CZ63796A3 - Genes of acarbose biosynthesis from actinoplanes sp., process of their isolation and use - Google Patents
Genes of acarbose biosynthesis from actinoplanes sp., process of their isolation and use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ63796A3 CZ63796A3 CZ96637A CZ63796A CZ63796A3 CZ 63796 A3 CZ63796 A3 CZ 63796A3 CZ 96637 A CZ96637 A CZ 96637A CZ 63796 A CZ63796 A CZ 63796A CZ 63796 A3 CZ63796 A3 CZ 63796A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- acarbose
- dna
- gene
- genes
- obtained according
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/365—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinoplanes (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Quinoline Compounds (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
Description
Vynález se týká genů biosyntesy acarbosy z Actinomycet, obzvláště Actinoplanes sp. SE 50/110 a jeho mutantů, způsobu isolace genů biosyntesy acarbosy z Actinoraycet pomocí genové sondy, odvozené od vysoce konservované proteinové oblasti známého enzymu dTDP-glukoso-dehydratázy, pro nalezení genů acbA (kódovaný pro dTDP-glukoso-syntetázu), acbB (kódovaný pro dTDP-glukoso-dehydratázu) a acbC (kódovaný pro cyklázu, zčásti identický s AroB, bakteriální syntetázou kyseliny 3-dehydrochinové), nebo jednoho nebo více genů biosyntesy acarbosy z Actinoplanes sp. , jakož i použití genů biosyntesy acarbosy.
Dosavadní stav techniky
Předmětem starších přihlášek (například DE 2 064 092, DE 2 209 834) je poznatek, že řada Actinomycet, především Actinoplanacet, tvoří inhibitory glykosid-hydroláz oligosacharidového typu, výhodně uhlohydráty štěpících enzymů trávicího traktu. Jako nejvýkonnější inhibitor této skupiny je uváděna sloučenina 0-4,6-dideoxy-4-[[IS-(IS, 4R, 5S, 6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-cyklohexen-l-yl]-amino] -α-D-glukopyranosyl- (1—>4) -O-ct-D-glukopyranosyl- (1—>4) -D-glukopyranosa, označovaná jako acarbosa (DE 2 347 782).
Acarbosa se používá při ošetření diabetes mellitus v humánní medicíně. Tvorba sekundárních metabolitú acarbosy se provádí pomocí Actinoplanes sp. SE 50 (CBS č. 961.70) a pomocí přírodní varianty tohoto kmene SE 50/110 (CBS 614.71) , jakož i jejich selektantů a mutantú. Původní isolant pochází z Keni okolo Ruiru. V uvedených patentových přihláškách, například v příkladech 1 až 4 německé patentové přihlášky P 20 09 834 je získání takovéhoto inhibitoru sacharázy popsáno.
Ze struktury acarbosy se předpokládá, že deoxyglukosová část molekuly acarbosy je tvořena podobně jako při biosyntese zbytků 6-deoxycukrů různých antibiotik (například aminoglykosidy, jako je streptomycin a kasugamycin; makrolidy, jako je erythromycin a tylosin; polyeny, jako je amphotericin A, Ba nystatin; anthracykliny, jako je daunorubicin; glykopeptidy, jako je vancomycin).
Pomocí genové technologie se dají určité geny isolovat přímo z genomu, přičemž se používají například genové sondy, které se specificky vážou na DNA-sekvenci. Tím se může isolovaný gen získat z velkého počtu neznámých sekvencí.
Dále je u Actinomycet, především u Streptomycet, známé, že u dosud zkoumaných producentů sekundárních metabolitú jsou geny biosyntesy uspořádány vedle sebe na chromosomu, vzácněji na plasmidu, v clusteru [Martin J. F., J. Ind. Microbiol 9, 73-90 /1992/ ; Cháter K. F., Ciba Found. Symp., 171 (Secondary Metabolites: Their Function and Evolution) 144-162 /1992/] . Tím se mohou získáváním pomocí genových sond isolovat sousední, dosud neznámé geny biosyntesy, jejichž význam pro biosyntesu může být potom objasněn.
Odpovídající použití molekulárně biologických technik
Λ-'
se uActinoplanacet dosud ještě nepodařilo a nebýlo utěchto geneticky necharakterisovaných skupin organismu také očekávané .
Podstata vynálezu
Nyní bylo neočekávatelně zjištěno, že genová sonda, která je odvozená od vysoce konservovaných proteinových oblastí známých enzymů dTDP-glukoso-dehydratázy, je vhodná v Actincplanes sp. pro nalezeni genů acbA (kódující dTDP-glukoso-syntetázu) a acbB (kódující dTDP-glukoso-dehydratázu). Překvapivé je dále to, že jako další gen byl zjištěn acbC jako sousední genu acbB , který kóduje cyklázu (zčásti identický s AroB, bakteriální syntetáza 3-dehydrochinakyseliny) a tím se účastní biosyntesy nenasyceného cyklitolu (valienamin) .
Předložený vynález se týká :
Úplné DNA-sekvence acbC , jakož i dílčí DNA-sekvence acbA a acbC .
Úplné sekvence aminokyselin acbC , jakož i dílčí sekvence aminokyselin acbA a acbC .
Způsobu isolace genů biosyntesy sekundárního metabolitu z Actinomycet, především z Actinoplanes, jehož podstata spočívá v tom, že se genová sonda, která je odvozena od vysoce konservovaných proteinových oblastí známých enzymů dTDPglukosodehydratázy, použije pro nalezení genů acbA (kódovaný pro dTDP-glukoso-syntetázu), acbB (kódovaný pro dTDPglukoso-dehydratázu) a acbC (kódovaný pro cyklázu, zčásti identický s AroB, bakteriální syntetázou kyseliny 3-dehydrochinové) , nebo jednoho nebo více genů biosyntesy acarbosy z Actinoplanes sp..
Způsobu isolace genů biosyntesy acarbose příbuzných přírodních látek v Actinomycetách (například pro validamycin, oligostatine /trestatin/, adiposine).
Zvýšení výkonu syntesy acarbosy v Actinoplanes zvýšenou dávkou genu nebo efektivních promotorů nebo genově technickou změnou regulace (například exprese regulátorproteinu nebo rozeznávcacích míst regulátoru).
Zvýšení výkonu syntesy acarbosy v Actinoplanes sestrojením proteinu při biosyntetických krocích, limitujících syntesu acarbosy (Bottleneck-enzymy) nebo pro vyloučení tvorby vedlejších komponent.
Omezení spektra produktů v Actinoplanes na požadovaný hlavní produkt vyřazením nežádoucích cest biosyntesy vedlejších komponent nebo nežádoucích enzymatických odbourávacích reakcí.
Změna regulace a tím potřeby živných látek se zřetelem na zlepšenou produktivitu acarbosy v Actinoplanes.
Exprese v heterologních hostitelských kmenech (například ve Streptomyces lividans, jakož i v jiných Streptomycetách, v rychle rostoucích bakteriích, jako je Escherichia coli, Bacillus sibtilis a Corynebacterium glutamicum, nebo v kvasinkách) , aby se zlepšeným prostorovým výtěžkem za jednotku času do5 sáhlo zvýšení produkce, nalezl zjednodušený způsob pro vyčištění a dosáhlo cíleného omezení spektra produktů.
Použití genů biosyntesy acarbosy pro in-vitro syntesu acarbosy nebo sloučenin této třídy, za použití synteticky nebo mikrobielně vyrobených předstupňů.
Předložený vynález je detailněji popsán v následujícím.
Všechny genově technologické metody se provádějí, pokud není uvedeno jinak, podle J. Sambrooka a kol. (Molecular Cloning; A laboratory manual; 2. vydání, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., USA) .
Genová sonda, použitá pro screening byla získána pomocí PCR (polyraerase chain reaction) s oligonukleotidovými primery (viz tabulka 1), odvozenými od vysoce konservovaných proteinových oblastí známého enzymu dTDP-glukosodehydratázy, z Actinoplanes sp. SE50/110 . Amplifikovaný fragment DNA Actinoplanes sp. SE50/1210 se klonuje v pUC18 a transformuje se v E. coli DH5a
Eggenstein, BRD) . Resultující plasmid
2) se z E. coli isoluje pomocí Boiling-Methoď alkalickou lysí (Sambrook a kol, 1989) .
(Gibco BRL, (pASl , viz obr.
nebo
Plasmid pASl z E. coli DH5a se hydrolysuje pomocí restrikčních enzymů EcoRI a HindiII . 0,3 kb-fragment
EcoRI/HindlII se isoluje a označí se takzvanou Nick-translácí J P-značeným desoxynukleotidera. Tento radioaktivně značený fragment se použije jako genová sonda pro isolaci genů biosyntesy acarbosy a v následujícím je označován jako acb-sonda.
Geny syntesy acarbosy se isolují následujícím způsobem. Chromosoraální DNA Actinoplanes sp. se štěpí různými restrikčními enzymy (Sstl, BglII a BamHI) , chroraatograficky se rozdělí a zkouší se Southern''-hybridisací s acbsondou podle horaologních genů. Genosondou hybridisující DNA-restrikční fragmenty mají následující velikosti : 10 kb (Sstl) . 9-10 kb (BglII) a 2,2 kb (BamHI) . Různé DNAfragmenty, hybridisující acb-sondou, se z gelu eluují, ligují se do vektoru pUC 18 a klonují se v Escherichia coli DH5a .
Výhodně se klonuje a sekvencuje 2,2 kb BamHI-DNAfragment. Klony E. coli DH5ct , které obsahují DNA Actinoplanes sp., hybridisující acb-sondou, se identifikují pomocí pool-hybridisace (bod 7). Z positivních klonů se isoluje plasmid-DNA a výsledek pool-hybridisace se ověří
Southern-hybridisací. Získaný plasmid (obr. 3) se podrobí štěpení různými restrikčními endonukleázami a vzniklé DNA-fragmenty v pUC18 se subklonuji v E. coli DH5a , popřípadě se re-ligují a sekvenují.
Pro stanovení sekvence DNA 2,2 kb BamHI-fragmentu Actinoplanes sp. se konstruují následující plasmidy (bod 7) a analysuje se sekvence insert-DNA : (viz obr. 1 a 14) pAS 2/1 = 1,3 kb Pstl/BamHI fragment z pAS2 (obr. 4) pAS 2/2 = 1,6 kb SphI/BamHI fragment z pAS2 (obr. 5) pAS 2/3 pAS 2/4 pAS 2/5 pAS 2/6 pAS 2/7 pAS 2/8 pAS 2/9 pAS 2/10 = 0,9 kb = 0,6 kb = 0,8 kb = 0,65 kb = 0,5 kb = 0,28 kb = 0,7 kb = 0,3 kb
Pstl fragment z pAS2 (obr. 6)
Sphl fragment z pAS2 (obr. 7)
HincII fragment z pAS2/l (obr. 8)
Xhol/Sall fragment z pAS2 (obr. 9)
Xhol/Sall fragment z pAS2 (obr. 10)
HincII fragment z pAS2/3 (obr. 11)
Xhol/Bcll fragment z pAS2/l (obr. 12)
Sstl/BdI fragment z pAS2 (obr. 13) .
Pro DNA-sekvencování se použije metoda F. Sangera a kol. (1977) nebo z ní odvozený způsob. Pracuje se s Autoread Sequencing Kit (Pharmacia, Freiburg, BRD) ve spojení s Autoraated Laser Fluoreszens (ALF) DNA-sekvencovacím přístrojem (Pharmacia, Freiburg, BRD) . Vhodný fluoresceinem značený pUC reverse sequencing a sequencing priraer je možno komerčně získat (Pharmacia, Freiburg, BRD; viz tabulka 1) .
T a bul k a 1
Primer pro PCR :
Označení primeru
Sekvence
AS 2 5 ’ GCCCCCGAATCCCATGTGGAC 3’
AS 5 5’ CCCGTAGTTGTTGGAGCAGCGGGT 3’
Primer pro sekvencovací reakci :
Označení primeru Sekvence universální primer reversní primer
5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’
5’ GAAACAGCTATGACCATG 3’
Příklady provedení vynálezu
Přikladl
Kultivace kmene E.-coli. Preparace plasmid-DNA a isolace
Escherichia coli DH5a se pěstuje v LB-mediu při teplotě 37 °C . Plasraid nesoucí bakterie se získají za selekčního tlaku (ampicilin, 100 pg/ml). Kultivace se provádí na rotační třepačce při 270 otáčkách za minutu. Jako přes noc kultivovaná kultura (PN) se označuje vsázka, která se kultivuje alespoň 16 hodin.
Pro preparaci plasmid-DNA se použijí buňky z 1,5 ml za selekčního -tlaku kultivované PN kultury: Isolace plasrai du se provádí metodou alkalické SDS-lyse (Birnboim & Doly 1979) .
Pro cílenou hydrolysu vektor-DNA se konečně použijí restrikční endonukleázy podle návodu výrobce (Gibco BRL, Eggenstein, BRD) . Pro restrikci 10 gg plasmid-DNA se použije 5 U odpovídající restrikční endonukleázy a inkubuje se po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C . Aby se zaručila úplná hydrolysa, přidá se podruhé stejné množství restrikční endonukleázy a znovu se inkubuje po dobu alespoň jedné hodiny.
Rozštěpená DNA se dělí elektroforeticky, vždy podle velikosti DNA-fragmentů, na 0,5% až 1,2% horisontálním agarosovém gelu. Pro eluci se kousek gelu, který obsahuje DNA-fragment, odřízne sterilním skalpelem. Eluce DNA-fragmentu z agarosy se provádí podle předpisu s JETsorb-Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, BRD) .
Příklad 2
Kultivace preparátu Actinoplanes sp. . Štěpení chromosomální DNA a elektroforetické dělení
Actinoplanes sp. SE50/110 se kultivuje na rotační třepačce při teplotě 30 °C v TBS-mediu po dobu tří dnů. Předkultura (5 ml) se kultivuje v kultivačních zkumavkách při 240 otáčkách za minutu a hlavní kultura (50 ml) v baňkách o objemu 500 ml při 100 otáčkách za minutu. Buňky se po kultivaci sedimentují odstředěním a dvakrát se promyjí TE-pufrem.
Preparace celkové DNA se provádí s 1,5 až 2 mg buněk (hmotnost vlhkých buněk) pomocí metody extrakce fenol/chloroform (D. A. Hopwood a kol. 1985).
Hydrolysa 20 gg chromosoraální DNA se provádí 10 U odpovídajícího restrikčního enzymu (Gibco BRL, Eggenstein, BRD) po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C v odpovídajícím pufru. Aby se zaručila úplná hydrolysa, přidá se po druhé stejné množství restrikční endonukleázy a znovu se inkubuje po dobu alespoň jedné hodiny.
í
Rozštěpená DNA se elektroforeticky dělí na 0,7% horisontálním agarosovém gelu.
Eluce DNA-fragmentů z agarosy se opět provádí podle předpisu s JETsorb-Kit (Genomed, Bad Oeynhausen, BRD) .
Příklad 3
Výroba acb-genová sondy
Fragment z pASl , preparovaný podle př. 1 se pomocí Nick Translation Systému výrobce Gibco BRL, Eggenstein, BRD , radioaktivně značí podle údajů výrobce. Při tom se použije 0,5 až 1,0 gg DNA-fragmentu. Použije se [a^^PjdCTP (3000 Ci/mol; Amersham, Braunschweig, BRD) . Potom se vsázka vaří po dobu 10 minut (denaturace) a ihned se přidá k hybridisačnímu roztoku (příklad 4) .
P ř ί k 1 ad-------4 DNA-transfer na membrány. DNA-hybridisace (Southern-hybridisace) a autoradiografie
Přenesení DNA-fragmentů z agarosového gelu na membrány se provádí podle metody Southern-Transfer (Southern E. M. , 1975). Agarosový gel, získaný podle příkladu 2, se třepe po dobu 20 minut v 0,25 M kyselině chlorovodíkové. Gel se uloží na 3 vrstvy savého papíru Vhatman 3MM (Vhatraan, Maidstone, GB) a bez vytvoření bublin se překryje Hybond11 -N+Membranou (Amersham, Braunschweig, BRD) . Na ní se uloží více vrstev savého papíru a na tuto vrstvu se umístí asi 1 kg těžké závaží. DNA-transfer se provádí difundací 0,4 M NaOH . Po alespoň 12 hodinách doby transferu se nylonový filtr promyje po dobu 5 minut 2xSSC a na vzduchu se usuší.
Nylonový filtr se potom po dobu alespoň 2 hodin při teplotě 68 °C třepe v 50 až 100 ml prehybridisačního roztoku ve vodní lázni. Při tom se roztok alespoň dvakrát vymění. Hybridisace se koná v hybridisační skříni po dobu alespoň 12 hodin. Použije se 15 ml hybridisačního roztoku, který obsahuje acb-sondu (př, 3) .
Nylonový filtr se potom promyje 15 minut 6x Postwasch a lx Postwash . Nylonový filtr se potom v ještě vlhkém stavu pokryje folií aby nevyschl. Autoradiografie se provádí pomocí Hyperfilm-MP (Amersham, Braunschweig, BRD) ve světlotěsné kasetě se zesilovací folií při teplotě -80 °C po dobu alespoň 16 hodin.
Příklad 5
Isolace a klonování BamHI- fragmentů z celkové DNA z Actinoplanes sp.
Chromosomální DNA z Actinoplanes sp. SE50/110 se pomocí BamHI úplně hydrolysuje, potom se jednotlivé štěpy rozdělí se pomocí agarosové elektroforesy a z agarosy se eluují DNA-fragmenty o délce 1,5 až 3 kb . Vektor-plasmid pUC18 se preparuje z E. coli DH5a , hydrolysuje se pomocí BamHI a opracuje se alkalickou fosfatasou (Boehringer, Mannheim, BRD) podle předpisu výrobce. Ligace se provádí v objemu 20 μΐ , přičemž poměr fragmentu ku vektoru činí 3:1 s 0,01 až 0,1 gg DNA ve vsázce. Použije se 1 U T4-DNA-ligázy s odpovídajícím pufrem (Gibco BRL, Eggenstein, BRD) . Transformace schopné buňky E. coli DH5a se transformují úplnou ligační vsázkou (podle Hanahana). Ampicilin resistentní transformanty se přenesou na LB-Amp selektivní plotny (100 gg/ml) .
Příklad 6
Identifikace klonů, které obsahují gen dTDP-D-glukoso-syntetázy
Ampicilin-resistentní transformanty se zkoušejí na přítomnost genu dTDP-D-glukoso-syntetázy. Vždy deset těchto klonů se natře na selektivní plotnu, přes noc se kultivuje a promyje se 3 ml LB-media na plotnu. Potom se ze 20 takovýchto desetičlených souborů isoluje plasraidová DNA (podle Birnboim & Dolyho, 1979) . Aby se odstranily klonované BamHI-fragmenty z polylinkeru, hydrolysuje se 20 různých plásraidových preparátů restrikčními endonuklěázanfi EcoRI a HindlII. Restrikční vsázky se potom elektroforeticky dělí na 0,8% agarosovém gelu a DNA se potom pomocí SouthernTransferu z agarosového gelu přenese na nylonový filtr (viz příklad č 4) . Hybridisace se provádí opět s acb-sondou (viz příklad 4) . Jeden ze souborů, který reaguje positivně s acb-sondou , se rozdělí na deset jednotlivých klonů. Jeho plasmidy se rovněž isolují a podrobí se výše uvedené proceduře. Hybridisovaný plasmid se označí pAS2 . Obsahuje 2,2 kb BamHI-fragment.
Příklad 7
Subklonování plasmidu pAS2
Když se vychází z plasmidu pAS2 , vyrobí se více subklonů, aby se mohla objasnit sekvence dvoupramenné DNA (obr. 1 ; obr. 4 až 13).
pAS2/l a pAS2/3
Plasmid pAS2 se hydrolysuje pomocí Pstl a restrikční vsázka se rozdělí na 1% agarosovém gelu. Z agarosového gelu se eluuje hydrolysou vzniklý 0,9 kb Pstl-fragment a plasmidové pásy se zbytkovým 1,3 kb Pstl/BamHI-fragmentem (JETsorb-Kit; Genomed, Bad Oeynhausen, BRD). Plasmid s 1,3 kb Pstl/BamHI-fragmentem se re-liguje na subklon pAS2/l . 0,9 kb Pstl-fragment se klonuje do vektoru pUC18 (hydrolysovaný pomocí Pstl) za vzniku subklonu pAS2/3 .
pAS2/2 a pAS2/4
Plasmid pAS2 se hydrolysuje pomocí Sphl . Plasmid s 1,6 kb SphI/BamHI-fragmentem se re-liguje na subklon ... pAS2/2 . 0,6 kb Sphl-fragment se klonuje do pUC18 (hydrolysovaný pomocí Sphl) a vznikne subklon pAS2/4 .
pAS2/5
Plasmid pAS2/l se hydrolysuje pomocí Hind I/Hindi 11 . Tímto vzniklý 0,8 kb fragment se klonuje do pUC18 (hydrolysovaný pomocí HindlII/HincII) a vznikne subklon pAS2/5 .
pAS2/6
Plasmid pAS2 se hydrolysuje pomocí Xhol/Sall . Tímto vzniklý 0,65 kb fragment se klonuje do pUC18 (hydrolysovaný pomocí Sáli) a vznikne subklon pAS2/6 .
pAS2/7
Plasmid pAS2 se hydrolysuje pomocí Xhol/Sall . Tímto vzniklý 0,5 kb fragment se klonuje do pUC18 (hydrolysovaný pomocí Sáli) a vznikne subklon pAS2/7 .
pAS2/8
Plasmid pAS2/3 se hydrolysuje pomocí Hindi . Tímto vzniklý 0,3 kb fragment se klonuje do pUCl8 (hydrolysovaný pomocí HincII) a vznikne subklon pAS2/8 .
pAS2/9
Plasmid pAS2/l se hydrolysuje pomocí Xhol/Bcll .
Tímto vzniklý 0,7 kb fragment se klonuje do pUCl8 (hydrolysovaný pomocí Sall/BamHI) a vznikne subklon pAS2/9 .
pAS2/10
Plasraid pAS2 se hydrolysuje pomocí Sstl/BclI . Tímto vzniklý 0,3 kb fragment se klonuje do pUCl8 (hydrolysovaný pomocí Sstl/BamHI) a vznikne subklon pAS2/10 .
Příklad 8
DNA-sekvenování 2,2 kb BamHI-fragmentu Actinoplanes sp.
Sekvenuji se plasmidy, popsané v příklade 7 . V sekvencovací reakci se použije 6 - 8 pg plasmidové DNA z preparace (viz příklad 1) . Sekvencovací reakce se provádí s Auto-Read-Sequenzing-Kit (Pharmacia, Freiburg, BRD) . Při tom se použije standardní protokol pro sekvenování dsDNA . Aby se umožnilo vyhodnocení nukleotidové sekvence pomocí A.L.F. (automatisovaný Laser Fluorescens-(DNA)-Sequenzierer), použijí se jako startovací molekuly pro sekvencovací reakci fluoresceinem značené universální a reversní sekvenovací primery (viz tabulka 1) . Pro výrobu gelu se smísí ml Hydro Link Long Rangeru (Serva, Heidelberg, BRD),
33,6 g močoviny, 8 ml lOx TBE-pufru a vodou se doplní do 80 ml, sterilně se přefiltruje a po dobu jedné minuty se zbavuje plynů. Polymerace se nastartuje přidáním 350 μΐ 10% (hmot./obj.) persíranu amonného a 40 μΐ Ν,Ν,Ν’,N’-tetramethylendiaminu. Roztok se vlije do. gelové formy (50x50x0,05 cm) . Elektroforesa se provádí při 38 V a při konstantní teplotě 45 °C. Jako pohyblivý pufr slouží lx TBE-pufr. Zpracování naměřené fluorescence na DNA-sekvenci se provádí přes uzavřený počítač (Compaq 386/20e) , který také slouží pro řízení elektroforesy (program A.L.F.
Manager 2,5 ; Phafmačia) .
Pufry a roztoky
Media pro kultivaci bakterií
LB-Medium :
Trypton chlorid sodný kvasničný extrakt voda g 10 g g
do 1000 ml.
Hodnota pH se upraví pomocí 4 M hydroxidu sodného na 7
TSB-Medium :
Trypton.sojový bujón (oxoid) 30 g voda do 1000 ml.
TE-pufr (pH 8,0) :
Tris-HCl 10 mM
Na2-EDTA 1 mM .
Standardní preparace plasmidové DNA (modifikace podle Birnboira & Dolya, 1979)
Mix I : 50 mM glukosa mM Tris-HCl (pH 8,0) mM EDTA (pH 8,0) mg/ml lysozym
Mix II : 200 mM NaOH
1% (hmot./obj.) SDS (natriumdodecylsulfát)
Mix III : 3 M octan draselný
1,8 M formiát .
DNA-DNA-hybridisace x SSC : 3 M NaCl
0,3 M citrát sodný pH 7,2 .
Prehybridisační roztok :
x SSC : 0,01 M natriumfosfátový pufr pH 6,8 mM EDTA 0,5 % SDS
0,1% práškového netučného mléka
Hybridisační roztok :
Do 15 ml prehybridisačního roztoku se dá acb-sonda po značkovací reakci x Postwash : 6 x SSC
0,5 % SDS .
DNA-sekvencování
TBE-pufr (pH 8,0) ; 1 M Tris-base ...... ...
0,83 M kyselina boritá 10 mM EDTA .
Literatura
1. Birnboim H. C. & Doly J. (1979)
A rapid alkine extraktion proceduře for screening re combinant plasmid DNA
Nucleid Acids Res.; 7, 1513-1523 .
2. Hanahan D. (1983)
Studies on Transformation of Escherichia coli vith plasmids
J. Mol. Biol.;166, 557-580
3. Hopwood D. A. a kol., (1985)
Genetic manipulation of Streptomyces
A laboratory m.anual; The John Innes Foundation, Nor wich, England
4. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977)
DNA sequencing with chain-terrainating inhibitors Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467
5. Southern Ε. M. (1975)
Detection of specific sequences araong DNA Fragments separated by gel electrophoresis J. Mol. Biol., 98, 503-521 .
Sekvenčníprotokol ...................................
Délka řetězce : 2219 párů basí typ : nukleotid forma řetězce : dvojitý topologie : lineární
Typ molekuly : Genom-DNA
Původ : Actinoplanes sp. SE 50/110
| Popis G GAT C C GGGA | sekvence GTACTTCACC | ID 01 : CATCACGGCA | TGGATCATTC | GATCCTGGTG | ATGCGGGTGC | 60 |
| GCGAGACGGT | CAAGGACTTC | GA.CAC GGC GG | GCCGCATCGT | CGCCGCGATG | GACGCCTTCG | 120 |
| GACTGGCGCG | CCGGCGGGAG | CGGATGATCG | T GGT CGGTGG | TGGGGTGGTG | AT GGACGTGG | 130 |
| CCGGTCTGGT | GGGCAGGGTC | TAC C GGGC GC | GGGACGGCGT | TCTGGGGGTG | CCGACGACAC | 240 |
| TGGTCGGACT | GATCGACGGG | GTGTCGCGCG | AAGACCGGGT | CAACTTCAAC | GGC CACAAGjt | 300 |
| AACCGGCTGG | GTACGTACGC | C C GGCTGAT C | TGACCCTGGT | GGACGGCGGG | TTCCTGGCCA | 360 |
| CCCTGGACCG | GCGCCACCTC | AGCAAC G GGC | TC3GCGAGAT | GCTCAAGATC | GCGCTGATCA | 420 |
| AGGAT GC CGA | GCTGTTCCAG | CTGCTGGAGC | GGGACGGGGG | GGTCGTGATC | GAG GAAC GGT | 430 |
| TCCAGGGCGT | ACCGGAACCG | GTGACCGGGC | CGCCGTCCGG | GCCCTGCGCG | wA V i* | 540 |
| GGCATGCTGG | AGGAACTCGG | CCCAATCTGT | GGGAGAGGCG | GCTGGAACGC | AGTGTCGACT | 600 |
| ACGGGCACAC | GTTCAGCCCG | ACCATCGAGA | TGCGCGCGCT | GCCGGGTCTG | CTGCACGGCG | 660 |
| AGGCCGTGTG | TGTGGACATG | GCGCTGACCA | CGGTGGTGGG | GTACCGGCGG | GGTCTGGTCG | 720 |
| ACGTCGCGCA | GGGGGACCGG | AT CTT CGCGG | TGATGAGCGG | CCTGGGCCTG | CGGACCGGGA | 730 |
| TCCGCCTGCT | CACGGCGGAG | GT GCT GGAGG | CGGGGTTGCA | GGACACCGTC | CGGGACCGGG | 340 |
| ACGGGTGGCA | GGGGGTGCCA | CTGCCGGTGG | GGATCGGGGG | TGTCACGTTC | GTCAACGACG | 900 |
| T GAC GGGCGG | CGAGGTGCAG | CCGCCGCGCT | GATGCAGCAC | CGGGTCGCCG | AGGACGGCCT | 950 |
| GCTGCTGGGG | GCCCTAGCTC | GGGCCGCGGA | CGGCGATCGC | CGGAAGvGAC | CGGCGTCCGT | 1020 |
| CCGCCCACCG | GTTSCC3TCA | .GTC.CAC.CAGG | .AACGGTTGGC | G\- GATAGGAC | GCGACCGTTT | 1030 |
| CC3CGATGCC | GT C GGT GAAA | TGGACGCGGG | GCCGGTAACC | GAGTTCGGGG | GGGATTTTCG | 1140 |
| AATAGTCGAG | AGAAT AGC GC | C G\jT C GT GAC | CTTTGCGATC | GGT CAC GAP A | GATATGCGCG | 1200 |
| AACGCCGGGC | GCCGCACGCC | T G GAGGAGGA | TCTCGGTCAA | TTCGAGATTG | GTCGCCTCCC | 1250 |
| ACCCACCGCC | GAT GT GATAG | AGGTCGGCTG | CCCGGCCGGC | ACCGAGGGGC | AGGGC ^r\GA.C | 1320 |
| CGCGGCAATG | GTCGCTGACG | TGGAGCCAGT | CGCGGATGTT | GGGGGGGTCG | CCGTAGACCG | 13 3 0 |
| GTACGTCGAG | CCCGTCGAGC | AGGGTGGTGA | CGAACAGCGG | AATCATTTTC | TCCGGGAATT | 1440 |
| GC C GGGGCCC | GTAGTTGTTG | GA.GGAGGGGG | TCACCACGAC | GTCCATGCCG | TGCGTCTGGT | 1300 |
| GGTAGGCCAG | AGCGAGGAGG | TGGGACCGGG | CTTTGCTCGC | GGG GT AC GGG | GAGTTGGGCG | 1350 |
| CCA.GCGGATG | GCCCTCGGCC | CA<_ GAGG C GG | TGTCGATCGA | C G C GT ACAC C | TCGTCGGTGG | 1520 |
| AAA.CA.TGCAG | GAAG C GGC C G | AT AT GGT GGG | GTAGCGCGGC | GTCCAGTAGG | ACCTGAGTGC | 1530 |
| CGACCAGGTT | GGT GGGGACG | AAGGGGCCGG | AG GCGAC CAC | C GP.GG GGT C G | ACGTGGGTCT | 1740 |
| C GGC GGC GAA | GTGCGCCACG | GTGTCGTGCC | ČCCCTCGATT | AGACCTTCGT | 1300 | |
| CACAGATGTC | GCCCCGAACG | AAGCTGAAAC | GAGGGTCCGC | CGACGGTTCG | GCGAGATTTC | 1350 |
| TGAGATTGCC | TCCGTAACCC | AGTTTGTCGA | CGACCGTAAC | CTGCGTCACG | GGTTGTGGTG | 1320 |
| TGGCAAT GT C | GCCACTGA.TC | A- G l^AAGT TA | C.MAAAT GGGA | C C C G AT AAAG | CCGGCTCCGv. | 19 3 0 |
| CGGTGACCAA | GATTTTCATC | GG GGGGATT G | TAGCAATGCC | GGCAAT GGGT | GCCCGATGTT | 2040 |
| CGGCCGAGCC | ATTTACGGGG | CTTGGTGATA | TGGTCGGTCA | CGTGCGCSGA | ATATTGCTGG | 2100 |
| C C GGGGGAAC | C GGCTCACGG | CTTCGA.CCGG | TGACCTGGGC | GGTTTCCAAA | CAACTGATGC | 2150 |
| CGGTCTATGA | CAAACCGATG | ATCTACTATC | CGCTGGCCAC | GCTCGTCAGC | TGCGGATCC | 2219 |
Claims (17)
1. DNA-sekvence se sekvencí ID 01 .
2. DNA podle nároku 1 , vyznačující· se tím, že obsahuje úplnou acbA-DNA-sekvenci, kodovanou pro dTDP-glukoso-syntetázu, jakož i DNA dílčí sekvence acbB , kodovanou pro dTDPglukoso-dehydratázu a acbC , kodovanou pro cyklázu.
3. Funkční varianty DNA podle nároku 2 .
4. Vektor, obsahující DNA podle nároků 1 až 3 .
5. Mikroorganismy, transformované vektorem podle nároku 4 .
6. Sekvence aminokyselin se sekvencí ID 01 .
7. Funkční varianty a mutanty sekvence aminokyselin podle nároku 6 .
8. Protein, obsahující sekvenci aminokyselin podle nároků 6 a 7 , popřípadě její části.
9. Způsob isolace jednoho nebo několika genů biosyntesy acarbosy z Actinomycet, vyznačující se tím, že oligonukleotidové primery, odvozené od vysoce konservované proteinové oblasti známého enzymu dTDP-glukoso-dehydratázy, slouží jako genosondy a hybridisují se s geny biosyntesy acarbosy.
10. Způsob výroby acarbosy, vyznačující se tím, že se kultivují mikroorganismy podle nároku 5 a acarbosa se isoluje z kultivačního media.
11. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 , pro identifikaci dalších strukturních a regulačních genů acarbosy.
12. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro zlepšení výkonu syntesy acarbosy zvýšením dávky genu, nebo použitím efektivních promotorů nebo genově technickou změnou regulace, například exprese regulátor-proteinu nebo rozpoznávajících míst regulátoru.
13. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro isolaci genů biosyntesy přírodních látek, příbuzných acarbose.
14. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro modifikaci biosyntesních enzymů pomocí konstrukce proteinů.
15. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro eliminaci nežádoucích směrů biosyntesy na vedlejší komponenty acarbosy.
16. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro eliminaci nežádoucích enzymatických odbourává- 23 _________cích reakcí acarbosy________ . _ ....... ..
17. Použití genu nebo genů, získaných podle nároku 2 a 11 , pro získávání biosyntesních enzymů a jejich použití pro syntesu acarbosy nebo sloučenin této třídy za použití synteticky nebo mikrobiálně vyrobených předstupňů.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19507214A DE19507214A1 (de) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | Acarbose-Biosynthesegene aus Actinoplanes sp., Verfahren zu ihrer Isolierung sowie ihre Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ63796A3 true CZ63796A3 (en) | 1996-09-11 |
Family
ID=7755404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ96637A CZ63796A3 (en) | 1995-03-02 | 1996-03-01 | Genes of acarbose biosynthesis from actinoplanes sp., process of their isolation and use |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5753501A (cs) |
| EP (1) | EP0730029B1 (cs) |
| JP (1) | JPH08256781A (cs) |
| KR (1) | KR960034418A (cs) |
| CN (1) | CN1144271A (cs) |
| AT (1) | ATE281523T1 (cs) |
| AU (1) | AU706116B2 (cs) |
| CA (1) | CA2170577A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ63796A3 (cs) |
| DE (2) | DE19507214A1 (cs) |
| ES (1) | ES2232829T3 (cs) |
| FI (1) | FI960951A7 (cs) |
| HU (1) | HUP9600500A2 (cs) |
| IL (1) | IL117316A0 (cs) |
| NO (1) | NO960852L (cs) |
| NZ (1) | NZ286092A (cs) |
| SK (1) | SK28596A3 (cs) |
| TW (1) | TW375657B (cs) |
| ZA (1) | ZA961674B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0796915A3 (de) * | 1996-03-22 | 1999-04-14 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung sowie zur Verwendung von Acarviosyl-Transferase bei der Umwandlung von Acarbose-Homologen in Acarbose, zur Herstellung von Acarbose-Homologen |
| DE19622783A1 (de) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Hoechst Ag | Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung |
| DE19637591A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Bayer Ag | Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose |
| DE19708127A1 (de) * | 1997-02-28 | 1998-09-03 | Bayer Ag | Acarbose acb-Cluster: Isolierung von weiteren Genen der Acarbose Biosynthese und des Acarbose-Stoffwechsels aus Actinoplanes sp. SE 50/110 sowie deren Verwendung |
| CN106566796B (zh) * | 2016-10-28 | 2020-11-10 | 上海交通大学 | 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2064092C2 (de) * | 1970-12-28 | 1983-06-01 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Inhibitoren für Glykosidhydrolasen aus Actinomyceten |
| DE2209834C3 (de) * | 1972-03-01 | 1978-04-20 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Herstellung von Saccharase-Inhibitoren |
| DE2347782C3 (de) * | 1973-09-22 | 1979-10-11 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
| US4062950A (en) * | 1973-09-22 | 1977-12-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Amino sugar derivatives |
-
1995
- 1995-03-02 DE DE19507214A patent/DE19507214A1/de not_active Withdrawn
-
1996
- 1996-02-17 AT AT96102398T patent/ATE281523T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-17 DE DE59611131T patent/DE59611131D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-17 ES ES96102398T patent/ES2232829T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-17 EP EP96102398A patent/EP0730029B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-22 AU AU45684/96A patent/AU706116B2/en not_active Ceased
- 1996-02-23 US US08/606,322 patent/US5753501A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-02-28 CA CA002170577A patent/CA2170577A1/en not_active Abandoned
- 1996-02-28 JP JP8067226A patent/JPH08256781A/ja active Pending
- 1996-02-28 NZ NZ286092A patent/NZ286092A/en unknown
- 1996-02-29 IL IL11731696A patent/IL117316A0/xx unknown
- 1996-02-29 HU HU9600500A patent/HUP9600500A2/hu unknown
- 1996-02-29 FI FI960951A patent/FI960951A7/fi unknown
- 1996-02-29 KR KR1019960005291A patent/KR960034418A/ko not_active Withdrawn
- 1996-02-29 TW TW085102372A patent/TW375657B/zh active
- 1996-03-01 ZA ZA961674A patent/ZA961674B/xx unknown
- 1996-03-01 SK SK285-96A patent/SK28596A3/sk unknown
- 1996-03-01 NO NO960852A patent/NO960852L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-03-01 CZ CZ96637A patent/CZ63796A3/cs unknown
- 1996-03-01 CN CN96102718A patent/CN1144271A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA961674B (en) | 1996-09-05 |
| EP0730029B1 (de) | 2004-11-03 |
| NZ286092A (en) | 1997-11-24 |
| CN1144271A (zh) | 1997-03-05 |
| EP0730029A3 (de) | 1999-04-14 |
| DE59611131D1 (de) | 2004-12-09 |
| JPH08256781A (ja) | 1996-10-08 |
| AU4568496A (en) | 1996-09-12 |
| KR960034418A (ko) | 1996-10-22 |
| FI960951L (fi) | 1996-09-03 |
| HUP9600500A2 (en) | 1996-11-28 |
| AU706116B2 (en) | 1999-06-10 |
| FI960951A7 (fi) | 1996-09-03 |
| DE19507214A1 (de) | 1996-10-31 |
| SK28596A3 (en) | 1996-10-02 |
| ATE281523T1 (de) | 2004-11-15 |
| ES2232829T3 (es) | 2005-06-01 |
| EP0730029A2 (de) | 1996-09-04 |
| NO960852D0 (no) | 1996-03-01 |
| IL117316A0 (en) | 1996-06-18 |
| TW375657B (en) | 1999-12-01 |
| US5753501A (en) | 1998-05-19 |
| HU9600500D0 (en) | 1996-04-29 |
| CA2170577A1 (en) | 1996-09-03 |
| FI960951A0 (fi) | 1996-02-29 |
| NO960852L (no) | 1996-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110305881B (zh) | 一种聚酮类化合物neoenterocins的生物合成基因簇及其应用 | |
| US20170081690A1 (en) | Moenomycin biosynthesis-related compositions and methods of use thereof | |
| KR20110118545A (ko) | 새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법 | |
| US6825013B2 (en) | Isolation of biosynthesis genes for pseudo-oligosaccharides from Streptomyces glaucescens GLA.O, and their use | |
| CZ63796A3 (en) | Genes of acarbose biosynthesis from actinoplanes sp., process of their isolation and use | |
| KR20000075777A (ko) | 악티노플라네스 종 ｓｅ50/110 유래의 아카보스 (ａｃｂ) 클러스터 | |
| TW201406951A (zh) | 用於製造重組１１－去－Ｏ－甲基托馬黴素（１１－ｄｅ－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ）之方法 | |
| JP7086984B2 (ja) | Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓの遺伝子組換え株におけるエンデュラシジンの産生を増強するための組成物及び方法 | |
| EP1270728B1 (en) | Process for producing avermectin derivative | |
| US7670827B2 (en) | Strain belonging to the genus Streptomyces and being capable of producing nemadictin and process for producing nemadictin using the strain | |
| OHTA et al. | Cloning and analysis of a gene (SMS13) encoding sannamycin B-glycyltransferase from Streptomyces sannanensis and its distribution among actinomycetes | |
| CZ88097A3 (en) | Acarviosyl transferase, process of its preparation and use, dna sequence encoding the acarviosyl transferase, vector in which the sequence is comprised and process of transferring side components of acarbose to acarbose | |
| MXPA97002141A (es) | Procedimiento para la produccion asi como para eluso de acarviosil-transferasa en la transformacion de homologos de acarbosa en acarbosa, para la produccion de homologos de acarbosa | |
| EP0792285B1 (en) | Process for producing anthracyclines and intermediates thereof | |
| KR101721750B1 (ko) | 신규 마크로락탐 글리코시드 유도체, 이의 화학효소적 제조방법 및 이를 포함하는 항균용 조성물 | |
| KR101451037B1 (ko) | 신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법 | |
| KR20120117568A (ko) | 신규 나르보마이신 유도체 화합물, 상기 화합물을 포함하는 항균용 조성물 및 상기 화합물의 생산 방법 | |
| JP2003033188A (ja) | エバーメクチン誘導体の製造法 | |
| JP2004173537A (ja) | カナマイシン生合成遺伝子 | |
| MXPA99007728A (en) | Acarbose (acb) cluster from actinoplanes | |
| Tsunekawa | Acyltylosins by Genetically Engineered Strains of Streptomyces fradiae | |
| Arisawa et al. | Strains of Streptomyces fradiae | |
| 見﨑裕也 | Functional analysis of transcriptiopnal regulators for secondary metabolites production in Actinomycetes | |
| JPWO2000050605A1 (ja) | エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子 |