JPH08256781A - アクチノプラーネス種からのアカルボース生合成遺伝子、それらの単離法、及びそれらの利用 - Google Patents
アクチノプラーネス種からのアカルボース生合成遺伝子、それらの単離法、及びそれらの利用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子プローブを用いてアクチノプラーネス
種においてアカルボース生合成遺伝子を発見し、利用す
る。 【解決手段】 本発明は放線菌から、特にアクチノプラ
ーネス種ＳＥ ５０／１１０及びその突然変異体からの
アカルボース生合成遺伝子に、遺伝子ａｃｂＡ（ｄＴＤ
Ｐ−グルコースシンターゼをコード）、ａｃｂＢ（ｄＴ
ＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコード）及びａｃｂ
Ｃ（サイクラーゼをコード、ＡｒｏＢ、バクテリア３−
デヒドロキネートシンターゼと部分的に同じ）、あるい
はアクチノプラーネス種からの１種又はそれ以上のアカ
ルボース生合成遺伝子の発見のために、既知のｄＴＤＰ
−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存されたタ
ンパク質領域から誘導された遺伝子プローブを用いた、
放線菌からのアカルボース生合成遺伝子の単離法に、な
らびにアカルボース生合成遺伝子の利用に関する。
種においてアカルボース生合成遺伝子を発見し、利用す
る。 【解決手段】 本発明は放線菌から、特にアクチノプラ
ーネス種ＳＥ ５０／１１０及びその突然変異体からの
アカルボース生合成遺伝子に、遺伝子ａｃｂＡ（ｄＴＤ
Ｐ−グルコースシンターゼをコード）、ａｃｂＢ（ｄＴ
ＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコード）及びａｃｂ
Ｃ（サイクラーゼをコード、ＡｒｏＢ、バクテリア３−
デヒドロキネートシンターゼと部分的に同じ）、あるい
はアクチノプラーネス種からの１種又はそれ以上のアカ
ルボース生合成遺伝子の発見のために、既知のｄＴＤＰ
−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存されたタ
ンパク質領域から誘導された遺伝子プローブを用いた、
放線菌からのアカルボース生合成遺伝子の単離法に、な
らびにアカルボース生合成遺伝子の利用に関する。
Description
【０００１】本発明は放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ）から、特にアクチノプラーネス種（Ａｃｔｉｎｏ
ｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）ＳＥ ５０／１１０及びその突
然変異体からのアカルボース生合成遺伝子に、遺伝子ａ
ｃｂＡ（ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼをコード）、
ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコー
ド）及びａｃｂＣ（サイクラーゼをコード、ＡｒｏＢ、
バクテリア３−デヒドロキネートシンターゼと部分的に
同じ）、あるいはアクチノプラーネス種からの１種又は
それ以上のアカルボース生合成遺伝子の発見のために、
既知のｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度
に保存されたタンパク質領域から誘導される遺伝子プロ
ーブを用いた、放線菌からのアカルボース生合成遺伝子
の単離法に、ならびにアカルボース生合成遺伝子の利用
に関する。
ｅｓ）から、特にアクチノプラーネス種（Ａｃｔｉｎｏ
ｐｌａｎｅｓ ｓｐ．）ＳＥ ５０／１１０及びその突
然変異体からのアカルボース生合成遺伝子に、遺伝子ａ
ｃｂＡ（ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼをコード）、
ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコー
ド）及びａｃｂＣ（サイクラーゼをコード、ＡｒｏＢ、
バクテリア３−デヒドロキネートシンターゼと部分的に
同じ）、あるいはアクチノプラーネス種からの１種又は
それ以上のアカルボース生合成遺伝子の発見のために、
既知のｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度
に保存されたタンパク質領域から誘導される遺伝子プロ
ーブを用いた、放線菌からのアカルボース生合成遺伝子
の単離法に、ならびにアカルボース生合成遺伝子の利用
に関する。
【０００２】以前の特許出願（例えばＤＥ ２ ０６４
０９２、ＤＥ ２ ２０９ ８３４）は、複数の放線
菌、特にアクチノプラーネスがグリコシドヒドロラー
ゼ、好ましくは消化管の炭水化物−切断酵素のオリゴ糖
−結合阻害剤を生産するという発見に関連する。記載さ
れているこの群の最も有力な阻害剤は化合物アカルボー
ス、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［１Ｓ−（１Ｓ，
４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３
−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イ
ル］−アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ
−グルコピラノースである（ＤＥ ２ ３４７ ７８
２）。
０９２、ＤＥ ２ ２０９ ８３４）は、複数の放線
菌、特にアクチノプラーネスがグリコシドヒドロラー
ゼ、好ましくは消化管の炭水化物−切断酵素のオリゴ糖
−結合阻害剤を生産するという発見に関連する。記載さ
れているこの群の最も有力な阻害剤は化合物アカルボー
ス、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［１Ｓ−（１Ｓ，
４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３
−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イ
ル］−アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ
−グルコピラノースである（ＤＥ ２ ３４７ ７８
２）。
【０００３】アカルボースは人間の医学において真性糖
尿病の抑制に用いられる。二次代謝物アカルボースはア
クチノプラーネス種ＳＥ ５０（ＣＢＳ Ｎｏ．９６
１．７０）により、及びこの株の天然の変異体ＳＥ ５
０／１１０（ＣＢＳ ６１４．７１）［ＤＥ ２２ ０
９ ８３４］により、ならびにそれらの選択体（ｓｅｌ
ｅｃｔａｎｔｓ）及び突然変異体により生産される。最
初の単離物はケニアのルイル（Ｒｕｉｒｕ ｉｎ Ｋｅ
ｎｙａ）近辺から得られた。この種のサッカラーゼ阻害
剤の単離は該特許出願において、例えば該ドイツ特許出
願Ｐ ２２ ０９８３４の実施例１〜４において記載さ
れている。
尿病の抑制に用いられる。二次代謝物アカルボースはア
クチノプラーネス種ＳＥ ５０（ＣＢＳ Ｎｏ．９６
１．７０）により、及びこの株の天然の変異体ＳＥ ５
０／１１０（ＣＢＳ ６１４．７１）［ＤＥ ２２ ０
９ ８３４］により、ならびにそれらの選択体（ｓｅｌ
ｅｃｔａｎｔｓ）及び突然変異体により生産される。最
初の単離物はケニアのルイル（Ｒｕｉｒｕ ｉｎ Ｋｅ
ｎｙａ）近辺から得られた。この種のサッカラーゼ阻害
剤の単離は該特許出願において、例えば該ドイツ特許出
願Ｐ ２２ ０９８３４の実施例１〜４において記載さ
れている。
【０００４】アカルボースの構造から、アカルボース分
子のデオキシグルコース部分が種々の抗生物質（例えば
アミノグリコシド類、例えばストレプトマイシン、カス
ガマイシン；マクロライド類、例えばエリスロマイシ
ン、チロシン；ポリエン類、例えばアムホテリシンＡ、
Ｂ、ナイスタチン；アントラサイクリン類、例えばダウ
ノルビシン；グリコペプチド類、例えばバンコマイシ
ン）の６−デオキシサッカリド残基の生合成に従って生
産されることが予測されるべきであった。
子のデオキシグルコース部分が種々の抗生物質（例えば
アミノグリコシド類、例えばストレプトマイシン、カス
ガマイシン；マクロライド類、例えばエリスロマイシ
ン、チロシン；ポリエン類、例えばアムホテリシンＡ、
Ｂ、ナイスタチン；アントラサイクリン類、例えばダウ
ノルビシン；グリコペプチド類、例えばバンコマイシ
ン）の６−デオキシサッカリド残基の生合成に従って生
産されることが予測されるべきであった。
【０００５】遺伝子工学を用い、ある種の遺伝子をゲノ
ムから直接、例えば必要なＤＮＡ配列に特異的に結合す
る遺伝子プローブ類を用いて単離することが可能であ
る。この方法で、多数の未知の配列から単離されるべき
遺伝子を「釣る」ことができる。
ムから直接、例えば必要なＤＮＡ配列に特異的に結合す
る遺伝子プローブ類を用いて単離することが可能であ
る。この方法で、多数の未知の配列から単離されるべき
遺伝子を「釣る」ことができる。
【０００６】さらに放線菌、特にストレプロミセスの場
合、今日までに研究された二次代謝物生産体において、
生合成遺伝子は染色体上のクラスターに並んで配置さ
れ、プラスミド上には少ないことが既知である［Ｍａｒ
ｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
９，７３−９０（１９９２），Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．
Ｆ．，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，１７１（Ｓ
ｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：Ｔｈｅｉ
ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
１４４−６２（１９９２）］。かくして遺伝子プローブ
を用いた「釣り」により隣接して、これまで未知であっ
た生合成遺伝子を単離することが可能であり、次いで必
要な生合成に対するその重要性を明らかにすることがで
きる。
合、今日までに研究された二次代謝物生産体において、
生合成遺伝子は染色体上のクラスターに並んで配置さ
れ、プラスミド上には少ないことが既知である［Ｍａｒ
ｔｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
９，７３−９０（１９９２），Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．
Ｆ．，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．，１７１（Ｓ
ｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：Ｔｈｅｉ
ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）
１４４−６２（１９９２）］。かくして遺伝子プローブ
を用いた「釣り」により隣接して、これまで未知であっ
た生合成遺伝子を単離することが可能であり、次いで必
要な生合成に対するその重要性を明らかにすることがで
きる。
【０００７】分子生物学的方法のアクチノプラーネスに
関する対応する適用はこれまで不成功であり、生物のこ
の遺伝子的に特性化されていない群に関して期待される
べきでもなかった。
関する対応する適用はこれまで不成功であり、生物のこ
の遺伝子的に特性化されていない群に関して期待される
べきでもなかった。
【０００８】驚くべきことに今回、既知のｄＴＤＰ−グ
ルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存されたタンパ
ク質領域から誘導された遺伝子プローブが、アクチノプ
ラーネス種において、遺伝子ａｃｂＡ（ｄＴＤＰ−グル
コースシンターゼをコード）及びａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−
グルコースデヒドラターゼをコード）の発見のために適
していることが見いだされた。さらにａｃｂＢ遺伝子に
隣接し、サイクラーゼをコードし、かくして不飽和シク
リトール（バリエナミン類）の生合成に含まれる（Ａｒ
ｏＢ、バクテリア３−デヒドロキネートシンターゼと部
分的に同じ）別の遺伝子がａｃｂＣの形態で見いだされ
たことも驚くべきことである。
ルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存されたタンパ
ク質領域から誘導された遺伝子プローブが、アクチノプ
ラーネス種において、遺伝子ａｃｂＡ（ｄＴＤＰ−グル
コースシンターゼをコード）及びａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−
グルコースデヒドラターゼをコード）の発見のために適
していることが見いだされた。さらにａｃｂＢ遺伝子に
隣接し、サイクラーゼをコードし、かくして不飽和シク
リトール（バリエナミン類）の生合成に含まれる（Ａｒ
ｏＢ、バクテリア３−デヒドロキネートシンターゼと部
分的に同じ）別の遺伝子がａｃｂＣの形態で見いだされ
たことも驚くべきことである。
【０００９】本発明は：ａｃｂＢの完全ＤＮＡ配列、な
らびにａｃｂＡ及びａｃｂＣの部分ＤＮＡ配列。
らびにａｃｂＡ及びａｃｂＣの部分ＤＮＡ配列。
【００１０】ａｃｂＢの完全アミノ酸配列、ならびにａ
ｃｂＡ及びａｃｂＣの部分アミノ酸配列。
ｃｂＡ及びａｃｂＣの部分アミノ酸配列。
【００１１】遺伝子ａｃｂＡ（ｄＴＤＰ−グルコースシ
ンターゼをコード）、ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコース
デヒドラターゼをコード）及びａｃｂＣ（サイクラーゼ
をコード、ＡｒｏＢ、バクテリア３−デヒドロキネート
シンターゼと部分的に同じ）、あるいはアクチノプラー
ネス種からの１種又はそれ以上のアカルボース生合成遺
伝子の発見のために既知のｄＴＤＰ−グルコースデヒド
ラターゼ酵素の高度に保存されたタンパク質領域から誘
導された遺伝子プローブを用いることを特徴とする、放
線菌から、特にアクチノプラーネスから二次代謝物生合
成遺伝子を単離する方法。
ンターゼをコード）、ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコース
デヒドラターゼをコード）及びａｃｂＣ（サイクラーゼ
をコード、ＡｒｏＢ、バクテリア３−デヒドロキネート
シンターゼと部分的に同じ）、あるいはアクチノプラー
ネス種からの１種又はそれ以上のアカルボース生合成遺
伝子の発見のために既知のｄＴＤＰ−グルコースデヒド
ラターゼ酵素の高度に保存されたタンパク質領域から誘
導された遺伝子プローブを用いることを特徴とする、放
線菌から、特にアクチノプラーネスから二次代謝物生合
成遺伝子を単離する方法。
【００１２】放線菌においてアカルボース−関連天然物
質（例えばバリダマイシン、オリゴスタチン類（トレス
タチン）、アジポジン類）の生合成遺伝子を単離する方
法。
質（例えばバリダマイシン、オリゴスタチン類（トレス
タチン）、アジポジン類）の生合成遺伝子を単離する方
法。
【００１３】遺伝子投薬量の増加又はより有効なプロモ
ーターにより、あるいは遺伝子操作による調節の（例え
ば調節タンパク質発現又は調節タンパク質認識部位の）
変更による、アクチノプラーネスにおけるアカルボース
合成生産量の増加。
ーターにより、あるいは遺伝子操作による調節の（例え
ば調節タンパク質発現又は調節タンパク質認識部位の）
変更による、アクチノプラーネスにおけるアカルボース
合成生産量の増加。
【００１４】アカルボース合成を制限する生合成段階に
おける（ボトルネック酵素）、又は追加の成分の生産を
妨げるためのタンパク質操作による、アクチノプーネス
におけるアカルボース合成生産量の増加。追加の成分へ
の望ましくない生合成経路又は望ましくない酵素的分解
反応を除去することによる、アクチノプラーネスにおけ
る生成物範囲の必要な主生成物への制限。
おける（ボトルネック酵素）、又は追加の成分の生産を
妨げるためのタンパク質操作による、アクチノプーネス
におけるアカルボース合成生産量の増加。追加の成分へ
の望ましくない生合成経路又は望ましくない酵素的分解
反応を除去することによる、アクチノプラーネスにおけ
る生成物範囲の必要な主生成物への制限。
【００１５】アクチノプラーネスにおけるアカルボース
生産性の向上を目的とする調節の、かくして栄養要求の
変更。
生産性の向上を目的とする調節の、かくして栄養要求の
変更。
【００１６】−空時収率（ｓｐａｃｅ−ｔｉｍｅ ｙｉ
ｅｌｄ）を向上させることによる生産の向上の達成のた
め、 −精製のための簡単な方法の開発のため、 −生成物範囲の特異的制限の達成のため の、異種宿主株における（例えばストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）及び他のストレプトミセテス（ｓｔｒｅｐｔｍｙｃ
ｅｔｅｓ）における、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）又はコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）など
の急速に増殖するバクテリアにおける、あるいは酵母類
における）発現。
ｅｌｄ）を向上させることによる生産の向上の達成のた
め、 −精製のための簡単な方法の開発のため、 −生成物範囲の特異的制限の達成のため の、異種宿主株における（例えばストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）及び他のストレプトミセテス（ｓｔｒｅｐｔｍｙｃ
ｅｔｅｓ）における、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシ
ルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）又はコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）など
の急速に増殖するバクテリアにおける、あるいは酵母類
における）発現。
【００１７】合成的に、又は微生物的に生産された前駆
体から出発するアカルボース又はこの種の物質の化合物
の試験管内合成のための、アカルボース生合成遺伝子の
利用に関する。
体から出発するアカルボース又はこの種の物質の化合物
の試験管内合成のための、アカルボース生合成遺伝子の
利用に関する。
【００１８】後文において本発明を詳細に説明する。
【００１９】他に指示がなければすべての遺伝子操作法
はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＤＳ）における通り
に行った。
はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＤＳ）における通り
に行った。
【００２０】スクリーニングに用いた遺伝子プローブは
アクチノプラーネス種ＳＥ ５０／１１０から、既知の
ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存
されたタンパク質領域から誘導されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー（表１を参照）を用いたＰＣＲ法（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）を用いて得た。増幅されたアクチノプ
ラーネス種ＳＥ ５０／１１０ ＤＮＡフラグメントは
ｐＵＣ１８にクローニングされ、Ｅ．コリ ＤＨ５α
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）中に形質転換された。得られたプラスミド
（ｐＡＳ１、図２を参照）を、加熱法（ｂｏｉｌｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ）により、又はアルカリライシス（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）によりＥ．コ
リから単離した。
アクチノプラーネス種ＳＥ ５０／１１０から、既知の
ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ酵素の高度に保存
されたタンパク質領域から誘導されたオリゴヌクレオチ
ドプライマー（表１を参照）を用いたＰＣＲ法（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）を用いて得た。増幅されたアクチノプ
ラーネス種ＳＥ ５０／１１０ ＤＮＡフラグメントは
ｐＵＣ１８にクローニングされ、Ｅ．コリ ＤＨ５α
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）中に形質転換された。得られたプラスミド
（ｐＡＳ１、図２を参照）を、加熱法（ｂｏｉｌｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ）により、又はアルカリライシス（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）によりＥ．コ
リから単離した。
【００２１】Ｅ．コリ ＤＨ５αからのプラスミドｐＡ
Ｓ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて
加水分解した。０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ
フラグメントを単離し、32Ｐ−標識デオキシヌクレオチ
ドを用いたいわゆるニックトランスレーションにより標
識した。この放射標識フラグメントを、アカルボース生
合成遺伝子の単離のための遺伝子プローブとして用い、
後文ではａｃｂプローブと呼ぶ。
Ｓ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて
加水分解した。０．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ
フラグメントを単離し、32Ｐ−標識デオキシヌクレオチ
ドを用いたいわゆるニックトランスレーションにより標
識した。この放射標識フラグメントを、アカルボース生
合成遺伝子の単離のための遺伝子プローブとして用い、
後文ではａｃｂプローブと呼ぶ。
【００２２】アカルボース生合成遺伝子は以下の通りに
単離した。アクチノプラーネス種からの染色体ＤＮＡを
種々の制限酵素（ＳｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨ
Ｉ）を用いて切断し、ゲルクロマトグラフィーに供し、
ａｃｂプローブを用いたサザンハイブリッド形成により
相同遺伝子に関して調べた。遺伝子プローブとハイブリ
ッド形成するＤＮＡ制限フラグメントは以下のサイズを
有する：１０ｋｂ（ＳｓｔＩ）、９〜１０ｋｂ（Ｂｇｌ
ＩＩ）及び２．２ｋｂ（ＢａｍＨＩ）。ａｃｂプローブ
とハイブリッド形成する種々のＤＮＡフラグメントをゲ
ルから溶離し、ベクターｐＵＣ１８中に連結し、Ｅ．コ
リ ＤＨ５αにクローニングした。
単離した。アクチノプラーネス種からの染色体ＤＮＡを
種々の制限酵素（ＳｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨ
Ｉ）を用いて切断し、ゲルクロマトグラフィーに供し、
ａｃｂプローブを用いたサザンハイブリッド形成により
相同遺伝子に関して調べた。遺伝子プローブとハイブリ
ッド形成するＤＮＡ制限フラグメントは以下のサイズを
有する：１０ｋｂ（ＳｓｔＩ）、９〜１０ｋｂ（Ｂｇｌ
ＩＩ）及び２．２ｋｂ（ＢａｍＨＩ）。ａｃｂプローブ
とハイブリッド形成する種々のＤＮＡフラグメントをゲ
ルから溶離し、ベクターｐＵＣ１８中に連結し、Ｅ．コ
リ ＤＨ５αにクローニングした。
【００２３】２．２ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡフラグメ
ントを優先的にクローニングし、配列決定した。ａｃｂ
プローブとハイブリッド形成するアクチノプラーネス種
ＤＮＡを含むＥ．コリ ＤＨ５αクローンをプールハ
イブリッド形成（ｐｏｏｌｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）により同定した（ポイント７を参照）。プラスミド
ＤＮＡを陽性のクローンから単離し、プールハイブリッ
ド形成の結果をサザンハイブリッド形成により確証し
た。得られたプラスミド（図３を参照）を種々の制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて切断し、得られたＤＮＡフラ
グメントをＥ．コリ ＤＨ５αにおいてｐＵＣ１８にサ
ブクローニングし、連結し、配列決定した。
ントを優先的にクローニングし、配列決定した。ａｃｂ
プローブとハイブリッド形成するアクチノプラーネス種
ＤＮＡを含むＥ．コリ ＤＨ５αクローンをプールハ
イブリッド形成（ｐｏｏｌｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ）により同定した（ポイント７を参照）。プラスミド
ＤＮＡを陽性のクローンから単離し、プールハイブリッ
ド形成の結果をサザンハイブリッド形成により確証し
た。得られたプラスミド（図３を参照）を種々の制限エ
ンドヌクレアーゼを用いて切断し、得られたＤＮＡフラ
グメントをＥ．コリ ＤＨ５αにおいてｐＵＣ１８にサ
ブクローニングし、連結し、配列決定した。
【００２４】アクチノプラーネス種の２．２ｋｂのＢａ
ｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列を決定するために、以
下のプラスミドを構築し（ポイント７を参照）、挿入Ｄ
ＮＡの配列を分析した：（図１、１４を参照） ｐＡＳ２／１＝１．３ｋｂ ｐＡＳ２からのＰｓｔＩ／
ＢａｍＨＩフラグメント（図４） ｐＡＳ２／２＝１．６ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｐｈＩ／
ＢａｍＨＩフラグメント（図５） ｐＡＳ２／３＝０．９ｋｂ ｐＡＳ２からのＰｓｔＩフ
ラグメント（図６） ｐＡＳ２／４＝０．６ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｐｈＩフ
ラグメント（図７） ｐＡＳ２／５＝０．８ｋｂ ｐＡＳ２／１からのＨｉｎ
ｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図８） ｐＡＳ２／６＝０．６５ｋｂ ｐＡＳ２からのＸｈｏＩ
／ＳａｌＩフラグメント（図９） ｐＡＳ２／７＝０．５ｋｂ ｐＡＳ２からのＸｈｏＩ／
ＳａｌＩフラグメント（図１０） ｐＡＳ２／８＝０．２８ｋｂ ｐＡＳ２／３からのＨｉ
ｎｃＩＩフラグメント（図１１） ｐＡＳ２／９＝０．７ｋｂ ｐＡＳ２／１からのＸｈｏ
Ｉ／ＢｃｌＩフラグメント（図１２） ｐＡＳ２／１０＝０．３ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｓｔＩ
／ＢｃｌＩフラグメント（図１３）。
ｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列を決定するために、以
下のプラスミドを構築し（ポイント７を参照）、挿入Ｄ
ＮＡの配列を分析した：（図１、１４を参照） ｐＡＳ２／１＝１．３ｋｂ ｐＡＳ２からのＰｓｔＩ／
ＢａｍＨＩフラグメント（図４） ｐＡＳ２／２＝１．６ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｐｈＩ／
ＢａｍＨＩフラグメント（図５） ｐＡＳ２／３＝０．９ｋｂ ｐＡＳ２からのＰｓｔＩフ
ラグメント（図６） ｐＡＳ２／４＝０．６ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｐｈＩフ
ラグメント（図７） ｐＡＳ２／５＝０．８ｋｂ ｐＡＳ２／１からのＨｉｎ
ｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図８） ｐＡＳ２／６＝０．６５ｋｂ ｐＡＳ２からのＸｈｏＩ
／ＳａｌＩフラグメント（図９） ｐＡＳ２／７＝０．５ｋｂ ｐＡＳ２からのＸｈｏＩ／
ＳａｌＩフラグメント（図１０） ｐＡＳ２／８＝０．２８ｋｂ ｐＡＳ２／３からのＨｉ
ｎｃＩＩフラグメント（図１１） ｐＡＳ２／９＝０．７ｋｂ ｐＡＳ２／１からのＸｈｏ
Ｉ／ＢｃｌＩフラグメント（図１２） ｐＡＳ２／１０＝０．３ｋｂ ｐＡＳ２からのＳｓｔＩ
／ＢｃｌＩフラグメント（図１３）。
【００２５】ＤＮＡ配列決定のためにＦ．Ｓａｎｇｅｒ
ｅｔ ａｌ．（１９７７）の方法、又はそれから誘導
される方法を用いた。自動読み取り配列決定キット（Ａ
ｕｔｏｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を自動化レーザー蛍光（ＡＬＦ）ＤＮＡ配列決定機
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）と連結させて用いた。適したフルオレセイン−標
識ｐＵＣ逆配列決定（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）及び配列決定プライマーを購入した（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；表１
を参照）。
ｅｔ ａｌ．（１９７７）の方法、又はそれから誘導
される方法を用いた。自動読み取り配列決定キット（Ａ
ｕｔｏｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を自動化レーザー蛍光（ＡＬＦ）ＤＮＡ配列決定機
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）と連結させて用いた。適したフルオレセイン−標
識ｐＵＣ逆配列決定（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）及び配列決定プライマーを購入した（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；表１
を参照）。
【００２６】 ＰＣＲのためのプライマー類： プライマー名 配列 ＡＳ ２ ５′ＧＣＣＧＣＣＧＡＡＴＣＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣ ３′ ＡＳ ５ ５′ＣＣＣＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴ ３′ 配列決定反応のためのプライマー類： プライマー名 配列 ユニバーサルプライマー (ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ) ５′ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３′ リバースプライマー (ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ） ５′ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ ３′
【００２７】
【実施例】実施例１ Ｅ．コリ株の培養、プラスミドＤＮＡの調製及び単離 Ｅ．コリ ＤＨ５αをＬＢ培地において３７℃でインキ
ュベートした。プラスミド−潜在（ｈａｒｂｏｕｒｉｎ
ｇ）バクテリアを選択圧下に保持した（アンピシリン、
１００μｇ／ｍｌ）。培養は軌道震盪機上で２７０ｒｐ
ｍにおいて行った。少なくとも１６時間インキュベート
された混合物を終夜培養物（ＯＣ）と呼んだ。
ュベートした。プラスミド−潜在（ｈａｒｂｏｕｒｉｎ
ｇ）バクテリアを選択圧下に保持した（アンピシリン、
１００μｇ／ｍｌ）。培養は軌道震盪機上で２７０ｒｐ
ｍにおいて行った。少なくとも１６時間インキュベート
された混合物を終夜培養物（ＯＣ）と呼んだ。
【００２８】選択圧下でインキュベートされた１．５ｍ
ｌのＯＣからの細胞をプラスミドＤＮＡの調製に用い
た。プラスミドはアルカリ性ＳＤＳライシス法（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ １９７９）により単離し
た。
ｌのＯＣからの細胞をプラスミドＤＮＡの調製に用い
た。プラスミドはアルカリ性ＳＤＳライシス法（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ １９７９）により単離し
た。
【００２９】ベクターＤＮＡの特異的加水分解のため
に、制限エンドヌクレアーゼ類のみをを製造者の指示に
従って用いた（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅ
ｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。５Ｕの特定の制限エンドヌク
レアーゼを１０μｇのプラスミドＤＮＡの制限のために
用い、３７℃で２時間インキュベートした。完全な加水
分解を保証するために、同量の制限エンドヌクレアーゼ
を２回目に加え、再開したインキュベーションを少なく
とも１時間行った。
に、制限エンドヌクレアーゼ類のみをを製造者の指示に
従って用いた（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅ
ｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。５Ｕの特定の制限エンドヌク
レアーゼを１０μｇのプラスミドＤＮＡの制限のために
用い、３７℃で２時間インキュベートした。完全な加水
分解を保証するために、同量の制限エンドヌクレアーゼ
を２回目に加え、再開したインキュベーションを少なく
とも１時間行った。
【００３０】切断されたＤＮＡを、ＤＮＡフラグメント
のサイズに依存して０．５〜１．２％の水平アガロース
ゲル上の電気泳動に供した。溶離のために、ＤＮＡフラ
グメントを含むゲルの１片を無菌の外科用メスを用いて
切り出し、秤量した。ＪＥＴｓｏｒｂキット（Ｇｅｎｏ
ｍｅｄ，Ｂａｄ Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を指示の通りに用いてＤＮＡフラグメントをアガロ
ースから溶離した。
のサイズに依存して０．５〜１．２％の水平アガロース
ゲル上の電気泳動に供した。溶離のために、ＤＮＡフラ
グメントを含むゲルの１片を無菌の外科用メスを用いて
切り出し、秤量した。ＪＥＴｓｏｒｂキット（Ｇｅｎｏ
ｍｅｄ，Ｂａｄ Ｏｅｙｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を指示の通りに用いてＤＮＡフラグメントをアガロ
ースから溶離した。
【００３１】実施例２ アクチノプラーネス種試料の培養、染色体ＤＮＡの切断
及びゲル電気泳動 アクチノプラーネス種ＳＥ ５０／１１０をＴＳＢ培地
中で、軌道浸透機上において３０℃で３日間インキュベ
ートした。予備培養（５ｍｌ）は２４０ｒｐｍにおいて
培養管中で行い、主培養（５０ｍｌ）はじゃま板を有す
る５００ｍｌのフラスコ中で１００ｒｐｍにおいて行っ
た。培養の後、細胞を遠心により沈降させ、ＴＥ緩衝液
中で２回洗浄した。
及びゲル電気泳動 アクチノプラーネス種ＳＥ ５０／１１０をＴＳＢ培地
中で、軌道浸透機上において３０℃で３日間インキュベ
ートした。予備培養（５ｍｌ）は２４０ｒｐｍにおいて
培養管中で行い、主培養（５０ｍｌ）はじゃま板を有す
る５００ｍｌのフラスコ中で１００ｒｐｍにおいて行っ
た。培養の後、細胞を遠心により沈降させ、ＴＥ緩衝液
中で２回洗浄した。
【００３２】フェノール／クロロホルム抽出法（Ｄ．
Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．１９８５）により
１．５〜２ｍｇの細胞（新鮮重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉ
ｇｈｔ））を用いて完全ＤＮＡを調製した。
Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．１９８５）により
１．５〜２ｍｇの細胞（新鮮重量（ｆｒｅｓｈ ｗｅｉ
ｇｈｔ））を用いて完全ＤＮＡを調製した。
【００３３】適した緩衝液中で１０Ｕの適した制限酵素
を用い（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）、３７℃において２時間、２０μｇの
染色体ＤＮＡの加水分解を行った。完全な加水分解を保
証するために、同量の制限エンドヌクレアーゼを２回目
に加え、再開したインキュベーションを少なくとも１時
間行った。
を用い（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）、３７℃において２時間、２０μｇの
染色体ＤＮＡの加水分解を行った。完全な加水分解を保
証するために、同量の制限エンドヌクレアーゼを２回目
に加え、再開したインキュベーションを少なくとも１時
間行った。
【００３４】切断されたＤＮＡを０．７％の水平アガロ
ースゲル上で電気泳動に供した。
ースゲル上で電気泳動に供した。
【００３５】ＤＮＡフラグメントをＪＥＴｓｏｒｂキッ
ト（ポイント１を参照）を用いて再度溶離した。
ト（ポイント１を参照）を用いて再度溶離した。
【００３６】実施例３ ａｃｂ遺伝子プローブの調製 ポイント１における通りにして調製されたｐＡＳ１から
のフラグメントを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓ
ｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより製造されたニックトラ
ンスレーション系を用い、彼により記載されている通り
にして放射標識した。このために０．５〜１．０μｇの
ＤＮＡフラグメントを用いた。［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを
用いた（３０００Ｃｉ／ミリモル；Ａｍｅｒｓｈａｍ，
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。次いで
混合物を１０分間煮沸し（変性）、すぐにハイブリッド
形成溶液に加えた（ポイント４を参照）。
のフラグメントを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓ
ｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙにより製造されたニックトラ
ンスレーション系を用い、彼により記載されている通り
にして放射標識した。このために０．５〜１．０μｇの
ＤＮＡフラグメントを用いた。［α−32Ｐ］ｄＣＴＰを
用いた（３０００Ｃｉ／ミリモル；Ａｍｅｒｓｈａｍ，
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。次いで
混合物を１０分間煮沸し（変性）、すぐにハイブリッド
形成溶液に加えた（ポイント４を参照）。
【００３７】実施例４ 膜へのＤＮＡ転移、ＤＮＡハイブリッド形成（サザンハ
イブリッド形成）及びオートラジオグラフィー ＤＮＡフラグメントをサザン転移法（Ｓｏｕｔｈｅｒａ
ｎ，Ｅ．Ｍ．，１９７５）によりアガロースゲルから膜
に転移させた。ポイント２における通りにして得られた
アガロースゲルを０．２５ＭのＨＣｌ中で２０分間震盪
させた。ゲルを３層の吸着床（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）Ｗ
ｈａｔｍａｎ ３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓ
ｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上に置き、ＨｙｂｏｎｄTM
−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、気泡を含まずに上に置いた。
この上に数層の吸着紙を置いた。約１ｋｇの重さの重し
をフィルターの積み重ねの上に置いた。ＤＮＡは０．４
モルのＮａＯＨを通して吸引することにより転移させ
る。少なくとも１２時間の転移時間の後、ナイロンフィ
ルターを２ｘＳＳＣを用いて５分間濯ぎ、空気中で乾燥
する。
イブリッド形成）及びオートラジオグラフィー ＤＮＡフラグメントをサザン転移法（Ｓｏｕｔｈｅｒａ
ｎ，Ｅ．Ｍ．，１９７５）によりアガロースゲルから膜
に転移させた。ポイント２における通りにして得られた
アガロースゲルを０．２５ＭのＨＣｌ中で２０分間震盪
させた。ゲルを３層の吸着床（ａｂｓｏｒｂｅｎｔ）Ｗ
ｈａｔｍａｎ ３ＭＭ紙（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓ
ｔｏｎｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上に置き、ＨｙｂｏｎｄTM
−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、気泡を含まずに上に置いた。
この上に数層の吸着紙を置いた。約１ｋｇの重さの重し
をフィルターの積み重ねの上に置いた。ＤＮＡは０．４
モルのＮａＯＨを通して吸引することにより転移させ
る。少なくとも１２時間の転移時間の後、ナイロンフィ
ルターを２ｘＳＳＣを用いて５分間濯ぎ、空気中で乾燥
する。
【００３８】次いでナイロンフィルターを６８℃の水浴
において５０〜１００ｍｌの予備ハイブリッド形成溶液
中で少なくとも２時間震盪する。この間に溶液を少なく
とも２回変える。ハイブリッド形成は、ハイブリッド形
成キャビネットにおいて少なくとも１２時間行った。ａ
ｃｂプローブ（ポイント３を参照）を含む１５ｍｌのハ
イブリッド形成溶液を用いた。
において５０〜１００ｍｌの予備ハイブリッド形成溶液
中で少なくとも２時間震盪する。この間に溶液を少なく
とも２回変える。ハイブリッド形成は、ハイブリッド形
成キャビネットにおいて少なくとも１２時間行った。ａ
ｃｂプローブ（ポイント３を参照）を含む１５ｍｌのハ
イブリッド形成溶液を用いた。
【００３９】次いでナイロンフィルターを、６ｘ後洗浄
液（ｐｏｓｔｗａｓｈ）及び１ｘ後洗浄液を用いて各回
１５分間洗浄した。次いでナイロンフィルターをまだ湿
潤状態の間に付着性フィルム（ｃｌｉｎｇ ｆｉｌｍ）
で覆った。オートラジオグラフィーはＨｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、増強スクリーン（ｉｎｔ
ｅｎｓｉｆｙｉｎｇｓｃｒｅｅｎ）を有する遮光カセッ
ト（ｌｉｇｈｔｐｒｏｏｆ ｃａｓｓｅｔｔｅ）におい
て、−８０℃で少なくとも１６時間行う。
液（ｐｏｓｔｗａｓｈ）及び１ｘ後洗浄液を用いて各回
１５分間洗浄した。次いでナイロンフィルターをまだ湿
潤状態の間に付着性フィルム（ｃｌｉｎｇ ｆｉｌｍ）
で覆った。オートラジオグラフィーはＨｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、増強スクリーン（ｉｎｔ
ｅｎｓｉｆｙｉｎｇｓｃｒｅｅｎ）を有する遮光カセッ
ト（ｌｉｇｈｔｐｒｏｏｆ ｃａｓｓｅｔｔｅ）におい
て、−８０℃で少なくとも１６時間行う。
【００４０】実施例５ アクチノプラーネス種の完全ＤＮＡからのＢａｍＨＩフ
ラグメントの単離及びクローニング アクチノプラーネス種ＳＥ５０／１１０からの染色体Ｄ
ＮＡをＢａｍＨＩを用いて完全に加水分解し、アガロー
スゲル電気泳動に供し、１．５〜３ｋｂの長さのＤＮＡ
フラグメントをアガロースから溶離した。ベクタープラ
スミドｐＵＣ１８をＥ．コリ ＤＨ５αから調製し、Ｂ
ａｍＨＩを用いて加水分解し、製造者の指示に従ってア
ルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した。連結は２
０μｌの体積において、３：１のフラグメント対ベクタ
ーの比率で、混合物中の０．０１〜０．１μｇのＤＮＡ
を用いて行った。１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを適した
緩衝液と共に用いた（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎ
ｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｅ．コリ ＤＨ５αの
形質転換−感応細胞を完全連結混合物を用いて形質転換
した（Ｈａｎａｈａｎ １９８３により記載の通り
に）。アンピシリン−耐性形質転換細胞をＬＢ−Ａｍｐ
選択プレートに転移させた（１００μｇ／ｍｌ）。
ラグメントの単離及びクローニング アクチノプラーネス種ＳＥ５０／１１０からの染色体Ｄ
ＮＡをＢａｍＨＩを用いて完全に加水分解し、アガロー
スゲル電気泳動に供し、１．５〜３ｋｂの長さのＤＮＡ
フラグメントをアガロースから溶離した。ベクタープラ
スミドｐＵＣ１８をＥ．コリ ＤＨ５αから調製し、Ｂ
ａｍＨＩを用いて加水分解し、製造者の指示に従ってア
ルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した。連結は２
０μｌの体積において、３：１のフラグメント対ベクタ
ーの比率で、混合物中の０．０１〜０．１μｇのＤＮＡ
を用いて行った。１ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを適した
緩衝液と共に用いた（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎ
ｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｅ．コリ ＤＨ５αの
形質転換−感応細胞を完全連結混合物を用いて形質転換
した（Ｈａｎａｈａｎ １９８３により記載の通り
に）。アンピシリン−耐性形質転換細胞をＬＢ−Ａｍｐ
選択プレートに転移させた（１００μｇ／ｍｌ）。
【００４１】実施例６ ｄＴＤＰ−Ｄ−グルコースシンターゼ遺伝子を含むクロ
ーンの同定 アンピシリン−耐性形質転換細胞をｄＴＤＰ−Ｄ−グル
コースシンターゼ遺伝子の存在に関して調べた。それぞ
れの場合に１０個のこれらのクローンを選択プレート上
に線状に塗り、終夜インキュベートし、プレートを３ｍ
ｌのＬＢ培地で洗い流した。次いでそのような１０個の
プールの２０個からプラスミドＤＮＡを単離した（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ，１９７９により記載の通
りに）。クローニングされたＢａｍＨＩフラグメントを
ポリリンカーから抹消するために、２０種のプラスミド
試料を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで加水分解した。次いで制限混合物を０．８％の
アガロースゲル上の電気泳動に供し、ＤＮＡをサザン転
移によりアガロースゲルからナイロンフィルターに転移
させた（ポイント４を参照）。ａｃｂプローブを用いた
ハイブリッド形成を再度行った（ポイント４を参照）。
プールの１つはａｃｂプローブと陽性に反応し、それを
１０個の各クローンに分別した。それらのプラスミドを
同様に単離し、上記の方法に供した。ハイブリッド形成
するプラスミドをｐＡＳ２と呼んだ。それは２．２ｋｂ
のＢａｍＨＩフラグメントを含む。
ーンの同定 アンピシリン−耐性形質転換細胞をｄＴＤＰ−Ｄ−グル
コースシンターゼ遺伝子の存在に関して調べた。それぞ
れの場合に１０個のこれらのクローンを選択プレート上
に線状に塗り、終夜インキュベートし、プレートを３ｍ
ｌのＬＢ培地で洗い流した。次いでそのような１０個の
プールの２０個からプラスミドＤＮＡを単離した（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ，１９７９により記載の通
りに）。クローニングされたＢａｍＨＩフラグメントを
ポリリンカーから抹消するために、２０種のプラスミド
試料を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩで加水分解した。次いで制限混合物を０．８％の
アガロースゲル上の電気泳動に供し、ＤＮＡをサザン転
移によりアガロースゲルからナイロンフィルターに転移
させた（ポイント４を参照）。ａｃｂプローブを用いた
ハイブリッド形成を再度行った（ポイント４を参照）。
プールの１つはａｃｂプローブと陽性に反応し、それを
１０個の各クローンに分別した。それらのプラスミドを
同様に単離し、上記の方法に供した。ハイブリッド形成
するプラスミドをｐＡＳ２と呼んだ。それは２．２ｋｂ
のＢａｍＨＩフラグメントを含む。
【００４２】実施例７ プラスミドｐＡＳ２のサブクローニング ２本鎖ＤＮＡの配列を推定するために、プラスミドｐＡ
Ｓ２から出発して数個のサブクローンを製造した（図
１；図４〜１３）。
Ｓ２から出発して数個のサブクローンを製造した（図
１；図４〜１３）。
【００４３】ｐＡＳ２／１及びｐＡＳ２／３） プラスミドｐＡＳ２をＰｓｔＩを用いて加水分解した。
制限混合物を１％のアガロースゲル上で分離した。加水
分解から生じた０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメント及び
残りの１．３ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント
のプラスミドバンドをアガロースゲルから溶離した（Ｊ
ＥＴｓｏｒｂキット；Ｇｅｎｏｍｅｄ，Ｂａｄ Ｏｅｙ
ｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。１．３ｋｂのＰｓ
ｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドを再
連結してサブクローンｐＡＳ２／１を得た。０．９ｋｂ
のＰｓｔＩフラグメントをベクターｐＵＣ１８（Ｐｓｔ
Ｉを用いて加水分解）中にクローニングしてサブクロー
ンｐＡＳ２／３を生じた。
制限混合物を１％のアガロースゲル上で分離した。加水
分解から生じた０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメント及び
残りの１．３ｋｂのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメント
のプラスミドバンドをアガロースゲルから溶離した（Ｊ
ＥＴｓｏｒｂキット；Ｇｅｎｏｍｅｄ，Ｂａｄ Ｏｅｙ
ｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。１．３ｋｂのＰｓ
ｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドを再
連結してサブクローンｐＡＳ２／１を得た。０．９ｋｂ
のＰｓｔＩフラグメントをベクターｐＵＣ１８（Ｐｓｔ
Ｉを用いて加水分解）中にクローニングしてサブクロー
ンｐＡＳ２／３を生じた。
【００４４】ｐＡＳ２／２及びｐＡＳ２／４） プラスミドｐＡＳ２をＳｐｈＩを用いて加水分解した。
１．６ｋｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有す
るプラスミドを連結してサブクローンｐＡＳ２／２を得
た。０．６ｋｂのＳｐｈＩフラグメントをｐＵＣ１８
（ＳｐｈＩを用いて加水分解）中にクローニングしたサ
ブクローンｐＡＳ２／４を生じた。
１．６ｋｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを有す
るプラスミドを連結してサブクローンｐＡＳ２／２を得
た。０．６ｋｂのＳｐｈＩフラグメントをｐＵＣ１８
（ＳｐｈＩを用いて加水分解）中にクローニングしたサ
ブクローンｐＡＳ２／４を生じた。
【００４５】ｐＡＳ２／５） プラスミドｐＡＳ２／１をＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉを用いて加水分解した。得られた０．８ｋｂのフラグ
メントをｐＵＣ１８（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩを
用いて加水分解）中にクローニングし、サブクローンｐ
ＡＳ２／５を生じた。
Ｉを用いて加水分解した。得られた０．８ｋｂのフラグ
メントをｐＵＣ１８（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩを
用いて加水分解）中にクローニングし、サブクローンｐ
ＡＳ２／５を生じた。
【００４６】ｐＡＳ２／６） プラスミドｐＡＳ２をＸｈｏＩ／ＳａｌＩを用いて加水
分解した。得られた０．６５ｋｂのフラグメントをｐＵ
Ｃ１８（ＳａｌＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／６を生じた。
分解した。得られた０．６５ｋｂのフラグメントをｐＵ
Ｃ１８（ＳａｌＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／６を生じた。
【００４７】ｐＡＳ２／７） プラスミドｐＡＳ２をＸｈｏＩ／ＳａｌＩを用いて加水
分解した。得られた０．５ｋｂのフラグメントをｐＵＣ
１８（ＳａｌＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／６を生じた。
分解した。得られた０．５ｋｂのフラグメントをｐＵＣ
１８（ＳａｌＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／６を生じた。
【００４８】ｐＡＳ２／８） プラスミドｐＡＳ２／３をＨｉｎｃＩＩを用いて加水分
解した。得られた０．３ｋｂのフラグメントをｐＵＣ１
８（ＨｉｎｃＩＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／８を生じた。
解した。得られた０．３ｋｂのフラグメントをｐＵＣ１
８（ＨｉｎｃＩＩを用いて加水分解）中にクローニング
し、サブクローンｐＡＳ２／８を生じた。
【００４９】ｐＡＳ２／９） プラスミドｐＡＳ２／１をＸｈｏｌＩ／ＢｃｌＩを用い
て加水分解した。得られた０．７ｋｂのフラグメントを
ｐＵＣ１８（ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩを用いて加水分解）
中にクローニングし、サブクローンｐＡＳ２／９を生じ
た。
て加水分解した。得られた０．７ｋｂのフラグメントを
ｐＵＣ１８（ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩを用いて加水分解）
中にクローニングし、サブクローンｐＡＳ２／９を生じ
た。
【００５０】ｐＡＳ２／１０） プラスミドｐＡＳ２をＳｓｔＩ／ＢｃｌＩを用いて加水
分解した。得られた０．３ｋｂのフラグメントをｐＵＣ
１８（ＳｓｔＩ／ＢａｍＨＩを用いて加水分解）中にク
ローニングし、サブクローンｐＡＳ２／１０を生じた。
分解した。得られた０．３ｋｂのフラグメントをｐＵＣ
１８（ＳｓｔＩ／ＢａｍＨＩを用いて加水分解）中にク
ローニングし、サブクローンｐＡＳ２／１０を生じた。
【００５１】実施例８ アクチノプラーネス種の２．２ｋｂのＢａｍＨＩフラグ
メントのＤＮＡ配列決定 ポイント７に記載のプラスミドを配列決定した。１つの
試料から６〜８μｇのプラスミドＤＮＡを（ポイント１
を参照）、配列決定反応において用いた。配列決定反応
は自動読み取り（Ａｕｔｏ−Ｒｅａｄ）配列決定キット
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を用いて行った。この場合、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ
ＤＮＡ）の配列決定のための標準的案を用いた。Ａ．
Ｌ．Ｆ．（自動化レーザー蛍光（ＤＮＡ）配列決定機）
を用いたヌクレオチド配列の分析を可能にするために、
配列決定反応の開始剤分子としてフルオレセイン−標識
したユニバーサル及びリバース配列プライマーを用いた
（表１を参照）。ゲルの調製のために、８ｍｌのＨｙｄ
ｒｏ Ｌｉｎｋ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（Ｓｅｒｖ
ａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３３．
６ｇの尿素、８ｍｌの１０ｘＴＢＥ緩衝液、及び８０ｍ
ｌとする量のＨ2Ｏを混合し、濾過により滅菌し、１分
間脱ガスした。３５０μｌの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸ア
ンモニウム及び４０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミンを加えることにより重合を開始
した。溶液をゲルモールド（ｇｅｌ ｍｏｕｌｄ）中に
注いだ（５０ｘ５０ｘ０．０５ｃｍ）。電気泳動を３８
Ｗにおいて、及び４５℃の一定の温度において行った。
１ｘＴＢＥ緩衝液を移動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕ
ｆｆｅｒ）として用いた。測定された蛍光のＤＮＡ配列
への変換は、オン−ラインコンピューター（Ｃｏｍｐａ
ｑ ３８６／２０ｅ）において行い、それは電気泳動装
置の制御にも働いた（Ｐｒｏｇｒａｍ Ａ．Ｌ．Ｆ．Ｍ
ａｎｇｅｒ ２．５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
メントのＤＮＡ配列決定 ポイント７に記載のプラスミドを配列決定した。１つの
試料から６〜８μｇのプラスミドＤＮＡを（ポイント１
を参照）、配列決定反応において用いた。配列決定反応
は自動読み取り（Ａｕｔｏ−Ｒｅａｄ）配列決定キット
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を用いて行った。この場合、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓ
ＤＮＡ）の配列決定のための標準的案を用いた。Ａ．
Ｌ．Ｆ．（自動化レーザー蛍光（ＤＮＡ）配列決定機）
を用いたヌクレオチド配列の分析を可能にするために、
配列決定反応の開始剤分子としてフルオレセイン−標識
したユニバーサル及びリバース配列プライマーを用いた
（表１を参照）。ゲルの調製のために、８ｍｌのＨｙｄ
ｒｏ Ｌｉｎｋ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（Ｓｅｒｖ
ａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３３．
６ｇの尿素、８ｍｌの１０ｘＴＢＥ緩衝液、及び８０ｍ
ｌとする量のＨ2Ｏを混合し、濾過により滅菌し、１分
間脱ガスした。３５０μｌの１０％（ｗ／ｖ）過硫酸ア
ンモニウム及び４０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミンを加えることにより重合を開始
した。溶液をゲルモールド（ｇｅｌ ｍｏｕｌｄ）中に
注いだ（５０ｘ５０ｘ０．０５ｃｍ）。電気泳動を３８
Ｗにおいて、及び４５℃の一定の温度において行った。
１ｘＴＢＥ緩衝液を移動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕ
ｆｆｅｒ）として用いた。測定された蛍光のＤＮＡ配列
への変換は、オン−ラインコンピューター（Ｃｏｍｐａ
ｑ ３８６／２０ｅ）において行い、それは電気泳動装
置の制御にも働いた（Ｐｒｏｇｒａｍ Ａ．Ｌ．Ｆ．Ｍ
ａｎｇｅｒ ２．５；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００５２】 緩衝液及び溶液：バクテリアの培養のための培地 ＬＢ培地： トリプトン １０ｇ ＮａＣｌ １０ｇ 酵母抽出物 ５ｇ Ｈ2Ｏ １０００ｍｌとなる量 ｐＨは４ＭのＮａＯＨを用いて７．５に調節した。
【００５３】 ＴＳＢ培地： トリプトン大豆ブロス（Ｏｘｏｉｄ） ３０ｇ Ｈ2Ｏ １０００ｍｌとなる量 ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０） トリスＨＣｌ １０ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡ １ｍＭプラスミドＤＮＡの標準的試料 （Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ＆ Ｄｏｌｙ １９７９の方法の修正法） 混合物Ｉ： ５０ｍＭのグルコース ５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０） １０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０） ５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム 混合物ＩＩ： ２００ｍＭのＮａＯＨ １％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム ） 混合物ＩＩＩ： ３Ｍの酢酸カリウム １．８Ｍの蟻酸塩ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成 ２０ｘＳＳＣ： ３ＭのＮａＣｌ ０．３Ｍのクエン酸Ｎａ ｐＨ７．２ 予備ハイブリッド形成溶液： ６ｘＳＳＣ ０．０１Ｍの硫酸ナトリウムセＨ６．８ １ｍＭのＥＤＴＡ ０．５％のＳＤＳ ０．１％のスキムミルク粉末 ハイブリッド形成溶液： 標識反応の後のａｃｂプローブを１５ｍｌの予備ハイブリッド形成溶液に加える 。
【００５４】 ６ｘ後洗浄液： ６ｘＳＳＣ ０．５％のＳＤＳＤＮＡ配列決定 ： ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ８．０）： １Ｍのトリス塩基 ０．８３Ｍの硼酸 １０ｍＭのＥＤＴＡ
【００５５】
【表１】
【００５６】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
である。
【００５７】１．配列番号：０１の配列を有するＤＮＡ
配列。
配列。
【００５８】２．ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼをコ
ードする完全ａｃｂＢ ＤＮＡ配列、ならびに部分ＤＮ
Ａ配列ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ
をコードする）及びａｃｂＣ（サイクラーゼをコードす
る）を含むことを特徴とする上記１項に記載のＤＮＡ。
ードする完全ａｃｂＢ ＤＮＡ配列、ならびに部分ＤＮ
Ａ配列ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼ
をコードする）及びａｃｂＣ（サイクラーゼをコードす
る）を含むことを特徴とする上記１項に記載のＤＮＡ。
【００５９】３．上記２項に記載のＤＮＡの機能性変異
体。
体。
【００６０】４．上記１〜３項に記載のＤＮＡを含むベ
クター。
クター。
【００６１】５．上記４項に記載のベクターを用いて形
質転換された微生物。
質転換された微生物。
【００６２】６．配列番号：０１の配列を有するアミノ
酸配列。
酸配列。
【００６３】７．上記６項に記載のアミノ酸配列の機能
性変異体及び突然変異体。
性変異体及び突然変異体。
【００６４】８．上記６及び７項に記載のアミノ酸配列
又はその一部を含むタンパク質。
又はその一部を含むタンパク質。
【００６５】９．既知のｄＴＤＰ−グルコースデヒドラ
ターゼ酵素の高度に保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）
タンパク質領域から誘導されるオリゴヌクレオチドプラ
イマーを遺伝子プローブとして用い、アカルボース生合
成遺伝子とハイブリッド形成させることを特徴とする放
線菌から１種又はそれ以上のアカルボース生合成遺伝子
を単離する方法。
ターゼ酵素の高度に保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）
タンパク質領域から誘導されるオリゴヌクレオチドプラ
イマーを遺伝子プローブとして用い、アカルボース生合
成遺伝子とハイブリッド形成させることを特徴とする放
線菌から１種又はそれ以上のアカルボース生合成遺伝子
を単離する方法。
【００６６】１０．上記５項に記載の微生物を培養し、
アカルボースを培養ブロスから単離することを特徴とす
るアカルボースの製造法。
アカルボースを培養ブロスから単離することを特徴とす
るアカルボースの製造法。
【００６７】１１．さらに別のアカルボース構造遺伝子
及び調節遺伝子を同定するための上記２項に従って得ら
れる遺伝子の利用。
及び調節遺伝子を同定するための上記２項に従って得ら
れる遺伝子の利用。
【００６８】１２．遺伝子投薬量（ｇｅｎｅ ｄｏｓ
ｅ）を増加させることにより、又はより活性なプロモー
ターを用いることにより、又は（例えば調節タンパク質
発現の、又は調節タンパク質認識部位の）遺伝子操作に
より調節を変更することによりアカルボース合成生産量
を増加させるための、上記２及び１１項に従って得られ
る遺伝子の利用。
ｅ）を増加させることにより、又はより活性なプロモー
ターを用いることにより、又は（例えば調節タンパク質
発現の、又は調節タンパク質認識部位の）遺伝子操作に
より調節を変更することによりアカルボース合成生産量
を増加させるための、上記２及び１１項に従って得られ
る遺伝子の利用。
【００６９】１３．アカルボース−関連天然物質の生合
成遺伝子の単離のための上記２及び１１項に従って得ら
れる遺伝子の利用。
成遺伝子の単離のための上記２及び１１項に従って得ら
れる遺伝子の利用。
【００７０】１４．タンパク質操作により生合成酵素を
修飾するための上記２及び１１項に従って得られる遺伝
子の利用。
修飾するための上記２及び１１項に従って得られる遺伝
子の利用。
【００７１】１５．アカルボースの追加の成分への望ま
しくない生合成経路を除去するための上記２及び１１項
に従って得られる遺伝子の利用。
しくない生合成経路を除去するための上記２及び１１項
に従って得られる遺伝子の利用。
【００７２】１６．アカルボースの望ましくない酵素的
分解反応を除去するための上記２及び１１項に従って得
られる遺伝子の利用。
分解反応を除去するための上記２及び１１項に従って得
られる遺伝子の利用。
【００７３】１７．生合成酵素を得るための上記２及び
１１項に従って得られる遺伝子の利用、ならびに合成的
に又は微生物的に製造された前駆体から出発してアカル
ボース又はこの種の物質の化合物を合成するためのそれ
らの利用。
１１項に従って得られる遺伝子の利用、ならびに合成的
に又は微生物的に製造された前駆体から出発してアカル
ボース又はこの種の物質の化合物を合成するためのそれ
らの利用。
【００７４】
【表２】
【００７５】
【表３】
【００７６】
【表４】
【図１】プラスミドｐＡＳ２中にクローニングされたＢ
ａｍＨＩフラグメントのための配列決定手順を説明する
ための図である。
ａｍＨＩフラグメントのための配列決定手順を説明する
ための図である。
【図２】ｐＡＳ１の制限酵素地図である。
【図３】ｐＡＳ２の制限酵素地図である。
【図４】ｐＡＳ２／１の制限酵素地図である。
【図５】ｐＡＳ２／２の制限酵素地図である。
【図６】ｐＡＳ２／３の制限酵素地図である。
【図７】ｐＡＳ２／４の制限酵素地図である。
【図８】ｐＡＳ２／５の制限酵素地図である。
【図９】ｐＡＳ２／６の制限酵素地図である。
【図１０】ｐＡＳ２／７の制限酵素地図である。
【図１１】ｐＡＳ２／８の制限酵素地図である。
【図１２】ｐＡＳ２／９の制限酵素地図である。
【図１３】ｐＡＳ２／１０の制限酵素地図である。
【図１４】プラスミドｐＡＳ２中にクローニングされた
２,２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列及び
遺伝子ａｃｂＡ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列である。
２,２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡ配列及び
遺伝子ａｃｂＡ、Ｂ、Ｃのアミノ酸配列である。
【図１５】図１４の続き。
【図１６】図１４の続き。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:045） (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:045） (72)発明者 ユルゲン・デイストラー ドイツ42107ブツペルタール・デユツペラ ーシユトラーセ44 (72)発明者 アンスガー・シユトラトマン ドイツ42103ブツペルタール・バルマーシ ユトラーセ51
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号：０１の配列を有するＤＮＡ配
列。 - 【請求項２】 ｄＴＤＰ−グルコースシンターゼをコー
ドする完全ａｃｂＢＤＮＡ配列、ならびに部分ＤＮＡ配
列ａｃｂＢ（ｄＴＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコ
ードする）及びａｃｂＣ（サイクラーゼをコードする）
を含むことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡの機能
性変異体。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含むベ
クターを用いて形質転換された微生物。 - 【請求項４】 配列番号：０１の配列を有するアミノ酸
配列又はその機能性変異株もしくは突然変異体、或いは
その一部を含むタンパク質。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19507214.6 | 1995-03-02 | ||
| DE19507214A DE19507214A1 (de) | 1995-03-02 | 1995-03-02 | Acarbose-Biosynthesegene aus Actinoplanes sp., Verfahren zu ihrer Isolierung sowie ihre Verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08256781A true JPH08256781A (ja) | 1996-10-08 |
Family
ID=7755404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8067226A Pending JPH08256781A (ja) | 1995-03-02 | 1996-02-28 | アクチノプラーネス種からのアカルボース生合成遺伝子、それらの単離法、及びそれらの利用 |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5753501A (ja) |
| EP (1) | EP0730029B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08256781A (ja) |
| KR (1) | KR960034418A (ja) |
| CN (1) | CN1144271A (ja) |
| AT (1) | ATE281523T1 (ja) |
| AU (1) | AU706116B2 (ja) |
| CA (1) | CA2170577A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ63796A3 (ja) |
| DE (2) | DE19507214A1 (ja) |
| ES (1) | ES2232829T3 (ja) |
| FI (1) | FI960951L (ja) |
| HU (1) | HUP9600500A2 (ja) |
| IL (1) | IL117316A0 (ja) |
| NO (1) | NO960852L (ja) |
| NZ (1) | NZ286092A (ja) |
| SK (1) | SK28596A3 (ja) |
| TW (1) | TW375657B (ja) |
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| EP0796915A3 (de) * | 1996-03-22 | 1999-04-14 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung sowie zur Verwendung von Acarviosyl-Transferase bei der Umwandlung von Acarbose-Homologen in Acarbose, zur Herstellung von Acarbose-Homologen |
| DE19622783A1 (de) * | 1996-06-07 | 1997-12-11 | Hoechst Ag | Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung |
| DE19637591A1 (de) * | 1996-09-13 | 1998-03-19 | Bayer Ag | Osmokontrolliertes Fermentationsverfahren zur Herstellung von Acarbose |
| DE19708127A1 (de) * | 1997-02-28 | 1998-09-03 | Bayer Ag | Acarbose acb-Cluster: Isolierung von weiteren Genen der Acarbose Biosynthese und des Acarbose-Stoffwechsels aus Actinoplanes sp. SE 50/110 sowie deren Verwendung |
| CN106566796B (zh) * | 2016-10-28 | 2020-11-10 | 上海交通大学 | 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 |
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|---|---|---|---|---|
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| DE2209834C3 (de) * | 1972-03-01 | 1978-04-20 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Herstellung von Saccharase-Inhibitoren |
| US4062950A (en) * | 1973-09-22 | 1977-12-13 | Bayer Aktiengesellschaft | Amino sugar derivatives |
| DE2347782C3 (de) * | 1973-09-22 | 1979-10-11 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Aminozuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel |
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