CZ69799A3 - Herpesvirus saimiri a způsob jeho použití jako virového vektoru - Google Patents

Description

HERPES VIRUS SAIMIRIA ZPŮSOB JEHO POUŽITÍ JAKO VIROVÉHO VEKTORU <

OBLAST TECHNIKY

Vynález popisuje způsob virové manipulace, jejíž prostředky a produkty jsou použitelné zejména, nikoliv však výhradně, v genové therapii.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Genová therapie většiny chorob je dnes již teoreticky možná, což je důsledek pokroku v lidské genetice. Prvním cílem je konverze fenotypu buněk ze stavu kdy se buňky projevují jako nemocné do stavu, kdy je jejich fenotyp zcela normální, a to pomocí vložení transdominantně působícího genetického materiálu. Konverze této technologie ze systému buněčných kultur do in vivo stádia experimentálních modelů a následně klinické praxe, vyžaduje vyvinutí nových metod účinného doručování genů dobře kontrolovatelným způsobem. Začíná se ukazovat, že zatímco lidská genetika rychle identifikuje nové a nové mutace zodpovědné za projevy dědičných chorob, vývoj nových systémů pro doručování genů do buněk značně zaostává. V současnosti je možné na výběr ze tří způsobů a to doručování pomocí lipozómů, DNA agregátů nebo systémy založené na virových vektorech.

Doručování genů pomocí lipozómů je stále velmi neefektivní způsob přenosu DNA (1), agregáty DNA vzniklé z virových částic a nabitých materiálů, jako je polylysin, značně zvyšují míru internalizace DNA (2), problémem však je standartizace přípravy. Retrovirové a adenovirové vektory jsou limitované velikostí heterologní DNA, kterou je možné vložit do vektoru (3,4) a navíc jsou nespolehlivé co se týče dlouhodobého zajištění exprese heterologního genu. Retro viry integrují do genomu hostitele je však velmi obtížné je přinutit k produkci dostatečně vysokých titrů a vždy obsahují vysoké množství mutací způsobené chybami vzniklými při reverzní transkripci. Navzdory jejich širokému buněčnému tropismu, adenoviry indukují buněčnou imunitní reakci a nukleová kyselina jimi doručená není v dlouhodobě infikovaných buňkách stabilní.

Slibnými kandidáty pro vývoj virových vektorů se zdají být herpesviry, částečně díky jejich schopnosti udržet svůj genom v buňkách v episomální podobě, která neumožňuje replikaci. Množství heterologní DNA, kterou je možné vložit do virové částice je v jejich případě více než 50 Kbp (6) a většinou je velmi snadné s nimi manipulovat in vitro. Virové vektory odvozené od Herpes simplex viru však mají některé podobné problémy jako adenoviry, neboť většina

0 · · · ·

0 0 0 · · · 0··· • · 0 0 0 0 0000 0 000 0 0 0 0 0 000 000 0 00000 0 0

0000 00 00 00 00 00 populace má velmi dobře vyvinutou imunitní odpověď proti tomuto viru. Jiné původně ne lidské herpesviry, které jsou však schopné infikovat lidské buňky, pak mohou tento problém vyřešit.

PODSTATA VYNÁLEZU

Herpesviru saimiri (HSV) je lymfotropní rhadinovirus (γ 2 herpesvirus) infikující opice druhu kotul veverkovitý (Saimiri sciureus). Virus může být snadno izolovaný z periferních lymfocytů zdravých opic kde nezpůsobuje žádnou patrnou chorobu. Virový genom je detekovatelný v episomální formě v T-buňkách a transkripce genomu zůstává limitována na tři geny během nelytické (latentní) fáze. Kompletní virový genom byl zcela sekvenován a v mnoha rysech se podobá lidskému viry Epstain-Baarové (EBV). Genetická organizace se skládá z jedné unikátní kódující oblasti DNA, dlouhé 112 930 bp, obklopené variabilním počtem nekódujících repetitivních sekvencí. Je zde 76 otevřených čtecích rámců, z nichž 60 je podobných genům nalezeným u jiných herpesvirů (7). Zbývající geny jsou sekvenčně homologní (na úrovni proteinu) s lidskými geny známé funkce, včetně proteinů regulujících funkce komplementu, lidského povrchového antigenu CD59 a proteinu spojeného s receptory cyklinu D a G (8,9).

Virus byl rozdělen do tří odlišných kmenů nazvaných A,B a C , podle své schopnosti být (A a B) nebo nebýt (C) onkogenní pro některé jiné druhy opic. Kmen C má dokonce schopnost transformovat lidské T-buňky tak, že jsou schopny omezeného nezávislého růstu in vitro (10). Tato schopnost transformovat buňky je dána genem nazvaným STP (11), který je značně variabilní co se sekvence proteinu týče v rámci kmenů a pouze gen z kmene C je schopen transformovat buňky (12). Gen STP není nezbytný pro normální lytický cyklus viru, nebo jeho episomální údržbu a přirozené deleční genomové mutanty tohoto regionu jsou známé i u divokých kmenů viru (13), tyto kmeny pak nejsou onkogenní. Virové kmeny s delecí tohoto genu byly upraveny tak aby exprimovaly geny, zajišťující rezistenci k volitelným látkám (14). Tyto viry byly použity k důkazu své schopnosti infikovat celou řadu lidských buněčných typů, přenášet heterologní geny s vysokou účinností a zajistit dlouhodobou expresi v nepřítomnosti přirozeného selekčního tlaku. Není známo, že tento virus by byl schopen vyvolat chorobu u lidí, ačkoliv lidské buňky schopen infikovat je. Zdá se tedy, že tento virus je dobrým objektem pro vývoj nereplikujícího se bezpečného vektoru pro lidské buňky. Není však zatím zcela jasné jak se HVS replikuje vzhledem k jeho transkripční kontrole a DNA replikaci.

Všechny dosud sekvenované části herpesviru ukazují, že HVS je velmi sekvenčně podobný EBV. Přesto je kódující region značně menší. Odlišné genové bloky se zdají být u těchto dvou virů velmi podobné, stejně jako u všech herpesvirů. HVS se odlišuje od ostatních herpesvirů přítomností některých genů, které dosud nebyly identifikovány u žádných jiných herpesvirů.

0 0 0 • · • · • · · · · ·

0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 • · · β · · · 0 · ·

000 0 0 0 0 0 000 000

00000 0 0 • 00 0 00 00 00 00 00 Každý virový vektor určený k pokusům na lidském materiálu byl až do dnešní doby poškozen buď delecí genů, které nebyly esenciální pro růst v kultuře, nebo delecí esenciálních genů a jejich nahrazením trans formou od pomocné buněčné linie. Odvozením od dobře prostudovaných herpesvirů můžeme předpovídat, že delece některých HVS membránových proteinů bude chránit mezibuněčné rozšiřování. Navíc inaktivací proteinů kontrolujících základních transkripční kontrolní body, jako je E1A u adenovirů (17) a IE175 u herpes simplex viru (18), nevyhnutelně zabrání replikaci těchto virů. Tedy hlavním předmětem této aplikace je zaměřit se na konstrukci mutantního viru, který je neschopen aktivovat časnou a pozdní genovou expresi. Cílovými geny jsou dva transkripční kontrolní proteiny, které jsou produkty IRF50 a 57 a zdají se být nezbytné pro růst v buněčné kultuře.

Publikovaná data (14) ukazují, že Kmen virového vektoru odvozeného od 11/S4 je schopen pouze limitovaného růstu některých buněčných linií. Tedy potřeba deletovat, blokovat nebo manipulovat transkripční kontrolní geny, bude nezbytné pouze v případě buněčných linií, které podporují replikaci viru. Zdá se tedy být žádoucí, za účelem vyprodukování viru pro doručování genů, který by byl zcela bezpečný, vyrobit virus, který je buď neschopný produkovat, nebo produkující nefunkční, transkripční, kontrolní proteiny.

Dalším cílem této aplikace je identifikovat geny, které nejsou nezbytné pro růst, a poté deletovat alespoň část alespoň jednoho z nich, za účelem umožnit inzerci heterologního genetického materiálu do virového genomu.

V současné době existující plasmid určený pro rekombinaci s herpesvirem saimiri je konstruován tak, aby inzertoval heterologní genetický materiál do virového genomu na předem určené místo, které se nalézá v napojení jednoho jedinečného kódujícího regionu DNA a nekódující repetitivní sekvence herpesvirové DNA. Tento plasmid je tedy relativně neflexibilní v otázce způsobu vklonování do virového genomu. Například, je tam několik vhodných restrikčních míst a tedy plasmid není vhodný pro komerční použití. Účelem této aplikace je také identifikovat neesenciální geny, zejména za účelem delece části alespoň jednoho z řečených genů tak, aby vzniklo umělé klonovací místo pro inzerci velkého množství libovolně zvoleného heterologního genetického materiálu. Je jasné, že tato delece neesenciální ch genů a následná inzerce heterologního genetického materiálu, je nezbytná v případě, kdy je třeba vložit do virového genomu velké množství virového heterologního materiálu.

Další aspekt navrhovaného vynálezu je použít herpesvirus saimiri k manipulaci, a to k delecí alespoň části alespoň jednoho genu kontrolujícího transkripci, a pokud možno také alespoň část alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální růstové proteiny. Toto je preferovaný aspekt navrhovaného vynálezu, neboť větší počet manipulací s virovým genomem zvyšuje bezpečnost • « · · · · ’ ··············· • ····· · · ···· ·· ·· ·· « 9 99 manipulovaného viru. S ohledem na tento fakt preferujeme také manipulaci s genomem herpesviru saimiri tak, aby byla deletována část, anebo zcela, STP gen. Tuto poslední manipulaci preferujeme i v případě, kdy jsou použity Kmeny A a B, neboť i tak se zvýšeným množstvím manipulací je virus bezpečnější.

Je zřejmé z výše zmíněného, že zde je potřeba vytvořit vhodný systém pro doručování genů, který zaručí intracelulární doručení genetického materiálu, který je přenášen bezpečně, a tedy bez jakýchkoliv cytopatologických následků na cílové buňky.

Prvním účelem navrhovaného vynálezu je tedy popsat bezpečný a kontrolovatelný systém doručování genů. Navíc, vzhledem k množství doručovaného materiálu, je nezbytné vytvořit genový doručovací systém, který bude adaptovaný pro inkorporaci většího množství genetického materiálu, což jsou DNA sekvence od 4 Kbp do 20 Kbp, ideálně pak více než 50 Kbp. Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je zajistit genový doručovací systém, který umožní selektivní rekombinaci alespoň jednoho genu nebo jeho části, za stejný gen nebo jeho část, ke kterému byl v cílové buňce doručen.

Nejširším aspektem navrhovaného vynálezu je vytvoření mutantního viru, který je neschopný aktivovat expresi časných i pozdních genů. Jinými slovy, vynález se zabývá přípravou viru, který je neschopný replikace v cílové buňce, a pokud možno v lidské buňce, a/nebo přípravu mutantního viru, který je adaptovaný tak, aby pojal relativně velké množství heterologního genetického materiálu.

Dle prvního aspektu navrhovaného vynálezu je vytvořit herpesvirus saimiri s alespoň jednou mutací v genu zajišťujícím replikaci genu, tato mutace pak zabrání viru, aby se replikoval v cílové lidské buňce.

V preferované variantě vynálezu je řečený gen jeden nebo oba z genů, kódujících transkripční kontrolní proteiny ORF50 a/nebo ORF57.

Preferovaná varianta mutace pak představuje kompletní nebo částečnou deleci jednoho nebo obou genů.

V další variantě navrhovaného vynálezu řečený kmen herpesviru saimiri zcela postrádá nebo má mutaci v STP genu, takže takto upravený virus je neschopný transformovat cílové buňky, a tedy vytvořit onkogenní fenotyp.

Preferovaný virový kmen je dále manipulován tak, že alespoň část alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální růstové proteiny je deletovaná. Ideální variantou jsou geny ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.

V další preferované variantě navrhovaného vynálezu je řečený virus upraven vložením inzerčního místa, do kterého může být vložen libovolný heterologní materiál. Je vhodné, aby

5»· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · · ·········· ¹ · ··· « · · · « ··· «· • β···· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· virus byl manipulovaný tak, aby inzerce proběhla buď těsně anebo poblíž delečního místa pro deleci alespoň části neesenciálního genu pro růstový protein, nebo poblíž alespoň jedné nekódující repetitivní sekvence a pokud možno na spoji mezi jedním jedinečným kódujícím regionem DNA a nekódující repetitivní sekvencí. Nejlépe pak, pokud řečený virus je manipulován tak, aby nekódující repetitivní sekvence byla přítomna na jednom nebo obou koncích jednoho jedinečného kódujícího regionu.

V případě, kdy inzerce proběhne uvnitř nebo v blízkosti řečeného delečního místa a řečená delece proběhne, mělo by jít o částečnou nebo kompletní deleci jednoho nebo více následujících genů ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.

Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je zde popisován herpesvirus saimiri s alespoň jednou mutací v alespoň jednom genu kódujícím neesenciální růstové proteiny.

V další preferované variantě navrhovaného vynálezu se jedná o jeden nebo více genů z ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.

Další preferovaná varianta řečené mutace představuje částečnou nebo kompletní deleci jednoho nebo více řečených genů.

Jiná preferovaná varianta navrhovaného vynálezu kmen herpesviru saimiri buď zcela postrádá nebo má mutaci v STP genu, a tedy tento virus je neschopný transformovat cílové buňky a vytvořit onkogenní fenotyp.

Je vhodné, aby řečený virus byl dále manipulován tak, aby alespoň část alespoň jednoho genu nezbytného pro virovou replikaci, byla deletována. Optimální variantou je delece genu ORF50 a/nebo ORF57.

V další preferované variantě preferovaného vynálezu je u viru vytvořeno inzerční místo, do kterého může být inzertován požadovaný heterologní materiál. Je vhodné, aby toto inzerční místo leželo uvnitř, těsně vedle nebo poblíž místa, kde proběhla řečená delece jednoho nebo více genů.

Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je herpesvirus saimiri upraven nebo adaptován tak, že je v něm inzertován alespoň jeden vybraný heterologní genetický fragment poblíž delečního místa, které představuje místo částečné nebo naprosté delece alespoň jednoho genu, kódujícího neesenciální růstové proteiny.

V preferované variantě navrhovaného vynálezu je virus upraven mutací v genu nezbytném pro virovou replikaci tak, aby to zamezilo replikaci viru po inzerci tohoto viru do cílové buňky.

Nej vhodnější virový kmen je ten, který postrádá nebo má podstatné mutace v STP genu, tudíž tento virus je zcela neschopen transformovat cílovou buňku a samozřejmě neschopen vytvořit onkogenní fenotyp. Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je zde popisován herpesvirus • · · · · · • · • · · · • · · · ·· 4 · · · · • * * · · · « · « · • ··· « · · · · ··· «·· • · · · · · · » ···· ·· ·· ·· ·· «9 saimiri, uvnitř kterého se nachází, nebo který je upravený tak, aby se uvnitř nacházelo inzerční místo pro inzerci alespoň jednoho heterologního genového fragmentu na spoji jediné kódující oblasti a nekódující oblasti, a kdy tento virus byl manipulován tak, aby bylo redukováno na minimum množství nekódujících repetitivních sekvencí přítomných na obou koncích jediného kódujícího regionu a zároveň je upraven mutací v genu nezbytném pro virovou replikaci tak, aby to zamezilo replikaci viru po inzerci řečeného viru do cílové buňky.

Je vhodné, aby počet nekódujících repetitivních sekvencí byl 5 a méně, ideálně 1.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je popsat transferový vektor, který umožní inzerci heterologního genového fragmentu do DNA viru herpesviru saimiri.

Je preferováno, aby řečená inzerce byla provedena jakoukoliv dříve popsanou inzerční metodou.

V preferované variantě tohoto aspektu obsahuje vektor řadu jedinečných restrikčních míst a ještě lépe tři jedinečná restrikční místa. Navíc řečený vektor obsahuje β galaktosidázový gen, který je pod kontrolou HCMV IE 3 promotoru. Nejlepší je pokud řečený vektor odvozen od pRUNeo (16).

Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je upravit herpesvirus saimiri tak, aby měl alespoň jednu mutaci v genu nezbytném pro virovou replikaci, kdy tato mutace je dostatečná pro prevenci virové replikace v cílové buňce a také alespoň jednu mutaci v genu kódujícím neesenciální růstové proteiny.

V preferované variantě vynálezu má herpesvirus saimiri také mutaci v STP genu. Je vhodné aby tyto mutace představovaly buď částečnou nebo kompletní deleci řečených genů.

Je vhodné, aby řečené geny nezbytné pro virovou replikaci byly jeden nebo oba geny pro proteiny kontrolující transkripci ORF50 a/nebo ORF57 a geny kódující neesenciální růstové proteiny byly jeden nebo více z následujících genů: ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.

Z výše zmíněného je zřejmé, že virus preferovaný navrhovaným vynálezem obsahuje řadu výhodných kombinací genetických mutací, které slouží pro znemožnění nebo naopak umožnění některých vlastností viru tak, aby byl bezpečný a kontrolovatelný. Termínem znemožnění funkcí je míněná prevence virové replikace v cílové buňce, a termínem umožnění je míněno zvýšení kapacity viru tak, aby byl schopen pojmout inzerci relativně velkých množství heterologního genetického materiálu. Nej důležitějším požadavkem je, aby zmíněné kombinace mutací znemožnily viru transformovat cílovou buňku, a tedy vyprodukovat onkogenní fenotyp.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je připravit cílové buňky, které budou mít alespoň část vektoru pro genovou terapii herpesviru saimiri.

Ještě dalším aspektem navrhovaného vynálezu je transformovat buňky vektorem herpesviru saimiri, jak bylo popsáno výše.

• · · · · · • · · · · · » to · · · • toto · · · to · · · • to to to to to · · to ··· · to to • · · to to · to to toto·· · · · · · · · · ·♦

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je popsat metodu doručování zvoleného heterologního genetického materiálu do cílových buněk zahrnující vystavení alespoň části buněk herpesviru saimiri, který bude alespoň částečně obsahovat dříve zvolený heterologní genetický materiál za podmínek, které umožní infekci těchto buněk řečeným virem.

Předmět vynálezu bude nyní popsán pomocí příkladů s odkazy na následující materiál a metody.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1.

Izolace a charakterizace virových mutantů

Manipulovaný virus je modifikován z kmene 11, který neobsahuje ORF1 (STP) gen. Ačkoliv normálně by byl zvolen “divoký” kmen, je výhodnější když je vektor odvozen od viru, který má tento gen odstraněný. Modifikovaný kmen může mít esenciální kmeny deletované, a tedy je nezbytné vytvořit pomocnou buněčnou linii (detaily dále). To bylo uskutečněno pomocí kotransfekce s vhodným HVS genomovým klonem plus pSV2Neo, a izolovaným buněčným klonem, který je G418 rezistentní. Tyto buněčné klony byly prvně kontrolovány pomocí PCR na přítomnost požadovaných genových sekvencí, a ty, které byly testovány pozitivně, byly analyzovány pomocí RT-PCR na přítomnost RNA transkriptů genů zajištěné trans. Příslušné klony byly namnoženy a použity pro kotransfekci virovou DNA a deleěním konstruktem. Viry exprimující β-galaktosidázu (což je měřitelné mírou metabolizace X-gal) byly testovány pro svoji schopnost replikovat se v pomocných buňkách a v normálních Věro buňkách, a následně v lidských buněčných liniích několika typů. Publikovaná data naznačují, že vektory odvozené od kmene 11 jsou schopné limitovaného růstu v několika buněčných liniích B-buněk (Ráji) a lidských fetálních fibroblastech (HFF). Ráji buňky (transformované pomocí EBV) nejsou reprezentativní normální lidské buňky, proto jsme se rozhodli otestovat růstové charakteristiky těchto virů v lymfoidních buňkách izolovaných z čerstvé periferní krve dospělého člověka, odebrané ze zdravého dobrovolníka, a primárních lidských embryonálních fibroblastech a epiteliálních buňkách, které jsou běžné dostupné z komerčních zdrojů. Replikace byla testována pomocí exprese β-galaktosidázy (důkazy infekce a mezibuněčného šíření) přítomnosti epizomální DNA a expresi typických časných a pozdních genů, detekovatelných pomocí RTPCR. Setrvání v genómu těchto buněk bylo testováno pomocí měření procenta buněk schopných exprimovat reportér gen po několika buněčných generacích a zároveň testování na přítomnost epizomální virové DNA (19).

• 9 ··9 9

9··· 99 · 999 9 • 9» 99 9 9999

99999 9 99 999 999 • 99999 9 9

9999 99 99 99 99 99

Produkce rekombinantních virů s deletovanými geny

Extracelulární viry, sekreto váné buňkami byly izolovány pomocí centriťugace při 30 000 g, po dobu 2 hodin při 4 °C. Částečně purifikovaná peleta viru byla resuspendována v 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA (TE) pH 8,0. Bylo přidáno SDS do konečné koncentrace 1 % váhy a Proteináza K do koncentrace 100 pg/ml. Vzorky byly inkubovány 16 hodin při 50 °C a poté proběhlo 5 chloroform/fenolových extrakcí v poměru 50:50. Vodná fáze byla odebrána a nukleová kyselina byla precipitována přidáním 0,2 M octanu sodného pH 5,0 a tří objemů 98 % ethanolu. Precipitát DNA byl sebrán ze zkumavek, vysušen na vzduchu a znovu rozpuštěn v odpovídajícím množství TE pufru. Koncentrace DNA byla měřena pomocí absorbance vzorku při 240 nm na spektrofotometru. Purifikovaná virová DNA byla kotransfekována do OMK (ATCC CRL 1556) buněk, za použití plasmidového konstruktu za použití činidla DOTAP.

Po 24 hodinách bylo kultivační médium odstraněno a nahrazeno médiem obsahujícím 2 % tepelně inaktivovaného FCS. Vrstva buněk byla poté pozorována tak dlouho dokud nebyl zřejmý rozvoj extenzivního cytopatického efektu viru. V tomto stádiu byl virus uvolňovaný buňkami sbírán a použit k infekci další generace OMK buněk. Ty byly pokryty po 24 hodinách 1 % agarem s DMEM bez fenolové červeně a 2 % tepelně inaktivovaným FCS. Po 48 hodinách byla přidána X-gal tak aby konečná koncentrace byla 100 μg/ml, což umožnilo identifikovat virové plaky ve kterých se byla exprimována β-galaktosidáza. Modré plaky byly sebrány a poté dvakrát přečištěny plakovou purifikací, dokud nebyla virová populace homogenní. Tyto viry byly poté testovány jestli byla homologní rekombinace korektní za pomoci PCR a Southern blottingu.

Produkce rekombinantních virů obsahujících heterologní geny

Purifikovaná virová DNA, která byla připravena tak jak je popsáno výše, byla kotransfekována do OMK buněk s plasmidovým vektorem (pJG101-105 a/nebo pAW 201, 202, 203, 205, 207 nebo 209), který obsahuje odpovídající heterologní gen nahrazený β-galaktosidázovou sekvencí pro rekombinaci do buď neesenciálních nebo esenciálních genů, nebo do mezigenových oblastí. Rekombinantní viry, které neexprimovaly β-galaktosidázový gen byly selektovány plakovou purifikací stejným způsobem, jaký byl popsán výše.

Infekce buněk s HVS in vitro

Vysoké titry virů byly vyprodukovány pomalým dělením infekcí v OMK nebo Věro buňkách. Vyprodukovaný virus byl titrován z OMK nebo Věro buněk, a byl skladován při -70 °C. Množství viru nezbytné pro infekci konkrétního typu buněk se 100 % účinností bylo stanoveno pomocí infekce definovaného množství buněk při různém množství infekčních částic viru • « · 4 · · • · · · «· · · · · · * ♦ · · · · · · · · • ··· · · · · · ··♦ *·· « ···«· · · ···» ·· ·· 99 99 ·· exprimujících β-galaktosidázu. Adherentní buňky byly infikovány přidáním viru v minimálním množství kultivačního média a inkubovány po dobu 2 hodin v 37 °C za stálého jemného míchání. Po této době bylo médium sebráno a nahrazeno stejným objemem čerstvého média. Neadherentní buňky byly sebrány, spočítány a naředěný tak aby jejich koncentrace byla mezi 10⁶ až 10⁷ buněk na 1 ml roztoku viru v koncentraci která zajistí 100 % účinnost infekce. Po 2 hodinách inkubace za stálého míchání byly buňky ošetřeny stejným způsobem jako bylo popsáno výše.

Produkce pomocné buněčné linie

Virové geny které mají být exprimovány v stabilních buněčných liniích, v trans konformaci, byly klonovány ve vhodném plasmidovém vektoru pod kontrolou jejich vlastní, nebo heterologní 5'nebo 3' kontrolní sekvence. Tento plasmid může také obsahovat volitelný markér, např. gen pro neomycin fosfotransferázu, který zajistí eukaryotickým buňkám rezistenci na látku označovanou G418. Tento gen může být také alternativně přítomen na separátním plasmidu, opět pod kontrolou heterologní eukaryotické kontrolní sekvence, například časného promotoru SV40 a odpovídajícího polyadenylačního signálu. V každém případě je tímto vytvořena buněčná linie. 5 x 10⁶ buněk (nebo odpovídající množství tak aby dalo 40 - 50 % denzitu) jako jsou OMK nebo Věro buňky bylo rozděleno na 10 cm kultivační destičky v 10 ml DMEM s 10 % fetálního telecího séra a inkubováno 12 až 18 hodin při 37 °C v humidifikované atmosféře obsahující 5 % CO2. Po této době byly 2 pg plasmidu transfekovány do těchto buněk za použití DOTAP činidla tak jak bylo popsáno výše pro transfekci virové DNA. Může to být buď jeden plasmid, který obsahuje odpovídající gen a zvolený markér gen, nebo směs 2 pg každého plasmidu. Buňky byly poté inkubovány v 37 °C v humidifikované atmosféře obsahující 5 % CO2 po dobu následujících 48 hodin. V tomto stádiu, další souvislá vrstva buněk byla sebrána z plastikových inkubačních misek promytím 2 x 10 ml fosfát-fyziologického roztoku (PBS, Life Technologies inc., cat no. 20012) a inkubací s 2 ml trypsinu (0,25 % váhových) a EDTA (0,2 % váhových) v PBS. K buněčné suspenzi bylo poté přidáno čerstvé médium, buňky byly spočítány a rozděleny do 96 jamkových destiček pro klonování v limitním ředění, nebo byly rozředěny na 10⁴ buněk na 10 cm kultivační misku. Kultivační médium (DMEM + 10 % FTS) bylo doplněno odpovídající koncentrací G418, která byla dostatečná k tomu aby zcela zlikvidovala všechny netransfekované buňky. Tato koncentrace je závislá jak na počtu buněčných pasáží, tak na jejich typu. Typická koncentrace pro Věro buňky při pasáži číslo 150 je 800 pg/ml. Buňky byly poté přeneseny do výše popsaného kultivačního prostředí a byla sledována míra jejich přežívání v pravidelných intervalech. Kultivační médium bylo měněno každé 3 až 4 dny v závislosti na míře

9 9 9

9 9 9

999 999

9 • 9 9 * 9 9

99 • · · · 9 9 · • 999 • 9

9999 99 přežívání/vymírání buněk. Po 7 až 14 dnech narostly individuální klony buněk, které byly sebrány, naředěny na patřičné množství a testovány na expresi transfekováných HVS genů. To může být provedeno buď za použití imunofluorescence, Northern blottingu nebo method RTPCR, tak jak je v oboru běžné.

Stanovení bezpečnosti buněk

Schopnost modifikovaného viru replikovat se byla stanovena měřením genové exprese viru za použití method RT-PCR, pro výběr okamžitých-časných, časných nebo pozdních genů. Navíc, supematanty z buněčných kultur transdukovaných buněk byly inkubovány s indikátorovými OMK buňkami, tak aby bylo detekováno možné uvolňování infekčních partikulí viru.

Inzerce rekombinantního vektoru

Tato strategie umožňuje produkci rekombinantního vektor, který je schopen inzerce heterologního genu na Ύ konec HVS L DNA. Plasmid pSJNeo (od R. Grassmana) obsahuje 9,4 kb HVS DNA která obsahuje H-L DNA spoj. Restrikční místo pro Smál ležící poblíž 35 bp od první H repetitivní jednotky bylo změněno ne Sáli restrikční místo tak aby to umožnilo inzerci neo genu. Tento vektor je tedy dlouhý pomalý vektor a není vhodný pro inzerci velkých heterologních genů. Expresní vektor pSA91 byl zvolen jako výchozí vektor pro výrobu nového rekombinantního vektoru. Tento vektor je produkován v mnoha kopiích a obsahuje hCMV IE promotor řídící genovou expresi. Pro vytvoření efektivního virového expresního vektoru, umožňujícího rekombinaci, byla sekvence HVS DNA vystřižena z pSIneo a inzertována do jedinečného Narl restrikčního místa umístěného směrem k 5'od promotoru, za použití linker adaptérů. Takto vzniklý vektor byl označen pJGlOl.

Delece ORF06

Gen ORF06 (umístěný mezi bp 12 584 a 15 967) kóduje velký DNA vazebný protein a tedy delece tohoto genu znemožní viru replikaci. Pro výrobu rekombinační kazety pro deleci ORF06, byly vystřiženy obklopující oblasti DNA vystřiženy z pSS54 obsahující oblast HVS DNA od 11507 do 18013 (KnpIF fragment). Fragment Knpl (11507) až Haell (12613) dlouhý 1106bp z 5' ORF06 kódujícího regionu a Sphl (15258) až BglIII (16407) dlouhý 1149 bp byly vystřiženy a ligo vány dohromady pomocí syntetických oligomerů. Tyto oligomery obsahují restrikční místa EcoRI a BamHI, jak je ukázáno níže, tak aby byla do tohoto místa možná inzerce heterologního genu. Je nezbytné zajistit aby 3' konec ORF06 obsahoval promotor ORF07. Ligovaný Knpl •4 4444

4

444 • 4

44 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 ·

444 ♦ 4 4

4 4 4 4

4444 44 44 44

BglI fragment byl inzertován do klonovacího vektoru pBluescript KS tak aby vznikla rekombinační kazeta pJG102.

Sekvence oligomerů spojujících fragmenty:

TGAATTCGGATCCGCATG CGCGACTTAAGCCTAGGC HaelII EcoRI BamlII Sphl

Konstrukce ORF06 pro výrobu pomocné buněčné linie

Pro výrobu HVS postrádajícího oblast kódující ORF06 je nezbytné zajistit produkci genu ORF06 v trans. Toho je dosaženo pomocí stabilní pomocné buněčné linie.Gen ORF06 je vystřižen z pSS54 jako Haell (12613) - Pstl (15998) fragment. Syntetické oligomery (jak jsou zobrazeny výše) byly použity pro přesnou výrobu začátku kódující oblasti ORF06 a pro umožnění inzerce do expresního vektoru pSVK3 (Pharmacia). Následuje ligace syntetických oligomerů na 5' konec ORF06 a EcoRI - Psi fragment je ligo ván do pSVK3 tak aby vznikl pJG103. Tak bude exprese řízena z časného promotoru SV40, použití alternativních promotorů minimalizuje míru rekombinací v pomocné buněčné linii.

Sekvence oligomerů:

AAŤTCATGGCAACGAAGACAGCGCAACCTAGCGC

GTACCGTTGCTTCTGTCGCGTTGGAT

EcoRI ORF06 start Haell

Delece ORF51

Gen ORF51 byl vystřižen z pKK104 jako Hpal (72602) - Stul (73495) fragment o délce 806 bp a vklonován do SV40 expresního vektoru pSVK3. EcoRI linkery byly napojeny na 5' a 3' koncích ORF1 tak aby umožnily tuto klonovací reakci. Výsledný expresní vektor obsahující ORF51 byl označen pJG105.

Delece ORF57

Gen ORF57 kóduje transkripční aktivátor homologní s HSV-1 UL54, což je esenciální velmi časný gen. Aby bylo možné vytvořit virus s kompletní delecí ORF57, bylo třeba amplifikovat oblasti přilehlé kódující oblasti ORF57 tak aby to umožnilo homologní rekombinaci s virovou DNA. Byly připraveny tyto primery:

•4 4444 • 4 4 · 44 4 444 4

444 44 · 4444 t 4 444 9 4 4 4 9 994 444

44444 4 4

4444 44 44 44 44 44

5'-dGGC GAA TTC GTC TAT AAC TGA CTG GGT TGC TG

5'-dGCC CTG CAG GCA GTT ACT CAC CAT AGC TTG AG

5'-dGCC CTG CAG CAA GTG TCC AAG CTC TAC TTG TGC

5'-dGGG GCA TCC CTA TTG ATG TGC CAA GCA ATA GGG T která amplifikují dvě oblasti HSV a to konkrétně 77870 až 78260 a 79530 až 80120, a do nichž byla vložena vhodná restrikční místa tak aby umožnila vklonování. Trojitá ligace proběhla za použití těchto fragmentů a pUC18, dříve naštípané pomocí EcoRI a Sphl, tak aby vznikl pAWIOl. Tento plasmid byl pak linearizován pomocí Pstl a Sáli a ligo ván s lacZ genem pod kontrolou hCMV IE promotoru, tak aby vznikl PdeltaORF57, který byl uložen v National Collection of Industrial and Marině Bacteria Ltd (NCIMB), 23 St. Máchán Drive, Aberdeen, AB2 IRY, pod depozitním číslem 40894.

Inzerční inaktivace HVS konstruktu

Inzerční inaktivace je méně preferovaná metoda prevence genu před funkcí, spočívá v umístění indikátorového β-galaktosidázového genu do kódující sekvence patřičného genu, bez předchozího odstranění jakékoliv části daného otevřeného čtecího rámce. Existuje riziko náhodné rekombinace které vede k deleci β-gal sekvence a nemožnosti ligace otevřeného čtecího rámce umožňující reaktivaci genu.

Pro vytvoření inzerčně inaktivováného genu byl konstruován transferový vektor který inaktivuje každý konkrétní gen inzercí lacZ genu pod kontrolou I.E. CMV promotoru na 5' konci kódující oblasti ORF. Tento inaktivo váný gen byl poté inzertován do virového genomu, kotransfekcí plasmidu a DNA viru HVS tak aby vznikl rekombinantní virus, který je pak plakově purifikován.

Konstrukce plasmidu

ORF4 / kontrolní protein komplementu

Plasmid pJC81-KpnB byl naštěpen BglII a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 1152 bp obsahující kódující oblast ORF4. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF4. Tento plasmid byl linearizován za použití BglII, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW201.

·· ···· • φ · · φ φ φ φ • ΦΦΦΦ· ·· ·· ·· ·Φ

0RF14 / malý ΙΕ gen

Plasmid pACYC184-EcoF byl naštěpen pomocí EcoRI a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 3189 bp, obsahující kódující oblast ORF14. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF14. Tento plasmid byl linearizován pomocí KpnI, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW202.

ORF15 / CD59 homolog

Plasmid pACYC184-EcoF byl naštěpen pomocí Sstl a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 2415 bp, obsahující kódující oblast ORF15. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF15. Tento plasmid byl linearizován pomocí MunI, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW203.

ORF50 / hlavní transkripční aktivátor

Plasmid pACYC184-EcoD byl naštěpen pomocí BglII a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 4149 bp, obsahující kódující oblast ORF50. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pAW204. Tento plasmid byl naštěpen pomocí Pstl a ligován s DNA fragmentem obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl PdeltaORF50. Který byl uložen v NCIMB, stejně jak bylo zmíněno výše, pod číslem 40892. Pomocná buněčná linie byla konstruovaná za použití PUCPST který je uložen v NCIMB, stejně jak bylo zmíněno výše, pod číslem 40893, což je pUC18 obsahující Pstl fragment DNA viru HVS obklopený oběma exony genu.

ORF57 / IE gen

Plasmid pACYC184-EcoJ byl naštěpen pomocí BglII, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW203.

Pro konstrukci pomocné buněčné linie byla kódující sekvence ORF57 amplifikována pomocí PCR za použití následujících primerů:

5'-d CCG GGT ACC CAC ATG TCT ATA ATC GAC TGG GTT

-D CGG GGT ACC CTG AGT CAT TAG TAG TAG CTC ATG

Tyto PCR fragmenty byly poté ligovány do TA klonovacího vektoru pCRII a označeny pAW207.

• 9 99 ·9 ·9·9 99 «9

0RF16 / supresor apoptózy

Neboť tato kódující oblast neobsahuje žádné konvenční restrikční místo, byla amplifikována pomocí PCR, což umožnilo vložit na 5' konec kódující oblasti Pstl restrikční místo aby bylo proveditelné následné klonování, pomocí následujících primerů:

5'-d GCC GAA TCC CAC AGT GCC AAG CTT GCC AGT T

5'-d CGC CTG CAG GGT GTA TAA CTG AGT GTT ACA GC

5'-d GGG CTG CAG GCT GTA CAC TCA GTT ATA CAC C

5'-d CCC GCA TGC ACT TGA TCC AGG ACA TGC TTC

Získané produkty PCR byly ligo vány s pUC18 tak aby vznikl pAW208. Plasmid byl linearizován pomocí Pstl a ligován s lacZ genem pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW2-09. Pomocná buněčná linie byla konstruována pomocí pAW208.

·· «· ► · · 4 • · « * ♦ « · «

XJ·» »*Λ·

REFERENCE

Ledley, F. D. (1994) Non-viral gene therapy Curr. Opinion Biotech 5, 626-636.

Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R., and Bimsteil, M., (1991) Transferrin-polycation complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4255-4259.

Rich, D.P., Couture, L.A., Cardoza, L.M. Guiggio, V. M., Armentano, D., Espino, P. C., Hehir, K., Welsh, M. J., Smith, A. E. and Gregory, R.

J. (1993) Development and analysis of recombinant adenoviruses for gene therapy of cystic fibrosis. Hum. Gene Ther. 4:461-476.

Gordon, E. M. and Anderson, W. F. (1994) Gene therapy using retroviral vectors. Curr. Opinion Biotech. 5:611-616.

Crystal, R. G., McElvaney, N. G., Rosenfeld, M. A., Chu, C., Mastrangeli, A., Hay, J. G., Brody, S. L., Jaffe, H. A., Eissa, Ν. T. and Danel, C. (1994) Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respirátory tract of individuals with cystic fibrosis Nátuře Genet. 8:42-51.

Locker, H. and Frenkel, N. (1979) Structure and origin of defective genomes contained in serially passaged herpes simplex virus type 1 (Justin). J. Virol. 29:1065-1077.

Davison, A. J. (1993) Herpesvirus genes. Rev. Med. Virol. 3:237-24 • fe ··*· > ' ' X ·*» » ·

1C

Albrecht, J-C., Nicholas, J., Biller, • fe fefe • · · · fe fefe · « · · fefefe

D.‘,’Cameron,TL Rf, BiešfngSř, B.,

Newman, C., Wittmann, S., Craxton, M. A., Coleman, H., Fleckenstein, B. and Honess, R. W. (1992) Primary structure of the Herpesvirus saimiri genome. J. Virol. 66:5047-5048.

Jung, J. U., Stager, M., and Desrosiers, R. C. (1994) Virus-encoded cyclin Mol. Cell Biol. 14:7235-7244.

Biesinger, B., Muller-Fleckenstein, I., Simmer, B., Lang, G., Wittmann,

S., Platzer, E., Desrosiers, R. C. and Fleckenstein, B (1992) Stable growth transformation of human T lymphocytes by herpesvirus saimiri. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:3116-3119.

Murthy, S. C. S., Trimble, J. J, and Desrosiers, R. C. (1989) Deletion mutants of herpesvirus saimiri defíne an open reading frame necessary for transformation. J. Virol 63:3307-3314.

Grassmann, R., Fleckenstein B. and Desrosiers, R. C. (1994) Viral transformation ofhumanT lymphocytes. Adv. Cancer Res. 63:211-244.

Desroisers, R. C., Burghoff, R. L. Bakker, A. and Kamine, J. (1984) Construction of replication-competent herpesvirus saimiri deletion mutants J. Virol 49:343-348.

Simmer, B., Alt, M., Buckreus, I., Berthold, S., Fleckenstein, B., Platzer, E. and Grassmann, R. (1991) Persistence of selectable herpesvirus saimiri in various human haemopoietic and epithelial cell lineš. J. Gen. Virol. 72:1953-1958.

Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles,

D. M. and Moore, P. S. (1994) Identification of heipesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science 266:18651871.

/7 φφ ·* φ · · · • · · φ φφφ φ φ ··»* »φ • · φ φ φ • φ φ φ«

Φ· ·9 Φ Φ · Φ

Φ · · ·

ΦΦΦ ΦΦΦ

Φ Φ *Φ Φ·

Grassmann, R. and Fleckenstein, Β. (1989) Selectable recombinant herpesvirus saimiri is capable of persisting in a human T-cell line. J. Virol 63:1818-1821.

17. Berkner, K. L. (1988) Development of Adenovirus vectors for the expression of heterologous genes. BioTechniques, 6, 616-629.

18. Glorioso, J., Goins, W. F., and Fink, D. J. (1992) Herpes simplex virusbased vectors Semin. Virol. 3:265-276.

19. Gardella, T., Medveczky, P., Sairenji, T. and Mulder, C. (1984) Detection of circular and linear herpesvirus DNA molecules in mammalian cells by gel electrophoresis. J. Virol. 50:248-254.

Claims (22)

1.

Herpesvirus saimiri vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu mutaci v alespoň jednom genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru, kde uvedená mutace zabrání viru replikovat se v lidské buňce.

2.

Herpesvirus saimiri dle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný gen je buď ORF50 a/nebo ORF57.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.

Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v alespoň jednom genu z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.

Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.

Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus je připraven s inzerčním místem pro inzerci heterologního genetického materiálu.

Herpesvirus saimiri dle nároku 6, vyznačující se tím, že inzerční místo je umístěno uvnitř a nebo poblíž alespoň jedné nekódující repetitivní sekvence a pokud možno na spoji mezi jedinečnou kódující sekvencí a nekódující sekvencí.

Herpesvirus saimiri dle nároků 6 a 7, a závislý i na nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené inzertní místo je umístěno na místě uvedené delece.

Herpesvirus saimiri dle nároku 6, vyznačující se tím, že inzerční místo je umístěno v, nebo leží poblíž alespoň jednoho z následujících genů ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.

Herpesvirus saimiri, vyznačující se tím, že uvedený gen je jeden z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.

Herpesvirus saimiri dle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.

12. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 11, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.

99 9 9 9

9 9

13. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že uvedený virus je dále manipulován tak, že alespoň část genu kódujícího ORF50 a/nebo ORF57 je mutována a/nebo deletována.

14. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedený virus je připraven s inzerčním místem pro inzerci heterologní DNA.

15. Herpesvirus saimiri, dle nároku 10, vyznačující se tím, že má uvnitř inzertovanou, nebo je připraven pro inzerci alespoň jednoho předem vybraného heterologního DNA fragmentu poblíž místa delece, toto místo pak představuje místo částečné nebo kompletní delece alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální gen a uvedený virus je dále mutován nebo deletován v genu kódujícím protein nezbytný pro virovou replikaci.

16. Herpesvirus saimiri dle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.

17. Herpesvirus saimiri, vyznačující se tím, že má uvnitř inzertovanou, nebo je připraven pro inzerci alespoň jednoho předem vybraného heterologního DNA fragmentu na spojení jedinečného kódujícího regionu a nekódující oblasti, dále uvedený virus obsahuje redukovaný počet repetitivních nekódujících sekvencí na jednom nebo obou koncích jedinečné kódující oblasti a virus také obsahuje alespoň jednu mutaci v alespoň jednom genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru.

18. Herpesvirus saimiri dle nároku 17, vyznačující se tím, že počet uvedených nekódujících repetitivních sekvencí je 5 a méně a ideálně pak 1.

19. Herpesvirus saimiri dle nároku 1, vyznačující se tím, že má alespoň jednu mutaci v genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru a mutaci v genu kódujícím neesenciální protein,

20. Herpesvirus saimiri dle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.

21. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 a 20, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.

22. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 až 21, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný gen kódující protein nezbytný pro replikaci viru je buď ORF50 nebo ORF57.

99 99 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 999·· 9

9 9 9 9

9999 99 99 ·»

23. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 až 22, vyznačující se tím, že uvedený gen, kódující neesenciální protein, je jeden z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.

24. Způsob doručení zvolené heterologní DNA do cílové buňky, vyznačující se tím, že cílové buňky jsou inkubovány s herpesvirem saimiri dle nároků 6 až 9 a 14 až 18, který obsahuje alespoň část předem zvolené DNA, za podmínek, které umožní virovou infekci.