bromchromanového derivátu (pokud X je O) vzorce 20. Bromsloučeniny vzorce 20 pak prochází v podstatě stejným sledem reakcí, jako sloučeniny vzorce 20 za obdobných podmínek, které jsou popsány v reakčním schématu 1, vedoucí k přeměně bromsloučenin vzorce 7 na sloučeniny podle vynálezu. Stručně shrnuto, bromsloučeniny vzorce 20 reagují s (trimethylsilyl)acetylenem za vzniku 6-(trimethylsilyl)ethinyl-substituovaného thiochroman-4-on nebo chroman-4-on sloučenin vzorce 21. 6-(trimethylsilyl)ethinylsubstituované thiochroman-4-on sloučeniny vzorce 21 pak reagují s bází (hydroxidem draselným nebo uhličitanem draselným) za vzniku ethinyl substituovaných 6-ethinyl substituovaných thÍochroman-4-on sloučenin vzorce 22. Sloučeniny vzorce 22 se pak sloučí s aromatickým nebo heteroaromatickým činidlem Xi-Y(R2)-A-B’ (vzorec 10) za obdobných podmínek, jako jsou popsány u obdobných sloučenin reakčního schématu 1, za vzniku sloučenin vzorce 23.
Sloučeniny vzorce 23 pak reagují nadále za obdobných podmínek podobných reakcí popsaných v reakčního schématu 1 s bis(trimethylsilyl)amidem sodným a
2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chloropyridinem za vzniku 4trifluormethylsulfonyloxy benzothiopyranu nebo benzopyranových derivátů charakterizovaných vzorcem 24. Sloučeniny vzorce 24 se pak přemění na sloučeniny charakterizované vzorcem 25 reakcí s organokovovým derivátem odvozeným od aryl nebo heteroarylové sloučeniny R14H, jak je popsáno v souvislosti s reakčním schématem 1.
Podobně jako se použije meziprodukt 7-brom-tetrahydronaftalen-1 -sloučenin vzorce 7 reakčního schématu 1, meziprodukt 6-bromthiochroman-4- sloučenin vzorce 20 se může též použít pro přípravu dalších sloučenin v rozsahu vynálezu, jak je popsáno níže, v reakčních schématech 6, 7 a 8. Sloučeniny vzorce 25 se mohou také přeměnit na další homology a deriváty v obdobných reakcích jak jsou popsány v souvislosti s reakčním schématem 1.
Reakční schéma 3
vzorec 26
Pda2(PPh3)2
Cul/Et3N/70’C
K2C03
M«OH v
PdC>2(PPh3)2 CuI/El3N/70*C
X-YCFy-A-B· vzorec 10
1. NaN(SiM«3)2 THF/-7B*C
homology a deriváty
Reakční schéma 3 popisuje cestu syntézy sloučenin, kde s ohledem na vzorec 1, X je [C(Ri)2]n, n je 0 a skupina Z je ethinylová funkce (-C =C-). Ve shodě s tímto schématem, derivát 6-brom-2,3-dihydro-1H-inden-1-on vzorce 26 reaguje podle sledu reakcí (počínaje reakcí s trimethylsilylacetylenem), které jsou obdobné reakcím popsaným výše v souvislosti s reakčním schématem 1 a 2, přes meziprodukty o vzorcích 27-30 za vzniku indenových derivátů vzorce 31. V doporučeném postupu v rozsahu reakčního schématu 3 je 6-brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on vhodný jako výchozí surovina ve shodě s chemickou literaturou (viz Smith a kol. Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123-131). Sloučeniny vzorce 26, jako je 6-brom-2,3dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on, se mohou také použít pro syntézu ještě dalších příkladových sloučenin pro použití ve vynálezu, jak je popsáno níže.
Reakční schéma 4
♦ jiný izomer hoch2ch2ow pTsOH/A
R-jxMgSr <---Et2O
pTsOH
Δ
V
1.
Formula 37
------->
NaH/TMF
Z DIBAL-H
o
II (ElO),P
s homology a deriváty vzorec 39 v lda/ihf
K reakčnímu schématu 4 - cesta syntézy těchto sloučenin je zde uvedena s odkazem na vzorec 1, Z je (CRi = CRi)n·, n’ je 3, 4 nebo 5 a Y představuje přímou valenční vazbu mezi skupinou (CRi = CRi)n· a B. Tato cesta syntézy je popsaná pro příklady, kde skupinou Xje [C(R1)2]n a n je 1 (dihydronaftalenové deriváty). Nicméně, je třeba si uvědomit, že reakce a metody syntézy popsané reakčním schématem 4 a dalšími následnými schématy, jsou také použitelné s takovými úpravami, které jsou známé odborníkům v této oblasti, pro deriváty, kde Xje S, O, NR’ (benzothiopyranové, benzopyranové nebo dihydrochinolinové deriváty) nebo [C(R1)2]n a n je O (indenové deriváty).
Ve shodě s reakčním schématem 4, 1,2,3,4- tetrahydronaftalenové deriváty vzorce 32 reagují s chloridem kyseliny (RtCOCI) za Friedel Craftových podmínek a výsledný acetylovaný produkt se oxiduje, například v Jones oxidační reakci za vzniku směsi izomerů 6- a 7-acetyl-1(2H)- naftalenonových derivátů vzorce 33. Ve zvláště výhodném příkladu této reakce je výchozí sloučeninou vzorce 32 - 1,2,3,4- tetrahydro1,1-dimethylnaftalen (známá sloučenina), která se může připravit ve shodě s postupem popsaným v experimentální části přihlášky. 7-acetyl-1(2H)-naftalenonový derivát vzorce 33 reaguje s ethylenglykolem v přítomnosti kyseliny pro chránění oxo skupiny exocyklické ketonové skupiny, jako je například ketalový derivát vzorce 34.
Ketal vzorce 34 následně reaguje s Grignardovým činidlem vzorce R14MgBr (označení jsou definována v souvislosti se vzorcem 1), za vzniku terciálního alkoholu vzorce 35. Dioxolanová chránící skupina se následné odstraní a terciální alkohol se dehydratuje reakcí s kyselinou za vzniku 3,4-dihydro-7-acetylnaftalenových derivátů vzorce 36. Ketonová funkce sloučenin vzorce 36 se využije v Horner Emmonsově (nebo podobné) reakci za silně alkalických podmínek s činidlem vzorce 37 a po redukci vzniknou aldehydové sloučeniny vzorce 38. Ještě další Horner Emmonsovou (nebo podobnou) za silně alkalických podmínek vznikají s činidlem 39 sloučeniny vzorce 40. Poslední uvedená sloučenina se může přeměnit na další homology a deriváty s ohledem na reakce popsané výše. Zvláštním příkladem Horner Emmonsova činidla vzorce 37, který se použije pro přípravu výhodné sloučeniny, je diethylkyanomethylfosfosforitan; příkladem Horner Emmonsova činidla vzorce 39 je diethyl-(E)-3-ethoxykarbonyl-2methylallylfosforitan.
Reakční schéma 5
hno3
------►·
H2SO4
Hj/Pd EtOAc
HOAc
ON—Y(Rj)—A—9 vzorec 43
1. NaN(SiMe3)2
THF/-78*C
homology a deriváty
Reakční schéma 5 uvádí postup syntézy sloučenin, kde skupina Z je azo skupina (-N=N-).
Jako v reakčním schématu 4, tento postup popisuje příklady, kdy skupina X je [C(R1)2]n a n je 1 (dihydronaftalenové deriváty). Nicméně, je třeba si uvědomit, že popsané metody syntézy jsou také použitelné s takovými úpravami, které jsou známé odborníkům v této oblasti, pro všechny azo sloučeniny pro použití ve vynálezu, zejména pro deriváty, kde X je S, O, NR’ (benzothiopyran, benzopyran nebo dihydrochinolinové deriváty) nebo [C(Ri)2]n a n je O (indenové deriváty). Nitro skupina je tedy zavedena do výchozí sloučeniny vzorce 6 za v podstatě standardních podmínek nitrace a vzniku 3,4-dihydro-7-nitro-1(2H)-naftalenonového derivátu vzorce 41. Poslední uvedená sloučenina se redukuje na 3,4-dihydro-7-amino-1(2H)naftalenonový derivát vzorce 42 a následně reaguje s nitrozo sloučeninou vzorce ONY(R2)-A-B (vzorec 43) za podmínek běžně používaných (ledová kyselina octová) pro přípravu azo sloučenin. Nitrozo sloučenina vzorce 43 se může získat již známými reakcemi. Zvláštním příkladem takové sloučeniny, která se používá pro syntézu výhodných sloučenin, je ethyl 4-nitrozobenzoát. Azo sloučenina vzorce 44 následně reaguje s bis(trimethylsilyl)amidem sodným a 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5chlorpyridinem za vzniku 4- trifluormethylsulfonyloxy derivátů, zastoupených vzorcem 45. Sloučeniny vzorce 45 se pak přemění na azo sloučeniny, vyjádřené vzorcem 46, reakcí s organokovým derivátem odvozeným od arylové nebo heteroarylové sloučeniny R14H. Poslední dvě výše uvedené reakce, a to přeměna na 4- trifluormethylsulfonyloxy deriváty a následná reakce s organokovovým derivátem, byly popsány výše v souvislosti s reakčními schématy 1,2 a 3 a jsou součástí některých výhodných syntetických postupů vedoucích k příkladovým RAR antagonním sloučeninám.
Reakční schéma 6
vzorec 47 homology a —i deriváty ηχ,-W-a-b vzorec 48 ^Nfi^eboO)
Reakční schéma 6 popisuje výhodné syntetické postupy přípravy sloučenin, kde s odkazem na vzorec 1, skupina Z je COO- nebo CONRt (Rt je výhodně H). Tyto esterové a amidové deriváty se připraví z 3,4-dihydro-7-bromnaftalenových derivátů vzorce 16, které se mohou získat podle popisu v reakčním schématu 1. Sloučeniny vzorce 16 tak reagují se silnou bází, jako je t-butyllithium, v inertním etherovém typu rozpouštědla, jako například v tetrahydrofuranu při nízké teplotě, přidá se oxid uhličitý (CO2) za vzniku derivátů kyseliny 5,6-dihydro-12-naftalenkarboxylové vzorce 47. Sloučeniny vzorce 47 pak reagují se sloučeninami vzorce X2 -Y(R2)-A-B (vzorec 48), kde X2 představuje OH nebo skupinu NR^ R! je výhodně vodík. Odborníci v této oblasti poznají, že sloučeniny vzorce 48 jsou aryl nebo heteroarylhydroxy nebo amino deriváty, které se mohou získat již známými metodami. Reakce mezi sloučeninami vzorce 47 a vzorce 48 mohou probíhat za různých známých podmínek pro tvorbu esteru nebo amidu, jako je například jejich sloučení v přítomnosti 1-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimid hydrochloridu a 4-dimethylaminopyridinu. Sloučeniny vzorce 47 se mohou též přeměnit na odpovídající chlorid kyseliny sloučením se sloučeninami vzorce 48 v přítomnosti báze. Amidové nebo esterové sloučeniny vzorce 49 se mohou převést na další homology a deriváty, jak je popsáno výše. Ačkoli je reakční schéma 6 popsáno a uvedeno pro případ, kdy skupina X vzorce 1 je [C(Ri)2]n a n je 1 (dihydronaftalenové deriváty), popsaný postup se může upravit též pro přípravu benzopyranových, benzothiopyranových, dihydrochinolinových a indenových derivátů.
Sloučeniny podle vynálezu s ohledem na vzorec 1, kde Z je -OCO-, NR,CO, stejné jako odpovídající thioesterové a thioamidové analogy, se mohou připravit z meziproduktů odvozených od sloučenin vzorce 16, kde bromová funkce je nahrazena amino nebo hydroxylovou skupinou a podle popisu v patentu Spojených států číslo 5,324,744.
Reakční schéma 7
1. Mg/THF ΖΖη©2
3. Ni(0)/THF
------>
a-b vzorec 10
homology a deriváty
Reakční schéma 7 popisuje výhodné syntetické postupy přípravy sloučenin, kde s odkazem na vzorec 1, skupina Z je -(CRi =CRi)n’ a n’ je 0. Tyto sloučeniny vzorce 50 se mohou získat slučovací reakcí mezi sloučeninami vzorce 16 a Grignardovým činidlem, odvozeným od halogensloučenin vzorce 10. Slučovací reakce se běžně provádí v přítomnosti zinečnaté soli a katalyzátoru niklu (Ni(O)) v inertním, etherovém typu rozpouštědla, jako například v tetrahydrofuranu. Sloučeniny vzorce 50 se mohou také přeměnit na další homology a deriváty, jak je popsáno výše.
Rf R, Pd2(PPh3)2(OAc)2 Et3N/P(o-MePh)3 r/r,
CHjxCH—Y(R,)-A—Θ vzorec 51 (R,)m
vzorec 7 vzorec 52
1. NaN(SiMe3)2 THF/-78* C
ΓΌ,..
R14ZnCI
Pd(PPh3)4
-<---------THF/strč
homology a deriváty
K reakčnímu schématu 8 - uvádí se výhodný syntetický postup pro přípravu sloučenin, kde Z je -(CRi =CRi)n· a n’ je 1. Přesněji, reakční schéma 8 uvádí výhodný postup přípravy těch sloučenin, které jsou dihydronaftalenovými deriváty, a kde skupina Z představuje vinylovou (-CH = CH-) funkci. Avšak uvedená obecná metodika se může rozšířit o takové úpravy, které budou známé odborníkům v této oblasti, vedoucí k analogům benzopyranových, benzothiopyranových, dihydrochinolinových sloučenin a sloučeninám se substituovanou vinylovou skupinou. Ve shodě s reakčním schématem 8, 7-brom-1(2H)naftalenonový derivát vzorce 7 reaguje s vinylovým derivátem se strukturou -CH2 = CHY(R2)-A-B (vzorec 51) v přítomnosti vhodného katalyzátoru, běžně vzorce Pd(PPh3), kyselého akceptoru (jako například triethylaminu) v atmosféře inertního plynu (argon). Podmínky této reakce jsou podobné jako při slučování acetylenových derivátů vzorce 9 s činidlem vzorce 10 (viz například reakční schéma 1), a tento typ reakce je obecně znám jako Heckova reakce. Vinylový derivát vzorce 51 se může získat již známým postupem, příkladem činidla použitého ve vynálezu pro syntézu výhodné sloučeniny je
4-vinylbenzoát.
Produktem Heckovy slučovací reakce je ethenylový derivát vzorce 52, který se následně přeměňuje na sloučeniny používané ve vynálezu v reakci s bis(trimethylsilyl)amidem sodným a 2-[N,N-bis(trifluormethylsulfonyl)-5-chloropyridinem za vzniku 4-trifluormethylsulfonyloxy derivátů vzorce 53 a následné reakce s organokovovým derivátem odvozeným od aryl nebo heteroarylové sloučeniny R14H, jak je popsáno výše. Výsledné sloučeniny vzorce 54 se mohou přeměnit na další homology a deriváty.
Sloučeniny vzorce 54 se mohou také získat podle schématu syntézy, které zahrnuje Wittig nebo Horner Emmonsovu reakci. Například, meziprodukt vzorce 33 (viz reakční schéma 4) může reagovat s trifenylfosfonium bromidovým (Wittig) činidlem nebo výhodněji s diethylfosfonátovým činidlem (Horné Emmons) se strukturou (EtO)2PO-CH2-Y(R2)-A-B, jak je popsáno pro analogické Hornern Emmonsovy reakce v patentu Spojených států číslo 5,324,840. Již zmíněnou Horner Emmonsovou reakcí vznikají meziproduktové sloučeniny, strukturou podobné vzorci 52, které se mohou přeměnit na sloučeniny vzorce 54 následnými reakcemi popsanými v reakčním schématu 8 pro sloučeniny vzorce 52.
Metody syntézy - aryl a (3-oxv-1-profenyl)-substituovaných sloučenin
RAR antagonní sloučeniny vzorce 101, podložené příklady, se mohou připravit zde vysvětlenou chemickou cestou syntézy. Odborník v oblasti chemických syntéz jistě ocení to, že uvedené podmínky pro specifické postupy je možné zobecnit pro jakoukoli a všechny sloučeniny odpovídající vzorci 101.
Reakční schéma 101
I.AJCI3 . 9 zCMm
• 11 í
^Qu RjjCHjCOa (RJo-f 1 **Í1 ?” izo měrní
zco3 JL J ♦
x/x, diketon
R, R, HOAC/AC2O R, R, 0
vzorec 103 vzorec 104
hoch2ch2oh p-TiOH r
H*
R„ Y(R,)-A-6 vzorec 108
1· vzorec 107
NaOH/EtOH
homology a deriváty
Reakční schéma 101 zobrazuje syntézu sloučenin vzorce 101, kde X je [C(Ri)2]n, n je 1, p je nula a R17 je H nebo nižší alkyl. Jinými slovy, reakční schéma 101 zobrazuje syntézu sloučenin vynálezu, kterými jsou 3,4-dihydronaftalenové deriváty. V souhlasu s tímto schématem, tetrahydronaftalenová sloučenina vzorce 103, která je výhodně substituována skupinami R3 a R2 (tyto jsou definovány v souvislosti se vzorcem 101), slouží jako výchozí surovina. Výhodným příkladem sloučeniny vzorce 103 je 1,3,3,4-tetrahydro-1,1-dimethyl-naftalen, který je popsán v chemické literatuře (Marmur a kol. Tetrahedron, 1985, 41:1509. Zde doporučená cesta syntézy této sloučeniny z 1-brom-3-fenylpropanu je popsána také v experimentální části přihlášky.
Sloučenina vzorce 103 reaguje ve Friedel Kraftově typu reakce s chloridem kyseliny struktury Ri6CH2COCI (Ri6 je definován v souvislosti se vzorcem 101) a následně se oxiduje oxidem chromovým v kyselině octové za vzniku izomerních 6 a 7 acyl-3,4-dihydro-1(2H)-naftalenonových derivátů. Pouze 6-acyl derivát, který je předmětem vynálezu, je zobrazen strukturním vzorcem (vzorec 104) v reakčním schématu 101. V přípravě výhodných sloučenin podle vynálezu představuje skupina R! methyl, R2 , R3 a R16 jsou H, a proto výhodným meziproduktem, odpovídajícím vzorci 104, je 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naftalenon.
Exocyklická ketonová funkce sloučeniny 104 je následně ochráněna jako ketal, například reakcí s ethylem glykolem v kyselině, za vzniku 1,3-dioxolanyl derivátu vzorce 105. Sloučenina vzorce 105 pak reaguje s Grignardovým činidlem vzorce R14 MgBr (Ru je definován v souvislosti se vzorcem 101) za vzniku 1,2,3,4-tetrahydro-lhydroxy-naftalenderivátu vzorce 106. Exocyklická ketonová funkce sloučeniny 106 se pak odstraní reakcí s kyselinou a dehydratuje se za vzniku sloučeniny 107.
Alternativním způsobem pro získání sloučenin vzorce 107 ze sloučenin vzorce 105 je reakce sloučenin vzorce 105 s bis(trimethylsilyl)amidem sodným a 2-[N,Nbis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridinem (Tf = SO2CF3) v inertním etherovém typu rozpouštědla, jako například v tetrahydrofuranu, při nízkých teplotách (-78°C a 0°C). Tato reakce probíhá přes sodnou sůl meziproduktu, která se obvykle neizoluje, a není uvedena v reakčním schématu 101. Celkovým sledem rekcí výsledně vzniká u trifluormethylsulfonyloxy derivát, který následné reaguje s organokovým derivátem, odvozeným od arylové nebo heteroarylové sloučeniny R14H, jako například s derivátem vzorece organokovového čimidla Ri4Met (Met představuje monovalentní kov), výhodně
Ri4Li. (R14 je definován v souvislosti se vzorcem 101). Reakce s organokovým derivátem, výhodně lithným derivátem vzorce R14Li, nejčastěji probíhá v inertním etherovém typu rozpouštědla (jako například v tetrahydrofuranu) v přítomnosti chloridu zinečnatého (ZnCI2) a tetrakis(trifenylfosfin)-paladia (Pd(PPh3)4). Pokud není organolithné činidlo R14Li komerčně dostupné, může se připravit ze sloučeniny R14H (nebo jeho halogenového derivátu R14Xi, kde X! je halogen) v etherovém typu rozpouštědla ve shodě s již známými postupy. Teplotní rozmezí reakce mezi činidlem Ri4Li a trifluormethylsulfonyloxy derivátem se pohybuje obecné v rozmezí přibližné 78°C až 50°C.
Sloučeniny podle vynálezu se tvoří jako výsledek kondenzace mezi ketonovou sloučeninou vzorce 107 a aldehydem nebo ketonem vzorce 108. V přípravě vybraných příkladových sloučenin vynálezu je činidlem vzorce 108, 4-karboxybenzaldehyd (R17H). Příklady jiných činidel v rozsahu vzorce 108 a vhodné pro kondenzační reakci a pro syntézu sloučenin v rozsahu vynálezu (vzorec 101) jsou: 5-karbozy-pyridin-2aldehyd, 4- karboxy-pyridin-2-aldehyd, 4- karboxy-thiofen-2-aldehyd, 5- karboxythiofene-2-aldehyd, 4-karboxy-furan-2-aldehyd, 5-karboxy-furan-2-aldehyd, 4karboxyacetofenon, 2-acetyl-pyridin-5-karboxylová kyselina, 2- acetyl-pyridin-4karboxylová kyselina, 2- acetyl- thiofen-4-karboxylová kyselina, 2- acetyl- thiofen-5karboxylová kyselina, 2- acetyl-furan-4- karboxylová kyselina a 2- acetyl-furan-5karboxylová kyselina. Uvedené sloučeniny jsou vhodné v souladu s chemickou literaturou; viz například Decroix a kol., J. Chem. Res. (S), 4: 134 (1978); Dawson a kol., J. Med. Chem. 29: 1282 (1983); a Queguiner a kol., Bull Soc. Chimique de France Nčíslo 10, strana 3678 - 3683 (1969). Kondenzační reakce mezi sloučeninami vzorce 107 a vzorce 108 probíhá v přítomnosti báze v alkoholovém rozpouštědle. Reakce probíhá výhodně v ethanolu v přítomnosti hydroxidu sodného. Odborníci v oboru znají tuto kondenzační reakci jako aldolovou kondenzaci a v případě popsaných výhodných příkladů (kondenzace ketonu vzorce 107 s aldehydem vzorce 108) jako ClaisenSchmidtovu reakci, (viz March: Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Struktuře, strana 694 - 695 McGraw Hill (1968). Sloučeniny vzorce 109 v rozsahu vynálezu mohou také vstoupit do dalších transformací za vzniku dalších sloučenin vynálezu. A-B skupina vzorce 108 může být též skupinou, která v rozsahu vynálezu je definována vzorcem 101, jen po jedné nebo více syntetických transformacích, jejichž podstata je již známa a které patří k praxi organického chemika. Například, reakce probíhající na A-B skupině může být krokem odstranění chránící skupiny, homologací, esterifikaci, saponifikací, tvorby amidu a tak podobně.
Obecně řečeno, s ohledem na odvození sloučenin vzorce 109 a/nebo syntézu arylových nebo heteroarylových sloučenin vzorce 108, které mohou následně reagovat se sloučeninami vzorce 107, se mohou použít obecně známé a publikované principy a metody syntézy
Jak je výše uvedeno, karboxylové kyseliny se běžně esterifikují zahřátím kyseliny v roztoku odpovídajícího alkoholu v přítomnosti kyselého katalyzátoru, jako například v chlorovodíku nebo chloridu thionylu. Karboxylová kyselina může také kondenzovat s odpovídajícím alkoholem v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu a dimethylamino pyridinu. Ester se oddělí a přečistí již známým způsobem. Acetaly a ketaly se vyrobí metodou popsanou v March, Advanced Orqanic Chemistry, 2. vydání, McGraw-Hill Book Company, strana 810. Alkoholy, aldehydy i ketony se mohou chránit tvorbou etherů a esterů, acetaly nebo ketaly známými metodami, popsanými v McOmie, Plenům Publishing Press, 1973 a Protecting Groups, Ed. Greene, John Wiley & Sons, 1981.
Pro zvýšení hodnoty n ve sloučeninách vzorce 108 před kondenzační reakcí podle reakčního schématu 101 (kde takové sloučeniny odpovídající vzorci 108 nejsou dostupné z komerčních zdrojů) mohou aromatické nebo heteroaromaticlké karboxylové kyseliny podstoupit homologizaci (zatímco aldehydová skupina je chráněna) postupnou reakcí za Ardt-Eistertových podmínek nebo podle jiných homologizačních postupů. Deriváty jiné než karboxylové kyseliny, se mohou také homologizovat vhodným postupem. Homologizované kyseliny se pak mohou esterifikovat obecným postupem naznačeným v předchozím odstavci.
Sloučeniny vzorce 108, (nebo jiné možné meziprodukty kromě vynálezu), kde A je alkenylová skupina s jednou nebo více dvojnými vazbami, se může vyrobit například podle schémat syntézy, která jsou známá odborníkům v této oblasti; například Wittigovou a podobnými reakcemi, nebo vznikem dvojné vazby eliminací halogenu z alfa-halo-arylalkyl-karboxylové kyseliny, esteru nabo podobně karboxaldehydem. Sloučeniny vzorce 108, (nebo jiné možné meziprodukty a sloučeniny vynálezu), kde skupina A má trojnou vazbu (acetylenovou) se mohou vyrobit reakcí odpovídajícího aromatického methylketonu se silnou bází, jako například s lithiumdiizopropylamidem, reakcí s diethylchlorofosfátem a následným přidáním lithiumdiizopropylamidu.
Kyseliny a soli odvozené od sloučenin vzorce 109 (nebo jiné možné meziprodukty vynálezu), se mohou snadno získat přímo jako výsledek kondenzační reakce nebo z odpovídajících esterů. Základní saponifikací s bází alkalického kovu vznikne kyselina. Například, ester vzorce 109 (nebo jiné meziprodukty a sloučeniny vynálezu), se může rozpustit v polárním rozpouštědle, jako například v alkanolu, výhodně v inertní atmosféře za pokojové teploty s přibližně třímolárním přebytkem báze, například hydroxidu lithného nebo hydroxidu draselného. Roztok se delší dobu míchá, přibližné 15 až 20 hodin, zchladí, okyselí a hydrolyzát se zpracuje standardími metodami.
Amid může vzniknout příslušnou amidací již známými metodami z odpovídajícího esterů nebo karboxylových kyselin. Jednou z možných příprav takových sloučenin je přeměna kyseliny na chlorid kyseliny a pak reakce této sloučeniny a hydroxidem amonným nebo vhodným aminem.
Alkoholy se vyrobí přeměnou příslušných kyselin na chlorid kyseliny s chloridem thionylu nebo jiným způsobem (J. March, Advanced Orqanic Chemistry, 2. vydání, McGraw-Hill Book Company), pak redukcí chloridu kyseliny tetrahydridoboritanem sodným (March, Ibid, strana 1124), čímž vzniknou odpovídající alkoholy. Estery se mohou také redukovat tetrahydridoboritanem lithným při snížených teplotách. Alkylací těchto alkoholů s příslušnými alkyl halogenidy za podmínek Williamsonovy reakce (March, llbid, strana 357). vznikají odpovídající ethery. Tyto alkoholy se mohou přeměnit na estery reakcí s příslušnou kyselinou v přítomnosti kyselého katalyzátoru nebo dicyklohexylkarbodiimidu a dimethylaminopyridinu.
Aldehydy se mohou připravit z vhodných primárních alkoholů použitím slabých oxidačních činidel, jako například pyridinium dichromanu v methylen chloridu (Corey, E.J., Schmidt, G., Tet. Lett., 399, 1979) nebo simethylsulfoxid/oxalylchloridu v methylen chloridu (Omura, K., Swern. D., Tetrahedron, 34:1651 (1978)).
Ketony se mohou připravit z vhodného aldehydu reakcí aldehydu s alkyl Grignardovovým činidlem nebo podobným činidlem s následnou oxidací.
Acetaly nebo ketaly se mohou připravit z odpovídajícího aldehydu nebo ketonu metodou popsanou v March, Ibid, s. 810.
Reakční schéma 102
OCHa
CHjOz
RjRjZn τία4
vzorec 110 vzorec 111
CrO3
HOAc
AcjO v *
R,4Mg3r
THF neboEtjO
vzorec 113 vzorec 112
2. R^CHjCOa pyridin
1. BBr3 CHjClj
R, R,
vzorec 114 vzorec 115
Reakční schéma 102 (pokračování)
vzorec 115
AK33
135 *C -----► (Friesovo přeskupení)
R, R, vzorec 119
K reakčnímu schématu 102, kde je popsána cesta syntézy sloučenin vynálezu s odkazem na vzorec 101, je p nula, R2 je v aromatické části kondenzované kruhové struktury OH a R17 je OH. Odborníci v této oblasti snadno poznají, že tyto sloučeniny jsou β-diketony v enolovém tvaru. Reakční schéma 102 také popisuje cestu syntézy těch sloučenin vynálezu, kde p je 1. Odborníci v této oblasti snadno poznají, že poslední uvedené sloučeny jsou flavony. V souladu s tímto schématem, derivát 1,2,3,4tetrahydro-6-mathoxynaftalen-1-on vzorce 110 reaguje s dialkylzinkem (RiZn) v přítomnosti chloridu titaničitého ve vhodném rozpouštědle, jako například v CH2Cl2, pro záměnu oxofunkce geminální dialkylovou skupinou R1R1, za vzniku sloučeniny vzorce 111, kde Rí je nižší alkyl. Ve výhodných postupech pro sloučeniny vynálezu , které jsou v souladu s reakčním schématem 102, je R3 vodík a Rí methyl. Stejně tak činidlem dialkylzinku je dimetnylzinek a vhodnou výchozí surovinou vzorce 110 je 1,2,3,4tetrahydro-6-mathoxynaftalen-1-on. Poslední uvedená sloučenina je komerčně dostupná, například od chemické společnosti Aldrich. 1,2,3,4-tetrahydro-1,2-dialkyl-6methoxynaftalenový derivát vzorce 111, se následně oxiduje oxidem chromovým v kyselině octové a acetanhydridem za vzniku derivátu 1,2,3,4-tetrahydro-3,4-dialkyl-7methoxy naftalen-1-on vzorce 112. Ketonová sloučenina vzorce 112 reaguje s Grignardovým činidlem (Ri4MgBr, R,4 je definováno v souvislosti se vzorcem 101) za vzniku 1-hydroxy-1-aryl-3,4-dihydro-3,4-dialkyl-7-methoxy naftalenového derivátu vzorce 113. Hydroxy sloučenina vzorce 113 podstupuje při zahřátí eliminaci, výhodně v kyselině, za vzniku dihydronaftalenové sloučeniny vzorce 114. Methylová skupina se odstraní z fenolové methyletherové funkce sloučeniny vzorce 114 působením bromidu boritého ve vhodném rozpouštědle, jako například v CH2CI2 , a následně se fenolová OH skupina acyluje acylačním činidlem, které zavede skupinu Ri6CH2CO za vzniku sloučeniny vzorce 115. Ve výhodných postupech je R16 - H, a proto acylačním činidlem je acetyl chlorid nebo acetanhydrid. Acylační reakce probíhá v bazickém rozpouštědle, jako například v pyridinu. Acylovaná fenolová sloučenina vzorce 115 reaguje s chloridem hlinitým při zvýšené teplotě, čímž dojde k Friesově přeskupení a vzniku 1aryl-3,4-dialkyl-3,4-dihydro-6-acyl-7-hydroxy-naftalenové sloučeniny vzorce 116. Fenolová hydroxy skupina sloučeniny vzorce 116 se acyluje acylačním činidlem (jako například chloridem kyseliny), které zavádí skupinu CO-Y(R2)-A-B za vzniku sloučeniny 117. V činidle chloridu kyseliny CI-CO-Y(R2)-A-B (nebo podobném acylačním činidle) mají symboly Y, R2 a A-B stejný význam, jak je definováno v souvislosti se vzorcem
101. V přípravě výhodné sloučeniny vynálezu ve shodě s tímto schématem je tímto činidlem CICOC6H4COOEt (z poloviny ester a z poloviny ethylchlorid tereftalové kyseliny).
Sloučenina vzorce 117 reaguje se silnou bází, jako je hydroxid draselný v pyridinu a vzniká sloučenina vzorce 118, jako výsledek intramolekulámí Claisenovy kondenzační reakce.
Sloučeniny vzorce 118 jsou v rozsahu vynálezu a vzorece 101, kde R2 je OH substituent v aromatické části kondenzované kruhové skupiny a Ri? je OH. V souvislosti s předchozí reakcí (intramolekulámí Claisenova kondenzace) a dříve zmíněným Friesovým přeskupením je třeba si uvědomit, že tyto pravděpodobné reakční mechanismy jsou uvedené v tomto popisu za účelem úplného vysvětlení popsaných reakcí, a pro usnadnění práce odborníkům v této oblasti při provádění popsaných reakcí a přípravy sloučenin vynálezu. Nicméně, vynálezci se nechtějí vázat na reakčními mechanismy a teorie, a proto by nárokovaný vynález neměl být omezující.
Sloučeniny vzorce 118 reagují se silnou kyselinou, jako je kyselina sírová, ve vhodném kationtovém rozpouštědle, jako například v kyselině octové, za vzniku flavonovýcxh sloučenin vzorce 119. Sloučeniny vzorce 119 jsou též sloučeninami vynálezu podle vzorce 101, kde p je 1. Sloučeniny vzorce 118 i vzorce 119 mohou podstupovat další reakce a transformace za vzniku dalších homologů a derivátů, jak je popsáno výše v souvislosti s reakčním schématem 101. Toto je uvedeno v reakčním schématu 102 jako přeměna na homology a deriváty.
Reakční schéma 103
vzorec 120
BrClRakCHCFyCO^ vzorec 121 báze
vzorec 122 ch3so3h
0 Pd(!1)CI2
K R’« Oj / OuOj
Wackerova
0 oxidace
vzorec 124 vzorec 123
hoch2ch2oh p-TaOH
0 R · OH/Wm
R’· R14Mg9r
(Rjlo-f Ϊ 1 J - (Rj)° i jL 1 j
THF nebo EljO
\-J vJ
vzorec 125 vzorec 126
Reakční schéma 103 (pokračování)
vzorec 126
vzorec 127
O vzorec 108 NaOH/EtOH homology a < _______ deriváty
O vzorec 126
K reakčnímu schématu 103 - cesta syntézy vedoucí k sloučeninám podle vynálezu s odkazem na vzorec 101, X je S, O nebo NR’, p je nula a R17 je H nebo nižší alkyl. Avšak při použití základních principů syntézy uvedených v reakčním schématu 102, si uvedený postup syntézy mohou odborníci v této oblasti změnit nebo upravit tak, aby získali sloučeniny podle vynálezu, kde X je S, O nebo NR’, p je 1, nebo kde X je S, O nebo NR’ a p je nula, skupina R2 v aromatické části kondenzované kruhové struktury je OH a R17je OH.
Výchozí sloučeninou reakčního schématu 103 je fenol, thiofenolnebo anilinový derivát vzorce 120. U výhodných sloučenin podle vynálezu jsou R2 a R3 skupiny vodíky a výhodnými výchozími sloučeninou vzorce 120 jsou 3-ethyl-thiofenol nebo 3-ethenylfenol, které jsou známyz chemické literatury (Nuyken a kol. Polym. Bull (Berlin) 11:165 (1984). Z důvodů zjednodušení a upřesnění může být v příslušném popisu X primární síra pro přípravu benzothiopyranových derivátů podle vynálezu. Je třeba si uvědomit, že posané schéma je též po úpravách odborníky v této oblasti vhodné pro přípravu benzopyranových (X = O) a dihydrochinolinových (X = NR’) sloučenin v rozsahu vynálezu . Sloučenina vzorce 120 tak reaguje za bazických podmínek s 3- brom karboxylovou kyselinou vzorce 121. V tomto reakčním schématu mají symboly stejný význam, jak je popsáno v souvislosti se vzorcem 101. Příkladem činidla vzorce 121 , kde R3 představuje vodík, je kyselina
3-brompropionová. Reakcí s 3-brompropionovou kyselinou vzorce 121 vzniká sloučenina vzorce 122. Později reakcí s kyselinou cyklizuje na derivát 7-ethenylthiochroman-4-on (pokud X je S) nebo 7-ethenyl-chromanový derivát (pokud X je O) vzorce 123. 7-ethenyl-thiochroman-4-on nebo 7-ethenyl-chroman-4-one derivát vzorce 123 se oxiduje v přítomnosti katalyzátorů Pd(ll)CI2 a CuCI2 za vzniku odpovídající 7acyl(keton) sloučeniny vzorce 124. Odborníci v této oblasti znají poslední reakci jako Wackerovu oxidaci. Exocyklická ketonová skupina sloučeniny vzorce 124 je chráněna tvorbou ketalu, například reakcí s ethylen glykolem v kyselině za vzniku 1,3dioxolanylového derivátu vzorce 125. Sloučenina vzorce 125 podstupuje následné reakce analogické popsaným pro sloučeniny vzorce 105 v reakčním schématu 101.
1,3-dioxolanylový derivát vzorce 125 tak reaguje s Grignardovým činidlem vzorce R14MgBr za vzniku terciálního alkoholu vzorce 126, který se následně dehydratuje v kyselině za vzniku benzothiopyranového (X je S), benzopyranového (X je O) nebo dihydrochinolinového (Xje NR’) derivátu vzorce 127. Ketonová sloučenina vzorce 127 pak reaguje v přítomnosti báze s činidlem vzorce 108 v aldolové kondenzační (ClaisenSchmidt) reakci za vzniku sloučenin vzorce 128 podle vynálezu. Sloučeniny vzorce 128 se mohou přeměnit na další homology a deriváty, jak je popsáno výše v souvislosti s reakčními schématy 101 a 102.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1- znázorňuje chemickou strukturu AGN 193109.
Obrázky 2A-2F jsou řady spojnicových grafů, které znázorňují, že AGN 193109 inhibuje ATRA-závislou transaktivaci na RAR. Obrázek 2A a 2B představuje aktivitu na
RAR-α receptoru; Obrázky 2C a 2D představují aktivitu na RAR-β receptoru; obrázky
2E a 2F představují aktivitu na RAR-γ receptoru. Na obrázcích 2A, 2C a 2E představují prázdné čtverce reakci s kyselinou retinovou a vyplněné kruhy představují reakci s
AGN 193109. Na obrázcích 2B, 2D a 2F představují jednoduché čáry luciferázovou aktivitu měřenou po reakci s 108 M ATRA a různými koncentracemi AGN 193109.
Obrázky 3A a 3B jsou spojnicové grafy představující luciferázovou aktivitu měřenou v CV-1 buňkách transfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a expresním plazmidem ER-RAR-α a stimulované ASTRA (obrázek 3A) nebo AGN 193109 (obrázek 3B) při různých koncentracích. Bodově vyznačená data představují průměrnou hodnotu ± SEM tří nezávislých luciferázových stanovení. V každém obrázku jsou uvedeny výsledky transfekcí získané použitím různých množství kotransfektovaného ER-RAR-a (0,05, 0,1 a 0,2 pg/jamku).
Obrázky 4A a 4B jsou spojnicové grafy grafy představující luciferázovou aktivitu měřenou v CV-1 buňkách transfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a expresním plazmidem ER-RAR-β a stimulovaných ATRA (obrázek 4A) nebo AGN 193109 (obrázek 4B) při různých koncentracích. Bodově vyznačená data představují průměrnou hodnotu r SEM tří nezávislých luciferázových stanovení. V každém obrázku jsou uvedeny výsledky transfekcí získané použitím různých množství kotransfektovaného ER-RAR-a (0,05, 0,1 a 0,2 pg/jamku).
Obrázky 5A a 5B jsou spojnicové grafy představující luciferázovou aktivitu měřenou v CV-1 buňkách transfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a expresním plazmidem ER-RAR-γ a stimulovaných ATRA (obrázek 5A) nebo AGN 193109 (obrázek 5B) při různých koncentracích. Bodová data představují průměrnou hodnotu ± SEM tří nezávislých luciferázových stanovení. V každém obrázku jsou uvedeny výsledky transfekcí získané použitím různých množství ko-transfektovaného ER-RAR-a (0,05, 0,1 a 0,2 pg/jamku).
Obrázek 6 znázorňuje odpověď CV-1 buněk kotransfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a ER-RXR-α plazmidovou expresi chimerního receptoru nebo v kombinaci s RAR-y-VP-16 expresním plazmidem. ER-RXR-α kotransfektované buňky reagovaly s ATRA (čtverec) a AGN 193109 (kosočtverec). Buňky kotransfektované v kombinaci ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 reagovaly s ATRA (kruh) nebo AGN 193109 (trojúhelník).
Obrázek 7 znázorňuje spojnicový graf představující měření luciferázové aktivity provedená v lyzátech CV-1 buněk transfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a expresním konstruktem ER-RAR-γ, které pak reagovaly s 10'8 M ATRA a testovanými sloučeninami v koncentracích uvedených na horizontální ose. Testovanými sloučeninami byly: AGN 193109 (čtverec), AGN 193357 (prázdný kosočtverec), AGN
193385 (kruh), AGN 193389 (trojúhelník), AGN 193840 (vyplněný čtverec) a AGN
192870 (vyplněný kosočtverec).
Obrázek 8 je spojnicový graf představující měření luciferázové aktivity provedená v lyzátech CV-1 buněk transfektovaných s reportním plazmidem ERE-tk-Luc a RAR-y-VP-16 a expresním konstruktem ER-RXR-α, které pak reagovaly s testovanými sloučeninami v koncentracích uvedených v horizontální ose. Testovanými sloučeninami byly: ATRA (prázdný čtverec), AGN 193109 (prázdný kruh), AGN 193174 (prázdný trojúhelník), AGN 193199 (šrafovaný čtverec), AGN 193385 (šrafovaný trojúhelník), AGN 193389 (obrácený trojúhelník), AGN 193840 (diagonálně vyplněný čtverec) a AGN 193871 (napůl vyplněný kosočtverec).
Obrázky 9A, 9B a 9C schematicky znázorňují mechanismus, kdy AGN 193109 může regulovat interakci mezi RAR (vystínovaný box) a negativními koaktivátorovými proteiny (-) uvedenými v souvislisti s transaktivačním měřením. Obrázek 9A zobrazuje, že negativní koaktivátorové proteiny a pozitivní koaktivátorové proteiny (+) jsou ve vazebné rovnováze s RAR. Nepřítomnost ligandu ovlivní základní hladinu transkripce sledovaného genu. Jak je znázorněno na obrázku 9B, přídavek RAR agonisty způsobí asociaci pozitivních koaktivátorových proteinů s RAR a výsledkem je zvýšená transkripce sledovaného genu. Obrázek 9C znázorňuje, jak přídavek AGN 193109 způsobí asociaci negativních koaktivátorových proteinů s RAR a zabraňuje transkripci sledovaného genu.
Obrázek 10 je sloupcový diagram znázornění inhibice TPA-indukované Str-AP1CAT exprese jako funkce koncerntrace AGN 191183 (10’1° -10'12 M) při konstantní W8 M koncentraci AGN 193109. Výsledky pokusu jsou znázorněny tak, že samostatný AGN 191183 představuje vyšrafovaný sloupec a reakci v kombinací AGN 193109 s AGN 191183 představuje jednoduchý sloupec.
Obrázek 11 schematicky znázorňuje mechanismus, kdy AGN 193109 může zvyšovat aktivity RAR a jiných členů jaderné receptorové rodiny. Jak je zobrazeno v diagramu, zavedení RAR (prázdný obdélník s AB-C-DEF doménami) zvýší citlivost k
RAR ligandům při anti-AP1 měření, protože negativní koaktivátorový protein (ncp), přítomný v omezeném množství, se odloučí do RAR, což vede k dvěma populacím:
RAR+ncp a RAR-ncp. RAR-ncp má zvýšenou citlivost k ligandům. Non-RAR jaderné faktory (stínovaný obdélník s AB-C-DEF doménami) má zvýšenou citlivost k příbuzným ’ · · * · · · ligandů, protože ncp se odloučilo do RAR díky aktivitě AGN 193109. Standardní domény jaderných receptorů jsou navrženy za použití standardní nomenklatury “AB” (na ligandu nezávislá transaktivační doména), “C” (DNA vazebná doména) a “DEF” (ligand regulující transaktivační doména a dimerizační doména).
Obrázek 12 je spojnicový graf znázorňující vliv dávky AGN 193109 na
1.25- dihydroxyvitamínu D3 v CV-1 buňkách transferovaných pomocí MTV-DR3-Luc reportního plazmidu. Tratransfektanty reagovaly s 1,25-dihydroxyvitamínem D3 (prázdný čtverec),
1.25- dihydroxyvitamínem D3 a 10’8 M AGN 193109 (prázdný trojúhelník) a
1,25-dihydroxyvitamínem D3 a 10'7 M AGN 193109 (prázdný kruh).
Obrázek 13 je sloupcový graf znázoméňující vliv dávky AGN 193109 (10 nM) na
1,25-dihydroxyvitamínem D3 zproatředkovanou inhibici TPA indukované aktivity StrAP1-CAT. Vyšrafované sloupce představují inhibici CAT aktivity v transfekrovaných buňkách, které reagovaly pouze s 1,25-dihydroxyvitamínem D3 . Prázdné sloupce představuje inhibici CAT aktivity v transfekrovaných buňkách zreagovaných s kombinací 1,25-dihydroxyvitamínu D3 a AGN 193109.
Obrázek 14 je spojnicový graf vlivu samotného AGN 193109 a v kombinaci s AGN 191183 na HeLa buňky kotransfektované s RAR-γ a RAR odpovídajícím MT VTREp-Luc reportním konstruktem. Použitá léčiva znázorněná v grafu jsou: AGN 193109 (čtverec), AGN 193109 v kombinaci s AGN191183 v koncentraci 10’1° M (kosočtverec) a AGN 193109 v kombinaci s AGN191183 o koncentraci 10'9 M (kruh).
Obrázek 15 je spojnicový graf znázorňující ECE16-1 buněčnou proliferací v závislosti na EGF (vyplněný čtverec), ale ne v závislosti pouze na definovaném médiu (prázdný kruh). Buňky, které reagovaly pouze s AGN 193109 jsou znázorněny vyplněným trojúhelníkem. Prázdné kruhy představují výsledky získané u buněk, které reagovaly s 10 nM AGN 191183 a 0-1000 nM AGN 193109.
Obrázek 16 je sloupcový graf znázornění vlivu AGN 193109 na proliferací CaSki buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti AGN191183 retinoidního agonisty. Všechny skupiny vzorků dostaly 20 ng/ml epidermálního růstového faktoru (EGF) až na vzorek namnožený pouze v definovaném mediu (DM) (prázdný sloupec). Šrafované sloupce představují vzorky inkubované v nepřítomnosti AGN193109. Vystínované sloupce představují vzorky množené v přítomnosti 1000 nM AGN193109. Použité koncentrace
AGN 191183 v postupu jsou uvedeny na horizontální ose.
Obrázek 17 je křivka vlivu dávky ukazující, že AGN193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu ATRA na buňky retinálního pigmentového epitelia (RPE). Vzorky, které reagovaly pouze s ATRA, představují prázdné čtverce. Vzorky, které reagovaly s kombinací ATRA a AGN 193109 (10‘7 M) představují prázdné kruhy. Použité koncentrace ATRA pro různé vzorky jsou uvedeny na horizontální ose.
Obrázek 18 je křivka vlivu dávky ukazující, že 13-c/s -RA i ATRA inhibují růst RPE buněk, a že AGN193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu 13-cis-RA. Reakce různých vzorků v závislosti na dávace zahrnují pouze 13-c/s -RA (prázdný čtverec), 13-c/s -RA v kombinaci s AGN193109 (108 M) (prázdný kruh), 13-c/s -RA v kombinaci s AGN193109 (W8 M) (prázdný trojúhelník) a ATRA (prázdný kosočtverec). Použité koncentrace 13-c/s -RA a ATRA pro reakce se vzorky jsou uvedeny na horizontální ose.
Obrázek 19 je křivka odpovědi na dávku, která ukazuje, že AGN193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu dexamethazonu v primární kultuře RPE buněk. Reakce různých vzorků v závislosti na dávce zahrnují ATRA (prázdný čtverec), samostatný dezamethazon (prázdný kruh), dezamethazon v kombinaci s AGN193109 (10'8 M) (prázdný trojúhelník) a dezamethazon v kombinaci s AGN193109 (W5 M) (prázdný kosočtverec). Použité koncentrace dexamethazonu a ATRA pro reakce se vzorky jsou uvedeny na horizontální ose.
Obrázek 20 je křivka odpovědi na dávku, která ukazuje, že AGN193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu thyroidního hormonu (T3) v primární kultuře RPE buněk. Reakce různých vzorků v závislosti na dávce zahrnují ATRA (prázdný čtverec), samostatný T3 (prázdný kruh), T3 v kombinaci s AGN193109 (W8 M) (prázdný trojúhelník) a T3 v kombinaci s AGN193109 (W6 M) (v prázdné kosočtverec). Použité koncentrace T3 a ATRA pro reakce se vzorky jsou uvedeny na horizontální ose.
Příklady
2-hydroxy-2-methyl-5-fenylpentan
Ke směsi 13,16 g (0,541 mol) hořčíkových pilin v 200 ml bezvodého EtO2 se přidá 100,0 g (0,492 mol) 1-brom-3-fenyl propanu jako roztoku v 100 ml EtO2. Po 5-10 ml přídavku roztoku se další přidávání zastaví, jakmile začne reagovat Grignardovo činidlo. Zbývající bromid se pak přidá za další hodinu. Grignardovo činidlo se míchá 20 minut při 35°C a pak se přidá 31,64 g (0,541 mol) acetonu po 45 minutové periodě. Reakce se míchá přes noc při pokojové teplotě, pak se zchladí na 0°C a okyselí opatrným přídavkem 20% HCI. Vodná vrstva se extrahuje pomocí EtO2. (3x200 ml), smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a nasyceným vodným NaCI před vysušením nad MgSO4. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a destilací zbytku se získá 63,0 g (72%) produktu jako bledě žlutého oleje, bod varu 99-102°C / 0,5 mm Hg. 1H NMR (CDCI3): δ 7,28-7,18 (5H, m), 2,63 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,68 (2H, m), 1,52 (2H, m), 1,20 (6H, s).
1.2.3.4- tetrahydro-1,1-dimethylnaftalen
Směs P2O5 (55,3 g, 0,390 mol) ve 400 ml methansulfonové kyseliny se zahřeje na 105°C v argonové atmosféře, až se všechna pevná část rozpustí. Výsledný roztok se zchladí na pokojovou teplotu a pomalu za míchání se přidá 2-hydroxy-2-methyl-5fenylpentan (63,0 g, 0,354 mol). Po 4 hodinách se reakce zastaví opatrným nalitím roztoku do 11 ledu. Výsledná směs se extrahuje pomocí EtO2.(4x125 ml), Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a nasyceným vodným NaHCO3, vodou a nasyceným vodným NaCI před vysušením nad MgSO4. Zakoncentrování roztoku za sníženého tlaku a následná destilace poskytne 51,0 g (90%) produktu jako čirého bezbarvého oleje , bod varu 65-67°C / 1,1 mm Hg. 1H NMR (CDCI3): δ 7,32 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,16-7,05 (3H, m), 2,77 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,80 (2H, m), 1,66 (2H, m), 1,28 (6H, s).
3.4- dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naftalenon (sloučenina A)
350 ml roztoku ledové kyseliny octové a 170 ml anhydridu kyseliny octové se zchladí na 0°C a po malých částech se opatrně přidá 25,0 g (0,25 mol) CrO3. Výsledná směs se míchá 30 minut a pak se přidá 120 ml benzenu. Pomalu se přidá roztok
1.2.3.4- tetrahydro-1,1-dimethylnaftalenu v 30 ml benzenu. Po dokončení přídavku se reakce míchá 4 hodiny při 0°C. Roztok se zředí H2O (200 ml) a extrahuje pomocí EtO2 (5x50 ml). Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným vodným NaHCO3 a nasyceným vodným NaCI před vysušením nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku a destilací se získá 16,0 g (74%) produktu jako bledě žlutého oleje, bod varu 93-96°C / 0,3 mm Hg. 1H NMR (CDCI3): δ 8,02 (1H, dd, J = 1,3, 7,8 Hz), 7,53 (1H, m), 7,42 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,29 (1H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,02 (2H, t, J =
6,8 Hz), 1,40 (6H, s).
3.4- dihvdro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naftalenon (sloučenina B)
100 ml tříhrdlová nádoba, opatřená zpětným kondenzorem, sušící zkumavkou a nálevkou, se naplní směsí 9,5 g (71,4 mmol) AICI3 a 3 ml CH2CI2. Do směsi se při pokojové teplotě po kapkách za míchání se přidá 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-1 (2H)naftalenonu (5,0 g, 28,7 mmol) (Pozor: exotermická reakce !) Velmi pomalu se pak přidá 5,5 g (34,5 mmol) bromu a výsledná směs se míchá 2 hodiny při pokojové teplotě. (Upozornění: při zastevení míchání se směs může zahřát na 70°C, než se míchání znovu obnoví.) Reakce se pak ukončí pomalým přídavkem ledem chlazené 6M HCI. Směs se extrahuje pomocí EtO2 a smíchané organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným vodným NaHCO3 a nasyceným NaCI před vysušením nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku a destilací zbytku se získá 5,8 g (80%) produktu jako bledě žlutého oleje, který při stání krystalizuje, bod varu 140°C / 0,4 mm Hg. 1H NMR (CDCI3): δ 8,11 (1H, d, J = 3,0 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,31 (1H, d, J = 9,0 Hz), 2,72 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,28 (6H, s).
1.2.3.4- tetrahydro-1 -hydroxy-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaftalen (sloučenina Cl
Ke směsi hořčíkových pilin (648,0 mg, 27,0 mmol) v 25 ml THF se po dvou částech přidá roztok 4-bromtoluenu (5,40 g, 31,8 mmol) v 10 ml THF. Reakce se zahájí přídavkem 2 ml roztoku za následeného pomalého přídavku zbývajícího roztoku pomocí přídavné nálevky. Směs se míchá 1 hodinu při pokojové teplotě a pak se roztok pomocí hadičky přemístí do jiné nádoby. K takto získanému Grignardovu činidlu se přidá 4,0 g (15,9 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naftalenonu (sloučenina B) jako roztoku v 15 ml THF. Výsledný roztok se přes noc refluxuje, zchladí na pokojovou teplotu a reakce se zastaví opatrným přidáním ledem chlazené 10% HCI. Po extrakci pomocí EtO2 následuje promytí smíchaných organických vrstev vodou a nasyceným vodným NaCI a pak vysušení nad MgSO4. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a získá se olej, z kterého vznikne po chromatografii bezbarvá pevná látka jako produkt. (hexan/EtOAc, 96 : 4). 1H NMR (CDCI3): δ 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 7,6 Hz), 7,26 (3H, m), 7,12 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,24-2,04 (2H, m), 1,81 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1,35 (3H, s), 1,30 (3H, s).
3.4- dihydro-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaftalen (sloučenina D)
Nádoba opatřená Dean-Starkovým uzávěrem se naplní 3,4 g (9,85 mmol)
1.2.3.4- tetrahydro-1 -hydroxy-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaftalenem (sloučenina C) a 40 ml benzenu. Přidá se katalytické množství monohydrátu ptoluensulfonové kyseliny a výsledný roztok se zahřeje k varu na dvě hodiny. Po zchlazení na pokojovou teplotu se přidá EtO2 , roztok se promyje H2O, nasyceným vodným NaHCO3 , nasyceným vodným NaCI a pak vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku a sloupcovou chromatografii (100% hexan / silika gel) se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 7,32 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,21 (5H, m), 7,15 (1H, d, J = 2,1 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,30 (6H, s).
7-ethynyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaftalen-1 (2H)-one! (sloučenina E)
K roztoku (provzdušňovanému 15 minut proudem argonu) 7 g (27,6 mmol) 3,4dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naftalenonu (sloučenina B) v 150 ml triethylaminu se přidá 0,97 g (1,3 mmol) chloridu bis(trifenylfosfin)paladnatého a 0,26 g (1,3 mmol) jodidu měďného. Směs roztoku se provzdušňuje 5 minut argonem a pak se přidá 39 ml (36,6 mmol) trimethylsilyl)acetylenu. Reakční směs se uzavře v tlakové zkumavce a přemístí do předehřáté olejové lázně (100 °C) na 24 hodin. Reakční směs se pak přefiltruje přes celit, promyje EtO2 a filtrát se zakoncentruje pod tlakem za vzniku surové sloučeniny 7-(trimethylsilyl)ethynyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaftalen-1 (2H)-on. K roztoku této surové TMS-acetylenové sloučeniny v 50 ml methanolu se přidá 0,6 g (4,3 mmol) K2CO3. Směs se míchá 8 hodin při teplotě okolního vzduchu a pak se přefiltruje. Filtrát se za vakua zakoncentruje, zředí EtO2 , promyje vodou, 10% HCI a solankou, vysuší nad MgSO4 a za vakua zakoncentruje. Přečištění sloupcovou chromatografii (křemík, 10% EtOZc-hexan) dává vznik žádané sloučenině jako bílé pevné látce. PMR (CDCI3): δ 1,39 (6H, s), 2,02 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 7,0
Hz), 3,08 (1H, s), 7,39 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 91,8 Hz).
Ethyl-4-jodobenzoát
K suspenzi 10 g (40,32 mmol) 4-jodobenzoové kyseliny v 100 ml absolutního ethanolu se přidají 2 ml chloridu thionylu a směs se pak 3 hodiny refluxuje. Rozpouštědlo se odstraní za vakua a zbytek se rozpustí ve 100 ml etheru. Etherový roztok se promyje nasyceným NaHCO3 a nasyceným roztokem NaCI a vysuší (MgSO4). Rozpouštědlo se odstraní za vakua a zbytek se destiluje Kugelrohrovou destilací (100°C; 55 mm) za vzniku žádané sloučeniny jako bezbarvého oleje, PMR (CDCI3): δ 1,42 (3H, t, J = přibližně 7 Hz), 4,4 (2H, q, J = přibližně 7,0 Hz), 7,8 (4H).
kyselina 6-jodnikotinová
Jodid sodný (20,59 g, 137,40 mmol) se zchladí na -78°C v argonové atmosféře a pak se přidá kyselina jodovodíková (91,13 g, 759,34 mmol). Chladící lázeň se odstraní a suspenze se míchá 5 minut. K této směsi se přidá kyselina 6-chlomikotinová (22,09 g, 140,20 mmol) a výsledná směs se pomalu za míchání zahřívá při teplotě okolního vzduchu. Směs se refluxuje 24 hodin při 125°C, zchladí na teplotu okolního vzduchu a naleje do acetonu (500ml) při 0°C. Filtrací se nashromáždí žlutá pevná látka a promyje 200 ml roztoku 1N vodného NaHSO3. Rekrystalizací z methanolu (krystaly se promyjí ethyletherem) se získá žádaná sloučenina v podobě bílých krystalů: teplota tání 177179°C [teplota tání uvedená v literatuře - 187-192°C, Newcome a kol. “Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives” J. Org. Chem. 51: 953-954 (1986). 1H NMR (DMSO-d6): δ 8,81 (1H, dd, J = 0,8, 2,4 Hz), 8,01 (1H, dd, J = 0,8, 8,2 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,4, 8,2 Hz).
Ethyl 6-jodonikotínoát
K suspenzi kyseliny 6-jodnikotinové (23,38 g, 94,20 mmol) v dichlormethanu (100 ml) se přidá roztok 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidchloridu (19,86 g, 103,6 mmol) v dichlormethanu (250 ml). K této směsi se přidá ethanol (12,40 g, 269,27 mmol) a pak dimethylaminopyridin (1,15 g, 9,41 mmol). Směs se zahřeje na 50°C po dobu 24,5 hodin, zakoncentruje ve vakuu, zředí vodou (200 ml), pak se extrahuje ethyl etherem (550 ml). Smíchané organické fáze se promyjí nasyceným vodným NaCI, vysuší (MgSO4) a zakoncentrují za vzniku žluté pevné látky. Přečištěním pomocí mžikové chromatografie (křemík, 10% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě bílých jehliček: teplota tání 48-49°C; 1H NMR (CDCI3): δ 8,94 (1H, d, J = 2,1
Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,85 (1H, d, J = 7,1 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl4-K5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naftalenyllethvnyllbenzoát (sloučenina El
Ke 4 g (21,7 mmol) roztoku 7-ethynyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaftalen-1(2H)-on (sloučenina E) 15 minut provzdušňovanému proudem argonu se přidá 6 g (21,7 mmol) ethyl 4-jodbenzoátu v 100 ml triethylaminu, 5 g (7,2 mmol) chloridu bis(trifenylfosfin)paladnatého a 1,4 g (7,2 mmol) jodidu měďného. Směs se 5 minut provzdušňuje proudem argonu a pak míchá 18 hodin při teplotě okolního vzduchu. Reakční směs se pak přefiltruje přes celit a filtrát se zakoncentruje za vakua. Přečištěním pomocí mžikové chromatografie (křemík, 10% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě bílé pevné látky. PMR (CDCI3): δ 1,41 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,41 (6H, s), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,04 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,15 (1H, d, J = 1,8 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxv-2-naftalenyl) ethynyll benzoát (sloučenina G)
Ke zchlazenému roztoku (-78°C) 291,6 mg (1,59 mmol) amidu bis(trimethylsilyl)sodnému v 5,6 ml THF se přidá 500 mg (1,44 mmol) roztoku ethyl 4[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naftalenyl]benzoátu (sloučenina F) v 4,0 ml THF. Reakční směs se míchá 35 minut při -78°C a pak se přidá 601,2 mg (1,59 mmol) roztoku 5-chlor(2-bis-trifluormethylsulfonyl)imidu v 4 ml THF. Po 1 hodinové míchání při -78°C se roztok zahřeje na 0°C a míchá 2 hodiny. Reakce se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI. Směs se extrahuje EtAc (50 ml) a smíchané organické vrstvy se promyjí 5% vodným NaOH, vodou a slanou vodou. Organické fáze se vysuší pomocí Na2SO4 a pak zakoncentrují za vakua na žlutý olej. Přečištěním pomocí kolonové chromatografie (křemík, 7% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 8,04 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,60 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,51 (2H, m), 7,32 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,1
Hz), 6,02 (1H, t, J = 5,0 Hz), 2,44 (2H, d, J = 5,0 Hz), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H,
s)·
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynynbenzoát (sloučenina 1)
Roztok 4-lithiotoluenu se připraví přídavkem 189,9 mg (1,74 ml, 2,96 mmol) tbutyl lithia (1,7 M roztok v hexanu) do zchlazeného (-78°C) 4-bromtoluenu 253,6 mg (1,482 mmol) v 2,0 ml THF. Po 30 minutovém míchání se přidá 269,4 mg (1,977 mol) roztoku chloridu zinečnatého v 3,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na pokojovou teplotu, 30 minut míchá a pak se pomocí hadičky přidá 472,9 mg (0,988 mmol) ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina G) a 50 mg (0,04 mmol) tetrakis (trifenylfosfin)paladia v 4,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na 50°C na 45 minut, zchladí na pokojovou teplotu a zředí nasyceným vodným NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc (40 ml) a smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a solankou. Organická fáze se vysuší pomocí Na2SO4 a pak zakoncentrují za vakua na žlutý olej. Přečištěním pomocí kolonové chromatografie (křemík, 5% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-aceton): δ 1,35 (6H,s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,42 (3H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,25 (5H, m), 7,35 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz).
Ethyl 4-í(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-fenvl-2-naftalenvl)ethvnvl1benzoát (sloučenina 1a)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 203,8 mg (0,43 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 58,2 mg (0,36 ml, 0,69 mmol) fenyllithya (1,8 M roztok v cyklohexan(Et2O),
116,1 mg (0,85 mmol) chloridu zinečnatého a 13,8 mg (0,01 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia. PMR (CDCI3): δ 1,36 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,20 (1H, d, J =
1,5 Hz), 7,27 (1H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl] benzoát (sloučenina 2)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 284,8 mg (2,090 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 3-methylfenyl lithia (připraveného přídavkem 201,2 mg (1,86 ml, 3,14 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78OC) 3-methylbrombenzenu 274,0 mg (1,568 mmol) v 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,14 (7H, m), 5,99 (1H, t, 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methvlfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoát (sloučenina 3)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 200,0 mg (0,418 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 199,4 mg (1,463 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 4,0 ml THF a 2-methylfenyl lithia (připraveného přídavkem 133,9 mg (1,23 ml, 2,09 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 2-methylbrombenzenu 178,7 mg (1,045 mmol) ve 2,0 ml THF. 1H NMR (CDCI3): δ 7,97 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,49-7,19 (6H, m), 6,81 (1H, d, J = 1,6 Hz), 5,89 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,432,14 (2H, dq, J = 3,7, 5,4 Hz), 2,15 (3H, s), 1,39-1,34 (9H, m).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoát (sloučenina 4)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 249,0 mg (1,827 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 3,5-dimethylfenyl lithia (připraveného přídavkem 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 3,5-dimethylbrombenzenu 249,0 mg (1,305 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,33 (2H, m), 7,20 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,00 (1H, s), 6,97 (2H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, g. J = 7,1 Hz), 2,36 (6H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyll benzoát (sloučenina 5)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 249,0 mg (1,827 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 4-dimethylfenyl lithia (připraveného přídavkem 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-dimethylbrombenzenu 244,0 mg (1,305 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,42-7,24 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,71 (2H, q, J = 7,6 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-( 1,1 -dimethvl)fenyl)-2-naftalenyl)ethynyl] benzoát (sloučenina 6)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2thiazolyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití
142,4 mg (1,045 mmol) chloridu zinečnatého a 4-terc-butyllithia (připraveného přídavkem 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) terc-butyllithia (1,5 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-terc-buthylbrombenzenu 167,0 mg (0,78 mmol) v 1,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,28-7,45 (7H, m), 6,02 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,59 (3H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,35 (6H, s).
Ethyl 4-r(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorŤenvl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoát (sloučenina 7)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 249,0 mg (1,827 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 4-chlorfenyl lithia (připraveného přídavkem 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-chlor-1-brombenzenu 252,4 mg (1,305 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,27 (6H, m),
7,12 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyfenyl)-2-naftalenyl)ethynvllbenzoát (sloučenina 8)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl)ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 249,0 mg (1,827 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 4-methoxyfenyl lithia (připraveného přídavkem 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-methoxy-1-brombenzenu 244,1 mg (1,305 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,40-
7,21 (5H, m), 6,95 (2H, d, J = 8,7 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz),
4.34 (3H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dÍmethyl-8-(4-trifluormethylenyl)-2-naftalenyl) ethynyl] benzoát (sloučenina 9)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 249,0 mg (1,827 mmol) chloridu zinečnatého a 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 4-_trifluormethylfenyl lithia (připraveného přídavkem 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) terc-butyllithia (1,7 M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-trifluormethylbrombenzenu 296,6 mg (1,305 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54-7,36 (6H, m), 7,10 (2H, d, J = 1,6 Hz), 6,06 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoát (sloučenina 10)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 142,4 mg (1,045 mmol) chloridu zinečnatého a 2-lithiopyridinu (připraveného přídavkem 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) terc-butyllithia (1,5M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 4-brompyridinu 123,8 mg (0,784 mmol) ve 1,0 ml THF). 1H NMR (d6-aceton): Λ [ δ 8,64 (1H, m), 7,99 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,85(1 H, ddd, J = 1,8,
7,7, 9,5 Hz), 7, 58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,47 (2H, d, J = 1,1 Hz),
7.35 (2H, m), 6,32 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,42 (2H, d, J = 7,4 Hz),
1.35 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(3-pyridvl)-2-naftalenvl)ethvnyllbenzoát (sloučenina 11)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 170,0 mg (0,35 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 142,4 mg (1,045 mmol) chloridu zinečnatého a 3-lithiopyridinu (připraveného přídavkem 100,2 mg (0,92 ml, 1,56 mmol) terc-butyllithia (1,5M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 3-brompyridinu 123,8 mg (0,784 mmol) ve 1,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 8,63-8,61 (2H, dd, J = 1,7 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,67(1 H, dt, J = 7,9 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43-7,34 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,07 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,390 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
Ethyl 4-í(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5-pyridyl)-2-naftalenyl)ethynynbenzoát (sloučenina 12)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučeninal), 250,0 mg (0,522 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 142,4 mg (1,045 mmol) chloridu zinečnatého a 2-methyl-5-lithiopyridinu (připraveného přídavkem 100,5 mg (0,92 ml, 1,57 mmol) terc-butyllithia (1,7M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) a 2-methyl-5-lithiopyridinu 134,8 mg (0,784 mmol) ve 1,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 8,50 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,21 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,11 (1H, d. 1,5 Hz), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,63 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
r 80 .
Ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethvl)-dimethylsiloxy)fenyl-2naftalenyl)ethynyl]benzoát (sloučenina H)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)oxy-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina G), 150,0 mg (0,314 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 150,0 mg (1,10 mmol) chloridu zinečnatého, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 3-((2,2-dimethylethyl) dimethyl siloxy)fenyl lithia (připraveného přídavkem 100,2 mg (0,92 ml, 1,564 mmol) terc-butyllithia (1,7M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) a 3-((2,2dimethylethyl)dimethylsiloxy)fenyl lithia 226,0 mg (0,787 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCh): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 ((2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40-7,22 (4H, m), 6,95 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,84-6,82 (2H, m), 6,00 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (3H, s), 0,99 (9H, s), 0,23 (6H, s).
Ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxv)fenyl-2naftalenyl)ethynyllbenzoát (sloučenina I)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 210,0 mg (0,439 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 209,0 mg (1,53 mmol) chloridu zinečnatého, 24 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF a 4-((2,2-dimethylethyl) dimethylsiloxy) fenyl lithia (připraveného přídavkem 140,3 mg (1,30 ml, 2,19 mmol) terc-butyllithia (1,7M roztok v pentanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) a 4-((2,2-dimethylethyl) dimethylsiloxy)brombenzenu 315,0 mg (1,09 mmol) ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39-7,25 (3H, m), 7,21 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,87 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s), 1,01 (9H, s), 0,25 (6H, s).
Ethyl 4-r(516-dihydro-5,5-dimethvl-8-(3-hvdroxyfenvl)-2-naftalenvl)ethynvnbenzoát (sloučenina 13)
K 60,0 mg (0,114 mmol) roztoku ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2dimethyl)-dimethylsiloxy)fenyl-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina H) v 1,0 ml THF se za pokojové teploty přidá 91,5 mg (0,35 ml, 0,35 mmol) tetrabuthylamonium fluoridu (1M roztok v THF). Roztok se míchá přes noc, pak se zředí EtOAc, promyje H2O a nasyceným vodným NaCI a vysuší nad MgSO4. Rozpuštédla se odstraní za sníženého tlaku a následnou sloupcovou chromatografií (4:1, hexan:EtOAc) se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka.
1H NMR (CDCIa): δ 7,98 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,39-7,21 (4H, m), 6,93 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,84 (1H, d, J = 7,1 Hz), 6,83 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,91 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-((5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-hydroxyfenyl)-2-naftalenyl)ethynynbenzoát (sloučenina 14)
K 50,0 mg (0,095 mmol) roztoku ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2dimethyl)-dimethylsiloxy)fenyl-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina I) v 1,0 ml THF se za pokojové teploty přidá 73,2 mg (0,29 ml, 0,29 mmol) tetrabuthylamonium fluoridu (1M roztok v THF). Roztok se míchá přes noc, pak se zředí EtOAc, promyje H2O a nasyceným vodným NaCI a vysuší nad MgSO4. Rozpuštédla se odstraní za sníženého tlaku a následnou sloupcovou chromatografií (4:1, hexan:EtOAc) se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,41-7,20 (5H, m), 6,88 (2H, d, J = 8,4 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,34 (2H, t, J = 4,5 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-naftalenyl)ethynvl1benzoát (sloučenina 15)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina I) se přemění 264,1 mg (0,552 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-282 naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina G) na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 150,0 mg (1,10 mmol) chloridu zinečnatého, 14 mg (0,012 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 4,0 ml THF a 5-methylthiazol-2-yl lithia (připraveného přídavkem 53,2 mg (0,53 ml, 0,83 mmol) n-butyllithia (1,55M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 82,0 mg (0,83 mmol) 5-methylthiazolu v 5,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 7,99(2H, d, J = 7,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,55 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,54 (1H, s), 7,45 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,48 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,51 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, s),
1,32 (6H, s).
Ethyl 44(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoát (sloučenina 15a)
Roztok 2-lithiothiazolu se připraví přídavkem 41,2 mg (0,42 ml, 0,63 mmol) nbutyl-lithia (1,5 M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) thiazolu 53,4 mg (0,63 mmol) v 1,0 ml THF. Roztok se míchá 30 minut a pak se přidá 113,9 mg (0,84 mmol) chloridu zinečnatého v 1,5 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na pokojovou teplotu, míchá 30 minut a pak se pomocí hadičky přidá organozinek k roztoku 200,0 mg (0,42 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluoromethylsulfonyl)oxy-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu(sloučenina G) a 12,4 mg (0,01 mmol) tetrakis (trifenylfosfin)paladia v 1,5 ml THF. Výsledný roztok se zahřívá 45 minut při 50°, zchladí na pokojovou teplotu a zředí nasyceným vodným NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc (40 ml) a smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a solankou. Organická fáze se vysuší nad Na2SO4 a zakoncentruje ve vakuu na žlutý olej. Přečištěním sloupcovou chromatografií (křemík, 20%EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina ve formě bezbarvého oleje. PMR (CDCI3): δ 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,57 (1H, t, J = 4,8 Hz), 7,33 (1H, d, J =
3,3 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,92 (1H, d, J = 3,3Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazolyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoát (sloučenina 16)
Podle stejného postupu jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina I), 295,0 mg (0,617 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 168,0 mg (1,23 mmol) chloridu zinečnatého, 16 mg (0,014 mmol) tetrakis(trifenylfosfin) paladia v 6,0 ml THF a 4-methylthiazol-2-yl lithia (připraveného přídavkem 59,6 mg (0,60 ml, 0,93 mmol) n-butyllithia (1,55M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 92,0 mg (0,93 mmol) 4-methylthiazolu v 6 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 8,00(2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, s), 6,52 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,54 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,40 (3H, t, j =
7,2 Hz), 1,33 (3H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(4,5-dimethylthiazol)-2-naftalenyl) ethynyl] benzoát (sloučenina 17)
Stejným postupem jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina I), 200,0 mg (0,418 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 110,0 mg (0,84 mmol) chloridu zinečnatého, 12 mg (0,011 mmol) tetrakis(trifenylfosfin) paladia v 2,0 ml THF a 4,5-dimethylthiazol-2-yl lithia (připraveného přídavkem 40,2 mg (0,39 ml, 0,63 mmol) n-butyllithia (1,55M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 71,0 mg (0,63 mmol) 4,5-dimethylthiazolu v 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3): δ 8,00(2H, d, J = 8,4 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,33 (91H, d, J = 8,0 Hz), 6,45 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H, s), 2,40 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
44(5,6-dihydro-5,5-dimethvl-8-(2-methvl-5-pyridyl)-2-naftalenyl)ethvnvl]benzoová kyselina (sloučenina 18)
Roztok 81,7 mg (0,194 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5pyridyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 12) a 40,7 mg (0,969 mmol) LiOHH2O v 3 ml THF/voda (3:1, v/v) se míchá přes noc při pokojové teplotě. Reakce se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a slanou vodou, vysuší pomocí Na2SO4 a zakoncentruj'za vakua za vzniku žádané sloučeniny jako bezbarvé pevné látky. 1H
NMR (d6-DMSO): δ 8,41 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (1H, dd, J =
2,3, 7,9 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, m), 7,33 (1H, d, J = 7,8 Hz), 6,95 (1H,
s), 6,11 (1H, t, J = 4,5, Hz), 2,52 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,31 (6H, s).
4-í(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naftalenyl) ethynyll benzoová kyselina (sloučenina 19)
Roztok 80,0 mg (0,196 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 10) a 20,6 mg (0,491 mmol) LiOH-H2O v 3 ml THF/voda (3:1, v/v) se míchá přes noc při pokojové teplotě. Reakce se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou a slanou vodou, vysuší nad Na2SO4 a zakoncentruj za vakua za vzniku žádané sloučeniny jako bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-DMSO): δ 8,64(1 H, m), 7,94 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,87 (1H, dt, J = 1,7, 7,8 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,47 (2H, s), 7,37 (1H, m), 7,25 (1H, s), 6,30 (1H, t, J = 4,6 Hz),
2,39 (2H,d,J = 4,6 Hz) 1,31 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethvl-8-(3-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoová kyselina (sloučenina 20)
K roztoku 30,0 mg (0,071 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 2) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 N vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí se na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J =
8,5 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,46 (2H, s), 7,32-7,13 (4H, m), 7,10 (1H, s), 6,98 (1H, t, J = 4,5Hz), 2,34 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,30 (6H, s).
4-r(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-ethvlfenyl)ethvnvl]benzoová kyselina (sloučenina 21)
K roztoku 47,0 mg (0,108 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4ethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 5) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 N vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J =
8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29-7,21 (4H, m), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,5Hz), 2,64 (2H, q, J = 7,5 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,29 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,5 Hz).
4-í(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxvfenvl)-2-naftalenyl)ethynynbenzoová kyselina (sloučenina 22)
K roztoku 80,0 mg (0,183 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methoxyfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 8) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 40,0 mg (1,00 mmol, 1,0 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J =
8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45 (2H, s), 7,24 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,02-6,89 (3H, m), 5,98 (1H, t, J = 4,4Hz), 3,79 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,29 (6H, s).
4-1(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoová kyselina (sloučenina 23)
K roztoku 70,0 mg (0,148 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4trifluormethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 9) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,61-7,47 (6H, m), 6,97 (2H, s), 6,16 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,30 (6H, s).
4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoová kyselina (sloučenina 24)
K roztoku 90 mg (0,207 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5dimethylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 4) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením pomocí Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J =
8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,45 (2H, s), 7,00 (1H, s), 6,97 (1H, s), 5,97 (1H, t, J =
4,5 Hz), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 2,30 (6H, s), 1,29 (6H, s).
4-r(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorfenyl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoová kyselina (sloučenina 25)
K roztoku 80,0 mg (0,181 mmol) 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorfenyl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 7) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,48 (4H, m), 7,34 (2H, d, J = 8,4Hz), 6,97 (1H, s), 6,07 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(3-pyridyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoová_______kyselina (sloučenina 26)
K roztoku 45,0 mg (0,110 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 11) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 8,60 (1H, d, J = 4,6 Hz), 8,55 (1H, s), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,76 (1H, d, J = 7,5Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51-7,46 (3H, m), 6,94 (1H, s), 6,14 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,31 (6H, s).
4-r(5,6-dihydro-5,5-dimethvl-8-(2-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoová kyselina (sloučenina 27)
K roztoku 80,0 mg (0,190 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 3) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (DMSO): δ 7,89 (2H, d, J =
8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29-7,14 (4H, m), 6,59 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,39 (2H, m), 2,60 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,29 (3H, s).
4-((5,6-d i hydro-5,5-dimethyl-8-(3-hydroxyfeny I )-2-naftaleny I jethyny llbenzoová kysel i na (sloučenina 28)
K roztoku 40,0 mg (0,076 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2dimethyl)-dimethylsiloxy)fenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina H) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 40,0 mg (1,00 mmol, 1,00 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35 (2H, s), 7,15-7,07 (2H, m), 6,776,69 (3H, m), 5,92 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,25 (2H, d, j = 4,7 Hz), 1,23 (6H, s).
4-((5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(4-hydroxyfenvl)-2-naftalenvl)ethynyllbenzoová kyselina (sloučenina 29)
K roztoku 75,0 mg (0,143 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2dimethyl)-dimethylsiloxy)fenyl-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina I) v 3 ml EtOH a 2 ml THF se přidá 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M vodný roztok). Roztok se zahřívá 2 hodiny při 50°C, zchladí se na pokojovou teplotu a okyselí 10% HCI. Extrakcí s EtOAc, vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (2H, s), 7,20-7,17 (3H, m), 6,926,89 (2H, m), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,34 (6H, s).
44(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methvlthiazol-2-vl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoová kyselina (sloučenina 30)
K roztoku ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylrhiazol-2-yl)-2 naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 15) (100 mg, 0,23 mmol) se 4 ml EtOH se při pokojové teplotě přidá vodný NaOH (1 ml, 1M, 1 mmol). Výsledný roztok se zahřívá 1 hodinu při 50°C a zakoncentruje za vakua. Zbytek se rozsuspenduje v roztoku CH2CI2 a etheru (5:1) a okyselí na pH 5 pomocí 1M vodné HCI. Vrstvy se oddělí a organická vrstva se promyje slanou vodou, vysuší (Na2SO4), přefiltruje a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bílá pevná látka. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,96 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,95 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,64 (1H, s), 7,53 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,59 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,50 (3H, s), 2,69 )2H, d, J = 4,5 hz), 1,27 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoová kyselina (sloučenina 30a)
Roztok 33,9 mg (0,08 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 15a) a 8,5 mg (0,20 mmol) LiOH-H2O v 3 ml THF/voda (3:1, v/v) se míchá přes noc při pokojové teplotě. Reakce se ukončí přídavkem nasyceného vodného NH4CI a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou, slanou vodou, vysuší pomocí Na2SO4 a zakoncentrováním za vakua se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. PMR (d6-DMSO): δ 1,29 (6H, s), 2,42 (2H, d, J = 4,6 Hz), 6,68 (1H, t, J = 4,6 Hz), 7,51 (2H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,2 Hz ), 7,77 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (1H, d, J = 3,3 Hz).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methvlthiazol-2-yl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoová kyselina (sloučenina 31)
K roztoku ethyl 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol)-2-yl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 16) (145,0 mg), 0,34 mmol) a 4 ml EtOH se při pokojové teplotě přidá vodný NaOH (1 ml, 1M, 1 mmol). Výsledný roztok se zahřívá 1 hodinu při 50°C a zakoncentruje za vakua. Zbytek se rozsuspenduje v roztoku CH2CI2 a etheru (5:1) a okyselí na pH 5 pomocí 1M vodné HCI. Vrstvy se oddělí a organická vrstva se promyje slanou vodou, vysuší (Na2SO4), přefiltruje a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bílá pevná látka. 1H
NMR (d6-DMS0): δ 7,94 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,63 (2H, d, J =
8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,27 (1H, s), 6,58 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,43 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,26 (6H, s).
4-í(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naftalenyl) ethynyll benzoová kyselina (sloučenina 32)
K roztoku ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol)-2-yl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 17) (58,0 mg, 0,13 mmol) a 4 ml EtOH se při pokojové teplotě přidá vodný NaOH (1 ml, 1M, 1 mmol). Výsledný roztok se zahřívá 1 hodinu při 50°C a zakoncentruje za vakua. Zbytek se rozsuspenduje v roztoku CH2CI2 a etheru (5:1) a okyselí na pH 5 pomocí 1M vodné HCI. Vrstvy se oddělí a organická vrstva se promyje slanou vodou, vysuší (Na2SO4), přefiltruje a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina jako bílá pevná látka. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,94 (2H, d, J = 8,14Hz), 7,86 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,61 (2H, d, J =
8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,51 (1H, t, J = 4,9 Hz),
2,37 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,6 Hz), 2,32 (3H, s), 1,26 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naftalenyl) ethynyll benzoát (sloučenina 33)
Stejným postupem jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1) 170,0 mg (0,366 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 202,0 mg (1,48 mmol) chloridu zinečnatého, 24 mg (0,022 mmol) tetrakis(trifenylfosfin) paladia v 2,0 ml THF a 5-methyl-2-lithiothiofenu (připraveného přídavkem 58,6 mg (0,36 ml, 0,915 mmol) n-butyllithia (2,5M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C) 89,8 mg (0,915 mmol) 2-methylthiofenu ve 2,0 ml THF). 1H NMR (CDCI3); δ 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J =
8,2 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,74 (1H, q, J = 2,8 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s),
2,32 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
Ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoát (sloučenina 33a)
Stejným postupem jako je příprava ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1) 250,0 mg (0,52 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl) ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 186,8 mg (1,37 mmol) chloridu zinečnatého, 37,1 mg (0,03 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia a 2-lithiothiofenu (připraveného přídavkem 65,9 mg (0,69 ml, 1,03 mmol) n-butyllithia (1,5M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C)
86,5 mg (1,03 mmol) thiofenu v 1,0 ml THF). PMR (CDCIs) - δ 1,33 (6H, s), 1,36 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 6,25 (1H, t, J = 4,7 Hz),
7,13 (2H, m), 7,47 (4H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,5 Hz).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methvl-2-thienyl)-2-naftalenyl)ethynynbenzoová kyselina (sloučenina 34)
K roztoku 4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naftalenyl) ethynyljbenzoátu (sloučenina 33) (35,0 mg, 0,082 mmol) v 2 ml EtOH a 1 ml THF se při pokojové teplotě přidá vodný NaOH (1 ml, 1M, 1 mmol). Výsledný roztok se míchá přes noc při pokojové teplotě, a pak se okyselí 10% HCI. Extrakcí pomocí EtOAc, následným vysušením nad Na2SO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žáaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ 8,03 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,54-7,48 (3H, m), 6,89 (1H, m), 6,18 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,49 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (6H, s).
4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(2-thienvl)-2-naftalenyl)ethynvl1benzoová kyselina (sloučenina 34a)
Stejným postupem jako pro přípravu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)2-naftalenyl)ethynyl]benzoové kyseliny (sloučenina 30a), 70,0 mg (0,17 mmol) ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 33a) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 17,8 mg (0,42 mmol) LiOH v H2O. PMR (Č6-DMSO): δ 1,27 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,23 (1H, t, J = 4,9 Hz), 7,14 (2H, m), 7,38-7,56(4H, m), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,3 Hz).
5,6-dihydro-5,5-dimethvl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenkarboxvlová kyselina (sloučenina K)
Roztok 3,4-dihydro-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-bromonaftalenu (sloučenina D) (250,0 mg, 0,764 mmol) v 2,0 ml THF se zchladí na -78°C a pomalu se přidá tbutyllithium (1,68 mmol, 1,7 M roztok v petanu). Po 1 hodinovém míchání při -78°C se reakcí nechá 1 hodinu probublávat plynný CO2 (vznikající vypařováním suchého ledu a procházelící přes suchou zkumavku). Roztok se pak zahřeje na pokojovou teplotu a reakce se zastaví přídavkem 10% HCI. Následuje extrakce pomocí EtOAc, promytí smíchaných organických vrstev vodou a nasyceným vodným NaCI a vysušení nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku a promytí pevné látky hexanem se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 7,94 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,76 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,24 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl______4-n(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyllaminolbenzoát (sloučenina 35)
Roztok 170,0 mg (0,58 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenkarboxylové kyseliny (sloučenina K) 115,0 mg (0,70 mmol) ethyl 4aminobenzoátu, 145,0 mg (0,76 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu a 92,4 mg )0,76 mmol) 4-dimethylaminopyridinu v 6,0 ml DMF se míchá přes noc při pokojové teplotě. Přidá se ethylacetát a výsledný roztok se promyje vodou, nasyceným vodným NaHCO3, nasyceným vodným NaCI a pak vysuší nad MgSO4. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se sloupcovou chromatografií vyizoluje produkt jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,02 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,72 (2H, m), 7,65 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,52 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,48 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (4H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J =
4,9 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
4-[[(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonvnamino]-benzoová kyselina (sloučenina 36)
K roztoku 26,0 mg (0,06 mmol) ethyl 4-(((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyl]amino]-benzoátu (sloučenina 35) v 3,0 EtOH a 4,0 mITHF se přidá 240,1 mg NaOH (6,00 mmol, 3,0 ml 2M vodného roztoku). Po 72 hodinovém míchání při pokojové teplotě se reakce zastaví přídavkem 10% HCI. Extrakcí pomocí EtOAc, sušením orgenických vrstev nad MgSO4 a odstraněním rozpouštědela za sníženého tlaku vznikne pevná látka. Krystalizací z CH3CN se získá žádaná sloučenina v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-DMSO): δ 10,4 (1H, s), 7,91-7,81 (5H, m), 7,54 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (5H, s), 1,33 (6H, s).
Ethyl 4-(((5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methvl-fenyl)-2-naftalenvl)karbonynoxylbenzoát (sloučenina 37)
Roztok 25,0 mg (0,086 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenkarboxylové kyseliny (sloučenina K), 17,5 mg (0,103 mmol) ethyl 4hydroxybenzoátu, 21,4 mg (0.112 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimidhydrochloridu a 12,6 mg (0,103 mmol) 4-dimethylaminopyridinu v 2,0 ml DMF se míchá pres noc při pokojové teplotě. Přidá se ethylacetát a výsledný roztok se promyje vodou, nasyceným vodným NaHCO3 , nasyceným vodným NaCI a pak vysuší nad MgSO4. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se sloupcovou chromatografií vyizoluje produkt jako bledě žlutá pevná látka (10% EtOAc/hexan). 1H NMR (CDCI3): δ 8,08 (2H, d, J = 8,1 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (5H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,38 (3H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
2-trimethylsilylethyl 4-íí(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methvlfenyl)-2naftalenyljkarbonynoxyl-benzoát (sloučenina 38)
Roztok 93,5 mg (0,320 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenkarboxylové kyseliny (sloučenina K), 76,0 mg (0,319 mmol) 2trimethylsilylethyl-4-hydroxybenzoátu, 80,0 mg (0,417 mmol) 1-(3-dimethylamino propyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu a 51,0 mg (0,417 mmol) 4-dimethylamino pyridinu v 4,0 ml DMF se míchá přes noc při pokojové teplotě. Přidá se ethylacetát a výsledný roztok se promyje H2O, nasyceným vodným NaHCO3 , nasyceným vodným NaCI před vysušením nad MgSO4. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se sloupcovou chromatografií vyizoluje produkt jako bezbarvá pevná látka (5% EtOAc/hexan). 1H NMR (CDCI3): δ 8,08 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,26-7,18 (6H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,42 (2H, t, J =
8,4 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,39 (3H, s), 1,38 (6H, s), 0,09 (9H, s).
44[(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(4-methylfenvl)-2-naftalenyl)karbonynoxyl-benzoová kyselina (sloučenina 39)
Roztok 110,0 mg (0,213 mmol) 2-trimethylsilylethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-
8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyl]oxy]-benzoátu (sloučenina 38) a 167,3 mg tetrabutylamoniumfluoridu (0,640 mmol, 0,64 ml 1M roztok v THF) v 2,0 ml THF se míchá 22 hodin při pokojové teplotě. Přidá se ethylacetát a výsledný roztok se promyje H2O, nasyceným vodným NaHCO3, nasyceným vodným NaCI a vysuší nad MgSO4. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku a promytím zbytku pevné látky EtOAc a CH3CN se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ
8,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,06 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,35 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,25 (4H, m), 6,08 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,42 (2H, d, j = 4,7 Hz), 2,35 (3H, s), 1,39 (6H, s).
Ethyl 2-fluor-4-([(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenyl)karbonyllamino1-benzoát (sloučenina 40)
Roztok 115,0 mg (0,41 mmol) 5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenkarboxylové kyseliny (sloučenina K), 89,0 mg (0,49 mmol) ethyl 2-fluoraminobenzoátu, 102,0 mg (0,53 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridu a 65,0 mg (0,53 mmol) 4-dimethylaminopyridinu v 5,0 ml DMF se míchá 1 hodinu při 50°C a pak přes noc při pokojové teplotě. Přidá se ethylacetát a výsledný roztok se promyje H2O, nasyceným vodným NaHCO3 , nasyceným vodným NaCI před vysušením nad MgS04. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se sloupcovou chromatografií vyizoluje produkt jako bezbarvá pevná látka (20% EtOAc/hexan). 1H
NMR (CDCI3): δ 7,96 (1H, s), 7,89 (1H, t, J = 8,4 Hz), 7,70 (2H, m), 7,52 (1H, d, J = 1,9
Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (5H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1
Hz), 2,38 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
2-fluor-4-íí(5.6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyllaminoF benzoová kyselina (sloučenina 41)
K roztoku 41,6 mg (0,091 mmol) ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyl]amino]-benzoátu (sloučenina 40) v 2,0 ml EtOH a 2,0 ml THF se přidá 40,0 mg NaOH (1,00 mmol, 1ml 1M vodného roztoku). Po míchání za pokojové teploty přes noc se reakce zastaví přídavkem 10% HCI. Extrakcí pomocí EtOAc, vysušením organických vrstev nad MgSO4 vznikne po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku pevná látka. Krystalizací z CH3CN se získá žádaná sloučenina jako bledě žlutá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ 9,84 (1H, s), 7,94-7,83 (3H, m), 7,64 (1H, dd, J = 2,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,36 (3H, s), 1,35 (6H, s).
Ethyl 4-[[(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methvlfenyl)-2-naftalenyl) thiokarbonyllaminolbenzoát (sloučenina 42)
Roztok 110,0 mg (0,25 mmol) ethyl 4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyl]amino]-benzoátu (sloučenina 35) a 121,0 mg (0,30 mmol) [2,4-bis(4-methoxyfenyl)-1,3-dithia-2,4-difosfetan-2,4-disulfid] (Lawessonovo činidlo) v 12,0 ml benzenu se zahřívá se refluxuje přes noc. Po zchlazení na pokojovou teplotu se směs přefiltruje a filtrát se zakoncentruje za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se izoluje pomocí kolonové chromatografie (10 až 25% EtOAc/hexan) v podobě žluté pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 8,92 (1H, s), 8,06 (2H, t, J = 8,5 Hz), 7,88-7,70 (3H, m), 7,42 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,18 (4H, m), 6,03 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,56 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)thiokarbonyl]amino]benzoová kyselina (sloučenina 43)
K roztoku 84,0 mg (0,184 mmol) ethyl4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ihiokarbonyl]aminc]-benzoátu (sloučenina 42) v 2,0 ml EtOH
·. 1 { a 2,0 ml THF se přidá 60,0 mg NaOH (1,50 mmol, 1,5 ml 1M vodného roztoku). Po míchání za pokojové teploty přes noc se reakce zastaví přídavkem 10% HCI. Extrakcí pomocí EtOAc, vysušením organickáých vrstev nad MgSO4 vznikne po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku pevná látka. Krystalizací z CH3CN se získá žádaná sloučenina jako bledé žlutá pevná látka.
1H NMR (d6-aceton): δ 10,96 (1H, s), 8,05 (4H, m), 7,72 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,54 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,20 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,33 (3H, s), 1,35 (6H, s).
2-acetyl-6-bromnaftalen (sloučenina L)
Ke zchlazené (10°C) směsi 44,0 g (0,212 mol) 2-bromnaftalenu a 34,0 g (0,255 mol) chlotidu hlinitého v 400 ml nitrobenzenu se přidá 21,0 g (267 mmol) acetylchloridu. Mechanicky míchaná reakční směs se zahřeje na pokojovou teplotu a pak na 40°C po dobu 18 hodin. Po zchlazení na 0°C v ledové lázni se reakce zastaví přídavkem 12 M HCI (70 ml). Vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje vodou a zředí vodným Na2CO3. Kugelrohrovou destilací a následnou rekrystalizaci z 10% EtOAc-hexan se získá 23 g žádané sloučeniny jako nahnědlé pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 8,44 (1H, br, s), 8,04-8,10 (2H, m), 7,85 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,82 (1H, d, J =
8,8 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,8 Hz), 2,73 (3H, s).
6-brom-2-naftalenkarboxylová kyselina (sloučenina M)
K roztoku chlornanu sodného (62 ml, 5,52% ve vodě (w/w), 3,6 g, 48,18 mmol) a hydroxidu sodného (6,4 g, 160,6 mmol) v 50 ml vody se přidá roztok 2-acetyl-6bromnaftalenu (sloučenina L) 4 g (16,06 mmol) v 50 ml 1,4-dioxanu. Žlutý roztok se zahřívá 2 hodiny na 70°C v olejové lázni, zchladí na teplotu okolního vzduchu a extrahuje ethyletherem (2 χ 50 ml). Vodné vrstvy se zředí roztokem NaHSO3 (dokud roztok Kl jako indikátor nezůstane bezbarvý), a pak se okyselí (pH < 2) pomocí 1N kyseliny sírové za vzniku bílé sraženiny. Směs se extrahuje ethyletherem, smíchané organické fáze se promyjí nasyceným vodným NaCI, vysuší (MgSO4) a zakoncentrují za vzniku 3,54 g (88%) žádané sloučeniny jako pevné látky. 1H NMR (DMSO-d6): δ 8,63 (1H, br, s), 8,32 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,10 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,00-8,05 (2H, m), 7,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,8Hz).
Ethyl 6-brom-2-naftalenkarboxylát (sloučenina N)
K roztoku 6-brom-2-naftalenkarboxylové kyseliny (sloučenina M) 3,1 g, (12,43 mmol) v ethanolu (30 ml, 23,55 g, 511,0 mmol) se přidá 18M kyselina sírová (2 ml). Roztok se 30 minut refluxuje, zchladí se na pokojovou teplotu a reakční směs se rozdělí na pentan (100 ml) a vodu (100 ml). Vodní fáze se extrahuje pentanem (100 ml) a pak se smíchané organické vrstvy promyjí nasyceným vodným NaCI (100 ml), vysuší (MgSO4) a zakoncentrují za vzniku ne zcela bílé pevné látky. Přečištěním mžikovou chromatografií (křemík, 10% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina jako bílá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,58 (1H, br, s), 8,10 (1H, dd, J = 1,7, 9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 2 Hz), 7,83 (1H, d, J = 9 Hz), 7,80 (1H, d, J= 9 Hz), 7,62 (1H, dd, J = 2, 9 Hz).
Ethyl______(E)-4-[2-[5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naftalenyllethenvl1-benzoát (sloučenina O)
K roztoku 520,0 mg (2,00 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)naftalenonu (sloučenina B) a 510,0 mg (2,190 mmol) ethyl 4-vinylbenzoátu v 4,0 ml triethylaminu (šetrně odplyněný argonem po dobu 25 minut) se přidá 124,0 mg (0,40 mmol) tris(2-methylfenyl) fosfinu a následně 44,0 mg (0,20 mmol) octanu paladnatého. Výsledný roztok se zahřívá při 95°C po dobu 2,5 hodin, zchladí na pokojovou teplotu a zakoncentruje za sníženého tlaku. Přečištěním sloupcovou chromatografií (10% EtOAchexan) se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3) : δ 8,19 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (1H, d, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,20 (2H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz a 6H, s).
Ethyl (E)-4-r245,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2naftalenyllethenyll-benzoát (sloučenina P)
Ke zchlazenému roztoku (-78°C) 440,0 mg (2,40 mmol) bis(trimethylsilyl)amidu v
10,0 ml THF se přidá 700,0 mg (2,00 mmol) ethyl (E)-4-[2-[5,6,7,8-tetrahydro-5,5dimethyl-8-oxo-2-naftalenyl]ethenyl]-benzoátu (sloučenina O) jako roztoku v 25,0 ml
THF. Po 1,5 hodinovém míchání při -78°C se naráz přidá 960,0 mg (2,40 mmol) 2[N,Nbis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridinu. Po 30 minutách se roztok zahřeje na
0°C a míchá 3 hodiny. Reakce se zastaví přídavkem NH4CI a extrahuje EtOAc.
Smíchané extrakty se promyjí 5% vodným NaOH, vysuší (Na2SO4) a rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje pomocí kolonové chromatografie (7% EtOAc-hexan) jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3) : δ 8,04 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (1H, s), 7,49 (1H, d, J = 8,0 Hz),
7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,10 (1H, d, J = 16,4 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
Ethyl (E)-4-[2-[5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyllethenyn-benzoát (sloučenina 44)
Roztok 4-lithiotoluenu se připraví přídavkem 130,7 mg t-butyllithia (2,04 mmol);
1,20 ml 1,7M roztoku v pentanu) k roztoku 374,5 mg (2,20 mmol) 4-bromtoluenu v 2,5 ml THF při -78°C. Po 30 minutách se přidá 313,4 mg (2,30 mmol) ZnCI2 v 2,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na pokojovou teplotu, míchá 1,25 hodiny a pak se hadičkou přidá roztok 285,0 mg (0,590 mmol) ethyl (E)-4-[2-[5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl]ethenyl]-benzoátu (sloučenina P) a 29,0 mg (0,025 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF. Výsledný roztok se míchá při pokojové teplotě 1 hodinu a pak 2 hodiny při 55°C. Po zchlazení na pokojovou teplotu se reakce zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc. Smíchané organické extrakty se promyjí 5% vodným NaOH, nasyceným vodným NaCl, vysuší nad Na2SO4 a zakoncentrují za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje pomocí kolonové chromatografie (10% EtOAc/hexan) jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 7,96 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,47 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,43-7,16 (7H, s), 7,07 (1H, d, J = 16,3 Hz), 6,93 (1H, d, J = 16,3 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,41 (3H, s), 2,33 (1H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,33 (6H, s).
(E)-4-r2-[5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methvlfenvl)-2-naftalenyl]ethenyl]-benzoová kyselina (sloučenina 45)
K roztoku 65,0 mg (0,190 mmol) ethyl (E)~4-[2-[5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl]ethenyl]-benzoátu (sloučenina 44) v 4,0 ml THF se přidá 30,0 mg LiOH (0,909 mmol, 1,0 ml 1,1 M roztoku) a 1,0 ml MeOH. Roztok se zahřívá při 55°C po dobu 3 hodin, zchladí se na pokojovou teplotu a zakoncentruje za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v H2O a extrahuje hexanem. Vodná vrstva se okyselí na pH 1 pomocí 10% HCI a extrahuje pomocí Et2O. Smíchané organické vrstvy se promyjí nasyceným vodným NaCl, rozpustí v EtOAc za vzniku jasného roztoku a vysuší nad
Na2SO4 . Rozpouštědla se odstraní při sníženém tlaku za vzniku žádané sloučeniny jako bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,86 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,41 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,28 (1H, d, J =
16.5 Hz), 7,23 (4H, s), 7,08 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,07 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,31 (1H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
(E)-4-[2-(1,1-dimethvl-3-(4-methvlfenvl)-5-indenyl)ethynvl1benzoát (sloučenina 47)
Roztok 32,0 mg (0,178 mmol) 4-bromtoluenu v 1,0 ml THF se zchladí na -78°C a pomalu se přidá 24,0 mg t-butyllithia (0,375 mmol, 0,22 ml 1,7M roztok v pentanu). Žlutý roztok se míchá a po 30 minutách se přidá 29,8 mg (0,219 mmoi) ZnCI2 jako roztok v 1,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na pokojovou teplotu a po 30 minutách se přemístí do druhé láhve, obsahující 29,0 mg (0,062 mmol) ethyl 4-[2-(1,1 -dimethyl-3(trifluormethylsulfonyl)oxy-5-indenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina FF) a 2,9 mg (0,003 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 1,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřívá při 55°C po dobu 1 hodiny a pak se míchá při pokojové teplotě 4 hodiny. Reakce se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI a pak se extrahuje Et2O. Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným vodným NaCl, vysuší nad Na2SO4 a zakoncentrují za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje pomocí kolonové chromatografie (10% Et2OAc/hexan) jako bezbarvý olej. 1H NMR (300 MHz CDCh): δ 8,03 (2H, d, J =
8.5 Hz), 7,66 (1H, s), 7,58 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J =
7,9 Hz), 7,38 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,28 (2H, d, J = 9,0 Hz), 6,43 (1H, s), 4,40 (2H, q, J =
7,2 Hz), 2,43 (3H, s), 1,41 (3H, t; + 6H, s).
4-(2-(1,1-dimethyl-3-(4-methvlfenyl)-5-indenyl)ethynyl]benzoová kyselina (sloučenina 48)
K roztoku 10,0 mg (0,025 mmol) (E)-4-[2-(1,1-dimethyl-3-(4-methylfenyl)-5indenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 47) v 0,5 ml THF/H2O (3:1 v/v) s přidá 5,2 mg (0,12 mmol) LiOH H2O. Po 48 hodinovém míchání při pokojové teplotě se roztok extrahuje hexanem a vodná vrstva se okyselí nasyceným vodným NH4CI. Přidá se pevný NaCl a výsledná směs se extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se vysuší (Na2SO4) a zakoncentrují za sníženého tlaku za vzniku žádané sloučeniny jako bezbarvé pevné látky. 1H NMR (300 MHz, d6-DMSO): δ 7,95 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, m), 7,49 (3H, m), 7,30 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,61 (1H, s),
2,36 (3H, s), 1,36 (6H, s).
3-(4-bromthiofenoxy)propionová kyselina
K roztoku 1,44 g (35,7 mmol) NaOH ve 20,0 ml odplyněné vody (probublané argonem) se přidá 6,79 g (35,7 mmol) 4-bromthiofenolu. Výsledná směs se 30 minut míchá při pokojové teplotě. Druhá nádoba se naplní 2,26 g (16,3 mmol) K2CO3 a 15 ml odplyněné H2O. K tomuto roztoku se přidá ( po částech) 5,00 g (32,7 mmol) kyseliny 3brompropionové. Výsledný roztok uhličitanu draselného se přidá k roztoku thiolátu sodného a výsledná směs se míchá 48 minut při pokojové teplotě. Směs se přefiltruje a filtrát extrahuje benzenem a smíchané organické vrstvy se odstraní. Vodná vrstva se okyselí 10% HCI a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí nasyceným NaCI, vysuší nad MgSO4 a zakoncentrují za sníženého tlaku. Výsledná pevná látka rekrystalizuje z Et2O - hexan za vzniku žádané sloučeniny v podobě ne zcela bílých krystalu. 1H NMR (CDCI3): δ 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,4 Hz), 3,15 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,68 (2H, t, J = 7,3 Hz).
2.3- dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Roztok 3,63 g (13,9 mmol) 3-(4-bromthiofenoxy)propionové kyseliny v 60 ml methansulfonové kyseliny se zahřeje na 75°C na 1,5 hodiny. Po zchlazení na pokojovou teplotu se roztok zředí H2O a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí 2N vodným NaOH, H2O, nasyceným NaCI a pak se vysuší pomocí MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku vznikne žlutá pevná látka, z které se sloupcovou chromatografií vyizoluje produkt jako bledě žlutá pevná látka (3% EtOAchexan). 1H NMR (CDCI3): δ 8,22 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,48 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,17 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,24 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,98 (2H, t, J = 6,7 Hz).
2.3- dihydro-6-(2-trimethylsilylethynyl)-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Roztok 1,00 g (4,11 mmol) 2,3-dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyranu-4-on a
78,3 mg (0,41 mmol) Cul v 15,0 ml THF a 6,0 ml Et2NH se probublává 5 minut argonem. K tomuto roztoku se přidají 2,0 ml (1,39 g, 14,2 mmol) (trimethylsilyl)acetylenu a pak 288,5 mg (0,41 mmol) chloridu
100 bis(trifenylfosfin)paladnatého. Výsledný tmavý roztok se míchá 3 dny při pokojové teplotě, přefiltruje přes celitovou podušku, která byla promyta EtOAc. Žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (4% EtOAc-hexan) jako oranžový olej. 1H NMR (CDCI3): δ 8,13 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,19 (2H, d, J = 6,3 Hz), 2,91 (2H, d, J = 6,3 Hz), 0,21 (9H, s).
2,3-dihydro-6-ethynyl-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Roztok obsahující 600,0 mg (2,25 mmol) 2,3-dihydro-6-(2-trimethylsilylethynyl)(4H)-1-benzothiopyran-4-on a 100,0 mg (0,72 mmol) K2CO3 v 15 ml MeOH se se míchá 20 hodin při pokojové teplotě. Roztok se zředí H2O a extrahuje Et2O. Smíchané organické vrstvy se promyjí H2O, nasyceným NaCI a pak se vysuší nad MgSO4 . Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina v podobě oranžové pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 8,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,40 (1H, dd, J =
1,8, 8,2 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,22 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,08 (1H, s), 2,94 (2H, t, J = 6,3 Hz).
Ethyl 4-[2-(6-(2.3-dihydro-(4-)-1-benzothiopyran-4-onyl)ethynyllbenzoát
Roztok 405,0 mg (2,15 mmol) 2,3-dihydro-6-ethynyl-(4H)-1- benzothiopyran-4-on a 594,0 mg (2,15 mmol) ethyl 4-jodobenzoátu v 15 ml Et3N a 3 ml THF se probublává 15 minut argonem. K tomuto roztoku se přidá 503,0 mg (0,72 mmol) chloridu bis(trifenylfosfin)paladnatého a 137,0 mg (0,72 mmol) Cul. Tento roztok se míchá 20 hodin při pokojové teplotě a pak se přefiltruje přes celitovou podušku, která byla promyta EtOAc. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá hnědá pevná látka. Sloupcovou chromatografií (3% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina jako oranžová pevná látka. 1H NMR (d6- aceton): δ 8,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,40 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,96 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl 4-r2-(6-(4-(trifluoromethvlsulfonyl)oxy-(2H)-1-benzothiopyranyl)ethynyl]benzoát
K roztoku 221,9 mg (1,21 mmol) bis(trimethylsilyl)amidu sodného v 3,0 ml THF zchlazeného na -78°C se přidá 370,0 mg (1,10 mmol) ethyl 4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1benzothiopyran-4-onyl)ethynyl]benzoátu v 4,0 ml THF. Po 30 minutách se pomalu přidá
101 roztok 2-[N,N-bis(trifluotmethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridinu v 4,0 ml THF. Reakce se pomalu zahřeje na pokojovou teplotu a po 5 hodinách se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc a smíchané orgenické vrstvy se pak promyjí 5% vodným NaOH, H2O, nasyceným vodným NaCI a vysuší nadMgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se a následnou sloupcovou chromatografií (4% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina jako bledě žlutá pevná látka. 1H NMR (d6- aceton): δ 8,12 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,56 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,33 (1H, t, J = 5,7Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,82 (2H, d, J = 5,7 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl 4-[2-(6-(4-(methvlfenyl)-(2H)-1-benzothiopvranvl)ethynyllbenzoát (sloučenina 49) K roztoku 120,8 mg (0,70 mmol) 4-bromtoluenu v 2,0 ml THF se při -78°C přidá
88,4 mg (1,38 mmol, 0,81 ml 1,7M roztok v petanu) t- butyllithia. Po 30 minutách se přidá roztok 131,6 mg (0,97 mmol) ZnCI2 v 2,0 ml THF a výsledný bledě žlutý produkt se zahřeje na pokojovou teplotu. Po 40 hodinovém míchání se tento roztok přemístí do druhé nádoby, obsahující 129,2 mg (0,28 mmol) ethyl 4-(2-(6-(4(trifluormethylsulfonyl)oxy-(2H)-1 benzothiopyranyl)ethynyl]benzoátu, 14,0 mg (0,012 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia a 2,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřívá při 50°C po dobu 5 hodin, zchladí na pokojovou teplotu a zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc a smíchané organické vrstvy se pak promyjí H2O, nasyceným vodným NaCI, vysuší (MgSO4) a zakoncentrují na oranžový olej. Sloupcovou chromatografií (3-5% EtOAc-hexan) se získá žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka. 1H NMR (d6- aceton): δ 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44-7,38 (2H, m), 7,26-7,15 (5H, m), 6,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,53 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,37 (2H, s), 1,35 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-r2-(6-(4-(4-methylfenyl)-(2H)-1-benzothiopvranyl)ethynyll-benzoová kyselina (sloučenina 50)
K roztoku 29,0 mg (0,07 mmol) ethyl 4-[2-(6-(4-(methylfenyl)-(2H)-1benzothiopyranyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 49) v 2,0 ml THF a 2,0 ml EtOH se přidá 160,0 mg (4,00 mmol, 2,0 ml 2M vodný roztok)ČEHO??!!l. Výsledný roztok se míchá 2 hodiny při 35°C , pak se zchladí na pokojovou teplotu a míchá další 2 hodiny. Reakce se zastaví přídavkem 10% vodné Hel a extrahuje EtOAc. Smíchané orgenické
102 vrstvy se pak promyjí H2O, nasyceným vodným NaCl a vysuší nad Na2SO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá pevná látka, která se promyje CH3CN a vysuší za vysokého vakua za vzniku žádané sloučeniny jako bledě žluté pevné látky. 1H NMR (d6- DMSO): δ 7,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz),
7,40 (4H, m), 7,25-7,13 (4H, m), 7,02 (1H, d, J = 1,7 Hz), 6,11 (1H, t, J = 5,7Hz), 3,54 (2H, d, J = 5,7 Hz), 2,34 (3H, s).
3.4- dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naftalenon (sloučenina R); a 3,4-dihydro-4,4dimethyl-6-acetyl-1 (2H)-naftalenon (sloučenina S)
Ke zchlazené (0°C) směsi chloridu hlinitého (26,3 g, 199,0 mmol) v dichlormethanu (55 ml) se během 20 minut přidá acetylchlorid (15 g, 192 mmol) a
1.2.3.4- tetrahydro-1,1-dimethylnaftalen (24,4 g, 152 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Do reakční nádoby se přidá led (200 g) a směs se zředí etherem (400 ml). Vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje 10% HCI (50 ml), vodou (50 ml), 10% vodným hydrogenuhličitanem sodným, nasyceným vodným NaCl (50 ml) a vysuší nad MgSO4. Rozpouštědlo se odstraní destilací za vzniku žlutého oleje, který se rozpustí v benzenu (50 ml).
Ke zchlazenému roztoku (0°C) kyseliny octové (240 ml) a acetanhydridu (120 ml) se během 20 minut po malých částech přidá oxid chromový (50 g, 503 mmol). Směs se míchá 30 minut při 0°C a zředí benzenem (120 ml). Benzenový roztok připravený dříve se přidá pomocí přídavné nálevky a za míchání během 20 minut. Po 8 hodinách se reakce zastaví opatrným přídavkem izopropanolu (50 ml) při 0°C a následně vody (100 ml). Po 15 minutách se reakční směs zředí etherem (1100 ml) a vodou (200 ml) a pak se zneutralizuje pevným hydrogenuhličitanem sodným (200 g). Etherová vrstva se promyje vodou (100 ml) a nasyceným vodným NaCl (2 x 100 ml) a vysuší nad MgSO4. dstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku se získá směs izomemích diketonů, které se oddělí chromatograficky (5% EtOAc/hexan) (sloučenina R): 1H NMR (CDCI3): δ 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,41 (6H, s). (sloučenina S): 1H NMR (CDCI3): δ 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
103
3.4- dihydro-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1 (2H)-naftalenon (sloučenina II
Směs 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naftalenonu (sloučenina R) (140,0 mg, 0,60 mmol), ethylen glykolu (55,0 mgm 0,90 mmol), monohydrátu kyseliny ptoluensulfonové (4 mg) a benzenu (25 ml) se refluxuje 12 hodin v Dean-Starkově aparatuře. Reakce se zastaví přídavkem 10% vodného hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje etherem (2 x 75 ml). Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou (5 ml), nasyceným vodným NaCl (5 ml) a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina v podobě oleje. 1H NMR (CDCI3): δ 8,13 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,97-4,10 (2H, m), 3,70-3,83 (2,3H, m), 2,73 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,64 (3H, s), 1,39 (6H,s).
1.2.3.4- tetrahydro-1 -hydroxy-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3dioxolanyl)naftalen (sloučenina U)
K roztoku 195,4 mg (1,00 mmol) p-tolulymagnesiumbromidu (1,0 ml; 1M roztok v etheru) v 2 ml THF se přidá roztok 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3dioxolanyl))-1(2H)-naftalenonu (sloučenina T) 135,0 mg, 0,52 mmol) v 5 ml THF. Roztok se 16 hodin refluxuje, zchladí na pokojovou teplotu a zředí etherem (50 ml). Roztok se promyje vodou (5 ml), nasyceným vodným NH4CI (5 ml) a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku a sloupcovou chromatografií (5% EtOAc/hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ
7,37 (2H, d), 7,21 (1H, s), 7,13 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,08 (2H, d, J = 8,5 Hz), 3,88-3,99 (2H, m), 3,58-3,75 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,12-2,30 (2H, m), 1,79-1,90 (1H, m), 1,57 (3H, s), 1,48-1,58 (1H, m), 1,38 (3H, s), 1,31 (3H, s).
3,4 dihydro-1-(4-methylfenyl)-4l4-dimethyl-7-acetylnaftalen (sloučenina V)
Směs 1,2,3,4-tetrahydro-1 -hydroxy-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7 -(2-(2methyl-1,3-dioxolanyl)naftalenu (sloučenina U) 130,0 mg (0,38 mmol), monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (4 mg) a benzenu (5 ml) se 16 hodin refluxuje. Po zchlazení na pokojovou teplotu a reakční směs zředí etherem (100 ml) a 10% vodným hydrogenyhličitanem sodným, vodou a nasyceným vodným NaCl. Organická vrstva se
104 vysuší nad MgSO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina v podobě pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 7,83 (1H, dd, J = 1,8, 8,0 Hz),
7,66 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,3 Hz), 2,47 (3H, s), 2,47 (3H, s), 2,41 (3H, s), 2,37(2H, d, J = 6,3 Hz), 1,36 (6H, s).
(E)-3-(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl-2-butennitryl (sloučenina W)
K suspenzi NaH (48,0 mg, 2,00 mmol) v THF (6 ml) se přidá diethylkyanomethylfosfonát (450,0 mg, 2,50 mmol). po 40 minutách se přidá roztok 3,4 dihydro-1-(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-acetylnaftalenu (sloučenina V) 95,0 mg, (0,33 mmol) v THF (4 ml). Směs se míchá 16 hodin, zředí etherem (100 ml), promyje vodou, nasyceným vodným NaCI a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku a sloupcovou chromatografií (3% EtOAc/hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 7,39 (1H, d, j = 1 Hz), 7,32 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,20-7,25 (4H, široké s), 7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,44 (1H, s), 2,42 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 6 Hz), 2,35 (3H, s), 1,35 (6H, s).
(E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)-2-butenal (sloučenina X)
Ke zchlazenému roztoku (-78°C) (E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl-2-butennitrilu (sloučenina W) 84,0 mg, 0,29 mmol) v dichlormethanu (4 ml) se přidá 0,50 ml (0,50 mmol) diizobutylaluminiumhydridu (1M roztok v dichlormethanu). Po 1 hodinovém míchání se reakce zastaví přídavkem 2propanolu (1 ml) zředěným etherem (100 ml) při -78°C. Po zahřátí na pokojovou teplotu se roztok promyje vodou, 10% HCI a nasyceným vodným NaCI. Organická fáze se vysuší nad MgSO4 a odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá žádaná sloučenina v podobě oleje. 1H NMR (CDCI3): δ 10,12 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,43 (2H, s), 7,19-7,28 (5H, m), 6,27 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,03 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,42 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,37 (6H, s).
105
Ethyl (E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methvlfenyl)-2-naftalenyl)-
2,4,6-oktatrienoát (sloučenina 51)
Ke zchlazenému roztoku (-78°C) diethyl-(E)-3-ethoxykarbonyl-2methylallylfosforitanu [připraveného podle J.Org.Chem. 39: 821 (1974)] 264,0 mg, (1,00 mmol) v THF se přidá 26,0 mg (0,41 mmol, 0,65 ml) n-butyllithia v hexanu (1,6M roztok) a následně se přidá (E)-3-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenyl)-2-butenal (sloučenina X) 82,0 mg, 0,26 mmol) v THF (3 ml). Za 1 hodinu se reakční směs zředí etherem (60 ml), promyje vodou (5 ml), nasyceným vodným NaCI (5 ml) a vysuší nad MgSO4. Po odstranění rozpouštědel za sníženého tlaku a sloupcovou chromatografií (5% EtOAc/hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě oleje. 1H NMR (CDCI3): δ 7,36-7,43 (2H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 11,2, 15,2 Hz), 6,46 (1H, d, J = 11,2 Hz), 6,38 (1H, d, J = 15,2 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,78 (1H, s), 4,10 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,12 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,1 Hz).
(E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)-2,4,6oktatrienová kyselina (sloučenina 52)
K roztoku ethyl (E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2naftalenyl)-2,4,6-oktatrienoátu (sloučenina 51) 85,0 mg, 0,20 mmol) v THF (1 ml) a methanolu (1 ml) se přidá 12,0 mg (0,50 mmol) LiOH (0,5 ml, 1M roztok). Směs se 6 hodin míchá, zředí etherem (60 ml) a okyselí 10% HCI (1 ml). Roztok se promyje vodou, nasyceným vodným NaCI a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku se získá pevná látka, která se přečistí rekrystalizací z acetonu. 1H NMR (aceton-d6): δ 7,35-7,45 (2H, m), 7,19-7,28 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 11,5, 15,1 Hz), 6,48 (1H, d, J = 11,5 Hz), 6,42 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,82 (1H, s), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 hz), 2,32 (3H, s),
2,13 (3H, s), 1,32 (6H, s).
3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naftalenon (sloučenina Y)
K 1,7 ml (3,0g, 30,6 mmol, 18M) H2SO4 se pomalu při -5°C (lázeň led-NaCI) přidá 783,0 mg (4,49 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naftalenonu. Pomalu se přidá roztok 426,7 mg (6,88 mmol, 0,43 ml, 16M) HNO3 a 1,31 g (0,013 mol, 0,74 ml,
18M) H2SO4. Po 20 minutách se přidá led a výdledná směs se extrahuje EtOAc.
106
Smíchané organické extrakty se zakoncentrují za sníženého tlaku za vzniku zbytku, z kterého se žádaná sloučenina získá sloupcovou chromatografií (10% EtOAc/hexan) jako bledě žlutá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,83 (1H, d, J = 2,6 Hz), 8,31 (1H, dd,
J = 2,8, 8,9 Hz), 7,62 (1H, d, J = 8,7 Hz), 2,81 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,08 (2H, t, J = 6,5
Hz), 1,45 (6H, s).
3,4-dihydro-4l4-dimethyl-7-amino-1(2H)-naftalenon (sloučenina Z)
Roztok 230,0 mg (1,05 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naftalenonu (sloučenina Y) v 5,0 ml EtOAc se míchá 24 hodin při pokojové teplotě s katalytickým množstvím 10% Pd-C pod tlakem 1 atmosféra H2. Katalyzátor se odstraní filtrací přes celitovou podušku a filtrát se zakoncentruje za sníženého tlaku za vzniku žádané sloučeniny v podobě tmavě zeleného oleje. 1H NMR (CDCI3): δ 7,30 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,22 (1H, d, J = 8,4 Hz), 6,88 (1H, dd, J = 2,7, 8,5 Hz), 2,70 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,97 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl 4-((5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naftalenvl)azo1-benzoát (sloučenina AA)
K roztoku 198,7 mg (1,05 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl~7-amino-1(2H)naftalenonu (sloučenina Z) v 5,0 ml ledové kyseliny octové se přidá 180,0 mg (1,00 mmol) ethyl 4-nitrozobenzoátu. Výsledný roztok se míchá přes noc při pokojové teplotě a pak se zakoncentruje za sníženého tlaku. Produkt se vyizoluje sloupcovou chromatografií (15% EtOAc-hexan) ze zbývajícího oleje jako červená pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,57 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 8,6Hz), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,79 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,07 (2H, t, J = 7,02 Hz, 1,44 (6H, s), 1,42 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl 4-((5,6,-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethvlsulfonyl)oxv-2-naftalenyl)azo1benzoát (sloučenina BB)
K roztoku 90,4 mg bis(trimethylsilyl)amidu sodného (0,48 mmol, 0,48 ml 1,0M roztoku THF) v 2,0 ml THF se při -78°C přidá 153,0 mg (0,437 mmol) ethyl 4-((5,6,7,8tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naftalenyl)azo]-benzoátu (sloučenina AA) v 2,0 ml THF. Tmavý roztok se míchá 30 minut při -78°C a pak se přidá 204,0 mg (0,520 mmol) 2-[N,N-bis(triflormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridinu jako roztok v 2,0 ml THF.
107
Reakční směs se zahřeje na pokojovou teplotu a po 3 hodinách se zastaví přídavkem H2O. Organická vrstva se zakoncentruje za sníženého tlaku za vzniku červeného oleje. Produkt se vyizoluje sloupcovou chromatografií (25% EtOAc-hexan) jako červený olej. 1H NMR (CDCI3): δ 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (2H,m), 7,49 (1H, d, J = 8,2Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz, 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
Ethyl 4-[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)azol-benzoát (sloučenina 46a)
Roztok 4-lithiotoluenu se připraví přídavkem 62,9 mg (0,58 ml, 0,98 mmol) tbutyllithia (1,7M roztok v pentanu) k zchlazenému roztoku ( -78°C ) 84,0 mg (0,491 mmol) 4-bromtoluenu v 1,0 ml THF. Po 30 minutovém míchání se přidá roztok 107,0 mg (0,785 mmol) chloridu zinečnatého v 2,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřeje na pokojovou teplotu, 30 minut míchá a pak se pomocí hadičky přidá k roztoku 94,7 mg (0,196 mmol) ethyl 4-[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(triflormethylsulfonyl)oxy-2naftalenyl)azo]-benzoátu (sloučenina BB) a 25 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia v 2,0 ml THF. Výsledný roztok se zahřívá při 50°C po dobu 1,5 hodiny, zchladí se na pokojovou teplotu a zředí nasyceným vodným NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc (40 ml) a smíchané organické extrakty se promyjí vodou a solankou. Organická fáze se vysuší nad Na2SO4, zakoncentruje ve vakuu a žádaná sloučenina vyizoluje sloupcovou chromatografií (25% EtOAc-hexan) jako červená pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 hz), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[(5.6,-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)azo]-benzoová kyselina (sloučenina 46b)
K roztoku ethyl 4-[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl) azo]benzoátu (sloučenina 46a) 16,5 mg, 0,042 mmol) v THF (2 ml) a ethanolu (1 ml) se přidá 80,0 mg (2,00 mmol) NaOH (2,0 ml, 1M vodný roztok). Směs se míchá 12 hodin při pokojové teplotě, okyselí 10% HCI a extrahuje EtOAc. Smíchané organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným NaCI a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku za rekrystalizací zbytku z EtOAc/hexan se získá žádaná sloučenina
108 jako červená pevná látka. 1H NMR (aceton-d6): δ 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,92 (2H, d,
J = 8,5 Hz), 7,88 (2H, dd, J = 2,1, 6,1 Hz), 7,66 (1H, s), 7,64 (2H, d, J = 2,3 Hz), 7,28 (4H, d, J = 3,0 Hz), 6,089 (1H, t, J = 2,1, 6,1 Hz), 7,66 (1H, s), 7,64 (2H, d, J = 2,3 Hz),
7,28 (4H, d, J = 3,0 Hz), 6,09 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,39 (3H, s),
1,40 (6H, s).
6-(2-trimethylsilyl)ethvnvl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1 H-inden-1 -on (sloučenina CC)
K roztoku 518,0 mg (3,41 mmol) 6-brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1 H-inden-1-on (viz Smith a kol. Org. Proced. Int. 1978 10 123-131) v 100 ml odplyněného Et3N ( probublaného argonem 20 minut) se přidá 259,6 mg (1,363 mmol) jodidu měďného,
956,9 mg (1,363 mmol) chloridu bis(trifenylfosfin) paladnatého a 3,14 mg (34,08 mmol) trimethylsilylacetylenu. Tato směs se zahřívá při 70°C po dobu 42 hodin, zchladí na pokojovou teplotu, přefiltruje pres podušku silikagelu a promyje etherem. Filtrát se promyje vodou, 1M HCI, vodou a nakonec nasyceným vodným NaCI a poté vysuší nad MgSO4. Zakoncentrováním roztoku za sníženého tlaku a následné sloupcovou chromatografii (silika gel; 10%Et2O-hexan) se získá žádaná sloučenina v podobě hnědého oleje. 1H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,79 (1H, d, J = 1,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 1,6, 8,3 Hz), 7,42 (1H, d, J = 8,5 Hz), 2,60 (2H, s), 1,41 (6H, s), 0,26 (9H, s).
6-ethynyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1 H-inden-1-on (sloučenina DD)
K roztoku 875,0 mg (3,41 mmol) 6-(2-trimethylsilyl)ethynyl-2,3-dihydro-3,3dimethyl-1 H-inden-1-on (sloučenina CC) v 28 ml MeOH se naráz přidá 197,3 mg (1,43 mmol) K2CO3 . Po 6 hodinovém míchání za pokojové teploty se směs přefiltruje přes celitovou podušku a filtrát se zakoncentruje za sníženého tlaku. Zbylý olej se nanese na silikagelovou kolonu a eluuje 5% EtOAc-hexan za vzniku žádané sloučeniny v podobě bezbarvého oleje. 1H NMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,82 (1H, s), 7,72 (1H, dd, J = 1,6, 7,8 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,11 (1H, s), 2,61 (2H, s), 1,43 (6H, s).
Ethyl 4-[2-(5,6-dihvdro-5,5-dimethvl-7-oxo-2-indenvl)ethynyllbenzoát (sloučenina EE)
Roztok 280,0 mg (1,520 mmol) 6-ethynyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1 H-inden-1on (sloučenina DD) a 419,6 mg (1,520 mmol) ethyl 4-jodobenzoátu v 5 ml Et3N se probublá argonem 40 minut. K tomuto roztoku se přidá 271,0 mg (1,033 mmol) trifenylfosfinu, 53,5 mg (0,281 mmol) jodidu měďného a 53,5 mg (0,076 mmol) chloridu bis(trifenylfosfin)paladnatého. Výsledná směs se refluxuje 2,5 hodiny,zchladí na
109 pokojovou teplotu a zředí Et2O. Po filtraci pres celitovou podušku se filtrát promyje H2O, 1M HCI, H2O a nasyceným vodným NaCI, pak vysuší nad MgSO4 a zakoncentruje za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (15% EtOAc-hexan) v podobě bleděžluté pevné látky. 1H NMR (300 MHz, d6-aceton): δ 8,05 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,87 (1H, dd, J = 1,4, 8,1 Hz), 7,75 (2H, m), 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (2H, s), 1,45 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl 4-(2-( 1,1 -dimethvl-3-(triflormethyl-sulfonyl)oxv-5-indenyl)ethvnyllbenzoát (sloučenina FF)
K roztoku 88,0 mg (0,48 mmol) bis(trimethylsilyl)amidu sodného v 0,5 ml THF zchlazenému na -78°C se přidá 145,0 mg (0,436 mmol) ethyl 4-(2-(5,6-dihydro-5,5dimethyl-7-oxo-2-indenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina EE) jako roztoku v 1,0 ml THF. Po 30 minutách se přidá 181,7 mg (0,480 mmol) 2-(N,N- bis(trimethansulfonyl)amino)-
5-chlor-pyridinu jako roztoku v 1,0 ml THF. Reakce se pomalu zahřeje na pokojovou teplotu a po 5 hodinách se zastaví přídavkem nasyceného vodného NH4CI. Směs se extrahuje EtOAc, smíchané organické vrstvy se promyjí 5% vodným NaOH, H2O a nasyceným vodným NaCI, pak vysuší (MgSO4 ) a zakoncentruje za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (10% EtOAc-hexan) v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (300 MHz, d6-aceton): δ 8,05 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,63 (2H, s), 7,55 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s), 1,37 (3H, t, J= 7,1 Hz).
4-[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoová kyselina (sloučenina 60)
Roztok 142,6 mg (0,339 mmol) ethyl 4-((5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1) a 35,6 mg (0,848 mmol) LiOH-H2O v 12 ml THF/voda (4:1, v/v) se míchá přes noc při pokojové teplotě. Reakční směs se extrahuje hexanem a hexanová frakce se extrahuje 5 % vodným NaOH. Vodné vrstvy se smíchají a okyselí 1M HCI, a pak extrahují EtOAc a Et2O. Smíchané organické vrstvy se vysuší nad Na2SO4 a zakoncentrují ve vakuua a vznikne žádané sloučenina v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,91 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,47 (2H, s), 7,23 (4H, q, J = 8,1 Hz), 7,01 (1H, s), 6,01 (1H, t, J =
4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,30 (6H, s).
110
4-[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-fenyl-2-naftalenyl)ethynynbenzoová kyselina (sloučenina 60a)
Stejným postupem jako pro přípravu 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)2-naftalenyl)ethynyl]benzoové kyseliny (sloučenina 30a), 27,0 mg (0,07 mmol) ethyl 4[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-fenyl-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1a) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití 5,9 mg (0,14 mmol) LiOH v H2O. PMR (d6-DMSO): δ 1,31 (6H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,5 Hz), 6,05 (1H, t, J = J = J = 4,5 Hz), 7,00 (1H, s), 7,33 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,44 (4H, m), 7,59 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,1 Hz).
4-r(5.6,-dihvdro-5,5-dimethvl-8-(4-(1,1-dimethyl)fenyl-2-naftalenyl)ethvnvl]benzoová kyselina (sloučenina 61)
Roztok 80,0 mg (0,173 mmol) ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1dimethyl)fenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 6) a 18,1 mg (0,432 mmol) LiOH-H2O v 6 ml THF/voda (3:1, v/v) se míchá přes noc při pokojové teplotě. Reakční směs se extrahuje hexanem, zbývající vodná vrstva se okyselí 1M HCI a pak extrahuje EtOAc. . Smíchané organické vrstvy se vysuší nad Na2SO4 a zakoncentrují ve vakuu za vzniku žádané sloučeniny v podobě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (d6-DMSO): δ 7,82 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44 (6H, m), 7,25 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, tm, J = 4,6 Hz), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (9H, s), 1,29 (6H, s).
Ethyl 2-flor-4-í(5,6,-dihydro-5,5-dimethvl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)thiokarbonvl] aminol-benzoát (sloučenina 62)
Roztok 54,4 mg (0,119 mmol) ethyl 2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)karbonyl]amino]-benzoátu (sloučenina 40) a 57,7 mg (0,143 mmol) [2,4-bis(4-mrethoxyfenyl)-1,3-dithia-2,4-disulfid] (Lawessonovo činidlo) v 12 ml benzenu se refluxuje přes noc. Po zchlazení na pokojovou teplotu se směs přefiltruje a filtrát se zakoncentruje za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (10 až 25% EtOAc/hexan) v podobě žluté pevné látky. 1H NMR (CDCh): δ 9,08 (1H, s), 7,92 (1H, br s), 7,90 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,66 (1H, dd, J = 2,0, 6,0 Hz),
7,38 (3H, m), 7,18 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
111
2-flor-4-n(516,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylfenyl)-2-naftalenyl)thiokarbonyll aminolbenzoová kyselina (sloučenina 63)
K roztoku 46,5 mg (0,098 mmol) ethyl 2-flor-4-[[(5,6,-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)thiokarbonyl]amino]-benzoátu (sloučenina 62) v 1,0 ml EtOH a 1,0 ml THF se přidá 55 mg NaOH (1,4 mmol) a 1,0 ml H2O. Po míchání za pokojové teploty přes noc se přidá EtOAc a reakce se pak ukončí přídavkem 10% HCI. Po extrakci EtOAc následuje promytí smíchaných organických vrstev H2O, nasyceným vodným NaCI a sušení nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku se po krystalizaci z CH3CN získá žádaná sloučenina jako bledě žlutá pevná látka. 1H NMR (d6-aceton): δ 11,05 (1H, s), 8,02 (1H, m), 7,99 (1H, t, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, m), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 6,1 Hz), 7,52 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,21 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,33 (3H, s), 1,36 (6H, s).
Ethyl 5,,6,-dihydro-5’,5’-dimethvl-8-(4-methylfenvl)-[2,2,-binaftalen]-6-karboxvlát (sloučenina 64)
Roztok 3,4-dihydro-1 -(4-methylfenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaftalenu (sloučenina D) 0,45 g, 1,40 mmol) a THF (2,1 ml)se přidá k hořčíkovým pilinám (0,044 g, 1,82 mmol) při pokojové teplotě a v argonové atmosféře. Přidají se dvě kapky ethylendibromidu a roztok, který pomalu přechází v zakalený a žloutne, se zahřeje k refluxu na 1,5 hodiny. Do druhé nádoby se přidá chlorid zinečnatý (0,210 g, 1,54 mmol), který se za vysokého vakua roztaví, zchladí na pokojovou teplotu a rozpustí v THF (3 ml). Do druhé nádoby se přidá Grignardovo činidlo a po 30 minutách se přidá roztok ethyl 6-brom-2-naftalenkarboxylátu (sloučenina N) 0,293 g, (1,05 mmol) a THF (2 ml). V třetí nádobě se připraví roztok Ni(PPh3)4 a THF následovně: k roztoku NiCI2(PPh3)2 (0,82 g, 1,25 mmol) a PPh3 (0,66 g, 2,5 mmol) v THF (3,5 ml) se přidá 1M roztok diizobutylaluminiumhydridu a hexanu (2,5 ml, 2,5 mmol) a výsledný roztok se zředí THF na celkový objem 15 ml a míchá při pokojové teplotě 15 minut. Do druhé nádoby se v 15 minutových intervalech přidají tři 0,60 ml alikvoty roztoku Ni(PPh3). Výsledná suspenze se míchá 2 hodiny při pokojové teplotě. Reakce se zastaví přídavkem 5 ml 1N vodného HCI a míchá 1 hodinu před extrakcí produktu octanem ethylnatým. Organické vrstvy se smíchají, promyjí solankou, vysuší (MgSO4), přefiltrují a rozpouštědlo se odstraní za vakua. Zbytek krystalizuje z hexanu za vzniku 130 mg
112 čisté látky. Matečný roztok se zakoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se přečistí chromatografií na silika gelu (95:5-hexan: octan ethylnatý) za vzniku dalších 170 mg žádané sloučeniny (celkový výtěžek = 300 mg, 64%) jako bezbarvé pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 8,57 (s, 1H), 8,05 (dd, 1H, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,84-7,95 (překrývající se d, 3H), 7,66 (dd, 1H, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,58 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,43 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,32 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,04 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 4,44 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,39 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 1,45 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 1,39 (s, 6H).
S^-dihydro-S^-dimethyl-S-M-methylfenylj-re^-binaftalenl-e-karboxylová kyselina (sloučenina 65)
Roztok ethyl 5’,6’-dihydro-5’,5’-dimethyl-8’-(4-methylfenyl)-[2,2’-binaftalen]-6karboxylátu (sloučenina 64) (0,19 g, 0,43 mmol), EtOH (8 ml) a 1N vodný NaOH (2 ml) se zahřívá při 60°C po dobu 3 hodin. Roztok se zchladí na 0°C a okyselí 1N vodným HCI. Produkt se extrahuje do octanu ethylnatého, organické vrstvy se smíchají, promyjí solankou, vysuší (MgSO4), přefiltrují a rozpouštědlo se odstraní za vakua. Zbytek krystalizuje ze směsi THF/octan ethylnatý při 0°C za vzniku 35 mg čisté látky. Matečný roztok se zakoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se přečistí chromatografií na silika gelu (100% octan ethylnatý) za vzniku 125 mg žádané sloučeniny (celkový výtěžek = 160 mg, 90%) jako bezbarvé pevné látky. 1H NMR (DMSO-d6): δ 8,57 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,967,82 (překrývající se d, 3H), 7,65 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 7,9Hz), 7,28 (s, 1H,), 7,26 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,01 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 3,34 (br s, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,31 (d, 2H, J = 4,5 Hz), 1,31 (s, 6H).
Ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethy-8-(2-furyl)-2-naftalenyl)ethynyllbenzoát (sloučenina 66)
Stejným postupem jako pro přípravu ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4methylfenyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoátu (sloučenina 1), 250,0 mg (0,52 mmol) ethyl
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naftalenyl)ethynyl] benzoátu (sloučenina G) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) za použití
142,4 mg (1,045 mmol) chloridu zinečnatého 24,1 mg (0,02 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)paladia a 2-lithiofuranu (připraveného přídavkem 53,4 mg (0,52 ml, 0,78 mmol) n-butyllithia (1,5M roztok v hexanu) ke zchlazenému roztoku (-78°C)
113
53,4 mg (0,784 mmol) furanu v 1,0 ml THF). PMR (CDCI3): δ 1,32 (6H, s), 1,41 (3H, t,
J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 5,0 Hz), 4,39 ( 2H, q, J = 7,1 Hz), 6,41 (1H, t, J = 5,0Hz),
6,50 (1H, s), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,49 (1H, s), 7,57 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,63 (1H, d, J = 1,7 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,2 Hz).
4-[(5,6-dihvdro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naftalenyl)ethynyl1benzoová kyselina (sloučenina 67)
Stejným postupem jako je příprava 4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2naftalenyl)ethynyl]benzoové kyseliny (sloučenina 30a), ethyl 4-[(5,6-dihydro-5,5dimethyl-8-(2-furyl)-2-naftalenyl)ethynyl]benzoát (sloučenina 66) se přemění na žádanou sloučeninu (bezbarvá pevná látka) použitím 16,0 mg (0,38 mmol) LiOH v H2O. PMR (d6- DMSO): δ 1,26 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,41 (1H, t, J = 4,9 Hz),
6,60 (2H, m), 7,45-7,53 (3H, m), 7,64 (2H, d, j = 8,3 Hz), 7,75 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,93 (2H, d. J = 8,3 Hz).
3.4- dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naftalenon (sloučenina 100C) a 3,4-dihydro-
4.4- dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naftalenon (sloučenina 100D)
Ke zchlazené směsi (0°C) chloridu hlinitého (26,3 g, 199,0 mmol) v dichlormethanu (55 ml) se během 20 minut přidá acetylchlorid (15 g, 192 mmol) a
1.2.3.4- tetrahydro-1,1-dimethylnaftalen (24,4 g, 152 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Směs se zahřeje na teplotu okolního vzduchu a míchá 4 hodiny. Do reakční nádoby se přidá led (200 g) a směs se zředí etherem (400 ml). Vodné a organické vrstvy se oddělí a organická fáze se promyje 10% HCI (50 ml), vodou (50 ml)10% vodným hydrgenouhličitanem sodným a nasyceným vodným NaCl (50 ml) a vysuší nad MgSO4. Rozpoiuštědlo se odstraní destilací za vzniku žlutého oleje, který se rozpustí v benzenu (50 ml).
Ke zchlazenému roztoku (0°C) kyseliny octové (240 ml) a acetanhydridu (120 ml) se během 20 minut po malých částech v argonové atmosféře přidá oxid chromový (50 g, 503 mmol). Směs se míchá 30 minut při 0°C a zředí benzenem (120 ml). Během minut se během míchání a pomocí přídavné nálevky přidá připravený roztok benzenu. Po 8 hodinách se reakce zastaví opatrným přídavkem izopropanolu (50 ml) při 0°C a následně vody (100 ml). Po 15 minutách se reakční směs zředí etherem (1100 ml) a vodou (200 ml) a pak zneutalizuje pevným ughličitanem sodným (200 g).
114
Etherová vrstva se promyje vodou (100 ml) a nasyceným vodným NaCl (2 x 100 ml) a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku se získá směs izomerních diketonů, které se oddělí chromatograficky (5% EtOAc/hexan) (sloučenina 100C): 1H NMR (CDCh): δ 8,55 (1H, d, j = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6Hz), 1,41 (6H, s). (sloučenina 100 D): 1H NMR (CDCI3): δ 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1Hz), 1,44 (6H, s).
3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl)-1 (2H)-naftalenon (sloučenina 100E)
Roztok 1,80 g (8,34 mmol) 1:5 směsi 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)naftalenonu (sloučenina 100C); a 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naftalenonu (sloučenina 100D) v 50 ml benzenu se smíchá s 517,7 mg (8,34 mmol) ethylen glykolu a 20,0 mg (0,11 mmol) monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové. Výsledný roztok se 18 hodin refluxuje, zchladí na pokojovou teplotu a zakoncentruje za sníženého tlaku. Žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (10%EtOAc-hexan) jako bezbarvý olej. 1H NMR (CDCI3): δ 8,01 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,51 (1H, s), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz), 4,07 (2H, m), 3,79 (2H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,5Hz), 2,04 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,67 (3H, s),1,46 (6H, s).
1,2,3,4-tetrahydro-1 -hydroxy-1 (4-methoxyfenyl)- 4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3dioxolanyl)naftalenon (sloučenina 100F)
K roztoku 496,25 mg (2,54 mmol) p-tolylmagnesiumbromidu v 20 ml THF (2,54 ml; 1M roztok v etheru) se přidá roztok 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3dioxolan-yl)-1(2H)-naftalenonu (sloučenina 100E, 200,0 mg, 0,769 mmol) v THF (5 ml). Roztok se refluxuje 16 hodin, zchladí na pokojovou teplotu, promyje vodou, nasyceným vodným NH4CI a vysuší nad MgSO4. Odstraněním rozpouštědla za sníženého tlaku a sloupcovou chromatografií (10% EtOAc/hexan) se získá žádaná sloučenina ve formě bezbarvé pevné látky. 1H NMR (CDCI3): δ 7,49 (1H, d, j = 1,7 Hz), 7,19 (2H, m), 7,10 (2H, d, J = 7,9 Hz), 7,04 (1H, d, J = 8,2Hz), 4,05 (2H, m), 3,80 (2H, m), 2,34(3H, s),
2,21 (1H, m), 2,10 (1H, m), 1,88 (1H, m), 1,65 (3H, s), 1,54 (1H, m), 1,39 (3H, s), 1,33 (3H, s).
115
3.4- dihydro-1(4-methoxyfenyl)- 4,4-dimethyl-6-acetylnaftalen (sloučenina 100G)
Roztok 1,2,3,4-tetrahydro-1 -hydroxy-1 )4-methylfenyl)- 4,4-dimethyl-6-(2-(2methyl-1,3-dioxolanyl)naftalenu (sloučenina 100F 160,0 mg, 0,52 mmol), monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové (4 mg) a 30 ml benzenu se refluxuje 12 hodin. Po zchlazení na pokojovou teplotu se reakční směs zředí etherem (100 ml), promyje 10% vodným hydrogenuhličitanem sodným, vodou a nasyceným vodným NaCI. Organická vrstva se vysuší nad MgSO4 a rozpouštědla za odstraní za sníženého tlaku za vzniku žádané sloučeniny, která se vyizoluje sloupcovou chromatografií (10% EtOAc/hexan) a získá se žlutý olej. 1H NMR (CDCI3): δ 7,97 (1H, d, j = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz),
7,22 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,10 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,59 (3H, s), 2,40 (3H, s),
2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[3-oxo-3-(7,8-dihydro-5-(4-methylfenyl)-8,8-dimethyl-2-naftalenyl)-1-propenyl]benzoová kyselina (sloučenina 101)
K roztoku 3,4-dihydro-1 (4-methoxyfenyl)- 4,4-dimethyl-6-acetylnaftalenu (sloučenina 100G) v 4,0 ml MeOH se přidá 53,1 mg (0,354 mmol) 4karboxybenzaldehydu a 80 mg (2,00 mmol; 2,0 ml 1M vodného NaOH). Výsledný roztok se míchá při pokojové teplotě 12 hodin, zakoncentruje za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí v EtOAc. Na roztok se působí 10% HCI, organická vrstva se promyje H2O, nasyceným vodným NaCI a vysuší nad Na2SO4. Odstraněním rozpouštědel za sníženého tlaku vznikne žádaná sloučenina jako bezbarvá pevná látka, která se přečistí rekrystalizací z CH3CN.1H NMR (aceton-d6): δ 8,00 (7H, m), 7,83 (1H, d, J =
15,6 Hz), 7,24 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,38 (3H, s), 1,41 (6H, s).
3.4- dihydro-1 -fenyl-4,4-dimethvl-6-acetylnaftalen (sloučenina 100H)
K roztoku 508,0 mg(1,95 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3dioxolanyl)-1 (2H)-naftalenonu (sloučenina 100E) v 10 ml THF se přidá 496,2 mg (2,54 mmol; 2,54 ml 1M roztoku v Et2O) fenylmahnesiumbromidu. Výsledný roztok se refluxuje 8 hodin, přidá se H2O a v zahřívání se pokračuje dalších 30 minut. THF se odstraní za sníženého tlaku a vodný zbytek se extrahuje pomocí EtOAc. Smíchané organické vrstvy se vysuší (MgSO4), zakoncentrují za sníženého tlaku a žádaná
116 sloučenina se vyizoluje za zbytku sloupcovou chromatografií (10% EtOAc-hexan) jako bezbarvý olej. 1H NMR (CDCI3): δ 7,97 (1H, d, j = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 2,1, 8,0
Hz), 7,34 (5H, m), 7,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, d, J = 4,6 Hz), 2,59 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,38 (6H, s).
4-F3-oxo-3-(718-dihydro-5-fenyl-8,8-dimethyl-2-naftalenyl)-1-propenvl]-benzoová kyselina (sloučenina 103)
K roztoku 115,0 mg (0,42 mmol) 3,4-dihydro-1-fenyl-4,4-dimethyl-6acetylnaftalenu (sloučenina 100H) a 65,0 mg (0,43 mmol) kyseliny 4-formyl-benzoové v 5,0 ml EtOH a 1,0 ml THF se přidá 120,0 mg (3,00 mmol); 3,0 ml 1M vodný roztok) NaOH. Výsledný žlutý roztok se míchá 12 hodin při pokojové teplotě. Roztok se okyselí 6% vodnou HCI a extrahuje EtOAc.
Smíchané organické vrstvy se vysuší (MgSO4), zakoncentrují za sníženého tlaku a žádaná sloučenina se vyizoluje sloupcovou chromatografií (50% EtOAc-hexan) jako bledě žlutá pevná látka. 1H NMR (CDCI3): δ 8,13 (2H, d, J = 7,7 Hz), 8,04 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,75 (3H, m), 7,60 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,35 (5H, m), 7,14 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,2 Hz), 2,41 (2H, d, J = 4,2 Hz), 1,41 (6H, s).
Metoda zvyšování účinku jaderných receptorových agonistů
Bylo uvedeno, že podskupina retinoidních antagonistů, vykazujících negativní hormonální aktivitu, se může použít pro zvýšení biologické aktivity jiných retinoidů a receptorové superrodiny steroidních hormonů. Tyto jiné retinoidy a hormony steroidní receptorové superrodiny mohou být buď endogenní hormony nebo farmaceutická činidla. Proto například v použití v kombinaci s retinoidním negativním hormonem se mohou určití farmaceutičtí retinoidní antagonisté stát aktivnější pro vyvolávání specifických biologických účinků. Tato možnost kombinace lékového podání může výhodně minimalizovat nežádoucí vedlejší účinky farmaceutických retinoidů, protože se mohou použít nižší dávky farmaceutických retinoidů se zvýšeným účinkem.
Přesněji, bylo uvedeno, že AGN 193109 a syntetické retinoidy se strukturou uvedenou na obrázku 1, mají zvláštní a nečekané farmakologické aktivity. AGN 193109 vykazuje vysokou afinitu k RAR podtřídě jaderných receptorů bez aktivace těchto receptorů nebo stimulace transkripce retinoidních odpovídajících genů. AGN 193109
117 naopak inhibuje aktivaci RAR pomocí retinoidních agonistů, a proto se chová jako retinoidních antagonista.
Navíc, bylo uvedeno, že retinoidní negativní hormony se mohou použít bez současného podání retinoidního agonisty nebo streroidního hormonu pro kontrolu určitých symptomů onemocnění. Přesněji, retinoidní negativní hormony zde uvedené mohou snižovat vysokou hladinu základní transkripce genů, které jsou zodpovědné za nenavázané RAR. Například, nekontrolované buněčné dělení vyplývá z aktivity genů zodpovědných za nenavázané RAR, pak se genová aktivita může snížit podáním retinoidního negativního hormonu, který inaktivuje RAR. Buněčné dělení závislé na aktivitě nenavázaných RAR se tak může inhibovat negativním hormonem. Inhibice nenavázaných RAR se může dosáhnout běžnými antagonisty.
Důležité je, že bylo zjištěno, že AGN 193109 může potlačit základní aktivitu RAR a někdy může také zvyšovat aktivity jiného retinoidu a agonistů superrodiny steroidních receptářových hormonů. V souvislosti s vynálezem se negativním hormonem, jako je AGN 193109 zvyšuje účinek hormonálního agonisty v přítomnosti nagativního hormonu, snížená koncentrace agonisty vyvolá v podstatě stejnou kvantitativní odpověď, jaké se dosáhne pouze agonistou. Kvantitativní odpověď se může například měřit vzhledem k odpovídajícímu genu in vitro. Terapeutický retinoid, který vyvolá žádanou odpověď, pokud se použije v určitém množství nebo koncentraci, zvyšuje účinek pomocí AGN 193109, v kombinaci s AGN 193109 se může použít nižší množství nebo koncentrace terapeutického retinoidu k dosažení podstatě stejného účinku jako větším množstvím nebo koncentrací terapeutického retinoidu použitého samostatně. Výčet agonistů, jejichž účinek se může zvýšit pomocí AGN 193109, zahrnuje RAR agonisty, agonisty receptoru pro vitamín D, agonisty pro glukokortikoidový receptář a agonisty pro receptor tyroidního hormonu. Přesněji, specifičtí antagonisté, jejichž účinek se může zvýšit, zahrnují : ATRA, kyselinu 13-cisretinovou, syntetického RAR antagonistu AGN 191183, 1,25-dihydroxyvitamin D3, dexametazon a thyroidní hormon (3,3’,5-trijodotyronin). Uvádí se zde také způsob, který se může použít pro určení jiných hormonů, které mohou zvyšovat účinek současným podáním s AGN 193109.
AGN 193109 se tak nechová podle očekávání odpovídajícímu samostatnému retinoidnímu antagonistu, ale jako negativní hormon, který může zvyšovat aktivity různých členů rodiny jaderných receptářů. Uvádí se také možný mechanismus, kterým
118 lze vysvětlit negativní hormonální aktivitu a schopnost AGN 193109 zvyšovat aktivity jiných jaderných receptorových ligandů. Mechanismus zahrnuje známé části, podílející se na signálních cestách, v závislosti na retinoidech a navíc zahrnuje nové negativní regulační složky.
Odborníci pracující v této oblasti ocení to, že RAR s vysokou afinitou pro vazbu AGN 193109 jsou transkripčními faktory, které regulují expresi různých retinoidních odpovídajících genů. Cis-regulační DNA vazebná místa pro RAR byla nalezena vedle genů, které jsou transkripčně regulovány v závislosti na retinoidu. RAR, vážící se na taková místa, jako je DNA, známé jako oblasti odpovídající kyselině retinové, (RARE) jsou již dobře známy. Důležité je, že RARE váží heterodimery sestávající z RAR a RXR. RXR složky heterodimerových funkcí podporují vysokou afinitní interakci mezi RAR/RXR heterodimetem a RARE (Mangelsdorf a kol. The Retinoid Receptors v The Retinoids: Biology, Chemistry a Medicine, 2 . vydání, eds. Sporn a kol., Raven Press, Ltd., New York 1994).
Jak je podrobně popsáno níže, zjištění týkající se negativní hormonálníaktivity AGN 193109 jsou ve shodě s mechanismem zahrnujícím interakci domělého nagativního koaktivátorového proteinu (NCP) s RAR. Podle předpokládaného mechanismu je tato interakce stabilizována pomocí AGN 193109.
Výsledky dále ukazují, že AGN 193109 může regulovat nitrobuněčnou dostupnost NCP pro interakci s jadernými receptory jinými než jsou RAR, které jsou obsazeny AGN 193109. Z toho vyplývá, že AGN 193109 může podporovat transkripční regulační cesty, zahrnující jaderné receptory, které s RAR sdílejí schopnost vazby s NCP. Vzhledem k tomu, AGN 193109 vykazuje schopnost měnit rozmanitost jaderných receptorových cest, aktivitu, kterou nelze předvídat u běžného retinoidního antagonisty. Vzhledem k tomu je AGN 193109 užitečný jako činidlo pro zvyšování aktivity jaderných receptorových ligandů, zahrnujících endogenní hormony a předepsaná léčiva. Tento specifický postup ukazuje obecný princip, kterým jakýkoli jaderný receptor negativního hormonu zvyšuje aktivitu jiných jaderných receptorů, které kompetetivně vážou NCP.
Přestože mohou být v praxi nebo při testování vynálezu použity jiné látky a metody ekvivalentní popsaným, jsou popsány výhodné způsoby a látky. Hlavní odkazy na metody, které se mohou použít při různých možnostech zacházení s nukleovými kyselinami a popsané postupy je možno nalézt v Molecular Cloning: 4 Laboratory Manual (Sambrook a kol. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) a Current Protocols
119 in Molecular Biology (Ausubel a kol. eds., Greene Publishing Associates and WileyInterscience 1987). Následuje popis experimentů a výsledků, které vedly k vynálezu.
Příklad 6 popisuje použité způsoby které dokazují, že AGN 193109 váže každý ze tří RAR s vysokou afinitou, ale neaktivuje genovou expresi závislou na retinoidů.
Příklad 6
AGN 193109 váže RAR s vysokou afinitou, ale neatransaktivuje genovou expresi závislou na retinoidů.
Lidské receptory RAR-a, RAR-β a RAR-γ se samostatně exprimují jako rekombinantní proteiny za použití baculovirového expresního systému přesně podle metody popsané Allegretem a kol. v J. Biol. Chem. 268:26625 (1993). Rekombinantní receptorové proteiny se odděleně použily pro určení vazebné afinity AGN 193109 za použití [3H]-ATRA diplacement assay popsaného Heymanem a kol. v Cell 68:397 (1992). Disociační konstanty (Kd) se určily podle postupu popsaného Chengem a kol. v Biochemical Pharmacoiogy 22:3099 (1973).
AGN 193109 byla také testována na schopnost transaktivace RAR v CV-1 buňkách přechodně kotransfektovaných RAR expresním vektorem a odpovídajícím retinoidním genovým konstruktem. Receptorové expresní vektory pRShRAR-α (Giguere a kol. Nátuře 330:624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook a kol. Nátuře 333:669 (1988)) a pRShRAR-γ (Ishikawa a kol. Mol. Endocrinol. 4:837 (1990)) se odděleně kotransfektovaly pomocí reportního plazmidu AMTV-TREp-Luc. Použití tohoto luciferázového reportního plazmidu je popsáno Heymanem a kol. v Cell 68:397 (1992). AMTV-TREp-Luc plazmid je zcela shodný s AMTV-TREp-CAT reportním konstruktem popsaným Umesonem a kol. v Nátuře 336:262 (1988), s tou výhradou, že reportní gen pro chloramfenikol acyltransferázu (CAT) byl zastoupen polynukleotidovou sekvencí kódující luciferázu světlušky. Transfekce CV-1 buněk opice zelené se provedla použitím koprecipitační metody pomocí fosforečnanu vápenatého popsané v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook a kol. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). CV-1 buňky v hustotě 4 x 104/jamku se přenesly do 12 řadových destiček a přechodně se transfektovaly sraženinou fosforečnanu vápenatého obsahujícího 0,7 μς reportního plazmidu a 0,1 μg receptorovího plazmidu podle standardních laboratorních postupů. Po 18 hodinách se buňky promyly pro odstranění sraženiny a přidalo se Dulbeccem modifikované Eaglovo medium (DMEM) (Gibco), obsahující 10% hovězí
120 sérum extrahované pomocí aktivního uhlí (Gemini Bio-Products). Buňky reagovaly 18 hodin pouze s rozpouštědlem (ethanol) nebo AGN 193109 (10'9 až lO^M). Buněčný lyzát se připravil v 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Lusiferázová aktivita se měřila podle popisu Wet a kol. v Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987), za použití luciferinu světlušky (Analytical Luminiscence Laboratory) EG&G Berholdovým 96-jamkovým luminometrem. Uváděné luciferázové hodnoty představují průměrnou hodnotu ± SEM trojího stanovení.
Z výsledků uvedených v tabulce 11 vyplývá, že AGN 193109 váže RAR-α, RARβ i RAR^y s vysokou afinitou, ale neaktivuje genovou expresi závislou na retinoidu. Přesněji, AGN 193109 všechny tri receptory s Kd hodnotou v rozmezí 2-3 nM. Pro tuto pevnou vazbu AGN 193109 neaktivuje genovou expresi ve srovnání s indukcí stimulovanou pomocí ATRA. Vzhledem k tomu byla polovina maximální účinné koncentrace AGN 193109 (EC5o) neměřitelná. Bylo také zjištěno, že AGN 193109 má neměřitelnou afinitu pro RXR, což není v tabulce uvedeno.
TABULKA 11
Vazba AGN 193109 a transaktivace RAR
RAR RAR RAR
ECso (nM) Neaktivní Neaktivní Neaktivní
Ka (nM) 2 2 3
Příklad 7 popisuje použité metody, které odkazují, že AGN 193109 je antagonistou genové exprese závislé na ATRA.
Příklad 7
Inibice transaktivace RAR pomocí ATRA závislé na AGN 193109
Schopnost AGN 193109 působit proti ATRA zprostředkované RAR aktivaci byla zkoumána na buňkách CV-1 kotransfektovaných koprecipitační metodou pomocí fosforečnanu vápenatého podle Sambrooka a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Eukaryotické expresní vektory pRShRAR-α (Giguere a kol. Nátuře 330:624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook a kol.
121
Nátuře 333:669 (1988)) a pRShRAR-γ (Ishikawa a kol. Mol. Endocrinol. 4:837 (1990) se kotransfektovaly pomocí ÁMTV-TREp-Luc reportního plazmidu popsaného Hollenbergem a kol. (Cell 55:899 (1988)). Za povšimnutí stojí, že reportní plazmid obsahoval dvě kopie TRE-palindromické odpovídající části. Transfekce pomocí fosforečnanu vápenatého se prováděla přesně podle popsaného příkladu 6. K buňkám se na 18 hodin_přidalo pouze rozpouštědlo (ethanol), ATRA (10’9 až W6 M), AGN 193109 (10'9 až W6 M), nebo W8 M ATRA v kombinaci s AGN 193109 (10’9 až W6 M). Měření buněčných lyzátů a luciferázové aktivity se provádělo podle příkladu 6.
Výsledky těchto postupů jsou zřejmé z obrázku 2A až 2F, kde hodnoty luciferázy jsou uvedeny jako průměrná hodnota ± SEM trojího stanovení. Přesněji, výsledky uvedeny na obrázcích 2A, 2C a 2E ukazují, že stimulace transfektovaných buněk pomocí ATRA vedlo k dávce projevující se zvýšením luciferázové aktivity. To potvrdilo, že ATRA aktivovalo všechny tři RAR v experimentálním systému a tím se vytvořil základ pro porovnání při detekci aktivity antagonisty. Grafické výdsledky, vyjádřené v obrázcích 2B, 2D a 2F ukazují, že spolupůsobení transfektovaných buněk s 10 nM ATRA a zvýšení koncentrací AGN 193109 vedlo k inhibici luciferázové aktivity. Přesněji, stejná dávka AGN 193109 a ATRA měla za následek více než 50% inhibici vzhledem k samostatnému ATRA pro všechny tři RAR subtypy. Srovnáním odpovědí na různé dávky ATRA v přítomnosti různých koncentrací AGN 193109 znamená, že ATRA je kompetetivně inhibován AGN 193109. Je třeba si uvědomit, že horizontální osy všech grafů zobrazených v obrázku 2 představují logaritmus koncentrace retinoidů. Výsledky potvrdily, že AGN 193109 je silným antagonistou RAR.
Pak byly provedeny experimenty pro vysvětlení mechanismu dokládajícího antagonní aktivitu AGN 193109. Odbornici pracující v této oblasti ocení, že aktivace jaderného receptorů pravděpodobně zahrnuje konformační změnu receptorů, který se indukuje navázáním ligandu. Výsledky proteázového protekčního měření skutečně potvrdily, že jaderní hormonální agonisté a antagonisté způsobují, že receptorové proteiny zaujímají různé konformace. (Keidel a kol. Mol. Cell. Biol. 14:287 (1994); Allan a kol. J. Biol. Chem. 267:19513 (1992)). Toto měření bylo použito pro určení, zda AGN 193109 a ATRA způsobují různé konformace RAR-σ. AGN 193583, RAR-σ selektivní antagonista se použil jako pozitivní kontrola u níž je známá antagonní specifická proteázová citlivost.
122 i : : i
Příklad 8 popisuje jeden způsob, který byl použit pro detekci konformačních změn u RAR-σ, způsobených vazbou AGN 193109. Jak je uvedeno níže, výsledky tohoto postupu nečekaně ukázaly, že AGN 193109 vedla ke vzoru trypsinové citlivosti, která byla v podstatě identická s indukovanou ATRA, agonistou RAR a na rozdíl od indukce RAR antagonistou. Na základě tohoto výsledku se předpokládá, že AGN 193109 navozuje podmínky odlišné od jiných retinoidních antagonistů.
Příklad 8
Proteázová protekční analýza
Plazmid upravený na vektor pGEM3Z (Pharmacia) a obsahující RAR-α cDNA (Giguere a kol. Nátuře 330:624 (1987)), byl použit v souvislosti s TNT-sdruženým retikulocytovým lyzátem transkripčně-translačního systému in vitro pro (Promega) pro přípravu [35S]-methioninem značeného RAR-α. Omezené proteolytické štěpení značeného RAR-α proteinu se provedlo podle metody popsané Keidelem a kol. v Mol. Cell. Biol. 14:287 (1994). Alikvoty retikulocytárního lyzátu obsahující [35S]-methioninem značený RAR-α byly inkubovány s ATRA, AGN 193583 nebo AGN 193109 na ledu 45 minut v celkovém objemu 9μΙ. Konečná koncentrace retinoidů ve všech pokusech byla 100 nM ATRA a AGN 193109 a 1000 nM AGN 193583. Rozdíl mezi konečnými koncentracemi retinoidů byl založen na přibližně 10 násobném rozdílu v relativních afinitách ATRA a AGN 193109 (s Kd pro RAR - 2 a 10 nM) a AGN 193583 (s Kd pro RAR - > 100 nM). Po vazbě ligandu byl do směsi přidán přibližně 1 μΙ koncentrovaného trypsinu pro konečné koncentrace 25, 50 nebo 100 μg/ml. Vzorky se inkubovaly 10 minut při pokojové teplotě a trypsinové štěpení se zastavilo přídavkem SDS- pufru pro vzorky. Provedla se elektroforéza vzorků na polyakrylamidovém gelu a autoradiografie podle standardních postupů.
Agonista i antagonista vedli k různým vzorům trypsinové citlivosti, které se lišily od výsledku získaného štěpením nenavázaného receptorů. Autoradiografické výsledky ukazují, že koncentrace trypsinu 25, 50 a 100 μο^Ι zcela štěpí radioaktivně značený
RAR-α během 10 minut při pokojové teplotě v nepřítomnosti přidaného retinoidů.
Předchozí navázání ATRA vedlo k objevu dvou hlavních k proteáze rezistentních druhů. Předchozí navázání RAR-α selektivního antagonisty AGN 193583 se objevil k proteáze rezistentní druh , který měl nižší molekulovou hmotnost než předchozí s
123 předem navázaným ATRA. Tento výsledek ukazuje, že retinoidní agonista a antagonista vedou ke konformačním změnám, detekovatelným podle změněn citlivostí na trypsin.
Překvapivě, předběžné navázání AGN 193109 vedlo k proteázově ochrannému vzoru, který byl nerozlišitelný od případu předběžného navázání ATRA.
Výsledky uvedené výše potvrzují, že AGN 193109 váže RAR-α a mění jeho konformaci. Zajímavé je, že podstata těchto konformačních změn se více podobá těm, které vyplývají z vazby agonisty (ATRA), než těm změnám, které jsou způsobeny vazbou antagonisty (AGN 193583). Jasně řečeno, mechanismus na AGN 193109 závislého antagonismu je jedinečný.
Předpokládal se možný mechanismus, kterým by se vysvětlila antagonní aktivita AGN 93109. Přesněji, použila se standardní metoda, kdy se s pomocí gelu zjistí, zda AGN 193109 zabraňuje vzniku heterodimeru RAR/RXR nebo inhibuje interakci mezi RAR a jeho příbuzným vazemným místem na DNA.
Příklad 9 popisuje měření na základě elektroforetické pohyblivosti použité pro důkaz toho, že AGN 193109 neinhibuje dimerizaci RAR/RXR, ani vazbu dimerů na cílovou DNA.
Příklad 9
Analýza pomocí gelu
Translace RAR-α in vitro proběhla přesně podle popisu příkladu 8, pouze ^Sznačený methionin se vynechal. Translace RAR-α in vitro proběhla podobně použitím vektoru na bázi pBluescript (ll)(SK), obsahujícím RAR-α cDNA, popsanou Mangelsdorfem a kol. v Nátuře 345:224-229 (1990), jako templát pro tvorbu transkriptů in vitro. Značený RAR-α a RAR-α samostatně nebo v kombinaci nebo s předběžně navázaným AGN 193109 (W6 M) samostatně nebo v kombinaci interagoval s koncově značeným DR-5 RARE dvouřetězcovým oligonukleotidem o sekvenci 5’TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3’ (SEQ ID NO:1). U vazebné směsi se provedla elektroforéza na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu a autoradiografie podle standardních laboratorních postupů. Jeden opožděný typ, objevující se na autoradiogramu společně ve všech liniích gelu představuje nedefinovatelný oligonukleotid-vázající faktor, který se objevuje v retikulocytárním lyzátu. Tento retinoidní receptor-specifický opožděný typ vzniká pouze v kombinaci RAR/RXR.
124
Samostatný RAR ani samostatný RXR nevážou oligonukleotid za vzniku zmíněného typu. Přítomnost AGN 193109 tuto interakci nezeslabuje.
Tyto výsledky ukazují, že AGN 193109 podstatně nemění homo- nebo heterodimerizační vlastnosti RAR-α. AGN 193109 neinhibuje interakci receptářových dimerů s oblastí DNA obsahující podobné vazebné místo.
Vzhledem k těmto jedinečným vlastnostem, které charakterizují AGN 193109, bylo dále zajímavé zjistit, zda tento antagonista může navíc inhibovat aktivitu nenavázaných RAR. Receptor/reportní systém použitý pro toto zjišťování výhodně vykazoval vysokou hladinu základní aktivity v nepřítomnosti přidaného agonisty. Přesněji, v těchto postupech se použil ER-RAR chimerní receptor a ERE-tk-Luc reportní systém. Plazmid ERE-tk-Luc obsahuje oblast-397 až -87 estrogen odpovídající 5’-koncovou oblast Xenopus A2 genu pro vitellogenin, popsaanou Klein-Hitpassem a kol. v Cell 46:1053-1061 (1986), ligovanou proti směru HSV thymidin kinázového promotoru a luciferázového reportního genu v tk-Luc plazmidů. U ER-RAR chimerních receptářů se předpokládá estrogen receptářové DNA vazebná doména, pojící se k “DE-F” doméně RAR. Odborníci pracující v této oblasti ocení tyto funkce“D-E-F” domény vázat retinoid, pro možnou retinoidem vyvolanou transaktivační funkci a takto vznik kontaktního místa pro heterodimerizaci s RXR. Proto je luciferázová exprese v tomto reportním systému závislá na aktivaci transfektovaného chimerního receptorového konstruktu.
Příklad 10 popisuje použitý způsob, který dokazuje, že AGN 193109 inhibuje základní genovou aktivitu, která je vlastností nenavázaných RAR. Tyto postupy se provedly v nepřítomnosti přidaného retinoidního agonisty. Výsledky uvedené níže představují první doklad toho, že AGN 193109 vykazuje negativní hormonální aktivitu.
Přikladlo
Potlačení základní genové aktivity retinoidem-regulovaného reportéru u přechodně kotransfektované buněčné linie
Buněčná linie CV-1 se kotransfektovala s ERE-tk-Luc reportním plazmidem a
ER-RAR-a, ER-RAR-β nebo ER-RAR-γ expresními plazmidy. ERE-tk-Luc plazmid obsahoval promotorovou oblast pro estrogen vitellogenin A2 genu Xenopus Laevis a byl v podstatě shodný s reportním plazmidem popsaným Klein-Hitpassem a kol. v Cell
46:1053 (1986) kromě toho, že CAT reportní gen byl zastoupen polynukleotidovou
125 sekvencí kódující luciferázu. ER-RAR-a, ER-RAR-β nebo ER-RAR^ chimemí receptor kódující polynukleotidy zahrnuté v kotransfekci byly popsány Graupnerem a kol.v Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991). Tyto polynukleotidy se ligovaly do pECE expresního vektoru popsaného Ellisem a kol. v Cell 45.721 (1986) a exprimovaly pod trankripční kontrolou promotoru SV-40. Transfekce pomocí fosforečnanu vápenatého proběhla přesně podle popisu v příkladu 6 za použití 0,5 gg/jamku reportního plazmidu a 0,05 μg, 0,10 μg nebo 0,2 μg/jamku receptorového plazmidu. K buňkám se na 18 hodin přidalo pouze rozpouštědlo (ethanol), ATRA (10’9 až 10-6 M) nebo AGN 193109 (10'9 až W6 M). Měření buněčných lyzátů a luciferázové aktivity se provedlo podle popisu v příkladu 6.
Výsledky uvedené v obrázcích 3A, 4A a 5A potvrzují, že ATRA silně indukuje luciferázovou expresi ve všech transfektantech Základní hladina exprese luciferázy u tří transfektovaných chimerních RAR izoforem se pohybuje od přibližně 7,000 do 40,000 relativních světelných jednotek (rlu) a částečně závisí na množství receptorového plazmidu použitého v transfekci. Tři chimemí receptory jsou tak aktivovatelné ATRA, jak se očekávalo. Přesněji, všechny tři receptory vážou ATRA a aktivují transkripci luciferázového reportního genu přítomného na plazmidu ERE-tk-Luc.
Obrázky 3B, 4B a 5B představují křivku odpovědi na dávku AGN 193109 v nepřítomnosti jakéhokoli exogenního retinoidního agonisty. Zajímavé je, že na ERRAR-a (obrázek 3B) neměla AGN 193109 v podstatě žádný vliv, zatímco u chimerních receptorů ER-RAR-β a ER-RAR-γ (obrázek 4B a respektive 5B) se projevuje snížením luciferázové reportní aktivity v závislosti na dávce AGN 193109.
Dále byla zjištěna negativní hormonální aktivita AGN 193109 při testování jeho schopnosti potlačovat genovou expresi zprostředkovanou chimerním RAR-γ receptorem tvořícím konstitutivní trankripční aktivátorovou doménu. Přesněji, použil se konstitutivní aktivní chimemí RAR-γ receptor připojený ke kyselé aktivátorové doméně HSV VP-16, zvaný RAR-y-VP-16, ve dvou typech luciferázových reportních systémů. První se skládal z ERE-tk-Luc reportéru kotransfektovaného s ER-RAR a ER-RXR-a. Druhý využíval AMTV-TRE-p-Luc reportní místo ERE-tk-Luc reportéru.
Příklad 11 popisuje způsob použitý pro důkaz toho, že AGN 193109 může potlačovat aktivitu transkripční aktivátorové domény RAR. Výsledky uvedené níže dokazují, že AGN 193109 může potlačovat genovou expresi závislou na RAR v
126 nepřítomnosti agonisty a potvrzují, že AGN 193109 vykazuje negativní hormonální aktivitu.
Příklad 11
Potlačení RAR-VP-16 aktivity v přechodně transfektovaných buňkách.
Buňky CV-1 se přechodné kotransfektovaly technikou precipitace pomocí fosforečnanu vápenatého, popsanou v příkladě 6, za použití 0,5 pg/jamku luciferázového transportního plazmidu ERE-tk-Luc, 0,1 pg/jamku ER-RXR-a chimerního reportního expresního plazmidu a 0 pg nebo 0,1 pg/jamku expresního plazmidu RAR-y-VP-16. U chimerního receptoru ER-RXR-α se předpokládala vazebná doména pro hormon (aminokyseliny 181 až 458) pro RXR-α ( Mangelsdorf a kol. Nátuře 345:224-229 (1990)) spojená s DNA vazebnou doménou pro estrogenový receptor (Graupner a kol. Biochem. Biophys.Res.Comm. 179:1554 (1991) a exprimoval se ze SV-40 základního expresního vektoru pECE popsaného Ellisem a kol. v Cell 45:721 (1986). RAR-y-VP- byl identický s VP16RAR-y 1 expresním plazmidem popsaným Nagpalem a kol. v EMBO J. 12:2349 (1993) a kódoval chimerní protein s aktivační doménou proteinu VP16 z HSV připojeného k aminokyselinovému konci celé délky RAR-γ. Za 18 hodin po transfekci se buňky promyly solí fosfátového pufru (PBS) a nasytily 104 DMEM (GibcoBRL) obsahujícím 10%FBS (Gemini BioProducts), který se vyextrahoval dřevěným uhlím k odstranění retinoidů. K buňkám se na 18 hodin přidalo určité ředění AGN 193109 nebo ATRA v ethanolových rozpouštědle nebo pouze ethanol, pak se promyly PBS a zlyzovaly pomocí 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 1 mM EDTA. Luciferázobvá aktivita se měřila metodou popsanou de Wetem a kol.v Mol. Cell. Biol . 7:725 (1987), za použití luciferinu světlušky (Analytical Luminescence Laboratory) a EG&G Bertholdova 96 jamkového luminometru. Luciferázové hodnoty se vyjádřily jako průměrná hodnota ± SEM trojího měření.
Jak je vidět z obrázku 6, CV-1 buňky transfektované s ERE-tk-Luc reportním konstruktem a ER-RAR-α chimerním expresním plazmidem vykazujícím slabou aktivaci luciferázové aktivity pomocí ATRA, způsobenou pravděpodobně izomerizací ATRA na 9C-RA, přirozeného ligandu pro RXR (Heymamn a kol. Cell 68:397 (1992). U buněk transfektovaných se stejnou směsí reportního a chimerního reportního plazmidu, ale reagujících s AGN 193109, se neprojevila žádná změna luciferázové aktivity. Pozdější
127 výsledek, že AGN 193109 se neváže na RXR, se očekával. CV-1 buňky podobné transfektované s ERE-tk-Luc reportérem, ale se zastoupením ER-RAR chimemího receptorového expresního plazmidu ER-RXR-α vykazovaly silnou indukci luciferázové aktivity po reakci s ATRA.
Naopak, inkluze expresního plazmidu RAR-y-VP-16 s ER-RXR-α a ERE-tk-Luc plazmidem v transfekční směsi způsobila výrazné zvýšení základní luciferázové aktivity při měření v nepřítomnosti jakéhokoli přidaného retinoidů. Zvýšení základní luciferázové aktivity zjištěné u ER-RXR-a/ RAR-y-VP-16 kotranfektantů ve srovnání s výsledky získanými za použití buněk transfektovaných pouze s ER-RXR-α znamená, že rekomnbinantní proteiny ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 mohou heterodimerizovat. Interakce heterodimeru s cis-regulačním estrogen odpovídající částí vedlo k zacíleníaktivační domény VP-16 promotorové oblasti na ERE-tk-Luc reportér. Reakce takto trojnásobně transfektovaných buněk s ATRA vedlo k mírnému zvýšení luciferázové aktivity nad základní hladinu. Avšak reakce trojnásobných transfektantů s AGN 193109 se projevila ve snížení luciferázové aktivity v závislosti na dávce. Obrázek 6 ukazuje reakci buněk s AGN 193109 kotransfektovaných s ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 vedoucí k potlačení luciferázové aktivity s maximální inhibicí, objevující se při asi W8 M AGN 193109, což je důležité.
Zjištění, že AGN 193109 potlačuje konstitutivní transkripční aktivační funkci RAR-y-VP-16 v přítomnosti RXR se vysvětlilo pomocí modelu, kde vazba AGN 193109 na RAR indukuje konformační změnu v RAR, která stabilizuje negativní konformaci, usnadňující vazbu trans-aktivačního negativního koaktorového proteinu. Pokud se AGN 193109/RAR komplex váže s NCP, RAR je neschopný zvýšit transkripci genů, které jsou běžně zodpovědé za aktivaci RAR. Další model předpokládal, že intracelulární zásoba NCP je v určitých souvislostech v omezené koncentraci a může se vyčerpat účinkem AGN 193109 stimulujícím komplexaci sRAR.
Výsledky znázorněné na obrázku 6 navíc ukazují, že dokonce při W6 M AGN
193109 mohou proteiny ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 interagovat za vzniku heterodimerů schopných aktivovat transkripci reportního genu. Přesněji, buňky transfektované s ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 a reagující s AGN 193109 v koncentraci (10* - lO^M) dostečné pro maximální inhibici, měly luciferázovou aktivitu asi 16,000 rlu. Naopak, buňky kontransfektované pouze s ER-RXR-α a pak reagující s AGN
193109 v koncentraci tak vysoké, jako ΙΟ'θΜ, vykazovaly hladinu exprese luciferázy
128 přibližné 8,000 rlu. Skutečnost, že vyšší hladiny luciferázové aktivity se dosáhne u buněk s expresí ER-RXR-α i RAR-7-VP-I6 a v přítomnosti lO^M AGN 193109 dokazuje trvanlivost interakce mezi těmito dvěma rekombinantními receptory. Potlačení aktivity RAR-y-VP-16 pomocí AGN 193109 podporuje myšlenku, že změna NCP interakce může dominovat nad VP-16 aktivací. Na základě toho se předpokládá, že je možné měnit expresi genů, které běžně nejsou regulovány retinoidy v závislosti na AGN 193109.
Kandidáty pro AGN 193109 regulovatelné geny jsou ty, které jsou aktivovány komplexy transkripčního faktoru , který se skládá z non-RAR faktorů, které se asociují nebo heterodimerizují s RAR, kde non-RAR faktor nevyžaduje aktivaci RAR agonistou. Zatímco stimulace RAR agonistou nemusí mít v podstatě žádný vliv na expresi takových genů, podání AGN 193109 může podpořit tvorbu neaktivních transkripčních komplexů zahrnujících AGN 193109/RAR/NCP. V důsledku toho může přídavek AGN 193109 retinoidního negativního hormonu snižovat transkripci jinak na retinoid necitlivého genu.
Tento stejný mechanismus podporuje zjištění, že AGN 193109 může potlačovat aktivitu tkáňového transglutaminázového genu (TG áza) v HL-60 buňkách. Retinoidní odpovídající oblast stávající ze tří kanonických retinoidních částí o 5 až 7 párech baží byla identifikována v oblasti genu pro kontrolu transkripce. Zatímco Tgáza se může indukovat RXR-selektivními agonisty, na RAR-selektivní agonisty nereaguje. TG áza retinoidní odpovídavá oblast se váže na RAR/RXR heterodimer (Davis a kol. in Press). Zajímavé je, že AGN 193109 je schopna potlačovat TG ázovou aktivitu indukovanou RXR agonisty. Toto potlačení regulovatelné AGN 193109 se může přičíst schopnosti tohoto negativního hormonu oddělit NCP od RAR složky heterodimeru a takto potlačit aktivitu asociovaného RXR.
Byly získány také výsledky, které podporují závěr shodný s uvedeným v příkladě 11 při použití RAR-y-VP-16 a expresních konstruktů a AMTV-TRE-p-Luc reportního plazmidu místo RAR-y-VP-16 a ER-RXR--a expresních konstruktů v kombinaci s EREtk-Luc reportním plazmidem. Ve shodě s výše uvedenými výsledky se zjistilo, že aktivita RAR-y-VP-16 v AMTV-TRE-p-Luc reportéru je inhibována AGN 193109. AGN 193109 proto potlačuje aktivitu RAR-y-VP-16, pokud se tento chimerní receptor váže přesně k části receptorů pro kyselinu retinovou místo přímé vazby na část pro estrogen v promotorové části reportního plazmidu. Tato zjištění dokazují, že měření pro zjištění
129 činidel s negativní hormonální aktivitou nemusí být omezena na použití určitého reportního plazmidu. Místo toho důležitý postup, v experimentálním systému použitelném pro určení retinoidních negativních hormonů zahrnuje detekci schopnosti sloučeniny potlačit aktivitu RAR s vytvořenou konstitutivní transkripční aktivační doménu.
Obecně, retinoidní negativní hormony mohou být charakterizovány jako podskupina retinoidních sloučenin, které potlačují v transfektovaných buňkách základní hladinu exprese reportního. genu , který je transkripčně zodpovědný za přímou nebo nepřímou vazbu retinoidního receptoru nebo chimernerního receptoru, který zahrnuje nejméně domény retinoidního receptoru umístěné na C-konci DNA vazebné domény tohoto receptoru. Tento poznatek byl upraven pro screeningovou metodu použitelnou pro identifikaci retinoidních negativních hormonů. V různých postupech této vynalezené screeningové metody je struktura receptoru pro negativní hormon variabilní. Přesněji, retinoidní receptor může být subtypem RAR nebo RXR. Receptor může být volitelně vytvořen tak, aby zahrnoval konstitutivní transkripční aktivátorovou doménu. Retinoidní receptor, používaný pro screening negativních hormonů volitelně obsahuje heterologní DNA vazebnou doménu jako zástupce DNA vazebné domény endogenní k nativnímu receptoru. Avšak pokud se ve screeningové metodě použije jiný receptor, a pokud tento druhý receptor může dimenzovat s retinoidním receptorem, který by měl být negativním hormonem, pak tento retinoidní receptor nemusí vyžadovat DNA vazebnou doménu, protože se může připojit ke kontrolní oblasti pro transkripci reportního genu a nemusí vést k dimerizaci s druhým receptorem, který se sám váže k oblasti transkripční kontroly.
Pomocí screeningové metody se v praxi schopnost sloučeniny potlačit základní expresi reportéru běžně měří in vitro. Základní exprese znamená základní hladinu exprese reportéru v transfektovaných buňkách za podmínek, kdy není přítomen žádný exogenní agonista. Mohou se použít libovolné kroky k odstranění endogenních retinoidních ligandů z prostředí transfektovaných buněk pomocí takových postupů, jako je extrakce séra pomocí dřevěného uhlí, které se používá v buněčných kulturách in vitro.
Příklady reportních genů, použitelných v souvislosti se screeningovou metodou, zahrnují geny kódující luciferázu, beta galaktosidázu, chloramfenikol acetyl transferázu nebu buněčné povrchové antigeny, které se mohou detekovat imunochemickými
130 metodami. Avšak transkripčni regulační oblast reportního konstruktu musí zahrnovat jeden nebo více cis-regulačních částí, které jsou cílem transkripčních faktorů, mezi něž patří negativní hormony. Například, jestliže je třeba identifikovat RAR negativní hormony, pak může transkripčni regulační oblast reportního konstruktu obsahovat cisregulační část, která může vázat RAR obsahující protein. V tomto příkladu by měla být shoda mezi DNA vazebnou oblastí RAR a cis-regulační částí transkripčni regulační oblasti reportního konstruktu. Pokud je tedy do screeningové metody zahrnut chimemí RAR se základní transkripčni aktivátorovou oblastí a DNA vazebnou doménou, která může vázat cis-regulační estrogen odpovídající oblasti, pak by měla transkripčni regulační oblast reportního konstruktu obsahovat estrogen odpovídající část.
Příklady cis-regulačních částí, které přímo vážou retinoidní receptory (RARE) použitelné v souvislosti s reportním měřením, uvádí Mangelsdorf a kol. v The Retinoid Receptors , v The Retinoids: Biology, Chemistry and Mediáne, 2. vydání, eds. Spom a kol., Ravern Press, Ltd., New York (1994). Příklady cis-regulačních částí, které nepřímo vážou chimerní receptory, zahrnují DNA vazebná místa pro DNA vazebný protein, pro který může být DNA vazebná doména inkorporována do chimemího receptoru obsahujícího DNA vazebnou doménu, připojenou k retinoidnímu receptoru. Specifické příklady heterologní DNA vazebných domén, které mohou být vytvořeny na chimerních receptorech, a které rozeznají heterologní cis-regulační oblasti, zahrnují ty, které rozeznají estrogen odpovídající části. Retinoidní receptářové části chimemího receptoru použitelné v souvislosti se screeningovou metodou, tak nemusí obsahovat DNA vazbu retinoidního receptoru, ale musí obsahovat nejméně ligand vazebnou doménu retinoidního receptoru.
Další příklad nepřímé vazby retinoidního receptoru na cis-regulační část zahrnuje použití proteinu, který může vázat cis-regulační část a dimerizovat s retinoidním receptářem. V tomto případě se retinoidní receptor asociuje s cis-regulační částí jen v asociaci s proteinem odpovědným za DNA vazbu. Příklad takového systému zahrnuje použití spojovacího proteinu skládajícího se z heterologní DNA vazebné oblasti pojící se k RXR, obsahující nejméně oblast RXR odpovídající za dimerizaci s RAR. Současně zavedený RAR může dimerizovat s tímto spojovacím proteinem navázaným na cis-regulační část. Předpokládáme že jakýkoli cis-regulační oblastvazebný protein, který dimerizuje s RAR za vzniku nepřímé asociace s RAR s cis131 regulační částí je též vhodný pro použití ve screeningové metodě pro negativní hormon.
V doporučeném postupu screeningové metody se za retinoidní negativní hormony považují ty retinoidy, které polačují základní expresi vytvořeného RAR transkripčního faktoru se zvýšenou základní aktivitou. Vytvořený RAR použitý v následujícím příkladu obsahuje konstitutivní transkripční aktivační oblast, což však není zásadní pro použití screeningové metody. Použití tohoto chimerního receptoru výhodně uplatní jev, kdy se základní exprese reportního genu může zvýšit v nepřítomnosti retinoidů. Ačkoli jsme použili přechodnou transfekci v postupu podrobně popsaném níže, stabilně transfektované buněčné linie běžně exprimující chimemí receptor by byly v souvislosti se screeningovou metodou též použitelné.
Jak se uvádí v následujícím příkladu, chimemí retinoidní receptor s konstitutivní transkripční aktivační oblastí byl heterodimerizibilní s druhým receptářem vytvořeným tak, aby obsahoval DNA vazebnou oblast pro estrogen odpovídající cis-regulační část. V tomto případě se chimemí retinoidní receptář s konstitutivní transkripční aktivační oblastí asociuje s cis-regulační oblastí kontrolující expresi reportního genu nepřímo přes vazbu na druhý receptář, který váže DNA cílovou sekvenci. Přesněji, druhý receptor vytvořený tak, aby obsahoval DNA vazebnou oblast, která rozezná estrogen odpovídající oblast. Výhodné je, že reportní gen s estrogen odpovědnou oblasastí v protisměru k promotorové oblasti nereaguje na retinoidní agononisty v nepřítomnosti transfektovaného chimerního receptoru s konnstitutivní transkripční aktivátorovou oblastí. Podle toho je aktivita všech reportních genů dána transfektovanými receptory. Kombinační použití estrogen odpovědné části DNA vazebné oblasti a estrogen odpovědné oblasti cis-regulační oblasti jsou úmyslně voleny jen jako ilustrativní. Odborníci pracující v této oblasti zjistí, že v praxi vynalezené screeningové metody mohou být také použitelné s jinými kombinacemi vytvořených receptorů se specifitou pro non-RARE cis-regulační oblasti.
Buňky využitelné v souvislosti se screeningovou metodou jsou eukaryotické buňky, které se mohou transfektovat. Tyto buňky mohou být živočišného původu, jako například lidské, primátů nebo hlodavců. Velmi dobrých výsledků bylo dosaženo s buňkami CV-1, ale důvodně se očekává, že mohou být s úspěchem použity také jiné kultury buněčných linií. Pro zavedení expresního konstruktu kódujícího chimemí
132 retinoidní receptor s konstitutivní transkripční aktivátorovou doménou může být použita jakákoli ze známých běžných metod.
Konstitutivní transkripční aktivátorové doména se skládá z množství aminokyselin, které mají nejlépe kyselý celkový charakter vyjádřený záporným nábojem při neutrálních podmínkách pH. Například, konstitutivní transkripční aktivátorové doména může mít aminokyselinovou sekvenci , která se nachází také u virových transkripčních faktorů. Jedním z příkladů virového transkripčního faktoru s konstitutivní transkripční aktivátorovou doménou je virus herpes simplex 16. Avšak při konstrukci expresních konsruktů kódujících chimerní retinoidní receptor s konstitutivní transkripční aktivátorovou doménou se mohou použít i jiné virové nebo syntetické transkripční aktivátorové domény.
Jak je popsáno níže, byl vyvinut obecný screeningový způsob využitelný pro identifikaci retinoidních negativních hormonů. Tento screeningový způsob umožňuje odlišení samotných antagonistů od negativních hormonů. Tabulka 12 uvádí některé retinoidní sloučeniny, které vykazují zvýšenou afinitu k RAR-γ a kromě ATRA netransaktivují tento receptor v přechodné kotransfekci transaktivačního měření. Testovali jsme proto tyto sloučeniny kvůli zjištění, co jsou RAR-γ antagonisté a jestliže jsou, které z těchto antagonistů vykazují negativní hormonální aktivitu.
Příklad 12 popisuje způsob použitý pro identifikaci retinoidních sloučenin, které jsou antagonisty a podskupinu antagonistů, které vykazují negativní hormonální aktivitu.
Příklad 12
Měření retinoidních negativních hormonů
Buňky CV-1 v koncentraci 4 χ 104 se transfektovaly koprecipitační metodou pomocí fosforečnanu vápenatého, popsanou v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook a kol. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) za použití 0,5 μς ERE-tkLuc reportního plazmidu a 0,1 μς chimerního expresního plazmidu ER- RAR-γ (Graupner a kol. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)). Po 18 hodinách se buňky promyly PBS a nasytily DMEM (Gibco-BRL) obsahujícím 10% aktivovaného FBS extrahovaného dřevěným uhlím (Gemini Bio-Products). Buňky reagovaly s 10'8M ATRA v ethanolu nebo pouze s ethanolem. Buňky, které reagovaly s ATRA, navíc reagovaly s 10'9, 10’8, 10‘7 nebo lO^M sloučeninami uvedenými v tabulce 12. Po hodinách se buňky promyly PBS a lyžovaly v 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Luciferázová aktivita se měřila podle popisu deWeta a kol. v Mol. Cell. Biol.
7:725(1987).
133
TABULKA 12
Sloučenina Kd (nM) @ RAR-γ3 ECso (nM) @ RAR-γ1
ATRA 12 17
AGN 1931109 (sloučenina 60) 6 na
AGN 1931174 (sloučenina 34a) 52 na
AGN 193199 30 na
AGN 193385 (sloučenina 23) 25 na
AGN 193389 (sloučenina 25) 13 na
AGN 193840 40 na
AGN 193871 (sloučenina 50) 30 na
3 Relativní afinita (Kd) určená kompeticí vazby 3H-ATRA na baculovirus exprimující RAR-γ a použití Cheng-Prussofovy rovnice.
b EC50 měřeno u buněk CV-1 přechodně kotransfektovaných s AMTV-TREp-Luc a RS-RAR-γ. “na” značí nulovou aktivitu.
Jak ukazují výsledky uvedené v části obrázku 7 a v tabulce 12, kromě ATRA jsou všechny sloučeniny, uvedené v tabulce 12 retinoidními antagonisty na RAR-γ.
RAR-γ antagonisté z tabulky 12 byly se dále zkoumány pro určení, který, jestliže takový existuje, je také retinoidním negativním hormonem. CV-1 buňky o koncentraci 4
134 χ 104 se kotransfektovaly koprecipitační metodou pomocí fosforečnanu vápenatého popsanou v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook a kol. eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) za použití 0,5 gg ERE-tk-Luc reportního plazmidu a 0,1 pg ER- RXR-α (Graupner a kol. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1554 (1991)) a 0,2 μg RAR-y-VP-16 chimemího expresního plazmidu (Nagpal a kol. EMBO J. 12:2349 (1993)). Po 18 hodinách se buňky promyly PBS a nasytily DMEM (Gibco-BRL) obsahujícím 10% aktivovaného FBS extrahovaného dřevěným uhlím (Gemini BioProducts). Buňky reagovaly s 10'9, 10'8, 10‘7 nebo ΙΟ’θΜ sloučeninami uvedenými v tabulce 12. Reakce pouze s ethanolovým rozpouštědlem se použila jako negativní kontrola. Po 18 hodinách se buňky promyly PBS a lyžovaly v 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mMEDTA. Luciferázové aktivita se měřila jak je dříve uvedeno podle deWeta a kol. v Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987).
Jak je zřejmé z tabulky 8, retinoidní antagonisté z tabulky 12 se mohou rozdělit na dvě skupiny podle jejich účinku na konstitutivní transkripční aktivační funkci chimemího expresního receptorů RAR-y-VP-16. Jedna skupina, která zahrnuje AGN 193174, AGN 193199 a AGN 193840, nepotlačuje aktivitu RAR-y-VP-16, přestože se skládá z ATRA antagonistů. Naopak AGN 193109, AGN 193385, AHN 193389 a AGN 193871 vykazují na dávce závislé potlačení konstitutivní aktivity RAR-y-VP-16. Proto, zatímco sloučeniny obou skupin jsou RAR-γ antagonisty, pouze ty z druhé skupiny mají negativní hormonální aktivitu. Toto měření výhodně odliší retinoidní negativní hormony od samotných retinoidních antagonistů.
Předchozí experimentální výsledky potvrzují, že AGN 193109 splňuje kritéria, která definují negativní hormon. Přesněji, výsledky uvedené pod příkladem 11 dokazují, že AGN 193109 má schopnost uplatnit inhibiční aktivitu na RAR, dokonce v nepřítomnosti exogenně přidaných retinoidních ligandů. Takto tyto sloučeniny vykonávají biologickou aktivitu, která nezávisí na blokádě interakce mezi RAR a antagonisty, jako například ATRA a AGN 191183. Tato zjištění vedou k závěru, že AGN 193109 stabilizuje interakce mezi RAR a NCP. Jak je znázorněno v diagramu obrázku 9, interakce NCP/RAR/PCP existují v rovnovážném stavu. Agonista zvyšuje PCP interakce a snižuje NCP interakce, zatímco inverzní agonista nebo negativní hormon stabilizuje NCP a snižuje PCP interakce.. Jak bylo dříve uvedeno, experimentální výsledky naznačují, že intracelulámí dosažitelnost NCP pro jiné receptory se může měnit podáním AGN 193109. Přesněji, bylo zjištěno, že AGN 193109 může podporovat
135 tvorbu komplexu NCP s RAR a takto snižuje intracelulární zásobu NCP dostupného pro interakci s transkripčními faktory jinými než RAR.
Dále se zkoušel vliv AGN 193109 na agonistou zprostředkovanou inhibici závislosti genové exprese na AP-1. V Endocr. Rev. 14:651 (1993), Pfhal uvádí, že retinoidní antagonisté mohou snižovat genovou expresi. MEndocr. Rev. 14:651 (1993), Pfhal uvádí, že retinoidní antagonisté mohou snižovat genovou expresi mechanismem, který zahrnuje inhibici aktivity AP-1. Předpokládáme, že AGN 193109 by mohl mít jeden ze dvou účinků, pokud se použije v kombinaci s retinoidním antagonistou v modelovém systému navrženém pro měření aktivity AP-1. Zaprvé, AGN 193109 může pravděpodobně antagonizovat účinek agonisty, čímž odstraňuje na antagonistovi závislou inhibici aktivity AP-1. AGN 193109 by mohl případně zvyšovat antagonní aktivitu, čímž by prudce zvyšoval na antagonistů závislou inhibici aktivity AP-1.
Příklad 13 popisuje metody použité pro důkaz toho, že AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu retinoidního agonisty. Jak je uvedeno níže, retinoidní antagonosta AGN 191183 inhibuje velmi málo genovou expresi závislou na AP-1. Kombinace AGN 193109 a retinoidního antagonosty silně inhibuje genovou expresi závislou na AP-1. AGN 193109 nemá sama o sobě v podstatě žádnou anti-AP-1 aktivitu.
Příklad 13
AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu retinoidního agonisty
Buňky HeLa se transfektovaly s 1 pg Str-AP1-CAT reportním genovým konstruktem a 0,2 pg plazmidů pRS-hRARa podle popisu Giguera a kol. v Nátuře 33:624 (1987) za použití LIPOFECTAMINU (Life Technologies, lne.). Str-AP1-CAT se připravil klonováním DNA fragmentu odpovídajícímu pozici -84 až +1 promotoru krysího stromelysinu-1 (Matrisian a kol.. Mol. Cell. Biol. 6:1679 (1986)) mezi HindlII-BamHI místa pBLCAT3 (Luckow a kol., Nud. Acids Res. 15:5490 (1987)). Tato sekvence promotoru stromelysinu-1 obsahuje AP1 motiv jako samostatnou zesilovací část (Nicholson a kol., EMBO J. 9:4443 (1990). Promotorové sekvence se připravila annealingem dvou syntetických oligonukleotidů o sekvencích:
136
5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGG
GCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCCAG-3'(SEQID N0:2), a
5’-CTGGATCCTCGAGGTCCACCnTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCAGAGTCACCCGCAAAC TGACTCATAAnGCTTCCATAAGCTTCT-3' (SEQ ID N0:3).
Postupy zahrnující transfekci, reakci s vhodnými sloučeninami a měření CAT aktivity se prováděly podle popisu Negpala a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995).
Výsledky těchto podtupů ukazují, že AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu retinoidního antagonisty AGN 191183. Přesněji, v koncentračním rozmezí 10’12až 10' 10M AGN 191183 neinhibuje TPA-indukovanou Str-AP1-CAT expresi. Reakce s AGN 193109 v koncentračním rozmezí 10‘1° až 10’8M podstatně neinhibuje AP-1 zprostředkovanou reportní aktivitu. Avšak výsledky uvedené v obrázku 10 ukazují, že stimulace transfektantů kombinací AGN 193109 (10δΜ) a AGN 191183 v koncentračním rozmezí 10‘12 až 10'10M podstatně inhibuje TPA-indukovanou Str-AP1CAT expresi v množství od 12% do 21%. AGN 193109 proto zvyšuje anti-AP-1 aktivitu AGN 191183 za podmínek, kdy tento retinoidní agonista běžné neinhibuje AP-1 aktivitu.
AGN 193109 zvýšené agonistou zprostředkované potlačení AP-1 aktivity bylo zdůvodněno mechanismem zahrnujícím na AGN 193109 závislé maskování NCP na RAR. RAR patří k superrodiné jaderných receptorů, které zahrnují také receptory pro
1,25-dihydroxyvitamín D3, glukokortikoid, thyroidní hormon, estrogen a progesteron. Důvodně se předpokládalo, že schopnost vázat NCP může být vlastní různým členům jaderné receptorové superrodiny. To vedlo k domněnce, že AGN 193109 může zvyšovat anti-AP-1 aktivitu jednoho nebo více ligandů, které interagují s touto superrodinou jaderných receptorů.
Výsledky všech příkladů jasně ukazují, že AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu retinoidního antagonisty. Jasněji, AGN 193109 snižuje prahovou dávku při které je anti-AP-1 aktivita AGN 191183 detekovatelná. Zatímco AGN 193109 nemá samostatně v podstatě žádnou anti-AP-1 aktivitu, jeho vliv na jaderné receptorové antagonisty je synergistický. Bylo také zjištěno, že negativní hormon AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu 1,25dihydroxyvitamínu D3, přirozeného ligandu D3 receptorů.
137
Zjištěná synergie mezi AGN 193109 a AGN 191183 v předchozím příkladu nezbytně předpokládá, že anti-AP-1 aktivita retinoidního antagonisty a AGN 193109 zprostředkované zvýšení této aktivity musí být výsledkem různých mechanismů. Jestliže jsou mechanismy působení těchto dvou činitelů shodné, pak to znamená, že účinek kombinace AGN 193109 a antagonisty bude jejich součtem. Ukázalo se naopak, že kombinace má větší účinek než činidla samotná, takový účinek, který nemohl být předpovězen předem.
AGN 193109 zprostředkované zesilování RAR agonisty se zřejmě provádí za použití přibližně 100 násobného molárního přebytku AGN 193109 vzhledem k retinoidnímu agonistu. Vzhledem k tomu by se měla většina RAR navázat na AGN 193109 a pouze malé množství by mělo zůstat pro vazbu s agonistou. Vzhledem k tomuto faktu, bylo množství RAR, které se neváže s AGN 193109 schopné vázat retinoidního agonistu a silně stimulovat na antagonistu závislou odezvu, měřitelnou jako inhibici exprese reportního genu. Výsledky tak předpokládají možnou heterogenitu RAR, která je indukovatelná AGN 193109.
Negativní hormonální aktivita AGN 193109 se přisuzuje její schopnosti podporovat interakci mezi RAR a NCP, což je základem k pochopení synergie mezi AGN 193109 a retinoidními agonisty. Výsledky jsou zcela v souladu s modelem, v kterém reakce buněk s AGN 193109 podporuje vazbu RAR a NCP takto snižuje množství volného NCP a volného RAR v buňkách. Výsledky těchto dvou populací RAR jsou funkčně rozdílné. První populaci zastupuje RAR asociovaný s NCP. Takové komplexy jako AGN 193109/RAR/NCP se nemohou aktivovat retinoidními agonisty. Druhou populaci tvoří RAR, které se nevážou s NCP a zachovávají si tak schopnost innterakce s agonisty. Poslední výše uvedená populace se značí “RAR” pro vyjádření volného RAR v prostředí s podstatně vyčerpaným NCP.
RAR* má sníženou pravděpodobnost asociace s NCP díky ekvivalentní vazbě a má zvýšenou měřitelnou citlivost k retinoidním agonistům, například anti-AP-1 aktivitu. Je tomu tak proto, že zatímco intracelulární zásoba NCP se vyčerpá podáním AGN 193109, zásoba PCP se nevyčerpá. Vzhledem k tomu, volný RAR* může vázat retinoidního agonistu a intreragovat s PCP faktory v prodtředí s v podstatě vyčerpaným NCP. Tato schopnost AGN 193109 zvyšovat citlivost jiných jaderných receptorů k jejim případným agonistům se může přisoudit schopnosti těchto různých jaderných receptorů interagovat se stejnými NCP, které interaagují s komplexy AGN 193109 /RAR. Tento
138 model AGN 193109 zprostředkované změny schopnosti NCP u členů jaderné receptářové rodiny je schématicky znázorněna v obrázku 11.
Tento mechanistický model vedl k předpokladu, že AGN 193109 může měnit aktivity jaderných receptorových ligandů jiných, než jsou retinoidní antagonisté. Jak je nastíněno v následujícím příkladu, potvrdilo se, že AGN 193109 zvyšuje aktivitu 1,25dihydroxyvitamínu D3 v transaktivačním měření in vitro .
Příklad 14 popisuje způsoby použité pro důkaz toho, že AGN 193109 zvyšuje aktivitu 1,25-dihydroxyvitamínu D3 v transaktivačním měření.
Příklad 14
AGN 193109 zvyšuje aktivitu1,25-dihydroxyvitamínu D3
Buňky HeLa se transfektovaly za použití lipozomem zprostředkovaného kationtového transfekčního postupu, popsaného Felgnerem a kol. v Proč. Natí. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987). 5 χ 104 buněk se umístilo do 12 jamkové destičky a rostlo v DMEM doplněném 10% FBS. Buňky se kotransfektovaly v médiu bez séra za použití 2 pg/jamku LIPOFECTAMINU (Life Technologies, lne.) s 0,7 pg reportního, plazmidu MTV-VDRE-Luc, obsahujícím dvě kopie 1,25-dihydroxyvitamínu D3 odpovídající oblasti 5’-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3’ (SEQ ID NO:4) z myšího osteopontinového genu (Ferrara a kol. J. Biol. Chem. 269:2971 (1994)) ligovaného do reportního plazmidu AMTV-Luc (Heyman a kol. v Cell 68:397 (1992)) a 0,3pg plazmidu pGEM3Z (Pharmacia, lne.), jako nosiče DNA pro poslední koncentraci DNA - 1 pg na jamku. Po 6 hodinách transfekce se buňky nastytily růstovým médiem obsahujícím FBS extrahované aktivním uhlím v konečné koncentraci 10%. Osmnáct hodin po transfekci buňky reagovaly se samostatným rozpouštědlem (ethanol) nebo AGN 193109 v ethanolu v konečné koncentraci W8 až 10’7 M. Za šest hodin se přidal 1,25dihydroxyvitamín D3 v ethanolu na konečnou koncentraci od 10'1° do 10’7M. Buňky se lyžovaly, sklidily za 18 hodin a následně reagovaly s 1,25-dihydroxyvitamínem D3. Luciferázová aktivita se měřila podle výše uvedeného popisu. Tento experimentální systém používá vhodnou metodu monitorování a měření kvantity 1,25dihydroxyvitamínu D3 v závislosti na genové exopresi.
Výsledky uvedené na obrázku 12 ukazují, že při srovnání výsledků získaných při použití samostatného 1,25-dihydroxyvitamínu D3, AGN 1931091, současně podaná s
1,25-dihydroxyvitamínem D3, posouvá křivku reakce na dávku doleva. Toto potvrzuje,
139 že AGN 1931091 zvyšuje účinek 1,25-dihydroxyvitamínu D3, v in vitro transaktivačním měření. Přesněji, obrázek 12 graficky ukazuje, že AGN 193109 v tak nízké koncentraci jako 10 - 100 nM činí 1,25-dihydroxyvitamín D3 přibližně 10 krát aktivnější. Zatímco u
1,25-dihydroxyvitamínu D3 v koncentraci lO^M se pedpokládala luciferázová exprese přibližně 2,000 rlu, pouze desetina 1,25-dihydroxyvitamínu D3 byla potřeba pro produkci stejného množství luciferázy, když se vitamín podal současně s AGN 193109 v koncentraci 108 - 10‘7 Μ. V podstatě stejné výsledky se získaly při použití AGN 193109 v koncentracích 10'9 a W8 M, nejsou však uvedeny v grafu obrázku 12. Současné podání AGN 193109 tak podstatně snižuje množství 1,25-dihydroxyvitamínu D3, které je nutné pro podobný účinek v nepřítomnosti negativního hormonu.
Zajímavé je, že pokud se výše uvedený postup zopakuje s kotransfekcí expresního plazmidu receptoru vitamínu D3 (VDR), objeví se současné snížení schopnosti AGN 1931091 zvyšovat aktivitu 1,25-dihydroxyvitamínu D3. Tyto výsledky jsou vysvětlovány tak, že nadměrná exprese VDR může způsobit schopnost AGN 193109 zvyšovat aktivitu 1,25-dihydroxyvitamínu D3. Intacelulární koncentrace ligandového receptoru, který může být odlišný v různých druzích tkání, tak může mít vliv na schopnost AGN 1931091 zvyšovat aktivitu ligandu, který se váže na receptor. To je opět v souladu s modelem, v kterém se titrovatelný NCP podílí na regulaci odpovědi na vitamín D3 a podporuje výše uvedený model.
Jak je nastíněno v následujícím příkladu, předpokládalo se také, že AGN 193109 zvyšuje anti-AP-1 aktivitu 1,25-dihydroxyvitamínu D3. Náš model aktivity AGN 193109 vysvětluje toto zjištění tím, že NCP se okamžitě asociuje s RAR v přítomnosti tohoto léčiva. Endogenní receptory vitamínu D na HeLa buňkách se zdály být cilivější k ligandu 1,25-dihydroxyvitamín D3 s byla přeceněna schopnost tohoto ligandu následně inhibovat expresi z reportního Str-AP1-CAT.
Příklad 15 popisuje způsoby použité pro vysvětlení, že AGN 1931091 zvyšuje anti-AP-1 aktivitul ,25-dihydroxyvitamínu D3.
Příklad 15
AGN 1931091 zvyšuje anti-AP-1 aktivitul ,25-dihydroxyvitamínu D3.
HeLa buňky se transfektovaly s 1 pg Str-AP1-CAT za použití LIPOFECTAMINU, jak popisuje v metodě Nagpal a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995). Transfektované buňky reagovaly pouze s AGN 193109 (10‘9 až 10'7M), pouze s 1,25140 dihydroxyvitamínem D3 (10‘12 až 10'7M) nebo s 1,25-dihydroxyvitamínem D3 (10'12 až 10' 7M) v přítomnosti lO^M AGN 193109.
Výsledky těchto postupů ukazují, že AGN 193109 zvyšuje schopnost 1,25dihydroxyvitamínu D3 inhibovat TPA-indukovanou AP-1 aktivitu. Pokud se použije samostatně v koncentračním rozmezí 10'9 až 10‘7M, AGN 193109 má nedetekovatelnou anti-AP-1 aktivitu. Výsledky uvedené na obrázku 13 ukazují, že 1,25-dihydroxyvitamín D3 potlačuje TPA-stimulovanou aktivitu pouze v W8 a 10’7M koncetračním rozmezí. Analýza 1,25-dihydroxyvitamínem D3 ovlivněného potlačení TPA stimulované CAT aktivity v přítomnosti lO^M AGN 1931091 ukazuje, že anti-AP-1 aktivita je detekovatelná při 10‘1° a 10‘9M 1,25-dihydroxyvitamínu D3 a zvýšení aktivity při dávce W8 a 10'7M ve srovnání s reakcí pouze s 1,25-dihydroxyvitamínem D3. Tato na AGN 1931091 závislá změna
1,25-dihydroxyvitamínem D3 ovlivněné anti-AP-1 aktivity je v souladu s modelem, v kterém působení NCP s RAR činí NCP neschopný interakce s jinými členem jaderné receptářové rodiny. Na základě toho jsou receptory považovány za citlivější k léčbě
1,25-dihydroxyvitamínem D3.
Mechanismy, kterými probíhá RAR zprostředkovaná transaktivace aanti-AP1 aktivita jsou pravděpodobně různé. Tento závěr je podložen zjištěními, že vysoké dávky AGN 193109 zcela inhibují transaktivaci bez zásadní inhibice anti-AP-1 aktivity. Bylo třeba proto získat další důkaz pro podporu modelu tvorby RAR* zprostředkovanou reakcí s AGN 193109. Pro úplnost bylo třeba zjistit, zda AGN 193109 zvyšuje akltivitu RAR specifického agonisty AGN 191183 v transaktivačním měřen í/n vitro.
Příklad 16 popisuje způsoby použité pro důkaz toho, že AGN 1931091 zvyšuje aktivitu RAR specifického agonisty AGN 191183. Výsledky těchto postupů ukazují, že za určitých podmínek AGN 193109 zvyšuje sílu RAR specifického retinoidu a podává jasný důkaz toho, že AGN 1931091 podporuje tvorbu RAR*.
Příklad 16
Zvýšení účinků retinoidu při současném podání AGN 1931091
Buňky HeLa se transfektovaly za použití kationtovým lipozomem zprostředkovaného transfekčního postupu, popsaného Felgnerem a kol. v Proc.Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987).
141 χ 104 buněk se umístilo do 12 jamkové destičky a rostlo v DMEM s doplňkem 10% FBS. Buňky se kotransfektovaly v médiu bez séra za použití činidla LIPOFECTAMIN (2 μρ/ΐβηΓ^υ, Life Technologies, lne.) s 0,7 pg reportního plazmidu MTV-VDRE-Luc, obsahujícím dvé kopie TREpal odpovídající oblasti 5’- TCAGGTCATGACCTGA-3’ (SEQ ID NO:5) inzertovaného do reportního plazmidu AMTV -Luc (Heyman a kol. v Cell 68:397(1992)) a 0,1 pg RAR-γ expresního plazmidu pRShRAR-γ (Ishikawa a kol. Mol. Endocrínol. 4:837 (1990)). Po 6 hodinách transfekce se buňky nastytily růstovým médiem obsahujícím FBS extrahované aktivním uhlím v konečné koncentraci 10%. Osmnáct hodin po transfekci buňky reagovaly se samostatným rozpouštědlem (ethanol) nebo AGN 193109 v ethanolu v konečné koncentraci 10'11 až 10'8 M. Za dalších šest hodin se přidal AGN 191183 v ethanolu na konečnou koncentraci 0, 10’1° nebo 10’9M. Buňky se po osmnácti hodinách reakce s AGN 191183 sklidily a luciferázová aktivita se měřila jak je popsáno výše.
Uvedené experimenty ukazují, že 10‘9 M AGN 193109 byl relativně neúčinný při inhibici odpovědi na 10’9 M AGN 191183 v HeLa buňkách. To je v rozporu se schopností 10‘9 M AGN 193109 inhibovat W8 M ATRA v CV-1 buňkách (obrázek 2).
Výsledky uvedené v obrázku 14 podporují předpoklad, že AGN 193109 stimuluje tvorbu RAR*. V souladu s naší charakteristikou antagonisty a negativními hormonálními aktivitami AGN 193109, se reakce s AGN 193109 projeví dvoufázovou křivkou odpovědi v závislosti na dávce. Nejnižší dávka AGN 193109 (10‘11 a 10'1°M) se projeví stimulací luciferázové aktivity více než samostatným AGN 191183. Tento jev napovídá, že RAR* se tvoří pomocí AGN 193109. Vzhledem k tomu, že se toto projevilo také při reakci se samostatným AGN 193109, předpokládá se, že RAR* mohou reagovat na endogenní ligand. AGN 191183 je syntetický retinoidní agonista a stejně jako ATRA aktivuje transkripci přes RAR. Náhrada AGN 191183 za ATRA v příkladu 7 dává kvantitativné podobné výsledky (například AGN 193109 antagonizuje účinek 10 nM AGN 191183). Příklad 16 ukazuje, že zatímco AGN 193109 může působit jako antagonista RAR agonisty, dávkování se může jednoduše zjistit, pokud současné podání AGN 193109 zvyšuje aktivitu zprostředkovanou RAR agonistou. Je důležité si uvědomit, že dávky sloučenin, použitých v příkladu 16 jsou podstatně nižší než dávky v postupech popsaných v příkladu 7. Předpokládá se, že léčba AGN 193109 může vést k heterogenitě RAR oproti RAR*. Projevující se heterogenita (například schopnost zvyšovat) se projevuje různými způsoby v transaktivasi oproti potlačení AP-1. Důvodem
142 dvojfázových křivek je to, že se zvýšeným množstvím AGN 193109 je proporcionálně méně RAR schopného vázat agonistu. Toto se neprojevuje v případě AP-1 potlačení a domníváme se, že tento rozdíl musí odrážet dva různé mechanismy transaktivace potlačení AP-1 stejnými receptorovými druhy.
Klinické výsledky potvrzují, že některé retinoidy jsou využitelné pro inhibici růstu premalignit a maligních krčních lézí. Příkladové studie podporující tento závěr publikoval Graham a kol. ve West. J. Med. 145:192 (1986) s Lipmanem a kol. v J. Natí. Cancer. Inst. 84:241 (1992) a s Weinerem a kol. v Invest. New Drugs 4:241 (1986)).
Podobné závěry podporují výsledky studií in vitro, které použily buňky v kultuře pro kvantifikaci antiproliferativních účinků různých retinoidů. Jasněji, Agarwal a kol. v Cancer. Res. 51:3982 (1991) použil buněčnou linii ECE 16-1 jako model raných stavů krční dysplazie a dokázal tak, že kyselina retinová může inhibovat buněčnou proliferaci závislou na epidermálním růstovém faktoru (EGF).
Příklad 17 popisuje metody použité pro vysvětlení že AGN 193109 může antagonizovat aktivitu AGN 191183 retinoidního agonisty, který inhibuje proliferaci buněčné linie ECE16-1.
Příklad 17
AGN 193109 antagonizuje antiproliferativní účinek retinoidů v buněčné linii ECE16-1.
Buňky ECE-16-1 se naočkovaly v hustotě 1 χ 104 na cm2 do kompletního média obsahujícího DMEM:F12 (3:1), neesenciální aminokyseliny, 5% FBS, 5 μΙ/ml transferinu, 2 nM 3,3’,5 trijodthyroninu (thyroidní hormon nebo “T3”), 0,1 nM cholera toxin, 2 mM L-glutamin, 1,8 χ 10’4M adeninu a 10 ng/ml EGF. Buňky se ponechaly na deskách přes noc a pak se přemístily do definovaného média obsahujícího DMEM:F12 (3:1), 2 mM L-glutamin, neesenciální aminokyseliny, 0,1% hovězí sérový albumin, 1,8 χ 10'4M adeninu, 2 nM T3, 50 μΙ/ml kyseliny askorbové, 100 μg/ml streptomycinu, 100 jednotek/ml penicilinu a 50 pg/ml gentamicinu. Definované médium (DM) se doplnilo 10 ng/ml EGF. Buňky reagující s EGF dostaly 10 nM AGN 191183 retinoidního agonisty v kombinaci s 0, 0,1, 1,0, 10, 100 nebo 1000 nM AGN 193109 nebo samostatný 1000 nM AGN 193109. Po třech dnech reakce se buňky sklidily postupem podle Hembree a kol. v Cancer Res. 54:3160 (1994) a počet buněk se určil pomocí počítače COULTER.
Výsledky uvedené v obrázku 15 vysvětlují, že ECE-16-1 buňky proliferují v závislosti na EGF, ale ne pouze v definovaném médiu. Toto potvrzuje zjištění
143 publikovaná Andreatta-van Leyenem a kol. v J. Cell. Physio. 160:265 (1994) a Hembreem a kol. v Cancer. Res. 54:3160 (1994). Přídavek 10 nM AGN 191183 a 0 nM AGN 193109 zcela inhibuje EGF zprostředkovanou proliferací. AGN 191183 je tak potenciálním antiproliferativním retinoidem. Zvýšení koncentrace AGN 193109 z 0 nM na 10 nM antagonizovalo AGN 191183 zprostředkovanou inhibici růstu na přibližně 50%. Desetinásobný molární přebytek AGN 193109 zcela obrací antiproliferatinvní účinek AGN 191183. Reakce buněk se samostatným 1000 nM AGN 193109 nemělo žádný vliv na EGF zprostředkované zvýšení proliferace. Tyto výsledky potvrdily, že AGN 193109 antagonizuje antiproliferatinvní účinek retinoidu, ale samo nemělo v podstatě žádnou antiproliferativní aktivitu pokud se použilo na reakci s buňkami představujícími krční epitel, který je citlivý na inhibici růstu způsobenou retinoidy, jako například AGN 191183. Nebyl tedy žádný důkaz toho, že by AGN 193109 zvyšovalo antiproliferatinvní aktivitu agonisty AGN 191183 při použití modelového systému ECE16-1.
V protikladu k modelového systému zastoupenému buněčnou linií ECE16-1, existují další příklady, kdy buněčná proliferace asociovaná s krční dysplazií nemůže být inhibována retinoidními antagonisty. Například, Agarwal a kol. v Cancer. Res. 54:2108 (1994) popisuje použití CaSi buněk jako modelového příkladu krčních nádorů, které nereagují na retinoidní léčbu. Jak se uvádí níže, kromě inhibice buněčné proliferace nemá retinoidní léčba v podstatě žádný vliv na rychlost růstu CaSi buněk. Následující příklad prokazujetento vliv negativního hormonu AGN 193109 na proliferační rychlost buněčné linie. Výsledky nečekaně potvrdily, že AGN 193109 může inhibovat proliferací krčních tumorových buněk, které neodpovídají na antiproliferativní účinky retinoidních agonistů.
Příklad 18 popisuje metody použité pro důkaz toho, že AGN 193109 inhibuje růst krčních tumorových buněk, které neodpovídají na antiproliferativní účinek jiných retinoidů, jako například AGN 191183. AGN 193109 jasně vykazuje antiproliferativní aktivitu v nepřítomnosti přidaného retinoidu.
Příklad 18
AGN 193109 inhibuje proliferační rychlost CaSi buněčné linie odvozené od krčního karcinomu
144
Testoval se účinek EGF na CaSki buněčnou proliferaci, samostatně nebo v kombinaci s retinoidním agonistou AGN 191183 a/nebo negativním hormonem AGN 193109 v koncentraci W6 M. Měření buněčné proliferace se provedlo podle výše uvedeného popisu pro studie zahrnující buňky ECE 16-1. EGF se přidalo ke kultuře s působícím retinoidem na konečnou koncentraci 20 ng/ml. Buňky reagovaly s AGN 191183 (10'1° až 10‘6M) v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10^M AGN 193109 celkem po dobu tří dnů. Medium se vyměnilo za čerstvé a každá ze dvou retinoidních složek každý den, bylo-li to nutné. Počet buněk se určil pomocí počítače COULTER jak je uvedeno výše.
Výsledky ivedené v obrázku 16 ukazují, že CaSki buňky byly podstatně odolné na působení retinoidního agonisty, a že AGN 193109 vykazovalo antiproliferativní aktivitu v nepřítomnosti přidaného retinoidu. Přítomnost EGF v mediu kultury podporovalo buněčný růst CaSki. Tento závěr je postaven na srovnání vyšrafovaného sloupce představujícího nepřítomnost AGN 191183 a prázdného sloupce představujícího pouze definované růstové médium (“DM”). Reakce s AGN 191183 nevykazovalo žádnou antiproliferativní aktivitu na CaSki nádorovou buněčnou linii. Zjistili jsme pouze slabé zvýšení rychlosti buněčné proliferace spojené s retinoidním agonistou, protože desetitisícinásobné zvýšení koncentrace retinoidního agonisty je spojeno s pouze asi 20% zvýšením proliferační rychlosti.
Výsledky uvedené v obrázku 16 také ukazují, že AGN 193109 inhibuje proliferaci CaSki krční epiteliální buněčné linie. Tento závěr je postaven na srovnání měření označené jako “0” AGN 191183 vystínovaný sloupec a “0” AGN 191183 vyšrafovaný sloupec. AGN 193109 je tak schopen stimulovat biologickou odpověď v nepřítomnosti přidaného retinoidného agonisty, pokud se použil pro reakci s krčními nádorovými buňkami, u kterých nebyl inhibován růst retinoidními agonisty, jako například AGN 191183.
Zjištění, že negativní hormon AGN 193109 může inhibovat buněčnou proliferaci, je v souladu s modelem, kdy nenavázaný RAR mění expresi genů, které jsou zodpovědné za proliferaci. Zatímco RAR agonista, jako například AGN 191183 nemá v podstatě žádný účinek, nebo snad podporuje buněčnou proliferaci slabě, AGN 193109 proliterativní účinek má. Negativní hormon AGN 193109 zřejmě váže RAR, a tím podporuje NCP asociaci a způsobuje tak inaktivní konformaci RAR. Podle modelu toto představuje genovou aktivitu, která je pozitivně ovlivňována nenavázaným RAR. Tato
145 schopnost AGN 193109 snižovat aktivitu nenavázaného RAR zřejmě vyplývá z jeho schopností podporovat asociaci RAR s NCP.
Odbornicí pracující v této oblasti ocení to, že někteří retinoidní antagonisti jsou využitelní pro kontrolu nežádoucích důsledků buněčného růstu, jehož následkem je retinodní poškození.
Po retinodním poškození se retinální pigmentové epitelium (RPE) dediferencuje, proliferuje a migruje do subretinálního prostoru. Tento proces může negativně ovlivnit úspěch chirurgických postupů vedoucích k odstranění retinálního poškození. Campochiaro a kol. v Invest. OpthalÁ Vis. Sci. 32:65 (1991) dokázal, že RAR agonisté, jako například ATRA vykazují antiproliferativní účinek na růst primárních lidských RPE kultur. Retinoidní agonisté také vykazují snížení výskytu retinálního poškození s následným chirurgickým odstraněním tohoto poškození. (Fekrat a kol. Ophtalmology 102:412 (1994)). Jak se uvádí v následujícím příkladu, analyzovala se schopnost negativního hormonu AGN 193109 potlačovat růst v primárních lidských RPE kulturách.
Příklad 19 popisuje způsoby použité pro vysvětlení toho, že AGN 193109 zvyšuje antiproliferativní účinek retinoidního antagonisty v primární kultuře lidského retinálního pigmentového epitelia.
Příklad 19
AGN 193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu ATRA
Primární kultura lidského retinoidního pigmentového epitelia (RFE) se připravila metodou popsanou Campochiarem a kol. v Invest. Opthal & Vis. Sci. 32:65 (1991). 5 x 104 buněk se umístilo do16 mm jamek 24 jamkových destiček v DMEM (Gibco) obsahující 5% FBS. Buňky modelově reagovaly pouze s ethhanolovým rozpouštědlem, ATRA (10'1° až lO^M) v ethanolu, AGN 193109 (10'1° až 10-®M) v ethanolu nebo ATRA (10’1° až 10^M) a 10^M AGN 193109. Buňky se každé dva dny po dobu celkově pěti dnů působení nasytily čerstvým mediem obsahujícím určité koncentrace těchto sloučenin. Buňky se odstranily z destiček jemným natrávením trypsinem a počet buněk se spočítal elektronickým počítačem buněk.
Výsledky uvedeny na obrázku 17 ukazují, že AGN 193109 prudce zvyšuje antiproliferativní aktivitu ATRA na RPE buňkách. Reakce primárních RFE buněk s
146
ATRA vedla ke snížení RPE proliferace závislé na dávce s přibližně 40% snížením při 10'6M ATRA vzhledem ke kontrolním kulturám. Reakce s AGN 193109 podstatné nezvyšovala rychlost růstu RPE buněk při jakékoli koncentraci použité v postupu. Kombinace ATRA (10'11 až lO^M) a 10-6 M AGN 193109 měla nečekaně silnější antiproliferativní aktivitu než samotná ATRA. Současná reakce s AGN 193109 tak zvyšuje antiproliferativní účinek ATRA. Přesněji, výsledky uvedené v obrázku ukazují, že antiproliferativní účinek W8 M ATRA je dosažitelný použitím pouze 10‘1° M ATRA v kombinaci s 10’7M AGN 193109. Negativní hormon AGN 193109 tak výhodně zesiluje antiproliferativní aktivitu ATRA přibližně 100 krát.
V nezávislém experimentu srovnání antiproliferačního účinku ATRA (10‘11 až 10' 6M) s pokusem pro ATRA a lO^M AGN 193109 opět dokázalo zřejmé zvýšení citlivosti primárních RPE buněk na ATRA v přítomnosti AGN 193109. V tomto systému AGN 193109 nemá funkci retinoidního antagonisty, ani nevykazuje antiproliferativní účinek, pokud se použije samostatně. Avšak současné podání AGN 193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu retinoidního agonisty.
AGN 193109 se testovalo na schopnost zvýšit antiproliferativní účinek kyseliny 13-c/s retinové (13-c/s RA) v primárních RPE kulturách při podmínkách a technikách měření RPE buněčné proliferace popsané výše. Je třeba mít na paměti, že 13-c/s RA je klinicky důležitá. Pčesněji, 13-c/s RA je používaná při léčbě některých chorobných stavů, zahrnujících akné (Peck a kol. N. Engl. J. Med. 300:329 (1977); Jones a kol. Br. J. Dermatol. 108:333 (1980)) a šupinatý buněčný karcinom kůže a krku v kombinované léčbě s interferonem 2a (Lippman a kol. J. Nati. Cancer Inst. 84:241 (1992); Moore a kol. Seminars in Hematology 31:31 (1994)).
Výsledky uvedené v obrázku 18 ukazují, že 13-c/s RA (10'12 až lO^M) a ATRA (10‘12 až lO^M) účinně inhibují buěčný růst RPE. Je třeba mít na paměti, že izomer13c/s RA je při tomto měření průměrně dvakrát méně účinný ve srovnání s ATRA. Podobně k výsledkům získaným při současném podání AGN 193109 a ATRA (výše) současné podání AGN 193109 (W8 nebo
W6 M) s 13-c/s RA (10‘12 až W6 M) prudce zvyšuje sílu 13-c/s RA ve zprostředkovaném potlačení RPE buněčné proliferace. V protikladu k léčbě samotnou
13-c/s RA, současné podání AGN 193109 zvyšuje sílu 13-c/s RA. AGN 193109 tak zvyšuje antiproliferativní aktivitu 13-c/s RA.
147
Následně jsme testovali schopnost AGN 193109 zvyšovat aktivity jiných jaderných receptářových hormonů v primárních RPE buněčných kulturách. Dexametazon, syntetický glukokortikoidový receptorový agonista, je jedním z členů třídy sloučenin, které se klinicky využívají pro svůj protizánětlivý účinek a imunosupresivní vlastnosti. Thyroidní hormon (T3; 3,3’,5-trijodthyronin) je přirozený thyroidní hormonální receptorový agonista primárně využívaný jako hormonální náhrada při léčbě hypothyroidismu. Metody použité v těchto experimentech jsou shodné s výše popsanými pro postupy zahrnující ATRA a 13-c/s RA.
Výsledky těchto postupů ukazují, že současné podání AGN 193109 a jaderných receptářových agonistů zvyšuje antiproliferativní aktivity jaderných receptářových agonistů. Jasněji, výsledky uvedené na obrázku 19 ukazují, že jednočinidlová reakce RPE buněk s dexametazonem (10'11 až W6 M) nebo ATRA (10‘12 až 106 M) byla podstatně neschopná inhibovat RPE buněčnou proliferací. Reakce RPE buněk s dexametazonem (10’11 až ΙΟ'θΜ) a 10’8 nebo W8 M AGN 193109 však potlačuje buněčnou proliferací RPE až do průměrné inhibice způsobené reakcí s ATRA. Podobně, výsledky uvedené na obrázku 20 ukazují, že AGN 193109 zvyšuje antiproliferační aktivitu thyroidního hormonu. Podobně k výsledkům získaným s použitím dexametazonu - proliferace RPE buněk odolávala jednočinidlové reakci s thyroidním hormonem (10'11 až 10‘6 M). Avšak současnou reakcí s thyroidním hormonem (10‘11 až 106 M) a AGN 193109 (10'8 až 10'6 M) se inhibuje buněčná proliferace RPE z hlediska závislosti na thyroidním hormonu. Shrnuto, AGN 193109 je modelem primárních RPE kultur citlivých na antiproliferační účinek těchto jaderných receptářových agonistů. Mechanismus, kterým AGN 193109 zprostředkovává tyto účinky, pravděpodobně zahrnuje změnu interakcí NCP/RAR.
Navíc byl vyzkoušen vliv AGN 193109 na expresi markerových genů u jiných experimentálních systémů, které jsou citlivé na retinoidní agonisty. U MRP8 i u stromelysinových genů je známa jejich inhibice retinoidními agonisty v různých biologických systémech. Například, Wilkinson a kol. v J. Cell Sci. 91:221 (1988) a Madsen a kol. v J. Invest. Dermatol. 99:299 (1992) uvádějí, že genová exprese MRP8 je zvýšena u psoriázy. Naopak, genová exprese MRP8 je potlačena retinoidním agonistou AGN 190168 u psoriázy lidské kůže (Negpal a kol., přijato 1995), v lidských keratinocytových Taftových kulturách (Chandraratna a kol. J. Invest. Dermatol. 102:625 (1994)) a v kulturách lidských kožních keratinocytů u novorozenců (Thacher a kol. J.
148
Invest. Dermatol. 104:594 (1995)). Nagpal a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995) uvedl, že množství stromelysinové mRNA je potlačeno retinoidními antagonisty jako například
AGN 190168 v kultuře lidských kožních keratinocytů u novorozenců. Analyzovala se regulovaná exprese těchto genů s následnou reakcí kultury lidských kožních keratinocytů u novorozenců s retinoidním agonistou AGN 191183 nebo AGN 193109.
Příklad 20 popisuje metody použité pro vysvětlení toho, že AGN 193109 inhibuje expresi MRP-8 v kultuře keratinocytů
Příklad 20
AGN 193109 inhibuje expresi MRP-8 v keratinocytech.
Primární keratinocyty předkožky se vyizolovaly podle postupu popsaného Negpalem a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995) a kultiviovaly se v keratinocytovém růstovém médiu (KGM) získaného od Clonetics. Po 3 dnech reakce s AGN 191183 (10' 7M) nebo AGN 193109 (lO^M) se vyizolovala celková buněčná RNA ze zreagovaných a kontrolních keratinocytů podle standatdních metod. U mRNA se provedla reversní transkripce na cDNA, která pak sloužila jako templát v PCR amplifikačním protokolu za použití primerů specifických pro provozní gen glyceraldehyd fosfát dehydrogenázy (GAPDH) nebo MRP-8. Primery pro GAPDH měly sekvenci 5’-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’ (SEQ ID NO:6) a 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’ (SEQ ID NO:7). Primery pro MRP-8 měly sekvence 5’-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3’ (SEQ ID NO:8) a 5’ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3’ (SEQ ID NO:9). V každém cyklu PCR amplifikace počínaje 12 a konče 21 cyklem se odebral alikvot z MRP-8 amplifikace (10 μΙ). Podobně se odebral alikvot z amplifikační reakce GAPDH po každém PCR cyklu počínaje 15 a konče 24 cyklem. U vzorků se provedla elektroforéza na 2% agarózových gelech a odebrané amplifikační produkty se detekovaly obarvením ethidium bromidem. Počáteční intenzita amplifikačních produktů sloužila pro kvantitativní měření množství výchozí mRNA specifické pro určitý příměrový set.
Výsledky postupu ukazují, že AGN 191183 i AGN 193109 nezávisle inhibují expresi MRP-8 v keratinocytech. Intenzita obarveného GAPDH amplifikačního produktu byla v podstatě stejná v jednotlivých liniích gelu, představujících počáteční množství izolované z kontroly, AGN 191183 a AGN 193109 zreagované s keratinocyty. Slabé proužky představující GAPDH amplifikační produkt byly poprvé detekovatelné v liniích
149 odpovídajících vzorkům odebraným po 18 cyklech PCR amplifikace. Shodná intenzita obarvení v různých linií gelu znamená, že ve všech vzorcích bylo stejné množství výchozího materiálu. Rozdíly v intenzitách barvených proužků představujích MRP-8 amplifikační produkty znamenaly rozdíly v expresi u mRNA MRP-8 u různých výchozích vzorků. Jak se očekávalo, amplifikační signál MRP-8 byl inhibován v kulturách reagujících s AGN 191183 (10'7M) vzhledem k nereagující kontrole. Reakce s AGN 193109 (106 M) u inkubovaných kerotinocytů také potlačovala expresi MRP-8, což se usuzuje z nižší intenzity barveného amplifikačního produktu.
Jak je nastíněno v následujícím příkladu, AGN 193109 také inhibuje expresi druhého markerového genu v keratinocytech. Nagpal a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995) uvádí, že exprese stromelysinové mRNA se snižuje RAR specifickými agonisty u inkubovaných keratinocytů předkožky lidských novorozeňat. Nicholson a kol. (EMBO J. 9:4443 (1990)) uvádí, že AP-1 promotorové oblast hraje roli v negativní regulaci stromelysin-1 genu závislé na retinoidu. Bylo tak zajímavé zjistit, zda může AGN 193109 měnit expresi tohoto genu.
Příklad 21 popisuje použité metody pro důkaz toho, že AGN 193109 inhibuje genovou expresi stromelysinu-1 v nepřítomnosti exogenně přidaného retinoidního agonisty.
Příklad 21
AGN 193109 inhibuje expresi stromelysinu-1 v kultuře keratinocytů
Primární keratinocyty předkožky byly reagovaly modelově nebo reagovaly 24 hodin s RAR agonistou AGN 191183 (10‘7M) nebo AGN 193109 (lO^M). Celková RNA získaná z modelových a keratinocytů reagujících s retinoidem se reverzně transkribovala a výsledná cDNA se amplifikovala PCR s použitím oligo primerů pro βaktin nebo stromelysin-1 přesně podle popisu Negpala a kol. v J. Biol. Chem. 270:923 (1995)). Vzorek z PCR amplifikační reakce (10 μΙ) se odebral po každých třech cyklech počínaje 18. cyklem PCR amplifikace. U vzorků se pak provedla elektroforéza na 2% agarózovém gelu a detekce po obarvení ethidium bromidem.
Výsledky těchto postupů ukazují, že AGN 193109 inhibuje genovou expresi stromelysinu-1 v neopřítomnosti exogenně přidaného retinoidního agonisty. Přesněji, ethidiem obarvené proužky představují amplifikační produkty β-aktinu a jsou dobře detekovatelné na agarosových gelech po 18 cyklech PCR. Zatímco intenzity všech
150 proužků se zvětšovaly s dalšími cykly amplifikační reakce, obarvené proužky byly o něco méně intenzivní u vzorků představující buňky inkubované s AGN 191183. To znamená, že u výchozích vzorků odpovídajících buňkám zreagovaným s AGN 191183 musí být o něco menší množství RNA. Výsledky také ukazují, že stromelysin-1 mRNA je detekovatelná u modelově zreagovaných keratinocytů od 33. cyklu PCR amplifikace. Jak se očekávalo, exprese stromelysinu-1 mRNA je inhibována po inkubaci s AGN 191183 (10'7M), jak je zřejmé ze slabší intenzity proužku ve srovnání se vzorky odvozenými od modelově zreagovaných vzorků. Po standardizaci intenzit β-aktinových amplifikačních produktů a v souladu s výsledky získanými z měření genové exprese MRP-8 je zřejmé, že keratinocyty, které reagovaly s AGN 193109 (W^M) měly snížené množství stromelysin-1 mRNA. Toto snížení, stimulované reakcí s AGN 193109 je skutečně neodlišitelné od snížení způsobeného reakcí keratinocytů s RAR agonistou AGN 191183.
Jak je uvedeno výše, AGN 193109 může mít tři různé účinky z hlediska regulace aktivity současně podaného agonisty ze steroidní superrodiny. Zaprvé, AGN 193109 nemusí mít žádný vliv. Zadruhé, AGN 193109 může antagonizovat účinek agonisty, což vede ke snížení aktivity agonisty. Konečně, AGN 193109 může zvyšovat aktivitu agonisty, což vede ke stimulaci měřeného účinku, vyvolaného agonistou.
Sloučeniny s aktivitami, které mohou být ovlivněny AGN 193109, zahrnují agonisty retinoidního receptoru a agonisty, které vážou na jiné členy steroidní receptářové superrodiny. Tato poslední uvedená kategorie agonistů zahrnuje receptářové agonisty vitamínu D, receptářové agonisty glukokortikoidu a receptářové agonisty thyroidního hormonu. Peroxizomem proliferačně aktivované receptory, estrogenový receptor a orfanové receptory s dosud neznámými ligandy mohou být také zesíleny AGN 193109. V případě, že agonistou steroidní superrodiny je RAR agonista, AGN 193109 může antagonizovat nebo zvyšovat aktivitu tohoto agonisty. V případě, kdy agonista použitý v kombinaci s AGN 193109 je sloučenina, která může vázat jaderný receptář jiný než RAR, současné podání AGN 193109 nebude mít žádný účinek, nebo způsobí zcitlivění systému k agonistů a pak se aktivita agonisty zvýší.
Následuje obecný příkladový postup pro určení, která z těchto tří možných aktivit
AGN 193109 se uplatní v daném systému. Tento popis přibližuje každý z možných výsledků pro AGN 193109 v současném podání s agonistou steroidní receptářové superrodiny. Biologické systémy použitelné pro vyhodnocení schopnosti AGN 193109
151 měnit aktivitu jaderného receptorového agonisty zahrnují, ale nejsou jediné: zavedenou buněčnou tkáňovou kulturu, virové transformované buněčné linie, ex-vivo primární buněčnou kulturu a in vivo studie využívající živé organismy. Měření biologického účinku AGN 193109 v takových systémech může zahrnovat určení některého z různých biologických koncových bodů. Tyto koncové body zahrnují: analýzu buněčné proliferace, analýzu programované buněčné smrti (apoptózu), analýzu diferenciačního stavu buněk na základě měření genové exprese, analýzu schopnosti buněk tvořit nádory u nahé myši a analýzu genové exprese po přechodném nebo stabilním zavedení reportních genových konstruktů.
Pro ilustrativní účely se vzorky mRNA označené jako mRNA”X” exprimují z genu “X” do primárně inkubovaných Ύ” buněk izolovaných z orgánu “Z”. Za standardních podmínek kultury, kdy se udržují některé “Y” buněčné genetické markéry, zahrnující expresi genu “X”, vede přidaný retinoidní agonista ke snížení nadbytku “X” mRNA. Analýza genové exprese X se může vyhodnotit na základě izolace buněčné mRNA a měření nadbytku X mRNA pomocí polymerázové řetězové reakce, ribonukleázovou ochranou nebo RNA blotovacích podstupů, jako například Nothern analýzou. Po izolaci z orgánu Z se primární buňky Y inkubovaly ve vhodném růstovém médiu. Primární kultury se pak umístily na destičky pro tkáňové kultury pro růst buněčné populace. Tento krok usnadňuje rozdělení buněk na čtyři skupiny vzorků, aby se mohly dodat různé dávky retinoidního agonisty a AGN 193109. První skupina byla kontrolní, přidalo se pouze rozpouštědlo K druhé skupině se přidal RAR agonista, kyselina retinová podaná v ethanolu v dostatečném množství pro konečnou koncentraci v rozmezí od 10' 11 až W^M. Nejnižší dávka může vyžadovat empirické určení v závislosti na citlivosti systému. Takové určení spadá do rámce rutinních experimentů odborníků pracujících v této oblasti. Ke třetí skupině se přidal jaderný receptorový agonista ve stejné dávce použité pro kultivaci buněk 2. skupiny a konstantní dávau AGN 193109. Dávka AGN 193109 použitá pro kultivaci buněk 3. skupiny vyžaduje také empirické určení , ale může se určit přibližně podle afinitní konstanty (Kd) AGN 193109 pro RAR subtypy (to znamená nejméně 10'8M). Ke čtvrté skupině se přidala AGN 193109 v minimální dávce používané pro současné podání agonisty ve 3. skupině. V tomto dávkovacím předpisu se může případně AGN 193109 nahradit retinoidním agonistou, jak je popsáno v následujícím příkladě pro 2. skupinu a konstantní dávkou retinoidního agonisty místo AGN 193109, což platí pro skupiny 3 a 4. Po vhodné inkubační době se buňky sklidí
152 způsobem vhodným pro určení biologického koncového bodu měřeného jako indikátoru agonní aktivity.
Například, analýza účinku AGN 193109 na regulaci genové exprese závisle na kyselině retinové zahrnuje srovnání nárůstu mRNA vzorku X v celkovém množství mRNA získaného z buněk reagujících podle jednoho ze čtyř protokolů uvedených výše. RNA odvozená z kontrolních buněk slouží pro určení základního stupně exprese X mRNA a představuje podmínky odpovídající nulovému potlačení. Srovnáním této hladiny s měřením celkového množství mRNA získaného z buněk zreagovaných s kyselinou retinovou slouží k určení účinku tohoto agonisty na genovou expresi. Kvantitativní hladina potlačení specifické mRNA, která je výsledkem reakce s kyselinou retinovou se může srovnat s nárůstem mRNA z buněk zreagovaných v panelu se samostatnou AGN 193109 nebo s AGN 193109 v kombinaci s kyselinou retinovou. Zatímco tento obecný příklad představuje analýzu účinku současně podaného AGN 193109 na expresi genu potlačenou retinoidním agonistou, může tento příklad případně popisovat analýzu účinku současně podaného AGN 193109 na gen, který se indukuje retinoidním agonistou. Základním rysem pro určení, zda se AGN 193109 bude chovat jako agonista, negativní hormon nebo nebude mít žádný vliv v určitém systému, zahrnuje kvantitativní srovnání míry úřinku v přítomnosti a nepřítomnosti AGN 193109.
Příklad, v kterém AGN 193109 zvyšuje aktivitu současně podaného agonisty je případem, v kterém současná léčba AGN 193109 s kyselinou retinovou má vliv na hladinu exprese X mRNA, což je další potlačení vzhledem k měřené hladině v buňkách reagujících pouze s kyselinou retinovou. Přesněji, ksrovnání řivky odpovědi biologického účinku (to znamená potlačení nárůstkuXmRNA) na dávce je vykresleno na y-ose oproti dávce agonisty (logaritmické měřítko) na ose x a je srovnáním agonistou ovlivněného potlačení nárústku XmRNA v přítomnosti a nepřítomnosti současně podaného AGN 193109. Schopnost AGN 193109 zcitlivění biologické odpovědi na agonistu, a tím zvýšení aktivity agonisty se projeví v křivce směrem doleva zvýšením odpovědi na dávku. Přesněji, v přítomnosti AGN 193109 stačí menší množství agonisty pro dosažení stejného biologického účinku, kterého lze dosáhnout za použití pouze agonisty.
Příklad AGN 193109 ovlivňovaného antagonismu při současném podání agonisty je případem, v kterém se současné podání AGN 193109 s kyselinou retinovou projeví v hladině exprese X mRNA, která je méně potlačena ve srovnání s měřením v
153 buňkách reagujících pouze s kyselinou retinovou. Srovnání křivky závislosti potlačení X mRNA na log dávky agonisty v přítomnosti a nepřítomnosti AGN 193109 se projeví vpravo zvýšením křivky závislosti odpovědi na dávce. Přesněji, v přítomnosti AGN
193109 je třeba více agonisty pro dosažení stejného biologického účinku, kterého se dosáhne reakcí pouze s agonistou.
V předchozích příkladech AGN 193109 mění antagonismus nebo zvýšuje popsané experimentální výsledky při současném podání AGN 193109 s retinoidním agonistou. Jestliže však agonista současně podaný s AGN 193109 je agonistou schopným vazby a aktivace některého z receptoru steroidní superrodiny, jiného než RAR, pak místo antagonizování agonisty je možné, že AGN 193109 nebude mít žádný vliv na aktivitu agonisty. Jestliže podání AGN 193109 s takovým agonistou se projeví v hladině exprese mRNA, která je shodná s měřenou v buňkách reagujících pouze s agonistou, pak schopnost AGN 193109 ovlivnit dostupnost NCP pomocí zvýšení RAR:NCP asociace se v tomto systému neprojeví. Toto je příkladem, kdy AGN 193109 nemá žádný vliv na současně podaného agonistu.
Příklad antagonismu
Způsob popsaný ve výše uvedeném obecném příkladu pro určení vlivu_AGN 193109 současně podaného s retinoidním agonistou je použitý v postupu popsaném v příkladu 7. K buňkám CV-1, kotransfektovaných s jedním ze tří receptářů kyseliny retinové a retinoidním agonistou induktibilním MTV-TRE-p-Luc reportním. konstruktem se přidal ethanol (kontrola, skupina 1), AGN 193109 ve výsledné koncentraci ad 10'9 do ΙΟ-6!)/! (skupina 2), AGN 193109 ve výsledné koncentraci od 10’9 do W6 M současně s kyselinou retinovou 10’8M (skupina 3) nebo kyselina retinová (10‘8M, skupina 4). Srovnání luciferázové aktivity skupiny 1 se skupinou 4 umožňuje určení hladiny retinoidním antagonistou indukované exprese iuciferázového reportního genu v nepřítomnosti přidaného AGN 193109. Srovnání exprese Iuciferázového reportního genu v buňkách skupiny 3 s měřením v buňkách skupiny 4 ukazuje, že se AGN 193109 v systému chová jako antagonista retinoidního agonisty.
Příklad antagonismu
Způsob popsaný ve výše uvedeném obecném příkladu pro určení vlivu AGN
193109 současně podaného s retinoidním agonistou se podobně použil v příkladu 17 k
154 určení toho, že_AGN 193109 vystupuje ve funkcí antagonisty retinoidním agonistou zprostředkovaného potlačení EGF-stimulované buněčné proliferace u ECE-16-1 transformovaných krčních epiteliálních buněk. V tomto postupu reakce ECE-16-1 buněk zahrnuje kontrolní vzorek zreagovaný pouze s EGF (skupina 1), vzorek zreagovaný s kombinací EGF a AGN 193109 v konečné koncentraci 10_6M (skupina 2), vzorek reagující s kombinací EGF a AGN 193109 v konečné koncentraci 10‘1° až 10'6M současně s jednou dávkou retinoidního agonisty AGN 191183 v koncentraci 10'8 M (skupina 3) a vzorek zreagovaný s kombinací EGF a AGN 191183 v koncentraci 10‘8M (skupina 4). Po třech dnech reakce se měřila rychlost buněčné proliferace. Je možné určit, zda buňky byly stimulovány k proliferaci pomocí EGF, protože je zahrnuta další kontrolní reakce, kdy jsou buňky inkubovány v definovaném médiu, které neobsahuje EGF. Srovnáním počtu buněk skupiny 1 s počtem buněk skupiny 4 se určí, zda RAR agonista AGN 191183 potlačuje EGF-stimulovanou proliferaci buněk ECE-16-1. Srovnání skupiny 3 a skupiny 4 ukazuje, že AGN 193109 v systému antagonizuje aktivitu RAR agonisty.
Příklad zesílení účinku
Způsob uvedený v obecném příkladu pro vysvětlení účinku AGN 193109 současně podaného s retinoidním agonistou se také použil pro určení v příkladu 14 pro zjištění, že AGN 193109 zvyšuje aktivitu jaderného receptorového agonisty v HeLa buňkách transfektovaných s 1,25-dihydroxyvitamínem D3 induktibilním MTV-VDRE-Luc reportním genem. Reakce transfektovaných buněk zahrnovala samostatné rozpouštědlo (kontrola, skupina 1), 1,25-dihydroxyvitamin D3 v konečné koncentraci od 10'1° do 10'7M(skupina 2), 1,25-dihydroxyvitamin D3 v konečné koncentraci od 10'1° do 10'7M v současném podání s AGN 193109 v konečné koncentraci W8 nebo 10'7M (skupina 3) a AGN 193109 jako samostatné reakční činidlo v konečné koncentraci 10'8 nebo 10'7M (skupina 4). Srovnáním luciferázové aktivity měřené u buněk ve skupině 1 (kontrola) s buňkami skupiny 2 se zjistilo, že 1,25-dihydroxyvitamínem D3 zvyšovaná luciferázové aktivita je závislá na dávce. Srovnání luciferázové aktivity měřené u buněk ve skupině 4 (AGN 193109 jako samostatné činidlo) s buňkami skupiny 3 (současně podáný AGN 193109) vede podobně k zjištění, že 1,25-dihydroxyvitamín D3 stimuluje luciferázovou aktivitu v závislosti na dávce v přítomnosti určité koncentrace AGN 193109. V tomto případě představuje nulová hodnota luciferázovou aktivitu v
155 buňkách zreagovaných se samotným AGN 193109 (skupina 4). Takovýto rozpis dávkování vede ke srovnání tří křivek závislosti na dávce 1,25-dihydroxyvitamínu D3. Srovnání těchto křivek účinku 1,25-dihydroxyvitamínu D3 v nepřítomnosti AGN 193109 s křivkou představující současně podáný AGN 193109 (10-3 nebo 10‘7M) dokazuje zvýšení agonní aktivity, jak je zřejmé ze zvýšení v levé části při poloviční maximální odezvě.
Příklad zesílení účinku
Způsob uvedený v obecném příkladu pro vysvětlení účinku AGN 193109 současně podaného s retinoidním agonistou se dále použil v příkladu 19 pro zjištění, že AGN 193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu RAR agonisty v primárních kulturách lidských retinálních pigmentových epiteliárních buněk. Reakce buněk zahrnovala: samostatné ethanolové rozpouštědlo (skupina 1), kyselinu retinovou v konečné kon centraci 10'10 až ΙΟ'θΜ (skupina 2), kyselinu retinovou v konečné koncentraci 10’10 až 106 M v současném podání sW6 M AGN 193109 (slupina 3) a samostatný AGN 193109 v konečné koncentraci 10‘1° až 10-6 M (skupina 4). Srovnání výsledků měření získaných za použití buněk skupiny 1 a 2 vedlo k určení závislosti inhibice proliferace těchto buněk na dávce kysliny retinové. Podobně, srovnání výsledků měření získaných za použití buněk skupiny 3 a skupiny 1 vedlo k určení závislosti inhibice proliferace těchto buněk na dávce kysliny retinové v přítomnosti současně podaného AGN 193109. Skupina 4 dokazuje neschopnost AGN 193109 podstatně měnit rychlost proliferace těchto buněk, pokud se použije jako jedno reakční činidlo. Srovnáním křivky závislosti kyselinou retinovou zprostředkovaného potlačovaní buněčné prolifrace v závislosti na její dávce ve skupinách 2 a 3 vede k závěru, že zcitlivění primárních buněk RPE k antiproliferativním účinkům RAR agonisty pomocí AGN 193109 vede ke zvýšení aktivity RAR agonisty.
Jak je uvedeno výše, Agarwal a kol. v Cancer. Res. 54:2108 (1994)) ukazuje, že růst CaSki buněk na rozdíl od růstu HPV buněk, které jsou chráněny ECE-16-1 před odumřením, nebyl inhibován reakcí s retinoidními agonisty. Jak se zde uvádí, nečekaně bylo zjištěno, že buněčný růst CaSki buněk byl inhibován AGN 193109 v nepřítomnosti retinoidního agonisty. Následující příklad nastiňuje, jak se AGN 193109 může použít k inhibici růstu CaSki buněčných nádorů in vivo.
156
Příklad 22
Inhibice nádorového růstu CaSki buněk u nahé myši po podání AGN 193109
CaSki buňky o koncentraci 1 x 106 se injekčně aplikovaly každé nahé myši panelu. Tvorba nádoru se hodnotila běžnými technikami, které používají odborníci v této oblasti. Po injekci se myši náhodně rozdělily na kontrolní a testované skupiny. Kontrolní skupině se podalo placebo. Testované skupině se podal AGN 193109. Na zvířata, kterým bylo podáno placebo, se se pomocí intragastické sondy působilo kukuřičným olejem. Testovaná zvířata dostala denně 20 gmol/kg AGN 193109 v kukuřičném oleji běhěm reakce. Velikost nádoru se měřila v milimetrach krychlových za použití posuvných měřítek. Velikost nádoru se vyjádřila jako funkce času. U myší, které dostaly AGN 193109 rostly nádory výrazně pomaleji, než nádory u kontrolních myší při posouzení podle velikosti a počtu nádorů na konci pozorování. Tento výsledek při uskutečnění in vivo znamená, že AGN 193109 inhibuje růst pokročilého krčního nádoru, který je odolný k léčbě zahrnující podání retinoidního agonisty.
Jak je uvedeno výše, buňky CaSki jsou modelovým příkladem krčních nádorů, které nereagují na léčbu retinoidním agonistou. Bylo však uvedeno, že buněčný růst CaSki buněk je inhibován AGN 193109 v nepřítomnosti retinoidního agonisty při léčbě. Schopnost AGN 193109 inhibovat proliferaci CaSki buněk předpokládá, že by AGN 193109 mohla být využitelná při léčbě krčních nádorů, které nereagují na léčbu retinoidním agonistou. Následující příklad uvádí metodu, která se může použít ke zjištění léčebného účinku AGN 193109 při působení na nádor cervixu.
Příklad 23
Zjištění léčebného účinku AGN 193109 u pacientek s nádorem děložního čípku
Nejprve byli vybrány pacientky s pokročilým nádorem děložního čípku Provedla se biopsie děložního čípku metodami, které jsou známy odborníkům v této oblasti. Buňky z explantovaného nádoru se namnožily v tkáňové kultuře standardními metodami za účelem získání dostatečného množství buněk pro rozdělení do tří experimentálních skupin. Pro tento účel se použily podmínky kultury popsané Argawalem a kol. v Cancer. Res. 54:2108 (1994). První skupina byla kontrolní a dostala pouze nosič (ethanol). Druhá skupina reagovala s RAR agonistou- kyselinou retinovou v koncentraci 10'1° až W6 M. Třetí skupina reagovala s AGN 193109 v dávkách v rozmezí od 10'1° do ΙΟ^Μ. K buňkám se denně přidalo čerstvé růstové
157 médium a retinoidy podle výše uvedeného rozpisu pro každou experimentální skupinu. Po třech dnech se spočítaly buňky pomocí elektrického počítače buněk. Srovnání počtu buněk v kontrolních kulturách s počtem buněk v kulturách, které reagovaly s kyselinou retinovou ukazuje, že RAR antagonista výrazně neinhiboval rychlost růstu inkubovaných buněk nádoru děložního čípku. Naopak, buňky zreagované s AGN 193109 vykazovaly snížení počtu buněk v závislosti na dávce ve srovnání s počtem buněk v kontrolní skupině. Tento výsledek, kdy reakce s AGN 193109 inhibovala proliferaci inkubovaných buněk nádoru děložního čípku ukazuje, že AGN 193109 může být užitečnou léčebnou látkou pro léčbu pacientů s metastázovým projevem nádoru děložního čípku.
Do klinické studie pro vysvětlení terapeutického účinku AGN 193109 byli pro tento účel náhodně vybrány pacientky s nádorem děložního čípku, kteří podstoupili chirurgické odstranění primárních nádorů a pacientky s metastázovým rozšířením. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin. První skupina byla kontrolní, zatímco pacientům druhé skupiny se podal AGN 193109. AGN 193109 se smíchal s farmaceuticky přijatelným nodičem za vzniku vhodného složení pro systémové podání, vše pomocí technik známých odborníkům v této oblasti. Kontrolní skupině se podalo v podobě placeba a experimentální skupině se podalo v podobě obsahující negativní hormon AGN 193109. Pacientkám se podala maximální tolerovatelná dávka každý druhý den po dobu tří měsíců až jednoho roku. Kvantitativní výsledek této studie se posuzoval podle příznaků onemocnění na konci sledování. U pacientek, které dostávali AGN 193109, se výrazně zvýšilo přežití bez příznaků chroby, zahrnující nepřiměřený počet pacientek s úplným odstraněním metastáz. Tento výsledek ukazuje, že AGN 193109 má léčebné využití při léčbě krčních karcinomů in vivo, které nereagují na antiproliferatiní účinek retinoidních agonistů, jako je kyselina retinová.
Jak se uvádí výše, AGN 193109 zvyšuje antiproliferativní aktivitu RAR agonistů v primárních kulturách lidských epiteliálních buněk retinálního pigmentu. Proto se u současného podání AGN 193109 s RAR agonistou in vivo důvodně očekává zvýšení léčebného indexu agonisty, protože pro dosažení stejného terapeutického výsledku je třeba menší množství RAR agonisty. Navíc, u AGN 193109 bylo dokázáno zcitlivění primárních kultur lidských epiteliálních buněk retinoidního pigmentu na antiproliferativní účinky glukokortikoidu a agonistů receptoru thyroidního hormonu. Následující králičí model PVR se využil u dvou různých studii pro vysvětlení zvýšení léčebného indexu
15S získaného současným podáním AGN 193109 a RAR agonisty (kyselina 13-c/s retinová) nebo případně antagonisty receptoru thyroidního hormonu. Je třeba si uvědomit, že králičí model retinálního poškození publikovaný Senem a kol. v Arch. Opthalmol. 106:1291 (1988) se použil pro důkaz toho, že retinoidní agonisté, kteří inhibují proliferaci primárních buněk RPE in vitro, také inhibují frekvenci retinálního poškození in vivo (Araiz a kol. Invest. Opthalmol. 34:522 (1993)). Tak s ohledem na jejich využití jako léčebných látek v prevenci retinálního poškození již byla stanovena korelace mezi in vitro a in vivo aktivitami retinoidních agonistů. Následující příklady ukazují, jak se může AGN 193109 využít v léčebných aplikacích jako prevence retinoidního poškození.
Příklad 24
Použití AGN 193109 pro zvýšení léčebného účinku agonistů receptoru steroidní superrodiny při léčbě proliferativní vitreoretinopatie (PVP)
V první studii byly lidské RPE buňky injekčně aplikovány do sklivcové dutiny očí králíka podle metody popsané Senem a kol.v Arch. Opthalmol. 106:1291 (1988). Po intrasklivcové injekci se králíci rozdělili na pět skupin. První skupina (kontrolní) dostala pouze veh. intrasklivcovou injekci. Druhé skupině byla aplikována intrasklivcové injekce kyseliny retinové jako samostatného léčiva (100 pg). Třetí skupině byla aplikována intrasklivcovou injekcí AGN 193109 jako samostatné činidlo (100 pg). Čtvrté skupině byla aplikována intrasklivcové injekce RAR agonisty (kyselina retinová v dávce desetiny množství podaného druhé skupině (10pg). Páté skupině byla aplikována intrasklivcovou injekcí kombinace AGN 193109 (100 pg) a kyseliny retinové (10pg). Zvířata dostala jednu intrasklivcovou injekci určitého léčiva jeden den po intrasklivcové injekci lidských RPE buněk. Králíci se vyšetřili nepřímou oftalmoskopií 7., 14. a 28. den a zjistil se stupeň frekvence a rozsah retinálního poškození. Králíci ze skupiny, která dostala 100 pg kyseliny retinové vykazovali výrazně sníženou frekvenci a rozsah retinálního poškození, ve srovnání s kontrolními králíky nebo králíky, kteří dostali AGN 193109 nebo kyselinu retinovou (1 Opg) samostatné. Králíci ze skupiny, která dostala injekcí kombinaci AGN 193109 (100 pg) a kyseliny retinové (10pg) vykazovali výrazně sníženou frekvenci a rozsah retinálního poškození ve srovnání s kontrolním jedincem, AGN 193109 nebo kyselinou retinovou (10pg). Tento výsledek ukazuje, že AGN
159
193109 zvyšuje terapeutický index RAR agonisty - kyseliny retinové v modelu PVR in vivo.
Ve druhé studii byly králíkům nejprve injekčné aplikovány lidské RPE buňky do sklivcové dutiny oční a pak byli rozděleni na čtyři skupiny. První skupina (kontrolní) dostala pouze veh. intrasklivcovou injekcí. Druhé skupině byl intrasklivcovou injekcí aplikován thyroidní hormon jako samostatné léčivo (100 pg). Třetí skupině bytla intrasklivcovou injekcí aplikována AGN 193109 jako samostatné léčivo (100 pg). Čtvrté skupině byla aplikována kombinace AGN 193109 (100 pg) a thyroidní hormon (100 pg). Králíci se vyšetřili nepřímou oftalmoskopií 7., 14. a 28. den a zjistil se stupeň frekvence a rozsah retinálního poškození. Srovnání frekvence a rozsahu retinoidního poškození u čtyř skupin ukazuje, že reakce s jedním činidlem, AGN 193109 nebo thyroidním hormonem neinhibovala retinální poškození ve srovnání s kontrolními králíky. Naopak, skupina králíků, kterým se podala kombinace AGN 193109 a thyroidního hormonu vykazovala výrazné snížený výskyt a rozsah retinálního poškození. Tento výsledek ukazuje, že AGN 193109 zvyšuje terapeutický index thyriodního hormonu v modelu PVR in vivo.
Následující příklad ukazuje, jak se může AGN 193109 využít pro zvýšení terapeutického indexu RAR agonisty použitého při léčbě pacientů, kteří podstoupili chirurgický zákrok pro odstranění retinálního poškození.
Příklad 25
Zvýšení terapeutického indexu RAR agonisty kyselinou 13-cis retinovou
Nejprve byla vybrána populace dospělých dobrovolníků s retinálním poškozením způsobeným PVR. Osoby podstoupily chirurgický zákrok pro odstranění tohoto poškození použitím standardních postupů v této oblasti. Pacienti byli pak rozděleni na pět skupin. První skupina se skládala z pacientů, kteří podstoupily chirurgický zákrok pro odstranění retinálního poškození a nedostávali žádnou retinoidní sloučeninu. Pacienti druhé skupiny užívali orálně 40 mg kyseliny 13- cis retiniové a dvakrát denně čtyři týdny po operaci. Pacienti třetí skupiny užívali orálně 40 mg AGN 193109 dvakrát denně čtyři týdny po operaci. Apacienti čtvrté skupiny užívali orálně 4 mg kyseliny 13cis retinové dvakrát denně čtyři týdny po operaci. Pacienti páté skupiny užívali orálně 40 mg AGN 193109 v kombinaci se 4 mg kyseliny 13-cis retinové dvakrát denně čtyři
160 týdny po operaci. Protokol léčby a stanovení léčebného účinku se provedlo přesné podle popisu Fekrata a kol. v Opthalmology 102:412 (1995).
Frekvence a rozsah retinálního poškození u pacientů po operaci ve všech pěti skupinách se sledoval po devíti měsících za použití oftalmologických testovacích metod známým odborníkům v této oblasti. Pacienti, kteří dostávali 40 mg kyseliny 13-cis retinové vykazovali výrazně snížený výskyt retinálního poškození ve srovnání s kontrolními pacienty, pacienty, kteří dostávali orálně 4 mg kyseliny 13-cis retinové dvakrát denně nebo pacienty, kteří dostávali 40 mg orálně AGN 193109 dvakrát denně. Po prohlídce pacientů ze skupiny, která dostávala 40 mg AGN 193109 v kombinaci se 4 mg kyseliny 13-cis retinové dvakrát denně čtyři týdny po operaci bylo zjištěno, že terapeutický výsledek této skupiny pacientů byl totožný nebo lepší než u pacientů, kteří dostávali orálně 40 mg kyseliny 13-cis retinové dvakrát denně čtyři týdny po operaci. Tento výsledek ukazuje, že negativní hormon AGN 193109 zvyšuje terapeutický index RAR agonisty snížením frekvence a rozsahu retinálního poškození u PVR pacientů.
Obecné měření pro určení jaderného receptorového negativního hormonu
Výše bylo vysvětleno, že AGN 193109 může vystupovat jako negativní hormon schopný potlačení základní transkripční aktivity RAR jaderných receptorů. Dále bylo popsáno měření pomocí CV-1 buněk kotransfektovaných s ERE-tk-Luc luciferázovým reportním plazmidem a ER-RXR-α a RAR-y-VP-16 receptářových expresních plazmidů pro rozlišení RAR ligandů, které jsou jednoduchými agonisty od těch, které mají negativní hormonální aktivitu,.
Závěrem bylo uvedeno, že RAR negativní hormony ovlivňují potlačení RARzprostředkované transkripční aktivity podpořením zvýšené interakce mezi RAR a NCP. Dále bylo vysvětleno, že AGN 193109 může zvyšovat účinky agonistů jiných jaderných receptorů z hlediska souladu vzájemného sdílení NCP mezi členy steroidní superrodiny jaderných receptorů. Ligandy mohou být tak navrženy a sledovány pro určení sloučenin s negativní hormonální aktivitou na těchto non-RAR jaderných receptorech.
Způsob zjišťováni RAR negativního hormonu založen na použití CV-1 buněk kotransfektovaných s ERE-tk-Luc luciferázovým reportním plazmidem a ER-RXR-α a
RAR-y-VP-16 receptářovými expresnímih plazmidy se může obecné upravit tak, že skupina RAR-γ v RAR-y-VP-16 plazmidu se přemění na peroxizom proliferátorem161 :. - ; :.- :
aktivované receptory (PPAR), receptor vitamínu D (VDR), receptor thyroidního hormonu (T3R) nebo některý jiný jaderný receptor ze steroidní superrodiny jaderného receptoru schopný heterodimerizovat s RXR. CV-1 buňky kotransfektující s takovými plazmidy exprimují vysokou základní hladinu luciferázová aktivity. U ligandů schopných vázat ligand vazebnou doménu receptoru nahrazenou skupinou RAR-γ se negativní hormonální aktivita jednoduše určí měřením jejich schopnosti potlačit luciferázovou aktivitu.
U jaderných receptoru steroidní superrodiny, které neheterodimerizují s RXR (například glukokortikoidové a estrogenové receptory) se může dosáhnout stejného výsledku použitím GV-VP-16 nebo ER-VP-16 receptářů a luciferázového reportního plazmidu, obsahujícího vhodný glukokortikoid nebo estrogen odpovídající část, která se spojí s heterologní promotorovou částí luciferázového nebo jiného reportního genu. Důležitým rysem obecného měření negativní hormonální aktivity je zahrnutí nejméně ligand vazebné domény určitého jaderného receptoru, pro který se měří inverzní agonisté, a metoda určení místa vazebné domény jaderného receptorového ligandu v promotoru reportního genu. Toho se může dosáhnout za použití přirozeného receptorového DNA vazebného místa nebo případně konstrukcí chimerního receptoru s heterologní DNA vazebnou doménou a odpovídajícího použití reportního genu, který je pod kontrolou DNA regulační části, která je rozeznávaná heterologní DNA vazebnou doménou. Výhodndným postupem se plazmid, exprimující jaderný receptor, pro který se měří inverzní agonista, bude exprimovat tento jaderný receptor jako spojení proteinu, obsahujícího konstitutivní aktivační doménu, jako například HSV VP-16 aktivační doménu, pro dosažení vysoké základní aktivity. Tato vysoká základní aktivita bude účinně zvyšovat citlivost měření a tím analýzu jaderných receptářových ligandů, které potlačují transkripční aktivitu v nepřítomnosti přidaného jaderného receptorového agonisty.
Následující příklad uvádí jeden způsob, který se může použit pro screening sloučenin s negativní hormonální aktivitou na receptoru thyroidního hormonu.
Příklad 26
Způsob určení negativních hormonů receptoru thyroidního hormonu
Buňky CV-1 se kotransfektují s luciferázovým reportním plazmidem ERE-tk-Luc a plazmidyER-RXR-α a T3R-VP-16. T3R-VP-16 je shodný s plazmidem RAR-y-VP-16 až
162 na to, že skupina RAR-γ v RAR-y-VP-16 je nahrazena receptorem thyroidního hormonu cDNA. T3R-VP-16 tak exprimuje fúzní protein obsahující aktivační doménu HSV VP-16 v rámci N-terminálního konce receptorů pro thyroidní hormon. Pro tento účel se použila standatdní transfekce a metody pro buněčné kultury. Po transfekci se buňky promyly a nasytily růstovým médiem obsahujícím 10% plodové telecí sérum, které se extrahovalo pomocí aktivního uhlí. Buňky reagovaly pouze s rozpouštědlem (ethanol), thyroidním hormonem (10‘9 až 10'1° M) nebo sloučeninou TR-1 (10’9 až lO^M). TR-1 je syntetický ligand receptorů pro thyroidní hormon, který vykazuje silnou afinitu k receptorů thyroidního hormonu ve studiích o kompetetivní vazbě, ale který neaktivuje transfektovaný receptor thyroidního hormonu v přechodně kotransfektovaném transaktivačním méření za použití reportního genu odpovídajícího thyroidnímu hormonu a expresního plazmidu thyroidního hormonálního receptorů. TR-1 je dále schopen antagonizovat thyroidním hormonem zprostředkovanou transaktivaci a je tak antagonistou thyroidního receptorů.
Analýza luciferázové aktiivity CV-1 buněk transfektovaných s ERE-tk-Luc a plazmidyER-RXR-α a T3R-VP-16 dokazuje vysokou základní hladinu luciferázové reportní aktivity u buněk reagujících s veh. Buňky zreagované s thyroidním hormonem vykazovaly slabé zvýšení luciferázové aktiivity z hlediska závislosti na dávce. Buňky zreagované s TR-1 vykazovaly snížení luciferázové aktiivity v závislosti na dávce. Toto dokazuje, že TR-1 vykazuje inverzní agonní aktivitu thyroidního receptorů, způsobenou pravděpodobné zvýšenou interakcí NCP s receptorem thyroidního hormonu.
Proliferační rychlost epiteliárních buněk lidského primárního retinoidního pigmentu je potlačena reakcí s RAR agonisty. Léčebná cena tohoto zjištění se zjistila při použití retinoidů v pooperační léčbě po chirurgickém zákroku retinoidního pro odstranění retinálního poškození.. Výše jsme uvedli, že AGN 193109 RAR negativní hormon může zcitlivět primární RPE buňky k antiproliferativnímu účinku ATRA a kyseliny 13-c/s retinové při jejich současném podání. AGN 193109 dále prokázal zcitlivění RPE buněk k antiproliferačním účinkům jiných jaderných receptorových agonistů. Přesněji, AGN 193109 zcitlivěla RPE buňky k antiproliferačním účinkům glukokortikoidního agonisty, dexametazonu a agonisty thyroidního hormonu, 3,3’,5trijodthironinu, T3. Tyto skutečnosti jsou v souladu s pracovním modelem, kdy AGN 193109 ovlivňuje dostupnost NCP, které jsou sdíleny členy rodiny jaderného receptorů. Reakce RPE buněk s inverzním agonistou TR-1 receptorů thyroidního hormonu
163 podobně mění dostupnost sdíleného NCP jako v případě současného podání nonthyroidního receptorového agonisty, jako například RAR agonisty kyseliny 13-c/s retinové, což vede ke zvýšení antiproliferativního účinku v RPE kulturách ve srovnání s kyselinou 13-c/s retinovou jako samostatného činidla.
Následující příklad uvádí metodu, která se může použít u primárních RPE buněk senzitivnějších k antiproliferativní aktivitě RAR agonisty. Je třeba si uvědomit, že tento příklad dále uvádí, jak se může zvýšit aktivita RAR agonistů současným podáním negativního hormonu.
Příklad 27
Zcitlivéní epiteliálních buněk primárního retinálního pigmentu k antiproliferativním účinkům RAR agonistů současným podáním inverzního agonisty thyroidního hormonu TR-1
Lidské primární RPE buňky byly získány a kultivovány podle standardních metod. Inkubované buňky se rozdělily na čtyři skupiny a reagovaly následovně. 1. skupina regovala pouze s rozpouštědlem (ethanol). 2. skupina reagovala s kyselinou 13-c/s retinovou v koncentračním rozmezí 10’ až W6 M. 3.skupina reagovala s inverzním agonistou TR-1 thyroidního hormonu v koncentračním rozmezí 10’11 až 10'1 M. 4. skupina reagovala také s kyselinou 13-c/s retinovou v koncentračním rozmezí 10’ 11 až lO^M TR-1. Buňky se inkubovaly v čerstvém růstovém médiu a každý druhý den se znovu přidala určená sloučenina, celkově po dobu pěti dnů. Proliferační rychlost během doby experimentu se kvantitativně měřila podle počtu buněk v kulturách pomocí elektrického počítače buněk.
Buňky reagující s TR-1 (3. skupina) vykazovaly zcela stejnou rychlost buněčné proliferace jako kontrolní (1.skupina) buňky a tento inverzní agonista neměl žádný vliv podle měření rychlosti růstu v kulturách. Buňky zreagované s kyselinou 13-cisretinovou (2. skupina) vykazovaly snížení počtu buněk v závislosti na dávce. Srovnání snížení buněčné proliferace v závislosti na dávce u buněk 4. skupiny (současná reakce 13-c/s-RA a TR-1) se snížením získaným u 3. skupiny dokazuje schopnost současného podání inverzního agonisty TR-1 receptoru thyroidního hormonu zcitlivét RPE kultury k antiproliferativnímu účinku kyseliny 13-c/s retinové, což se po měření projevilo zvýšením křivky odpovědi RAR agonisty v závislosti na dávce ve 4. skupině ve srovnání s buňkami 2. skupiny.
164
Seznam sekvencí (1) obecné informace (i) Přihlašovatel: Allergan (ii) Název vynálezu: Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními hormonálními a/nebo antagonními aktivitami (ill) počet sekvencí: 9 (Iv) korespondenční adresa:
(A) adresát: Knobbe Martens, Olson & Bear (B) ulice: 620 NEWPORT CENTER DRIVE 16th FLOOR (C) město: Newport Beach (D) stát: CA (E) země: U. S. A.
(F) ZIP: 92660 (v) Počítačová Čtecí Forma:
(A) typ prostředku: Disketa (B) počítač: IBM kompatibilní (C) operační systém: DOS (D) software: FastSEQ Verze 1,5 (vi) současné údaje o přihlášce:
(A) číslo přihlášky:
(B) datum registrace:
(C) kategorie:
(vii) dřívější údaje o přihlášce:
(A) číslo přihlášky: 08/522, 778 (B) datum registrace: 1.9.1995 (A) číslo přihlášky: 08/522, 779 (B) datum registrace: 1. 9. 1995
165 1 (A) 08/542, 648 (B) datum registrace: 13.10.1995 (A) číslo přihlášky: 08/613, 863 (B) datum registrace: 11.3.1996 (viii) údaje o zmocnénci/zástupci:
(A) jméno: Altman, Daniel E (B) registrační číslo: 34,115 (C) referenční číslo/ označení: ALRGN. 058A (ix) telekomunikační údaje:
(A) telefon: 714-760-0404 (B) telefax: 714-760-9502 (C) telex:
(2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 1:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE SEQ ID NO; 1:
TCAGGTCACC AGGAGGTCAG A
166 (2) ÚDAJE SEQ ID NO: 2:
(I) sekvenční charakteristiky.
(A) délka: 101 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly; cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
AGAAGCTTAT GGAAGCAATT ATGAGTCAGT TTGCGGGTGA CTCTGCAAAT ACTGCCACTC TATAAAAGTT GGGCTCAGAA AGGTGGACCT CGAGGATCCA G (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 3:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 101 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
101
167 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
CTGGATCCTC GAGGTCCACC TTTCTGAGCC CAACTTTTAT AGAGTGGCAG TATTTGCAGA GTCACCCGCA AACTGACTCA TAATTGCTTC CATAAGCTTC T (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO: 4:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetézcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cdna (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
GTACAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 5:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 16 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetézcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná
101 lt>8 · (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
TCAGGTCATG ACCTGA (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 6:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 7:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární
169'i (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC (2) ÚDAJE O SEQ ID NO. 8:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 20 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednořetézcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8.
ACGCGTCCGG AAGACCTGGT (2) ÚDAJE O SEQ ID NO: 9:
(i) sekvenční charakteristiky:
(a) délka: 20 párů bází (b) typ: nukleová kyselina
170 (c) typ řetězce: jednoretězcová (d) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDN4 (iii) hypotetická: žádná (iv) antimediátorová: žádná (v) typ fragmentu:
(vi) původní zdroj:
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
ATTCTGCAGG TACATGTCCA

Claims (52)

  1. (opravené patentové nároky) PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Sloučenina vzorce w/ kde X je S, O, NR’, kde R’ je H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky;
    Ri je H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky;
    R2 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících F, Cl, Br, I, CF3, fluorem substituovaný alkyl o 1 až 6 uhlících, OH, SH, alkoxy o 1 až 6 uhlících nebo alkylthio o 1 až 6 uhlících;
    R3 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících nebo F;
    m je celé číslo o hodnotě 0-3;
    o je celé číslo o hodnotě 0-3;
    Z je -C^C-N=N-,
    -N=CR, -,
    -CR=N,
    -(CR,=CRi)n· - kde n’ je celé číslo o hodnotě 0-5,
    -CO-NR, -,
    -CS-NR, -,
    -NR, -CO,
    -NR, -CS,
    -COO -,
    -OCO -;
    -CSO -;
    -OCS -;
    172
    Y je fenylová nebo naftylová skupina nebo heteroaryl vybrán ze skupiny sestávající z pyridylu, thienylu, furylu, pyridazinylu, pyrimidinylu, pyrazinylu, thiazolylu, oxazolylu, imidazolylu a pyrrazolylu, fenylová a heteroalylové skupiny jsou volitelně substituovány jednou nebo dvěma R2 skupinami nebo pokud Z je -(CRi=CRi)n· - a n’ je 3,4 nebo 5, pak Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou skupinou (CRi=CRi)n· a B;
    A je (CH2)q kde q je 0-5, nižší rozvětvený alkylový řetězec o 3-6 uhlících, cykloalkenyl o 3-6 uhlících, alkenyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 dvojných vazbách, alkynyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 trojných vazbách;
    B je vodík, COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, COORa , CONRgR10,
    -CH2OH, CH20Rh, CH2OCORh , CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2, CR7ORi3O nebo tri-nižší alkylsilyl, kde R7 je alkylová, cykloalkylové nebo alkenylová skupina o 1 až 5 uhlících, Ra je alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo trimethylsilylalkyl, kde má alkylová skupina 1 až 10 uhlíků, nebo cykloalkylové skupina o 5 až 10 uhlících nebo Ra je fenyl nebo nižší alkylfenyl, R3 a Ri0 je nezávisle vodík, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo cykloalkylové skupina o 5 až 10 uhlících nebo fenyl nebo nižší alkylfenyl, Rn je nižší alkyl, fenyl nebo nižší alkylfenyl, R12 je nižší alkyl a Ri3 je divalentní alkylový radikál o 2-5 uhlících a
    Ru je (Ris)r -fenyl, (Ri5)r -naftyl nebo (R15)r -heteroaryl, kde heteroarylová skupina obsahuje 1 až 3 heteroatomy vybrány ze skupiny sestávající z O, S a N, r je celé číslo o hodnotě 0-5 a
    Ris je nezávisle H, F Cl, B, I, NO2, N(Re)2, NH(R)8, CORe, NReCON(Re)2, OH, OCORe, OR$, CN, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, fluorem substituovaná alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, alkenylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 dvojných vazbách, alkynylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 trojných vazbách nebo trialkylsilylová nebo trialkylsilyloxy skupina, kde alkylové skupiny mají nezávisle 1 až 6 uhlíků.
  2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je fenyl, pyridyl, thienyl nebo furyl.
  3. 3. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je fenyl.
  4. 4. Sloučenina podle nároku 3, kde je fenylový kruh 1,4 (para) substituován.
  5. 5. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je naftyl.
  6. 6. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je pytidyl.
  7. 7. Sloučenina podle nároku 1, kde Y je thienyl nebo furyl.
    173
  8. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -(CRí - CRi)n · a n’ je 3, 4 nebo 5 a Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou skupinou (CRi =CRi)n· a B.
  9. 9. Sloučenina podle nároku 1, kde R2 je H, F nebo CF3.
  10. 10. Sloučenina podle nároku 1, kde R3 je H nebo methyl.
  11. 11. Sloučenina podle nároku 1, kde R14 je (Ris)r - fenyl.
  12. 12. Sloučenina podle nároku 1, kde R14 je (R15)r - heteroaryl.
  13. 13. Sloučenina podle nároku 12, kde R14 je (R15)r - heteroaryl, kde je heteroarylovou skupinou pěti nebo šesti členný kruh s 1 nebo 2 heteroatomy.
  14. 14. Sloučenina podle nároku 13, kde je heteroarylové skupina vybrána z 2pyridylu, 3-pyridylu, 2-thienylu a 2-thiazolylu.
  15. 15. Sloučenina podle nároku 1, kde skupina Ri5 je H, CF3, F, nižší alkyl, nižší alkoxy, hydroxy nebo chlor.
  16. 16. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -C =C -.
  17. 17. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -N=N-
  18. 18. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -CO-NRt -.
  19. 19. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -CS-NRt
  20. 20. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je -COO-.
  21. 21. Sloučenina podle nároku 1, kde Z je (CRi =CRi)n· a n’ je 1.
  22. 22. Použití retinoidního agonisty nebo negativního hormonu schopného vazby na subtyp receptoru pro kyselinu retinovou, vybraného ze skupiny sestávající z RARa, RARp a RARy k přípravě léčiv pro léčbu patologických stavů u savců, stavů, které je možné léčit retinoidním antagonistou nebo negativním hormonem.
  23. 23. Použití podle nároku 22, kde uvedené léčivo potlačuje toxicitu nebo nežádoucí vedlejší účinky, způsobené podáním retinoidní sloučeniny zmíněným savcům.
  24. 24. Použití podle nároku 23, kde uvedené léčivo potlačuje vzniklé patologické stavy, způsobené příjmem retinoidní látky nebo vitamínu A nebo prekurzoru vitamínu A savcem.
  25. 25. Použití podle nároku 24, kde uvedené léčivo je pro lokální použití.
  26. 26. Použití podle nároku 22, kde uvedené léčivo je pro systémové použití.
  27. 27. Použití podle nároku 22, kde se retinoidní antagonista nebo negativní hormon váže na subtyp retinoidního receptoru s Ka menší než přibližně 1 mikromolární.
    174
  28. 28. Použití podle nároku 22, kde má negativní hormon nebo antagonista vzorec:
    v němž X je S, O, NR’, kde R’ je H nebo alkyl s 1 až 6 uhlíky, nebo
    X je [C(R1)2]n, kde Ri je nezávisle H nebo alkyl o 1 až 6 uhlících a n je celé číslo od 0 do 2;
    R2 je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících F, Cl, Br, I, CF3, fluorem substituovaný alkyl o 1 až 6 uhlících, OH, SH, alkoxy o 1 až 6 uhlících nebo alkylthio o 1 až 6 uhlících;
    Rs je vodík, nižší alkyl o 1 až 6 uhlících nebo F;
    m je celé číslo o hodnotě 0-3;
    o je celé číslo o hodnotě 0-3;
    Z je -CsC-N=N-,
    -N=CR1 -,
    -CR=N,
    -(CRi=CRi)n - kde n’ je celé číslo o hodnotě 0-5,
    -CO-NR! -,
    -CS-NR, -,
    -NR, -CO,
    -NRi -CS,
    -COO -,
    -OCO -;
    -CSO -;
    -OCS -;
    175
    Y je fenylová nebo naftylová skupina nebo heteroaryl ze skupiny sestávající z pyridylu, thienylu, furylu, pyridazinylu, pyrimidinylu, pyrazinylu, thiazolylu, oxazolylu, imidazolylu a pyrazolylu, fenylové a heteroalylové skupiny jsou volitelně substituovány jednou nebo dvěma R2 skupinami nebo pokud Z je -(CRi=CRi)n- - a n’ je 3,4 nebo 5, pak Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou skupinou (CR^CROn· a B;
    A je (CH2)q , kde q je 0-5, nižší rozvětvený alkylový řetězec o 3-6 uhlících, cykloalkyl o 3-6 uhlících, alkenyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 dvojných vazbách alkynyl o 2-6 uhlících a 1 nebo 2 trojných vazbách;
    B je vodík, COOH nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, COOR8 , CONR9R10, CH2OH, CH2ORu, CH2OCORu , CHO, CH(OR12)2, CHOR13O, -COR7, CR7(OR12)2. CR^RnO nebo tri-nižší alkylsilyl, kde R7 je alkylová, cykloalkylová nebo alkenylová skupina o 1 až 5 uhlících, R8 je alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo trimethylsilylalkyl, kde má alkylová skupina 1 až 10 uhlíků, nebo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo R8 je fenyl nebo nižší alkylfenyl, R9 a R10 je nezávisle vodík, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících nebo cykloalkylová skupina o 5 až 10 uhlících nebo fenyl nebo nižší alkylfenyl, Rn je nižší alkyl, fenyl nebo nižší alkylfenyl, R12 je nižší alkyl a R13 je divalentní alkylový radikál o 2-5 uhlících a
    R14 je (Ris)r -fenyl, (R15)r -naftyl nebo (Ri5)r . heteroaryl kde heteroarylová skupina obsahuje 1 až 3 heteroatomy vybrány ze skupiny sestávající z O, S a N, r celé číslo o hodnotě 0-5 a
    R15 je nezávisle H, F Cl, B, I, NO2, N(R8)2, NH(R8)COR8, NR8CON(R8)2, OH, OCOR8, OR8, CN, alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, fluorem substituovaná alkylová skupina o 1 až 10 uhlících, alkenylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 dvojných vazbách, alkynylová skupina o 1 až 10 uhlících a 1 až 3 trojných vazbách nebo trialkylsilylová nebo trialkylsilyloxy skupina, kde alkylové skupiny obsahují nezávisle 1 až 6 uhlíků.
  29. 29. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je Y fenyl, pyridyl, thienyl nebo furyl.
  30. 30. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je Y fenyl.
  31. 31. Použiti podle nároku 30, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je fenylový kruh 1,4 (para) substituován.
    176
  32. 32. Použití podle nároku 28, kde hormonu je Y naftyl.
  33. 33. Použití podle nároku 28, kde hormonu jeY pyridyl.
  34. 34. Použití podle nároku 28, kde hormonu je Y thienyl nebo furyl.
    ve vzorci antagonisty nebo negativního ve vzorci antagonisty nebo negativního ve vzorci antagonisty nebo negativního
  35. 35. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu Z je -(CRi - CR^n -, a n’ je 3,4 nebo 5, a Y představuje přímou valenční vazbu mezi uvedenou skupinou (CRi =CRi)n· a B.
  36. 36. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je R2 - H, F nebo CF3.
  37. 37. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je R3 - H nebo methyl.
  38. 38. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je R14 -(Ris)r - fenyl.
  39. 39. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je R14 -(R15)r - heteroaryl.
  40. 40. Použití podle nároku 39, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je R14 -(Ris)r - heteroaryl, kde je heteroarylovou skupinou pěti nebo šesti členný kruh s 1 nebo 2 heteroatomy.
  41. 41. Použití podle nároku 40, kde ve vzorci antagonisty je heteroarylová skupina vybrána z 2-pyridylu, 3-pyridylu, 2-thienylu a 2-thiazolylu.
  42. 42. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu skupina R15 je H, CF3, F, nižší alkyl, nižší alkoxy, hydroxy nebo chlor.
  43. 43. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je Z -C =C-
  44. 44. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je Z -N=N-
  45. 45. Použití podle nároku 28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního hormonu je Z -CO-NR!-.
    nároku
    28, kde ve vzorci antagonisty nebo negativního
    177
  46. 46. Použití podle hormonu je Z -CS-NRi -.
  47. 47. Použití podle hormonu je Ri - H.
  48. 48. Použití podle hormonu je Z -COO-.
  49. 49. Použití podle nároku nároku
    46,
    28, nároku hormonu je Z - (CRí =CR1)n- a n’ je 1.
  50. 50. Použití podle nároku 28, hormonu je X- [CÍROJn a n je 1 nebo 0.
  51. 51. Použití podle nároku 28, hormonu je X - S, O nebo NR’.
  52. 52. Sloučenina vzorce
CZ98621A 1995-09-01 1996-08-23 Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními a/nebo antagonními aktivitami CZ62198A3 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US52277895A 1995-09-01 1995-09-01
US52277995A 1995-09-01 1995-09-01
US54264895A 1995-10-13 1995-10-13
US08/613,863 US5776699A (en) 1995-09-01 1996-03-11 Method of identifying negative hormone and/or antagonist activities

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ62198A3 true CZ62198A3 (cs) 1998-11-11

Family

ID=27504571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98621A CZ62198A3 (cs) 1995-09-01 1996-08-23 Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními a/nebo antagonními aktivitami

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5776699A (cs)
EP (2) EP0853610B1 (cs)
JP (1) JP4295357B2 (cs)
KR (3) KR100447046B1 (cs)
CN (2) CN1121379C (cs)
AT (2) ATE233726T1 (cs)
AU (1) AU713586B2 (cs)
BR (1) BR9610412A (cs)
CA (1) CA2230672C (cs)
CZ (1) CZ62198A3 (cs)
DE (2) DE69626528T2 (cs)
ES (2) ES2205380T3 (cs)
HU (2) HU0202511D0 (cs)
IL (5) IL153305A0 (cs)
NO (1) NO317562B1 (cs)
NZ (2) NZ319762A (cs)
PL (1) PL188705B1 (cs)
RU (1) RU2203884C2 (cs)
WO (1) WO1997009297A2 (cs)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7655699B1 (en) 1992-04-22 2010-02-02 Eisai Inc. Compounds having selective activity for retinoid X receptors, and means for modulation of processes mediated by retinoid X receptors
GB9222253D0 (en) * 1992-10-23 1992-12-09 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9304920D0 (en) * 1993-03-10 1993-04-28 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9304919D0 (en) * 1993-03-10 1993-04-28 Celltech Ltd Chemical compounds
JP3806144B2 (ja) * 1993-12-22 2006-08-09 セルテック セラピューティックス リミテッド 三置換フェニル誘導体、その調製方法とホスホジエステラーゼ（ｉｖ型）阻害剤としてのその使用
US6245774B1 (en) 1994-06-21 2001-06-12 Celltech Therapeutics Limited Tri-substituted phenyl or pyridine derivatives
US6942980B1 (en) * 1995-09-01 2005-09-13 Allergan, Inc. Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US5958954A (en) * 1995-09-01 1999-09-28 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9526243D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9526245D0 (en) * 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5877207A (en) * 1996-03-11 1999-03-02 Allergan Sales, Inc. Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
KR100485642B1 (ko) * 1996-03-18 2005-09-30 에자이 가부시키가이샤 축합고리함유카르복실산유도체
GB9608435D0 (en) * 1996-04-24 1996-06-26 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
AU724541B2 (en) * 1996-06-21 2000-09-21 Allergan, Inc. Substituted tetrahydronaphthalene and dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
US5773594A (en) 1996-06-21 1998-06-30 Allergan Alkyl or aryl substituted dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
US6555690B2 (en) 1996-06-21 2003-04-29 Allergan, Inc. Alkyl or aryl substituted dihydronaphthalene derivatives having retinoid and/or retinoid antagonist-like biological activity
GB9619284D0 (en) * 1996-09-16 1996-10-30 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9622363D0 (en) * 1996-10-28 1997-01-08 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9625184D0 (en) * 1996-12-04 1997-01-22 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US6057329A (en) * 1996-12-23 2000-05-02 Celltech Therapeutics Limited Fused polycyclic 2-aminopyrimidine derivatives
US5760276A (en) * 1997-03-06 1998-06-02 Allergan Aryl-and heteroarylcyclohexenyl substituted alkenes having retinoid agonist, antagonist or inverse agonist type biological activity
AU6955898A (en) * 1997-04-11 1998-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Retinoid antagonists and uses thereof
KR20040031107A (ko) 1997-11-12 2004-04-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 레티노이드 길항제를 이용한 제2형 ｔ-보조세포 중재면역질환의 치료
IL142094A0 (en) * 1998-09-29 2002-03-10 Gamida Cell Ltd Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
US6403638B1 (en) 1998-10-01 2002-06-11 Allergan Sales, Inc. 2,4-pentadienoic acid derivatives having selective activity for retinoid X (RXR) receptors
US6048873A (en) * 1998-10-01 2000-04-11 Allergan Sales, Inc. Tetrahdroquinolin-2-one 6 or 7-yl, tetrahdroquinilin-2-thione 6 or 7-yl pentadienoic acid and related derivatives having retinoid-like biological activity
US6147224A (en) * 1998-10-01 2000-11-14 Allergan Sales, Inc. 2,4-pentadienoic acid derivatives having selective activity for retinoid X (RXR) receptors
DE69923854T2 (de) * 1998-10-08 2006-01-12 Allergan, Inc., Irvine Rar-antagonisten zur verhütung für männer
US6521641B1 (en) * 1998-10-08 2003-02-18 Allergan, Inc. Male anti-fertility agents
AU1229000A (en) * 1998-10-23 2000-05-15 Glaxo Group Limited Assays for ligands for nuclear receptors
US6326397B1 (en) 1998-11-10 2001-12-04 Hoffman-La Roche Inc. Retinoid antagonists and use thereof
US6054623A (en) * 1998-12-18 2000-04-25 Alliedsignal Inc. Hydroxythiol grignard reaction synthesis
TR200102587T2 (tr) * 1999-03-08 2002-03-21 Basilea Pharmaceutica Ag Retinoid antagonistleri ve bunlarìn kullanìmlarì.
WO2000061233A2 (en) 1999-04-14 2000-10-19 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for the treatment and prevention of lung disease involving a specific rar-gamma agonist
AU4225500A (en) * 1999-04-14 2000-11-14 Allergan Sales, Inc. Methods and compositions for the treatment and prevention of lung disease
DE60035271D1 (en) 1999-04-28 2007-08-02 Inst Med Molecular Design Inc Pyrimidincarbonsäurederivate
EP1185539B1 (en) 1999-06-11 2004-12-01 Allergan, Inc. Organosilyl compounds having nuclear hormone receptor modulating activity
US6906057B1 (en) 1999-06-11 2005-06-14 Allergan, Inc. Methods for modulating FXR receptor activity
MXPA02002032A (es) 1999-08-27 2003-05-19 Ligand Pharm Inc Compuestos moduladores del receptor de androgeno y metodos.
US6667313B1 (en) 1999-08-27 2003-12-23 Ligand Pharmaceuticals Inc. 8-substituted-6-triflouromethyl-9-pyrido [3,2-G] quinoline compounds as androgen receptor modulators
US6566372B1 (en) 1999-08-27 2003-05-20 Ligand Pharmaceuticals Incorporated Bicyclic androgen and progesterone receptor modulator compounds and methods
PE20010647A1 (es) * 1999-09-14 2001-06-23 Lilly Co Eli Moduladores de receptores de retinoide x (rxr) con perfil farmacologico mejorado
US6313168B1 (en) * 1999-12-15 2001-11-06 Allergan Sales, Inc. Use of retinoid receptor antagonists in the treatment of cartilage and bone pathologies
US20030114482A1 (en) * 1999-12-15 2003-06-19 Maurizio Pacifici Use of retinoid receptor antagonists or agonists in the treatment of cartilage and bone pathologies
US6713515B2 (en) 2000-09-13 2004-03-30 Bristol Myers Squibb Company Retinoic acid receptor antagonists as promoters of angiogenesis
US20030003517A1 (en) * 2001-03-22 2003-01-02 Klein Elliott S. Methods of detecting dissociated nuclear hormone receptor ligands
US20020193403A1 (en) 2001-05-03 2002-12-19 Allergan Sales, Inc. Methods of treating hyperlipidemia
MXPA03010810A (es) 2001-05-29 2004-03-22 Schering Ag Pirimidinas inhibidoras de cdk, su obtencion y su uso como medicamentos.
US7482366B2 (en) 2001-12-21 2009-01-27 X-Ceptor Therapeutics, Inc. Modulators of LXR
EP1465869B1 (en) 2001-12-21 2013-05-15 Exelixis Patent Company LLC Modulators of lxr
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (en) * 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR EXPANSION OF STEM AND PRESERVATIVE CELLS AND EXPANDED CELL POPULATIONS THEREWITH OBTAINED
US20040014117A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-22 Sention Apparatus for polynucleotide detection and quantitation
WO2004014388A1 (en) * 2002-08-13 2004-02-19 Warner-Lambert Company Llc 6,6-fused heteroaryl derivatives as matrix metalloproteinase inhibitors
US7105566B2 (en) * 2002-10-22 2006-09-12 Allergan, Inc. Methods of treatment during vascular procedures
FR2847255B1 (fr) * 2002-11-18 2006-11-17 Galderma Res & Dev Nouveaux ligands antagonistes des recepteurs rars, leur procede de preparation et leur utilisation en medecine humaine ainsi qu'en cosmetique
CA2505286C (en) 2002-11-18 2012-02-07 Galderma Research & Development, S.N.C. Novel ligands that are antagonists of rar receptors, process for preparing them and use thereof in human medicine and in cosmetics
US20050026950A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using retinoids to achieve consistent bioavailability
US20050026949A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoids without regard to body weight
US20050026951A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using retinoids with reduced drug interaction
EP1653941A1 (en) * 2003-07-30 2006-05-10 Allergan, Inc. Methods of therapeutic treatment using amounts of retinoid components
US20070224278A1 (en) * 2003-11-12 2007-09-27 Lyons Robert T Low immunogenicity corticosteroid compositions
US20060141049A1 (en) * 2003-11-12 2006-06-29 Allergan, Inc. Triamcinolone compositions for intravitreal administration to treat ocular conditions
US20050101582A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-12 Allergan, Inc. Compositions and methods for treating a posterior segment of an eye
US20050250737A1 (en) * 2003-11-12 2005-11-10 Allergan, Inc. Therapeutic ophthalmic compositions containing retinal friendly excipients and related methods
DE602004019685D1 (de) * 2003-12-26 2009-04-09 Allergan Inc DISUBSTITUIERTE CHALCOGENOXIME MIT ANTAGONISTISCHER WIRKUNG AM RAR(Gamma)-RETINOIDREZEPTOR
BRPI0506983A (pt) 2004-01-20 2007-07-03 Allergan Inc composições para terapia localizada dos olhos, compreendendo preferencialmente acetonida de triancinolona e ácido hialurÈnico
US7993634B2 (en) 2004-04-30 2011-08-09 Allergan, Inc. Oil-in-oil emulsified polymeric implants containing a hypotensive lipid and related methods
US7771742B2 (en) 2004-04-30 2010-08-10 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants containing tyrosine kinase inhibitors and related methods
US8455656B2 (en) 2004-04-30 2013-06-04 Allergan, Inc. Kinase inhibitors
US8425929B2 (en) 2004-04-30 2013-04-23 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for preventing retinal dysfunction
US20050244466A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Photodynamic therapy in conjunction with intraocular implants
US20050244471A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Estradiol derivative and estratopone containing sustained release intraocular implants and related methods
US20050244472A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems containing excipients with reduced toxicity and related methods
US8119154B2 (en) * 2004-04-30 2012-02-21 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and related methods
WO2005107708A1 (en) 2004-04-30 2005-11-17 Allergan, Inc. Biodegradable intravitreal tyrosine kinase inhibitors implants
US20050244465A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Drug delivery systems and methods for treatment of an eye
US9498457B2 (en) 2004-04-30 2016-11-22 Allergan, Inc. Hypotensive prostamide-containing biodegradable intraocular implants and related implants
US20050244461A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Controlled release drug delivery systems and methods for treatment of an eye
US8673341B2 (en) 2004-04-30 2014-03-18 Allergan, Inc. Intraocular pressure reduction with intracameral bimatoprost implants
US20050244462A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Devices and methods for treating a mammalian eye
US8147865B2 (en) 2004-04-30 2012-04-03 Allergan, Inc. Steroid-containing sustained release intraocular implants and related methods
US20050244478A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Anti-excititoxic sustained release intraocular implants and related methods
US8591885B2 (en) * 2004-04-30 2013-11-26 Allergan, Inc. Carbonic anhydrase inhibitor sustained release intraocular drug delivery systems
US20050244463A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for treating ocular vasculopathies
US7799336B2 (en) * 2004-04-30 2010-09-21 Allergan, Inc. Hypotensive lipid-containing biodegradable intraocular implants and related methods
US8722097B2 (en) 2004-04-30 2014-05-13 Allergan, Inc. Oil-in-water method for making polymeric implants containing a hypotensive lipid
US20070059336A1 (en) * 2004-04-30 2007-03-15 Allergan, Inc. Anti-angiogenic sustained release intraocular implants and related methods
US20050244458A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-03 Allergan, Inc. Sustained release intraocular implants and methods for treating ocular neuropathies
EP2216026B1 (en) * 2004-07-12 2016-04-20 Allergan, Inc. Ophthalmic compositions and uses for treating ophthalmic conditions
EP1621191A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-01 Werner Bollag Treatment of inflammatory diseases by RXR Antagonists
EP1799812A4 (en) 2004-09-16 2009-09-09 Gamida Cell Ltd EX VIVO CULTIVATION METHODS OF STEM CELLS AND PRECURSOR BY CO-CULTURE WITH MESENCHYMAL CELLS
PL1937244T3 (pl) 2005-09-30 2019-01-31 Io Therapeutics, Llc Leczenie nowotworu specyficznymi agonistami rxr
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
JP2009537540A (ja) * 2006-05-16 2009-10-29 ビテ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学療法および／または放射線療法の副作用を処置するためのｒａｒアンタゴニストまたはｒａｒインバースアゴニストの使用
US8969415B2 (en) 2006-12-01 2015-03-03 Allergan, Inc. Intraocular drug delivery systems
PT2120917E (pt) * 2007-02-28 2014-04-24 Univ Kentucky Res Found Método para aliviar os efeitos secundários da terapia com ácido retinóico e/ou melhorar a sua eficácia sem interferir com a eficácia desse tratamento
US7911053B2 (en) * 2007-04-19 2011-03-22 Marvell World Trade Ltd. Semiconductor packaging with internal wiring bus
US8082730B2 (en) * 2008-05-20 2011-12-27 Caterpillar Inc. Engine system having particulate reduction device and method
KR101041281B1 (ko) * 2009-05-18 2011-06-14 주식회사 니프코코리아 자동차의 에어벤트 다이얼
US20110124736A1 (en) 2009-11-09 2011-05-26 Allergan, Inc. Compositions and methods for stimulating hair growth
CA2838179A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Allergan, Inc. Targeted delivery of retinoid compounds to the sebaceous glands
AU2012352149B2 (en) 2011-12-13 2017-06-01 Io Therapeutics, Inc. Autoimmune disorder treatment using RXR agonists
US10653650B2 (en) 2011-12-13 2020-05-19 Io Therapeutics, Inc. Treatment of diseases by concurrently eliciting remyelination effects and immunomodulatory effects using selective RXR agonists
EP2814950A1 (en) 2012-02-13 2014-12-24 Gamida-Cell Ltd. Mesenchymal stem cells conditioned medium and methods of generating and using the same
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US20140094512A1 (en) 2012-10-02 2014-04-03 Nikolas Gunkel Method of modulating the degree of adipose tissue deposited intramuscularly
CA2901280A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Allergan, Inc. Sustained drug delivery implant
CN108289958A (zh) 2015-10-31 2018-07-17 Io治疗公司 使用rxr激动剂和甲状腺激素的组合治疗神经系统紊乱
WO2017091762A1 (en) 2015-11-25 2017-06-01 Io Therapeutics, Inc. Use of cyp26-resistant rar alpha selective agonists in the treatment of cancer
CN109414384A (zh) 2016-02-03 2019-03-01 高德美研究及发展公司 新的双芳香基丙炔基化合物，包含该化合物的药物和化妆品组合物及其用途
KR102605349B1 (ko) 2016-03-10 2023-11-22 아이오 테라퓨틱스, 인크. Rxr 작용제 및 갑상선 호르몬의 조합을 사용한 자가면역 질환의 치료
AU2016396659B2 (en) 2016-03-10 2019-02-14 Io Therapeutics, Inc. Treatment of muscular disorders with combinations of RXR agonists and thyroid hormones
WO2017152725A1 (zh) * 2016-03-11 2017-09-14 中国科学院上海有机化学研究所 一种视黄酸类化合物、其制备方法、中间体及应用
CN107176945B (zh) * 2016-03-11 2021-06-08 中国科学院上海有机化学研究所 一种视黄酸类化合物、其制备方法、中间体及应用
CN109310763B (zh) 2016-06-10 2022-10-21 Io治疗公司 用于癌症免疫疗法的受体选择性类视黄醇和rexinoid化合物和免疫调节剂
WO2019014468A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Io Therapeutics, Inc. RECEPTOR SUBTYPE AND RETINOID COMPOUNDS AND SELECTIVE REXINOIDS OF A FUNCTION IN COMBINATION WITH IMMUNE MODULATORS FOR ANTICANCER IMMUNOTHERAPY
EP3675843A4 (en) 2017-08-31 2021-11-03 IO Therapeutics, Inc. RAR-SELECTIVE AGONISTS IN COMBINATION WITH IMMUNE MODULATORS FOR CANCER THERAPY
CA3076373A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Io Therapeutics, Inc. Treatment of disease with esters of selective rxr agonists
US10966950B2 (en) 2019-06-11 2021-04-06 Io Therapeutics, Inc. Use of an RXR agonist in treating HER2+ cancers
US11998521B2 (en) 2021-12-07 2024-06-04 Io Therapeutics, Inc. Use of an RXR agonist in treating drug resistant HER2+ cancers
JP2024543621A (ja) 2021-12-07 2024-11-21 アイオー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｅｒ２＋がんの治療におけるｒｘｒアゴニストおよびタキサンの使用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5217867A (en) * 1988-11-30 1993-06-08 The Salk Institute For Biological Studies Receptors: their identification, characterization, preparation and use
WO1990007517A1 (en) * 1988-12-23 1990-07-12 The Salk Institute For Biological Studies Receptor transcription-repression activity compositions and methods
DE69106098T2 (de) * 1990-03-20 1995-05-24 Shionogi & Co Neuer prozess zur herstellung eines benzoesäurederivates.
CA2115452A1 (en) * 1991-09-17 1993-04-01 Ronald M. Evans Receptor of the thyroid/steroid hormone receptor superfamily
EP0617020A1 (en) * 1992-04-02 1994-09-28 Shudo, Koichi, Prof. Dr. Carboxylic acid derivatives having retinoic acid-like activity
ATE256653T1 (de) * 1992-04-22 2004-01-15 Ligand Pharm Inc Verbindungen mit retinoid x receptorselektivität
EP0638071B1 (en) * 1992-12-28 1997-04-09 Eisai Co., Ltd. Heterocyclic carbonic acid derivatives which bind to retinoid receptors (rar)
CA2138000A1 (en) * 1994-01-03 1995-07-04 John E. Starrett, Jr. Retinoid-like compounds

Also Published As

Publication number Publication date
WO1997009297A2 (en) 1997-03-13
EP0931786A3 (en) 1999-09-01
ATE233726T1 (de) 2003-03-15
DE69629399T2 (de) 2004-05-27
RU2203884C2 (ru) 2003-05-10
KR100447047B1 (ko) 2004-09-07
HK1018771A1 (en) 2000-01-07
JP2002504887A (ja) 2002-02-12
JP4295357B2 (ja) 2009-07-15
IL153296A0 (en) 2003-07-06
CN1360890A (zh) 2002-07-31
DE69629399D1 (de) 2003-09-11
EP0853610A2 (en) 1998-07-22
IL123490A0 (en) 1998-09-24
KR100447046B1 (ko) 2004-11-17
CN1209802A (zh) 1999-03-03
DE69626528T2 (de) 2003-12-24
PL325249A1 (en) 1998-07-06
NO980880D0 (no) 1998-02-27
BR9610412A (pt) 1999-07-06
EP0853610B1 (en) 2003-03-05
HU0202511D0 (cs) 2002-09-28
IL153307A0 (en) 2003-07-06
US5776699A (en) 1998-07-07
EP0931786A2 (en) 1999-07-28
NZ500397A (en) 2001-06-29
KR20040004463A (ko) 2004-01-13
CN1121379C (zh) 2003-09-17
HUP9902337A3 (en) 2000-02-28
IL123490A (en) 2010-05-17
KR20040004464A (ko) 2004-01-13
WO1997009297A3 (en) 1997-08-28
CA2230672C (en) 2006-10-31
CA2230672A1 (en) 1997-03-13
NO317562B1 (no) 2004-11-15
NZ319762A (en) 2000-01-28
ES2205380T3 (es) 2004-05-01
KR19990044302A (ko) 1999-06-25
AU7235496A (en) 1997-03-27
EP0931786B1 (en) 2003-08-06
ATE246669T1 (de) 2003-08-15
IL153306A0 (en) 2003-07-06
DE69626528D1 (de) 2003-04-10
IL153305A0 (en) 2003-07-06
ES2195014T3 (es) 2003-12-01
HUP9902337A2 (hu) 1999-10-28
AU713586B2 (en) 1999-12-02
PL188705B1 (pl) 2005-03-31
KR100447045B1 (ko) 2004-09-07
NO980880L (no) 1998-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ62198A3 (cs) Syntéza a použití retinoidních sloučenin s negativními a/nebo antagonními aktivitami
US5958954A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6521624B1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US5877207A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6469028B1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or anatgonist activities
US6218128B1 (en) Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
US20030219832A1 (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
US6942980B1 (en) Methods of identifying compounds having nuclear receptor negative hormone and/or antagonist activities
HK1019324A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
JP2008280346A (ja) ネガティブホルモン活性および／または拮抗薬活性を有するレチノイド化合物の合成と使用
HK1078867A (en) Synthesis and use of retinoid compounds having negative hormone and/or antagonist activities
HK1030167B (en) Benzopyran and benzothiopyran derivatives having retinoid antagonist like activity

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic