CZ69596A3

CZ69596A3 - Application of amylin, amylin agonist, amylin analog agonist or amylin antagonist for preparing a pharmaceutical preparation used for the control of gastrointestinal motility

Info

Publication number: CZ69596A3
Application number: CZ96695A
Authority: CZ
Inventors: Orville G Kolterman; Andrew A Young; Timothy J Rink; Kathleen Keiting Brown
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-09-07
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1997-06-11
Also published as: WO1995007098A1; DK0717635T3; NO960899L; HUT73490A; CN1134110A; PT717635E; DE69426304T2; EP0717635B1; US6114304A; US20040097415A1; JP3821839B2; KR100429966B1; JPH09502443A; SG98356A1; US6608029B1; US5795861A; RU2177331C2; NO960899D0; EP0717635A1; SK31496A3

Description

Oblast techniky

Vynález sa týká způsobů regulace gastrcintestinální motility. Zejména sa vynález týká použití amylinu a agonistů amylnu při léčbě poruch, na které by příznivě působily prostředky, které jsou schopné zdržet nebo/a zpomalit vyprázdnění žaludku. Vynález sa také týká použití antagonistů amylinu k urychlení vyprázdnění žaludku, například při léčba h/pomotility žaludku a orůvodních oocuch.

dosavadní stav techniky

Amylin ja hormon na bázi proteinu s 37 aminokyselinami, bvl izolován, vyčištěn a charakterizován chemicky jako hlavní složka škrobovitých usazenin v ostrůvcích slinivek diabetiků typu 2 (Cooper a spol., Proč. Hati. Acad. Sci., USA, 84:0028-8632 (1987 ). Molekula amylinu má dvě důležité posttranslační modifikace: C-konec ja amidová.n a cysteiny v polohách 2 a 7 jsou zesítěny tak, že tvoří H-terminální smyčku. Sekvence otevřeného čtecího rámce lidského amylinového genu prokazuje přítomnost proteolytického štěpného signálu dvojsytné aminokyseliny Lys-Arg před H-terminačním kodonem pro Lys a Gly před proteolytickým signálem Lys-Arg v terminální pozici CLAIMS, což je typická sekvence pro amidaci enzymem amidujícím protein, P.Alí (Cooper a spol., Siochem. Oiophys. Acta, 1314:247 až 258 (1989)). Amylin je předmětem GB patentové přihlášky č. 8709371, podané 27. dubna 1937 , a odpovídá jících US patentových přihlášek podaných 27. dubna 1938, 23. listopadu 1988 a 2. května 1989.

U diabetů typu 1 byl prokázán nedostatek amylinu a byla navržesa jeho kombinovaná náhrada insulinem jako výhodná léčba oproti insulinu samotnému například k omezení hypoglykemických příhod. Použití amylinu pro léčbu diabetů mellitus je předmětem GB patentové přihlášky č. 8720115 podané 26. srpna G.J.S. Cooperem a podané jako patentová přihláška č.

235 955 ve Spojených státech 25. srpne 1933. Farmaceutické pro středky obsahující amylin plus insulin jsou popsány v U3 patent č. 5 124 314, vydaném 23. června 1952.

Působení nadbytečného amylinu imituje klíčové rysy diabetů typu 2 a blokáda amylinu byla navržena jako nová terapeutická strategie. V související patentové přihlášce USA č. 275 475, podané 23. listopadu 1255 Cooperem, G.J.S a spol., bylo popsáno že amylin způsobuje snížení jak bazální tak insulinem stimulované inkorporace značené glukosy do glykogenu v kosterním svalstvu. Bylo popsáno, že tento účinek taká způsobuje CGR? (viz též Leighton, 3. a Cooper, G.J.S., Uature, 335:532-535 (1255)). Amylin a CGR? byly přibližné stejně účinné, vykazovaly význačnou účinnost při 1 ač 10 nii. 0 amylinu je též známo, že snižuje obsah glykogenu (Young s spol., Amer. J. Physiol. 252:457-451 (1990)). Je popsána léčba diabetů typu 2 a insulinové rezistence antagonisty amylinu.

Bylo uvedeno, že jak chemická struktura tak genová sekvence amylin^oodporuje zjištění, že je to biologicky aktivní nebo mediátorová molekula. Chemická struktura je téměř 50% identická s peptidy příbuznými genově s kalcitoninem (CCRP), též pcoteiny s 37 aminokyselinami, které jsou rozšířenými neurotransmittery s mnoha silnými biologickými účinky včetně vasodilabace.

. . í 2 7

Amylin a CGRP mají společný disulfidový můstek Cys- Cys a C-terminální amid, které oba jsou podstatně důležité pro plnou biologickou účinnost (Cooper a spol, Proč. Kati. Acad. Sci., 35-7753-7755 (1933)).

Amylin může být jedním článkem skupiny příbuzných peptidů, která zahrnuje CGRP, insulin, růstové faktory příbuzné insulinu a relaxiny a které mají společný' genetický původ (Cooper, G.J.S., a spol., Prog. Growth Factor Research 1:99-105 (1939)). Oba peptidy kalcitonin a CGRP-1 mají společný původ v kalcitoninovém genu, kde alternativní zpracování primárního transkriptu mRiIA vede k vytvoření dvou rozdílných peptidů, které mají

J společnou ροαζο o..lezenou sekvenční homologii (asi 30%) (Amara, S.O. a apel., Science, 225:1334-1037 (19J5 )).- Genová sekvence amylinu je typická pro · ernovany rasaiatocovy protein, pneemz

MR.íA kóduje proteinu v prepropaptio 3 maty pro proouroi sacernovarého C-olgiho nebe sekrecních granulích. Amylin ja uložen hlavně společně 3 insulinem v granulích beta-buněk a může mít společná proteolyticky pracující enzymy, které vytvářejí insulin z oroinsulinu.

Amylin je primárně syntetizován v pankreatických betabuňkách a je vylučován v odpovědi na stimuly živin, jako glukosy a argininu. Studie s klonovanými liniemi nádorových beta-buněk (Moore a spol., Biochem. Dioohys. Ras. Commun., 173(1)(1391)), izolovanými ostrůvky (Ranatsuka a spol., FS3S Lett., 259(1),199-201 (1333)) a perfundovanými pankreaty krys (Ogawa a spol., J. Clin. Invest., 35:973-376 (1530)) ukázaly, že krátké impulzy 10 až 20 minut nutričních stimulancií sekrece, jako glukosy a argininu, stimulují uvolňování amylinu jakož i insulinu. Molární poměr amylin/insulin secernovaných proteinů se pohybuje mezi prostředky asi od 0,01 do 0,4, ale zdá se, že se příliš nemění s různými stimuly v kterémkoliv prostředku. Avšak během delší stimulace vyšším množstvím glukosy může poměr amylin:insulin progresivně růst (Gedulin a spol., Siochem. Siophys. Res. Commun., ldO(1):732-739 (1991)). Tedy, možná protože exprese genu a rychlost translace jsou nezávisle řízeny, amylin a insulin nejsou vždy secernovány konstantní rychlostí.

Imunoreaktivita podobná amylinu byla změřena v cirkulující krvi u hlodavců a lidí různými radioimunologickými testy, z nichž všechny používají králičího antiamylinováho antiséra a většina z nich používá postupu extrakce a koncentrace ke zvýšení citlivosti pokusu. U normálních lidí byly konstatovány tři hladovění amylinovs hladiny od 1 do 13 pM a postorandialní nebo oostglukosové hladiny od 5 do 20 tM (napr. Hartter a stol., Diabetologia, 34: 52-54 (1991)), Sanke a spol., Diabetologia, 34:129-132 (1991)), Koda a spol., The Lancet, 339:1179-1130 (1992)). U obézních jedinců, rezistentních vůči insulinu, nohou být postprandiální hladiny amylinu vyšší, dosahující až asi 50 pM. Pro srovnání, hodnoty insulinu při hladovění a postprandiálního insulinu jsou 20 až 50 pil a 100 až 300 pil u zdravých lidí s hladinami možná 3 až 4 krát vyššími u lidí rezistentních vůči insulinu. U insulinu typu 1, kde jsou beta-buňky zničeny,jsou hladiny amylinu na nebe pod hladinami detekce a nestoupají v odpovědi na glukosu (Xoda a soci., The Lancet, 333, 1173-1130 (1992)). Pro normální myši a krysy byly popsány základní hladiny amylinu 30 až 100 pil, zatímco u některých diabetických kmenů hlodavců, rezistentních vůči insulinu, byly naměřeny hodnoty až 600 pi-1 (např. Kuang a spol., Hypertension, 19:1-101-1-103 (1392), Gill a spol., Lift ces, 43:703-710 (1991)).

ocienněkteré účinky amylinu jsou podobné účinkům OOP? a kalcitoninu. iietabolické é během zkoumání tohoto nově identifikoodrážejí jeho primární biologickou úlotšehto účinků jsou imitovány CGRP, i když zřetelně vazodilatační (viz např. Leigh5ylo objeveno, že známým nemetabolickým účinky amylinu objeven váného proteinu patrně hu. Alespoň některé z v dávkách, které jsou ton a spol., Nátuře, 335:612-535 (1933), Molina a spol., Diabe39:260-255 (1990)) .

Prvním objeveným účinkem amylinu bylo snížení insulinem stimulované inkorporace glukosy do glykogenu v kosterním svalu krysy (Leighton a spol., Nátuře, 335:632-635 (1938)). Sval se stal rezistentním vůčin insulinu. Další práce s musculus soleus krysy ex vivo a in vitro ukázala, že amylin snižuje aktivitu glykogen-synthasa, urychluje konverzi fosforylasy glykogenu z inaktivní formy b na aktivní formu a, urychluje čistou ztrátu glykogenu (v přítomnosti nebo nepřítomnosti insulinu), zvyšuje hladiny glukosa-S-fosfátu a může zvýšit produkci laktátu (viz např. Deems a spol., Biochem. Biophys. Pas. Commun., 181(1):115-120 (1991)), Young a spol., FEBS Letts. 231(1,2): 149-151 (1991)). Jestli amylin zasahuje do transportu glukosy sám o sobě není jisté (viz např. Young a spol., Am. J. Physiol.,

259:S457-E461 (1950), Zierath a sjel., Diabetciogia, 35:26-31 ( 1552 )). Studia vztáhl odpovědi na z.d'f'zz amylinu a insulinu ukazují, že amylin působí jako nekonkurenční funkční antagonista insulinu v kosterním svalstvu (Young a spol., Am. J. Physiol., 263 (2) : Ε274-Ξ231 ( 1592)). honí žádný důkaz pro to, že by amylin nepříznivě ovlivňoval vazbu insulinu na jeho rsc ceptory nebo následující aktivaci receptoru insulinu tyrosinkinasu. (Follett a spol., Clinical Research 39(1):39A (1991), Koopmans a spol., Ciabetologia, 24, 212-224 (1991)). Účinky amylinu na kosterní svalstvo se podobají těmto účinkům adrenalinu (epinefrin). Avšak, zatímco se má za to, že účinky _adrenalinu jsou zprostředkovány do značné míry cAl-lP, někteří pracovníci došli k závěru, že účinky amylinu nejsou zprostře kovány pomocí cAMP (viz Deems a spol·., Biochem. Bioohys. Res. Commun., 181(1): 116-120 (1951)), kiečho další pracovníci uvá

Ω-» amylin aktivuje adenyicy clasu a zvyšuje obsah cAM? -, Diabetes 42:5,821 červen seji, z v kosterním svalstvu (Moore a (1993)) v souladu s převedením jeho účinků na metabolismu glykogenu cestou fosforylace syntasy a fosforylasy pomocí CAMP dependentní protein kinasy.

se za to, ze amyrin inuuje urostreantetvum řece;

vorů přítomných v membránách plasmy, bylo popsáno, že amylin pů sobí v kosterním svalstvu pomocí receptorem zprostředkovaného mechanismu, který podporuje glykogenolýzu aktivací enzymu'· limitujícího rychlost pro degradaci glykogenu, fosforylasy a (Young, A. a spol., FE33 Letts., 231:145-151 (1951)). Studie t-37 - . .

amylinu a CGRP a ucinxu antagonisty CGRP naznačuji, ze amylin působí prostřednictvím svého vlastního receptoru (Mang a spol., FE35 Letts., 219 : 195-195 ( 1991 b)), což je v rozporu se závěrem ostatních pracovníků, že amylin může působit v prvé řad-ě na receptorecn CGRP (např. Chantry a spol., Biochem. J. 277:139-143 (1991), Galaazza a spol., Peptides, 12:535-591 (1991), Zhu a spol., Biochem. Fiophys. Res. Commun., 177 (2):771776 (1991)). dedávno byly popsány receotory amylinu a jejich použití při různých metodách skríningu a analýzy sloučenin agonistů a antagonistů amylinu v mezinárodní přihlášce č. PCT/ú392/O2125, zveřejněné 1. října 1992 a o názvu Suríningová metody ?ro agonisty a antagonisty amylinu na

Zatímco amyiin má výrazné účinky na metabolickou činnost jater , neexistuje obecný souhlasný názor na to, jaké účinky amylinu jsou patrná v izolovaných hepatocytech nebo perfundovaných játrech. Dostupné údaje nepodporují myšlenku, že amyiin zvyšuje heoatickou glukogenolýzu, tj. nepůsobí jako glukagon (např. Stephens a spol., Diabetes, 40:335-400 (1991)), Gomez-Foix a spol., Biochem J., 275:607-510 (1991)). Byl vysloven názor, že amyiin může působit na játra tak, že se vyvolá konverze laktatu na glykogen a zvýší se množství glukosy, kcerá může být uvolněna glukagonem (viz Rodea a spol., Diabetologia, 35:116-120 (1992)). Amyiin tedy může působit jak anabclický partner insulinu v játrech na rozdíl od jeho katabolického působení ve svalu.

Vliv amylinu na regionální hemodynamické účinky včetně renálního krevního průtoku ú krys, které jsou při vědomí, byl nedávno popsán (Oardiner a spol., Diabetes, 40:948-951 (1991)). Autoři uvedli, že infuse amylinu krys byla spojena s větší renální vasodilatací a menší mesenterickou vasokonstrikcí než jaká je pozorována u infuse lidského alfa-GGR?. Došli k závěru, že vyvoláním renální hyperemie ve větším rozsahu, než způsobil alfa-CGR?, mohl by krysí amyiin způsobit méně zřetelnou stimulaci systému renin-angiotensin a tedy méně sekundární aagiotensinem II zprostředkovanou vasokonstrikcí. Bylo však též pozname3-37 náno, že běhen společné infuze lidského alfa- CGR? a krysího amylinu byly zjištěny renální a mesenterické vasokonstrikce, patrně vzhledem k vasokonstrikčním účinkům a.ngiotensinu II, kterým nebylo čeleno, a že toto zjištění se podobá tomu, které bylo oozorováno během soolečné infuse lidského Λ-CGR? a lidského

“. - 3-37 alf aCGR? (viz shora 951)

V tukových buňkách nemá amylin na rozdíl od svého účinku .na způsob adrenalinu ve svalu žádné zjistitelné účinky na insulinem stimulovaný příjem glukosy, inkorporaci glukosy do triglyceridu, tvorbu oxidu uhličitého (Cooper a spol., Proč. Nati. Acad. Sci., 85:7763-7765 (1933)), epinefrinem stimulovanou lipolýzu nebo insulinem potlačenou lipolýzu (Lupien J.R. a Young A.A., Diabetes Nutrition and metabolism - Clinical and Experimental, sv. 6(1), strany 13 až 13 (únor 1993)). Amylin tedy uplatňuje specifické účinky na tkáň s přímým působením na kosterní svalstvo, výraznými nepřímými (cestou dodání substrátu) a možná přímými účinky na játra, zatímco adipocyty se jeví slepé vůči přítomnosti nebo nepřítomnosti amylinu. Nebyly popsány žádné přímé účinky amylinu na tkáň ledvin.

Bylo popsáno, že amylin může mít výrazná účinky na sekreci insulinu. Některé pokusy s izolovanými ostrůvky (Ohsasza a spol., Diochem. Biophys. Res. Commun., 150(2):361-957 (1983)), s per fundovaným pankreatern (Silvestře a spol., Reg. Pept., 3123-31 (1930))a s intaktní krysou (Young a spol., Mol. Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)) naznačují, že amylin snižuje sekreci insulinu. Pokusy s perf undova.ným pankreatem ukazují na selektivní snížení sekreční odpovědi na glukosu bez ovlivnění odpovědi na arginin. Jiní pracovníci vsak nezjistili účinky amylinu na izolované beta-buňky, izolované ostrůvky nebo celá zvíře (viz Broderick a spol., Biochem. Biophys. Ras. Comm, sv. 177:932-933 (1991) a zde uvedené odkazy).

Nejvýraznějším účinkem amylinu in vivo je stimulace prudkého vzestupu laktátu v plasmě, následovaného vzestupem glukosy v plasmě (Young a spol., FEBS Letts. 231(1,2):143-151 (1991)). Důkazy naznačují, že zvýšený obsah laktátu tvoří substrát pro tvorbu glukosy a že k účinkům amylinu může docházet nezávisle na změnách insulinu nebo glukagonu. Při pokusech s glukosovým sevřením i.nfuao amylinu způsobují rezistenci insulinu jak snížením periferního uložení glukosy, tak také oneženin insulinem zpro-3tředkované tvorcy hepatické glukosy (např.

Frontoni a spol., Diabetes, 40:553-575 (1991), Xcopmans a spol.,

Diabatologia, 34, 215-224 (1991)).

U lehce anestezovaných krys, kteří ss nechaly hladovět 13 hodin, aby ss spotřebovaly jejich zásoby hepatickěho glykogenu, injekce amylinu stimulovaly zvýšení obsahu laktátu v plasmě asi od 0,5 do 1,5 mil, následované dlouhotrvajícím zvýšením hladin glukosy v plasmě asi od 5 do 11 mil. Tyto účinky byly pozorovány jak oři intravenózních tak i subkutánních injekcích (Young a spol., FESS Letts., 251(1,2):145-151 (1991)). Účinky amylinu u krmených zvířat se liší kvantitativně od jeho účinků u zvířat podrobených hladovění. U krmených krys s předpokládané· normálními zásobami glykogeau v játrech způsobuje amylin výraznější a déletrvající vzestup obsahu laktátu v plasmě, je zde však jen mírný vzestup v obsahu glukosy v plasmě. Eyl vysloven názor, že amylin podporuje :n z ouiouu >rihc cyklu, tj.

svalový glykogen poskytuje cestou degradace na laktát substrát •pro hepatickou glukoneogenesi a tvorbu glykogenu a pravděpodobně syntézu triglycerIdu. Insulin řídí přední oblouk, tj. přívod glukosy do svalu a tvorbu svalového glykogenu. Insulin a amylin mohou tedy být pokládány za partnery při řízení nepřímé cesty doplnění postorandiálního hepatickěho glykogenu. Insulinová rezistence ve svalstvu a v játrech může být amylinem normálně, fyziologicky regulována.

tleme tabolické účinky amylinu zahrnují vasodilatační působení, která mohou být zprostředkována interakcí s vaskulárními receotory CGEP. Publikované testy in vivo naznačují, že amylin je nejméně asi 100 až 1000 krát účinnější než CGPP jako vasodilatační činidlo (Srain a spol., Eur. J. Pharmacol., 133:2221 (1930)), Wa.ng a spol., FESS Letts., 291:195-193 (1991)). Jak bylo publikováno, potlačuje amylin při injekční aplikaci do mozku příjem potravy (např. Chance a spol., Brain Pes., 939, 352-354 (1991)), což je účinek společný s CGPP a kalcitoninem.

'1 Γ .h ,1 < i

jak	bylo	popsáno
íků	aul	idí s ?
Min	eral	Res., S
•vlin	mohl	b‘7t pro

h í'<ů ? π lidí s Fagotovou nemocí (viz Gilbey a koncentrace v buňkách, která zprostředkovávají tento úóinek, nejsou známá, bylo referováno, že amylin má účinky jak na izolovaná osteoklastv, kde způsobuje stav klidu buněk, tak in vivo, kd;

Ll Λ v o / LI tk. 1 spol. , J, Bc vyplývá, že by amylin rtctil být pro tyto účely 10 až 30 krát méně účinný než lidský kalcitonin. Zajímavá bylo konstatování, že amylin, jak se zdá, zvyšuje tvorbu CAMP osteoklastů, ale nezvyšuje cytosolický Ca“', zatímco kalcitonin zvyšuje oboje (Alam a spol.-, Biochem Biophys. Bas. Commun., 179(1):134-139 (1931). Eyl vysloven názor, který ale nabyl prokázán, že kalcitonin může působit prostřednictvím dvou typů receptoru a že amylin může spolupůsobit s jedním z nich.

Infuze antagonistů receptoru amylinu může být použito ke změně glukoregulace. ^u 'cGR? je prokázaný blokátor amylinu in vitro a in vivo (Mang a spol., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(3):1233-1233 (1991)) a bylo zjištěno, že mění glukoregulaci po infuzi argininu u krmených krys (Young a spol., Mol. Cell Endocrinol., 84:R1-R5 (1932)). Počáteční zvýšení koncentrace glukosy se přičítá vylučování glukagonu z alfa buněk ostrůvků, stimulovanému argininem. Následující restaurace bazální glukosy se přičítá působení insulinu spolu se změnami v ostatních glukcreguiačních hormonech. Když je působení amylinu blokováno 8-37 předcházející infuzi hCGRP, není počáteční zvýšení glukosy významně rozdílné, ale následuje snížení koncentrace glukosy značná pod základní hladinu, která se restauruje až asi za 80 minut. Glukoregulace následující po tomto testu se sekretalogem ostrůvků byla obměněna infuzi antagonisty receptoru amylinu. Dodatečně byly změřeny koncentrace insulinu v půl hodinových intervalech a bylo zjištěno, že koncentrace insulinu 30 minut oo infuzi argininu byla téměř dvakrát tak vysoká u zvířat, kterým byl aplikován infuzi antagonista receptoru amylinu,

8-37 jako u normálních kontrolních zvířat. CGR? je také účinný antagonista CGRP. Velmi podobné výsledky však byly pozorovány u jiného antagonisty amylinu AC55, který je selektivní pro receptory amylinu ve srovnání s receptory CORP (Young a spol., Mol. Cell. Endocrino., 34:Rl-R5 (1992)). 0 teonto vysleocion se uvádí, že podporují závěr, že blokáda působeni.amylinu muže mít důležité příznivé léčebné účinky na diabetes typu 2.

U pacientů s diabetem typu 1 se kromé nedostatku insulinu uvádí zřetelný nedostatek amylinu. Jak je poznamenáno shora, změřené hodnoty ukazují, že u diabetů typu 1 exprese a sekrece amylinu pankreatickými beta-buňkami schází nebo je značně pod normálem. U řady modelů zvířat s diabetem typu 1 je sekrece amylinu a exprese genu snížena (Cooper et al., Diabetes, 4S7-500 (1591), Ogawa a spol., J. Clin. Invest., 35:373-375 (1990)) Měření amylinu v plasmě u pacientů s diabetem typu i ukazují, že amylin schází u těchto pacientů pc hladovění přes noc a že podání glukosy nevyvolá zvýšení hladin amylinu (Roada a spol,, The Lancet, 333:1173-1130 (1932)).

Bylo rovněž objeveno, překvapivě vzhledem k jeho dříve popsaným renálním vasodilatačním a jiným vlastnostem, že amylin zřetelně zvyšuje aktivitu reninu plasmy u intaktních krys při subkutánní aplikaci způsobem zamezujícím poruchám krevního tlaku. To je důležité, protože nižší krevní tlak je silným stimulem pro uvolnění-reninu. Antagonisté amylinu, jako antagonisté receptoru amylinu , včetně těch, které jsou selektivní pro receptory amylinu ve srovnání s receptory CGRP nebo/a kalcitoninu, mohou být použity k blokování amylinem vyvolaného zvýšení aktivity reninu plasmy. Tyto neočekávané nálezy podporují zjištění, že antagonisté amylinu sníží aktivitu reninu v plasmě s následným příznivým terapeutickým účinkem při hypertenzi a kardiálním selhání a jiných poruchách souvisejících se zvýšenou , nepřiměřenou nebo nežádoucí aktivitou reninu. kromě toho další schopnost antagonistů amylinu příznivě modulovat rezistenci insulinu a jiných obvyklých meta.bolick/ch poruch často spojených 3 hypertenzí a kardiálním onemocněním poskytuje zvláště žádoucí terapeutický profil.

cíděným vyprazdňováním kapalnší řady gastrointes finálních ooPharmacological Basis of ThePress, 3. vydání 1990). Sympat nauzeu, zvracení, pálení žáolení žaludku. Často je patrný že vést k ezofagové ulceespirační symptomy nebo intenmuže být zaměněna s astmatem u většiny pacientů je příčina žaludku je často důsledkem dia je také často přítomen u paoiiohydria nebo po operaci žaludŽaludeční hypomotilita s op ho nebo tuhého obsahu je součást ruch. Viz Goodman a Gilman's The rapeutics, kapitola 3á (Pergamen torny těchto poruch mohou zahrnov hy, postprandiální nevolnost a b gastroezofágový reflux, který mu raci. Taká ss mohou vyskytovat r živní substernální bolest, která nebo infarktem myokardu. I když neznámá, stáze nebo hypomotilita betické neuropathie. Tento stav entů s anorexie nervosa nebe ach ku. Viz shora na straně 923.

jecoa oacientu ;e zaiucecn:

hypomotil.itou obvykle zahrnuje aplikaci prokinetiokého prostředku. I když antiemetické fenothiaziny nebo bethanechol mohou poskytnout určitou úlevu, tyto léky neurychlují vyprazdňování žaludku u velké většiny pacientů a často mají nepřijatelné vedlejší účinky. V současná době prokinetické prostředky, které jsou k dispozici, zahrnují metoklcpramid a cisaprid, avšak jiné (např. domoeriden) se vyhodnocují. Viz shora.

Metoklcpramid snižuje receptivní relaxaci v horní části žaludku a zvyšuje antrální kontrakce. Pylorus a duedenum jsou relaxovány, zatímco tonus spodního ezofágového sfinkteru je zvýšen. Tyto účinky se spojují a zrychlují tak vyprazdňování obsahu žaludku a snižuji reflux zduodena a žaludku do ezofagu.

.\rcme tone te snížena precaccu matenaiu z duoaer.a ileocekální chlopně jako výsledek jejunální peristaltiky. Metoklopramid má malý účinek na sekreci žaludku nebo motilitu střev. Viz shora na straně 92ó.

Obočně vytvářají dopaminargičtí agonisté obrácený obraz účinků a tyto jsou zarosPředkovány receptory ΰ?, které jsou umístěny alespoň zčásti uvnitř gastrointestinálního traktu.

Viz shora.

Mechanismus působení metoklopramidu je málo známý, i když je to jasně dopaminergický antagonista a může blokovat gastrointestinální účinky způsobené lokálním nebo systémovým podáváním dopaminergických agonistů. I když se vagotomií neodstraní účinky metoklopramidu, jeho orokineticke účinky mohou oyt blokovány atroginem nebo muskarlnovými antagonisty. kromě toho ne všemi dogaminsrgickými antagonisty se dosáhne urychlení vyprázdnění žaludku. Má se zato, že tento lek urychluje uvolňováni acetylcholinu z myenterickýoh neuronů, i když přímý důkaz pro toto působení schází. Protože bethanechol může zvyšovat účinky metoklopraraidu, může být přítomen též sklon ke zvýšené odpovědi na acetylcholin. Viz shora na stranách 92Í-923.

Domperidon je derivát benzimidazolu, který má jak prokinetické tak antiemetické vlastnosti. Je to dopaminergický a.ntagonista a vytváří zřetelnou hypergrolaktinemii. Jeho účinky na gastrointestinální mobilitu se též úzce podobají účinkům metoklopramidu. Avšak na rozdíl od metoklopramidu nejsou tyto účinky antagonizovány atropinem. Vysvětlení pro tento rozdíl dosud nebylo podáno. Domperidon překračuje jen v omezeném rozsahu hranici krev-mozek a způsobuje jen zřídka extrapyramidální vedlejší účinky. V důsledku toho nezasahuje rušivě do léčby Parkinsonovy nemoci a může působit užitečně proti gastrointes tinálním poruchám způsobeným levodopy a brorakriotinem. 2a současného stavu se zdá, že tento lék má stejnou terapeutic kou užitečnost jako metoklooramid při léčbě pacientů trpících hypomotolitou žaludku. Má však menší antiemetický účinek. Viz shora na straně 929. Zdá se, že je domperidon rychle absorbo13 ická dostupnost je jen je vylučována - stolicí.

asi 7 až d hodin. Viz ze Spojených státech.

Optimální dávkování iiity žaludku byly poua na straně 929.

ván ρο orální aplikaci, ale jeho biolog asi 15¾. Většina léku a jeho motabolitů Poločas pro jeho odstranění z plasa/ je shora. Domperidon není obecně dostupný Jinde je k dostání pod názvem MOTILILN. nebylo stanoveno, ale při léčbě hypomot žity denní dávky 40 až 120 mg. viz sbor

Cisaorid je benzamid a jeho účinky na motilitu žaludku a tenkého střeva se naprosto podobají účinkům metoklopramidu a domperidonu, avšak na rozdíl od těchto léků zvyšuje také motilitu střev a může způsobit průjem, mechanismus jehc g-as trointest inálních účinků je málo jasný. Jako a metoklopramidu jsou tyto účinky blokovány atropinem a mohou zahrnovat uvolnění myente rického acetylcholinu. Zdá se, že cispranid postrádá dopaminer gickou blokovací účinnost a neovlivňuje koncentraci proláklinu v plasmě nebo nezpůsobuje excrapyramidální symptomy. Lék se váže na a blokuje tsyptaminergické receptory v krysím ileu, ale vztah mezi tímto působením a jeho účinky u člověka nebyl zjištěn. Viz shora. Dosud se jeví účinnost tohoto léku při léčbě poruch nypomotolity žaludku stejná jako účinnost metoklopramidu a domperidonu bez vedlejších účinků, které jsou výsledkem dopaminergické blokády. Kromě toho může bý cisaorid užitečný při léčbě pacientů s chronickou idiooatickou zácpou nebo s hypomotolitou střev v důsledku poranění míchy. Viz shora na straně 923.

Na rozdíl od shora uvedeného nalezly v léčbě své místo též prostředky, které slouží ls oddálení vyprázdnění žaludku, zejména jako diagnostické pomocné prostředky při gastrointestinálních rentgenových vyšetřeních. Například glukagon je polypeptidový hormon, který vytvářejí alfa-buňky Langerhansových pankreatických ostrůvků. Je to hyperglvkemický prostředek, který mobilizuje glukosu aktivací hepatické glykoge.nolýzy Nuže v menší míře stimulovat sekreci pankreatického insulinu.

Glukagon se aolikuje ve formě 'nydrochlor idu glukagonu. Dávky ie obvykle vyjadřují jako glukagon.

Glukagon se používá při Léčbě insulinem vyvolaná hypoglykémie, když intravenózní aplikace glukosy není možná. Podává se subkubánní, intramuskulární nebo intravenózní injekcí v dávce 0,5 až 1 mg (jednotka), opakovaná popřípadě po 20 .-minutách. Avšak, protože glukagon snižuje mobilitu gastrointestinálního traktu, používá se jako diagnostický pomocný prostředek při gastrointestinálnírc. rentgenovém vyšetření. Dávka 1 až 2 mg (jednotky) aplikovaná intramuskulárně má začátek účinku 4 až 14 minut a trvání účinku 10 až 40 minut. 0,2 až 2 mg (jednotky), podané intravenóznč, poskytují účinek během jedné minuty, který trvá 9 až 25 minut.

Glukagon byl používán v různých studiích k léčbě různých bolestivých gastrointestinálních poruch spojených se spasmem. Daniel a spol. (Er. Med. J., 1974, 2, 720) referoval o rychlejší symtomatické úlevě oři akutní divertikulitidě u pacientů léčených glukagonem ve srovnání s pacienty, kteří byli léčeni analgetiky nebo antispasmodiky. Glauser a spol. (J. Am* Coli. Srciergency Physns, 1973, 8, 229) referoval o úlevě při akutní ezofágové obstrukci potravy po lecbe glukagonem. Podle jiné studie glukagon významně odstranil bolest a citlivost u 21 pacientů s onemocněním žlučových cest ve srovnání s 22 pacienty, jimž bylo podáno plaoebo (M.J. Stower a spol., Br. J. Surg. 1932, 69, 591-2). Franken a spol.- však (Radiology, 1933, 146, 687) nebyli schopni prokázat žádnou výhodu glukagonu oproti pla cebu při hydrostatickém snížení ileokolické intussuscepce ve studii s 30 dětmi a Webb a spol. (Med. J. Aust., 1936, 144,

124) došli k závěru, že glukagon byl neúčinný při zvládání kolitidy močovodu.

Podstata vynálezu nyní bylo zjištěno, s překvapením vzhledem k jeho dříve popsaným hyperglykemickým vlastnostem, že amylin a agonisté amylinu včetně těch, které zde tyly popsány, například analog agonisty amylinu '^^?ro-h-amylin (také uváděný jako

AC-0137''), jsou schopny snížit žaludeční motilitu a zpomalit vyprazdňování žaludku , jak je sloučenin snížit postorandiální prokázáno schopností takovýchto hladiny glukosy v plasmě.

Předmětem vynálezu jsou nové způsoby snížení žaludeční motility a zpomalení vyprazdňování žaludku, které spočívají v aplikaci amylinu nebo agonisty amylinu, například analoguagonisty amylinu AC-0137. Tyto způsoby budou užitečné například při léčbě postorandiální hyperglykémie, to jest komplikace ve spojitosti s diabetem mellitus typu 2 (nezávislém na insulinu).

Pod výrazem, amylin se rozumí sloučeniny jako jsou ty, které definovali.Cooper a Young v US patentu č. 5 234-SOó, vydaném 10. srpna 1993 na Eyperglykemické sloučeniny .Zahrnuje lano crunove variací oznanapříklad lidský peptidový hormon a čované jako amylin .a vylučované z beta-buněk pankreatu. Agonisté amylinuje také výraz známý v oboru a týká se sloučenin, které napodobují účinky amylinu. Samotný amylin a analoga agonistů amylinu mohou tedy být označována v širokém smyslu slova též jako agonisté amylinu. Výraz analog agonisty amylinu je třeba rozumět tak, že se týká derivátů amylinu, které mají účinek jako agonisté amylinu na základě toho, že se, jak se má v současné době za to, váží na nebo jinak přímo nebo nepřímo spolupůsobí s receptorem amylinu nebo s jiným receptorem nebo recep tory, se kterými může spolupůsobit sám amylin, aby byly dosaženy shora uvedené biologické vlastnosti, kromě těch, která jsou zde popsána, jsou jinak užitečná analoga agonistů amylinu identifikována v mezinárodní přihlášce ÍJPI Acc, č. 93-182433/22 o názvu Nové peptidy agonisté amylinu pro léčbu a prevenci hypoglykémie a diabetů mellitus.

Hlavním význakem vynálezu je způsob příznivé regulace gas15 trointestinální motility u pacienta tím, že 52 tomuto pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množství amylinu nebo agonisty amylinu, s výhodou analoga agonisty amylinu. Podle jednoho význaku se způsoby podle vynálezu týkají snížení motility žaludku. Podle jiného význaku se vynález týká způsobů oddálení vyprázdnění žaludku.

Tyto způsoby se mohou aplikovat na pacienta, který je podroben gastroi.ntestinálnímu diagnostickému vyšetření, například rentgenovému vyšetření nebo zobrazení magnetickou rezonancí. Tyto způsoby se mohou též použít ke snížení motility žaludku u pacienta trpícího gastrointestinální poruchou, například spas mem (který může být spojen s akutní divertikulitidou, poruchou žlučových cest nebo poruchou sfinkteru Oddi).

Podle jiného význaku se vynález týká způsobu léčby postť-.álního dumping syndromu u pacienta tím, že se pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množství agonisty amylinu.

Podle ještě jiného význaku se vynález týká způsobu léčby postprandiální hyperclykémie tím, že se pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množství agonisty amylinu. Postprandiální hyperglykémie je zejména důsledek diabetů mellitus typu 2.

? '3 23

K výhodným.analogům agonisty amylinu patří také '' Pro25 23 29

K .výhodným agonistům amylinu patří ' ' Pro-h-amylin.

íodným -h-amylin.

Podle jiného význaku se vynález týká způsobu léčby žaludeč ní hypomotility u pacienta tím, že se pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množství antagonisty amylinu. Ve výhodných provedeních mohou být tyto způsoby použity tam, kde je hypomotilita dúsledtem diabetické neuropathie nebo tam, kde je hypomotilita důsledkem anorexie nervosa. HypomotiLita může být také důsledkem achlorhydrie nebo důsledkem operace žaludku.

Podle jiného význaku se vynález týká způsobu urychlení vy prazdňování žaludku u pacienta tím, že se pacientovi aplikuje terapeuticky účinné množství antagonisty amylinu. Antagonistou amylinu je míněna sloučenina, která ruší účinky amylinu, například sloučenina, která sama nemá významnou farmakologickou účinnost, ale vyvolává účinky inhibici působení specifického agonisty, např. konkurencí o vazebná místa agonisty. Antagonistou amylinu, používaným při těchto způsobech, je s výhodou antagonista receptoru amylinu. Výhodným antagonistou je „ . 11,18. 30.. 3 2., 9-32, . . . ,/ acstyl- Arg, Asn, Tyr kalcitónin(lososi).

Podle jiného význaku se vynález týká způsobu léčby pozření toxinu tím, že se aplikuje množství amylinu nebo agonisty amylinu, které je účinné pro zamezení nebo omezení průchodu obsahu žaludku do střev, a obsah žaludku se odsaje.

Přiložené výkresy slouží k objasnění vynálezu.

Obr. 1 znázorňuje účinek amylinu na hladiny glukosy v plasmě u psu po orální dávce glukosy ve srovnání s kontrolou. Na ose x jsou vyneseny minuty po orální glukose, na ose y pak mil glukosy v plasmě.

Obr. 2 znázorňuje postorandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo aplikováno placebo nebo jednorázově intravanózně 30 jig AC-0137. Ha ose x je vynesen čas v minutách a na ose y množství glukosy v plasmě v mg/dl.

V době mezi 30 a SO minutami bylo dobrovolníkům podáno jídlo.

V diagramu vynesená křivka plnou čarou se týká placeba, kdežto přerušovanou čarou vynesená křivka se týká podání AC-0137. Hodnoty použité v diagramu jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr. 3 představuje prostorandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo aplikováno placebo ta r o — nebo jednorázově intravenózně 100 pg AC-0137. -la ose x je vynesen čas v minutách a na ose y množství glukosy v plasmě v mg/dl. V době mezi 30 a 60 minutami bylo dobrovolníkům podáno jídlo. V diagramu plnou čarou vynesená křiv ba, kdežto přerušovanou čarou vynesená xzlv AC-0137. V diagramu použitě hodnoty jsz statistická odchylka.

ýká aplikace radní hodnoty +

Obr. 4 znázorňuje oostorandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo aplikováno placebo nebo jednorázově intravenózně 300 ,ug AC-0137. Ma ose x diagramu je vynesen čas v minutách a na ose y množství glukosy v plasmě v mg/dl. V době mezi 30 a 50 minutami bylo dobrovolníkům podáno jídlo. V diagramu plnou čarou vynesená křivka se týká placeba, kdežto přerušovanou čarou vynesená křivka se týká AC-0137. V diagramu použitá hodnoty jsou stř noty + statistická odchylka.

Obr. 5 představuje oostorandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo aplikováno placebo nebo kteří dostali dvouhodinovou intravenózní inřuzi AC-0137 rychlostí 15 „ug za hodinu. Ma ose x diagramu je vynesen. čas v minutách a na ose y množství gluxosy v plaau:« -j mg/dl. V době mezi 30 a 60 minutami bylo dobrovolníkům pocano jídlo. V diagramu plnou čarou vynesena kravka se týká placeba, kdežto přerušovanou čarou vynesená křivka se týká LC-0137. V diagramu použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr. δ představuje oostorandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo podáno placebo nebo kteří dostali dvouhodinovou intravenózní inřuzi AC-0137 rychlostí 50 ,ug za hodinu. Na ose x diagramu je vynesen zas v minutách a na ose y množství glukosy v plasmo v mg/zl. V době mezi 30 a 50 minutami bylo dobrovolníkům podáno jídlo.

V diagramu plnou čarou vynesená křivka se týká placeba, kdež15 to přerušovanou čarou gramu použité hodnoty vynesená křivka se týká AC-0137. V diajsou střední hodnoty t statistická odObr. 7 znázorňuje postprandiální hladiny glukosy lidských klinických dobrovolníků, kterým bylo podáno placebo nebo kterým byla oplikována dvouhodinová intcavenózní infuze AC-0137 rychlostí 150 ,uy za hodinu. Na ose x diagramu je vynesen čas v minutách a na osa y množství glukosy v plasmě v mg/dl. V době mezi 30 a 50 minutami bylo dobrovolníkům podáno jídlo. V diagramu plnou čarou vynesená křivka se týká placeba, kdežto přerušovanou čarou vynesená křivka se týká AC-0137. V diagramu použité hodnoty jsou střední hodnoty t statistická odchylka.

Obr. 6 a až triproamylinu v 5 o minus crec z amylinu. Pokrm ob ukazují koncentrac plasmě v ph a volného ahájením intravenózní oustacal oyl pocan oj e glukosy insulinu infuze 25 minut po v plasmě v mg/dl, v plasmě v „uU/ml jjg/hodina triprozahájení infuze triproamylinu.

V diagramech je na ose x vynesen čas v minutách a na ose y koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl (obr. 8a) a koncentrace triproamylinu v plasmě v pM (obr. 8 b). V diagramech použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr. 2a triproamylinu óG minut cred anylinu.Pokrm triproamylinu v plasmě v mg/dl, v plasmě v yiU/ml „ug/hodina triprozahájení infuze až 2c ukazují koncentrace glukosy v plasmě v pí-I a volného insulinu zahájením intravenózní infuze 50 R

Sustacal byl podán 50 minut po

V diagramech je na y koncentrace glukosy v v plasmě v pil (obr. 2b) (obr. 2c). V diagramech ose x vynesen čas v plasmě v mg/dl (obr. a volného insulinu v použité hodnoty jsou minutách a na ose 9a) triproamylinu plasmě v juU/ml střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr .10a ččž 10c ukazují koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl, triproamylinu v plasmě v pi-1 a volného insulinu v plasmě v juU/ml 60 minut před zahájením intravenózní infuze 50 „ug/hodina tri¹-* proamylinu. 60 minut před zahájením infuze triproamylinu byla aplikována intravenóznídávka 300 mg/kg glukosy.

V diagramech je ηει ose x vynesen čas v minutách a na ose y koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl (obr. 10a),triproamylinu v plasmě v pií (obr. 10b) a volného insulinu v plasmě vyiU/ml (obr. 10c). V diagramech použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr. 11a až 11c ukazují hladiny glukosy po pokrmu Susp R bacal' pro toleranční testy s pokrmem Sustacal , provedené při startu (den 1), 7. den a 14. den na lidských klinických dobrovolnících, kterým bylo aplikováno 30 ,ug triproamylinu (AC-0137) třikrát denně před jídlem po dobu 14 dnů.

V diagramech je vynesen na ose x čas v minutách a na ose y koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl (obr. 11a), triproamylinu v plasmě v pří (obr. 11b) a volného insulinu v plasmě v jiU/ml (obr. 11c). V diagramech použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

Obr. 12a až 12b ukazují hladiny glukosy po pokrmu Sustacal‘ pro toleranční testy s pokrmem Sustacal , provedené při startu (den 1), 7. den a 14. den na lidských klinických dobrovolnících, kterým bylo aplikováno loc jug triproamylinu (AC-0137) třikrát denně před jídlem po dobu 14 dnů.

V diagramech je vynesen na ose x čas v minutách a na ose y koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl (obr. 12a) a triproamylinu v plasmě v pil (obr. 12b). V diagramech použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistické odchylka.

Obr. 13a až 13b ukazují hladiny cal pro toleranční testy s pokrmem startu (den 1), 7. den a 14. den na brovolnících, kterým bylo aplikováno -0137) třikrát denně po dobu 14 dnů glukosy po pokrmu Susta□

Sustacal“, provedená při lidských klinických do300 jug triproamylinu (ACV diagramech je vynesen na ose x čas v minutách a na ose y koncentrace glukosy v plasmě v mg/dl (obr. 13a) a triproamylinu v plasmě v cti (obr. 13b). V diagramech použité hodnoty jsou střední hodnoty + statistická odchylka.

znázcrr e ucmxv octovém na cavxu •cnazejici subkutánní injekce krysího 20 minut co ccdání žaludečn lyiinu na zadržení obsahu žaludku sondou u normálních a diabetických krys (n = 3 až 9 pro každý + statistická odchylka a ki ké funkce. Nula označuje la zadržena u normálních a bod). Symboly jsou střední hodnoty ivky definují nejvhodnějsi logistictu frakci obsahu žaludku, která bydiabetických krys neléčenýcn amylinem.

(rozdíl u ? <0,00l).

V diagramu je vynesera na ose x dávka subkutánního amylinu v vug a na ose y procenta obsahu žaludku zůstávajícího v žaludku po 20 minutách.

Obr. 15 znázorňuje koncentraci amylinu v plasmě změřenou po subkutánní injekci buc 1 pg nebo 10 jug syntetického krysího amylinu (n = 3 na skupinu) . Symboly jsou střední hodnoty + standardní odchylka.

V diagramu je vynesen na ose x čas v minutách po subkutánním amylinu a na ose y koncentrace amylinu v plasmě v pil.

Obr. 16 znázorňuje tritium odvozené od glukosy v plasmě (cpm/10 jal) po aplikaci fyziologického roztoku naho AC-0187 žaludeční sondou. ± označuje statistickou významnost. Nejspcdnějčí křivka (přerušovaná čára označená původ) pochází cd 4 a.nes tezovar.ých krys, kterým byla aplikována žaludeční sonda po laparatomii a podvázání pyloru. Naznačuje to, že malé množství tritia je absorbováno přímo stěnami žaludku a že přírůstek tritia ukazuje na přechod glukosy do oběhu z tenkého střeva.

V diagramu je vynesen na ose x čas v minutách po podání žaludeční sondou a na ose y obsah od glukosy odvozeného tritia v plasmě v cpm/10 jal.

Obr. 17 znázorňuje obsah glukosy v plasmě v mg/dl po podání buc fyziologického roztoku nebo AC-0187 do žaludku sondou.

V diagramu je vynesen na ose x čas v minutách po podání sondou do žaludxu a na ose y obsah glukosy v plasmě v mg/dl.

Nomenklatura různých sloučenin analogů agonistů amylinu, •užitečných podle vynálezu, může být použita k označení jak peptidu, na kterém je sekvence založena, tak modifikací jakékoliv základní oeotidové amvlinové sekvence, jako lidského amylinu. Aminokyselina, kterou předchází horní číselný index,znamena, že uvedená aminokyselina nahrazuje aminokyselinu normálně přítomnou s tímto horním indexem v základní aminokyselinové sekvěnci. Například Arg“ ' Pro-h-amylin” se týká peptidů založeného na sekvenci h-amylinu neboli lidského amylinu, který má následující substituce: Arg nahrazuje His ve zbytku 18, Pro nahrazuje Ala ve zbytku 25 a Pro nahrazuje Ser ve zbytku 23. Výraz des-^Lys-h-amylin se týká peptidů založeného na sekvenci lidského amylinu s první neboli N-terrainální. aminokyselinou vypuštěnou.

Analoga agonistů amylinu podle vynálezu jsou užitečná vzhle dem ke svým farmakoiogickým vlastnostem. Jejich aktivita jako prostředků agonistů amylinu může být vyjádřena aktivitou v testu na vázání receptoru a testu s m. soleus, které jsou popsány níže. Aktivita agonistů amylinu sloučenin může být též stanovena schopností vyvolat u savců hyperkalcémii nebo/a hyper-: glykémii nebo snížit poscpradiální hladiny glukosy v plasmě, jak je zde popsáno.

Výhodné sloučeniry analoga agonistů amylinu des- Lys-h-amylin, „ .. 25,23,29 . .. 18_n 25,23

Pro-h-amylm, Pro-h-amylm, Arg Pro-h-amylm a . l_r 18- 25,22... . . . . . - - . , . . . . . .

des- Lys Arg Pro-h-amylm vyxazuji vsecnny akcivitu amylinu in vivo u léčených testovaných zvířat tím, že vyvolávají výraznou hyperlaktémii následovanou hyperglykémií. kromě toho, že mají aktivity charakteristické pro amylin, o některých výhodných sloučeninách bylo zjištěno, že jsou rozpustnější a stabilnější než lidský amylin. '( těmto výhodným sloučeninám pa25_ 25,. .23,29 , .. 25,25,29 , ' , ... tra Pro Val Pro-n-amylm, Pro-h-amylm (uvacený zde také jako Ac-0137) a

5-h-amylin.

Způsob podle vynálezu může používat agonistů amylinu včetně amylinu nebo'analogu agonisty amylinu,. například analogu ago . . ·. 18. 25,23- , . . . 1_T ceouoru amylinu ]a.w Arg .Pro-h-amylm, oas- Lys13. 23-23,29- ' ' ' , . . l_r

Are Pro-h-amyrm, des- Lysnisty

18, 25,23 _A .

Arg Prd-, n-amylm, ¹³Arc²⁵'^2d'²³^n-:25,23,29

25^3—29 7 ro-h-amylin, Pro-h-amylin, des-^Lys_ . .. 25_ 26.. . 25,23- , .. _ ,

Pro-h-amylm a Pro Val Pro-h-amylm. sako příklady jiných vhodných analogů agonistů amylinu je možno jmenovat:

3. 25_ 26,, .23,29 , ..

Leu Pro Val Pro-h-amylm,

23- 25_n 23,. . 23 . . .

Leu Pro Val Pro-n-amylm, dss-^Ly s ^{2 2}Leu^{2 35} Pro ² ° ValPro-h-amylm,

18. 23- 25- 25,. . 2 3-, . . . “

Arg lsu Pro Val Pro-n-amylm,

18. 23_T 25,23,29-. . . .

Arg Leu Pro-h-amylm,

18. 23. 25,23,. , ..

Arg Leu Pro-n-amylm,

17_T. 28_T 25,23,29-, , . .

Ile Leu Pro-n-amylm,

17_T. 25,23,29-,

Ile Pro-h-amylm, l_r 17 . 23_T 25,23,29 aes- Lys Ile Leu ?ro-h-amylin

X 7 1 £ ? 3 ile Arg“ Leu-h-amylin, Ile' _T, 15., 2 3 _r 2 5.29 . .

Arg Leu 7al ?ro-n-amyl in, i <

2 3 •g

21,..

Iq w

Ile Arg Leu __ . u V

13_m. 21... 23. 25.. 29„

Tnr r.is Leu Ala rro .25,23 . . .

al ?ro-n-aaylm, ²⁹?r<

31,„ e u ² 6Ala ^{2 3} Le u ^{2 3} ? ro ² As p-h-amy1i n, j-h-amylin,

31 ueu Ala“'^JPro Asp-h-amylin 13,„_; Id. 21,,. 23. ,25„ , 29„.__31, χΠΓ A27G HXS LiSuí nes- uys Thu

13_m, 21,,. 23. _25 , , 25 nr nio •“^Q Ala“^J?ro^xAsp-h-amylin,

13-, 12 zi„ ulir Ar~

1,.. 23.. 23,29_ 31. . ..

_y dis ueu Pro Asp-h-amylin a ^lJThr^láArg²¹his²²Leu^2o?ro^2SAla²³'^2y?ro³¹Asp-h-amyli

Ještě další agonisté amylinu včetně analogů agonistů amylinu jsou popsány v patentové přihlášce LPI č. 93-132432/22 o bázvu Levé ceptidy agonisté amylinu používané pro léčbu a pra věnci hypoglykémie a diabetů mellitus.

zde může data ní, nist

Aktivita agonistů amylinu se může vyhodnotit za použití popsaných biologických testů. Test na vázání na receptory identifikovat jak kandidáta agonistů amylinu tak kandiantagonistů amylinu a může být použit k vyhodnocení vázázatímco test s m. soleus rozlisuje mezi agonisty a a.ntago y. Účinky amylinů nebo agonistů amylinu na motilitu žaludbo podrobeny nebo jiných z h způsobů pro ku mohou být ident if iková.ny, vyhodnoceny ne ningu pro použití u způsobů uvedených níže teratury známých způsobů nebo ekvivale.ntnío ní mobility žaludku.

skríliurceJeden takový způsob pro použití při identifikaci nebo vyhodnocení schopnosti určité sloučeniny zpomalit motilitu žaludku spočívá v tom, že se (a) spojí testovaný vzorek a testovací systém, přičemž uvedený testovaný vzorek je tvořen jednou nebo více testovanými sloučeninami a uvedený testovací systém je tvořen systémem pro vyhodnocení motility žaludku, přičemž tento systém se vyznačuje tím, že se projevuje např. zvýšeným obsahem glukosy v plasmě v odpovědi na zavadění glukosy nebo potravy do uvedeného systému a (b) stanoví přítomnost nebo velikoct zvýšení obsahu glukosy v plasmě v uvedeném systému.Nohou být též použity pozitivní nebo/a negativní kontroly. Popřípadě se do testovacího systému může přidat předem určené množství antagonisty amylinu (např.

2-32. - , . , . .

lososi kacitonin).

Sloučeniny agonisté mají s výhodou v testu na vázání na receptory účinnost řádově nižší než asi 1 až 5 nN, s výhodou nižší než asi 1 nN a výhodněji nižší než asi 50 pN. V testu s m. soleus mají tyto sloučeniny hodnoty řádově nižší než asi 1 až 10 mikromolární.

Test na vázání na receptory je popsán v patentová přihlášce US?, č. 670 231, podané 15. března 1931 a zveřejněné jako mezinárodní přihláškač. FOT/U382/O2125 . Test na vázání na receptory je konkurenční test, při kterém se měří schopnost sloučenin vázat se specificky na receptory amylinu vázané na membráně. Výhodným zdrojem pro membránové přípravky používané v tomto testu je přední mozek, který obsahuje membrány z nuoleus accumber.s a okolních oblastí.Testované sloučeniny si konkurují vázání na tyto receptorové přípravky s krysím amylinem ~ i Solton hunter. Konkurenční křivky, ve kterých je vázané množství (3) vyneseno jako funkce logaritmu koncentrace ligandy, se zanalyzují počítačem za použití analýz nelineární regrese na logistickou rovnici o 4 parametřech(Inplot program, GraphTAO Software, San Diego, Kalifornie) nebo program ALLFIT od DeLeana a spol. (ALLFIT, Verš ion 2,7 (NIK, oethesda, ND 20392)). Nunson ? a Rodbard D., Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)

Testy biologické účinnosti agonistů amylinu včetně přípravků analogů agonistů amylinu v m. soleus se provádějí za použití dříve popsaných method (Leighton 3 a Cooper G.J.S., Nátuře, 335:632-535 (1938), Cooper G.J.S. a spol. ?roc. Nati. Acad. Sci. USA 85:7763-7765 (1938)). Souhrne řečeno se účinnost agonistů amylinu zjištuje měřením inhibice insulinem

L o stimulované syntézy glykog tagonistů amylinu se zjištu sulinem stimulované syntézy krysího amylinu a antagonis rozpuštěného v pufrach pros tiv.ní analýzou aminokyselin cenin působit jako agonisté hodnot EC--,. Standardní ode idálních křivek odpovědí na enu v musouius soleus. Účinnost an je mě žením opětovného zahájení ihglykcgonu v přítomnosti ICO rdí ty amylinu. Koncentrace peptidu tých nosičů se stanovují kvantita, jak je zde popsáno. Schopnost sl· v tomto testu se stanoví změřením hylky se stanoví sestrojením sigmo dávky za použití logistické rovnice o 4 parametrech (De Lean A., Munson ? .J. , C-uardabasso V a Rodbard Ώ. (1933)ALLFIT, Vsrsion 2.7, National Institute of Child Health an Human Development, N.I.H. Bethesda, ND, 1 dis keta). Použitím těchto biologických testů byla charakterizována řada agonistů amylinu. Bylo zjištěno, že všechny sloučeniny

18, 25,23-, , .. -1-18, 25,28- , . . 18,

Arg ?ro-h-amylm, ces uys Arg r-ro-n-amyim, Arg25,28,29- , /. , 1- la 25,28,29.

?ro-n-amyIrn, ces- rys Arg Pro-n-amyem,

2e,28,29 , ,. . 1_T 2 5 , 2 8,2 8 . , . . n

Pro-n-amylm, ces- Lys Pro-h-amylrn a Pro^Val^' ^Pro-h-anylin konkurují amylinu v testu vázání na receotor. Tyto sloučeniny mají zanedbatelnou antagonistickou účinnost změřenou testem s m. soleus a bylo prokázáno, že mají účinek agonistů amylinu. Podobné výsledky byly získány s jinými snora uvedeným..

• rouceninami aconisty.

Sloučeniny antagenisté amylinu použitelné při způsobech léčby hypomotility žaludku zahrnují sloučeniny popsané v US pa tentové přihlášce č. 07/794 233, podané 19. listopadu 1991.

Sloučeniny, jaké jsou popsány shora, se připravují za použití standardních technik syntézy peptidu v pevné fázi a s vý hodou automatizovaného nebo poloautomatizovaného syntetizéru peptidu. Typicky se kondenzuje aminokyselina chráněná alfa-N-karbamoylovou skupinou a aminokyselina připojená k rostoucímu peptidovému řetězci na pryskyřici při teplotě místnosti v inertním rozpouštědle jako dimethylformamidu, N-methylpyrrolidonu nebo methylenchloridu v přítomnosti kondenzačních pros27 tředků jako dicyklohexylkarbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu za přítomnosti báze jako diisopropylethylaminu. Chránící alfa-u-karbamoylová skupina se odstraní z výsledná peptidove pryskyřice použitím reagencie jako trifluoroctové kyseliny nebo piperidinu a danou B-chráněnou tidovému řetězci, v oboru, přičemž vé skupině (tBoc) kondenzační reakce se zopakuje s další žáaminokyselinou, která má být přidána k pepVhodne skupiny chránící tí jsou dobře známé se zde dává přednost terč.butyloxykarbonyloa fluorenylmethoxykarbonylové skupině (Fmoc).

Rozpouštědla, deriváty aminokyselin a 4-methylbenzhydrylová pryskyřice používané v syntetizéru peptidu byly zakoupeny od Applied Siosystems Inc. (Foster City, CA), pokud není uvedeno jinak. Aminokyseliny s které byly použity a zakoupeny ter City, CA) zahrnovaly násled chráněným postranním řetězcem, od .Applied Biosystems Inc. (Bosující aminokyseliny: Soc-Arg(Mts),

Fmoc-Arg ( r.mc ) , boc r(Szl), Fmoc-Thr(t-Eu), Boc-Cer(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoo-Tyr(t-3u), Eoc-Lvs(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Eoc-Clu(Bzl), Fmoc-Glu(t-3u),Fmoc-His(Trt), Fmoc-. -Asn(Trt) a Fmoc-Gln (Trt) . Aminokyselina Boc-His(BOM) byla zakoupena od Applied Biosystems, lne. nebo od Šachem. Inc. (Torranca, CA). Anisol, methylsulfid, fenol, ethandithiol a thioanisol byly získány od Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Firma Air croducts and Chemicals (Allentown, PA) dodala fluorovodík. Ethylether, kyselina octová -a methanol byly zakoupeny od firmy Fisher Bcientific (Pittsburgh, PA).

Syntéza peptidu v pevné fázi byla provedena automatickým syntetizérem peptidu (Model 43OA., Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) za použití systému íIMP/HOBt (opce 1) a chemie tBoc nebo Fmoc (viz Applied Biosysteme Usar's íianual for the A3I 43OA Peptide Synthesizer, Version 1.38, 1. červenec 1988, oddíl 6, str. 49 až 70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Boc-peptidové pryskyřice byly rozštěpeny pomocí fluorovodíku po dobu 1 hopiny při teplotě -5 °C až 0 °C. Peptid byl extrahován z pryskyřice střídavě vodou a kyselinou octovou a filtráty byly lyofilizovány. Pmoc-geptidové pryskyřice byly rozštěpeny standardními metodami (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, lne., 1390, str. 5 ac 12). Nektare peotidy byly také sestaveny použitím Advanced Chem Tech syntetizéru (Model MPS 350, Louisvllle, kentucky). Peotidy byly vyčištěny vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s reverzními fázemi (preoarativní a analytickou) za použití systému uaters Delta Preo 3000. k izolaci peptidě byla použita preparativní kolona C4, Có nebo Cítí (10 ju, 2,2 x 25 cm, Vydac, Eesperia, CA) a čistota byla stanovena analytickou kolonou C4, Ctí nebo Cítí (5ji, 0,45 x 25 cm, Vydac). Rozpouštědla (A=3,14 TFA(kyselina trifluoroctová)/voda a 3=0,14 T?A/CE-,CM) byla přiváděna do analvtické kolony průtokovou rychlostí 1 ral/minuta a do preparativní kolony průtokovou rychlostí 15 ml/ninuta. Analýzy aminokyselin byly prováděny na systému Tatsrs Pice Tag a aminokyseliny sviv hvdrolvyly zpracovány použitím programu Maxima, zovány kyselou hydrclýzou v parní fázi (115 °C, 20 až 24 hodin).

Hydrolyzáty byly ivatizovány a analyzovány standardními meMeys M. a Tarrin T.L. (1339), The Pico Tag Advanced Techniques for .Amino Acid Analysis, ipore Corporation, Milford, MA) . Analýza bomatomy byla provedena pomocí M-3can, Incorer,?A). kalibrace hmotnosti byla provedena todami (Cohen 3.A., Method: A Manuel of str. 11 až 52, Milí burdováním rychlými porated (ilest Cnest glycerinem. etekce času Applied Biopoužitím jodidu cesia nebo směsi jodidu cesia s Desorpční ionizační analýza plasmy využívající d přeletu byla provedena hmotnostním spektrometrem Systems Bio-Ion 20.

Peptidově sloučeniny použitelné podle vynálezu mohou být též připraveny použitím technik rekombinantni DNA, což jsou metody v současné době v oboru známé. Viz např. Sa.mbrock a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor (1939).

Shora uváděné sloučeniny tvoří soli s různými anorganickými a organickými kyselinami a bázemi. Tyto soli zahrnují soli připravená s organickými a anorganickými kyselinami, například s kysiinou solnou, kyselinou bromevodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou toluensulfo.novou, kyselinou methansulfonovou, kyselinou trifiuoroctcvou, kyselinou octovou, kyselinou mravenčí, kyselinou maleinovou, kyselinou fumarevou a kyselinou kafrosultonovou. Soli připravené s bázemi zahrnují amoniové soli, soli alkalických kovů, např. soli sodné a draselné, a soli alkalických zemin, např. soli vápenaté a horečnaté. Výhodná jsou acetáty, hydrochloridy a trifluoracetáty. Soli mohou být vytvořeny obvyklými způsoby, jako reakcí produktu ve for mě volné kyseliny nebo báze s jedním nebo více ekvivalenty vhodn báze nebo kyseliny v rozpouštědle nebo v prostředí, ve kterém je sůl nerozpustná , nebo v rozpouštědle jako je voda, která se pak odstraní ve vakuu nebo lyofilizací nebo výměnou iontů existující soli za jiný ion na vhodné iontoměničové pryskyřici.

Shora popsané sloučeniny jsou užitečné vzhledem ke svým farmakologickým vlastnostem. Sloučeniny podle vynálezu jsou zejména účinné jako prostředky, které zpomalují vyprazdňování žaludku, jak je prokázáno jejich schopností snížit postprandiální hladiny glukosy u savců.

Jak popsáno v příkladu 1, byly vyhodnoceny účinky amylinu v tolerančních testech na orální podání glukosy u psu. S překvapením byle zjištěno, že amylin, který byl dříve popsán jako hyperglykemický (tj.jako takový, jaký způsobuje zvýšený obsah glukosy) místo-toho snižuje pestprandiální hladiny glukosy v plasmě c těchto testovaných zvířat. Amylin snižoval při všech velikostech dávek jak velikost zvýšení obsahu glukosy v plasmě tak maximální obsah glukosy v plasmě v tolerančním testu na orální podání glukosy.

Příklad 2 popisuje účinky agonisty amylinu AC-0137 na postorandiální hladiny glukosy v plasmě při klinických testech na lidech. U pacientů s juvenilním diabetem mellitus bylo pozorováno na dávce závislé snížení postorandiální hyperglykemie jak při jednorázově aplikaci tak pri kontinalni intravenozní infuzi.

Příklad 3 popisuje účinek kontinuální infuze AC-0137 (triproamylinu) na hladiny glukosy v plasmě po pokrmu Sustacal a po intravenózním podání glukosy. Při intravenózním podání glukosy nebyly hladiny glukosy v plasmo u pacientů léčených 50 ,/ug/hodina 7*0-0137 významně rozdílné od hladin glukosy pacientů, kterým bylo aplikováno plaoebo. Avšak u pacientů, kteří dosta•g>

kteří byli léčeni 25 jjg/hodina nebo 50 infuzi AC-0137, byly hladiny glukosy v plasmě sníženy u pacientu léčených AC-0137 ve srovnání 3 placetem. AC-0137 snížil postorandiální koncentrace glukosy v plasmě u diabetických pacientů závislých na insulinu po orální výživě, neměl však žádný zjistitelný účinek na koncentrace glukosy v plasmě po aplikaci intravenózní dávky glukosy.

li pokrm Sustacal . a _vug/hodina intravenózní

Jak popsáno v příkladu 4, měli pacienti s juvenilním diabetem, kteří pokračovali ve své obvyklá insulinové terapii a sami si píchali třikrát denně triproamylin (AC-0137), ve 14-ti denní dvojnásobně slepé, placetem kontrolované klinické studii nižší průměrné hladiny glukosy v krvi po jídle v testu než měli pacienti, kteří dostali insulin a plaoebo. Po 14 dnech byl pozorován statisticky významný (O = 0,02) účinek snižující glukosu (změřený jako plocha pod glukosovou křivkou) při 30 mikrogramech, maximální koncentrace triproamylinu v plasmě byly v rozmezí amylinu zjištěného v krvi nadiabetických jedinců. Triproamylinem vyvolaná snížení AuC doprovázela průměrná snížení o 45 mg/dl až 60 mg/dl u maximálních koncentrací glukosy v krvi pacientů.

Jak popsáno v příkladu 5, vyprazdňování žaludku bylo měřeno u normálních a insulinem léčených spontánně diabetických krys EB pomocí retence kalorického methylcelulosového gelu obsahujícího fenylovou červeň,který byl aplikován žaludeční sondou. Obsah barvivé v žaludcích, odstraněných z krys, které byly uhubeny po 20 minutách, byl stanoven spektroskopicky a byl porovnán s obsahem barviva v žaludcích krys uhubených bezprostředně po aplikaci gelu žaludeční sondou ke stanovení vyprazdňování. U diabetických krys bylo zjištěno výrazně větší vyprázd ňování žaludku (prošlo 90,3+1,7 č) ve srovnání s normálními kry sami Harlan Sprague Dawley (43,1+4,7 -s prošlo, P<0,00l) _a nediabetickými krysami B3 (61,1 + 9,2 % prošlo,<(? 0,001). Paptid pankreatických beta-buněk amylin, který chybí v IDDti, zabraňoval v závislosti na dávce vyprazdňování žaludku jak u normálních tak u diabetických krys. ED-^ odpovědi jak u normálních tak 3 Ό· u diabetických krys bylo -ljug, dávka , která měla za následek maximální koncentraci 75 pM 20 minut po injekci. Tyto koncentrace jsou v rozmezí pozorovaném in vivo. Tyto výsledky podporují závěr, že se amylin podílí na fyziologické regulaci vstupu výživy do duodena.

Jak popsáno v příkladu 5, byl měřen u hladových, korpulentních krys LA/D, které byly při vědomí, příjem dávky spolknuté značené glukosy.Předcházející injekcí antagonisty receptoru amylinu AC-0187 sa urychlilo objevení se v plasmě tritiiniekce a pocházejícího od glukosy, .kromě toho vedla předb antagonity amylinu k většímu růstu koncentrace glukosy v plasma 15 minut co žaludeční sondo a k dřívějšímu poklesu hladin glukosy v plasmě. Tyto údaje souhlasí s tím, že antagonista amylinu AC-01S7 působí proti účinku endogenně secernovaneho amylinu, čímž se urychluje vyprazdňování žaludku.

V dodatečných studiích s anastezovanými krysami bylo zjištěno, že amylin neovlivňuje absorpci glukosy do krve z tenkého střeva. V těchto pokusech byla a.nes tezovaným krysám aplikována kontinuální infuze krysího amylinu (0,35 nm/kg/min) nebo fyziologického roztoku (v případě kontrolních zvířat) po do32 bu 3 hodin.Po uplynutí jedné hodiny po infuzi amylinu byla vpra vana jednorázová dávka glukosy (1 g/kg) bua do žaludku nebo do duodena trubičkou vsunutou ezofagem. Protože studie zahrnovaly spíše anestezované krysy než krysy při vědomí, nejsou tyto brány v úvahu při analýze mobility žaludku, např. rychlosti vyprazdňování obsahu žaludku do duodena. studie však naznačují že absorpce glukosy z duodena do krve nebyla zpomalena amylinem. X přesnějšímu určení, zda amylin ovlivnil přechod glukosy z lumanu tenkého střeva do krve, byl použit jiný preparát. Anestezovaným krysám byl odebrán segment tenkého střeva, stále ještě spojený se zvířetem cestou zásobení krví byly do něj vpraveny ka.nyly tak, aby tenké střevo mohlo být promývano glukosovými roztoky o regulovaném složení. Do zvířat byly zavedeny ka.nyly také prostřednictvím tepny za účelem odběru vzorků krve a prostřednictvím žíly za účelem infuze amylinu, insulinu a glukosy. Lumen byl promýván roztokem glukosy značené tritiem. Postup glukosy z lumene střeva do krysy byl měřen výskytem tritiového značení v plasmě. Předpoklad, že takový výskyt tritia v plasmě je vskutku měřítkem absorpce glukosy ze střeva, byl testován aplikací blokátoru transportu glukosy floridzinu. Floridzin zabránil značnou měrou transitu značení z lumenu stře va do plasmy. X zabezpečení, aby gradient glukosy mezi lumenem střeva a plasmou zůstal konstantní, byl během infuzi glukosy obsah glukosy v plasmě upravován infuzi glukosy, kterábyla regulována v odpovědi na změny v koncentraci glukosy v plasmě. V tomto preparátu neměly intravenózní infuze amylinu žádný účinek na rychlost, kterou značená glukosa předaná tenkému střevu vstoupila do plasmy. Tyto výsledky ukazují, že snížený obsah glukosy v krvi pozorovaný u amylinem léčených jedinců ve shora popsaných studiích není pravděpodobně důsledkem snížené absorpce z tenkého střeva, nýbrž spíše důsledkem snížené rychlosti transferu obsahu žaludku do duodena, tj. v důsledku zpomaleného vyprazdňování žaludku.

Prostředky použitelné podle vynálezu mohou být účelně u33 praveny do formy přípravků vhodných pro parenterální (včetně intravenózní, intramuskulární a subkutánní) nebo nasální nebo orální aplikaci. V některých případech bude účelné sestavit agonistu amylinu a jiné činidlo působící proti vyprazdňování, jako glukagon,do jediného prostředku nebo roztoku pro společnou aplikaci. Jindy může být výhodnější aplikovat jiné činidlo působící proti vyprazdňování odděleně od uvedeného amylinu nebo analogu agonisty amylinu. Vhodná aplikační forma může být nejlépe stanovena ošetřujícím lékařem pro každého pacienta indi viduálně. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče a jejich léko vá formy jsou popsány v standardních pojednáních o lékových formách, např. Remingtons Pharmaceutical Sciences od S.W. Mar tina. Viz též ííang Y.J. a Hanson M.A. Parenteral Formulation of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Tachnical Report č. 10, dodatek 42:23 (1938).Vhodné léková formy obsahující hypoglykemická činidla jako sulfonylmočoviny jsou známé v oboru.

Sloučeniny použitelné podle vynálezu mohou být upraveny jako parenterální prostředky pro injekce nebo infuze. Mohou být například suspendovány v inertním oleji, s výhodou v rostlinném oleji jako sezamovém, arašídovém, olivovém oleji nebo v jiném vyhovujícím nosiči. S výhodou jsou suspendovány ve vodném nosiči, například v isotonickém roztoku pufru při pH kolem 5,5 až 7,4. Tyto prostředky mohou být sterilizovány obvyklými sterilizačními technikami nebo mohou být sterilně filtrovány. Tyto prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky potřebné k dosažení fyziologických podmínek, například pufry. Užitečným pufrem je například směs octanu sodného a kyseliny octové. Může být použita forma s protrahovaným účinkem nebo depotní přípravek s pomalým uvolňováním účinné látky, aby sa terapeuticky účinná množství přípravku dostávala do krevního řečiště během mnoha hodin nebo dnů následujících po transdermální injekci nebe podání.

Žádoucí isotonicity může být dosaženo použitím chloridu sodného nebo jiných farmaceutick/ přijatelných činidel, jako dextrcsy, kyseliny borité, tartrátu sodného, propylenglykolu, polyolu (jako mannitolu a sorbitolu) nebo jiných anorganických nebe organických solutů. Chloridu sodnému sa dává přednost zešmena pokud se týká pufrů obsahujících sodíková ionty.

Roztoky shora uvedených prostředků mohou být popřípadě zahuštěny zahuštovadlem jako je methylcelulosa. Mohou být připraveny v emulgované formě, buc voda v oleji nebo olej ve vodě. ílúže být použito široké spektrum farmaceuticky přijatelných emulgacnicn činidel vcetne například akáciovéno prášku, neionogen.ního benzinu, například Tweenu, nebe iontového tanzidu, na?— íkla·. neoo sulconatu alkaliceých kovu polveťnsroly^oiú, napr τπ tonu.

Prostředky použitelné podle vynálezu se připravují smísením jednotlivých složek všeobecné přijatými postupy. Zvolené složky mohou být například jednoduše smíšeny v mísiči nebo jinam standardním zařízení pro přípravu koncentrované směsi, která pak může být upravena na konečnou koncentraci a viskozitu přídavkem vody nebo zahučtevadla a popřípadě pufru pro regulaci pí-I nebo dodatečného solutu pro regulaci tonicity.

Pro použití lékařem budou prostředky adjustovány do formy dávkovačích jednotek obsahujících množství amylinu nebo agonisty amylinu, například sloučeniny analogu agonisty amylinu s nebo bez jiného činidla působícího proti vyprazdňování, které bude schopno účinně regulovat v jedné dávce nebo ve vícenásobných dávkách cukr v krvi na zvolené hladině. Terapeuticky účinná množství amylinu nebo agonisty amylinu, například analogu agonisty amylinu, pro použití při regulaci vyprazdňování žaludku a za podmínek, při kterých je vyprazdňování žaludku příznivě zpomalováno nebo regulováno, jsou taková, která snižují postprandiální hladiny glukosy v krvi, s výhodou ne více než asi na nebo 9 mii, nebo taková, že se hladiny glukosy v krvi sníží podle potřeby. U diabetických pacientů nebo u pacientů, kteří nesnášejí glukosu, jsou hladiny glukosy v plasmě vyšší než u normálních jedinců. U těchto pacientů je mošno dosáhnout pří znivého snížení nebo vyrovnání postprandiálních hladin glu kosy v krvi. Jak je zřejmé od zorníkům, bude účinná množství te rapeútického prostředku ovlivněno mnoha faktory, jako věkem a hmotností pacienta, pacientovou fyzickou kondicí, hladinou cuk ru v krvi nebo tím, jakého snížení účinku amylim.

ženo, a jinými faktory.

má být dosaTyto farmaceutické prostředky jsou užitečné, aby u pacienta bylo dosaženo hypomotility žaludku,a mohou se použít i u jiných poruch, kde se mobilita žaludxu příznivě sníží.

z. - - - . - , . - , .--.13 2 □ , 2 3 _ ucrnna cenní ;cavxa sloučenin zanrnujicicn Arg Pro, .· . l_r 18_a 25,23,29 .. 13. 25,23,29_

-h-amylin, ces- Lys Arg ?ro-n-amylm, Arg Pro.. . l_r 18 25,23 .. 25,23,29 ...

-h-amylm, ces- Lys Arg Pro-h-amylm, Pro-h-amylm . 1- 25,28,29-, , . . 25 26_T, . 25,23 . .

des- Lys Pro-h-amylm a Pro Val Pro-h-amylm oude oovykle v rozmezí 0,01 nebo 0,03 až asi 5 mg/den, s výhodou asi 0,01 nebo 0,5 až 2 mg/den, a -výhodněji asi 0,01 nebo 0,1 až 1 mg/den, pro pacienta o hmotnosti 70 kg, aplikovaná v jediné dáv ce nebo v rozdělených dávkách. Přesná dávka, která má být aplikována, je stanovena ošetřujícím lékařem a je závislá na tom, kde příslušná sloučenina leží ve shora uvedeném rozmezí, jakož i na stáří , hmotnosti a kondici pacienta. S aplikací by se mělo začít při první známce symptomů nebo krátce oo stanovení diagnosy diabetů mellitus. Aplikace může být injekční, s výhodo^;subkutánní nebo intramuskulární. Orálně účinné sloučeniny by měly být podávány orálně, avšak dávkování by mělo být zvýšeno 5 až 10 násobně.

Obvykle mohou být při léčbě nebo prevenci zvýšených, nevyhovujících nebo nežádoucích postprandiálních hladin · glukosy v krvi podávány sloučeniny podle vynálezu pacientům, kteří potřebují takovou léčbu, v roz mezích dávek podobých shora uvsdaným, sloučeniny sa však aplikují častěji, například jednou, dvakrát nebo třikrát denně.

Antagonisté amylinu použitelní při léčbě žaludeční hypomotility se mohou aplikovat v dávkách od 0,1 do 30 mg/den, s výhodou od 0,3 do 10 mg/den a ještě výhodněji od 0,1 do 3 mg/den. Aplikace může být subkutánní nebo intramuskulární injekcí. Orálně účinné sloučeniny mohou být podávány orálně, avšak dávkování by mělo být zvýšeno 8 až 10 krát.

Následující příklady, které popisují výsledky serie pokusů, jsou připojeny pro lepší porozumění vynálezu. Pokusy týka-

jí	cí se vynálezu nemá	jí ovšem	omezovat	vynález a má se	za to,
'T o	všechny obměny vyn	á 1 s z u, v	současné	době- známé nebo	pozne-
ji	vyvinuté v mezích	znalostí	odborníků	. v oboru, budou	spadat
do	rozsahu vynálezu,	jak je zá	,e popsán	a později nárokován.

Príklady provedení vynálezu

Příklad 1

Předcházející studie ukázaly, že intravenózní injekce amylinu do hladových a krmených krys za podmínek tolerančního testu na glukosu mohou zmenšit pokles glukosy v plasmě, a zvýšit laktát v plasmě způsobem závislým na dávce. Infuzemi smylinu sa u hladových zvířat významně sníží odpovědi na insulin.

Následující studie a pokusy však ukázaly, že infuze amylinu snížila hladiny glukosy v plasmě u psů jako odpověó na hladinu orální glukosy. Účelem těchto studií bylo: (1) vyhodnotit změny obsahu glukosy, laktátu a insulinu v plasmě v odpovědi na dávku orální glukosy, (2) zhodnotit účinky intravenózně aplikovaného amylinu na tyto proměnné a (3) vyhodnotit účinnost a.ntagonisty amylinu AC-0253 (acetyl-^^' ^^Arg, ^°Arg, ^“tyr9-32 kacitonin(lososí)) při zrušení jakýchkoliv amylinem vy37 byli použiti psi smíšené rasy (9 samců, až 17 kg). všechna zvířata se nechala před ět přes noc. Každé zvíře sloužilo pro všec?

ní kontrola. Zvířata byla ekvilibrována volaných změn glukosy v krevní plasmě.

Pro tuto studii rozmezí hmotnosti 12 každou studií hladov ny pokusy jako vlast po dobu 30 až 50 minu před zahájením každého protokolu.

Při t = -30 bylo započato s nosičem nebo amylinem + AC-0253 Rychlosti aplikace dávek amylinu byly 50, 100 a 300 pmol/kg/min. Rychlosti aplikace dávek AC-0253 byly 500 a 1500 pmol/kg/min.

25¾ glukosa byla aplikována ústy při t = 0 minut. Aplikace amylinu + AC-0253 byla přerušena při t = 120 minut. Vzorky insulinu, glukosy a laktátu byly získány v 15 minutových intervalech od t = -45 do t = ltíO minut. Vzorky krysího amylinu a AC-0253 byly odebrány v t = 50 a 120 minut.

U normálních osu se maximum glukosy v plasmě dostavuje mezi 30 a 45 minutami po dávce orální glukosy u psů, kteří jsou při vědomí. I když mezi psi existovala značná různorodost, byly vzorky odpovědi reprodukovatelné pro každého jednotlivého psa. Amylin snižoval při všech velikostech dávek jak rychlost růstu koncentrace glukosy v plasmě tak také maximální obsah glukosy v plasmě. Během infuze amylinu se ukázalo, že glukosa v plasmě dosáhla stabilní hladiny při obsahu glukosy v plasmě výrazně nižším než u kontrolních pokusů, při 30 až 45 minutách a začala se zvyšovat znovu po ukončení infuze amylinu. Nebyly žádné rozdíly ve změně obsahu glukošv v plasmě mezi rychlostmi dávek amylinu 50, 100 a 300 pmol/kg/min.

Pro pokusy provedené k vyhodnocení účinnosti AC-0253 zvrátit amylinem vyvolané změny v obsahu glukosy byla zvolena rychlost aplikace dávek 50 pmol/kg/min. AC-0253 nezruší až do 1500 pmol/kg/min úplně účinky amylinu (50 pmol/kg/min).

AC-0253 sám nemá žádný účinek na změny v koncentraci glukosy

3c v plasmě. Účinky amylinu a AC-0253 na laktát v plasmě byly neznatelně .

Příklad 2

Dvacebčtyři rmižšrí pacienti s diabetem mellitus závislém na insulinu se zúčastnili, klinické studie agonisty amylinu AC-0137. každý pacient byl randomizcvaně určen do jedné ze čtyř skupin, které dostávaly placebo, 30, 100 nebo 300 jug AC-0137. Pacienti v každé skupině byli podrobeni dvoudobému křížovému pokusu k prozkoumání jednorázové intravenózní aplikace oproti intravenózní infuzi léku. každé období sestávalo z třídenního pobytu ve studijní jednotce. Při každé příležitosti byl počáteční den pobytu věnován aklimatizaci na studijní jednotku. Druhý a třetí den byl vytvořen vložený křížový pokus plaoeba proti aktivní medikaci. Například pacienti, kteří byli náhodně vybráni, aby dostali nejdříve intravenózní jednorázovou dávku, byli dále určeni, že dostanou intravenózně jednorázovou dávku AC-0137 jeden den a intravenózně jednorázovou dávku placeba druhý den (nebo naopak po jednorázově dávce placeba násle dovala jednorázová dávka AC-0137). Po dvou týdnech byli pacien ti znovu přijati, aby dostali stejnou dávku AC-0137 opačným způsobem aplikace, tj. intravenózní infuzi.2. a 3. den po tomto příjmu byl použitprojekt vloženého křížového pokusu pro aplikaci léku a placeba podobným způsobem, jaký byl použit během prvého příjmu. Šest pacientů určených do skupiny s placetem dostali placebo každv den během studie.

každý den v průběhu studie byly pacientům zavedeny nejméně 30 minut před zahájením studie katétry. 15 minut před us.nutím si pacienti aplikovali obvyklou dávku insulinu subkutánní injekcí. V čase 0 dostali pacienti bud jednorázovou injekci stanovené dávky AC-0137 nebo placeba během dvou minut nebo byla zahájena kontinuální infuze AC-0137 nebo placeba, ve které bylo pokračováno po dobu dvou hodin. Rychlost in39 fuze byla stanovena tak, aby určené množství léku bylo apliko váno během těchto dvou hodin. Po třiceti minutách snědli naci enti své obvyklé snídaně. Vzorky krve byly odebrány mezi -30 300 minutami ke změření hladin AC-0137 v plasmě a hladin glukosy v plasmě.

Hladiny léku v plasmo sledovaly očekávaný průběh, přičem dosáhly maxima brzy po injekci jednorázové dávky a potom zmi zely z plasmy. Na rozdíl od toho vedly kontinuální infuze k hladinám, které se přiblížily rovnovážnému stavu během 30 minut a zůstaly na této hladině po zbytek infuze. Po ukončení infuze hladiny plasmy poklesly podobným způsobem, jaký byl po zorován při aplikaci jednorázové infuzní dávky.

Hladiny glukosy v plasmě ukázaly na některé neočekávané a zajímavé jevy. Jak může být vyhodnoceno na základě pacientů kteří dostali placebo při každé příležitosti, byly hladiny gl kosy v plasmě zvýšeny oproti výchozímu stavu po SO až 90 minu tách a zůstaly zvýšeny nejméně 240 minut.Jednorázová intravenózní aplikace AC-0137 navedla k žádné zřejmé změně v hladí nach glukosy po dávce 30 pg. Při jednorázové dávce 100 jug by lo postprandiální zvýšení glukosy zřetelně opožděné a méně v razné. Po jednorázové dávce 300 jug byl postprandiální růst hladin glukosy v podstatě eliminován.

Při kontinuální intravenózní infuzi bylo pozorováno sniž ní postprandiální hyperglykémie závislé na dávce. Hodnoty z infuze 15 yig/hodina jsou vysoce přesvědčivé o účinku a jak se rychlost infuze zvyšovala na 50 a 150 jug/hodina, je snížení postprandiálního růstu hladin glukosy frapantní. Podobné třen dy jsou zřejmé ze studií používajících jednorázovou aplikaci léku.

Příklad 3

Aby byl dále demonstrován účinek triprcamyiinu (AC-0137) a abj bylo potvrzeno, řadě gastroA .· η

še snížení cos tprandiální 'nyperglykémie intestinálním účinkem, byla provedena jednostranně slepá, placebem kontrolovaná, dvoudobá, zkřížená studie minimálně s 15 hodinovou přestávkou mezi léčebnými postupy. Dvacet sedm pacientů s diabetem mellitus bylo určeno do kombinace skupin dvou hladin dávky a dvou typů tolerančních testů. Pacienti dostali léčbu AC-0137 a placabem pomocí kontinuální mikroinfuzní pumpy v souladu se zkříženou metodou. Pacienti byli rozděleni do tří skupin po devíti pacientech následovně: Skupina A dostala

O jídla Sustacal“ a dávku 25 pag/hodina AC-0137. Skupina 3 dostala jídla Sustacal^1, a dávku 50 pig/hodina. Skupina C dostala intravenózní dávku glukosy a dávku 50 jug/hodina AC-0137.

Pacienti zůstali na klinice tři dny. První den pobytu na klinice se pacienti aklimatizovali. Druhý a třetí den se pacienti podrobili dvcudobému zkříženému pokusu s AC-0137 oproti placetu. Kromě tohc dostali pacienti buc jidlo Sustacal nebo byli podrobeni tolerančnímu testu s intravenózní glukosou jak bylo předem pro danou skupinu stanoveno.

Během prvního dne byl pacientův insulinový a kalorický příjem stabilizován a každý pacient pak dodržoval tento insuli nový a dietetický režim během celého pobytu na klinice. Přibli žně v 7 hodin (T=0) se započalo s kontinuální infuzí v souladu s medikací podle studie. V T=30 minut si pacienti aplikovali svou obvyklou ranní dávku insulinu. V t=30 minut dostali paO cienti standardizovaná jídlo Sustacal“ obsahující 355 kalorii k vypití nebo intravenózní dávku 300 mg/kg glukosy, aplikovanou jako intravenózní infuzí D_<,’? během pěti minut za použití infuzní pumpy. Typ tolerančního testu byl stanoven podle randomizovaného rozvrhu. V pravidelných intervalech byly odebrány vzorky krve pro měření glukosy, laktatu a insulinu a pro stanovení koncentrací AC-0137 v plasmě.Aplikace léků při studii byla přerušena v t-300 minut.

Třetí sen ráno byly znovu zavedeny katétry podobným způsobem jako druhý den. Pacienti si aplikovali své ranní dávky insulinu jako druhý den. Pacienti dostali placebo nebo medikaci podle studie zkříženým způsobem za použití téže intravenózní cesty a téhož režimu jako předcházející den (tj. pacienti, kteří dostali infuzi AC-0137 druhý den, třetí den dostali infuzi placeba). Pacienti byli podrobeni stejnému tolerančnímu testu , R ss standardizovaným jídlem Sustacal nebo dostali stejnou intra venózní dávku glukosy, jako dostali druhý den. Po odebrání vzor ků byly intravenózní katetry odstraněny.

Jak je patrno na obr. 10, nebyly u pacientů léčených 50 jag/ hodina AC-0137 s dávkou intravenózní glukosy hladiny glukosy v plasmě významně odlišné od pacientů léčených placebem. Tyto rozdíly v koncentracích glukosy po injekci byly statisticky významné, k dv:

e srovnaly plochy pod křivkami glukosy zkorigovanými o výchozí hodnoty (P = 0,0015). Tedy pozorování snížení postprandiální hyperglykémie během aplikace AC-0137 bylo potvrzeno použitím standardizovaného jídla v přítomnosti významně nižších středních koncentrací A.C-0137, než jaké byly použity dříve.

9, u pacientů, kteří doAvšak, jak znázorněno v obr. 3 R stali jídlo Sustacal a byli léčeni 25 yag/hodina nebo 50 jig/hodina intravenózní infuzi AC-0137, byly sníženy hladiny glukosy v plasmě v případe pacientů léčených AC-0137 oproti pacientům léčeným placebem.

AC-0137 snižoval v přijatelných farmakologických dávkách postprandiální koncentrace glukosy v plasmě po orálně přijatých živinách u diabetických pacientů odkázaných na insulin, neměl však měřitelný účinek na koncentrace glukosy v plasmě po aplikaci intravenózní dávky glukosy. Tyto výsledky jsou v souladu s myšlenkou, že AC-0137 modifikuje příjem orálně podaných živin ze strava a naznačují, že na tomto účinku se alespoň zčásti podílí změna rychlosti vyprazdňování žaludku.

Přklad 4

Náhodně vybraná, dvojnásob □lepá, piacsben kontrolovaná paralelní skupina byla určena ke stanovaní účinku triproamylinu (AC-0137) na hladiny glukosy v plasmě po požití standardizovaného jídla Sustacal* (Mead-Johnson). Na 14-ti denním klinickém pokusu sa zúčastnilo 72 pacientů s diabetem mellitus závislém na insulinu. Každý pacient byl namátkově přidělen do jedné ze čtyř léčebných skupin, které dostávaly 14 dní třikrát denně subkutánní injekcí placebo, 30, 100 nebo 300 jug triproamylinu. Pacienti zůstávali také během studie při svém obvyklém insulinovém režimu. V den 1 (výchozí stav), 7 a 14 byly provedeny toleranční testy na standardizované jídlo.

Při tolerančních testech na s pacienti kapalné jídlo Sustacal** ( rií) v 3 hodin. Od 22 hodin minulé pít kromě vody. Pacienti si neacli dávku insulinu až do 30 minut před testu výchozího stavu byl 1. den t plikován až po dokončení testu. 7.

tandardizcvané jídlo dostali 350 ml obsahujících 350 kaleno večera nedostali jíst ani kovali svou obvyklou ranní jídlem Sustacal'. Za účelem riprcamvlin (nebo placebo) aa 14. den byl triproamylin kcí ve stejnou dobu pro stanovení hladin , 50, 120 a 130 mibyl pokládán čas, kdy (nebo placebo) aplikován samostaznou i.nje jako obvyklá ranní dávka insulinu. Vzorky glukosy v seru byly odebrány v -30, C, 30 nut vzhledem k začátku testu.Za čas nula pacient začal pít jídlo Sustacal tabulce 1 a na obr. 11 až 13 dávek 30 jug a ICO jig statis snižující účinek, změřený jaTriproamylinem (AC-0137) vy(AoC) doprovázela průměrná

Jak znázorněno v níže uvedené po 14 dnech byl pozorován u hladin ticky významný (o = 0,02) glukosu ko plocha pod glukosovou křivkou. ' volaná snížení v ploše pod křivkou snížení od 45 mg/dl do 50 mg/dl maximálních končen sy v krvi u pacientů.

ací gluko/1 7) -/

Tabulka 1

Změna v glukosa po jídle (AUC) po 14 dnech triproamylinu

Dávka triproamylinu podaná 3 krát denně placebo 30 jug 100 jag 300 jig

Počet pa	cisntů t
tova.ných	14 dní
Glukosa	po jídla
Průměr změn v AU·
(mg/dl*	min)(a)
Hodnoty	P oproti
clacebu	(b)

15 +229 -5 645

0,02

12

-5 412 -7 316

0,02 0,11

Maxima triproamylinu v plasmě (pikomoly/ litr) + 4

44+14 173+40 (a) AUC je plocha pod křivkou koncentrace glukosy týkající se hodnoty glukosy před jídlem, mezi počátkem testovacího jídla a 3 hodiny později. Změna v AUC je hodnota při cředdávkování minus hodnota 14. den pro každého pacienta testovaného po oba dny.

(b) P hodnoty získané z neparametrického Nilcoxonova testu.

Příklad 5

Následující cen byla studie uskutečněna k prozkoumání účin ků agonistů amylinu na vyprazdňování žaludku na modelu hlodavce se spontánním autoimunním diabetem, insulinem léčené krysy

23.

Byli použiti samci krys Marian Sprague Dawley (HSh) o hmot nosti 151 až 244 g a Biobresding (33) hmotnosti 181 až 405 kteří byli vypěstováni va vlastní laboratoři z kolonie, která byla původně získána roce 1989 z Nóllegárd Sreeding Center, Dánsko. Když bylo potvrzeno giykosurií nejméně po 2 dny, že kry sy 33 byly diabetické, byly léčeny denně subkutánními injekcemi lidského rekombinantniho insulinu ultralente (Humuiin-U, Eli Lilly, Indianapolis). Insulinová léčba měla za cíl udržet glukosu, ale minimalizovat ketony v moči, aby se zabránilo hypcglykemickým úmrtím. Ve skutečnosti byla přítomna glykosurie při 83 % měření a ketonurie v 52 %. Průměrné trvaní diabetů bylo 53+5 dní a denní potřeba insulinu činila 4,7+0,3 jednotky. Všechna zvířata byla ustájena při 22,7+0,3 při cyklu 12 hodin světlo, 12 hodin tma, přičemž se pokusy prováděly při světelném cyklu, a byla krmena a napájena vodou ad libitura (Diet liM—485, Cek lad, Madison, WI) .

Stanovení vyprazdňování žaludku níže popsanou metodou bylo obvykle provedeno po hladovění až 20 hodin k zajištění, aby žaludek neobsahoval žádný chymus, který by rušil spektrofotometrická měření absorbance.Diabetické krysy léčené insulinem ultralente se však nemohly nechat hlaaovžt20 hodin. Hladovění po dobu delší než 5 hodin mělo za následek vznik hypoglykémie. Takováto zvířata se proto nechala hladovět pouze 5 hodin před měřením vyprazdňování žaludku.Nediabetické krysy se nechaly hla dovět o nebo 20 hodin před provedením pokusu. Zjistili jsme, že i nediabetické krysy 33 mají zvýšené koncentrace glykovaného hemoglobinu.Pro srovnání s diabetickými krysami byly použity jak nediabetické krysy Marian Sprague Dawley tak nediabetické krysy 33. Bylo tedy 5 léčebných skupin:

(1) Nediabetické krysy Karlan Sprague Dawley, která se nechaly hladovět 5 hodin, n=8, (2) Nediabetické krysy 33, které se nechaly hladovět 6 hodin, n=5,

- 4 5-

(3)	diabetické krysy 32, hladovějící 5 hodin, n=10,
(4)	nediabetické krysy Karlan Sprague Dawley, které
	se nechaly hladovět 20 hodin, n=20,
(5)	nediabetické krysy 33, které se nechaly hladovět
	20 hodin, n=7.

Xrysám bylo při vědomí aplikováno žaludeční sondou 1,5 ml nskalorického gelu obsahujícího 1,5 % methylcelulosy (M-0252, Sigma Chemical Co., St Louis, MO) a 0,05 % fenolová červeni jako indikátoru. Dvacet minut po aplikaci žaludeční sondou byly kcysy anestezovány za použití 5¾ hnlotnanu, žaludek byl odkryt a sevřen u pylorickáho a ezofágcvého sfinkteru tepennými kleštěmi, vyjmul se a vyprázdnil do alkalického roztoku, který byl sestaven do určeného objemu. Obsah žaludku byl odvozen podle intenzity fenolové červeni v alkalickém roztoku, změřená absorbancí při vlnové délce 550 nm. U většiny pokusů byl žaludek čirý. U jiných pokusů se jednotlivé žaludeční obsahy odstředily, aby sa vyčeřil roztok pro měření absorba.nce. Tam, kde zředěné, žaludeční obsahy zůstaly kalné, byla spektroskopická absorbance v důsledku fenolové červeně odvozena od rozdílu absorbance v alkalickém a okyseleném rozpouštědle. Při separátních pokusech na 7 krysách byly žaludek a tenké střevo excitovány a vyprázdněny do alkalického roztoku. Množství fenolová červeně, které mohlo být regenerováno z horního gastrointestinálního traktu během 20 minut aplikace žaludeční sondou, činilo 89+4 %. Aby se dosáhlo maximální regenerace barviva menší nez 100%, byly žaludeční obsahy zbývající po 20 minutách vvjádr; ny jako podíl žaludečních obsahů získaných z kontrolních krys hubených ihned po aplikaci žaludeční sondou v tomtéž pokusu.

Při studiích výchozího stavu ( kde nebyl injektován amylin) bylo stanoveno vyprázdňování žaludku během 20 min v 5 léčebných skupinách popsaných shora. Ve studiích odpovědi na dávku byl krysí amylin (Šachem, Torrance, CA) rozpuštěn v 0,15M fvzioloformě 0,1 ml subkutánní jednorá , 0,1, 1, 10 nebo 100 jug 5 mindou 46 nediabetickým krysám 2 nechaly hladovět 20 hodin □etickým krysám 03, které se - , 5 , 3, 3, 10) .

gickém roztoku a aplikován va zová injekce v dávkách G, 0,01 nut před aplikací žaludeční sc Harlan Sprague Dawlsy, které s (n=17, 2, 8, 8, 5, 5) a 2 3 dia nechaly nladovět δ hodin(n=10,

V samostatném pokusu, provedeném za účelem vyhodnocení změny v koncentracích amylinu v plasmě, ke které došlo v důsledku účinné subkutánní dávky amylinu, byly odebrány vzorky kr ve z ocásků krys a.nes tezovaných halothanem pc subkutánní jedno rázové injekci buč 1 _Uug (n=3) nebo 10 yig (n=3) krysího amylinu Při jiném pokusu byly koncentrace amylinu v plasmě porovnány u krys Harlan Sprague Dawlsy, které se nenechaly hladovět (n=3) a u diabetických krys 33, které se nenechaly hladovět (r.=5). Plasma z 250^ul vzorků odebraná v 10 minutových intervalech se odstředila a zmrazila ori -20 C pro analýzu dvoumístným imunoenzymometrickým testem vyvinutým ve vlastní laboratoři.

K provedení imunologického testu byly pokryty černé mikro titracní destičky (Dynatech, Chantilly, VA) protilátkou 3024-4.4 (Phelps JL, Slase Ξ, Koda JS, nepublikováno) inkubací pře noc při 4 °C 20 jjg protilátky na ml v 50 mií uhličitanu při pH 9,6.Destičky se omyly Směsí 0,05 M Tris/0,15 li chloridu sodného/0,02 2 azidu sodného/0,1 % Tween 20 (THS/Tween) a zasytily se 1% nemastným práškovým sušeným mlékem ve stejném uhličitane vém pufru po dobu jedná hodiny při teplotě místnosti. Zamrazené vzorky se nechaly rozmrazit a zředily se ve směsi 4¾ 3SA a 200 mg/dl supertrátu hovězího cholesterolu (Hilex Pantax reagents, Miles Laboratories, Kankakee IL), pokud bylo zapotřebí. Vzorky nebo standardy se přidaly k pokrytým a zasyceným destičkám a inkubovaly se jednu hodinu oři teplotě místnosti. Po omytí byla přidána detekční protilátka FO25-27 konjugova.ná na alkalickou fosfatasu. Kondenzace protilátka-enzym byla provede na pomocí konjugačního setu maleimidevou alkalickou fosfatasou (Pierce Immunochemical Co (Rockford IL)). Konjugát byl inkubován tři hodiny při teploto místnosti, načež byly destičky důkladně omyty fyziologickým roztokem pufrovaným Tris. Vázaný enzym byl zjištěn inkubací destiček fluorescentním 4-methylumbelliferylfosfátovým substrátem o 50 jug/ml v 1’·! diethylamin/ 0,5 míl llgCl, plí 9,8 po dobu 40 minut při teplotě místnosti. Fluorescentní signál byl změřen pomocí přístroje Dynatech í-Ii— crofluor plate reader a hodnoty byly zanalyzovány na iiulticalc software (Wallac, Gaithersburg I1D) . koncentrace amylinu ve vzorcích plasmy byly stanoveny porovnáním s křivkou standardů provedenou při tomtéž pokusu. Při provedení tímto způsobem má pokus minimální zjistitelnou koncentraci 2 pil.

Křivky odpovědi na dávku pro vyprazdňování žaludku byly přizpůsobeny 4-parametrovému logistickému modelu za použití iterační rutiny nejmenších čtverců (ALLFIT, v2.7, ííIH, 110), aby se odvodila SD. . Protože SD_ je log-normálně rozloženo je vyjádřeno + standardní odchylka logaritmu.Srovnání v párech bylo uskutečněno za použití jednocestné analýzy variance a 3tudent-Newman-Keulsova vícenásobného srovnávacího testu (In□ tat v2.0, C-raphPad Software, San Diego) použitím P/o,O5 jako hladinv významnosti.

ϋ 3 krys Harlan Sprague Dawley, které se nenechaly hladovět, činily koncentrace cirkulujícího amylinu 11,7+1,4 pil (95 % Cl 3,4 až 14,9 pil) . Pro srovnání, koncentrace amylinu u 5 spontánně diabetických krys, které se nenechaly hladovět, nebyly zjistitelné.

V následující tabulce 2 jsou zaznamenány frakce barviva, zůstávajícího 20 minut po aplikaci fenolové červeni žaludeční sondou,spolu s příslušnými statistickými srovnáními. Jak u krys Harlan Sprague Dawley tak u nediabetických krys B3 bylo vyprazdňování barviva oo 20 minutách stejné, at se zvířata nechala hladovět po dobu δ hodin nebo po dobu 20 hodin. To znamená, že doba hladovění (v rozmezí 6 až 20 hodin) neovlivnila, jak se zdá,významným touto technikou.

- 48 způsobem vyprazdňování žaludku, změřené

Tabulka 2

Obsahy žaludku zbývající 20 minut po aplikaci sondou do žaludku

Nediabetické HSD Nediabetické.53 Diabetické B3

Hladovění 20 h 54,9+2% n=20	27+3,3	%	n=7	neprovei
Hladovění δ h 50,9+4,7 % n=3	33,9+5	/ *-	% n=5^a	9,7+1,7
				b,c
Obsahy žaludků jsou vyjádřeny jako	podíly	tě	c h, k t a	ré mohly
získány ihned po zavedení sondy do	žaludku	u	2 až 3	separat,

3Vt krys při tomtéž pokusu.

^a = není odlišné od krys, které se nechaly hladovět 20 hodin odlišné od krys HSD, které se nechaly hladovět δ hodin (?<0,00l) odlišné od nediabetických krys 3B, které se nechaly hladovět δ hodin (P<ý0,001)

Stojí za· to- poznamenat, že vyprazdňování žaludku bylo u diabetických krys 33 významně rychlejší (P</0,01 až 0,001) než u kterékoliv z ostatních 4 léčebných skupin (tj. nediabetických zvířat). Z pozorování, že diabetické krysy 3B mají větší rychlost vyprazdňování žaludku než nediabetické krysy 33 lze usuzovat, že toto pozorování souvisí s přítomností diabetů a není pouze spojeno s kmenem 33.

Vzhledem ke shora uvedeným metodologickým rozpakům byly účinky amylinu zkoumány na nediabetických krysách Harlan Sprague-Davley, které se nechaly hladovět 20 hodin, a na diabetických krysách 33, které se nechaly hladovět δ hodin. Když se amylinové subkutánní injekce aplikovaly 5 minut před zavedením fenolové červeni jako indikátoru sondou do žaludku, došlo κ potlačení vyprazdňování obsahu žaludku, které bylo závislé na dávce. Potlačení vyprazdňování žaludku bylo takové, že barvivo, které se mohlo získat od normálních krys USD, kterým byl podán 1 „ug amylinu, a od diabetických krys, kterým bylo podáno 10 jig, bylo stejné, jaké bylo možno získat ihned po aplikaci žaludeční sondou (0=0,22, 0,14). Dávka, při které bylo pozorováno 50 % maximální změnv ve vyprazdňování žaludku (£□-„) u normálních krys, byla 0,43 jug (0,6 nraolu amylinu na kg tělesné hmotnosti) + 0,19 log jednotek. U diabetických krys bylo EQ-^pro potlačení vyprazdňování žaludku 2,2jug (2,3 nmol/kg) +

0,ld log jednotek. Z vynesených křivek, znázorněných v obtilá, je možno usoudit, že dávka amylinu -2 pig podaná diabetické kryse by upravila vyprazdňování žaludku na rychlost pozorovanou u normálních krys, kterým nebyl podán amylin.

Jak znázorněno v obr. 15, když se 3 krysám aplikoval subkutánně injekčně 1 pjg krysího amylinu, byla koncentrace plasmy změřená po 10 minutách 66+ 10 pM a maximální koncentrace v 20. minutě byla 74 + 26 pí·!. U 3 krys, kterým byla injekčně aplikována jednorázová dávka 10_Uug subkutánně, byly odpovídající 10. a 20. minutové koncentrace 347+43 pí·! a 301+57 pí·!. Subkutánní dávka amylinu 1 yig, která potlačuje vyprazdňování žaludku o -50 % během 20 minut (ED-θ), musí začít působit brzy po injekci, aby měla účinek po 20 minutách. Například účinek, který započal kolem 20, minuty po injekci, by nebyl zjištěn v tomto systému. Z toho vyplývá, že 50% koncentrace v plasmě, účinné při potlačení vyprázdňování žaludku (EC-θ), se vyskytovaly mnohem dříve, než byly dosaženy maximální koncentrace v plasmě, 74 pil, a proto byly značně nižší než 74 pil.

Výsledky těchto pokusů ukazují, že amylin potlačuje značně a závisle na dávce vyprázdňování žaludku.

Příklad 5

Pokusy poosané v tomto příkladu byly provedeny, aby byly prozkoumány účinky antagonisty recepzoru amylinu na toleranci na orální glukosu a absorbci tritia odvozeného od orálního podání značené glukosy.

Příjem dávky značené glukosy byl změřen u 11 korpulentních krys (500 až 600 g) LA/N, které se nechaly hladovět 24 hodin, při dvou příležitostech s 14 hodinovou přestávkou. Při jedné příležitosti byly krysám aplikovány injekčně subkutánně 3 _tug selektivního antagonisty amylinu AC-0187 (ac- N lososí kalcitónin) 3 minuty před aplikací sondou do žaludku. Při druhé příležitosti byla krysám aplikována předem injekce samotného fyziologického roztoku jako nosiče. Krysám bylo aplikováno son3 sou do žaludku 5 _vuCi (3 H)glukosy v 1 ml 50¾ glukosy. Vzorky krve byly odebrány z anestezovaných ocásků 0, 15, 30, 60, 90 3 a 120 minut poté, co byla provedena aplikace (3 H)glukosy, a byl v nich zjišťován obsah od glukosy odvozeného tritia a glukosy

Předběžná injekce antagonisty amylinu, .AC-0187, urychlila objevení se od glukosy odvozeného tritia v plasmě o 48 % minut po aplikaci žaludeční sondou (P <0,02) a o 45 % (P <0,001) 30 minut po aplikaci sondou (zdvojený t-test). Předběžná injekce AC-0187 vedla také k většímu zvýšení glukosy v plasmě 15 minut po aplikaci 0,5 g glukosy sondou do žaludku (5,39 + 0,17 až 3,33 + 0,28 mil oproti 5,83 + 0,22 až 6,83 +

0,23 mil, P <0,001, zdvojený t-test) . Kromě toho u zvířat léčených AC-0187 poklesla glukosa v plasmě dříve (6,89 + 0,28 mil oproti 3,17 + 0,39 níl 60 minut oo aplikaci glukosy žaludeční sondou, P <f 0,001, zdvojený t-test).

Tedy u korpulentních krys LA/N zvýšil selektivní antagonista amylinu rychlost objevení se značené glukosy v plasmě po orální dávce glukosy a také zvýšil rychlost vzrůstu a po51 klesu koncentrace neznačené glukosy v plasmě. Tyto údaje souhlasí s tím, že antagonista amylinu působí proti účinku endogenně vylučovaného amylinu a tím urychluje vyprazdňování žaludku .

ING. JAN KUBÁT patentový zástupce

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu, s výjimkou CGRP nebo kalcitoninu, nebo antagonisty amylinu pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility.
2. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility, která spočívá ve snížení žaludeční motility.
3. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility, která spočívá v oddálení vyprázdnění žaludku.
4. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1, 2 nebo 3, pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility, při které je uvedená žaludeční motilita spojena s gastrointestinální poruchou.
5. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 4 pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility, při které je uvedená žaludeční motilita spojena s gastrointestinální poruchou, kterou je spasmus.
6. Použití amylinu nebo agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 5 pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility, při které je uvedená žaludeční motilita spojena s gastrointestinální poruchou, kterou je spasmus spojený s poruchou zvolenou ze skupiny zahrnující akutní divertikuli53 tidu, poruchu žlučových cest a poruchu Oddiho sfinkteru.
7. Použití agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení postprandiálního dumpingového syndromu.
8. Použití agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení postprandiální hyperglykémie.
9. Použití agonisty amylinu, kterým je amylin, podle nároku 8 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení postprandiální hyperglykémie.
10. Použití krysího amylinu podle nároku 9 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení postprandiální hyperglykémie.
11. Použití agonisty amylinu nebo analogu agonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení postprandiální hyperglykémie, která je důsledkem diabetes mellitus typu 2.
12. Použiti antagonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení žaludeční hypomotility.
13. Použití antagonisty amylinu podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického prostředku pro urychlení vyprazdňování žaludku.
14. Použití antagonisty amylinu podle nároku 12 nebo 13 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení žaludeční hypomotility, která je důsledkem diabetické neuropathie.
15. Použití antagonisty amylinu podle nároku 12 nebo 13 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení žaludeční hypomotility, která je důsledkem anorexia nervosa.
16. Použití analogu agonisty amylinu, kterým je ^25,28,29Pro-h-amylin, podle libovolného z nároků 1-3, 7, 8 nebo 11 pro přípravu farmaceutického prostředku pro příznivou regulaci gastrointestinální motility.
17. Použití antagonisty amylinu, kterým je antagonista receptoru amylinu, podle libovolného z nároků 12 - 15 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení žaludeční hypomotility.
18. Použití antagonisty amylinu, kterým je acetyl-^11,18Arg_/ ³⁰Asn, ³²Tyr-^9,32kalcitonin (lososí), podle nároku 17 pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčení žaludeční hypomotility.