CZ65698A3 - Geny kontrolující buněčný cyklus - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se vztahuje ke skupině kontrolních genů, které řídi průběh buněčného cyklu u eukaryotických buněk.

*

Dosavadní stav techniky v ---------------------------------------Řízení buněčného cyklu je základem pro růst a zachováni eukaryotických organismů, od kvasinek po savce. Eukaryotické buňky si vyvinuly řídicí dráhy nazývané „kontrolní body (checkpoints), které zajišťuji, že jednotlivé individuální fáze buněčného cyklu jsou dokončené před tím, než je zahájena další fáze. Při poškození DNA je tak zvýšena šance na přežití buňky jednak přímo mechanismy opravujícími DNA a také pozastavením postupu v buněčném cyklu. V závislosti na pozici buňky v buněčném cyklu v době ozáření, poškození DNA v savčích buňkách může zabránit (a) přechodu z G1 do ^< S fáze, (b) průběhu S fáze nebo (c) přechodu z G2 fáze do mitózy.

Předpokládá se, že takováto kontrolní místa (checkpoints) zabrání «

zhoubným událostem, jako je replikace poškozené DNA a segregaci fragmentovaných chromozómů během mitózy.

Gen rad3 z Schizosaccharomyces pombe je nezbytný pro kontrolní body, které odpovídají na poškození DNA a replikační bloky. Rad3 je * členem lipid kinázové podtřídy kináz, která obsahuje oblasti vykazující sekvenční homologii s lipid kinázovou doménou subjednotky pllO fosfatidylinositol-3 kinázy (PI-3 kináza). Tato podtřída také zahrnuje protein ATM, který je defektni u pacientů s ataxií (ataxiatelangiectasia). Buňky z těchto pacientů (AT buňky) nevykazuji zpoždění S fáze po ozáření a vykazují tak zvanou radio-resistentní DNA syntézu (Painter a Young, 1989). AT buňky ozářené v S-fázi akumulují v G2 letální poškození, pravděpodobně jako následek pokusu replikovat poškozenou DNA. AT buňky ozářené během G2 fáze vykazuji odlišný fenotyp: nezastavuji mitózu po poškozeni DNA a pokračuji • · · · « · • · · · · · • · · · · · · ··«· ··· · · 9 9 9 9 9

999 999 99 999 999 v mitóze s poškozenou DNA (Beamish a Levin, 1994). Mutace v A-T „ lokusu, kde byl ATM gen lokalizován, má tedy za následek poškozeni několika kontrolních bodů nezbytných pro přiměřenou odpověď na • ionizující ozáření. Mezi další členy této podtřídy lipidových kináz patří: Tellp (Greenwell et al. 1985), gen účastnící se při udržování správné délky telomer u Sacharomyces cerevisiae; Esrlp; Meclp a produkt genu pro kontrolní bod mei-41 u Drosophila melanogaster (Hari et al. 1995).

Podstata vynálezu

Analyzovali jsme rad3 gen S. pombe a zjistili jsme, že aminokyselinová sekvence je tvořena celkem 2386 aminokyselinami a ne 1070 aminokyselinami, jak uvedl Seatson et al. 1992. Určili jsme, že se jedná o přímý homolog S. cerevisiae Esrlp a že vykazuje shodnou celkovou strukturu jako ATM gen. Oblast C-konce rad3 proteinu obsahuje lipidovou kinázovou doménu, která je pro činnost Rad3 nezbytná. Ukázali jsme , že Rad3 je sám o sobě schopný vzájemného spoj ování(šelf association). Také jsme určili protein kinázovou aktivitu spojenou s Rad3.

Dále jsme nalezli lidský analog rad3. Tento gen, který jsme pojmenovali ATR (ataxia and rad related), vykazuje značně vyšší homologii s rad3 než s ATM genem.

Sekvence lidské ATR cDNA je uvedena jako Seq ID No. 1. Aminokyselinová sekvence ORF od nukleotidu 80 a 8011 je uvedena jako Seq. ID No. 2.

DNA sekvence otevřeného čtecího rámce (ORF - open reading frame) rad3 je uvedena jako Seq. ID No. 3. Výsledek translace genu - 2386 aminokyselin dlouhá sekvence (nukleotidy 585 až 7742 seq ID No. 3) je uvedena jako Seq. ID No. 4.

Stejně tak je důležité to, že vynález poskytuje protein ATR podle Seq. ID 2, jeho homologa, jeho polypeptidové fragmenty a také protilátky schopné vázat protein ATR nebo jeho polypeptidové fragmenty. ATR protein, jeho homologa a fragmenty jsou dále uváděny jako polypeptidy vynálezu.

• 4 ···· · 4 · ···· • 4 4 4 4 4 · · · · • 444 · · · 4 4 444 444 • 4 4 4 4 4 · ·

4 4 4 · · · · 4 · 4 4 44

Dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou polynukleotidy ve značně isolované formě schopné selektivní hybridizace k Seq ID No. 1 nebo k jeho komplementu (tj. opačnému prameni). Předkládány jsou také polynukleotidy kódující polypeptidy vynálezu. Takovéto polynukleotidy budou uváděny jako polynukleotidy vynálezu. Polynukleotidy vynálezu zahrnují DNA ze Seq. ID No. 1 a její fragmenty, schopné selektivní hybridizace k tomuto genu.

Další stránkou vynálezu jsou předkládané rekombinantní vektory nesoucí polynukleotid vynálezu, včetně expresních vektorů a metody kultivace těchto vektorů ve vhodných hostitelských buňkách, například za podmínek, ve kterých dochází k expresi proteinu nebo polypeptidů kódovaných sekvencí vynálezu.

Dále vynález poskytuje soupravy obsahující polynukleotidy, polypeptidy nebo protilátky vynálezu a metody použití takovýchto souprav při diagnose přítomnosti nebo absence ATR a jeho homologů, nebo jeho variant včetně škodlivých mutantů ATR.

Vynález dále poskytuje metody testů pro vyhledávání potenciálních substancí využitelných pro inhibici nebo aktivací ATR aktivity, nebo aktivity mutovaných forem ATR, které postrádají kontrolní aktivitu (checkpoint activity). Vynález také popisuje testovací metody pro vyhledávání vhodných substancí použitelných k inhibici interakcí mezi ATR a ostatními sloučeninami, které reagují s ATR, včetně samotného ATR.

V této souvislosti vynález také poskytuje polynukleotidovou sekvenci Seq ID No. 3 ve značně izolované formě a protein Seq ID No. 4 ve značně isolované formě a jejich nové fragmenty a varianty.

Detailní popis vynálezu

A. Polynukleotidy

Polynukleotidy vynálezu mohou zahrnovat DNA nebo RNA. Také se mohou vyskytnout polynukleotidy, které obsahují ve své struktuře syntetické nebo modifikované nukleotidy. Odborníci znají řadu různých typů modifikací oligonukleotidů. Patří mezi ně metylfosfonátová a fosforothioátová páteř (methylphosphonate and phosphorothioate backbone), přidání akridinového nebo polylysinového řetězce na 3' a/nebo 5' konec molekuly. Pro účely presentovaného

vynálezu je nutné pochopit, že polynukleotidy zde popsané mohou být modifikované jakoukoliv metodou známou odborníkům. Takovéto modifikace mohou být provedeny za účelem zvýšení aktivity in vivo nebo životnosti polynukleotidů vynálezu.

Polynukleotidy vynálezu schopné selektivní hybridizace k DNA Seq ID No. 1 budou obecně nejméně ze 70% (lépe ale nejméně z 80-90% a ještě lépe nejméně z 95%) homologni s odpovídající DNA Seq ID No. 1 v oblasti nejméně 20, nebo lépe nejméně 25-30 (například nejméně 40, 60 nebo 100 nebo i více) sousedících nukleotidů.

Je nutné uvědomit si, že odborně školené osoby můžou s použitím rutinních technik provést náhradu nukleotidů, které neovlivní polypeptidovou sekvenci kódovanou polynukleotidy vynálezu proto, aby se projevilo použití kodonů určitého hostitelského organismu, ve kterém mají být polypeptidy vynálezu exprimované.

Jakákoliv kombinace výše uvedených stupňů homologie a minimálních velkostí může být použita k definováni polynukleotidů vynálezu, přičemž preferovaná je stringentnější kombinace (tj. větší homologie u delších úseků). Tak například polynukleotid s nejméně 80% homologií u 25, nebo lépe 30 nukleotidů představuje jeden aspekt vynálezu, stejně jako polynukleotid s nejméně 90% homologií u 40 nukleotidů.

Polynukleotidy vynálezu mohou posloužit k vytvoření primeru (např. PCR primeru, primeru pro jinou amplifikační reakci), jako sonda (tj. označené značkou detekovatelnou běžnými prostředky např. použitím radioaktivní nebo neradioaktivní značky), nebo mohou být polynukleotidy klonovány do vektorů. Takovéto primery, sondy a ostatní fragmenty budu dlouhé nejméně 15 nukleotidů (lépe nejméně 20 a typicky nejméně 25, 30 nebo 40 nukleotidů dlouhé) a jsou také zahrnuty do zde používaného termínu polynukleotidy vynálezu.

Polynukleotidy jako DNA polynukleotid a primery podle tohoto vynálezu mohou být produkovány rekombinantě, synteticky nebo jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkům. Mohou také být klonovány standardními technikami.

Primery budou většinou produkovány synteticky, postupným přidáváním jednoho nukleotidu až k dosaženi žádoucí nukleotidové sekvence. Tyto techniky využívají automatů a jsou běžně známé.

• « · · ·· ···· «· ·· • · · · ·· · ···· ··· · · · ···· • ··· · 9 · · · ··· ··· • ····· · · • · ·« · · · · ·· · · ··

Delší polynukleotidy budou většinou produkovány s použitím rekombinantních technik, například využitím techniky PCR klonování (polymerázová řetězová reakce - polymerase chain reaction). Ta zahrnuje vytvoření páru primerů (např 15-30 nukleotidů dlouhých) k oblasti ATR genu, který chceme klonovat, aplikaci těchto primerů na mRNA nebo cDNA získané z lidských buněk (např. z dělících se buněk jako jsou leukocyty z periferní krve), vlastní PCR reakci za podmínek vedoucích k amplifikaci žádoucí oblasti, izolaci amplifikovaného fragmentu (např. purifikací reakční směsi na agarosovém gelu) a získání amplifikované DNA. Primery mohou být navrženy tak, aby obsahovaly vhodné cílové místo pro restrikční enzym, takže amplifikovaná DNA může být nakloňována do vhodného klonovacího vektoru.

Tyto techniky mohou být použity k získání celé nebo některé části sekvence ATR, která je zde popsaná. Genomové klony obsahující gen ATR a jeho introny a promotorové oblasti můžeme také získat analogickým způsobem, kdy jako výchozí materiál slouží genomová DNA z lidských buněk, např. jaterních buněk.

I když techniky zde zmíněné jsou obecně všeobecně známé, jejich popis je možné najít zejména v publikaci Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989).

Polynukleotidy, které nejsou 100% homologní k sekvenci předkládaného vynálezu, ale spadají do rámce tohoto vynálezu, mohou být získány různými způsoby.

Jiné zde popsané alelické varianty sekvence lidského ATR mohou být získány například testováním genomových DNA knihoven, připravených z řady jedinců, například jedinců z různých populací.

Dále mohou být získána homologa ATR např. ze zvířat, hlavně savců (např. myší, krys nebo králíků) a zejména primátů a tyto homologa a jejich fragmenty budou zpravidla schopné selektivně hybridizovat k Seq. ID No. 1. Takovéto sekvence mohou být získány testováním cDNA knihoven připravených z dělících se buněk nebo pletiv nebo genomových DNA knihoven z jiných živočišných druhů a testováním takovýchto knihoven sondami zahrnujícími celou nebo část Seq. ID. 1 za vysoce stringentních podmínek (např. 0,03 M chlorid sodný a 0,03 M citrát sodný při asi teplotách od 50 °C do 60 °C).

Alelické varianty a druhová homologa se mohou také získat s použitím „degenerované PCR (degenerate PCR), při které se použiji primery vytvořené tak, aby hybridizovaly s cílovými sekvencemi uvnitř variant a homologů kódujících konzervované aminokyselinové sekvence. Konzervované sekvence mohou být vytipovány porovnáním aminokyselinové sekvence ATR se sekvencí rad3. Primery budou obsahovat jednu nebo více degenerovaných pozic a budou použity za méně stringentních podmínek než jsou ty, které se použijí pro klonování sekvencí s jednosekvencovými primery proti známým sekvencím.

Takovéto polynukleotidy mohou být také získány místní řízenou mutagenezi sekvence ATR nebo příslušných alelických variant. To může být například užitečné tam, kde jsou nezbytné tiché změny kodónů pro optimalizaci vhodnosti kodónů pro určitou hostitelskou buňku, ve které má být polynukleotidová sekvence exprimována. Jiné změny sekvence mohou být žádoucí, chceme-li vnést nové místo pro restrikční enzym nebo pro změnu vlastnosti nebo funkce polypeptidu kódovaného polynukleotidem. Žádoucí můžou být i další změny, představující částečné změny kódování nalezené u ATR (které vedou-li ke vzniku mutantních ATR genů, které ztratily kontrolní funkci). Sondy založené na takovýchto změnách mohou být použity jako diagnostické sondy k detekci takovýchto ATR mutantů.

Vynález dále poskytuje dvojpramenné polynukleotidy zahrnující polynukleotidy vynálezu a jejich doplňky.

Polynukleotidy nebo primery vynálezu mohou obsahovat detekční značku. Vhodné značky zahrnují radioisotopy jako ³²P nebo ³⁵S, enzymové značky, nebo jiné proteinové značky, jako např. biotin. Takovéto značky mohou být připojeny k polynukleotidům nebo primerům vynálezu a mohou být detekovány s použitím známých technik.

Značené nebo neznačené polynukleotidy nebo primery vynálezu nebo příslušné fragmenty mohou být použity osobami znalými technik detekce a sekvenování nukleových kyselin pro detekci či sekvenování

ATR v lidském nebo zvířecím těle.

Takovéto detekční testy obecně zahrnují aplikaci sondy obsahující polynukleotid nebo primer vynálezu na vzorek z lidí nebo zvířat obsahující DNA nebo RNA za hybridizačních podmínek a detekci ·· ·Φ ·· ·Φ·· φφ ·· • · · · · · · φφφ· φ · · «· · φφφφ φ φφφ φφφ φ φ φφφ φφφ φ · φ φ φ · φ φ • ΦΦΦ φφ ·· φφ φφ · φ jakýchkoliv duplexů vytvořených mezi sondou a nukleovou kyselinou vzorku. Detekci je možné provést s použitím technik jako je PCR nebo imobilizací sondy na pevný povrch, odstraněním nepřihybridizovaných nukleových kyselin a potom detekováním nukleových kyselin, které přihybridizovaly k sondě. Nebo můžou být nukleové kyseliny vzorku přichyceny na pevný povrch a pak se detekuje množství navázané sondy ke vzorku. Vhodné detekční metody pro tyto způsoby detekce jsou uvedené například v W089/03891 a WO90/13667.

Při sekvenování ATR se aplikuje na cílový lidský nebo zvířecí tělní vzorek (obsahující DNA nebo RNA) sonda obsahující polynukleotid nebo primer vynálezu za hybridizačních podmínek a detekci sekvence například Sangerovou dideoxy terminační metodou (viz Sambrook et al.).

Takováto metoda zpravidla zahrnuje elongaci (za přítomnosti vhodných činidel) primeru syntézou komplementární cílové DNA nebo RNA a selektivní ukončení elongační reakce u jednoho nebo více A, C, G nebo T/U residuí. Dochází tedy k prodlužování pramene, které je ukončeno terminační reakcí; dále následuje vlastní určení sekvence nukleotidů separací podle velikosti prodloužených produktů (podle toho, kde došlo k selektivnímu ukončení prodlužování). Vhodná činidla zahrnují enzym DNA polymerázu, deoxynukleotidy dATP, dCTP, dGTP a dTTP, pufr a ATP. Pro selektivní terminaci se používají dideoxynukleotidy.

Testy pro detekci nebo sekvenování ATR v lidském nebo zvířecím organismu mohou být použity k určení sekvence ATR v buňkách individuálních organismů, které mají (nebo u kterých se předpokládá) pozměněnou genovou sekvenci ATR, například u rakovinných buněk včetně buněk leukemických nebo pevných tumorů, jako např. tumorů prsu, vaječníků, tračníku, pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kostí.

Navíc, objevení ATR umožní nyní zkoumat vliv tohoto genu u dědičných poruch způsobem obdobným jako u genu ATM. Obecně to zahrnuje určení stavu ATR (např. použitím sekvenční analýzy pomocí

PCR) v buňkách odvozených od pacientů nemocných chorobami, u kterých může docházet k poškození replikujících se buněk např. s rodinnou predispozici k rakovině, chromozomálním změnám nebo nestabilitě

44 ·· 4444 44 44

4 4 4 4 · · · 4 4 ·

4 4 4 4 · 4 4 4 4 • 444 · 4 · 44 444 444

44444 · 4

4 4 4 44 44 44 ·· 4 4 fenotypu nebo s fenotypem s citlivosti vůči poškození reparačních funkci.

Sondy vynálezu můžou být vhodně dodávány ve formě testovací soupravy ve vhodném obalu. V takovéto soupravě (vyžaduje li to daný test) může být sonda navázána na pevný povrch. Souprava může také obsahovat vhodné reagenční činidla pro přípravu analyzovaného vzorku, hybridizaci sondy k nukleovým kyselinám vzorku, kontrolní činidla, instrukce a podobně.

Předkládaný vynález také poskytuje polynukleotidy kódující dále popsané polypeptidy vynálezu. Protože takovéto polynukleotidy budou užitečné jako sekvence pro rekombinantní produkci polypeptidů vynálezu, není nezbytně nutné, aby selektivně hybridizovaly se sekvencí Seq ID No. 1, i když by to obecně bylo žádoucí. Jinak takovéto polynukleotidy mohou být - je-li to potřeba - značené, použité a připravené tak, jak bylo uvedeno výše. Polypeptidy vynálezu jsou popsány dále.

Zvláště preferované polynukleotidy vynálezu jsou ty, které jsou odvozené od lipid kinázové domény ATR, jejích alelických variant a druhových homologů. Lipid kinázová doména je reprezentována nukleotidy 7054 až 8011 Seq. ID 1. Polynukleotidy vynálezu, které obsahují tuto doménu, jsou zejména preferovány. Termín „lipid kinázová doména se vztahuje k doméně, která má homologii s ostatními lipid kinásami, zejména s podjednotkou pllO PI-3 kinázy (stanoveno srovnáním sekvencí).

Ostatní preferované polynukleotidy vynálezu jsou ty, které obsahují nukleotidy kódující aminokyseliny 181-302 Seq.ID No. 2 (nukleotidy 620-985 Seq. ID No. 1) o kterých se předpokládá, že tvoří oblast leucinového zipu (leucine zipper region), místo předpokládané interakce protein-protein, a aminokyseliny 1358-1336 (nukleotidy 4151-4177), které jsou také konzervované.

Další stránka vynálezu - byly připraveny polynukleotidy vynálezu obsahující Seq. ID No. 3 a její fragmenty schopné selektivní hybridizace k této sekvenci (jiné než fragmenty obsahující nukleotidy 2482-6599) u kterých byly provedeny tyto změny:

odstranění residuí 2499, 2501, 2507 a 2509 a vložení C mezi

5918/5919.

•9 99 99 9999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99999 9 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 99

Zvlášť preferované fragmenty představují ty, které obsahují residua 6826-7334 (lipid kinázová doména) a oblast leucinového zipu (1476-1625 a 2310-2357). Dále jsou preferované fragmenty obsahující konzervovanou oblast nukleotidů 3891-3917. Tyto polypeptidy a fragmenty mohou být připraveny postupy popsanými výše.

B. Polypeptidy

Polypeptidy vynálezu zahrnují polypeptidy ve značně isolované formě, které obsahují sekvenci uvedenou v Seq ID No. 2.

Polypeptidy dále zahrnují varianty těchto sekvencí, včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant a syntetických variant, které jsou vysoce homologní k daným polypeptidům. V tomto kontextu je značná homologie chápána jako sekvence, která má alespoň 70%, (například 80% nebo 90%) homologii (shodnost) nukleových kyselin na úseku přes 30 aminokyselin se sekvencí Seq. ID No. 2 kromě lipid kinázové domény a C-koncové části (residua 2326-2644), kde podstatná homologie je chápána jako nejméně 80% homologie, ale lépe 90% homologie (identita) úseku přes 50 aminokyslin.

Mezi polypeptidy patří i jiné polypeptidy kódované homology ATR z jiných druhů včetně zvířat, jako jsou savci (např. myši, krysy nebo králíci) a zejména primáti, a jejich varianty definované výše.

Polypeptidy vynálezu také zahrnují fragmenty výše zmíněných kompletních polypeptidu a jejich variant, včetně fragmentů sekvence uvedené v Seq. ID No. 2.

Mezi preferované fragmenty patří zejména ty, které obsahují epitop, zejména epitop (which include an epitop, especially an apitop). Vhodné fragmenty budou mít velikost alespoň 5, např. 10, 12, 15 nebo 20 aminokyselin. Polypeptidové fragmenty proteinu ATR a jeho alelických a druhových variant můžou obsahovat jednu nebo více (např. 2, 3, 5 nebo 10) substitucí, delecí nebo insercí včetně konzervovaných substitucí.

Konzervované susbstituce se můžou provádět podle následující tabulky uvádějící konzervativní substituce, kde aminokysliny ve stejném bloku ve druhém sloupci a je-li to možné i ve stejné řádce ve třetím sloupci můžou být nahrazeny jedna za druhou ·· ····

ALIFATICKÉ	Nepolární	G A P
I L V
Polární	C S T M
N Q
Polární - nabité	D E
K R
AROMATICKÉ		H F W Y
OSTATNÍ		N Q D E

Varianty polypeptidů vynálezu mohou také obsahovat polypeptidy, kde je jedna nebo více specifikovaných (tj. přirozeně kódovaných) aminokyselin odstraněna nebo nahrazena nebo kde je přidána jedna nebo více nespecifikovaných aminokyselin:

1) bez ztráty kinázové aktivity specifické pro polypeptidy vynálezu nebo 2) se ztrátou kinázové aktivity specifické pro polypeptidy vynálezu nebo 3) se ztrátou schopnosti interakce s jednotlivými členy nebo regulátory kontrolních bodů průběhu buněčného cyklu.

Epitopy mohou být například určeny technikami vyhledáváni polypeptidů, které jsou popsány např. v publikaci Geysen et al. Mol. Immunol., 23:709-715 (1986).

Polypeptidy vynálezu mohou být ve značně izolované formě. Je nutné vysvětlit, že polypeptidy mohou být smíseny s nosiči nebo ředidly, které nebudou interferovat se zamýšleným účelem polypeptidů a stále budou považovány za značně isolované. Polypeptidy vynálezu mohou být také ve značně vyčištěné (purifikované) formě, kdy polypeptidy vynálezu představuji zpravidla více než 90%, tedy např. 95%, 98% nebo 99% polypeptidů v přípravku. Polypeptidy vynálezu mohou být modifikovány například přidáním histidinových residuí s cílem usnadnit jejich purifikaci nebo přidáním signální sekvence s cílem usnadnit jejich sekreci z buněk.

Polypeptidy vynálezu mohou být označeny detekční značkou. Detekční značka může být vhodná značka, která umožní detekci proteinu. Mezi vhodné značky patří například radioisotopy, např.

9 99 9 ¹²⁵I, enzymy, protilátky, polynukleotidy a další látky, jako například biotin. Značené polypeptidy vynálezu mohou být použity v diagnostických postupech jako jsou imunotesty s cílem určit množství polypeptidů vynálezu ve vzorku. Polypeptidy nebo značené polypeptidy vynálezu mohou být také použity v serologických nebo buněčných imunologických testech pro detekci imunní reakce k daným polypeptidům u zvířat a lidí s použitím standardních protokolů.

Polypeptidy nebo značené polypeptidy vynálezu nebo jejich fragmenty mohou být také přichyceny k pevné fázi, například k povrchu jamky pro imunotesty nebo na testovací proužky.

Takovéto značené a/nebo imobilizované polypeptidy mohou být dodávány ve formě souprav ve vhodném obalu společně s příslušnými činidly, kontrolami, instrukcemi atp.

Takovéto polypeptidy a soupravy mohou být použity v metodách pro imunodetekci protilátek proti ATR proteinu nebo jeho alelickým variantám nebo druhovým variantám.

Imunometody jsou odborníkům známé a obecně zahrnují:

a) zajištění polypeptidů obsahujícím epitop zachytitelný protilátkou proti danému proteinu

b) inkubaci biologického vzorku s daným polypeptidem za podmínek, které umožni tvorbu komplexu protilátka-antigen a

c) určeni, jestli došlo k tvorbě komplexu protilátka-antigen obsahující daný polypeptid

Polypeptidy vynálezu mohou být připraveny synteticky (např. podle Geysen et al.) nebo rekombinantně, jak je popsáno dále.

Mezi zvláště preferované polypeptidy vynálezi patři ty, které překlenuji nebo jsou v lipid kinázové doméně, jmenovitě aminokyseliny 2326-2644 Seq. ID 2. nebo sekvence vykazující s· ní podstatnou homologií. Výše definované fragmenty z těchto oblastí jsou zevláště preferované. Polypeptidy a jejich fragmenty mohou obsahovat změny aminokyselin jak je uvedeno výše, včetně substitucí na jedné nebo více pozicích z pozic 2475, 2480 2494, které odpovídají poloze rad3 substitucí popsaných v následujících příkladech. Mezi preferované substituce patří D2475A, N2480K a D2494E.

»· ····

Polypeptidy vynálezu mohou být použity v in vitro nebo in vivo systémech buněčných kultur pro studium role ATR jako kontrolního genu. Například zkrácené nebo modifikované (např. modifikované v oblasti lipid kinázové domény) polypeptidy ATR mohou být včleněny do buňky s cílem narušit normální kontrolní funkce, které jsou v buňce.

Polypeptidy vynálezu mohou být zavedeny do buněk in sítu expresí polypeptidů z rekombinantního expresního vektoru (viz dále). Expresní vektor může obsahovat indukovatelný promotor pro řízení exprese polypeptidů.

Použití savčích hostitelských buněk je možné předpokládat tehdy, jestliže se chce dosáhnout různých post-translačních modifikací (např. myristoilace (myristolation), glykosylace, zkrácení, lapidace (lapidation) a fosforylace tyrosinu, šeřinu nebo threoninu) což může být nutné pro dosažení optimální biologické aktivity rekombinantních produktů exprese vynálezu.

Takovéto systémy buněčných kultur, ve kterých jsou exprimovány polypeptidy vynálezu, mohou být použity v testovacích systémech k identifikaci možných substancí, které interferují s nebo zesilují kontrolní funkce v buňce (viz dále) .

V dalším pohledu polypeptidy vynálezu zahrnují protein Seq. ID No. 4a jeho fragmenty z jiné oblasti než fragment složený z aminokyselin 713 až 1778. Mezi zvláště preferované fragmenty patří ty, které zahrnují residua 2082 až 2386 (lipid kinázová doména) a oblast leucinového zipu (leucine zipper) 298-347 a 576-591. Dále je preferován fragment obsahující konzervovanou oblast 1103-1111. Takovéto polypeptidy a fragmenty mohou být připraveny a použity jak je popsáno výše.

Vynález také poskytuje polypeptidy s významnou homologií k proteinu Seq. ID No. 4a jeho fragmentům. V této souvislosti se za významnou (podstatnou) homologii pokládá sekvence s minimálně 70%, např. 80% nebo 90% aminokyselinovou homologií (identitou) úseku 30 aminokyselin se sekvencí Seq. ID No.4 kromě lipid kinázové domény a C-konce (residua 2082-2386), kde se za podstatnou homologii pokládá minimálně 80%, nebo lépe alespoň 90% homologie (identita) v úseku 50 aminokyselin.

44 • 4 4 · · · • 444 4 • 4

444« ··

	4 44 4	«4	4·
9 ·	•	« ·	4 4
• ·	4	4 *	• 4
4 4	• 4	*44	44 4
4 4 4 4	•	•
44	44	44	• 4

C. Vektory

Polynukleotidy vynálezu mohou být včleněny do rekombinačních vektorů schopných replikovat se. Vektor se může použít pro replikaci nukleové kyseliny v kompatibilní hostitelské buňce. Vynález proto také poskytuje metodu pro tvorbu polynukleotidů vynálezu včleněním polynukleotidu vynálezu do replikačního vektoru, vpravením vektoru do kompatibilní hostitelské buňky a pěstováním hostitelské buňky za podmínek, které vyvolají replikaci vektoru. Vektor se může z hostitelských buněk znova získat. Vhodné hostitelské buňky jsou popsány dále v souvislosti s expresními vektory.

D. Expresní vektory

Je žádoucí, když polynukleotidy vynálezu ve vektoru jsou funkčně spojené (operably linked) s řídící sekvencí, která je shopná zajistit expresi kódující sekvence hostitelskou buňkou, tj. když vektor je expresním vektorem.

Termín „funkčně spojený se vztahuje k vzájemné pozici, kde jsou popsané složky v takovém vztahu, který umožňuje jejich zamýšlenou funkci. Řídící sekvence „funkčně spojená s kódující sekvencí je přiligována tak, že za podmínek vhodných pro řídící sekvenci dojde k expresi kódující sekvence.

Takovýmito vektory může být transformována výše popsaná vhodná hostitelská buňka s cílem exprimovat polypeptid vynálezu. Vynález tedy dále poskytuje postup pro přípravu polypeptidů podle vynálezu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky transformované nebo transfektované expresním vektorem jak je popsáno výše za podmínek, kdy dochází k expresi kódující sekvence vektora, která kóduje polypeptid a získání vytvořeného proteinu.

Vektory mohou být například plasmidy, virové nebo fágové vektory poskytnuté s počátkem replikace (origin of replication) a případně i promotorem pro expresi daných polynukleotidů a případně i regulátorem promotoru. Vektory mohou obsahovat jeden nebo více genů selekčních markérů například gen resistence na ampicilin v případě bakteriálních plasmidů nebo resistenci na neomycin v případě savčích vektorů. Vektory mohou být použity in vitro, například pro tvorbu • · • · · ·

RNA nebo použity k transfekci nebo transformaci hostitelských buněk. Vektor také může být upraven pro použiti in vivo, například v metodách využívaných při genové terapii.

Vynálezu dále poskytuje hostitelské buňky transformované nebo transfekované vektory pro replikaci a expresi polynukleotidů vynálezu. Buňky budou vybrány tak, aby byly kompatibilní s daným vektorem a mohou to být například buňky bakteriální, kvasniční, hmyzí nebo savčí.

Polynukleotidy vynálezu mohou být také včleněny do výše popsaných vektorů v opačném (antisense) směru s cílem získat antisense RNA. Antisense RNA nebo jiné „antisense polynukleotidy mohou být také připraveny synteticky. Takovéto antisense nukleotidy se mohou využít pro řízení hladiny ATR nebo jeho variant nebo druhových homologů.

Promotory a ostatní expresní regulační signály mohou být vybrány tak, aby byly slučitelné s hostitelskou buňkou, pro kterou byl expresní vektor navržen. Například kvasniční promotory zahrnují S. cerevisiae GAL4 a ADH promotory, S pombe nmtl a adh promotory. Savčí promotory zahrnují methalothioneinový promotor (metallothionein promotér), který reaguje na ionty těžkých kovů, například kadmia. Virové promotory jako např. „SV40 large T antigen promotor nebo promotory adenovirů mohou být také použity. Všechny tyto promotory jsou snadno dostupné.

E: Protilátky

Vynález také poskytuje monoklonální nebo polyklonální protilátky proti polypeptidům vynálezu nebo jejich fragmentům. Vynález také popisuje proces pro produkci monoklonálních nebo polyklonálních protilátek proti polypeptidům vynálezu. Monoklonální protilátky mohou být připraveny konvenčni hybridomovou technologií s využitím polypeptidu vynálezu nebo jejich polypeptidových fragmentů jako imunogenů. Polyklonální protilátky mohou být také připraveny konvenčními způsoby, které zahrnuji imunizaci hostitelského zvířete (například krysy nebo králíka) polynukleotidy vynálezu nebo jeich peptidovými fragmenty a získání imunního séra.

♦ · ·· • ·

·· · · · ·

Aby mohly být takovéto protilátky připraveny poskytuje vynález polypeptidy vynálezu nebo jejich fragmenty připojené (haptenised to) k jinému polypeptidu. Takovéto komplexy jsou použity jako imunogeny u savců nebo lidi.

Preferované protilátky vynálezu jsou schopné selektivní vazby proteinu lidského ATR, to jest s afinitou nejméně lOx ale lépe alespoň lOOx větší než s rad3 proteinem. Takovéto protilátky mohou být získány rutinními experimenty např. výběrem oblastí proteinu ATR se sekvencemi odlišnými od odpovídajících oblastí rad3, přípravou peptidů obsahujících takovéto sekvence a použitím takovýchto peptidů jako imunogenů. Po produkci daných protilátek se ověří jejich vazebné vlastnosti. Preferované protilátky vynálezu zahrnují ty, které mají schopnost selektivní vazby na lipid kinázovou doménu (definovanou výše) lidského ATR proteinu. Navíc protilátky, které jsou schopné vazby lidské a kvasniční (S. porube) lipid kinázové domény s podobnou afinitou ale ne k doménám ATM rodiny proteinů, pak představují další stránku vynálezu. Takovéto protilátky mohou být připraveny proti peptidům z lipid kinázové domény, která odpovídá oblastem, které byly shledány shodnými nebo podstatně shodnými v lidských a kvasničních genech.

Pro účely tohoto vynálezu termín „protilátka, pokud není uvedeno jinak, zahrnuje fragmenty celých protilátek, které si zachovávají svojí vazebnou aktivitu k cílovému tumorovému antigenu. Takovéto fragmenty zahrnují Fv, F(ab') a F(ab)₂ fragmenty a také jedno-řetězcové protilátky. Kromě toho protilátky a jejich fragmenty mohou být polidštěné protilátky (humanised antibodies) jak je to popsáno, v EP-A-239400.

Protilátky mohou být použity v metodách detekce polypeptidů vynálezu přítomných v biologických vzorcích metodami, které zahrnují:

a) přípravu protilátek vynálezu

b) inkubaci biologického vzorku s danou protilátkou za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu protilátka-antigen; a

c) určení, jestli došlo k tvorbě komplexu antigen-protilátka s danou protilátkou • ♦ • · · ♦

Mezi vhodné vzorky patří extrakty z dělicích se buněk, např. leukocytů nebo rakovinných buňek, zahrnující leukemické buňky a pevné nádory, jako například tumory prsu, vaječníků, plic, tračníku pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kosti.

Protilátky vynálezu mohou být navázány na pevný povrch a/nebo připraveny ve formě soupravy ve vhodném obalu společně s příslušnými činidly, kontrolami, instrukcemi atd.

F. Zkoušky

Potenciální strategií pro návrh a vývoj léčiv pro protirakovinnou léčbu je narušeni kontrolních bodů buněčného cyklu, ať už by se jednalo o nový postup nebo v kombinované terapii s cílem zvýšit specifickou toxicitu současných chemoteraeutických látek. Například alkylačni látky (např. nitrogen mustard) se používají jako chemoterapeutické látky, které poškodí DNA v rychle se dělících buňkách, což vede k smrti buňky. Toxicita takovéto látky může být snížena mechanismy opravujícími DNA a cestami kontrolních bodů. Narušení takovýchto mechanismů zvýši tedy účinnost terapeutických sloučenin navržených pro poškození DNA. Narušení ATR kontrolních bodů bude zejména užitečné tehdy, když tumorové buňky již ztratily ostatní kontrolní body nebo na poškozeni reagující geny, protože tyto ostatní geny můžou být schopné doplnit ztrátu funkce ATR v netumorových buňkách, což vede k dalšímu zvýšení účinnosti chemoterapeutických látek.

Cílem při vývoji proti rakovinných sloučenin je lipid kinázová aktivita ATR, protože výsledky prezentované v následujících příkladech naznačují, že kinázová doména je nezbytná pro funkci ATR. Předkládaný vynález tedy poskytuje testovací metodu pro zjišťování možných látek pro proti-rakovinovou léčbu, která zahrnuje:

a) přípravu polypeptidů vynálezu, který neztratil lipid kinázovou aktivitu a substrátu pro danou kinázu za podmínek a s takovými reagenciemi, za kterých bude kinázová aktivita působit na substrát

b) smíchání daného polypeptidů a substrátu s testovanou látkou

c) měření stupně poklesu kinázové aktivity daného polypeptidů a

d) výběr vhodné látky, která snižuje aktivitu

·· ··

Test může být proveden in-vitro, například v jamkách mikrotitrační desky. Takovýto formát může být snadno adaptován pro automatizaci, která umožňuje testování velkého množství potenciálních substancí.

Substrátem může být protein nebo lipidový substrát přírodního nebo syntetického původu, na který bude působit polypeptid vynálezu. Polypeptid vynálezu bude substrát obvykle fosforylovat.

Odborníci si mohou vybrat jakýkoliv vhodný formát výkonných testů. Typicky polypeptid vynálezu, který vykazuje lipid kinázovou aktivitu se zachytí k pevnému povrchu za přítomnosti substrátu a buněčných a dalších komponent, které jsou většinou nezbytné pro aktivitu. Značený fosfát a testovaná látka se přidají do směsi současně nebo po sobě v obojím pořadí. Po uplynutí příslušné reakční doby (většinou několik minut, ale v každém případě dostatečně dlouho pro to, aby došlo k fosforylaci substrátu za nepřítomnosti testované látky) se stanoví množství volného fosfátu, např. precipitací fosfátu. Testovaná látka, která inhibuje kinázovou aktivitu bude inhibovat inkorporaci volného fosfátu do substrátu a tak když je nalezen volný fosfát, naznačuje to přítomnost inhibice.

Odborníci můžou využít i jiné metody.

Testované látky můžou být při počátečním testování navzájem seskupené, takže je možné v jedné reakci otestovat třeba 10 vzorků a v případě pozitivního výsledku provést individuální testování.

Vhodné látky pro testování zahrnují peptidy, zejména o velikosti 5-20 aminokyselin, založené na sekvenci kinázové domény nebo variantách tohoto peptidů, kde je nahrazeno jedno nebo více residuí tak, jak je popsáno výše. Mohou být použity peptidy ze skupiny peptidů s náhodnými sekvencemi nebo sekvencemi, které byly upraveny v souladu s cílem získat maximálně rozsáhlý soubor peptidů. Další možné látky zahrnují inhibitory kináz, což jsou malé molekuly jako cyklosporinům a staurosporinům příbuzné látky (Cyklosporin-like and stauroporin-like compounds), nebo další komerčně dostupné látky ze skupiny malých molekul inhibitorů.

Testované látky, které vykazují aktivitu v in vitro pokusech popsaných výše mohou být následně testované v systémech in vivo,

• 9	9 9	9 ·	9999 9	• 9 9 9	9 W • ·
• « •	9 · 9 9	• · • ·	• •	9 9 9 ·♦·	9 · • · ·
• 9 9999	9 99 9 99	• · * • · • 9	• · • ·	• • ·	9 • ·

jako například v kvasničních nebo savčích buňkách, které se vystaví působení inhibitorů a testují na aktivitu kontrolních bodů.

Ukazali jsme také, že Rad3 vykazuje protein kinázovou aktivitu. Cílové substráty Rad3 protein kinázové aktivity se můžou zjistit zahrnutím testovaných sloučenin do testů na kinázovou aktivitu. Rad3 protein je resuspendován v kinázovém pufru a inkubován buď za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky (např. kasein, histon H1 nebo příslušný substrátový peptid). Přenesené množství (v molech) fosfátu kinázami se zjišťuje autoradiografií nebo scintilačně. Přenos fosfátu na testovanou látku svědčí o tom, že testovaná látka je kinázou.

Látky pozměňující Rad3/ATR lipid kinázovou nebo Rad3 protein kinázovou aktivitu se můžou zjišťovat inkubací testované látky a

Rad3/ATR získaného imunitní purifikací z buněk přirozeně produkujících Rad3/ATR s Rad3/ATR získaným z rekombinantních prokaryontních nebo eukaryontních buněk produkujících enzym nebo s purifikovaným Rad3/ATR a určením vlivu testované látky na aktivitu Rad3/ATR. Aktivita Rad3/ATR lipid kinázové nebo Rad3 protein kinázové domény může být měřena určením množství (v molech) ³²P-fosfátu přeneseného kinázami z gama-³²P-ATP na sebe samu (autofosforylace) nebo na vnější substrát, jako např. lipid nebo protein. Množství fosfátu včleněného do substrátu se měří scintilačně nebo autoradiografií. Zvýšení množství přeneseného fosfátu (počtu molů) na substrát v přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím přeneseného fosfátu (počtu molů) bez testované látky ukazuje, že testovaná látky působí jako aktivátor dané kinázové aktivity. A opačně snížení množství přeneseného fosfátu (počtu molů) na substrát v přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím přeneseného fosfátu (počtu molů) bez testované látky ukazuje, že testovaná látka působí jako inhibitor dané kinázové aktivity.

V testu, který je nyní preferován, je protilátka proti Rad3/ATR připojená k agarosovému nosiči (agarose beads) inkubována s buněčným lyzátem připraveným z hostitelských buněk produkujících Rad3/ATR. Nosič se pak opláchne (aby se odstranily na nosič nespecificky

• . · · • - · · · · « * · · · · navázané proteiny) a nosič je potom resuspendován v kinázovém pufru (např. 25 mM K-HEPES pH 7.7, 50 mM chlorid draselný, 10 mM chlorid hořečnatý, 0.1% Nonidet-P-40, 20% glycerol , ImM DTT). Přidáním 100 μΜ gama-³²P-ATP (4 pCi/mM) a exogenního substrátu (např. lipidu nebo peptidu) se iniciuje reakce, která probíhá při 30 °C po dobu 10 minut. Aktivita kínázy je měřena určením množství (v molech) ³²Pfosfátu přeneseného buď na vlastní kinázu nebo na přidaný substrát. V preferovaném případě hostitelské buňky postrádají vnitřní Rad3/ATR aktivitu. Selektivita látky, která upravuje lipid kinázovou aktivitu Rad3/ATR, může být stanovena porovnáním aktivity na Rad3/ATR s její aktivitou na např. jiných známých fosfatidylinositol-3 (PI-3) příbuzných kinázách. Kombinace rekombinantních Rad3/ATR produktů vynálezu s jinými rekombinantními PI-3 příbuznými kinázovými produkty v řadě nezávislých pokusů poskytne systém pro vývoj selektivních modulátorů Rad3/ATR kinázové aktivity. Podobně, selektivita sloučeniny, která moduluje protein kinázovou aktivitu Rad3, může být určena ve vztahu k jiným proteinovým kinázám, např. DNA dependentním protein kinázám nebo ATM.

Důkaz, že rad mutant rad.D2249E (viz příklady) může působit jako dominantní negativní mutant navíc naznačuje účast v jednom nebo více proteinových komplexech, a takovéto komplex samy o sobě mohou být cílem pro terapeutické působení. Ukázali jsme, že např. že Rad3 se může jednak spojit sám se sebou nebo spojit s ATR. Je tedy pravděpodobné, že Rad/ATR působí jako multimerní (multimeric) molekuly. Mutantní kvasniční rad nebo lidské ATR geny nebo jejich odvozeniny (které také postrádají rad/ATR aktivitu) mohou být včleněny do buňky, aby působily jako dominantní negativní mutanty. Jestliže tedy například exprese dominantního negativního mutantu (např. ATR D2475A, N2480K nebo D2494E) v tumorových buňkách vede ke zvýšené citlivosti k ozáření, ukazuje to, že přírodní ATR je stále aktivní a tedy cílem pro terapeutické látky.

Vzájemně se ovlivňující proteiny včetně komponenet multimerních proteinových komplexů zahrnujících Rad3 nebo ATR mohou být identifikovány v následujících experimentech.

První rozbor uvažovaný ve vynálezu je dvouhybridní test.

Dvouhybridní systém byl vyvinut pro kvasnice (Chien et al., 1991) a • · »♦ je založen na funkční in vivo rekonstituci traskripčního faktoru, který aktivuje reportérovy gen. Konkrétně polynukleotid kódující protein, který vzájemně reaguje s Rad3/ATR je izolován:

- transformací nebo transfekcí vhodné hostitelské buňky konstruktem DNA, který obsahuje reporterový gen řízený promotorem regulovným transkripčním faktorem s DNA vazebnou doménou a aktivující doménou

- expresí první hybridní DNA sekvence v hostitelské buňce kódující první syntézu (fusion) části nebo celého Rad3/ATR a buď DNA vazebné oblasti nebo aktivující oblasti transkripčního faktoru

- expresi knihovny (v hostitelské buňce) druhé hybridní DNA sekvence kódující druhou syntézu části nebo celého domnělého Rad3/ATR vazebného proteinu a DNA vazebnou doménu nebo aktivační doménu transkripčního faktoru, který není inkoroporován v první syntéze

- detekcí vazby proteinu reagujícího s Rad3/ATR k Rad3/ATR v dané hostitelské buňce detekcí produktu reporterového genu v hostitelské buňce

- izolací druhé hybridní DNA sekvence kódující interagující protein z dané hostitelské buňky

V současné době jsou při tomto postupu preferované: lexA promotor k řízení exprese reporterového genu, lacZ reporterový gen, transkripční faktor obsahující lexA DNA vazebnou oblast a GAL4 transaktivační doménu a kvasniční hostitelské buňky.

Další testy pro identifikaci proteinů, které reagují s Rad3 nebo ATR, mohou zahrnovat imobilizaci Rad3/ATR nebo testovaného proteinu, detekční značení nepřichyceného vazebného partnera, společnou inkubaci vazebných partnerů a určení množství navázané značky. Navázaná značka naznačuje, že testovaný protein reaguje s Rad3/ATR.

Jiný typ testu pro identifikaci proteinů reagujících s Rad3 nebo

ATR může zahrnovat imobilizaci Rad3/ATR nebo jejich fragmentu na pevný povrch potažený (nebo nasycený) fluorescenční látkou, značení testovaného proteinu sloučeninou schopnou excitace fluorescenční látky, aplikaci značeného testovacího proteinu na imobilizovaný

Rad3/ATR, detekci světelné emise produkované fluorescenční látkou a identifikaci vzájemně reagujících proteinů jako testovaných proteinů, které vyvolaly emisi světla fluorescenční látkou. Případně může být testovaný protein zmobilizovaný a v testu může být značený Rad3/ATR.

Sloučeniny, které mění vzájemné působení mezi Rad3/ATR a ostatními buněčnými komponenty mohou být použity při různých metodách léčení rakoviny. Jestliže například specifická forma rakoviny je výsledkem mutace jiného genu než genu ATR (např. p53 genu), látka, která inhibuje transkripci nebo enzymatickou aktivitu ATR a tedy kontrolní místo G₂ fáze buněčného cyklu, může být použita k zvýšení citlivosti rakovinových buněk k chemoterapii nebo ozařování. Terapeutická hodnota takovéto látky spočívá ve faktu, že současná radioterapie nebo chemoterapie nedělá ve většině případů nic pro překonání schopnosti p53 mutovaných rakovinných buněk opravit poškození DNA vyvolané jako výsledek léčby. Výsledkem je, že rakovinná buňka může jednoduše opravit poškození DNA. Modulující látky vynálezu mohou být tedy použity pro zesílení účinnosti chemoterapie a radioterapie, nebo se můžou použít přímo jako chemoterapeutika.

Testy pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují interakci Rad3/ATR s jinými proteiny můžou zahrnovat:

- transformaci nebo transfekci vhodných hostitelských buněk konstruktem DNA, který obsahuje reporterový gen řízený promotorem regulovaným transkripčním faktorem s DNA vazebnou doménou a aktivující doménou

- exprese první hybridní DNA sekvence v hostitelských buňkách kódující první syntézu (fusion) části nebo celého Rad3/ATR a buď DNA vazebné oblasti nebo aktivující oblasti transkripčního faktoru

- expresi druhé hybridní DNA sekvence v hostitelských buňkách kódující část nebo celý protein, který intereaguje s Rad3/ATR a buď DNA vazebnou oblast nebo aktivující oblast transkripčního faktoru, který není inkorporován v první syntéze

- vyhodnocení vlivu testované látky na interakci mezi Rad3/ATR a interagujícím proteinem detekcí vazby interagujícího proteinu k Rad3/ATR v dané hostitelské buňce měřením tvorby produktu reporterového genu v hostitelské buňce za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky a

- identifikaci modulujících sloučenin jako těch testovaných sloučenin, které ovlivňují tvorbu produktu reporterového genu v porovnání s tvorbou produktu reporterového genu za nepřítomnosti modulující látky.

V současné době jsou při tomto postupu preferované : lexA promotor k řízení exprese reporterového genu, lacZ reporterový gen, transkripční faktor obsahující lexA DNA vazebnou oblast a GAL4 transaktivační doménu a kvasniční hostitelské buňky.

Další typy testů pro identifikaci sloučenin, které mění interakci mezi Rad3/ATR a ovlivňujícím proteinem zahrnuje imobilizaci Rad3/ATR nebo přirozeného proteinu reagujícho s Rad3/ATR, detekční značení neimobilizovaného vazebného partnera, společnou inkubaci vazebných partnerů a určení vlivu testované látky na množství navázané značky. Snížení množství značky navázané za přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím navázané značky za nepřítomnosti testované látky ukazuje, že testovaná látka je inhibitorem interakce mezi Rad3/ATR a proteinem. Opačně, zvýšené množství navázané značky za přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím značky navázané za nepřítomnosti testované látky ukazuje, že testovaná látka je aktivátorem interakce mezi Rad3/ATR a proteinem.

Další metoda používaná vynálezem pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují vazbu mezi Rad3/ATR a interagujícím proteinem zahrnuje imobilizaci Rad3/ATR nebo jejich fragmentu na pevný povrch potažený (nebo nasycený) fluorescenční látkou, označení interagujícího proteinu sloučeninou schopnou excitace fluorescenční látky, inkubaci imobilizovaného Rad3/ATR se značeným interagujícím proteinem za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky, detekci světelné emise produkované fluorescenční látkou a identifikaci modulující sloučeniny jako té testované látky, která ovlivní emisi světla fluorescenční látkou v porovnání s emisí světla fluorescenční látkou za nepřítomnosti testované látky. Případně může být s Rad3/ATR interagující protein imobilizovaný a v testu může být značený Rad3/ATR.

Ukázali jsme, že Rad3 vzájemně reaguje s ATR. Proto výše zmíněné metody mohou být také použity k identifikaci látek, které ovlivňují

··	• 9	• ·		• · • ·	·· • ·
• ·	• ·	• ·	φ	• ·	• ·
	• ·	• ·	•	• ···	• · ·
• • ····	♦ ·· • • ·	• · · • · ··	• · ♦ ·	• ··	• ♦ ♦

interakci mezi Rad3 a ATR, kde interagující protein popsaný v testovacích metodách je buď Rad3 nebo ATR.

» Dále jsme ukázali, že Rad3 se může vázat mezi sebou, což by velmi pravděpodobně naznačovalo, že také ATR se mezi sebou může * vázat. Proto výše zmíněné metody mohou být také použity.

k identifikaci látek, které ovlivňují interakci mezi Rad3-Rad3 a také interakce ATR-ATR.

Takovéto látky mohou být použity terapeuticky k rozrušení ATR, ATR interakcí a zvýšení citlivosti tumorových buněk k chemoterapii a/nebo radioterapii. Vynález tedy poskytuje také metodu pro . vyhledávání vhodných substancí pro proti-rakovinovou terapii, která zahrnuje:

a) (i) inkubaci polypeptidů vynálezu s jiným polypeptidem vynálezu (který může být ten samý nebo jiný) za podmínek, které umožňují navázání prvního polypeptidů na druhý a tvorbu komplexu (ii) inkubaci tohoto komplexu a testované látky nebo

a) inkubaci polypeptidů vynálezu s jiným polypeptidem vynálezu (který může být ten samý nebo jiný) za podmínek, které umožní navázání prvního polypeptidů na druhý a tvorbu komplexu za přítomnosti testované látky a

b) určeni, jestli testovaná látka inhibuje vazbu prvního polypeptidů na druhý polypeptid a

c) výběr vhodné substance, která inhibuje vazbu prvního polypeptidů na druhý polypeptid

Je-li to možné, první a druhý polypeptid by měly být navzájem rozlišené. Například první polypeptid a druhý polypeptid mohou být oba ATR, nebo oba Rad3, nebo jeden může být ATR a jeden Rad3, nebo odvozeniny buď ATR nebo Rad3, které si uchovaly vazebnou aktivitu. Když jsou oba polypeptidy ATR nebo Rad3, měly by být v těchto testech použity pokud možno odlišitelné formy ATR/Rad3. Odlišeny můžou být například značením jednoho z polypeptidů. Jako značka se může použít radioaktivní značka, epitopové nebo jiná polypeptidové značky (tags), jako například glutation-S-transferáza (glutation-Stransferase). Například jedna forma Rad3 může mít jeden typ ·· ··

• φ • · · • · · » · φ · φ · · · φφφ · · · epitopové značky a druhá forma by pak měla jiný typ, což by umožňovalo jejich imunologické rozlišeni, takže navázání jednoho z nich k druhému může být zjištěné kvantitativně nebo kvalitativně. Preferovaná metoda zahrnuje imobilizaci prvního polypeptidu například na agarosový nosič (agarose beads) nebo na pevný povrch a druhý polypeptid může být volně v roztoku. Vazba je potom určena metodami popsanými výše, které jsou odborníkům známé.

Vynález se také týká protilátek (např. monoklonálních a polyklonálních protilátek, jednořetězcových protilátek, chimérické protilátky, CDR-štěpové protilátky (CDR-grafted antibodies) a podobně) a jiných vazebných proteinů (jako jsou například ty identifikované pomocí testů popsaných výše), které jsou specifické pro Rad3 protein kinázovou doménu nebo Rad3/ATR lipid kinázovou doménu. Vazebné proteiny jsou užitečné zase pro purifikaci rekombinantních nebo přirozeně se vyskytujících enzymů a identifikaci buněk produkujících takovéto enzymy. Testy pro detekci a kvantifikaci proteinů v buňkách a v tekutinách můžou zahrnovat systémy s jednou protilátkou nebo více protilátkami v „sendvičovém formátu. Vazebné proteiny jsou také zřejmě účinné v ovlivňování (např. blokování, inhibice nebo stimulace) interakcí enzym/substrát nebo enzym/regulátor.

Modulátory Rad3/ATR můžou mít vliv na kinázovou aktivitu, její lokalizaci v buňkách a/nebo jejich interakci s členy kontrolních míst buněčného cyklu. Mezi selektivní modulátory můžou patřit například polypeptidy nebo peptidy, které se specificky váží k Rad3/ATR nebo nukleové kyselině Rad3/ATR a/nebo jiné nepeptidové sloučeniny (např. izolované nebo syntetické organické molekuly), které specificky reagují s Rad3/ATR nebo nukleovou kyslinou Rad3/ATR. Mutantní formy Rad3/ATR, které ovlivňují enzymatickou aktivitu nebo buněčnou lokalizaci nemutovaného Rad3/ATR, jsou také uvažovány v tomto vynálezu.

Kromě toho jako modulátory Rad3/ATR kinázové aktivity a Rad3/ATR interakcí můžou být testovány kombinační knihovny (combinatorial libraries), peptidy a kopie peptidů, definované chemické entity, oligonukleotidy, knihovny přírodních produktů (natural product libraries) s pomocí výše popsaných testů.

• · · ·	• 9	····	·· • ·	• · • ·
• · · ·	• ·	φ *	• ·	• ·
• · ·	• ·	φ	• · · ·	W · ·
• ♦·· • · ··♦· ··	* « · 4 · ··	• · ··	• • ·	• • ·

F. Terapeutické použiti

Modulátory aktivity Rad3/ATR, včetně inhibitorů jejich lipid kinázové a protein kinázové aktivity, mohou být použity při protinádorové terapii. Zvláště mohou být tyto látky použity ke zvýšení citlivosti rakovinových buněk k chemoterapii a/nebo radioterapii na základě jejich schopnosti narušit regulační funkce Rad3/ATR v buněčném cyklu.

Vynález tedy zajišťuje použití sloučenin, které mění aktivitu Rad3/ATR a které jsou identifikovány na základě vyhledávacích pokusů popsaných výše, v metodách léčby rakoviny. V jednom případě jsou zmíněné látky schopné inhibice rad3/ATR lipid kinázové aktivity a/nebo Rad3 protein kinázové aktivity. V jiném případě jsou zmíněné látky schopné inhibovat interakci mezi samotným ATR a/nebo mezi ATR a jiným interagujícím proteinem, který může například tvořit část multimérního proteinového komplexu.

Je nutné uvědomit si, že termínem „sloučenina” jsou v tomto kontextu myšleny také látky, které byly vybrány výše popsanými testy.

V typickém případě jsou sloučeniny upraveny pro klinickou aplikaci jejich smísením s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem. Vyvinuta mohou být například pro místní, mimostřevní (parenteral), intravenosní, nitrosvalový, podkožní, intraokulární nebo transdermální aplikaci. Přednostně je sloučenina používána ve formě vhodné pro injekční aplikaci. Je vhodná přímá injekce do pacientova tumoru, protože tak je možné koncentrovat terapeutický efekt na úrovni postižené tkáně. Sloučeniny proto mohou být kombinovány s jakýmkoliv nosičem, který je farmakologický akceptovatelný pro injekovatelnou formu, přednostně pro přímou injekci na místo ošetření. Farmaceutickým nosičem nebo ředící látkou mohou být například sterilní nebo isotonické roztoky.

Výše dávky sloučeniny může být upravena podle různých parametrů, zvláště podle použité sloučeniny, podle věku, váhy a stavu ošetřovaného pacienta, podle použitého způsobu aplikace, patologičnosti tumoru a požadovaného klinického režimu. Jako vodítko lze říci, že množství sloučeniny, použité k aplikaci injekčně je

9·	99	99	9999 •	·· • 9	• · ♦ ·
• 9	9 ·	9 9	•	9 ·	• ·
9	9 9	9 ·	•	• 9 9 ·	···
9 9 9999	999 9 9 9	9 9 · • 9 99	• · • ·	• ··	•

přiměřené v dávce od 0,01 mg/kg do 30 mg/kg, přednostně pak od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg.

Popsané stanovení způsobu aplikace a velikosti dávky je zamýšleno pouze jako vodítko, jelikož zručný praktik bude schopen stanovit snadno optimální způsob aplikace a dávku pro jakéhokoliv jednotlivého pacienta a jeho stav.

Aplikované sloučeniny mohou zahrnovat polypeptidy nebo nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny mohou kódovat polypeptidy nebo mohou kódovat „antisense konstrukty, které inhibují expresi buněčných genů. Nukleové kyseliny mohou být například aplikovány lipofekcí (lipofection) nebo pomocí virových vektorů. Nukleová kyselina může tvořit například část virového vektoru jako je adenovirus. Pokud jsou použity virové vektory, je aplikovaná velikost dávky v zásadě mezi 10'* a 10¹⁴ pfu/ml, přednostně 10⁶ až 10^lů pfu/ml. Termín pfu (z anglického plaque forming unit) odpovídá infekčnosti roztoku viru a je stanoven infekcí vhodné buněčné kultury a měřením (obecně po 48 hodinách) počtu skvrn infekčních buněk. Postupy pro stanovení titru pfu virového roztoku jsou dobře popsány v literatuře.

Těmito metodami může být ošetřen jakýkoliv typ rakoviny, například leukémie nebo pevné nádory jako jsou nádory prsu, vaječníků, plic, tračníku, pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kostí. Přednostně pak nádorů, které mají normální funkci ATR.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. l:Vztah mezi ATR, rad3, mei-41, MEČI, TELÍ a ATM

Celkové struktury ATR, Rad3, Mei-41, Meclp, Tellp a ATM.

Legenda: otevřený čtvereček - doména Rad3, šrafovaná políčka kinázová doména

Dendrogram založený na porovnání sekvencí (sequence alignments) vytvořený metodou Clustal (PAM250) s použitím softwaru DNAstar.

Rad3/ESRl/mei-41/ATR jsou si vzájemně bližší než vůči ATM a TELÍ.

Sekvence rad3 a ATM jsou dostupné v databázi EMBL.

00	• 0	00
9 9	• ·	• 0
•	0 0	• ·
•	• 00	0 0 0
•	0	0 0
000 ·	0 0	99

• * · ♦	00	0 9
0	• 0	9 9
•	0 0	0 0
0	• t>0	0 0 0
• 9	0	•
9 0	00	0 0

Příklady provedeni vynálezu

Přikladl

Gen rad3 S. pombe je jeden ze šesti genů absolutně nezbytných pro strukturu kontrolních bodů (for the DNA structure checkpoints) u S.pombe (Al-Khodairy and Carr, 1992; Al-Khodairy et al., 1994). Sekvence reprezentující část genu rad3 byla popsána Seatonem et al. (1992). Při pokusech objasnit strukturu tohoto genu z hlediska intronů a exonů jsme zjistili sekvenční anomálie na obou (5' a 3') koncích. Sekvenovali jsme celý gen (viz experimentální postupy) a zjistili, že rad3 je schopný kódovat produkt dlouhý 2386 aminokyselin. C-koncová oblast obsahuje shodné sekvence (consensus sequences), typické pro podtřídu kináz známých jako lipidové kinázy, skupiny, jejíž zákládající člen (founder member) je pllO katalytická podjednotka PI3 kinázy (Hiles et al., 1992).

Bylo popsáno, že zkrácený klon rad3, postrádající amino-konec a kinázovou oblast, doplňuje (complement) genově narušený mutant rad3 - mutant rad3: :pR3Hl. 0 (Jimenez et al., 1992). Takovýto poškozený mutant neodstraňuje potenciální kinázovou doménu. K objasnění role této domény jsme vytvořili neúčinného mutanta metodou záměny genu. Tento mutant má aminokyseliny 1477-2271 rad3 včetně shodné kinázové domény nahrazeny ura4⁺. Tento kmen rad3.d má identické defekty kontrolního místa a citlivost k ozáření a hydroxymočovině jako mutant rad3.136 (Našim and Smmith, 1992) a také jako původní mutant rad3: :pR3Hl. 0 (Jimenez at al., 1992; Seaton et al., 1992) (data nejsou uvedena). Vytvořili jsme tři samostatné bodové mutanty s mutacemi v předpokládané kinázové doméně rad3 a tyto mutanty jsme použili při experimentech se záměnou genů ke konstrukci kmenů s definovanými kinázovými neúčinnými (null) mutacemi. Všechny tři kmeny rad3.D2230A, rad3. N2235K a rad3.D2249E mají identické fenotypy jako neúčinný mutant rad3.d (data nejsou uvedena), což naznačuje, že je kinázová aktivita potřebná k funkci Rad3. Ve světle našich zjištění se nabízí jedno z vysvětlení výsledků Seatona et al. (1992) a Jimeneze et al. (1992) a to, že částečný klon může vykazovat intragenní komplementaci mezi zkráceným genem vytvořeným v plazmidu a částečnou genomickou delecí, která zachovává kinázovou funkci.

»· ·· ·»»* • · · ··

Takováto interpretace by byla v souladu s tím, že Rad3 působí jako dimer nebo multimer.

Jestliže byla neúčinná kinázová alela rad3.D2249E lehce „přeexprimována v divokých typech buněk pod řízením modifikovaného promotoru nmtl (Maundrell, 1990), způsobilo to extrémní citlivost k ozáření, což bylo prokázáno proužkovým UV testem a působila jako dominantně negativní mutant (data nejsou uvedena). Jestliže byl stejný kinázový neúčinný konstrukt exprimován ve vyšších hladinách, inhiboval růst (data nejsou uvedena). Prohlídka buněk naznačila, že dělení probíhalo velmi pomalu a u menších buněk. Divoký typ buněk a buňky obsahující prázdný vektor se dělí při velikosti přibližně 15 mikronů, kdežto buňky s vyšší expresi rad3 a rad3.D2249E se děli při velikosti přibližně 11,2 mikronů (data nejsou uvedena). U S. pombe znamená toto většinou zrychlení mitózy.

Lidský homolog rad3 - ATR

K identifikaci lidské formy rad3 byla použita kombinace metod.

Těmito metodami jsme nakloňovali celou kódující oblast lidského genu (viz materiál a metody), který jsme nazvali ATR (z anglického ataxia and rad related). ATR kóduje protein skládající se z 2644 aminokyselin, který je o mnoho bližší produktu rad3 S.pombe, ESR1 S. cerevisiae (Kato and Ogawa, 1994) a genům mei-41 D.melanogaster (Hari et al., 1995) než lidskému proteinu ATM nebo proteinu Telí S.cerevisiae (Savitsky et al., 1995; Greenwell et al., 1995) a je pravděpodobné, že je to skutečný homolog rad3. ESR1 je alelický k mecl/sad3 mutantům kontrolních bodů (Allen et al., 1994; Weinert et al., 1994), které mají ekvivalentní fenotyp jako rad3. ATR je méně příbuzný lidskému genu kontrolního bodu ATM, obsahujícímu na C konci pravděpodobně lipid kinázovou doménu a mající podobnou celkovou strukturu. Sekvenční porovnání jasně ukázala, že geny rad3/ESRl (MEC1/SAD3)/mei-41/ATR jsou si vzájemně více příbuzné než jakýkoliv z nich s geny ATM či TELÍ, a že ATM je více homologní s TELÍ (Obr.l).

Gen ATM je exprimován v široké škále tkání (Savitsky et al., 1995). U S. cerevisiae vykazuje ESR1 v mitotických buňkách nízkou hladinu exprese, gen je však rychle indukován během meiózy I (Kato a

·· • ·	•	9 · • ·	·· • · • ·
• · • · ·	•	• *··	··· •
• · ♦ ·	• · *·	»·	·♦

Ogawa, 1994). S použitím Nothern blot analýz jsme ukázali, že ATR je také slabě exprimován v mnoha tkáních, ale že je daleko více exprimován ve varlatech (data nejsou uvedena). Jestliže platí, že proteiny ATR, Rad3 a Esrlp jsou si vzájemně více příbuzné než s proteinem ATM, pak vyšší exprese ATR ve varlatech je ve shodě s pozorováním, že Esrlp hraje roli při meiotické rekombinaci (Kato a Ogawa, 1994). S použitím FISCH a PCR analýzy jsme lokalizovali ATR na chromozomu 3q22 - 3q25 (data nejsou uvedena). Tento region není asociován se známými syndromy se sklony k rakovině.

Pro další výzkum možnosti, že Rad3 působí jako multimer jsme vytvořili dva odlišné konstrukty se značkou (tag) plné délkyu rad3 v inducibilním vektoru založeném na pREP. V prvním z nich probíhá translace Rad3 se dvěma myc epitopovými značkami na N konci, kdežto ve druhém případě jsou tyto nahrazeny trojnásobnou HA epitopovou značkou. Jestliže jsou oba konstrukty exprimovány najednou v divokém typu buněk, je možné společně vysrážet Rad3 s HA značkami protilátkami specifickými proti myc a Rad3 s myc značkami protilátkami specifickými proti HA (data nejsou uvedena). To dokazuje že protein Rad3 je schopen in vivo asociace se sebou samým. Tyto výsledky jsou plně ve shodě s komplementačními daty Jimeneze et al. (1992).

Ačkoliv gen ATR nemohl doplnit fenotyp mutantů rad3, zkoumali jsme schopnost ATR vytvářet proteinový komplex s Rad3 S.pombe, při expresi ATR a Rad3 S.pombe s myc značkou ve stejné kvasinkové buňce. S použitím protilátek proti ATR (které nesrážejí Rad3 S.pombe, viz materiál a metody) jsme byli schopni současně vysrážet kvasinkový protein. S pomoci specifických protilátek proti myc, které rozeznávají Rad3 S.pombe, jsme byli také schopni vysrážet lidský protein ATR (data nejsou uvedena). Tato data naznačují, že lidský a kvasinkový protein mohou tvořit heteromerni komplexy, což podporuje tvrzeni založená na sekvenční podobnosti o blízkém funkčním vztahu mezi těmito homology.

Rad3 proteiny vykazují také kinázovou aktivitu

Zdá se, že kinázová aktivita proteinů Rad3 in vivo je nepostradatelná pro jejich funkci, což naznačovali mutační experimenty. Tuto aktivitu jsme studovali detailněji. S použitím buněk S.pombe rad3:: ura4 exprimující S.pombe Rad3 s HA značkou jsme byli schopni detekovat významnou protein kinázovou aktivitu, která precipituje s HA specifickými protilátkymi pouze v případě, že je Rad3 indukován a která není změněna následným ozářením (data nejsou uvedena). Tato aktivita, která je specifická pro Rad3 či kinázy precipitující společně s Rad3, zřejmě odráží fosforylaci samotného Rad3, jelikož významný proužek o molekulové hmotnosti okolo 200 kD, který je fosforylován, může být detekován pomocí HA protilátek technikou western blotu (data nejsou uvedena). Pokusy identifikovat vhodné in vitro substráty, jako např. základní protein myelinu (myelin basic protein), RP-A či několik purifikovaných proteinů kontrolních míst S.pombe, byly doposud neúspěšné. Jestliže je IP test na detekci kinázy in vitro prováděn s buňkami zvýšeně exprimujícími kinázově neúčinnou (kinase-null) D2249E verzi Rad3, je spojená kinázová aktivita, která precipituje s HA specifickými protilátkymi, velmi snížena (data nejsou uvedena). Tento jev lze vysvětlit několika možnými způsoby. Měřená kinázová aktivita může odrážet přímo aktivitu Rad3. V tomto případě může zbytková aktivita pozorovaná i v případě nefunkčního Rad3 odrážet fakt, že nejsou neznámé případy, kdy ekvivalenty mutací D až E u jiných proteinových kináz produkovaly biologicky inertní proteiny se zbytkovou in vitro biochemickou aktivitou. Nebo může být kinázová aktivita, která fosforyluje Rad3 způsobena asociovanými proteiny a tyto proteiny mohou interagovat s D2249E mutantním proteinem s menši účinností.

Diskuze

Kontrolní místa drah kontrolujících postup buněčným cyklem, který následuje po poškození DNA nebo po zásahu v jednotlivých případech ze kterých se skládá buněčný cyklus, jsou značně důležité pro udržení genetické stability a mohou být považovány jako cesty, které potlačují vznik tumorů. Několik genů potlačujících vznik nádorů je těsně spjato s částí kontrolních cest (viz přehledná práce Hartwell a Kaštan, 1994). Jsou to zvláště ty, které ovlivňují přechod z fáze G1 do fáze S a jsou tedy plně odpovědné za buněčný cyklus. Sbližování dvou kvasničních modelových systémů v otázce ···· kontrolních míst jasně naznačuje, že geny podílející se na těchto cestách jsou konzervované. Naše práce rozšířila, tuto konzervaci na metazoické buňky a vysvětluje vztah mezi rad3. ESR1 (MEC1/SAD3), mei41 a ATM genem.

V této práci jsme ukázali, že bezchybná sekvence genu rad3 řadí jeho produkt do rodiny protein/lipid kináz vztahujících se k ATM. Zvýšená exprese u mutanta rad3 (kinázově defektního) v S. porube způsobí dominantně negativní fenotyp, což naznačuje, že Rad3 působí jako člen proteinového komplexu, jehož celistvost je nezbytná pro kontrolní funkci. To je v souladu se zjištěním, že všechny deleční mutanty radí, rad9, radl7, rad26 a husí mají fenotypy nerozeznatelné od rad3.d (Sheldrick a Carr, 1993). Neočekávaný je fakt, že na rozdíl od zbylých kontrolních rad genů, vysoká úroveň zvýšené exprese divokých či mutantních rad3 alel inhibuje buněčný růst a způsobuje, že dochází k mitóze buněk menší velikosti, což naznačuje předčasný vstup do mitozy. Tento drobný (semi wee) fenotyp není pozorován u neúčinných mutantů a může naznačovat interferenci s druhou cestou, jejíž funkce se překrývají s cestou Rad3 a působí inhibičně na mitozu. Kandidátem takové cesty je ATM/TEL1 cesta, u které byly ukázány některé překrývající se funkce s ESR1 (MEČI/SADÍ) cestou (Morrow et al., 1995).

Struktura ATM je nejvíce příbuzná struktuře proteinu Tellp, který se podílí na údržbě délky telomery (Greenwell et al., 1995), ačkoliv se též zdá, že se funkce ATM vztahuje k produktům Rad3/Esrlp/mei-41. Po prvním objevu genu ATM a zjištění jeho sekvenční příbuznosti k rad3/ESRl genům a k TELÍ, nebylo jasné, zdali se (jako je tomu v mnoha případech u kvasinek) gen duplikoval a oddělil v kvasinkách nebo zdali tyto dva kvasinkové proteiny popisují konzervované podrodiny těsně příbuzných genů. Důležitým objevem této práce je identifikace lidského genu ATR, který je úzce příbuzný genům rad3/ESRl/mei-41. To vymezuje dvě strukturně odlišné podrodiny protein/lipid kináz, vztahujících se ke kontrolním cestám, které jsou konzervovány v celé eukaryotické evoluci. Ačkoliv proteiny těchto dvou podrodin mohou mít některé vzájemně se překrývající funkce, kontrolují zřejmě rozdílné procesy. Tak například podrodina rad3 kontroluje v kvasinkách všechna poškození • ·

DNA v kontrolních bodech G1 a G2 a to jako odpověď na UV a radiační záření a dále také kontrolní bod S fáze, který zabraňuje mitóze následující po inhibici replikace (Al-Khodairy a Carr, 1992, Allen et al. , 1994, Weinert et al., 1994). Naproti tomu A-T buňky vykazují nenormální reakce na úzce specifickou skupinu látek poškozující DNA včetně ionizující radiace, bleomycinu a neocarzinostatinu. Tyto látky vyvolávají zlomy pramene DNA jako následek radikálního napadení. Reakce na UV a většinu chemických karcinogenů je normální, stejně jako reakce na inhibici syntézy DNA. Je možné, že některé či všechny zbývající kontrolní body poškození DNA a kontrolní body S fáze jsou kontrolovány ATR.

Experimentální postupy

Kmeny, plasmidy a media

V práci Gutz et al. (1974) jsou popsány standardní genetické techniky, růstové podmínky a media pro S.pombe. Kmeny spOll S.pombe (ura4.D18, leul.32, ade6.704 h) jsou popsány v práci Murray et al._t 1992. Plasmid pSUB41 byl dar S.Subramani (Seaton et al., 1992).

Klonování rad3 S.pombe

Fragment Kpnl dlouhý 4.0 kb byl oddělen od pSUB41 a sekvenován v obou směrech tak, aby byla získána 5'sekvence rad3. Klon 3' byl identifikován v genomové knihovně hybridizací kolon (Babet et al., 1992) s použitím 3' sondy dlouhé 1 kb odvozené od publikované sekvence rad3. Poté byl tento klon sekvenován v obou směrech. Tímto způsobem byla určena úplná sekvence genu rad3.

Null (nuloví) a kinase dead (kinázově mrtví) mutanti rad3

S použitím metodik popsaných v práci Barbet et al., (1992) byl vytvořen konstrukt rad3, v kterém bylo 794 aminokyselin mezi aminokyselinami 1477 a 2271 (zahrnující kinázovou doménu) nahrazeno genem ura4+. Lineární fragment tohoto konstruktu byl použit k transformaci spOll k uráčil prototropu (to uráčil prototropy).

Integrace jediné kopi na lokusu rad3 byla v takto vytvořeném kontrolována Southernovým přenosem. K vytvoření místně (site)

Λ · · ··· specifických kinázových null mutaci byl BamHI-SalI fragment rad3 dlouhý 3,01 kb na C konci mutován: A:GTTTTCGCCATGGCGCGCTCCCAAACCCAA

B: TTCATCAAACAATATCTTTTCGCCATGGCG

C: CAAAAAGACAGTTGAATTCGACATGGATAG s cílem vložit do kinasové domény mutace D2230A, N2235K nebo D2249E. Analogické změny byly již použity dříve při analýze PI3 kinázy VPS34 S.cerevisiae (Schu et al., 1993). Tyto fragmenty byly poté použity k tranformaci radf3.d null mutanta a nahrazení genu selektované jejich schopností růst na mediích obsahujících FOA (Grimm at al., 1988). Všechny linie byly kontrolovány Southernovým přenosem. Expresní konstrukty plné délky rad3.D2230A byly vytvořeny v pREPl a pREP41 (Maundrell, 1990) standardním subklonováním následujícím po vnesením Ndel místa na ATG a vyjmutí tří interních míst Ndel.

Proužkový test citlivosti k UV záření

Exprese z REP1 (vysoká) a REP41 (střední) byla indukována nedostatkem thiaminu po 18 hodin před nanesením na misky. Misky byly ozářeny snižujícími se dávkami UV záření od 0 do 300Jm'~ podle nastavení na Stratagene Stratalinker.

Klonování a exprese ATR

K izolaci vhodné sondy pro identifikaci cDNA korespondující s lidským homologem rad3 byly navrženy degenerované oligonukleotidy proti aminokyselinám LGLGDRH (5' oligo; 0DHI8) a HVDF[D/N]C (3' oligo; oDH-16) Rad3/Esrlp. Inosin byl inkorporován na pozice čtyřnásobné degenerace a primery byly zakončeny Baritil (0DHI8) a EcoRI (0DHI6) pro usnadnění klonování. Sekvenční analýza DNA produktu PCR dlouhého přibližně 100 bp, získaného amplifikací cDNA z periférních krevních leukocytů, ukázala významné shody s NEC/rad3. Tato sekvence byla použita k syntéze nedegenerovaného primeru (oDH23; GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCAAAGAG) pro PCR s dalším degenerovaným primerem (oDH17) navrženým proti aminokyselinové sekvenci KFPP[I/V][L/F]Y[Q/E]WF Rad3/Esrlp. 174 párů bází dlouhý produkt této reakce byl použit přímo k prozkoumání cDNA knihovny

Φ« · · · makrofága. Byly izolovány čtyři pozitivní klony (největší z nich byl cca 3 kb velký).

Souběžně byly prohledávány databáze pomocí genu rad3 S.pombe plné délky. Toto prohledávání získalo z databáze EMBL klon lidské cDNA - HSAAADPDG - potenciálního homologu rad.3 (jestliže byl povolen jeden posun čtecího rámce pro 233 bp sekvenci). Tato sekvence velká 233 bp je obsažena v klonu o velikosti 1,6 kb obdrženém od Dr.N.Affara, Human Molecular Genetics Group, Cambridge University, UK. Celý klon (1,6 kb) byl sekvenován a leží uvnitř cDNA klonů identifikovaných na základě degenerované PCR a zkoumání knihoven.

Pro identifikaci celého genu byla provedena RACE PCR s cDNA odvozené z placentální a thymové mRNA s použití instrukcí poskytovaných s Clontech Marathon Kit. Genově specifické markéry byly odvozené z cDNA klonů. Z těchto experimentů byla sestavena sekvence cDNA o velikosti 8239 bp s interními ORF (2644 aminokyselin), 79 bp 5' nekódující oblasti, 194 bp 3' nekódujícícm regionem a polyA' koncem. Část této sekvence byla stanovena pouze pomocí PCR. K vyloučení chyb byly sekvenovány klony z minimálně třech nezávislých PCR reakci v obou směrech.

233 párů bází dlouhá sekvence odpovídá sekvenci nukleotidů 6809 až 7042 (celkem 234 nukleotidů) Seq. ID No.l s výjimkou delece jedné báze na pozici 6942. Tato sekvence kóduje aminokyseliny 2244 až 2320 Seq.ID No.2

Sekvence 1,6 kb dlouhého inzertu koresponduje s nukleotidy 5725 až 7104 (celkem 1353 nukleotidů) Seq. ID No.l a kóduje aminokyseliny 1892 až 2340 Seq.ID No.2.

Nothern blot hybridizace: 1,3 kb produkt PCR byl amplifikován _t v přítomnosti ³²P-dCTP s použitím primerů 279-3 (TGGATGATGACAGCTGTGTC) a 279-6 (TGTAGTCGCCTGCTCAATGTC). Nylonová

- membrána obsahující 2 μς polyA⁺ RNA (frakcionované dle velikosti) z kolekce zdrojů lidských tkání (Clontech Laboratories) byla hybridizována podle doporučení výrobce s výjimkou posledního promytí, které bylo provedeno při 55°C (a ne při 50°C) k minimalizaci možnosti křížové hybridizace s podobnou sekvencí.

• · ·

Mapování ATR

Gen ATR jsme lokalizovali na chromozomu 3 kombinací metod založených na fluorescenční hybridizaci in šitu a polymerázové řetězové reakci (PCR). FISH analýza s použitím cDNA klonu identifikovala gen ATR na chromozom 3, přibližně na pozici q22-23. PCR analýza rovněž identifikovala gen ATR na chromozomu 3. Dva primery (oATR23: GACGCAGAATTCACCAGCTAAAGAATCAAAGAG a oATR26: TGGTTTCTGAGAACATTCCCTGA), které amplifikují fragment (257 bp) genu ATR, byly použity na DNA získané z hybridních somatických buněk (člověk/hlodavec) obsahujících různé skupiny lidských chromozomů dostupných v NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository (Drwinga et al., 1993). K sublokalizaci ATR na specifickou oblast chromozomu 3 bylo použito PCR se stejnými primery. Templaty pro tyto amplifikace představovaly vzorky DNA pacientů se zkráceními na chromozomu 3 (Leach et al., 1994).

Imunoprecipitace (IP) a stanovení kinasové aktivity s Rad3

Ke komplementačním studiím byly geny rad3 S.pombe a lidského ATR klonovány do expresního vektoru pREP41. K označení proteinů byly použity verze vektoru obsahující uvnitř rámce N-koncové tag sekvence - dvojitý myc nebo trojitý HA tag (Griffiths et al., 1995). Označené proteiny byly exprimovány pěstováním v růstových médiích neobsahujícíhc thiamin (Maundrell, 1990). Buňky kvasinek lysovaly v lysovacím pufru (25mM Tris.Cl pH 7,5, 60mM B-glycerofosfát, 0,lmM Na3VO4, 1% Triton X-100, 50mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF, lmM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 5gg/ml leupeptin, 5μg/ml aprotinin, 1 mM DTT) po přídavku skleněných kuliček a následné dvouminutové demembranaci. Při imunoprecipitaci bylo 300μg celkového proteinového extraktu inkubováno při 4°C s vhodnou protilátkou po 30 minut. Imunokomplexy se srážely po smíchání s kuličkami s navázaným proteinem G po dalších 30 minut při 4°C. Při stanovení kinázové aktivity byly imunokomplexy promyty čtyřikrát lysovacím pufrem a jednou kinázovým pufrem (25 mM Hepes pH 7,7, 50 mM KC1, 10 mM MgC12, 0,1% NP-40, 2% glycerol, 1 mM DTT). Poté byly inkubovány v kinázovém pufru s 10 μΜ ATP (50 Ci/mmol) po dobu • · · ♦ minut při 30°C. Reakce byla zastavena přídavkem 20 μΐ 2X SDS vzorkového pufru. Vzorky byly dále rozděleny na 6% polyakrylamidovém gelu. IP Rad3 obsahovaly několik fosforylovaných produktů, včetně jednoho, který postupoval společně se samotným proteinem Rad3 při westernové analýze.

Použitá literatura

Al-Khodairy, and Carr, A.M. (1992). DNA repair mutants defining G2 checkpoint pathways in Schizosaccharomyces pombe. EMBO J. 11, 1343-1350

Al-Khodairy, F., Fotou, E., Sheldrick, K.S., Griffiths, D.J.F., Lehmann, A.R. and Carr, A.M. (1994). Identification and characterization of new elements involved in checkpoints and feedback controls in fission yeast. Mol. Biol. Cell 5, 147 - 160

Allen, J.B., Zhou, Z., Siede, W., Friedberg, E.C. and Elledge, S.J. (1994). The SAD1/RAD53 protein kinase comtrols multiple checkpoints and DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev. 8 . , 2416 - 2428

Barbet, N.C., Muriel, W.J., and Carr, A.M. (1992) Versatile shuttle vetors and genomic libraries for ude with Schizosachaccharomyces pombe. Gene 144, 59 - 66

Beamish, H. and Lavin, M.F. (1994). Radiosensitivity in ataxia telangiectasia: anomailes in radíaton-induced cell cycle delay.

Int.J.Radiat, Biol. J. Radiat, Biol. 65, 175-184

Carr. A.M. and Hoekstra, M.F. (1995) The Cellular Responses to DNA Damage. Trends in Cell Biology 5, 32 - 40.

Chien et al., (1991) Proč. Nati. Acad Sci USA 88, 9578-9582

Deng, C., Zhang, P., Harper, J.W., Elledge, S.J. and Leder; P.J.

(1995) Mice lacking p21^CIP1/WAF1 undergo normál development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell, (in press).

Drwinga, H.L., Tojia, L.H., Kim, C.H., Greene, A.E., and

Mulovor, R.A. (1993). NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping

Panels 1 and 2. Genomics 16:311-314.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levý, D.B., Parson, R., Trent, J.M., Lin. D., Mercer, W.E., Kinzler, K.W, and Vogelstein, B. (1993) WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Cell 75, 817-825

Enoch, T., Carr, A.M. and Nurse, P. (1992). Fission yeast genes involved in coupling mitosis to completion of DNA-replication. Genes Dev. 6, 2035-2046.

Greenwell, P.W., Kronmal, S.L., Porter, S.E., Gassenhuber, J., Obermaier. B. and Petes, T.D. (1995) TEL 1, a gene involved in controlling telomere length in Saccharomyces cerevisiae, is homologous to the human ataxia telangiectasia (ATM) gene. Cell submitted

Grinmm, C., Kholi, J. Murray, J.M. and Maundrell, K. (1988) Genetic engineering of Schizosacharomyces porobe: a systém for gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable markér. Mol. Gen. Genet. 215_r 81-86.

Gutz, H., Heslot, H. Leupold, U. and Loprieno, N. (1974), In Handbook of Genetics, King R. C., Ed., Plenům Press, New York, Vol. 1, 395-446.

Hari, K.L., Santerre, A., Sekelsky, J.J., McKim, K.S., Boyd, J.B. and Hawley, RS. (1995) The mei-4 1 gene of Drosophila melanogaster is functionally homologous to the human ataxia telangiec

Harper, J.W., Adami, G., Wei, N., Keyomarsi, K. and Elledge, S.J. (1993) The 21 kD Cdk interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin dependent kinases. Cell 75, 805-816.

Hartwell, L.H., and Kaštan, M.B. (1994). Cell cycle control and Cancer. Science 266, 1821-1828.

Hiles, LD., Otsu, M., Yolinia, S., Fry, M.J., Gout, L, Dhand, R,

Panayotou, G., Ruin Larrea., F., Thompson, A., Totty, N.F., Hsuan,

J.J., Courtneidge, S.A., Parker, P.J. and Waterfield M.D. (1992)

Phosphatidylinositol 3’kinase: structure and expression of the HOkd catalytic subunit. Cell 70, 419-429.

Jimenez, G., Yucel, J., Rowley, R and Subramani S. (1992) 'The rad3+ gene of Schizosaccharomyces pombe is involved in multiple • to • · ♦ to to ···

• to

• toto to « to checkpoint functions and in DNA repair. Proč Nati. Acad. Sci. USA

87, 4952-4956

Kato, R. and Ogawa, H. (1994) An essential gene, ESR1, is required for mitotic cell growth, DNA repair and Meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 22, 3104-3112.

Lamb, J.R, Petit-Frere, C., Broughton, B.C., Leitrnann, A.R and Green, M.H.L. (1989) Inhibition of DNA replication by ionizing radiation is mediated by a trans acting factor. Int. J. Radiat. Biol. 56, 125-130.

Leach, R.I., Chině, R. , Reus, B.E., Hayes, S., Schantz, L., Dubois, B., Overhauser, J., Ballabio, A., Drabkín, H., Lewis, B.T., Mendgen, G., and Naylor, S.L. (1994) Regional Localisation of 188 Sequence Tagged Sites on a Somatic Cell Hybrid Mapping Panel for Human Chromosome 3 Genomics 24, 549-556

Maundrell, K. (1990). nmtl of fission yeast. A highly transcribed gene completely repressed by thiamine: J. Biol. Chem. 265. 10857-10864.

Morrow. D.M., Tagle. D.A., Shiloh, Y., Collins F.S. and Hieter. P. (1995) HAT1/TEL1, a Saccharomyces cerevisiae homologue of the human gene mutated in ataxia telangiectasia, is functionally related to the yeast checkpoint gene MEC1/ESR1. Cell submitted.

Murray, J.M., Doe, C. Schenk, P. Carr, A.M.. Lehmann, A.R and Watts, F.Z. (1992) Cloning and characterization of the S. pombe radl5 gene, a homologue to the S cerevisiae RAD3 and human ERCC2 genes Nucleic Acids Res. 20, 2673-2678

Našim, A. and Smith, B.P. (1975) Genetic control of radiation . sensitivity in Schizosaccharomyces pombe. Genetics 79, 573-582.

Painter, R_B. and Young, B.R ( 1980) Radiosensitivity in ataxia·. telangiectasia: A new explanation. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 77, 7315-7317

Rowley, R, Subratnani, S. and Young, P.G. ( 1992). Checkpoint controls in Schizosaccharomyces pornbe, radí. EMBO J. 11. 1335-1342.

Savitsky, K., Bar-Shim, A., Gilad, S., Rotman, G., Ziv, Y., Vanagaite L., Tagle, D.A., Smith, S., Uziel, T., Sfez, S., Ashkenazi, M., Pecker, I., Frydman, M., Harnik, R., Patanjali, S.R., ···· • ··: * í · ·..* ·»’ ·* • -- ·· .··· ··

Simmons, A., Clines, G.A., Sartiel, A., Gatti, R.A., Chessa, L., Sanal, O., Lavině, M.F., Jaspers, N.G.J., Taylor, M.R, Arlett, C.F., Miki, T., Weissman, S.M., Lovett, Μ., Collins, F.S. and Shiloh, Y. (1995). A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 286, 1749-1753.

Seaton, B.L., Yucel, J., Sunnerhagen P. and Subrannani, 5.

(1992). Isolation and characterisation of the Schizosaccharomyces pombe rad3 gene which is involved in the DNA damage and DNA synthesis checkpoints. Gene 119, 83-89.

Schu, P.V., Takegawa, K., Fry, M.J., Stack, J.H., Waterfield, M.D. and Emr. S.D. (1993) Phosphatidylinositol 3-kinase encoded by yeast VPS34 gene essential for protein sorting. Science 260, 88-91.

Sheldrick, K.S. and Carr. A.M. (1993). Feedback controls and G2 checkpoints, fission yeast as a model systém. BioEssays 15, 775-782.

Walworth, N., Davey, S, and Beach, D. (1993). Fission yeast chkl protein kinase links the rad checkpoint pathway to cdc2. Nátuře 363, 368-371.

Weinert, T.A., and Hartwell, L,H. (1988). The RAD9 gene controls the cell cycle response to DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Science 241, 317-322.

Weinert, T.A., Kiser, G.L. Hartwell, L.H. (1994). Mitotic checkpoint genes in budding yeast and the dependence of mitosis on DNA replication and repair. Genes Dev. 8, 652-665.

• ·

SEZNAM SEKVENCÍ <110> Carr, Antony M.

<120> Geny kontrolující buněčný cyklus <130> 27866/34132 <140> PCT/GB96/02197 <141> 1996-09-06 <150> GB 9518220.0 <151> 1995-09-06 <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 8239 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (80)..(8011) <400> 1 gcgctcttcc ggcagcggta cgtttggaga cgccgggaac ccgcgttggc gtggttgact 60 agtgcctcgc agcctcagc atg ggg gaa cat ggc ctg gag ctg gct tec atg 112 Met Gly Glu His Gly Leu Glu Leu Ala Ser Met 15 10

atc Ile

ccc gcc

ctg Leu 15

cgg Arg

gag ctg ggc agt

gcc aca

cca Pro

gag Glu

gaa Glu 25

tat Tyr

aat Asn

160

Pro

Ala

Glu

Leu Gly Ser 20

Ala

Thr

aca

gtt

gta

cag

aag

cca

aga

caa

att

ctg

tgt

caa

ttc

att

gac

cgg

208

Thr

Val

Val

Gin

Lys

Pro

Arg

Gin

Ile

Leu

Cys

Gin

Phe

Ile

Asp

Arg

30

35

40

ata

ctt

aca

gat

gta

aat

gtt

gtt

gct

gta

gaa

ctt

gta

aag

aaa

act

256

Ile

Leu

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Lys

Thr

45

50

55

gac

tet

cag

cca

acc

tcc

gtg

atg

ttg

ctt

gat

ttc

atc

cag

cat

atc

304

Asp

Ser

Gin

Pro

Thr

Ser

Val

Met

Leu

Leu

Asp

Phe

Ile

Gin

His

Ile

60

65

70

75

atg

aaa

tcc

tcc

cca

ctt

atg

tťt

gta

aat

gtg

agt

gga

age

cat

gag

352

Met

Lys

Ser

Ser

Pro

Leu

Met

Phe

Val

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

His

Glu

80

85

90

cgc

aaa

ggc

agt

tgt

att

gaa

ttc

agt

aat

tgg

atc

ata

acg

aga

ctt

400

Arg

Lys

Gly

Ser

Cys

Ile

Glu

Phe

Ser

Asn

Trp

Ile

Ile

Thr

Arg

Leu

95

100

105

• ·

ctg Leu

cgg Arg

att Ile 110

gca Ala

gca Ala

act Thr

CCC Pro

tcc Ser 115

tgt Cys

cat His

ttg Leu

tta Leu

cac His 120

aag Lys

aaa Lys

atc Ile

448

tgt

gaa

gtc

atc

tgt

tca

tta

tta

ttt

ctt

ttt

aaa

agc

aag

agt

cct

496

Cys

Glu

Val

Ile

Cys

Ser

Leu

Leu

Phe

Leu

Phe

Lys

Ser

Lys

Ser

Pro

125

130

135

gct

att

ttt

ggg

gta

ctc

aca

aaa

gaa

tta

tta

caa

ctt

ttt

gaa

gac

544

Ala

Ile

Phe

Gly

Val

Leu

Thr

Lys

Glu

Leu

Leu

Gin

Leu

Phe

Glu

Asp

140

145

150

155

ttg

gtt

tac

ctc

cat

aga

aga

aat

gtg

atg

ggt

cat

gct

gtg

gaa

tgg

592

Leu

Val

Tyr

Leu

His

Arg

Arg

Asn

Val

Met

Gly

His

Ala

Val

Glu

Trp

160

165

170

cca

gtg

gtc

atg

agc

ega

ttt

tta

agt

caa

tta

gat

gaa

cac

atg

gga

640

Pro

Val

Val

Met

Ser

Arg

Phe

Leu

Ser

Gin

Leu

Asp

Glu

His

Met

Gly

175

180

185

tat

tta

caa

tca

gct

cct

ttg

cag

ttg

atg

agt

atg

caa

aat

tta

gaa

688

Tyr

Leu

Gin

Ser

Ala

Pro

Leu

Gin

Leu

Met

Ser

Met

Gin

Asn

Leu

Glu

190

195

200

ttt

att

gaa

gtc

act

tta

tta

atg

gtt

ctt

act

cgt

att

att

gca

att

736

Phe

Ile

Glu

Val

Thr

Leu

Leu

Met

Val

Leu

Thr

Arg

Ile

Ile

Ala

Ile

205

210

215

gtg

ttt

ttt

aga

agg

caa

gaa

ctc

tta

ctt

tgg

cag

ata

ggt

tgt

gtt

784

Val

Phe

Phe

Arg

Arg

Gin

Glu

Leu

Leu

Leu

Trp

Gin

Ile

Gly

Cys

Val

220

225

230

235

ctg

cta

gag

tat

ggt

agt

cca

aaa

att

aaa

tcc

cta

gca

att

agc

ttt

832

Leu

Leu

Glu

Tyr

Gly

Ser

Pro

Lys

Ile

Lys

Ser

Leu

Ala

Ile

Ser

Phe

240

245

250

tta

aca

gaa

ctt

ttt

cag

ctt

gga

gga

cta

cca

gca

caa

cca

gct

agc

880

Leu

Thr

Glu

Leu

Phe

Gin

Leu

Gly

Gly

Leu

Pro

Ala

Gin

Pro

Ala

Ser

255

260

265

act

ttt

ttc

agc

tca

ttt

ttg

gaa

tta

tta

aaa

cac

ctt

gta

gaa

atg

928

Thr

Phe

Phe

Ser

Ser

Phe

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Val

Glu

Met

270

275

280

gat

act

gac

caa

ttg

aaa

ctc

tat

gaa

gag

cca

tta

tca

aag

ctg

ata

976

Asp

Thr

Asp

Gin

Leu

Lys

Leu

Tyr

Glu

Glu

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

Ile

285

290

295

aag

aca

cta

ttt

CCC

ttt

gaa

gca

gaa

gct

tat

aga

aat

att

gaa

cct

1024

Lys

Thr

Leu

Phe

Pro

Phe

Glu

Ala

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Pro

300

305

310

315

gtc

tat

tta

aat

atg

ctg

ctg

gaa

aaa

ctc

tgt

gtc

atg

ttt

gaa

gac

1072

Val

Tyr

Leu

Asn

Met

Leu

Leu

Glu

Lys

Leu

Cys

Val

Met

Phe

Glu

Asp

320

325

330

• ·

ggt gtg Gly Val

ctc Leu

atg Met 335

cgg Arg

ctt Leu

aag tet

gat ttg Asp Leu 340

cta Leu

aaa Lys

gca gct

ttg Leu

tgc Cys

1120

Lys

Ser

Ala

Ala 345

cat

tta

ctg

cag

tat

ttc

ctt

aaa

ttt

gtg

cca

gct

ggg

tat

gaa

tet

1168

His

Leu

Leu

Gin

Tyr

Phe

Leu

Lys

Phe

Val

Pro

Ala

Gly

Tyr

Glu

Ser

350

355

360

gct

tta

caa

gtc

agg

aag

gtc

tat

gtg

aga

aat

att

tgt

aaa

gct

ctt

1216

Ala

Leu

Gin

Val

Arg

Lys

Val

Tyr

Val

Arg

Asn

Ile

Cys

Lys

Ala

Leu

365

370

375

ttg

gat

gtg

ctt

gga

att

gag

gta

gat

gca

gag

tac

ttg

ttg

ggc

cca

1264

Leu

Asp

Val

Leu

Gly

Ile

Glu

Val

Asp

Ala

Glu

Tyr

Leu

Leu

Gly

Pro

380

385

390

395

ctt

tat

gca

gct

ttg

aaa

atg

gaa

agt

atg

gaa

atc

att

gag

gag

att

1312

Leu

Tyr

Ala

Ala

Leu

Lys

Met

Glu

Ser

Met

Glu

Ile

Ile

Glu

Glu

Ile

400

405

410

caa

tgc

caa

act

caa

cag

gaa

aac

ctc

agc

agt

aat

agt

gat

gga

ata

1360

Gin

Cys

Gin

Thr

Gin

Gin

Glu

Asn

Leu

Ser

Ser

Asn

Ser

Asp

Gly

Ile

415

420

425

tca

ccc

aaa

agg

cgt

cgt

ctc

agc

tcg

tet

cta

aac

cct

tet

aaa

aga

1408

Ser

Pro

Lys

Arg

Arg

Arg

Leu

Ser

Ser

Ser

Leu

Asn

Pro

Ser

Lys

Arg

430

435

440

gca

cca

aaa

cag

act

gag

gaa

att

aaa

cat

gtg

gac

atg

aac

caa

aag

1456

Ala

Pro

Lys

Gin

Thr

Glu

Glu

Ile

Lys

His

Val

Asp

Met

Asn

Gin

Lys

445

450

455

agc

ata

tta

tgg

agt

gca

ctg

aaa

cag

aaa

gct

gaa

tcc

ctt

cag

att

1504

Ser

Ile

Leu

Trp

Ser

Ala

Leu

Lys

Gin

Lys

Ala

Glu

Ser

Leu

Gin

Ile

460

465

470

475

tcc

ctt

gaa

tac

agt

ggc

cta

aag

aat

cct

gtt

att

gag

atg

tta

gaa

1552

Ser

Leu

Glu

Tyr

Ser

Gly

Leu

Lys

Asn

Pro

Val

Ile

Glu

Met

Leu

Glu

480

485

490

gga

att

gct

gtt

gtc

tta

caa

ctg

act

gct

ctg

tgt

act

gtt

cat

tgt

1600

Gly

Ile

Ala

Val

Val

Leu

Gin

Leu

Thr

Tkla

Leu

Cys

Thr

Val

His

Cys

495

500

505

tet

cat

caa

aac

atg

aac

tgc

cgt

act

ttc

aag

gac

tgt

caa

cat

aaa

1648

Ser

His

Gin

Asn

Met

Asn

Cys

Arg

Thr

Phe

Lys

Asp

Cys

Gin

His

Lys

510

515

520

tcc

aag

aag

aaa

cct

tet

gta

gtg

ata

act

tgg

atg

tca

ttg

gat

ttt

1696

Ser

Lys

Lys

Lys

Pro

Ser

Val

Val

Ile

Thr

Trp

Met

Ser

Leu

Asp

Phe

525

530

535

tac

aca

aaa

gtg

ctt

aag

agc

tgt

aga

agt

ttg

tta

gaa

tet

gtt

cag

1744

Tyr

Thr

Lys

Val

Leu

Lys

Ser

Cys

Arg

Ser

Leu

Leu

Glu

Ser

Val

Gin

540

545

550

555

• ·

aaa Lys

ctg Leu

gac Asp

ctg Leu

gag gca

acc att gat

aag gtg gtg aaa

att Ile

tat Tyr 570

gat Asp

1792

Glu 560

Ala

Thr

Ile

Asp

Lys 565

Val

Val

Lys

gct

ttg

att

tat

atg

caa

gta

aac

agt

tea

ttt

gaa

gat

cat

atc

ctg

1840

Ala

Leu

Ile

Tyr

Met

Gin

Val

Asn

Ser

Ser

Phe

Glu

Asp

His

Ile

Leu

575

580

585

gaa

gat

tta

tgt

ggt

atg

ctc

tea

ctt

cca

tgg

att

tat

tcc

cat

tet

1888

Glu

Asp

Leu

Cys

Gly

Met

Leu

Ser

Leu

Pró

Trp

Ile

Tyr

Ser

His

Ser

590

595

600

gat

gat

ggc

tgt

tta

aag

ttg

acc

aca

ttt

gcc

gct

aat

ctt

cta

aca

1936

Asp

Asp

Gly

Cys

Leu

Lys

Leu

Thr

Thr

Phe

Ala

Ala

Asn

Leu

Leu

Thr

605

610

615

tta

age

tgt

agg

att

tea

gat

age

tat

tea

cca

cag

gca

caa

tea

ega

1984

Leu

Ser

Cys

Arg

Ile

Ser

Asp

Ser

Tyr

Ser

Pro

Gin

Ala

Gin

Ser

Arg

620

625

630

635

tgt

gtg

ttt

ctt

ctg

act

ctg

ttt

cca

aga

aga

ata

ttc

ctt

gag

tgg

2032

Cys

Val

Phe

Leu

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Arg

Arg

Ile

Phe

Leu

Glu

Trp

640

645

650

aga

aca

gca

gtt

tac

aac

tgg

gcc

ctg

cag

age

tcc

cat

gaa

gta

atc

2080

Arg

Thr

Ala

Val

Tyr

Asn

Trp

Ala

Leu

Gin

Ser

Ser

His

Glu

Val

Ile

655

660

665

cgg

gct

agt

tgt

gtt

agt

gga

ttt

ttt

atc

tta

ttg

cag

cag

cag

aat

2128

Arg

Ala

Ser

Cys

Val

Ser

Gly

Phe

Phe

Ile

Leu

Leu

Gin

Gin

Gin

Asn

670

675

680

tet

tgt

aac

aga

gtt

CCC

aag

att

ctt

ata

gat

aaa

gtc

aaa

gat

gat

2176

Ser

Cys

Asn

Arg

Val

Pro

Lys

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Val

Lys

Asp

Asp

685

690

695

tet

gac

att

gtc

aag

aaa

gaa

ttt

gct

tet

ata

ctt

ggt

caa

ctt

gtc

2224

Ser

Asp

Ile

Val

Lys

Lys

Glu

Phe

Ala

Ser

Ile

Leu

Gly

Gin

Leu

Val

700

705

710

715

tgt

act

ctt

cac

ggc

atg

ttt

tat

ctg

aca

agt

tet

tta

aca

gaa

cct

2272

Cys

Thr

Leu

His

Gly

Met

Phe

Tyr

Leu

Thr

Ser

Ser

Leu

Thr

Glu

Pro

720

725

730

ttc

tet

gaa

cac

gga

cat

gtg

gac

ctc

ttc

tgt

agg

aac

ttg

aaa

gcc

2320

Phe

Ser

Glu

His

Gly

His

Val

Asp

Leu

Phe

Cys

Arg

Asn

Leu

Lys

Ala

735

740

745

act

tet

caa

cat

gaa

tgt

tea

tet

tet

caa

cta

aaa

gct

tet

gtc

tgc

2368

Thr

Ser

Gin

His

Glu

Cys

Ser

Ser

Ser

Gin

Leu

Lys

Ala

Ser

Val

Cys

750

755

760

aag

cca

ttc

ctt

ttc

cta

ctg

aaa

aaa

aaa

ata

cct

agt

cca

gta

aaa

2416

Lys

Pro

Phe

Leu

Phe

Leu

Leu

Lys

Lys

Lys

Ile

Pro

Ser

Pro

Val

Lys

765

770

775

•

ctt Leu 780

gct Ala

ttc Phe

ata Ile

gat Asp

aat Asn 785

cta Leu

cat His

cat His

ctt Leu

tgt Cys 790

aag Lys

cat His

ctt Leu

gat Asp

ttt Phe 795

2464

aga

gaa

gat

gaa

aca

gat

gta

aaa

gca

gtt

ctt

gga

act

tta

tta

aat

2512

•

Arg

Glu

Asp

Glu

Thr

Asp

Val

Lys

Ala

Val

Leu

Gly

Thr

Leu

Leu

Asn

800

805

810

tta

atg

gaa

gat

cca

gac

aaa

gat

gtt

aga

gtg

gct

ttt

agt

gga

aat

2560

Leu

Met

Glu

Asp

Pro

Asp

Lys

Asp

Val

Arg

Val

Ala

Phe

Ser

Gly

Asn

815

820

825

atc

aag

cac

ata

ttg

gaa

tcc

ttg

gac

tet

gaa

gat

gga

ttt

ata

aag

2608

Ile

Lys

His

Ile

Leu

Glu

Ser

Leu

Asp

Ser

Glu

Asp

Gly

Phe

Ile

Lys

830

835

840

»

gag

ctt

ttt

gtc

tta

aga

atg

aag

gaa

gca

tat

aca

cat

gcc

caa

ata

2656

Glu

Leu

Phe

Val

Leu

Arg

Met

Lys

Glu

Ala

Tyr

Thr

His

Ala

Gin

Ile

845

850

855

tca

aga

aat

aat

gag

ctg

aag

gat

acc

ttg

att

ctt

aca

aca

ggg

gat

2704

Ser

Arg

Asn

Asn

Glu

Leu

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Thr

Gly

Asp

860

865

870

875

att

gga

agg

gcc

gca

aaa

gga

gat

ttg

gta

cca

ttt

gca

ctc

tta

cac

2752

Ile

Gly

Arg

Ala

Ala

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Pro

Phe

Ala

Leu

Leu

His

880

885

890

tta

ttg

cat

tgt

ttg

tta

tcc

aag

tca

gca

tet

gtc

tet

gga

gca

gca

2800

Leu

Leu

His

Cys

Leu

Leu

Ser

Lys

Ser

Ala

Ser

Val

Ser

Gly

Ala

Ala

895

900

905

tac

aca

gaa

att

aga

gct

ctg

gtt

gca

gct

aaa

agt

gtt

aaa

ctg

caa

2848

Tyr

Thr

Glu

Ile

Arg

Ala

Leu

Val

Ala

Ala

Lys

Ser

Val

Lys

Leu

Gin

910

915

920

agt

ttt

ttc

agc

cag

tat

aag

aaa

CCC

atc

tgt

cag

ttt

ttg

gta

gaa

2896

Ser

Phe

Phe

Ser

Gin

Tyr

Lys

Lys

Pro

Ile

Cys

Gin

Phe

Leu

Val

Glu

925

930

935

tcc

ctt

cac

tet

agt

cag

atg

aca

gca

ctt

ccg

aat

act

cca

tgc

cag

2944

Ser

Leu

His

Ser

Ser

Gin

Met

Thr

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

Pro

Cys

Gin

940

945

950

955

-

aat

gct

gac

gtg

ega

aaa

caa

gat

gtg

gct

cac

cag

aga

gaa

atg

gct

2992

Asn

Ala

Asp

Val

Arg

Lys

Gin

Asp

Val

Ala

His

Gin

Arg

Glu

Met

Ala

960

965

970

tta

aat

acg

ttg

tet

gaa

att

gcc

aac

gtt

ttc

gac

ttt

cct

gat

ctt

3040

Leu

Asn

Thr

Leu

Ser

Glu

Ile

Ala

Asn

Val

Phe

Asp

Phe

Pro

Asp

Leu

975

980

985

aat

cgt

ttt

ctt

act

agg

aca

tta

caa

gtt

cta

cta

cct

gat

ctt

gct

3088

Asn

Arg

Phe

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gin

Val

Leu

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

990

995

1000

gcc aaa gca

age Ser

cct Pro

gca gct Ala Ala 1010

tet Ser

gct Ala

ctc Leu

att ega Ile Arg 1015

act Thr

tta Leu

gga Gly

aaa Lys

3136

Ala Lys 1005

Ala

caa

tta

aat

gtc

aat

cgt

aga

gag

att

tta

ata

aac

aac

ttc

aaa

tat

3184

Gin

Leu

Asn

Val

Asn

Arg

Arg

Glu

Ile

Leu

Ile

Asn

Asn

Phe

Lys

Tyr

1020

1025

1030

1035

att

ttt

tet

cat

ttg

gtc

tgt

tet

tgt

tcc

aaa

gat

gaa

tta

gaa

cgt

3232

Ile

Phe

Ser

His

Leu

Val

Cys

Ser

Cys

Ser

Lys

Asp

Glu

Leu

Glu

Arg

1040

1045

1050

gcc

ctt

cat

tat

ctg

aag

aat

gaa

a ca

gaa

att

gaa

ctg

ggg

age

ctg

3280

Ala

Leu

His

Tyr

Leu

Lys

Asn

Glu

Thr

Glu

Ile

Glu

Leu

Gly

Ser

Leu

1055

1060

1065

ttg

aga

caa

gat

ttc

caa

gga

ttg

cat

aat

gaa

tta

ttg

ctg

cgt

att

3328

Leu

Arg

Gin

Asp

Phe

Gin

Gly

Leu

His

Asn

Glu

Leu

Leu

Leu

Arg

Ile

1070

1075

1080

gga

gaa

cac

tat

caa

cag

gtt

ttt

aat

ggt

ttg

tea

ata

ctt

gcc

tea

3376

Gly

Glu

His

Tyr

Gin

Gin

Val

Phe

Asn

Gly

Leu

Ser

Ile

Leu

Ala

Ser

1085

1090

1095

ttt

gca

tcc

agt

gat

gat

cca

tat

cag

ggc

ccg

aga

gat

atc

ata

tea

3424

Phe

Ala

Ser

Ser

Asp

Asp

Pro

Tyr

Gin

Gly

Pro

Arg

Asp

Ile

Ile

Ser

1100

1105

1110

1115

cct

gaa

ctg

atg

gct

gat

tat

tta

caa

ccc

aaa

ttg

ttg

ggc

att

ttg

3472

Pro

Glu

Leu

Met

Ala

Asp

Tyr

Leu

Gin

Pro

Lys

Leu

Leu

Gly

Ile

Leu

1120

1125

1130

gct

ttt

ttt

aac

atg

cag

tta

ctg

age

tet

agt

gtt

ggc

att

gaa

gat

3520

Ala

Phe

Phe

Asn

Met

Gin

Leu

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Gly

Ile

Glu

Asp

1135

1140

1145

aag

aaa

atg

gcc

ttg

aac

agt

ttg

atg

tet

ttg

atg

aag

tta

atg

gga

3568

Lys

Lys

Met

Ala

Leu

Asn

Ser

Leu

Met

Ser

Leu

Met

Lys

Leu

Met

Gly

1150

1155

1160

ccc

aaa

cat

gtc

agt

tet

gtg

agg

gtg

aag

atg

atg

acc

a ca

ctg

aga

3616

Pro

Lys

His

Val

Ser

Ser

Val

Arg

Val

Lys

Met

Met

Thr

Thr

Leu

Arg

1165

1170

1175

act

ggc

ctt

ega

ttc

aag

gat

gat

ttt

cct

gaa

ttg

tgt

tgc

aga

gct

3664

Thr

Gly

Leu

Arg

Phe

Lys

Asp

Asp

Phe

Pro

Glu

Leu

Cys

Cys

Arg

Ala

1180

1185

1190

1195

tgg

gac

tgc

ttt

gtt

ege

tgc

ctg

gat

cat

gct

tgt

ctg

ggc

tcc

ctt

3712

Trp

Asp

Cys

Phe

Val

Arg

Cys

Leu

Asp

His

Ala

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

1200

1205

1210

ctc

agt

cat

gta

ata

gta

gct

ttg

tta

cct

ctt

ata

cac

atc

cag

cct

3760

Leu

Ser

His

Val

Ile

Val

Ala

Leu

Leu

Pro

Leu

Ile

His

Ile

Gin

Pro

1215 1220 1225

•

aaa Lys

gaa act gca gct atc ttc cac tac ctc ata

att gaa Ile Glu 1240

aac agg

gat Asp

3808

Glu Thr 1230

Ala

Ala

Ile

Phe His 1235

Tyr

Leu

Ile

Asn

Arg

gct

gtg

caa

gat

ttt

ctt

cat

gaa

ata

tat

ttt

tta

cct

gat

cat

cca

3856

-

Ala

Val

Gin

Asp

Phe

Leu

His

Glu

Ile

Tyr

Phe

Leu

Pro

Asp

His

Pro

1245

1250

1255

gaa

tta

aaa

aag

ata

aaa

gcc

gtt

ctc

cag

gaa

tac

aga

aag

gag

acc

3904

Glu

Leu

Lys

Lys

Ile

Lys

Tkla

Val

Leu

Gin

Glu

Tyr

Arg

Lys

Glu

Thr

1260

1265

1270

1275

tet

gag

age

act

gat

ctt

cag

aca

act

ctt

cag

ctc

tet

atg

aag

gcc

3952

Ser

Glu

Ser

Thr

Asp

Leu

Gin

Thr

Thr

Leu

Gin

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

1280

1285

1290

»

att

ca a

cat

gaa

aat

gtc

gat

gtt

cgt

att

cat

gct

ctt

aca

age

ttg

4000

Ile

Gin

His

Glu

Asn

Val

Asp

Val

Arg

Ile

His

Ala

Leu

Thr

Ser

Leu

1295

1300

1305

aag

gaa

acc

ttg

tat

aaa

aat

cag

gaa

aaa

ctg

ata

aag

tat

gca

aca

4048

Lys

Glu

Thr

Leu

Tyr

Lys

Asn

Gin

Glu

Lys

Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Thr

1310

1315

1320

gac

agt

gaa

aca

gta

gaa

cct

att

atc

tea

cag

ttg

gtg

aca

gtg

ctt

4096

Asp

Ser

Glu

Thr

Val

Glu

Pro

Ile

Ile

Ser

Gin

Leu

Val

Thr

Val

Leu

1325

1330

1335

ttg

aaa

ggt

tgc

caa

gat

gca

aac

tet

caa

gct

cgg

ttg

ctc

tgt

ggg

4144

Leu

Lys

Gly

Cys

Gin

Asp

Ala

Asn

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

Leu

Cys

Gly

1340

1345

1350

1355

gaa

tgt

tta

ggg

gaa

ttg

ggg

gcg

ata

gat

cca

ggt

ega

tta

gat

ttc

4192

Glu

Cys

Leu

Gly

Glu

Leu

Gly

Ala

Ile

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Asp

Phe

1360

1365

1370

tea

aca

act

gaa

act

caa

gga

aaa

gat

ttt

aca

ttt

gtg

act

gga

gta

4240

Ser

Thr

Thr

Glu

Thr

Gin

Gly

Lys

Asp

Phe

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Val

1375

1380

1385

gaa

gat

tea

age

ttt

gcc

tat

gga

tta

ttg

atg

gag

cta

aca

aga

gct

4288

Glu

Asp

Ser

Ser

Phe

Ala

Tyr

Gly

Leu

Leu

Met

Glu

Leu

Thr

Arg

Ala

1390

1395

1400

τ-

tac

ctt

gcg

tat

gct

gat

aat

age

ega

gct

caa

gat

tea

gct

gcc

tat

4336

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

Asp

Asn

Ser

Arg

Ala

Gin

Asp

Ser

Ala

Ala

Tyr

1405

1410

1415

Λ

gcc

att

cag

gag

ttg

ctt

tet

att

tat

gac

tgt

aga

gag

atg

gag

acc

4384

Ala

Ile

Gin

Glu

Leu

Leu

Ser

Ile

Tyr

Asp

Cys

Arg

Glu

Met

Glu

Thr

1420

1425

1430

1435

aac

ggc

cca

ggt

cac

caa

ttg

tgg

agg

aga

ttt

cct

gag

cat

gtt

cgg

4432

Asn

Gly

Pro

Gly

His

Gin

Leu

Trp

Arg

Arg

Phe

Pro

Glu

His

Val

Arg

1440 1445 1450

gaa Glu

ata Ile

cta gaa Leu Glu 1455

cct Pro

cat His

cta Leu

aat acc aga

tac Tyr

aag Lys

agt tet Ser Ser 1465

cag aag

4480

Asn Thr 1460

Arg

Gin

Lys

tca

acc

gat

tgg

tet

gga

gta

aag

aag

cca

att

tac

tta

agt

aaa

ttg

4528

Ser

Thr

Asp

Trp

Ser

Gly

Val

Lys

Lys

Pro

Ile

Tyr

Leu

Ser

Lys

Leu

1470

1475

1480

ggt

agt

aac

ttt

gca

gaa

tgg

tca

gca

tet

tgg

gca

ggt

tat

ctt

att

4576

Gly

Ser

Asn

Phe

Ala

Glu

Trp

Ser

Ala

Ser

Trp

Ala

Gly

Tyr

Leu

Ile

1485

1490

1495

aca

aag

gtt

ega

cat

gat

ctt

gcc

agt

aaa

att

ttc

acc

tgc

tgt

age

4624

Thr

Lys

Val

Arg

His

Asp

Leu

Ala

Ser

Lys

Ile

Phe

Thr

Cys

Cys

Ser

1500

1505

1510

1515

att

atg

atg

aag

cat

gat

ttc

aaa

gtg

acc

atc

tat

ctt

ctt

cca

cat

4672

Ile

Met

Met

Lys

His

Asp

Phe

Lys

Val

Thr

Ile

Tyr

Leu

Leu

Pro

His

1520

1525

1530

att

ctg

gtg

tat

gtc

tta

ctg

ggt

tgt

aat

caa

gaa

gat

cag

cag

gag

4720

Ile

Leu

Val

Tyr

Val

Leu

Leu

Gly

Cys

Asn

Gin

Glu

Asp

Gin

Gin

Glu

1535

1540

1545

gtt

tat

gca

gaa

att

atg

gca

gtt

cta

aag

cat

gac

gat

cag

cat

acc

4768

Val

Tyr

Ala

Glu

Ile

Met

Ala

Val

Leu

Lys

His

Asp

Asp

Gin

His

Thr

1550

1555

1560

ata

aat

acc

caa

gac

att

gca

tet

gat

ctg

tgt

caa

ctc

agt

aca

cag

4816

Ile

Asn

Thr

Gin

Asp

Ile

Ala

Ser

Asp

Leu

Cys

Gin

Leu

Ser

Thr

Gin

1565

1570

1575

act

gtg

ttc

tcc

atg

ctt

gac

cat

ctc

aca

cag

tgg

gca

agg

cac

aaa

4864

Thr

Val

Phe

Ser

Met

Leu

Asp

His

Leu

Thr

Gin

Trp

Ala

Arg

His

Lys

1580

1585

1590

1595

ttt

cag

gca

ctg

aaa

gct

gag

aaa

tgt

cca

cac

age

aaa

tca

aac

aga

4912

Phe

Gin

Ala

Leu

Lys

Ala

Glu

Lys

Cys

Pro

His

Ser

Lys

Ser

Asn

Arg

1600

1605

1610

aat

aag

gta

gac

tca

atg

gta

tet

act

gtg

gat

tat

gaa

gac

tat

cag

4960

Asn

Lys

Val

Asp

Ser

Met

Val

Ser

Thr

Val

Asp

Tyr

Glu

Asp

Tyr

Gin

1615

1620

1625

agt

gta

acc

cgt

ttt

cta

gac

ctc

ata

ccc

cag

gat

act

ctg

gca

gta

5008

Ser

Val

Thr

Arg

Phe

Leu

Asp

Leu

Ile

Pro

Gin

Asp

Thr

Leu

Ala

Val

1630

1635

1640

gct

tcc

ttt

ege

tcc

aaa

gca

tac

aca

ega

gct

gta

atg

cac

ttt

gaa

5056

Ala

Ser

Phe

Arg

Ser

Lys

Ala

Tyr

Thr

Arg

Ala

Val

Met

His

Phe

Glu

1645

1650

1655

tca

ttt

att

aca

gaa

aag

aag

caa

aat

att

cag

gaa

cat

ctt

gga

ttt

5104

Ser

Phe

Ile

Thr

Glu

Lys

Lys

Gin

Asn

Ile

Gin

Glu

His

Leu

Gly

Phe

1660

1665

1670

1675

4 4 4 · * 4« · ·4 · • 444 4 4 4 ««44» >44 4 »44 4 * * ««

4 444 44 4 >44 · 444»44

44 4 · 4·

4 44 4 4 · ·· >

-

tta Leu

cag Gin

aaa Lys

ttg tat Leu Tyr 1680

gct Ala

gct Ala

atg Met

cat gaa His Glu 1685

cct Pro

gat Asp

gga Gly

gtg gcc Val Ala 1690

gga Gly

5152

gtc

agt

gca

att

aga

aag

gca

gaa

cca

tet

cta

aaa

gaa

cag

atc

ctt

5200

-

Val

Ser

Ala

Ile

Arg

Lys

Ala

Glu

Pro

Ser

Leu

Lys

Glu

Gin

Ile

Leu

1695

1700

1705

gaa

cat

gaa

agc

ctt

ggc

ttg

ctg

agg

gat

gcc

act

gct

tgt

tat

gac

5248

Glu

His

Glu

Ser

Leu

Gly

Leu

Leu

Arg

Asp

Ala

Thr

Ala

Cys

Tyr

Asp

1710

1715

1720

agg

gct

att

cag

cta

gaa

cca

gac

cag

atc

att

cat

tat

cat

ggt

gta

5296

Arg

Ala

Ile

Gin

Leu

Glu

Pro

Asp

Gin

Ile

Ile

His

Tyr

His

Gly

Val

1725

1730

1735

gta

aag

tcc

atg

tta

ggt

ctt

ggt

cag

ctg

tet

act

gtt

atc

act

cag

5344

Val

Lys

Ser

Met

Leu

Gly

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Thr

Val

Ile

Thr

Gin

1740

1745

1750

1755

gtg

aat

gga

gtg

cat

gct

aac

agg

tcc

gag

tgg

a ca

gat

gaa

tta

aac

5392

Val

Asn

Gly

Val

His

Ala

Asn

Arg

Ser

Glu

Trp

Thr

Asp

Glu

Leu

Asn

1760

1765

1770

acg

tac

aga

gtg

gaa

gca

gct

tgg

aaa

ttg

tca

cag

tgg

gat

ttg

gtg

5440

Thr

Tyr

Arg

Val

Glu

Ala

Ala

Trp

Lys

Leu

Ser

Gin

Trp

Asp

Leu

Val

1775

1780

1785

gaa

aac

tat

ttg

gca

gca

gat

gga

aaa

tet

a ca

aca

tgg

agt

gtc

aga

5488

Glu

Asn

Tyr

Leu

Ala

Ala

Asp

Gly

Lys

Ser

Thr

Thr

Trp

Ser

Val

Arg

1790

1795

1800

ctg

gga

cag

cta

tta

tta

tca

gcc

aaa

aaa

aga

gat

atc

aca

gct

ttt

5536

Leu

Gly

Gin

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Lys

Lys

Arg

Asp

Ile

Thr

Ala

Phe

1805

1810

1815

tat

gac

tca

ctg

aaa

cta

gtg

aga

gca

gaa

caa

att

gta

cct

ctt

tca

5584

Tyr Asp

Ser

Leu

Lys

Leu

Val

Arg

Ala

Glu

Gin

Ile

Val

Pro

Leu

Ser

1820

1825

1830

1835

gct

gca

agc

ttt

gaa

aga

ggc

tcc

tac

caa

ega

gga

tat

gaa

tat

att

5632

Ala

Ala

Ser

Phe

Glu

Arg

Gly

Ser

Tyr

Gin

Arg

Gly

Tyr

Glu

Tyr

Ile

1840

1845

1850

...

gtg

aga

ttg

cac

atg

tta

tgt

gag

ttg

gag

cat

agc

atc

aaa

cca

ctt

5680

Val

Arg

Leu

His

Met

Leu

Cys

Glu

Leu

Glu

His

Ser

Ile

Lys

Pro

Leu

1855

1860

1865

ttc

cag

cat

tet

cca

ggt

gac

agt

tet

caa

gaa

gat

tet

cta

aac

tgg

5728

Phe

Gin

His

Ser

Pro

Gly

Asp

Ser

Ser

Gin

Glu

Asp

Ser

Leu

Asn

Trp

1870

1875

1880

gta

gct

ega

cta

gaa

atg

acc

cag

aat

tcc

tac

aga

gcc

aag

gac

cct

5776

Val

Ala

Arg

Leu

Glu

Met

Thr

Gin

Asn

Ser

Tyr

Arg Ala

Lys

Asp

Pro

1885

1890

1895

• 9 00 4« 04 4400 • 40 · 4 04 0 4 404 • 00 0 0 00 0 0 000

0 000 44 0 000 4 040000

00000040

0 ·· 00 44 4444

atc ctg Ile Leu 1900

gct Ala

ctc Leu

cgg agg Arg Arg 1905

gct Ala

tta Leu

cta Leu

age ctc Ser Leu 1910

aac Asn

aaa Lys

aga Arg

cca gat Pro Asp 1915

5824

tac

aat

gaa

atg

gtt

gga

gaa

tgc

tgg

ctg

cag

agt

gcc

agg

gta

gct

5872

Tyr

Asn

Glu

Met

Val

Gly

Glu

Cys

Trp

Leu

Gin

Ser

Ala

Arg

Val

Ala

1920

1925

1930

aga

aag

gct

ggt

cac

cac

cag

aca

gcc

tac

aat

gct

ctc

ctt

aat

gca

5920

Arg

Lys

Ala

Gly

His

His

Gin

Thr

Ala

Tyr

Asn

Ala

Leu

Leu

Asn

Ala

1935

1940

1945

ggg

gaa

tca

ega

ctc

gct

gaa

ctg

tac

gtg

gaa

agg

gca

aag

tgg

ctc

5968

Gly

Glu

Ser

Arg

Leu

Ala

Glu

Leu

Tyr

Val

Glu

Arg

Ala

Lys

Trp

Leu

1950

1955

1960

tgg

tec

aag

ggt

gat

gtt

cac

cag

gca

cta

att

gtt

ctt

caa

aaa

ggt

6016

Trp

Ser

Lys

Gly

Asp

Val

His

Gin

Ala

Leu

Ile

Val

Leu

Gin

Lys

Gly

1965

1970

1975

gtt

gaa

tta

tgt

ttt

cct

gaa

aat

gaa

acc

cca

cct

gag

ggt

aag

aac

6064

Val

Glu

Leu

Cys

Phe

Pro

Glu

Asn

Glu

Thr

Pro

Pro

Glu

Gly

Lys

Asn

1980

1985

1990

1995

atg

tta

atc

cat

ggt

ega

gct

atg

cta

cta

gtg

ggc

ega

ttt

atg

gaa

6112

Met

Leu

Ile

His

Gly

Arg

Ala

Met

Leu

Leu

Val

Gly

Arg

Phe

Met

Glu

2000

2005

2010

gaa

aca

gct

aac

ttt

gaa

age

aat

gca

att

atg

aaa

aaa

tat

aag

gat

6160

Glu

Thr

Ala

Asn

Phe

Glu

Ser

Asn

Ala

Ile

Met

Lys

Lys

Tyr

Lys

Asp

2015

2020

2025

gtg

acc

gcg

tgc

ctg

cca

gaa

tgg

gag

gat

ggg

cat

ttt

tac

ctt

gcc

6208

Val

Thr

Ala

Cys

Leu

Pro

Glu

Trp

Glu

Asp

Gly

His

Phe

Tyr

Leu

Ala

2030

2035

2040

aag

tac

tat

gac

aaa

ttg

atg

ccc

atg

gtc

aca

gac

aac

aaa

atg

gaa

6256

Lys

Tyr

Tyr

Asp

Lys

Leu

Met

Pro

Met

Val

Thr

Asp

Asn

Lys

Met

Glu

2045

2050

2055

aag

caa

ggt

gat

ctc

atc

cgg

tat

ata

gtt

ctt

cat

ttt

ggc

aga

tet

6304

Lys

Gin

Gly

Asp

Leu

Ile

Arg

Tyr

Ile

Val

Leu

His

Phe

Gly

Arg

Ser

2060

2065

2070

2075

cta

caa

tat

gga

aat

cag

ttc

ata

tat

cag

tca

atg

cca

ega

atg

tta

6352

Leu

Gin

Tyr

Gly

Asn

Gin

Phe

Ile

Tyr

Gin

Ser

Met

Pro

Arg

Met

Leu

2080

2085

2090

act

cta

tgg

ctt

gat

tat

ggt

aca

aag

gca

tat

gaa

tgg

gaa

aaa

gct

6400

Thr

Leu

Trp

Leu

Asp

Tyr

Gly

Thr

Lys

Ala

Tyr

Glu

Trp

Glu

Lys

Ala

2095

2100

2105

ggc

cgc

tcc

gat

cgt

gta

caa

atg

agg

aat

gat

ttg

ggt

aaa

ata

aac

6448

Gly

Arg

Ser

Asp

Arg

Val

Gin

Met

Arg

Asn

Asp

Leu

Gly

Lys

Ile

Asn

2110 2115 2120 • ·· ··· • · ·

aag gtt Lys Val 2125

atc Ile

aca Thr

gag Glu

cat aca His Thr 2130

aac Asn

tat Tyr

tta Leu

gct cca Ala Pro 2135

tat Tyr

caa Gin

ttt Phe

ttg Leu

6496

act

gct

ttt

tca

caa

ttg

atc

tet

ega

att

tgt

cat

tet

cac

gat

gaa

6544

Thr

Ala

Phe

Ser

Gin

Leu

Ile

Ser

Arg

Ile

Cys

His

Ser

His

Asp

Glu

2140

2145

2150

2155

gtt

ttt

gtt

gtc

ttg

atg

gaa

ata

ata

gcc

aaa

gta

ttt

cta

gcc

tat

6592

Val

Phe

Val

Val

Leu

Met

Glu

Ile

Ile

Ala

Lys

Val

Phe

Leu

Ala

Tyr

2160

2165

2170

cct

caa

caa

gca

atg

tgg

atg

atg

aca

gct

gtg

tca

aag

tca

tet

tat

6640

Pro

Gin

Gin

Ala

Met

Trp

Met

Met

Thr

Ala

Val

Ser

Lys

Ser

Ser

Tyr

2175

2180

2185

CCC

atg

cgt

gtg

aac

aga

tgc

aag

gaa

atc

ctc

aat

aaa

gct

att

cat

6688

Pro

Met

Arg

Val

Asn

Arg

Cys

Lys

Glu

Ile

Leu

Asn

Lys

Ala

Ile

His

2190

2195

2200

atg

aaa

aaa

tcc

tta

gag

aag

ttt

gtt

gga

gat

gca

act

ege

cta

aca

6736

Met

Lys

Lys

Ser

Leu

Glu

Lys

Phe

Val

Gly

Asp

Ala

Thr

Arg

Leu

Thr

2205

2210

2215

gat

aag

ctt

cta

gaa

ttg

tgc

aat

aaa

ccg

gtt

gat

gga

agt

agt

tcc

6784

Asp

Lys

Leu

Leu

Glu

Leu

Cys

Asn

Lys

Pro

Val

Asp

Gly

Ser

Ser

Ser

2220

2225

2230

2235

aca

tta

agc

atg

agc

act

cat

ttt

aaa

atg

ctt

aaa

aag

ctg

gta

gaa

6832

Thr

Leu

Ser

Met

Ser

Thr

His

Phe

Lys

Met

Leu

Lys

Lys

Leu

Val

Glu

2240

2245

2250

gaa

gca

aca

ttt

agt

gaa

atc

ctc

att

cct

cta

caa

tca

gtc

atg

ata

6880

Glu

Ala

Thr

Phe

Ser

Glu

Ile

Leu

Ile

Pro

Leu

Gin

Ser

Val

Met

Ile

2255

2260

2265

cct

aca

ctt

cca

tca

att

ctg

ggt

acc

cat

gct

aac

cat

gct

agc

cat

6928

Pro

Thr

Leu

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly

Thr

His

Ala

Asn

His

Ala

Ser

His

2270

2275

2280

gaa

cca

ttt

cct

gga

cat

tgg

gcc

tat

att

gca

ggg

ttt

gat

gat

atg

6976

Glu

Pro

Phe

Pro

Gly

His

Trp

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly

Phe

Asp

Asp

Met

2285

2290

2295

gtg

gaa

att

ctt

gct

tet

ctt

cag

aaa

cca

aag

aag

att

tet

tta

aaa

7024

Val

Glu

Ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Gin

Lys

Pro

Lys

Lys

Ile

Ser

Leu

Lys

2300

2305

2310

2315

ggc

tca

gat

gga

aag

ttc

tac

atc

atg

atg

tgt

aag

cca

aaa

gat

gac

7072

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Phe

Tyr

Ile

Met

Met

Cys

Lys

Pro

Lys

Asp

Asp

2320

2325

2330

ctg

aga

aag

gat

tgt

aga

cta

atg

gaa

ttc

aat

tcc

ttg

att

aat

aag

7120

Leu

Arg

Lys

Asp

Cys

Arg

Leu

Met

Glu

Phe

Asn

Ser

Leu

Ile

Asn

Lys

2335 2340 2345 ·· ·· φφ φφ * φφ φ φ φφ φ • ΦΦΦ φ φ φ φ • φ ··· φ φ · φφφ φ ♦ · φφφ φ φφ φφ φφ φφ

tgc Cys

tta aga Leu Arg 2350

aaa Lys

gat Asp

gca Ala

gag tet Glu Ser 2355

cgt Arg

aga Arg

aga Arg

gaa ctt Glu Leu 2360

cat His

att Ile

ega Arg

7168

aca

tat

gca

gtt

att

cca

eta

aat

gat

gaa

tgt

ggg

att

att

gaa

tgg

7216

Thr

Tyr

Ala

Val

Ile

Pro

Leu

Asn

Asp

Glu

Cys

Gly

Ile

Ile

Glu

Trp

2365

2370

2375

gtg

aac

aac

act

gct

ggt

ttg

aga

cct

att

ctg

acc

aaa

eta

tat

aaa

7264

Val

Asn

Asn

Thr

Ala

Gly

Leu

Arg

Pro

Ile

Leu

Thr

Lys

Leu

Tyr

Lys

2380

2385

2390

2395

gaa

aag

gga

gtg

tat

atg

aca

gga

aaa

gaa

ctt

ege

cag

tgt

atg

eta

7312

•

Glu

Lys

Gly

Val

Tyr

Met

Thr

Gly

Lys

Glu

Leu

Arg

Gin

Cys

Met

Leu

2400

2405

2410

>

cca

aag

tca

gca

gct

tta

tet

gaa

aaa

ctc

aaa

gta

ttc

ega

gaa

ttt

7360

Pro

Lys

Ser

Ala

Ala

Leu

Ser

Glu

Lys

Leu

Lys

Val

Phe

Arg

Glu

Phe

2415

2420

2425

ctc

ctg

CCC

agg

cat

cct

cct

att

ttt

cat

gag

tgg

ttt

ctg

aga

aca

7408

Leu

Leu

Pro

Arg

His

Pro

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Trp

Phe

Leu

Arg

Thr

2430

2435

2440

ttc

cct

gat

cct

aca

tca

tgg

tac

agt

agt

aga

tca

gct

tac

tgc

cgt

7456

Phe

Pro

Asp

Pro

Thr

Ser

Trp

Tyr

Ser

Ser

Arg

Ser

Ala

Tyr

Cys

Arg

2445

2450

2455

tcc

act

gca

gta

atg

tca

atg

gtt

ggt

tat

att

ctg

ggg

ctt

gga

gac

7504

Ser

Thr

Ala

Val

Met

Ser

Met

Val

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

2460

2465

2470

2475

cgt

cat

ggt

gaa

aat

att

ctc

ttt

gat

tet

ttg

act

ggt

gaa

tgc

gta

7552

Arg

His

Gly

Glu

Asn

Ile

Leu

Phe

Asp

Ser

Leu

Thr

Gly

Glu

Cys

Val

2480

2485

2490

cat

gta

gat

ttc

aat

tgt

ctt

ttc

aat

aag

gga

gaa

acc

ttt

gaa

gtt

7600

-

His

Val

Asp

Phe

Asn

Cys

Leu

Phe

Asn

Lys

Gly

Glu

Thr

Phe

Glu

Val

2495

2500

2505

cca

gaa

att

gtg

cca

ttt

ege

ctg

act

cat

aat

atg

gtt

aat

gga

atg

7648

Pro

Glu

Ile

Val

Pro

Phe

Arg

Leu

Thr

His

Asn

Met

Val

Asn

Gly

Met

2510

2515

2520

ggt

cct

atg

gga

aca

gag

ggt

ctt

ttt

ega

aga

gca

tgt

gaa

gtt

aca

7696

Gly

Pro

Met

Gly

Thr

Glu

Gly

Leu

Phe

Arg

Arg

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

2525

2530

2535

<

atg

agg

ctg

atg

cgt

gat

cag

ega

gag

cct

tta

atg

agt

gtc

tta

aag

7744

Met

Arg

Leu

Met

Arg

Asp

Gin

Arg

Glu

Pro

Leu

Met

Ser

Val

Leu

Lys

2540

2545

2550

2555

act

ttt

eta

cat

gat

cct

ctt

gtg

gaa

tgg

agt

aaa

cca

gtg

aaa

ggg

7792

Thr

Phe

Leu

His

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Trp

Ser

Lys

Pro

Val

Lys

Gly

2560 2565 2570 φφ ·♦ φφ • · φφ • · ·· φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ

-

cat His

tcc Ser

aaa gcg Lys Ala 2575

cca Pro

ctg aat

gaa act Glu Thr 2580

gga gaa gtt

gtc aat Val Asn 2585

gaa Glu

aag Lys

7840

Leu

Asn

Gly

Glu

Val

gcc

aag

acc

cat

gtt

ctt

gac

att

gag

cag

ega

cta

caa

ggt

gta

atc

7888

Ala

Lys

Thr

His

Val

Leu

Asp

Ile

Glu

Gin

Arg

Leu

Gin

Gly

Val

Ile

2590

2595

2600

aag

act

ega

aat

aga

gtg

aca

gga

ctg

ccg

tta

tet

att

gaa

gga

cat

7936

Lys

Thr

Arg

Asn

Arg

Val

Thr

Gly

Leu

Pro

Leu

Ser

Ile

Glu

Gly

His

2605

2610

2615

gtg

cat

tac

ctt

ata

caa

gaa

get

act

gat

gaa

aac

tta

cta

tgc

cag

7984

•

Val

His

Tyr

Leu

Ile

Gin

Glu

Ala

Thr

Asp

Glu

Asn

Leu

Leu

Cys

Gin

2620

2625

2630

2635

φ

atg

tat

ctt

ggt

tgg

act

cca

tat

atg

tgaaatgaaa ttatgtaaaa

8031

Met

Tyr

Leu

Gly

Trp

Thr

Pro

Tyr

Met

2640

gaatatgtta	ataatctaaa	agtaatgcat	ttggtatgaa	tctgtggttg	tatctgttca	8091
attctaaagt	acaacataaa	tttacgttct	cagcaactgt	tatttetete	tgatcattaa	8151
ttatatgtaa	aataatatac	attcagttat	taagaaataa	actgctttct	taataaaaaa	8211
aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaa				8239

<210> 2 <211> 2644 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Leu Glu Leu 5

Ala

Ser Met 10

Ile

Pro

Ala

Leu 15

Arg

Met 1

Gly Glu

His

Glu

Leu

Gly

Ser

Ala

Thr

Pro

Glu

Glu

Tyr

Asn

Thr

Val

Val

Gin

Lys

20

25

30

Pro

Arg

Gin

Ile

Leu

Cys

Gin

Phe

Ile

Asp

Arg

Ile

Leu

Thr

Asp

Val

35

40

45

Asn

Val

Val

Ala

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Lys

Thr

Asp

Ser

Gin

Pro

Thr

50

55

60

Ser

Val

Met

Leu

Leu

Asp

Phe

Ile

Gin

His

Ile

Met

Lys

Ser

Ser

Pro

65

70

75

80

Leu

Met

Phe

Val

Asn

Val

Ser

Gly

Ser

His

Glu

Arg

Lys

Gly

Ser

Cys

85

90

95

Ile

Glu

Phe

Ser

Asn

Trp

Ile

Ile

Thr

Arg

Leu

Leu

Arg

Ile

Ala

Ala

100

105

110

Thr

Pro

Ser 115

Cys His

Leu Leu

His 120

Lys

Lys

Ile

Cys

Glu 125

Val

Ile

Cys

Ser

Leu

Leu

Phe

Leu

Phe

Lys

Ser

Lys

Ser

Pro

Ala

Ile

Phe

Gly

Val

130

135

140

Leu

Thr

Lys

Glu

Leu

Leu

Gin

Leu

Phe

Glu

Asp

Leu

Val

Tyr

Leu

His

145

150

155

160

Arg

Arg

Asn

Val

Met

Gly

His

Ala

Val

Glu

Trp

Pro

Val

Val

Met

Ser

165

170

175

Arg

Phe

Leu

Ser

Gin

Leu

Asp

Glu

His

Met

Gly

Tyr

Leu

Gin

Ser

Ala

180

185

190

Pro

Leu

Gin

Leu

Met

Ser

Met

Gin

Asn

Leu

Glu

Phe

Ile

Glu

Val

Thr

»

195

200

205

Leu

Leu

Met

Val

Leu

Thr

Arg

Ile

Ile

Ala

Ile

Val

Phe

Phe

Arg

Arg

210

215

220

Gin

Glu

Leu

Leu

Leu

Trp

Gin

Ile

Gly

Cys

Val

Leu

Leu

Glu

Tyr

Gly

225

230

235

240

Ser

Pro

Lys

Ile

Lys

Ser

Leu

Ala

Ile

Ser

Phe

Leu

Thr

Glu

Leu

Phe

245

250

255

Gin

Leu

Gly

Gly

Leu

Pro

Ala

Gin

Pro

Ala

Ser

Thr

Phe

Phe

Ser

Ser

260

265

270

Phe

Leu

Glu

Leu

Leu

Lys

His

Leu

Val

Glu

Met

Asp

Thr

Asp

Gin

Leu

275

280

285

Lys

Leu

Tyr

Glu

Glu

Pro

Leu

Ser

Lys

Leu

Ile

Lys

Thr

Leu

Phe

Pro

290

295

300

Phe

Glu

Ala

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asn

Ile

Glu

Pro

Val

Tyr

Leu

Asn

Met

305

310

315

320

Leu

Leu

Glu

Lys

Leu

Cys

Val

Met

Phe

Glu

Asp

Gly

Val

Leu

Met

Arg

325

330

335

Leu

Lys

Ser

Asp

Leu

Leu

Lys

Ala

Ala

Leu

Cys

His

Leu

Leu

Gin

Tyr

340

345

350

Phe

Leu

Lys

Phe

Val

Pro

Ala

Gly

Tyr

Glu

Ser

Ala

Leu

Gin

Val

Arg

355

360

365

•

Lys

Val

Tyr

Val

Arg

Asn

Ile

Cys

Lys

Ala

Leu

Leu

Asp

Val

Leu

Gly

370

375

380

Ile

Glu

Val

Asp

Ala

Glu

Tyr

Leu

Leu

Gly

Pro

Leu

Tyr

Ala

Ala

Leu

385

390

395

400

Lys

Met

Glu

Ser

Met

Glu

Ile

Ile

Glu

Glu

Ile

Gin

Cys

Gin

Thr

Gin

405

410

415

99 99 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 · BBB B B B BBB B ··« *·« « · 9 9 9 9 99

99 99 99 9999

Gin

Glu

Asn

Leu 420

Ser

Ser

Asn

Ser Asp 425

Gly

Ile

Ser Pro

Lys 430

Arg

Arg

Arg

Leu

Ser

Ser

Ser

Leu

Asn

Pro

Ser

Lys

Arg

Ala

Pro

Lys

Gin

Thr

435

440

445

Glu

Glu

Ile

Lys

His

Val

Asp

Met

Asn

Gin

Lys

Ser

Ile

Leu

Trp

Ser

450

455

460

Ala

Leu

Lys

Gin

Lys

Ala

Glu

Ser

Leu

Gin

Ile

Ser

Leu

Glu

Tyr

Ser

465

470

475

480

Gly

Leu

Lys

Asn

Pro

Val

Ile

Glu

Met

Leu

Glu

Gly

Ile

Ala

Val

Val

485

490

495

Leu

Gin

Leu

Thr

Ala

Leu

Cys

Thr

Val

His

Cys

Ser

His

Gin

Asn

Met

500

505

510

Asn

Cys

Arg

Thr

Phe

Lys

Asp

Cys

Gin

His

Lys

Ser

Lys

Lys

Lys

Pro

515

520

525

Ser

Val

Val

Ile

Thr

Trp

Met

Ser

Leu

Asp

Phe

Tyr

Thr

Lys

Val

Leu

530

535

540

Lys

Ser

Cys

Arg

Ser

Leu

Leu

Glu

Ser

Val

Gin

Lys

Leu

Asp

Leu

Glu

545

550

555

560

Ala

Thr

Ile

Asp

Lys

Val

Val

Lys

Ile

Tyr

Asp

Ala

Leu

Ile

Tyr

Met

565

570

575

Gin

Val

Asn

Ser

Ser

Phe

Glu

Asp

His

Ile

Leu

Glu

Asp

Leu

Cys

Gly

580

585

590

Met

Leu

Ser

Leu

Pro

Trp

Ile

Tyr

Ser

His

Ser

Asp

Asp

Gly

Cys

Leu

595

600

605

Lys

Leu

Thr

Thr

Phe

Ala

Ala

Asn

Leu

Leu

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Ile

610

615

620

Ser

Asp

Ser

Tyr

Ser

Pro

Gin

Ala

Gin

Ser

Arg

Cys

Val

Phe

Leu

Leu

625

630

635

640

Thr

Leu

Phe

Pro

Arg

Arg

Ile

Phe

Leu

Glu

Trp

Arg

Thr

Ala

Val

Tyr

645

650

655

Asn

Trp

Ala

Leu

Gin

Ser

Ser

His

Glu

Val

Ile

Arg

Ala

Ser

Cys

Val

660

665

670

Ser

Gly

Phe

Phe

Ile

Leu

Leu

Gin

Gin

Gin

Asn

Ser

Cys

Asn

Arg

Val

675

680

685

Pro

Lys

Ile

Leu

Ile

Asp

Lys

Val

Lys

Asp

Asp

Ser

Asp

Ile

Val

Lys

690

695

700

Lys

Glu

Phe

Ala

Ser

Ile

Leu

Gly

Gin

Leu

Val

Cys

Thr

Leu

His

Gly

705

710

715

720

• φ	• φ	« φ	• *	• ·	φφ
• φ	φ ·	•	•	• ·	• φ	φ	•
•	•	• φ	•	φ	• φ	• φ	φ	•
•	φ	φφφ	φ «	φ	φφφ φ	φφφ	φ φ	•
•	φ	φ	•	φ	φ	φ		φ
φ φ	«φ	« φ	φφ	φφ	φ ·

Met

Phe

Tyr

Leu Thr 725

Ser

Ser

Leu

Thr Glu Pro 730

Phe

Ser

Glu

His 735

Gly

His

Val

Asp

Leu

Phe

Cys

Arg

Asn

Leu

Lys

Ala

Thr

Ser

Gin

His

Glu

740

745

750

Cys

Ser

Ser

Ser

Gin

Leu

Lys

Ala

Ser

Val

Cys

Lys

Pro

Phe

Leu

Phe

755

760

765

Leu

Leu

Lys

Lys

Lys

Ile

Pro

Ser

Pro

Val

Lys

Leu

Ala

Phe

Ile

Asp

770

775

780

Asn

Leu

His

His

Leu

Cys

Lys

His

Leu

Asp

Phe

Arg

Glu

Asp

Glu

Thr

785

790

795

800

Asp

Val

Lys

Ala

Val

Leu

Gly

Thr

Leu

Leu

Asn

Leu

Met

Glu

Asp

Pro

805

810

815

Asp

Lys

Asp

Val

Arg

Val

Ala

Phe

Ser

Gly

Asn

Ile

Lys

His

Ile

Leu

820

825

830

Glu

Ser

Leu

Asp

Ser

Glu

Asp

Gly

Phe

Ile

Lys

Glu

Leu

Phe

Val

Leu

835

840

845

Arg

Met

Lys

Glu

Ala

Tyr

Thr

His

Ala

Gin

Ile

Ser

Arg

Asn

Asn

Glu

850

855

860

Leu

Lys

Asp

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Thr

Gly

Asp

Ile

Gly

Arg

Ala

Ala

865

870

875

880

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Pro

Phe

Ala

Leu

Leu

His

Leu

Leu

His

Cys

Leu

885

890

895

Leu

Ser

Lys

Ser

Ala

Ser

Val

Ser

Gly

Ala

Ala

Tyr

Thr

Glu

Ile

Arg

900

905

910

Ala

Leu

Val

Ala

Ala

Lys

Ser

Val

Lys

Leu

Gin

Ser

Phe

Phe

Ser

Gin

915

920

925

Tyr

Lys

Lys

Pro

Ile

Cys

Gin

Phe

Leu

Val

Glu

Ser

Leu

His

Ser

Ser

930

935

940

Gin

Met

Thr

Ala

Leu

Pro

Asn

Thr

Pro

Cys

Gin

Asn

Ala

Asp

Val

Arg

945

950

955

960

Lys

Gin

Asp

Val

Ala

His

Gin

Arg

Glu

Met

Ala

Leu

Asn

Thr

Leu

Ser

965

970

975

Glu

Ile

Ala

Asn

Val

Phe

Asp

Phe

Pro

Asp

Leu

Asn

Arg

Phe

Leu

Thr

980

985

990

Arg

Thr

Leu

Gin

Val

Leu

Leu

Pro

Asp

Leu

Ala

Ala

Lys

Ala

Ser

Pro

995

1000

1005

Ala

Ala

Ser

Ala

Leu

Ile

Arg

Thr

Leu

Gly

Lys

Gin

Leu

Asn

Val

Asn

1010

1015

1020

Arg 025

Arg

Glu

Ile Leu Ile 1030

Asn

Asn

Phe

Lys

Tyr 1035

Ile

Phe

Ser

His

Leu 1040

Val

Cys

Ser

Cys Ser Lys

Asp

Glu

Leu

Glu

Arg

Ala

Leu

His

Tyr

Leu

1045

1050

1055

Lys

Asn

Glu

Thr Glu Ile

Glu

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

Arg

Gin

Asp

Phe

1060

1065

1070

Gin

Gly

Leu

His Asn Glu

Leu

Leu

Leu

Arg

Ile

Gly

Glu

His

Tyr

Gin

1075

1080

1085

Gin

Val

Phe

Asn Gly Leu

Ser

Ile

Leu

Ala

Ser

Phe

Ala

Ser

Ser

Asp

1090

1095

1100

Asp

Pro

Tyr

Gin Gly Pro

Arg

Asp

Ile

Ile

Ser

Pro

Glu

Leu

Met

Ala

105

1110

1115

1120

Asp

Tyr

Leu

Gin Pro Lys

Leu

Leu

Gly

Ile

Leu

Ala

Phe

Phe

Asn

Met

1125

1130

1135

Gin

Leu

Leu

Ser Ser Ser

Val

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

Lys

Met

Ala

Leu

1140

1145

1150

Asn

Ser

Leu

Met Ser Leu

Met

Lys

Leu

Met

Gly

Pro

Lys

His

Val

Ser

1155

1160

1165

Ser

Val

Arg

Val Lys Met

Met

Thr

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Leu

Arg

Phe

1170

1175

1180

Lys

Asp

Asp

Phe Pro Glu

Leu

Cys

Cys

Arg

Ala

Trp

Asp

Cys

Phe

Val

185

1190

1195

1200

Arg

Cys

Leu

Asp His Ala

Cys

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

Ser

His

Val

Ile

1205

1210

1215

Val

Ala

Leu

Leu Pro Leu

Ile

His

Ile

Gin

Pro

Lys

Glu

Thr

Ala

/Via

1220

1225

1230

Ile

Phe

His

Tyr Leu Ile

Ile

Glu

Asn

Arg

Asp

Ala

Val

Gin

Asp

Phe

1235

1240

1245

Leu

His

Glu

Ile Tyr Phe

Leu

Pro

Asp

His

Pro

Glu

Leu

Lys

Lys

Ile

1250

1255

1260

Lys

Ala

Val

Leu Gin Glu

Tyr

Arg

Lys

Glu

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Asp

265

1270

1275

1280

Leu

Gin

Thr

Thr Leu Gin

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ile

Gin

His

Glu

Asn

1285

1290

1295

Val

Asp

Val

Arg Ile His

Ala

Leu

Thr

Ser

Leu

Lys

Glu

Thr

Leu

Tyr

1300

1305

1310

Lys

Asn

Gin

Glu Lys Leu

Ile

Lys

Tyr

Ala

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Val

1315 1320 1325 ·· ·

Glu Pro 1330

Ile

Ile Ser Gin Leu 1335

Val

Thr Val

Leu

Leu Lys 1340

Gly

Cys

Gin

Asp

Ala

Asn

Ser

Gin

Ala

Arg

Leu

Leu

Cys

Gly

Glu

Cys

Leu

Gly

Glu

345

1350

1355

1360

Leu

Gly

Ala

Ile

Asp

Pro

Gly

Arg

Leu

Asp

Phe

Ser

Thr

Thr

Glu

Thr

1365

1370

1375

Gin

Gly

Lys

Asp

Phe

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Val

Glu

Asp

Ser

Ser

Phe

1380

1385

1390

Ala

Tyr

Gly

Leu

Leu

Met

Glu

Leu

Thr

Arg

Ala

Tyr

Leu

Ala

Tyr

Ala

1395

1400

1405

Asp

Asn

Ser

Arg

Ala

Gin

Asp

Ser

Ala

Ala

Tyr

Ala

Ile

Gin

Glu

Leu

1410

1415

1420

Leu

Ser

Ile

Tyr

Asp

Cys

Arg

Glu

Met

Glu

Thr

Asn

Gly

Pro

Gly

His

425

1430

1435

1440

Gin

Leu

Trp

Arg

Arg

Phe

Pro

Glu

His

Val

Arg

Glu

Ile

Leu

Glu

Pro

1445

1450

1455

His

Leu

Asn

Thr

Arg

Tyr

Lys

Ser

Ser

Gin

Lys

Ser

Thr

Asp

Trp

Ser

1460

1465

1470

Gly

Val

Lys

Lys

Pro

Ile

Tyr

Leu

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Asn

Phe

Ala

1475

1480

1485

Glu

Trp

Ser

Ala

Ser

Trp

Ala

Gly

Tyr

Leu

Ile

Thr

Lys

Val

Arg

His

1490

1495

1500

Asp

Leu

Ala

Ser

Lys

Ile

Phe

Thr

Cys

Cys

Ser

Ile

Met

Met

Lys

His

505

1510

1515

1520

Asp

Phe

Lys

Val

Thr

Ile

Tyr

Leu

Leu

Pro

His

Ile

Leu

Val

Tyr

Val

1525

1530

1535

Leu

Leu

Gly

Cys

Asn

Gin

Glu

Asp

Gin

Gin

Glu

Val

Tyr

Ala

Glu

Ile

1540

1545

1550

Met

Ala

Val

Leu

Lys

His

Asp

Asp

Gin

His

Thr

Ile

Asn

Thr

Gin

Asp

1555

1560

1565

Ile

Ala

Ser

Asp

Leu

Cys

Gin

Leu

Ser

Thr

Gin

Thr

Val

Phe

Ser

Met

1570

1575

1580

Leu

Asp

His

Leu

Thr

Gin

Trp

Ala

Arg

His

Lys

Phe

Gin

Ala

Leu

Lys

585

1590

1595

1600

Ala

Glu

Lys

Cys

Pro

His

Ser

Lys

Ser

Asn Arg

Asn

Lys

Val

Asp

Ser

1605

1610

1615

Met

Val

Ser

Thr

Val

Asp

Tyr

Glu

Asp

Tyr

Gin

Ser

Val

Thr

Arg

Phe

1620 1625 1630

Leu Asp	Leu 1635	Ile	Pro	Gin	Asp Thr 1640	Leu Ala Val	Ala	Ser 1645	Phe	Arg	Ser
Lys Ala	Tyr	Thr	Arg	Ala	Val Met	His Phe Glu	Ser	Phe	Ile	Thr	Glu
1650					1655		1660
Lys Lys	Gin	Asn	Ile	Gin	Glu His	Leu Gly Phe	Leu	Gin	Lys	Leu	Tyr
665				1670		1675					1680
Ala Ala	Met	His	Glu	Pro	Asp Gly	Val Ala Gly	Val	Ser	Ala	Ile	Arg
			1685			1690			1695
Lys Ala	Glu	Pro	Ser	Leu	Lys Glu	Gin Ile Leu	Glu	His	Glu	Ser	Leu
	1700			1705		1710
Gly Leu	Leu	Arg	Asp	Ala	Thr Ala	Cys Tyr Asp	Arg	Ala	Ile	Gin	Leu
	1715				1720			1725
Glu Pro	Asp	Gin	Ile	Ile	His Tyr	His Gly Val	Val	Lys	Ser	Met	Leu
1730					1735		1740
Gly Leu	Gly	Gin	Leu	Ser	Thr Val	Ile Thr Gin	Val	Asn	Gly	Val	His
745			1750		1755				1760
Ala Asn	Arg	Ser	Glu	Trp	Thr Asp	Glu Leu Asn	Thr	Tyr	Arg	Val	Glu
		1765			1770			1775
Ala Ala	Trp	Lys	Leu	Ser	Gin Trp	Asp Leu Val	Glu	Asn	Tyr	Leu	Ala
	1780			1785		1790
Ala Asp	Gly	Lys	Ser	Thr	Thr Trp	Ser Val Arg	Leu	Gly	Gin	Leu	Leu
1795				1800		1805
Leu Ser	Ala	Lys	Lys	Arg	Asp Ile	Thr Ala Phe	Tyr Asp	Ser	Leu	Lys
1810				1815		1820
Leu Val	Arg	Ala	Glu	Gin	Ile Val	Pro Leu Ser	Ala	Ala	Ser	Phe	Glu
825			1830		1835				1840
Arg Gly	Ser	Tyr	Gin	Arg	Gly Tyr	Glu Tyr Ile	Val	Arg	Leu	His	Met
		1845			1850			1855
Leu Cys	Glu	Leu	Glu	His	Ser Ile	Lys Pro Leu	Phe	Gin	His	Ser	Pro
	1860			1865		1870
Gly Asp	Ser	Ser	Gin	Glu	Asp Ser	Leu Asn Trp	Val	Ala	Arg	Leu	Glu
1875				1880		1885
Met Thr	Gin	Asn	Ser	Tyr	Arg Ala	Lys Asp Pro	Ile	Leu	Ala	Leu	Arg
1890				1895		1900
Arg Ala	Leu	Leu	Ser	Leu	Asn Lys	Arg Pro Asp	Tyr Asn	Glu	Met	Val
905			1910		1915				1920
Gly Glu	Cys	Trp	Leu	Gin	Ser Ala	Arg Val Ala	Arg	Lys	Ala	Gly	His

1925 1930 1935

• ·	• 4	44	«·	··	«4
4	•	4 4	•	•	V ·	4 4	4 4
•	•	• ·	•	•	• 4	4 ·	4 4
•	•	444	4 «	•	444 4	444	44 4
•	•	•	•	•	•	4	4
	44	• 4	44	• 4	44	44

His	Gin	Thr Ala 1940	Tyr Asn	Ala Leu Leu Asn Ala 1945	Gly Glu Ser 1950	Arg	Leu
Ala	Glu	Leu Tyr	Val Glu	Arg Ala Lys Trp Leu	Trp Ser Lys	Gly	Asp
		1955		1960	1965
Val	His	Gin Ala	Leu Ile	Val Leu Gin Lys Gly	Val Glu Leu	Cys	Phe
1970		1975	1980
Pro	Glu	Asn Glu	Thr Pro	Pro Glu Gly Lys Asn	Met Leu Ile	His	Gly
985			1990	1995		2000
Arg	Ala	Met Leu	Leu Val	Gly Arg Phe Met Glu	Glu Thr Ala	Asn	Phe
		2005	2010	2015
Glu	Ser	Asn Ala	Ile Met	Lys Lys Tyr Lys Asp	Val Thr Ala	Cys	Leu
		2020		2025	2030
Pro	Glu	Trp Glu	Asp Gly	His Phe Tyr Leu Ala	Lys Tyr Tyr	Asp	Lys
	2035		2040	2045
Leu	Met	Pro Met	Val Thr	Asp Asn Lys Met Glu	Lys Gin Gly	Asp	Leu
2050		2055	2060
Ile	Arg	Tyr Ile	Val Leu	His Phe Gly Arg Ser	Leu Gin Tyr	Gly	Asn
065			2070	2075		2080
Gin	Phe	Ile Tyr	Gin Ser	Met Pro Arg Met Leu	Thr Leu Trp	Leu	Asp
		2085	2090	2095
Tyr	Gly	Thr Lys	Ala Tyr	Glu Trp Glu Lys Ala	Gly Arg Ser	Asp	Arg
		2100		2105	2110
Val	Gin	Met Arg	Asn Asp	Leu Gly Lys Ile Asn	Lys Val Ile	Thr	Glu
	2115		2120	2125
His	Thr	Asn Tyr	Leu Ala	Pro Tyr Gin Phe Leu	Thr Ala Phe	Ser	Gin
2130		2135	2140
Leu	Ile	Ser Arg	Ile Cys	His Ser His Asp Glu	Val Phe Val	Val	Leu
145			2150	2155		2160
Met	Glu	Ile Ile	Ala Lys	Val Phe Leu Ala Tyr	Pro Gin Gin	Ala	Met
		2165	2170	2175
Trp	Met	Met Thr	Ala Val	Ser Lys Ser Ser Tyr	Pro Met Arg	Val	Asn
		2180		2185	2190
Arg	Cys	Lys Glu	Ile Leu	Asn Lys Ala Ile His	Met Lys Lys	Ser	Leu
	2195		2200	2205
Glu	Lys	Phe Val	Gly Asp	Ala Thr Arg Leu Thr	Asp Lys Leu	Leu	Glu
2210		2215	2220
Leu	Cys	Asn Lys	Pro Val	Asp Gly Ser Ser Ser	Thr Leu Ser	Met	Ser

225 2230 2235 2240

··	··	··	··	··	··
a ·	• ·	• ·	• ·	• ·	• ·
•	•	• ·	• ·	• ·	• ·	• ·
•	•	···	s * ·	··· *	···	··♦
•	•	•	• ·	•	•	•
«·	·*	··	··	··	··

Thr His

Phe

Lys Met 2245

Leu Lys

Lys

Leu Val 2250

Glu

Glu

Ala

Thr Phe 2255

Ser

Glu

Ile

Leu

Ile

Pro

Leu

Gin

Ser

Val

Met

Ile

Pro

Thr

Leu

Pro

Ser

2260

2265

2270

Ile

Leu

Gly

Thr

His

Ala

Asn

His

Ala

Ser

His

Glu

Pro

Phe

Pro

Gly

2275

2280

2285

His

Trp

Ala

Tyr

Ile

Ala

Gly

Phe

Asp

Asp

Met

Val

Glu

Ile

Leu

Ala

2290

2295

2300

Ser

Leu

Gin

Lys

Pro

Lys

Lys

Ile

Ser

Leu

Lys

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

305

2310

2315

2320

Phe

Tyr

Ile

Met

Met

Cys

Lys

Pro

Lys

Asp

Asp

Leu

Arg

Lys

Asp

Cys

2325

2330

2335

Arg

Leu

Met

Glu

Phe

Asn

Ser

Leu

Ile

Asn

Lys

Cys

Leu

Arg

Lys

Asp

2340

2345

2350

Ala

Glu

Ser

Arg

Arg

Arg

Glu

Leu

His

Ile

Arg

Thr

Tyr

Ala

Val

Ile

2355

2360

2365

Pro

Leu

Asn

Asp

Glu

Cys

Gly

Ile

Ile

Glu

Trp

Val

Asn

Asn

Thr

Ala

2370

2375

2380

Gly

Leu

Arg

Pro

Ile

Leu

Thr

Lys

Leu

Tyr

Lys

Glu

Lys

Gly

Val

Tyr

385

2390

2395

2400

Met

Thr

Gly

Lys

Glu

Leu

Arg

Gin

Cys

Met

Leu

Pro

Lys

Ser

Ala

Ala

2405

2410

2415

Leu

Ser

Glu

Lys

Leu

Lys

Val

Phe

Arg

Glu

Phe

Leu

Leu

Pro

Arg

His

2420

2425

2430

Pro

Pro

Ile

Phe

His

Glu

Trp

Phe

Leu

Arg

Thr

Phe

Pro

Asp

Pro

Thr

2435

2440

2445

Ser

Trp

Tyr

Ser

Ser

Arg

Ser

Ala

Tyr

Cys

Arg

Ser

Thr

Ala

Val

Met

2450

2455

2460

Ser

Met

Val

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Arg

His

Gly

Glu

Asn

465

2470

2475

2480

Ile

Leu

Phe

Asp

Ser

Leu

Thr

Gly

Glu

Cys

Val

His

Val

Asp

Phe

Asn

2485

2490

2495

Cys

Leu

Phe

Asn

Lys

Gly

Glu

Thr

Phe

Glu

Val

Pro

Glu

Ile

Val

Pro

2500

2505

2510

Phe

Arg

Leu

Thr

His

Asn

Met

Val

Asn

Gly

Met

Gly

Pro

Met

Gly

Thr

2515

2520

2525

Glu

Gly

Leu

Phe

Arg

Arg

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

Met Arg

Leu

Met

Arg

2530 2535 2540 • ·

Asp 545

Gin Arg Glu

Pro Leu 2550

Met Ser

Val Leu Lys 2555

Thr Phe Leu

His Asp 2560

Pro

Leu

Val

Glu

Trp

Ser

Lys

Pro

Val

Lys

Gly

His

Ser

Lys

Ala

Pro

2565

2570

2575

Leu

Asn

Glu

Thr

Gly

Glu

Val

Val

Asn

Glu

Lys

Ala

Lys

Thr

His

Val

2580

2585

2590

Leu

Asp

Ile

Glu

Gin

Arg

Leu

Gin

Gly

Val

Ile

Lys

Thr

Arg

Asn

Arg

2595

2600

2605

Val

Thr

Gly

Leu

Pro

Leu

Ser

Ile

Glu

Gly

His

Val

His

Tyr

Leu

Ile

2610

2615

2620

Gin

Glu

Ala

Thr

Asp

Glu

Asn

Leu

Leu

Cys

Gin

Met

Tyr

Leu

Gly

Trp

625

2630

2635

2640

Thr

Pro

Tyr

Met

<210> 3 <211> 8022 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (585).. (7742) <400> 3

ggtaccaagt	aaaaactgct	tagtaagtat	aaaacacaga	agaatccgcg	atctagtgaa	60
ccaatgccct	gcgtatgacg	ctccactgac	gctatagtca	atgagaacta	ggatgtgcga	120
ttataactta	tcttttcaat	attttcttat	tatttattta	agaaataatt	gaattaaaac	180
tcatttcttc	ttttattagc	cgtaaaatag	cttattttct	ctcctactac	ctttcaacaa	240
taactttttt	ttttgtttat	tgaccattat	aatcacatca	aaagtcaaaa	aattcaatca	300
ttatcagaaa	catccagcct	aatattactt	aaaagttagt	ttcctctgaa	aattcagtat	360
cacaaaagct	cgttaattag	catcgctcga	tacttagtgc	accatgcatc	ttcctttacc	420
tcgtgagtgg	aaatcgattt	gataatcgat	tgccactttt	cgcataattc	tattgagata	480
ttttattact	tacaatcgtc	ttttataaat	gctcaagact	ttgaacgcgc	gtgttgcgtt	540
ttaaaaaggc	ctttttttga	attgaatcaa	tggtttgata	tagt atg agc caa cac	596

Met Ser Gin His gca aaa agg aaa gct ggg tca ctc gat ctt tca

Ala Lys Arg Lys Ala Gly Ser Leu Asp Leu Ser

10 15 ccc aga ggc tta gat

Pro Arg Gly Leu Asp

644 • · · · ·· · · · · · · • ·· · · ·· · · ·· · • · · · · · · · 9 ♦ · · • · ··· · · · ··· · ··· ··· ······ ♦ · ·» ·· ·· ·· · · · ·

gac Asp

aga Arg

cag Gin

gct Ala

ttc Phe 25

gga Gly

cag Gin

ctt Leu

ttg Leu

aaa Lys 30

gaa Glu

gta Val

tta Leu

gca Ala

tta Leu 35

gac Asp

692

aaa

gaa

cat

gag

tta

ggt

aga

agt

aat

tet

tta

cca

tet

atg

acc

tcc

740

Lys

Glu

His

Glu 40

Leu

Gly

Arg

Ser

Asn 45

Ser

Leu

Pro

Ser

Met 50

Thr

Ser

gag

ctt

gtt

gaa

gtt

tta

att

gaa

gtt

ggt

ctt

cta

gct

ttt

aaa

cat

788

Glu

Leu

Val 55

Glu

Val

Leu

Ile

Glu 60

Val

Gly

Leu

Leu

Ala 65

Phe

Lys

His

gat

gat

tea

aaa

tet

gaa

ttt

atc

tet

cct

aag

atg

cta

aaa

gaa

gcc

836

Asp

Asp 70

Ser

Lys

Ser

Glu

Phe 75

Ile

Ser

Pro

Lys

Met 80

Leu

Lys

Glu

Ala

cat

ctc

tet

cta

caa

gcg

tta

atg

cta

atc

tta

aaa

agg

tet

ccg

aca

884

His 85

Leu

Ser

Leu

Gin

Ala 90

Leu

Met

Leu

Ile

Leu 95

Lys

Arg

Ser

Pro

Thr 100

gtt

ttg

cgg

gag

att

aaa

tea

tet

gtt

act

ctt

ttg

gat

tgg

att

tta

932

Val

Leu

Arg

Glu

Ile 105

Lys

Ser

Ser

Val

Thr 110

Leu

Leu

Asp

Trp

Ile 115

Leu

ccc

agg

act

ata

tea

ttg

ttt

gct

gat

att

cgt

ttt

att

aag

tta

ttt

980

Pro

Arg

Thr

Ile 120

Ser

Leu

Phe

Ala

Asp 125

Ile

Arg

Phe

Ile

Lys 130

Leu

Phe

gac

tea

tta

aaa

gag

ttt

cat

aag

cta

att

tat

cag

cta

atc

agt

gaa

1028

Asp

Ser

Leu 135

Lys

Glu

Phe

His

Lys 140

Leu

Ile

Tyr

Gin

Leu 145

Ile

Ser

Glu

aag

tea

ttc

cta

tgg

gac

tta

tat

gct

tcg

ttt

atg

cgt

tat

tgg

aaa

1076

Lys

Ser 150

Phe

Leu

Trp

Asp

Leu 155

Tyr

Ala

Ser

Phe

Met 160

Arg

Tyr

Trp

Lys

tat

tat

att

aca

aac

gtt

tet

tet

ata

gtt

ctc

caa

atc

act

aat

gct

1124

Tyr 165

Tyr

Ile

Thr

Asn

Val 170

Ser

Ser

Ile

Val

Leu 175

Gin

Ile

Thr

Asn

Ala 180

aca

ttc

cct

tac

aag

atg

ccc

tea

ccc

aat

tet

caa

cca

ttg

cag

agt

1172

Thr

Phe

Pro

Tyr

Lys 185

Met

Pro

Ser

Pro

Asn 190

Ser

Gin

Pro

Leu

Gin 195

Ser

atc

tcc

cca

aat

tat

cca

acc

cat

ega

gag

gac

aaa

ttt

gat

tta

ctt

1220

Ile

Ser

Pro

Asn 200

Tyr

Pro

Thr

His

Arg 205

Glu

Asp

Lys

Phe

Asp 210

Leu

Leu

atc

att

aat

ata

gag

gag

gct

tgt

aca

ttt

ttc

ttt

gaa

agt

gcc

cat

1268

Ile

Ile

Asn 215

Ile

Glu

Glu

Ala

Cys 220

Thr

Phe

Phe

Phe

Glu 225

Ser

Ala

His

ttt

ttt

gca

caa

tgc

tea

tat

tta

aag

aaa

tcc

aat

ttt

cct

agt

cca

1316

Phe

Phe 230

Ala

Gin

Cys

Ser

Tyr 235

Leu

Lys

Lys

Ser

Asn 240

Phe

Pro

Ser

Pro

cct Pro 245

ctc Leu

ttt Phe

aca gcg

tgg Trp 250

act Thr

tgg Trp

atc Ile

aag Lys

cca Pro 255

tgt Cys

ttt Phe

ttt Phe

aat Asn

ttt Phe 260

1364

Thr

Ala

gtt

att

tta

tta

aaa

ega

atc

age

atc

gga

gac

tea

cag

ctc

ttt

cta

1412

Val

Ile

Leu

Leu

Lys

Arg

Ile

Ser

Ile

Gly

Asp

Ser

Gin

Leu

Phe

Leu

265

270

275

cat

ttg

cat

tea

cgt

ata

gtc

caa

act

tta

tgc

tgt

ttt

tcc

ttg

aat

1460

His

Leu

His

Ser

Arg

Ile

Val

Gin

Thr

Leu

Cys

Cys

Phe

Ser

Leu

Asn

280

285

290

ttt

ata

tat

cat

ggc

ctt

CCC

att

tgt

gaa

aaa

tet

aaa

cat

att

tta

1508

Phe

Ile

Tyr

His

Gly

Leu

Pro

Ile

Cys

Glu

Lys

Ser

Lys

His

Ile

Leu

295

300

•

305

atg

tec

tec

atc

aac

tta

aca

ttg

gga

tea

ttg

aag

aaa

act

tat

aca

1556

Met

Ser

Ser

Ile

Asn

Leu

Thr

Leu

Gly

Ser

Leu

Lys

Lys

Thr

Tyr

Thr

310

315

320

gtt

get

aat

act

get

ata

tet

ctt

ttt

ttt

ctc

tet

tta

ttt

gtt

tta

1604

Val

Ala

Asn

Thr

Ala

Ile

Ser

Leu

Phe

Phe

Leu

Ser

Leu

Phe

Val

Leu

325

330

335

340

CCC

aaa

act

gta

get

ggt

cta

ttc

tat

cct

ttt

ggg

gtt

tcc

tta

ctt

1652

Pro

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Leu

Phe

Tyr

Pro

Phe

Gly

Val

Ser

Leu

Leu

345

350

355

tet

gac

ttc

aag

gta

tta

gag

caa

ctt

gaa

cca

gat

tet

gat

ctc

aaa

1700

Ser

Asp

Phe

Lys

Val

Leu

Glu

Gin

Leu

Glu

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Lys

360

365

370

aag

gca

ata

ata

tta

ttt

aag

tgc

aga

tac

caa

agt

tea

gaa

ata

gat

1748

Lys

Ala

Ile

Ile

Leu

Phe

Lys

Cys

Arg

Tyr

Gin

Ser

Ser

Glu

Ile

Asp

375

380

385

caa

aca

act

ctc

cgt

get

ttt

ggc

gaa

att

tgt

act

ggt

aaa

ctt

gaa

1796

Gin

Thr

Thr

Leu

Arg

Ala

Phe

Gly

Glu

Ile

Cys

Thr

Gly

Lys

Leu

Glu

390

395

400

aac

acg

ttg

ttt

tet

aac

tet

gaa

tta

aac

ctt

ttt

ctt

tta

cat

tat

1844

Asn

Thr

Leu

Phe

Ser

Asn

Ser

Glu

Leu

Asn

Leu

Phe

Leu

Leu

His

Tyr

405

410

415

420

ctt

tec

ttg

gac

aat

gac

ttg

tea

aat

att

ctt

aaa

gtg

gat

ttc

cag

1892

Leu

Ser

Leu

Asp

Asn

Asp

Leu

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

Val

Asp

Phe

Gin

425

430

435

aat

ggt

cat

aac

ata

tgt

aca

ttt

gca

aaa

tgg

tgt

ata

aac

aac

aac

1940

Asn

Gly

His

Asn

Ile

Cys

Thr

Phe

Ala

Lys

Trp

Cys

Ile

Asn

Asn

Asn

440

445

450

tta

gat

gaa

ccg

tet

aat

tta

aag

cac

ttt

cgt

gaa

atg

tta

gat

tat

1988

Leu

Asp

Glu

Pro

Ser

Asn

Leu

Lys

His

Phe

Arg

Glu

Met

Leu

Asp

Tyr

455

460

465

tat Tyr

age Ser 470

tet Ser

cat aat

gtt Val

aca Thr 475

ata Ile

agt Ser

gag gac

gac Asp 480

ctg aag

aac ttc

2036

His

Asn

Glu

Asp

Leu

Lys

Asn

Phe

tet

tta

gtt

ttg

tgt

act

cat

gtt

gca

aag

gtg

aat

gag

aaa

aca

aat

2084

Ser

Leu

Val

Leu

Cys

Thr

His

Val

Ala

Lys

Val

Asn

Glu

Lys

Thr

Asn

485

490

495

500

agt

att

ttc

ege

aca

tat

gaa

gta

cat

ggt

tgt

gaa

gtt

tgt

aac

tca

2132

Ser

Ile

Phe

Arg

Thr

Tyr

Glu

Val

His

Gly

Cys

Glu

Val

Cys

Asn

Ser

505

510

515

ttt

tgt

tta

cta

ttt

gat

gag

cgg

tcg

cct

ttt

aaa

att

cct

tat

cac

2180

Phe

Cys

Leu

Leu

Phe

Asp

Glu

Arg

Ser

Pro

Phe

Lys

Ile

Pro

Tyr

His

520

525

530

gaa

ttg

ttt

tgt

gca

ttg

cta

aaa

aat

ccc

gac

ata

att

tcc

tet

tet

2228

Glu

Leu

Phe

Cys

Ala

Leu

Leu

Lys

Asn

Pro

Asp

Ile

Ile

Ser

Ser

Ser

535

540

545

gtt

aaa

caa

tca

ttg

ttg

ctt

gat

ggc

ttt

ttt

cgg

tgg

age

cag

cat

2276

Val

Lys

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

Asp

Gly

Phe

Phe

Arg

Trp

Ser

Gin

His

550

555

560

tgc

tca

aac

ttt

aat

aaa

gaa

tca

atg

tta

agt

tta

aga

gaa

ttt

att

2324

Cys

Ser

Asn

Phe

Asn

Lys

Glu

Ser

Met

Leu

Ser

Leu

Arg

Glu

Phe

Ile

565

570

575

580

atg

aaa

gca

tta

gcc

agt

act

tca

aga

tgt

tta

cgt

gtt

gtt

gct

gca

2372

Met

Lys

Ala

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

Val

Val

Ala

Ala

585

590

595

aaa

gtt

ttg

ccc

att

ttc

att

aag

gga

cct

aat

aat

ctt

gat

ata

gtt

2420

Lys

Val

Leu

Pro

Ile

Phe

Ile

Lys

Gly

Pro

Asn

Asn

Leu

Asp

Ile

Val

600

605

610

gaa

ttt

cac

aag

gaa

agt

aaa

gcc

ttg

att

ttt

aat

acg

ttg

aaa

ata

2468

Glu

Phe

His

Lys

Glu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ile

Phe

Asn

Thr

Leu

Lys

Ile

615

620

625

ttg

gcg

gtg

gaa

aat

aca

gct

att

tta

gaa

acg

gtc

att

ctt

tcc

tgg

2516

Leu

Ala

Val

Glu

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Glu

Thr

Val

Ile

Leu

Ser

Trp

630

635

640

atc

tcc

tta

tet

aga

gtg

gta

gaa

gaa

gaa

gaa

tta

cat

ttt

gta

cta

2564

Ile

Ser

Leu

Ser

Arg

Val

Val

Glu

Glu

Glu

Glu

Leu

His

Phe

Val

Leu

645

650

655

660

ttg

gaa

gtt

ata

tet

tet

gtg

ata

aac

age

gga

ata

ttt

tat

caa

ggc

2612

Leu

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Val

Ile

Asn

Ser

Gly

Ile

Phe

Tyr

Gin

Gly

665

670

675

att

ggt

ctc

age

gct

ctg

caa

caa

att

gcc

tcg

acg

cgt

cat

ata

tcc

2660

Ile

Gly

Leu

Ser

Ala

Leu

Gin

Gin

Ile

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Ile

Ser

680

685

690

gtt Val

tgg Trp

caa tta Gin Leu 695

ctt Leu

tet Ser

cca Pro

tat tgg

cca Pro

aca Thr

gtg Val

tcc Ser 705

gtt Val

gcg Ala

att Ile

2708

Tyr 700

Trp

gtc

caa

ggt

atg

ggt

aaa

aaa

ccg

aac

ata

gcc

agt

tta

ttt

gct

cag

2756

Val

Gin

Gly

Met

Gly

Lys

Lys

Pro

Asn

Ile

Ala

Ser

Leu

Phe

Ala

Gin

710

715

720

ctt

atg

aat

att

tcc

gag

ggc

gat

ttt

ctt

att

ega

aca

cag

gcg

tac

2804

Leu

Met

Asn

Ile

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

Leu

Ile

Arg

Thr

Gin

Ala

Tyr

725

730

735

740

act

tta

cca

ttc

ctt

gta

ctt

act

aaa

aac

aaa

gcg

tta

ata

gta

cgt

2852

Thr

Leu

Pro

Phe

Leu

Val

Leu

Thr

Lys

Asn

Lys

Ala

Leu

Ile

Val

Arg

745

750

755

ata

gct

gaa

ctt

tca

caa

agt

gat

gtt

gct

act

ttg

tgc

ctt

acc

aat

2900

Ile

Ala

Glu

Leu

Ser

Gin

Ser

Asp

Val

Ala

Thr

Leu

Cys

Leu

Thr

Asn

760

765

770

atg

cat

aaa

atc

ctt

gct

tcg

cta

ctt

act

acg

gat

cat

cct

aat

ttg

2948

Met

His

Lys

Ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Thr

Thr

Asp

His

Pro

Asn

Leu

775

780

785

gaa

gag

agt

gtg

atg

ctt

ctt

ctt

tca

ctg

gcc

act

tet

gat

ttt

gaa

2996

Glu

Glu

Ser

Val

Met

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

Ser

Asp

Phe

Glu

790

795

800

aaa

gtt

gat

tta

acg

tet

ttg

tta

ege

tet

gat

cct

att

tet

att

act

3044

Lys

Val

Asp

Leu

Thr

Ser

Leu

Leu

Arg

Ser

Asp

Pro

Ile

Ser

Ile

Thr

805

810

815

820

gtg

gag

ttg

tta

cag

ctt

tat

cag

aat

gat

gtt

cct

cat

gaa

aaa

att

3092

Val

Glu

Leu

Leu

Gin

Leu

Tyr

Gin

Asn

Asp

Val

Pro

His

Glu

Lys

Ile

825

830

835

gaa

aat

gct

tta

aga

aag

gta

gca

atg

att

gtc

tet

caa

gtg

gtt

aat

3140

Glu

Asn

Ala

Leu

Arg

Lys

Val

Ala

Met

Ile

Val

Ser

Gin

Val

Val

Asn

840

845

850

gac

gaa

gac

ttg

agc

aat

aag

gaa

tta

ctt

tat

gat

ttt

ttt

aat

aat

3188

Asp

Glu

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Glu

Leu

Leu

Tyr

Asp

Phe

Phe

Asn

Asn

855

860

865

cac

att

ttg

ggt

atc

tta

gca

gaa

ttt

tet

aat

atc

ctt

aac

gac

ctg

3236

His

Ile

Leu

Gly

Ile

Leu

Ala

Glu

Phe

Ser

Asn

Ile

Leu

Asn

Asp

Leu

870

875

880

aaa

gga

aag

act

tca

att

aat

gaa

aag

att

aag

aca

att

gtc

ggc

att

3284

Lys

Gly

Lys

Thr

Ser

Ile

Asn

Glu

Lys

Ile

Lys

Thr

Ile

Val

Gly

Ile

885

890

895

900

gaa

aaa

atg

tta

tet

tta

tgt

gga

ggt

gca

gtc

aaa

ctt

gga

tta

cca

3332

Glu

Lys

Met

Leu

Ser

Leu

Cys

Gly

Gly

Ala

Val

Lys

Leu

Gly

Leu

Pro

905

910

915

cag Gin

ata Ile

ctt Leu

tet Ser 920

aat Asn

tta Leu

caa Gin

agt Ser

gct Tkla 925

ttt Phe

caa Gin

aat Asn

gag Glu

cac His 930

tta Leu

agg Arg

3380

ttt

tat

gca

atc

aaa

gct

tgg

ttc

agt

ttg

ata

tta

gca

acc

aag

gag

3428

Phe

Tyr

Ala 935

Ile

Lys

Ala

Trp

Phe 940

Ser

Leu

Ile

Leu

Ala 945

Thr

Lys

Glu

CCC

gag

tat

agt

tea

att

gct

ggt

tta

agt

ctt

gta

att

tta

cct

cct

3476

Pro

Glu 950

Tyr

Ser

Ser

Ile

Ala 955

Gly

Leu

Ser

Leu

Val 960

Ile

Leu

Pro

Pro

tta

ttc

cct

tat

tta

gaa

cca

caa

gaa

gca

gag

cta

gta

att

caa

ata

3524

Leu 965

Phe

Pro

Tyr

Leu

Glu 970

Pro

Gin

Glu

Ala

Glu 975

Leu

Val

Ile

Gin

Ile 980

ttt

gat

ttt

att

tet

tet

gac

aca

cac

aag

tgc

cta

caa

gga

tta

aag

3572

Phe

Asp

Phe

Ile

Ser 985

Ser

Asp

Thr

His

Lys 990

Cys

Leu

Gin

Gly

Leu 995

Lys

tgg

gct

atc

CCC

acc

agt

ctg

gat

tea

gcg

tgc

ttt

age

ctt

aag

gct

3620

Trp

Ala

Ile

Pro 1000

Thr

Ser

Leu

Asp

Ser 1005

Ala

Cys

Phe

Ser

Leu 1010

Lys

Tkla

aaa

gaa

ata

ttc

tgt

tcg

ctt

caa

aat

gaa

gat

ttt

tac

tet

gag

ctt

3668

Lys

Glu Ile 1015

Phe

Cys

Ser

Leu

Gin 1020

Asn

Glu

Asp

Phe Tyr 1025

Ser

Glu

Leu

caa

agt

ata

att

aag

tgt

tta

act

aac

gaa

aat

gag

cca

gtt

tgt

tat

3716

Gin

Ser L030

Ile

Ile

Lys

Cys Leu 1035

Thr

Asn

Glu

Asn Glu 1040

Pro

Val

Cys

Tyr

tta

ggt

tta

caa

aaa

tta

gaa

ctt

ttt

ttt

caa

gcc

aag

gtg

gac

gag

3764

Leu Gly 1045

Leu

Gin

Lys Leu 1050

Glu

Leu

Phe

Phe Gin 1055

Ala

Lys

Val

Asp Glu 1060

tta

cat

gac

aca

cta

aat

ttg

gac

ata

tcc

aac

gaa

gtt

ctg

gac

caa

3812

Leu

His

Asp

Thr Leu 1065

Asn

Leu

Asp

Ile Ser 1070

Asn

Glu

Val

Leu Asp 1075

Gin

tta

cta

aga

tgc

ctt

tta

gat

tgt

tgt

gta

aaa

tat

gct

tea

aca

aat

3860

Leu

Leu

Arg

Cys 1080

Leu

Leu

Asp

Cys Cys 1085

Val

Lys

Tyr

Ala

Ser 1090

Thr

Asn

atg

caa

ata

tea

tat

ctt

gct

gca

aaa

aat

ctt

ggt

gaa

ttg

ggt

gcg

3908

Met

Gin Ile 1095

Ser

Tyr

Leu

Ala Ala 1100

Lys

Asn

Leu

Gly

Glu 1105

Leu

Gly

Ala

ata

gat

CCC

age

ege

gcc

aag

gct

caa

cat

att

att

aaa

gaa

aca

gtt

3956

Ile Asp 1110

Pro

Ser

Arg

Ala Lys 1115

Tkla

Gin

His

Ile Ile 1120

Lys

Glu

Thr

Val

gtt

ctt

gat

aac

ttt

gaa

aac

gga

gaa

gaa

agt

ttg

aag

ttt

att

cta

4004

Val

Leu

Asp

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Glu

Glu

Ser

Leu

Lys

Phe

Ile

Leu

1125 1130 1135 1140 • · · · · · · · ·» · · • · · · ♦ · · · · ♦ · · • · · · · · · · · · · · • · ··· · · · ··· · ··· ··· • · ··· · · · ·· · · · · · · ·· · ·

gat Asp

ttt Phe

atg Met

caa tcg Gin Ser 1145

cag Gin

tta Leu

att Ile

cca gct ttc ctt gtt

act act gat

4052

Pro Ala 1150

Phe

Leu

Val

Thr Thr 1155

Asp

act

aaa

gca

caa

ggt

ttt

ctt

gcc

tat

gct

ctg

caa

gag

ttt

cta

aag

4100

Thr

Lys

Ala

Gin

Gly

Phe

Leu

Ala

Tyr

Ala

Leu

Gin

Glu

Phe

Leu

Lys

1160

1165

1170

ctt

ggt

gga

ttc

aag

tcc

gca

gtg

att

aat

aaa

aaa

aag

gga

cta

act

4148

Leu

Gly

Gly

Phe

Lys

Ser

Ala

Val

Ile

Asn

Lys

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

1175

1180

1185

gtg

gta

aca

gaa

cat

tgg

atg

tet

ttg

cct

gat

tta

tcc

aaa

cgt

gtg

4196

Val

Val

Thr

Glu

His

Trp

Met

Ser

Leu

Pro

Asp

Leu

Ser

Lys

Arg

Val

1190

1195

1200

ctt

ata

cca

ttt

tta

act

tcc

aag

tat

cat

tta

aca

cca

atc

CCC

aaa

4244

Leu

Ile

Pro

Phe

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Pro

Ile

Pro

Lys

1205

1210

1215

1220

att

gac

att

cgg

tac

cct

att

tat

aaa

gaa

aat

gtt

act

att

cat

act

4292

Ile

Asp

Ile

Arg

Tyr

Pro

Ile

Tyr

Lys

Glu

Asn

Val

Thr

Ile

His

Thr

1225

1230

1235

tgg

atg

cag

ttg

ttt

tet

ctt

aaa

ttg

atg

gag

tac

gcc

cat

tcg

caa

4340

Trp

Met

Gin

Leu

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Met

Glu

Tyr

Ala

His

Ser

Gin

1240

1245

1250

aac

gct

gaa

aaa

ata

ttt

ggt

att

tgt

tcg

aaa

gta

gtg

aaa

gac

caa

4388

Asn

Ala

Glu

Lys

Ile

Phe

Gly

Ile

Cys

Ser

Lys

Val

Val

Lys

Asp

Gin

1255

1260

1265

gag

gtt

aac

att

CCC

tgt

ttt

ctt

ctt

CCC

ttt

ctt

gtt

tta

aat

gtt

4436

Glu

Val

Asn

Ile

Pro

Cys

Phe

Leu

Leu

Pro

Phe

Leu

Val

Leu

Asn

Val

1270

1275

1280

att

tta

acc

gag

tea

gaa

ctg

gaa

gtt

aat

aaa

gtc

att

gaa

gaa

ttc

4484

Ile

Leu

Thr

Glu

Ser

Glu

Leu

Glu

Val

Asn

Lys

Val

Ile

Glu

Glu

Phe

1285

1290

1295

1300

cag

ctt

gtt

att

aat

caa

ccg

gga

cct

gat

gga

tta

aat

tcc

gtg

ggg

4532

Gin

Leu

Val

Ile

Asn

Gin

Pro

Gly

Pro

Asp

Gly

Leu

Asn

Ser

Val

Gly

1305

1310

1315

caa

caa

aga

tac

acc

tea

ttt

gta

gat

gta

ttt

ttt

aag

att

gtg

gat

4580

Gin

Gin

Arg

Tyr

Thr

Ser

Phe

Val

Asp

Val

Phe

Phe

Lys

Ile

Val

Asp

1320

1325

1330

tac

ctt

aac

aaa

tgg

ctt

ege

atg

ega

aag

aag

agg

aat

tgg

gat

aga

4628

Tyr

Leu

Asn

Lys

Trp

Leu

Arg

Met

Arg

Lys

Lys

Arg

Asn

Trp

Asp

Arg

1335

1340

1345

cgt

tet

gcc

att

gca

agg

aaa

gag

aac

cgt

tat

atg

tcg

gtg

gaa

gat

4676

Arg

Ser

Ala

Ile

Ala

Arg

Lys

Glu

Asn

Arg

Tyr

Met

Ser

Val

Glu

Asp

1350 1355 1360 • *

gct acc Ala Thr 1365

tet Ser

ega Arg

gaa tca Glu Ser 1370

tcg Ser

atc Ile

tca Ser

aaa gtt Lys Val 1375

gag Glu

tca Ser

ttt Phe

ctt tet Leu Ser 1380

4724

ega

ttt

cct

tca

aaa

aca

tta

ggt

att

gtc

tet

tta

aat

tgt

gga

ttt

4772

Arg

Phe

Pro

Ser

Lys

Thr

Leu

Gly

Ile

Val

Ser

Leu

Asn

Cys

Gly

Phe

1385

1390

1395

cat

gct

cgt

gca

ttg

ttt

tat

tgg

gag

caa

cac

ata

cgt

aat

gct

aca

4820

His

Ala

Arg

Ala

Leu

Phe

Tyr

Trp

Glu

Gin

His

Ile

Arg

Asn

Ala

Thr

1400

1405

1410

gct

cca

tat

gca

gct

tta

gag

tcc

gat

tat

aga

gtt

ttg

cag

gaa

ata

4868

Ala

Pro

Tyr

Ala

Ala

Leu

Glu

Ser

Asp

Tyr

Arg

Val

Leu

Gin

Glu

Ile

1415

1420

1425

tat

gct

gga

att

gat

gat

cca

gat

gaa

atc

gaa

gca

gtg

tet

tta

aat

4916

Tyr

Ala

Gly

Ile

Asp

Asp

Pro

Asp

Glu

Ile

Glu

Ala

Val

Ser

Leu

Asn

1430

1435

1440

ttc

cat

gat

tac

tcg

ttt

gat

caa

caa

ctc

ctt

tta

cat

gaa

aat

tca

4964

Phe

His

Asp

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gin

Gin

Leu

Leu

Leu

His

Glu

Asn

Ser

1445

1450

1455

1460

gga

aca

tgg

gac

tcg

gct

ttg

agt

tgt

tac

gaa

att

att

att

caa

aag

5012

Gly

Thr

Trp

Asp

Ser

Ala

Leu

Ser

Cys

Tyr

Glu

Ile

Ile

Ile

Gin

Lys

1465

1470

1475

gat

cct

gaa

aat

aaa

aag

gcg

aaa

atc

ggt

ttg

ctt

aac

agc

atg

ctg

5060

Asp

Pro

Glu

Asn

Lys

Lys

Ala

Lys

Ile

Gly

Leu

Leu

Asn

Ser

Met

Leu

1480

1485

1490

caa

tcg

ggg

cat

tat

gaa

tet

ctt

gtt

ttg

agt

tta

gat

tet

ttt

ata

5108

Gin

Ser

Gly

His

Tyr

Glu

Ser

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

Asp

Ser

Phe

Ile

1495

1500

1505

atc

aat

gac

aac

cac

gag

tat

tcg

aag

atg

tta

aat

ttg

ggt

att

gaa

5156

Ile

Asn

Asp

Asn

His

Glu

Tyr

Ser

Lys

Met

Leu

Asn

Leu

Gly

Ile

Glu

1510

1515

1520

gct

tca

tgg

cgt

tcg

cta

tet

att

gat

tcg

tta

aaa

aag

tgt

ctt

tca

5204

Ala

Ser

Trp

Arg

Ser

Leu

Ser

Ile

Asp

Ser

Leu

Lys

Lys

Cys

Leu

Ser

1525

1530

1535

1540

aaa

agc

aac

ttg

gaa

tet

ttc

gaa

gct

aaa

ttg

ggt

agc

ata

ttt

tac

5252

Lys

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Phe

Glu

Ala

Lys

Leu

Gly

Ser

Ile

Phe

Tyr

1545

1550

1555

caa

tac

cta

cgg

aag

gat

tet

ttt

gct

gaa

ttg

acg

gag

cgg

ctg

caa

5300

Gin

Tyr

Leu

Arg

Lys

Asp

Ser

Phe

Tkla

Glu

Leu

Thr

Glu

Arg

Leu

Gin

1560

1565

1570

CCC

ttg

tac

gtt

gat

gct

gct

aca

gca

att

gca

aac

aca

ggc

gcc

cat

5348

Pro

Leu

Tyr

Val

Asp

Ala

Ala

Thr

Ala

Ile

Ala

Asn

Thr

Gly

Ala

His

1575 1580 1585 • ♦ ·

tca gcc tat

gat Asp

tgt Cys

tat Tyr

gat att

tta tet aag

ctg Leu 1600

cac gca

att Ile

aat Asn

5396

Ser Ala 1590

Tyr

Asp 1595

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Ala

gac ttt

agt

agg

att

gct

gaa

act

gac

gga

att

gtt

tcc

gac

aat

ctt

5444

Asp Phe

Ser

Arg

Ile

Ala

Glu

Thr

Asp

Gly

Ile

Val

Ser

Asp

Asn

Leu

1605

1610

1615

1620

gat att

gtt

ctt

cgc

cgt

cgg

ctt

age

caa

gta

gct

ccg

tac

ggt

aaa

5492

Asp Ile

Val

Leu

Arg

Arg

Arg

Leu

Ser

Gin

Val

Ala

Pro

Tyr

Gly

Lys

1625

1630

1635

ttc aag

cac

caa

atc

ctg

tcc

act

cac

tta

gtt

ggc

tat

gaa

aaa

ttt

5540

Phe Lys

His

Gin

Ile

Leu

Ser

Thr

His

Leu

Val

Gly

Tyr

Glu

Lys

Phe

1640

1645

1650

gaa aac

acg

aag

aaa

act

gct

gaa

ata

tat

ctc

gag

att

gca

aga

ata

5588

Glu Asn

Thr

Lys

Lys

Thr

Ala

Glu

Ile

Tyr

Leu

Glu

Ile

Ala

Arg

Ile

1655

1660

1665

tet ega

aaa

aat

ggt

caa

ttt

caa

aga

gcc

ttc

aat

gcc

atc

ctc

aaa

5636

Ser Arg

Lys

Asn

Gly

Gin

Phe

Gin

Arg

Ala

Phe

Asn

Ala

Ile

Leu

Lys

1670

1675

1680

gca atg

gat

tta

gat

aaa

ccg

cta

gca

aca

ata

gag

cac

gca

caa

tgg

5684

Ala Met

Asp

Leu

Asp

Lys

Pro

Leu

Ala

Thr

Ile

Glu

His

Ala

Gin

Trp

1685

1690

1695

1700

tgg tgg

cat

caa

ggg

caa

cat

cgt

aaa

gct

att

tet

gaa

ttg

aat

ttt

5732

Trp Trp

His

Gin

Gly

Gin

His

Arg

Lys

Tkla

Ile

Ser

Glu

Leu

Asn

Phe

1705

1710

1715

tcg ctt

aat

aac

aac

atg

ttt

gat

ttg

gtt

gat

gag

cat

gaa

gaa

aga

5780

Ser Leu

Asn

Asn

Asn

Met

Phe

Asp

Leu

Val

Asp

Glu

His

Glu

Glu

Arg

1720

1725

1730

cct aaa

aat

cgt

aaa

gaa

act

tta

gga

aat

cca

ctt

aaa

gga

aaa

gtg

5828

Pro Lys

Asn

Arg

Lys

Glu

Thr

Leu

Gly

Asn

Pro

Leu

Lys

Gly

Lys

Val

1735

1740

1745

ttc ttg

aaa

ctt

aca

aaa

tgg

ctc

gga

aaa

gct

ggc

caa

ctg

gga

ttg

5876

Phe Leu

Lys

Leu

Thr

Lys

Trp

Leu

Gly

Lys

Ala

Gly

Gin

Leu

Gly

Leu

1750

1755

1760

aag gat

ttg

gag

acg

tat

tat

cat

aaa

gcg

gta

gag

att

tac

tca

gaa

5924

Lys Asp

Leu

Glu

Thr

Tyr

Tyr

His

Lys

Ala

Val

Glu

Ile

Tyr

Ser

Glu

1765

1770

1775

1780

tgt gag

aat

acg

cat

tat

tat

ctt

ggc

cat

cat

ega

gtt

tta

atg

tat

5972

Cys Glu

Asn

Thr

His

Tyr

Tyr

Leu

Gly

His

His

Arg

Val

Leu

Met

Tyr

1785

1790

1795

gaa gaa

gaa

caa

aag

ctc

cca

gtt

aat

gaa

cag

age

gaa

ega

ttt

tta

6020

Glu Glu

Glu

Gin

Lys

Leu

Pro

Val

Asn

Glu

Gin

Ser

Glu

Arg

Phe

Leu

1800 1805 1810

agt Ser

ggt gag tta Gly Glu Leu 1815

gta Val

act Thr

ege ata att

aac gaa

ttt ggt Phe Gly 1825

ega Arg

tet Ser

ttg Leu

6068

Arg Ile 1820

Ile

Asn

Glu

tac

tat

ggt

a ca

aat

cat

ata

tat

gaa

agt

atg

cca

aaa

ttg

ctc

aca

6116

Tyr

Tyr

Gly

Thr

Asn

His

Ile

Tyr

Glu

Ser

Met

Pro

Lys

Leu

Leu

Thr

1830

1835

1840

ctg

tgg

ctt

gat

ttt

ggg

gcc

gaa

gaa

ctt

ege

tta

tet

aaa

gat

gac

6164

Leu

Trp

Leu

Asp

Phe

Gly

Ala

Glu

Glu

Leu

Arg

Leu

Ser

Lys

Asp

Asp

1845

1850

1855

1860

ggc

gaa

aag

tac

ttt

cgt

gaa

cac

att

atc

tet

tcg

aga

aaa

aaa

tet

6212

Gly

Glu

Lys

Tyr

Phe

Arg

Glu

His

Ile

Ile

Ser

Ser

Arg

Lys

Lys

Ser

1865

1870

1875

ttg

gaa

ctt

atg

aat

tcg

aat

gtt

tgt

ege

ctt

tet

atg

aaa

att

cct

6260

Leu

Glu

Leu

Met

Asn

Ser

Asn

Val

Cys

Arg

Leu

Ser

Met

Lys

Ile

Pro

1880

1885

1890

caa

tac

ttt

ttt

ctg

gtt

gca

tta

tcc

caa

atg

ata

tcc

aga

gta

tgc

6308

Gin

Tyr

Phe

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Ser

Gin

Met

Ile

Ser

Arg

Val

Cys

1895

1900

1905

cat

cca

aat

aat

aaa

gtt

tat

aaa

att

ttg

gaa

cat

ata

att

gca

aac

6356

His

Pro

Asn

Asn

Lys

Val

Tyr

Lys

Ile

Leu

Glu

His

Ile

Ile

Ala

Asn

1910

1915

1920

gtt

gta

gca

tet

tat

cct

ggg

gag

acg

cta

tgg

caa

tta

atg

gca

aca

6404

Val

Val

Ala

Ser

Tyr

Pro

Gly

Glu

Thr

Leu

Trp

Gin

Leu

Met

Ala

Thr

1925

1930

1935

1940

ata

aaa

tcg

act

tet

caa

aag

ege

tcg

ctt

cgt

gga

aaa

agc

att

tta

6452

Ile

Lys

Ser

Thr

Ser

Gin

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Lys

Ser

Ile

Leu

1945

1950

1955

aat

gtt

tta

cat

tet

agg

aag

ctt

tet

atg

tet

tcc

aaa

gtt

gat

ata

6500

Asn

Val

Leu

His

Ser

Arg

Lys

Leu

Ser

Met

Ser

Ser

Lys

Val

Asp

Ile

1960

1965

1970

aaa

gca

ctc

agt

caa

tet

gca

att

ctc

att

act

gaa

aag

tta

atc

aat

6548

Lys

Ala

Leu

Ser

Gin

Ser

Ala

Ile

Leu

Ile

Thr

Glu

Lys

Leu

Ile

Asn

1975

1980

1985

ttg

tgc

aat

aca

agg

att

aac

agt

aaa

tet

gta

aaa

atg

agc

tta

aag

6596

Leu

Cys

Asn

Thr

Arg

Ile

Asn

Ser

Lys

Ser

Val

Lys

Met

Ser

Leu

Lys

1990

1995

2000

gat

cat

ttt

cgg

ctt

tet

ttt

gat

gat

ccg

gta

gat

tta

gtc

att

cct

6644

Asp

His

Phe

Arg

Leu

Ser

Phe

Asp

Asp

Pro

Val

Asp

Leu

Val

Ile

Pro

2005

2010

2015

2020

gct

aaa

tca

ttt

tta

gac

att

act

tta

cca

gct

aaa

gat

gct

aac

aga

6692

Ala

Lys

Ser

Phe

Leu Asp

Ile

Thr

Leu

Pro

Ala

Lys

Asp

Tkla

Asn

Arg

2025

2030

2035

·· ·· ·· • · · · • · ·· • · ··· ♦ • ··

9999

gct Ala

agt Ser

cat tat His Tyr 2040

cca Pro

ttt Phe

cca Pro

aaa act Lys Thr 2045

cag Gin

cct Pro

act Thr

ctg ttg aaa

ttt Phe

6740

Leu Leu 2050

Lys

gag

gat

gag

gtg

gat

ata

atg

aac

tet

ctt

caa

aaa

cca

aga

aaa

gtg

6788

Glu

Asp

Glu

Val

Asp

Ile

Met

Asn

Ser

Leu

Gin

Lys

Pro

Arg

Lys

Val

2055

2060

2065

tac

gtt

aga

ggt

a cg

gat

ggc

aac

tta

tac

cca

ttc

ttg

tgc

aaa

CCC

6836

Tyr

Val

Arg

Gly

Thr

Asp

Gly

Asn

Leu

Tyr

Pro

Phe

Leu

Cys

Lys

Pro

2070

2075

2080

aaa

gat

gat

ctt

cgt

aag

gat

gct

aga

ttg

atg

gaa

ttt

aat

aat

ctt

6884

Lys

Asp

Asp

Leu

Arg

Lys

Asp

Ala

Arg

Leu

Met

Glu

Phe

Asn

Asn

Leu

2085

2090

2095

2100

att

tgt

aaa

ata

ttg

agg

aaa

gat

caa

gaa

gcg

aac

aga

agg

aac

ttg

6932

Ile

Cys

Lys

Ile

Leu

Arg

Lys

Asp

Gin

Glu

Tkla

Asn

Arg

Arg

Asn

Leu

2105

2110

2115

tgt

att

aga

act

tat

gtt

gtt

att

cct

tta

aat

gaa

gaa

tgc

gga

ttt

6980

Cys

Ile

Arg

Thr

Tyr

Val

Val

Ile

Pro

Leu

Asn

Glu

Glu

Cys

Gly

Phe

2120

2125

2130

atc

gaa

tgg

gta

aat

cat

act

cgt

cca

ttt

aga

gaa

att

ttg

tta

aaa

7028

Ile

Glu

Trp

Val

Asn

His

Thr

Arg

Pro

Phe

Arg

Glu

Ile

Leu

Leu

Lys

2135

2140

2145

agc

tat

aga

cag

aaa

aac

att

CCC

ata

tca

tat

caa

gaa

atc

aaa

gtt

7076

Ser

Tyr

Arg

Gin

Lys

Asn

Ile

Pro

Ile

Ser

Tyr

Gin

Glu

Ile

Lys

Val

2150

2155

2160

gat

tta

gac

ttt

gca

ctg

ega

agt

cct

aac

cct

ggt

gat

ata

ttt

gaa

7124

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Leu

Arg

Ser

Pro

Asn

Pro

Gly

Asp

Ile

Phe

Glu

2165

2170

2175

2180

aag

aaa

atc

tta

ccg

aaa

ttt

cct

cca

gtt

ttt

tat

gag

tgg

ttt

gtt

7172

Lys

Lys

Ile

Leu

Pro

Lys

Phe

Pro

Pro

Val

Phe

Tyr

Glu

Trp

Phe

Val

2185

2190

2195

gaa

tet

ttc

cca

gaa

cca

aat

aat

tgg

gtt

act

agt

aga

caa

aac

tat

7220

Glu

Ser

Phe

Pro

Glu

Pro

Asn

Asn

Trp

Val

Thr

Ser

Arg

Gin

Asn

Tyr

2200

2205

2210

tgc

ega

act

tta

gca

gta

atg

tca

ata

gtt

ggc

tac

gtt

ttg

ggt

ttg

7268

Cys

Arg

Thr

Leu

Ala

Val

Met

Ser

Ile

Val

Gly

Tyr

Val

Leu

Gly

Leu

2215

2220

2225

gga

gat

ege

cat

ggc

gaa

aac

ata

ttg

ttt

gat

gaa

ttt

aca

ggt

gaa

7316

Gly

Asp

Arg

His

Gly

Glu

Asn

Ile

Leu

Phe

Asp

Glu

Phe

Thr

Gly

Glu

2230

2235

2240

gct

atc

cat

gtc

gat

ttc

aac

tgt

ctt

ttt

gat

aaa

ggt

ctt

act

ttt

7364

Ala

Ile

His

Val

Asp

Phe

Asn

Cys

Leu

Phe

Asp

Lys

Gly

Leu

Thr

Phe

2245

2250

2255

2260

• ·	• ·	·♦	·♦	·♦	«·
•	•	• e	•	•	• ·	• *	• ·
• ·	• ·	•	•	• ·	Φ ·	• ·
•	•	···	• ·	•	• · · *	···	···
•	•	•	•	•	*	•	•
··	·♦	• ♦	• ·	♦ ♦	• ·

gaa Glu

aaa Lys

cct Pro

gaa aag Glu Lys 2265

gtg Val

ccg Pro

ttc Phe

aga tta act Arg Leu Thr 2270

cat His

aat Asn

atg gta Met Val 2275

gat Asp

7412

gca

atg

ggt

ccg

aca

ggt

tat

gaa

ggg

ggt

ttc

agg

aaa

get

age

gaa

7460

Ala

Met

Gly

Pro

Thr

Gly

Tyr

Glu

Gly

Gly

Phe

Arg

Lys

Ala

Ser

Glu

2280

2285

2290

ata

acg

atg

cgg

ctt

ctt

ege

tea

aac

caa

gat

aca

ttg

atg

age

gta

7508

Ile

Thr

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Ser

Asn

Gin

Asp

Thr

Leu

Met

Ser

Val

2295

2300

2305

cta

gag

tet

ttc

cta

cat

gat

cct

tta

gtc

gag

tgg

aat

aga

aag

aag

7556

Leu

Glu

Ser

Phe

Leu

His

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Trp

Asn

Arg

Lys

Lys

2310

2315

2320

tcg

tea

age

aag

tac

ccg

aat

aat

gaa

gca

aat

gaa

gtt

ttg

gat

ata

7604

Ser

Ser

Ser

Lys

Tyr

Pro

Asn

Asn

Glu

Ala

Asn

Glu

Val

Leu

Asp

Ile

2325

2330

2335

2340

att

ege

aaa

aaa

ttt

caa

ggc

ttt

atg

cca

ggg

gag

acg

ata

cct

tta

7652

Ile

Arg

Lys

Lys

Phe

Gin

Gly

Phe

Met

Pro

Gly

Glu

Thr

Ile

Pro

Leu

2345

2350

2355

tet

att

gaa

ggg

caa

att

caa

gaa

ttg

atc

aaa

tet

get

gtc

aac

cca

7700

Ser

Ile

Glu

Gly

Gin

Ile

Gin

Glu

Leu

Ile

Lys

Ser

Ala

Val

Asn

Pro

2360

2365

2370

aaa

aac

ctg

gta

gaa

atg

tac

att

ggt

tgg

get

get

tat

ttc

7742

Lys

Asn

Leu

Val

Glu

Met

Tyr

Ile

Gly

Trp

Ala

Ala

Tyr

Phe

2375	2380		2385
tagcatttta	ctaacaaaaa	tttcaatgaa	caagctaccc	attattaaac	ttatgatttg	7802
aatcgaagat	attttattta	ttaatccgat	gaagaattct	cgctgagttg	ttcaatttct	7862
tgtaattttc	cttccatttc	taaatcgtcg	attcgcttaa	atagggcact	ggctttttgt	7922
gcatttttct	ctcgtaaagc	agettetgat	tgaaaaaaag	ctatatctgt	ttctgagtca	7982
tcatccgaat	caacaatata	ttttgcagat	cgacctgcag			8022

<210> 4 <211> 2386 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met 1

Ser

Gin

His

Ala 5

Lys

Arg

Lys

Ala

Gly 10

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser 15

Pro

Arg

Gly

Leu

Asp 20

Asp

Arg

Gin

Ala

Phe 25

Gly

Gin

Leu

Leu

Lys 30

Glu

Val

Leu

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

His

Glu

Leu

Gly

Arg

Ser

Asn

Ser

Leu

Pro

40 45 ·· ·· ·« • · · · · ♦ • · · t ·· • · ··« · ·♦ • · · *· ·· ··♦· ·♦ ·· ·· • · · ♦ ··

9 9 9 99

999 9 999999

99

9999

Ser Met Thr Ser

Glu

Leu Val 55

Glu

Val

Leu

Ile

Glu Val 60

Gly

Leu

Leu

50

Ala

Phe

Lys

His

Asp

Asp

Ser

Lys

Ser

Glu

Phe

Ile

Ser

Pro

Lys

Met

65

70

75

80

Leu

Lys

Glu

Ala

His

Leu

Ser

Leu

Gin

Ala

Leu

Met

Leu

Ile

Leu

Lys

85

90

95

Arg

Ser

Pro

Thr

Val

Leu

Arg

Glu

Ile

Lys

Ser

Ser

Val

Thr

Leu

Leu

100

105

110

Asp

Trp

Ile

Leu

Pro

Arg

Thr

Ile

Ser

Leu

Phe

Ala

Asp

Ile

Arg

Phe

115

120

125

Ile

Lys

Leu

Phe

Asp

Ser

Leu

Lys

Glu

Phe

His

Lys

Leu

Ile

Tyr

Gin

130

135

140

Leu

Ile

Ser

Glu

Lys

Ser

Phe

Leu

Trp

Asp

Leu

Tyr

Ala

Ser

Phe

Met

145

150

155

160

Arg

Tyr

Trp

Lys

Tyr

Tyr

Ile

Thr

Asn

Val

Ser

Ser

Ile

Val

Leu

Gin

165

170

175

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Phe

Pro

Tyr

Lys

Met

Pro

Ser

Pro

Asn

Ser

Gin

180

185

190

Pro

Leu

Gin

Ser

Ile

Ser

Pro

Asn

Tyr

Pro

Thr

His

Arg

Glu

Asp

Lys

195

200

205

Phe

Asp

Leu

Leu

Ile

Ile

Asn

Ile

Glu

Glu

Ala

Cys

Thr

Phe

Phe

Phe

210

215

220

Glu

Ser

Ala

His

Phe

Phe

Ala

Gin

Cys

Ser

Tyr

Leu

Lys

Lys

Ser

Asn

225

230

235

240

Phe

Pro

Ser

Pro

Pro

Leu

Phe

Thr

Ala

Trp

Thr

Trp

Ile

Lys

Pro

Cys

245

250

255

Phe

Phe

Asn

Phe

Val

Ile

Leu

Leu

Lys

Arg

Ile

Ser

Ile

Gly Asp

Ser

260

265

270

Gin

Leu

Phe

Leu

His

Leu

His

Ser

Arg

Ile

Val

Gin

Thr

Leu

Cys

Cys

275

280

285

Phe

Ser

Leu

Asn

Phe

Ile

Tyr

His

Gly

Leu

Pro

Ile

Cys

Glu

Lys

Ser

290

295

300

Lys

His

Ile

Leu

Met

Ser

Ser

Ile

Asn

Leu

Thr

Leu

Gly

Ser

Leu

Lys

305

310

315

320

Lys

Thr

Tyr

Thr

Val

Ala

Asn

Thr

Ala

Ile

Ser

Leu

Phe

Phe

Leu

Ser

325

330

335

Leu

Phe

Val

Leu

Pro

Lys

Thr

Val

Ala

Gly

Leu

Phe

Tyr

Pro

Phe

Gly

340

345

350

•9 •·

9 9999

99

9999

9999

9 99

9 99

9999

99

9999

Val

Ser Leu 355

Leu

Ser

Asp

Phe

Lys 360

Val

Leu Glu

Gin

Leu 365

Glu

Pro

Asp

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys

Ala

Ile

Ile

Leu

Phe

Lys

Cys

Arg

Tyr

Gin

Ser

370

375

380

Ser

Glu

Ile

Asp

Gin

Thr

Thr

Leu

Arg

Ala

Phe

Gly

Glu

Ile

Cys

Thr

385

390

395

400

Gly

Lys

Leu

Glu

Asn

Thr

Leu

Phe

Ser

Asn

Ser

Glu

Leu

Asn

Leu

Phe

405

410

415

Leu

Leu

His

Tyr

Leu

Ser

Leu

Asp

Asn

Asp

Leu

Ser

Asn

Ile

Leu

Lys

420

425

430

Val

Asp

Phe

Gin

Asn

Gly

His

Asn

Ile

Cys

Thr

Phe

Ala

Lys

Trp

Cys

435

440

445

Ile

Asn

Asn

Asn

Leu

Asp

Glu

Pro

Ser

Asn

Leu

Lys

His

Phe

Arg

Glu

450

455

460

Met

Leu

Asp

Tyr

Tyr

Ser

Ser

His

Asn

Val

Thr

Ile

Ser

Glu

Asp

Asp

465

470

475

480

Leu

Lys

Asn

Phe

Ser

Leu

Val

Leu

Cys

Thr

His

Val

Ala

Lys

Val

Asn

485

490

495

Glu

Lys

Thr

Asn

Ser

Ile

Phe

Arg

Thr

Tyr

Glu

Val

His

Gly

Cys

Glu

500

505

510

Val

Cys

Asn

Ser

Phe

Cys

Leu

Leu

Phe

Asp

Glu

Arg

Ser

Pro

Phe

Lys

515

520

525

Ile

Pro

Tyr

His

Glu

Leu

Phe

Cys

Ala

Leu

Leu

Lys

Asn

Pro

Asp

Ile

530

535

540

Ile

Ser

Ser

Ser

Val

Lys

Gin

Ser

Leu

Leu

Leu

Asp

Gly

Phe

Phe

Arg

545

550

555

560

Trp

Ser

Gin

His

Cys

Ser

Asn

Phe

Asn

Lys

Glu

Ser

Met

Leu

Ser

Leu

565

570

575

Arg

Glu

Phe

Ile

Met

Lys

Ala

Leu

Ala

Ser

Thr

Ser

Arg

Cys

Leu

Arg

580

585

590

Val

Val

Ala

Ala

Lys

Val

Leu

Pro

Ile

Phe

Ile

Lys

Gly

Pro

Asn

Asn

595

600

605

Leu

Asp

Ile

Val

Glu

Phe

His

Lys

Glu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ile

Phe

Asn

610

615

620

Thr

Leu

Lys

Ile

Leu

Ala

Val

Glu

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Glu

Thr

Val

625

630

635

640

Ile

Leu

Ser

Trp

Ile

Ser

Leu

Ser

Arg

Val

Val

Glu

Glu

Glu

Glu

Leu

645

650

655

1* ·

His

Phe

Val

Leu 660

Leu Glu Val

Ile

Ser 665

Ser

Val

Ile

Asn Ser 670

Gly

Ile

Phe

Tyr

Gin

Gly

Ile

Gly

Leu

Ser

Ala

Leu

Gin

Gin

Ile

Ala

Ser

Thr

675

680

685

Arg

His

Ile

Ser

Val

Trp

Gin

Leu

Leu

Ser

Pro

Tyr

Trp

Pro

Thr

Val

690

695

700

Ser

Val

Ala

Ile

Val

Gin

Gly

Met

Gly

Lys

Lys

Pro

Asn

Ile

Ala

Ser

705

710

715

720

Leu

Phe

Ala

Gin

Leu

Met

Asn

Ile

Ser

Glu

Gly

Asp

Phe

Leu

Ile

Arg

725

730

735

Thr

Gin

Ala

Tyr

Thr

Leu

Pro

Phe

Leu

Val

Leu

Thr

Lys

Asn

Lys

Ala

740

745

750

Leu

Ile

Val

Arg

Ile

Ala

Glu

Leu

Ser

Gin

Ser

Asp

Val

Ala

Thr

Leu

755

760

765

Cys

Leu

Thr

Asn

Met

His

Lys

Ile

Leu

Ala

Ser

Leu

Leu

Thr

Thr

Asp

770

775

780

His

Pro

Asn

Leu

Glu

Glu

Ser

Val

Met

Leu

Leu

Leu

Ser

Leu

Ala

Thr

785

790

795

800

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

Val

Asp

Leu

Thr

Ser

Leu

Leu

Arg

Ser

Asp

Pro

805

810

815

Ile

Ser

Ile

Thr

Val

Glu

Leu

Leu

Gin

Leu

Tyr

Gin

Asn

Asp

Val

Pro

820

825

830

His

Glu

Lys

Ile

Glu

Asn

Tkla

Leu

Arg

Lys

Val

Ala

Met

Ile

Val

Ser

835

840

845

Gin

Val

Val

Asn

Asp

Glu

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Glu

Leu

Leu

Tyr

Asp

850

855

860

Phe

Phe

Asn

Asn

His

Ile

Leu

Gly

Ile

Leu

Ala

Glu

Phe

Ser

Asn

Ile

865

870

875

880

Leu

Asn

Asp

Leu

Lys

Gly

Lys

Thr

Ser

Ile

Asn

Glu

Lys

Ile

Lys

Thr

885

890

895

Ile

Val

Gly

Ile

Glu

Lys

Met

Leu

Ser

Leu

Cys

Gly

Gly

Ala

Val

Lys

900

905

910

Leu

Gly

Leu

Pro

Gin

Ile

Leu

Ser

Asn

Leu

Gin

Ser

Ala

Phe

Gin

Asn

915

920

925

Glu

His

Leu

Arg

Phe

Tyr

Ala

Ile

Lys

Ala

Trp

Phe

Ser

Leu

Ile

Leu

930

935

940

Ala

Thr

Lys

Glu

Pro

Glu

Tyr

Ser

Ser

Ile

Ala

Gly

Leu

Ser

Leu

Val

945

950

955

960

Ile Leu	Pro	Pro	Leu 965	Phe	Pro Tyr Leu Glu 970	Pro	Gin	Glu Ala	Glu 975	Leu
Val Ile	Gin	Ile	Phe	Asp	Phe Ile Ser Ser	Asp	Thr	His Lys	Cys	Leu
		980			985			990
Gin Gly	Leu	Lys	Trp	Ala	Ile Pro Thr Ser	Leu	Asp	Ser Ala	Cys	Phe
	995				1000		1005
Ser Leu	Lys	Ala	Lys	Glu	Ile Phe Cys Ser	Leu	Gin	Asn Glu	Asp	Phe
1010				1015	1020
Tyr Ser	Glu	Leu	Gin	Ser	Ile Ile Lys Cys	Leu	Thr	Asn Glu	Asn	Glu
025			1030	1035			1040
Pro Val	Cys	Tyr	Leu	Gly	Leu Gin Lys Leu	Glu	Leu	Phe Phe	Gin	Ala
			1045	1050			1055
Lys Val	Asp	Glu	Leu	His	Asp Thr Leu Asn	Leu	Asp	Ile Ser	Asn	Glu
	1060			1065			1070
Val Leu	Asp	Gin	Leu	Leu	Arg Cys Leu Leu	Asp	Cys	Cys Val	Lys	Tyr
1075				1080		1085
Ala Ser	Thr	Asn	Met	Gin	Ile Ser Tyr Leu	Ala	Ala	Lys Asn	Leu	Gly
1090				1095	1100
Glu Leu	Gly	Ala	Ile	Asp	Pro Ser Arg Ala	Lys	Ala	Gin His	Ile	Ile
105			1110	1115			1120
Lys Glu	Thr	Val	Val	Leu	Asp Asn Phe Glu	Asn	Gly	Glu Glu	Ser	Leu
			1125	1130			1135
Lys Phe	Ile	Leu	Asp	Phe	Met Gin Ser Gin	Leu	Ile	Pro Ala	Phe	Leu
	1140			1145			1150
Val Thr	Thr	Asp	Thr	Lys	Ala Gin Gly Phe	Leu	Ala	Tyr Ala	Leu	Gin
1155				1160		1165
Glu Phe	Leu	Lys	Leu	Gly	Gly Phe Lys Ser	Ala	Val	Ile Asn	Lys	Lys
1170				1175	1180
Lys Gly	Leu	Thr	Val	Val	Thr Glu His Trp	Met	Ser	Leu Pro	Asp	Leu
185			1190	1195			1200
Ser Lys	Arg	Val	Leu	Ile	Pro Phe Leu Thr	Ser	Lys	Tyr His	Leu	Thr
			1205	1210			1215
Pro Ile	Pro	Lys	Ile	Asp	Ile Arg Tyr Pro	Ile	Tyr	Lys Glu	Asn	Val
	1220			1225			1230
Thr Ile	His	Thr	Trp	Met	Gin Leu Phe Ser	Leu	Lys	Leu Met	Glu	Tyr
1235				1240		1245
Ala His	Ser	Gin	Asn	Ala	Glu Lys Ile Phe	Gly	Ile	Cys Ser	Lys	Val

1250 1255 1260 • · φ ♦ φ · φφ φ» φ* φ · · φ φφφφ φ φ φ φ φφφ* φ φφφ «φφφ φ φ φφφ φ φ « φφφ φ φφφ ·Φ· φφφφφφ φφ φφ φφ φφ ·· φφ φφ

Val 265	Lys Asp	Gin Glu Val Asn 1270	Ile	Pro	Cys	Phe 1275	Leu Leu	Pro	Phe	Leu 1280
Val	Leu Asn	Val Ile Leu Thr	Glu	Ser	Glu	Leu	Glu Val	Asn	Lys	Val
		1285			1290				1295
Ile	Glu Glu	Phe Gin Leu Val	Ile	Asn	Gin	Pro	Gly Pro	Asp	Gly	Leu
		1300		1305				1310
Asn	Ser Val	Gly Gin Gin Arg	Tyr	Thr	Ser	Phe	Val Asp	Val	Phe	Phe
	1315	1320				1325
Lys	Ile Val	Asp Tyr Leu Asn	Lys	Trp	Leu	Arg	Met Arg	Lys	Lys	Arg
	1330	1335				1340
Asn	Trp Asp	Arg Arg Ser Ala	Ile	Ala	Arg	Lys	Glu Asn	Arg	Tyr	Met
345		1350			1355			1360
Ser	Val Glu	Asp Ala Thr Ser	Arg	Glu	Ser	Ser	Ile Ser	Lys	Val	Glu
		1365		1370			1375
Ser	Phe Leu	Ser Arg Phe Pro	Ser	Lys	Thr	Leu	Gly Ile	Val	Ser	Leu
	1380	1385			1390
Asn	Cys Gly	Phe His Ala Arg	Ala	Leu	Phe	Tyr	Trp Glu	Gin	His	Ile
	1395	1400				1405
Arg	Asn Ala	Thr Ala Pro Tyr	Ala	Ala	Leu	Glu	Ser Asp	Tyr	Arg	Val
1410	1415				1420
Leu	Gin Glu	Ile Tyr Ala Gly	Ile	Asp	Asp	Pro	Asp Glu	Ile	Glu	Ala
425		1430			1435			1440
Val	Ser Leu	Asn Phe His Asp	Tyr	Ser	Phe	Asp	Gin Gin	Leu	Leu	Leu
		1445		1450			1455
His	Glu Asn	Ser Gly Thr Trp	Asp	Ser	Ala	Leu	Ser Cys	Tyr	Glu	Ile
	1460	1465			1470
Ile	Ile Gin	Lys Asp Pro Glu	Asn	Lys	Lys	Ala	Lys Ile	Gly	Leu	Leu
	1475	1480				1485
Asn	Ser Met	Leu Gin Ser Gly	His	Tyr	Glu	Ser	Leu Val	Leu	Ser	Leu
1490	1495				1500
Asp	Ser Phe	Ile Ile Asn Asp	Asn	His	Glu	Tyr	Ser Lys	Met	Leu	Asn
505		1510			1515			1520
Leu	Gly Ile	Glu Ala Ser Trp	Arg	Ser	Leu	Ser	Ile Asp	Ser	Leu	Lys
		1525		1530			1535
Lys	Cys Leu	Ser Lys Ser Asn	Leu	Glu	Ser	Phe	Glu Ala	Lys	Leu	Gly
	1540	1545			1550
Ser	Ile Phe	Tyr Gin Tyr Leu	Arg	Lys	Asp	Ser	Phe Ala	Glu	Leu	Thr

1555 1560 1565

Glu Arg 1570	Leu	Gin Pro	Leu Tyr Val Asp Ala Ala Thr	Ala Ile	Ala	Asn
1575	1580
Thr Gly	Ala	His Ser	Ala Tyr Asp	Cys Tyr Asp Ile	Leu Ser	Lys	Leu
585			1590	1595			1600
His Ala	Ile	Asn Asp	Phe Ser Arg	Ile Ala Glu Thr	Asp Gly	Ile	Val
		1605	1610	1615
Ser Asp	Asn	Leu Asp	Ile Val Leu	Arg Arg Arg Leu	Ser Gin	Val	Ala
	1620	1625	1630
Pro Tyr	Gly	Lys Phe	Lys His Gin	Ile Leu Ser Thr	His Leu	Val	Gly
1635		1640	1645
Tyr Glu	Lys	Phe Glu	Asn Thr Lys	Lys Thr Ala Glu	Ile Tyr	Leu	Glu
1650			1655	1660
Ile Ala	Arg	Ile Ser	Arg Lys Asn	Gly Gin Phe Gin	Arg Ala	Phe	Asn
665			1670	1675			1680
Ala Ile	Leu	Lys Ala	Met Asp Leu	Asp Lys. Pro Leu	Ala Thr	Ile	Glu
		1685	1690	1695
His Ala	Gin	Trp Trp	Trp His Gin	Gly Gin His Arg	Lys Ala	Ile	Ser
	1700	1705	1710
Glu Leu	Asn	Phe Ser	Leu Asn Asn	Asn Met Phe Asp	Leu Val	Asp	Glu
1715		1720	1725
His Glu	Glu	Arg Pro	Lys Asn Arg	Lys Glu Thr Leu	Gly Asn	Pro	Leu
1730			1735	1740
Lys Gly	Lys	Val Phe	Leu Lys Leu	Thr Lys Trp Leu	Gly Lys	Ala	Gly
745		1750	1755		1760
Gin Leu	Gly	Leu Lys	Asp Leu Glu	Thr Tyr Tyr His	Lys Ala	Val	Glu
		1765	1770	1775
Ile Tyr	Ser	Glu Cys	Glu Asn Thr	His Tyr Tyr Leu	Gly His	His	Arg
	1780	1785	1790
Val Leu	Met	Tyr Glu	Glu Glu Gin	Lys Leu Pro Val	Asn Glu	Gin	Ser
1795		1800	1805
Glu Arg	Phe	Leu Ser	Gly Glu Leu	Val Thr Arg Ile	Ile Asn	Glu	Phe
1810			1815	1820
Gly Arg	Ser	Leu Tyr	Tyr Gly Thr	Asn His Ile Tyr	Glu Ser	Met	Pro
825		1830	1835		1840
Lys Leu	Leu	Thr Leu	Trp Leu Asp	Phe Gly Ala Glu	Glu Leu	Arg	Leu
		1845	1850	1855
Ser Lys	Asp	Asp Gly	Glu Lys Tyr	Phe Arg Glu His	Ile Ile	Ser	Ser

1860 1865 1870 ···· • » «· • · · * • ·· φφ • ·· ·· φφ

Φ*

Φ « Φ Φ « · · ·

Φ Φ · ΦΦΦ

Φ * · ·· ··

Arg Lys	Lys 1875	Ser	Leu Glu Leu Met 1880	Asn Ser	Asn	Val Cys Arg 1885	Leu	Ser
Met Lys	Ile	Pro	Gin Tyr Phe Phe	Leu Val	Ala	Leu Ser Gin	Met	Ile
1890			1895		1900
Ser Arg	Val	Cys	His Pro Asn Asn	Lys Val	Tyr	Lys Ile Leu	Glu	His
905			1910		1915		1920
Ile Ile	Ala	Asn	Val Val Ala Ser	Tyr Pro	Gly	Glu Thr Leu	Trp	Gin
			1925	1930		1935
Leu Met	Ala	Thr	Ile Lys Ser Thr	Ser Gin	Lys	Arg Ser Leu	Arg	Gly
	1940	1945		1950
Lys Ser	Ile	Leu	Asn Val Leu His	Ser Arg	Lys	Leu Ser Met	Ser	Ser
	1955		1960			1965
Lys Val	Asp	Ile	Lys /Via Leu Ser	Gin Ser	Ala	Ile Leu Ile	Thr	Glu
1970			1975		1980
Lys Leu	Ile	Asn	Leu Cys Asn Thr	Arg Ile	Asn	Ser Lys Ser	Val	Lys
985			1990	1995		2000
Met Ser	Leu	Lys	Asp His Phe Arg	Leu Ser	Phe	Asp Asp Pro	Val	Asp
			2005	2010		2015
Leu Val	Ile	Pro	Ala Lys Ser Phe	Leu Asp	Ile	Thr Leu Pro	Ala	Lys
	2020	2025		2030
Asp Ala	Asn	Arg	Ala Ser His Tyr	Pro Phe	Pro	Lys Thr Gin	Pro	Thr
2035		2040			2045
Leu Leu	Lys	Phe	Glu Asp Glu Val	Asp Ile	Met	Asn Ser Leu	Gin	Lys
2050			2055		2060
Pro Arg	Lys	Val	Tyr Val Arg Gly	Thr Asp	Gly	Asn Leu Tyr	Pro	Phe
065			2070	2075		2080
Leu Cys	Lys	Pro	Lys Asp Asp Leu	Arg Lys	Asp	Ala Arg Leu	Met	Glu
			2085	2090		2095
Phe Asn	Asn	Leu	Ile Cys Lys Ile	Leu Arg	Lys	Asp Gin Glu	Ala	Asn
	2100	2105		2110
Arg Arg	Asn	Leu	Cys Ile Arg Thr	Tyr Val	Val	Ile Pro Leu	Asn	Glu
2115		2120			2125
Glu Cys	Gly	Phe	Ile Glu Trp Val	Asn His	Thr	Arg Pro Phe	Arg	Glu
2130			2135		2140
Ile Leu	Leu	Lys	Ser Tyr Arg Gin	Lys Asn	Ile	Pro Ile Ser	Tyr	Gin
145			2150	2155		2160
Glu Ile	Lys	Val	Asp Leu Asp Phe	Ala Leu	Arg	Ser Pro Asn	Pro	Gly

2165 2170 2175

··	··	• to	*·	··	··
•	to	• ·	• ·	• ·	* ·	• ·
• ·	• ·	•	•	• ·	• ·	• ·
•	•	• toto ·	•	•	···	• ···	• · ·
•	•	•	•	•	•	•	•
·«	··	··	··	··	• to

Asp

Ile

Phe Glu 2180

Lys

Lys

Ile

Leu Pro 2185

Lys

Phe

Pro

Pro Val 2190

Phe Tyr

Glu

Trp

Phe

Val

Glu

Ser

Phe

Pro

Glu

Pro

Asn

Asn

Trp

Val

Thr

Ser

2195

2200

2205

Arg

Gin

Asn

Tyr

Cys

Arg

Thr

Leu

Ala

Val

Met

Ser

Ile

Val

Gly

Tyr

2210

2215

2220

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Asp

Arg

His

Gly

Glu

Asn

Ile

Leu

Phe

Asp

Glu

225

2230

2235

2240

Phe

Thr

Gly

Glu

Ala

Ile

His

Val

Asp

Phe

Asn

Cys

Leu

Phe

Asp

Lys

2245

2250

2255

Gly

Leu

Thr

Phe

Glu

Lys

Pro

Glu

Lys

Val

Pro

Phe

Arg

Leu

Thr

His

2260

2265

2270

Asn

Met

Val

Asp

Ala

Met

Gly

Pro

Thr

Gly

Tyr

Glu

Gly

Gly

Phe

Arg

2275

2280

2285

Lys

Ala

Ser

Glu

Ile

Thr

Met

Arg

Leu

Leu

Arg

Ser

Asn

Gin

Asp

Thr

2290

2295

2300

Leu

Met

Ser

Val

Leu

Glu

Ser

Phe

Leu

His

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Trp

305

2310

2315

2320

Asn

Arg

Lys

Lys

Ser

Ser

Ser

Lys

Tyr

Pro

Asn

Asn

Glu

Ala

Asn

Glu

2325

2330

2335

Val

Leu

Asp

Ile

Ile

Arg

Lys

Lys

Phe

Gin

Gly

Phe

Met

Pro

Gly

Glu

2340

2345

2350

Thr

Ile

Pro

Leu

Ser

Ile

Glu

Gly

Gin

Ile

Gin

Glu

Leu

Ile

Lys

Ser

2355

2360

2365

Ala

Val

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Val

Glu

Met

Tyr

Ile

Gly Trp

Ala

Ala

2370 2375 2380

Claims (14)

1. Polynukleotid hybridizace s ve značně izolované formě, schopný selektivní

   Seq.ID No.l nebo jejím komplementem.

   Polynukleotid část.

   podle nároku 1, zahrnující Seq.ID No.l nebo její

   3.

   Polynukleotidová sonda, která polynukleotidu podle nároků 1 zahrnuje část alespoň 15 nukleotidů a 2.

   Polynukleotid ve značně izolované formě, zahrnující Seq.ID No.3 nebo její komplement.
2. 5. Polypeptid ve značně izolované formě, zahrnující buď sekvence popsané v Seq ID Nos.2 nebo 4, nebo polypeptid značně homologní k těmto sekvencím nebo část polypeptidu Seq. ID No.2.
3. 6. Polynukleotid ve značně izolované formě kódující polypeptid podle nároku 5.
4. 7. Vektor nesoucí polynukleotid definovaný v nárocích 1,2 nebo 6.
5. 8. Protilátky schopné vázat polypeptid Seq.ID. No.2 nebo jeho část.
6. 9. Metoda detekce přítomnosti či nepřítomnosti polynukleotidu podle nároku 1 ve vzorcích lidských nebo živočišných tkání. Metoda zahrnuje kontakt vzorků lidských nebo živočišných tkání obsahujících DNA nebo RNA se sondou obsahující polynukleotid nebo primer podle nároku 1 za hybridizačních podmínek a detekci jakéhokoliv duplexu vytvořeného mezi sondou a nukleovou kyselinou ve vzorku.
7. 10.Metoda detekce polypeptidu podle nároku 6 přítomných v biologických vzorcích. Metoda zahrnuje:

   a) zajištění protilátek podle nároku 7 ·« »···

   b) inkubaci biologických vzorků s výše zmíněnými protilátkami za podmínek, které dovolí tvorbu komplexu protilátka - antigen

   c) určení, zdali se komplex protilátka - antigen zahrnující výše zmíněné protilátky vytvořil.
8. 11. Analytická metoda pro plošné určování potencionálně vhodných látek pro protirakovinovou terapii. Metoda zahrnuje:

   a) zajištění polypeptidů popsaného ve vynálezu, který si uchoval lipidkinázovou aktivitu a substrátu pro danou kinázu za * podmínek a s takovými reagenciemi, že aktivita bude působit na daný substrát

   b) kontakt uvedených polypeptidů substrátu a slibných látek

   c) měření stupně snížení kinázové aktivity polypeptidů

   d) selekci vhodných látek, které způsobili snížení aktivity
9. 12. Analytická metoda pro plošné určování potencionálně vhodných látek pro protirakovinovou terapii. Metoda zahrnuje:

   a) I.inkubaci polypeptidů popsaného ve vynálezu s dalším polypeptidem popsaným ve vynálezu, který může být stejný nebo odlišný od prvního polypeptidů za podmínek, které dovolují prvnímu polypetidu navázat se na druhý polypeptid a vytvořit komplex

   II.kontakt takto vzniklého komplexu s vhodnými látkami 'w nebo

   a) inkubaci polypeptidů popsaného ve vynálezu s dalším polypeptidem popsaným ve vynálezu, který může být stejný nebo odlišný od prvního polypeptidů za podmínek, které dovolují prvnímu polypetidu navázat se na druhý polypeptid a vytvořit komplex za přítomnosti vhodné látky

   b) stanovení zdali vhodná látka inhibuje vazbu prvního polypeptidů na druhý polypeptid

   c) selekci vhodné látky, která inhibuje vazbu prvního polypeptidů na druhý polypeptid.

   • e *··· r · · • · *
10. 13. Metoda podle nároku 12, u které může být první zmíněný polypeptid odlišen od druhého zmíněného polypeptidů.
11. 14. Metoda léčení rakoviny u pacientů, která zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivních množství slibných látek selektovaných metodou podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 výše zmíněným pacientům.
12. 15. Metoda zvýšení citlivosti rakovinných buněk pacienta k chemoterapii a/nebo radioterapii. Tato metoda zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivních množství slibných látek selektovaných metodou podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 výše zmíněným pacientům.
13. 16. Použití potencionálně vhodných látek selektovaných metodou podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 k léčení rakoviny.
14. 17. Použití potencionálně vhodných látek selektovaných metodou podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 ke zvýšení citlivosti rakovinných buněk k chemoterapii a/nebo radioterapii.