CZ69899A3

CZ69899A3 - Izolované polynukleotidy, jimi kódované proteinkinázy, je obsahující konstrukty a transgenní rostliny a způsob jejich použití

Info

Publication number: CZ69899A3
Application number: CZ99698A
Authority: CZ
Inventors: Marcos Fernando Godoy Lusso; Joseph Chappel
Original assignee: University Of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1997-07-08
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 1999-08-11
Also published as: IL128570A0; AU8568498A; ID21034A; OA10990A; PL332087A1; AP9901469A0; EP0948599A1; EA199900184A1; WO1999002655A1; ZA985999B; CN1234831A; JP2001500390A; BR9806183A; CA2265441A1; KR20000068498A; HUP0003564A2; WO1999002655A9

Description

(74) Zástupce:

PATENTSERVIS PRAHA a.s., Jlvenská 1, Praha 4, 14000;

CZ 698-99 A3 (54) Název přihlášky vynálezu:

Izolované polynukleotidy, jimi kódované proteinkinázy, je obsahující konstrukty a transgenní rostliny a způsob jejich použití (57) Anotace:

Jsou popsány molekuly nukleových kyseliny, které jsou Indukovány pří vniku patogena nebo působení eUcitoru. Takové molekuly jsou funkční v rostlinách, rostlinných pletivech a rostlinných buňkách pro indukovanou genovou expresi a změnu fenotypického vyjádření rezistence k nemocem v rostlinách. Takovéto molekuly odpovídají nebo jsou příbuzné sekvenci genů proteinkináz závislých na vápníku. Jsou také popsány způsoby vytvoření transgenních rostlin, které obsahují takovéto molekuly nukleových kyselin, a způsoby použití takovýchto molekul, jakož i polypeptidy, kódované takovýmito nuldeovými kyselinami.

9» 9999 » 99 99

9 99 9 9999

9 9 9 9 999 t · · · ·· ···· 9 · »·· 999

9 9 9 9 9 9 9 9 «4 9» 99 999 99 99 izolované polynukleotidy, jimi kódované proteinkinázy, je obsahující konstrukty a transgenní rostliny a způsob jejich použití.

Oblast techniky

Tento vynález se týká nukleových kyselin, kódujících proteinkinázi závislé na vápníku, polypeptidů vytvořených z takovýchto nukleových kyselin a transgenních rostlin, které exprimují takovéto nukleové kyseliny.

Dosavadní stav techniky

U rostlin je rezistence k houbovým, bakteriálním a virovým patogenům spojena s reakcí rostliny, která se nazývá hypersenzitivní reakce (HR). Při HR dochází v místě, kde vniká potenciální fytopatogen, k lokalizované buněčné smrti. Předpokládá se, že tato lokalizovaná smrt rostlinných buněk zahrnuje vnikající mikroorganismy nebo viry a tím ochraňuje zbytek rostliny. Jiné obranné reakce rostliny zahrnují produkci fytoalexinů, produkci lytických enzymů schopných zamezení vstupu patogena a modifikace buněčné stěny, které ji zpevní proti fyzickému a/nebo enzymatickému působení.

HR rostlin může jako součást reakce na vnikající mikroorganismus zahrnovat produkci fytoalexinů. Například, tabák (Nicotiana tabacum) produkuje v reakci na vnikající mikroorganismy, např. Pseudemonas lychrymans, seskvitérpeny.

Mnohé sloučeniny mohou sloužit jako elicitory syntézy rostlinných fytoalexinů. Tyto zahrnují jeden nebo více toxických iontů., např. měďnaté ionty, jiné chemicky definované sloučeniny, metabolické inihibitory, glykany buněčné stěny, určité glykoproteiny, určité • 0 ··· · · ···· ·· • · · · · · · • · ···· · ·· ·»· · ·· · · · • · · · · ·· ····· ·· enzymy, spory hub, chitosany, určité mastné kyseliny a určité oligosacharidy odvozené od rostlinných buněčných stěn. Viz. např., Sequira 1. (1983) Annu. Rev. Microbiol. 37 : 51-79 a odkazy zde citované. Fragmenty buněčné stěny určitých druhů Phytophtora a celuláza z Trichoderma viride, ale na pektolyáza z Aspergillus japonicum, mohou také vyvolat HR. HR může být také indukována útokem jiných rostlinných patogenů nebo avirulentních příbuzných kmenů.

Elicitiny jsou proteiny produkované rostlinnými patogeny a potenciálními rostlinnými patogeny. Elicitiny mohou indukovat HR v rostlinách. Obecně, ale ne nutně, je lokalizovaná buněčná smrt výsledkem elicitinem-indukované reakce v infikovaném (nebo napadeném) rostlinném pletivu. Tyto reakce zprostředkovávají úplnou nebo částečnou rezistenci k ničivé infekci vnikajícími potenciálními rostlinnými patogenními mikroorganismy. Aminokyselinové a nukleotidové kódující sekvence elicitinu z Phytophora parasitica byly publikovány. Kamoun et al., (1993) Mol. Plant-Microbe Interactions 6 : 573-581.

Rostlinné patogenní viry, včetně viru mozaiky tabáku (TMV), indukují v infikovaných rostlinách HR. Bakterie, které infikují rostliny, mohou také indukovat HR a tím rezistenci; mezi představitele bekterií vyvolávající HR patří např. Xanthomonas spp. a Pseudomonas syringae. Rostlinné patogenní houby obecně neindukují HR po útoku na hostitelskou rostlinu, např. Phytophtora parasitica a Peronospora tabaci na hostitelském tabáku, ale mohou indukovat HR po útoku na nehostitelské rostlině.

Mechanismy signální transdukce, zahrnuté ve fungování této rezistence k nemocem, se stále zkoumají a některé genetické a biochemické rysy byly jíž načrtnuty. Viz např. Staskawicz B., et al., ·· · · · · ···· ·· · ····· · · · · ·· ·)··· · · ··· ··· η ······· · · ·· «· ·· ··· ·· ··

Science 268 : 661-667 (1995). Avšak stále ještě nebylo pochopeno mnoho aspektů drah signální transdukce a role mnoha jeho specifických složek.

V oboru již dlouhou dobu existuje potřeba způsobů ochrany rostlin, obzvláště zemědělských plodin, proti infekci rostlinnými patogeny. Z hlediska hospodářských zájmů a zájmů životního prostředí jsou spíše než způsoby, které jsou závislé na aplikaci chemikálií na zemědělské plodiny, důležité zejména biologické nebo „přírodní“ způsoby. V oboru existuje také potřeba rostlinných polynukleotidových sekvencí pro zesílení a/nebo zlepšení rezistence k nemocem u rostlin.

Podstata vynálezu

Nukleové kyseliny předkládaného vynálezu jsou založeny na nových genech proteinkináz závislých na vápníku (CDPK) a jim odpovídajících proteinech. Indukce exprese těchto nových CDPK genů je překvapivě rychlá, to jest transkripce takovýchto genů může být pozorována již 30 minut po elicitorem zprostředkovaná indukci rostlinné obranné reakce. Nové, zde popsané geny jsou tedy mezi těmi geny, které jsou nejrychleji indukované v reakci na signály naznačující vnikání rostlinných patogenů.

Je zde popsán izolovaný polynukleotid, který zahrnuje nukleotidovou sekvenci SEK I. C. : 1 a její komplement a RNA analog SEK. I. C. : 1 nebo jeho komplement. Těmito polynukleotidy mohou také být fragmenty zmíněných nukleových kyselin, které jsou dlouhé alespoň 20 nukleotidů a které hybridizují za přísných (stringentních) podmínek s genomovou DNA, která kóduje polypeptid, který je na obrázku 3. Tento polynukleotid může obsahovat např. nukleotidy 1 až 170, nukleotidy 160 až 560 nebo nukleotidy 550 až 920 z obrázku 2.

·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · «*· ···· • * · ····· · · · · » · · · · · · · ······

4*·»··· · · · • « β · <9 · ··· ·· · ·

Konstrukt nukleové kyseliny, jak je zde popsán, obsahuje polynukleotid tohoto vynálezu. V takovémto konstruktu může být polynukleotid tohoto vynálezu operativně spojen s jedním nebo více úseky, které regulují transkripci tohoto polynuklotidu, např. regulačním úsekem, indukovaným v reakci na rostlinné patogeny, jako jsou houby (např. Phytophtora), bakterie (např. Pseudomonas) nebo viry (např. virus mozaiky tabáku), jak je zde popsáno. V jiných provedeních je tato indukce zprostředkována nějakým elicitorem (např. houbovými nebo bakteriálními elicitory).

Dalšími předměty předkládaného vynálezu jsou transgenní rostliny, jejich buňky a pletiva, které byly geneticky upraveny tak, aby obsahovaly a exprimovaly polynukleotid tohoto vynálezu, např. kódující sekvenci nebo antisense sekvenci. Konstrukt může dále obsahovat regulační úseky operativně spojené s polynukleotidem, např. indukovatetelný regulační úsek. Tato rostlina může být dvouděložná např. z čeledi Solanacae jako např. Nicotiana tabacum. Tato rostlina může být také jednoděložná, krytosemenná nebo jehličnan.

Je zde popsána taková transgenní rostlina, která obsahuje polynukleotid exprimující polypeptid, který má od asi 250 do 550 aminokyselin. Tento polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě identická s aminokyselinovou sekvencí na obrázku

3.

Je zde popsán způsob použití tohoto polynukleotidu. Součástí tohoto způsobu je hybridizace zde diskutovaného polynukleotidu s DNA nebo RNA z nějaké rostliny. Tento způsob může dále zahrnovat kroky identifikace úseku rostlinné DNA nebo RNA, která je z asi 70 nebo více procent shodná s tímto polynukleotidem, a kroky klonování alespoň části tohoto úseku DNA nebo RNA. Tato klonovaná část může • · · · · ·

9 4 · · 4 · · · ·

4 · 9 9 4 4 9 9 4 4 4 9 9 999 9 99 999994 , 9994449 49

J ·* 44 49 49« 44 «4 dále obsahovat DNA, sousedící s tímto úsekem, který je sekvenčně shodný ze 70 nebo více procent.

Z jiného pohledu je součástí tohoto vynálezu způsob změny rezistence k nemocem u rostliny. Tento způsob obsahuje kroky zavedení polynukleotidu tohoto vynálezu do rostlinné buňky a tvorbu rostlin, které obsahují tento polynukleotid, z těchto buněk. Exprese tohoto polynukleotidu změní rezistenci k nemocem v této rostlině. Např. konstrukt nukleové kyseliny může dále obsahovat indukovatelný regulační úsek, který je operativně spojen s tímto polynukleotidem, a exprese může být indukována pomocí tohoto regulačního úseku při vystavení rostliny nějakému elicitoru nebo rostlinnému patogenu.

Z jiného pohledu je součástí tohoto vynálezu izolovaný polypeptid, který má od asi 250 do asi 550 aminokyselin a obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě identická s obrázkem

3.

Indukovatelným regulačním úsekem je DNA sekvence, která je účinná při regulaci exprese nějakého polynukleotidu, který je s tímto regulačním úsekem operativně spojen. Např. produkt genu CDPK, spojený s rostlinnou obranou reakcí (např. hypersensitivní reakcí) může být operativně spojen s vývojově řízeným regulačním úsekem. Tento termín také zahrnuje regulační úseky, které jsou dostatečné k tomu, aby byla genová exprese indukovatelná v reakci na vnější signály nebo látky spojené s nemocí (např. patogenem nebo elicitorem indukované signály nebo látky, jak je zde popsáno). Tento termín také zahrnuje ty regulační úseky, které sousedí s novým CDPK genem a jsou zahrnuty v rychlé indukci transkripce takovéhoto nového genu. Obecně, regulační úseky obranné reakce jsou umístěny ve směru 5' od kódujícího úseku genu, ale toto není omezující.

„Pletivově specifický“ znamená schopný přednostně zvyšovat expresi • · • · · ·

produktu genu (např. molekuly mRNA nebo polypeptidu) v jednom pletivu (např. xylému) ve srovnání s jiným pletivem (např. floémem). „Buněčně specifický“ znamená schopný přednostně zvyšovat expresi produktu genu (např. molekuly mRNA nebo polypeptidu) v jedné buňce (např. parenchymatické buňce) ve srovnání s jinou buňkou (např. epidermální buňkou).

„Patogen“ je organismus jehož infekcí nebo spojením s ním může u životaschopných buněk dojít ke vzniku nemoci. „Elicitor“ je jakákoliv molekula, která je schopná spuštění rostlinné obranné reakce. Příklady elicitorů mohou být jeden nebo více toxických iontů., např. měďnaté ionty, jiné chemicky definované sloučeniny, metabolické inihibitory, glykany buněčné stěny, určité glykoproteiny, určité enzymy, spory hub, chitosany, určité mastné kyseliny a určité oligosacharidy odvozené od rostlinných buněčných stěn a elicitiny (např. harpin, kryptogein a parasiticein).

„Operativně spojený“ znamená, že dva polynukleotidy jsou spojeny takovýn způsobem, který umožňuje, aby oba tyto polynukleotidy dosáhly požadované funkční aktivity. Např. spojení indukovatelné regulační sekvence a kódující sekvence, aby byla dosažena genová exprese za přítomnosti vhodných molekul induktoru.

Jestliže není uvedeno jinak, mají všechny zde použité technické a vědecké termíny stejný význam, který se jimi běžně rozumí v oboru, do kterého tento vynález patří. Ačkoliv mohou být v praktikování nebo testování předkládaného vynálezu použity materiály nebo metody, které jsou stejné nebo ekvivalentní těm zde popsaným, vhodné metody a materiály jsou popsány níže.

Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a jiné zde zmíněné odkazy jsou zde zahrnuty ve své úplnosti. V případě sporu bude tento popis, včetně definic, kontrolován. Dále, materiály, metody a příklady « · jsou pouze ilustrativní a nejsou považovány za omezující.

Jiné znaky a výhody tohoto vynálezu, které budou zřejmé z následujícího popisu jeho upřednostňovaných provedení, jsou součástí nároků.

• · • 4 • 4 4 4 ·

Detailní popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká izolovaných polynukleotidů (nukleových kyselin), které jsou indukované v rostlinách, při reakci na vniknutí možného rostlinného patogena a/nebo působení elicitoru nebo elicitor napodobujících chemických signálů. Takové nukleové kyseliny obvykle kódují polypeptid proteinkinázy závislé na vápníku (CDPK) nebo CDPK-příbuzný polypeptid. Indukce nových, zde popsaných, polynukleotidů v čase odpovídá indukci genů rostlinné obranné reakce, kdežto ostatní CPDK geny se jeví být indukovány pomaleji. Indukce genové exprese takovýchto nových genů je rychlejší, něž indukce genů, které jsou zahrnuty ve vývojově řízených procesech, např. vývojově řízených procesech jako je vývoj květu. Indukce těchto nových CDPK genů, zde uvedených, je také rychlejší než indukce mnoha genů zahrnutých v reakci na abiotický stres, jako např. stres způsobený vodou nebo solemi.

Polynukleotidy předkládaného vynálezu mohou být ve formě RNA nebo ve formě DNA, včetně cDNA, syntetické DNA nebo genomové DNA. Tato DNA může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. V případě, že je jednořetězcová, to může být kódující řetězec nebo nekódující řetězec. RNA analog SEK. I. Č. : 1 může být např. mRNA nebo kombinace ribo- a deoxyribonukleotidů.

Polynukleotid předkládaného vynálezu může kódovat polypeptid, jehož součástí je aminokyselinová sekvence, která je velmi podobná nebo identická se sekvencí na obr. 3. V některých provedeních může • · 4 · · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ··· θ ······· · ·

O · · · · · · · · · · · · · být polynukleotid obměnou nukleové kyseliny, uvedené v SEK.I. Č. : I, např. může mýt odlišnou nukleotidovou sekvenci, která díky tomu, že genetický kód je degenerovaný, kóduje stejnou aminokyselinovou sekvenci jako polypeptid na obrázku 3.

Polynukleotid vynálezu může dále obsahovat přídavné sekvence. Například, N-terminální konec polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku 3, může bý fúzován ve čtecím rámci s fragment nukleové kyseliny, která kóduje sekreční nebo vedoucí (leader) aminokyselinou sekvenci. V oboru jsou známé další fragmenty nukleových kyselin, které kódují aminokyselinové sekvence, vhodné pro fúzi ve čtecím rámci se zde uvedenými CDPK polypeptidy. Viz např. U. S. 5 629 193. Polynukleotid může dále obsahovat jeden nebo více regulačních úseků, operativně spojených se zde uvedeným polynukleotidem.

Součástí překládaného vynálezu jsou také polynukleotidy, které selektivně hybridizují se zde uvedenou CPDK polynukleotidovou sekvencí. Hybridizace může zahrnovat Southernovu analýzu (Southern blotting), to jest metodu, pomocí které lze identifikovat přítomnost DNA sekvence v směsi cílové nukleové kyseliny na základě její hybridizace se značeným oligonukleotidem nebo sondou, kterou tvoří fragment DNA. Southernova analýza typicky zahrnuje elektroforetickou separaci štěpením vzniklých DNA fragmentů na agarózových gelech, denaturaci DNA po elektroforetické separaci a přenos DNA na nitrocelulózový, nylonový nebo jiný vhodný membránový podklad pro analýzu sondou, která je značena readioaktivně, biotinem nebo enzymově, jak jest popsáno v částech 9.37-9.52 Sambrook et al., (1989) Molecular cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY.

Polynukleotid může se zde uvedeným polynukleotidem hybridižoVat • · · * « 9 • · « · · 9 9 9 · · 9 9

9 9 9 9999 9 99 9

9 · 9 9 9 99 999999 _ * 9 * 9 9 9 9 99

99 4· 99 999 99 99 za málo přísných podmínek nebo za velmi přísných podmínek. Velmi přísné podmínky se používají pro nalezení nukleových kyselin, které mají vysoký stupeň homologie nebojsou sekvenčně totožné se sondou. Za velmi přísných podmínek mohou být během hybridizace použity denaturační činidla jako např. formamid. Příkladem je 50% formamid s 0,1% hovězím sérovým albuminem / 0,1% fikolem / 0,1% polyvinylpyrrolidonem / 50 mM pufrem fosforečnanu sodného při pH 6,5 s 750 mM NaCl a 75 mM citran sodný při 42 °C. Dalším příkladem je použití 50% formamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citran sodný, 50 mM fosforečnan sodný (pH 6,8), 0,1% pyrofosforečnan sodný, 5 x Denhardtův roztok, DNA sonikovaných lososích spermií (50 pg/ml), 0,1% SDS a 10% dextransulfát při 42 °C s promýváním při 42 °C v 0,2 x SSC a 0,1% SDS.

Alternativou je použití nízké iontové síly a vysoké teploty při promývání, např. 0,015 M NaCl / 0,0015 M citran sodný (0,1 x SSC); 0,1% laurylsulfát sodný (SDS) při 65 °C.

Málo přísné podmínky jsou takové hybridizační podmínky, které se používají pro nalezení nukleových kyselin, které mají se sondou menší homologii nebo totožnost, než mají nukleové kyseliny nalezené za velmi přísných podmínek. Za málo přísných podmínek mohou být použity vyšší iontové síly a/nebo nižší teploty při promývání hybridizační membrány, ve srovnání s iontovou silou a teplotami, použitými při hybridizaci za velmi přísných podmínek. Např. promývací roztok, obsahující 0,060 M NaCl / 0,0060 M citran sodný (0,4 x SSC) a 0,1% laurylsulfát sodný (SDS), může být použit při 50 °C, s alespoň jedním promýváním v lx SSC při 65 °C. Alternativou je použití promývání v 1 X SSC při 37 °C.

Hybridizace může být také provedena pomocí northernové analýzy (northern blotting), metody, používané pro vyhledání RNA, která

I · · · · β · · · • · ·

I · · · • · · · · · • · • 9 · 9 hybridizuje se sondou. Sonda je značena radioizotopem, např. ³²P, biotinem nebo enzymem. Analyzovaná RNA může být elektroforeticky rozdělena na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, přenesena na nitrocelulózovou, nylonovou nebo jinou vhodnou membránu a hybridizována se sondou, za použití v oboru dobře známých standardních technik jako např. těch, popsaných v částech 7,39 - 7,52 Sambrook et al., supra.

Obecně je upřednostňováno použití sond, které jsou dlouhé alespoň 20 nukleotidů, lépe alespoň 50 nukleotidů a nejlépe alespoň 100 nukleotidů. Je-li použita relativně krátká sonda, její sekvence přednostně neobsahuje konzervované úseky CDPK genů (proteikinázovou doménu a doménu vázající vápník), za účelem snadnějšího rozpoznání zde uvedených rychle indukovaných CDPK genů od pomalu indukovaných CDPK genů, konstitutivních CDPK genů či nízkoúrovňových konstitutivních CDPK genů. Nicméně, sondy, které takovéto konzervované úseky obsahují, mohou být použity, jestliže obsahují také dostatečně dlouhé nekonzervované úseky, které jsou specifické pro zde uvedené nové polynukleotidy. Polynukleotid tohoto vynálezu je alespoň z asi 70 % sekvenčně totožný, přednostně alespoň z asi 80 % sekvenčně totožný a lépe alespoň z asi 90 % sekvenčně totožný se SEK.l. C. : 1. Sekvenční totožnost může být určena např. pomocí počítačových programů, vytvořených tak, aby provedly jednoduchá nebo vícenásobná seřazení sekvencí. Polynukleotidy, které jsou z asi 70 % nukleotidové sekvence totožné s polynukleotidem, který má SEK. E Č. 1, jsou součástí vynálezu a mohou být identifikovány hybridizací za málo přísných podmínek. Polynukleotidy, které jsou alespoň z asi 80 % sekvenčně totožné, nebo alespoň z asi 90 % sekvenčně totožné nebo alespoň z asi 95 % sekvenčně totožné polynuklotidem, který má SEK.

• · ···· ·· ···· ·« ·· • · · ··· ···· « · · · » · · · · ·· · • · · * · · · · ··· ··· i . ·»«··· · · li «* · · a···· · · · · v

I. C. : 1, mohou být identifikovány hybridizací za velmi přísných podmínek.

Polynukleotidy tohoto vynálezu mohou být získány chemickou syntézou, izolací a klonováním z rostlinné genomové DNA, nebo jinými v oboru známými způsoby, včetně polymerázové řetězové reakce (PCR), která je provedena za použití oligonukleotidů, odpovídajícím částem SEK.I. Č. : I. Jako PCR se označuje postup nebo technika, kde je cílové nukleová kyselina amplifikována podobným způsobem, jako je ten, popsaný v U. S. Patent No. 4 683 195, který je zde zahrnut odkazem, a následné modifikace tohoto zde popsaného postupu. Obecně, sekvence konců úseku zájmu nebo sekvence za nimi se využívají pro navržení oligonukleotidových primerů, které jsou sekvenčně identické nebo podobné protilehlým řetězcům templátu, který má být amplifikován. PCR může být použita pro amplifikaci specifických sekvencí RNA, specifických sekvencí DNA z totální genomové DNA a cDNA, transkribované z totální buněčné RNA, bakteriofágových nebo plazmidových sekvencí apod. Alternativou je prohledávání knihovny cDNA (v expresním vektoru) pomocí CDPK-specifické protilátky, připravené za použití peptidové sekvence (sekvencí) z hydrofilních úseků CDPK sekvence na obrázku 3 a postupu, známého v oboru.

Nové polynukleotidy tohoto vynálezu mohou být nalezeny v podstatě u všech rostlin, včetně rostlin z čeledi Leguminaceae (např. sóji), z čeledi Solanaceae (např. N. tabacuní), z čeledi Brassicaceae (např. Arabidopsis thaliana) a z čeledi Graminaceae (např. Zea mays}. Polynukleotidy tohoto vynálezu jsou přednostně vybrány z Čeledi Solanaceae.

V některých provedeních je polynukleotid tohoto vynálezu identifikován a izolován z rostliny na základě homologie nukleotidové » · · · · · ···· · · a·*·· ···· • · · · · · · a aaa ··· _1O ······· · ·

1Z 99 99 99 999 99 99 sekvence a na základě rychlé indukce exprese po působení elicitoru nebo patogena. Např. DNA:DNA hybridizace za málo až velmi přísných podmínek, za použití zde uvedené polynukleotidové sondy, umožňuje nalezení odpovídajících genů z jiných rostlinných druhů. Použití cílové nukleové kyseliny (např. cDNA), připravené z pletiva krátce po indukci obranné reakce usnadňuje izolaci zde uvedených nových polynukleotidů, protože takovéto polynukleotidy jsou obvykle indukovány rychleji než jiné CDPK geny.

Konstrukt nukleové kyseliny obsahuje zde uvedený polynukleotid, který je typicky spojen s jiným, odlišným, polynukleotidem. Například, CDPK kódující sekvence plné délky může operativně fúzována ve čtecím rámci s fragmentem nukleové kyseliny, která kóduje vedoucí sekvenci, sekreční sekvenci nebo jiné přídavné aminokyselinové sekvence, které mohou být užitečně spojené s polypeptidem nebo peptidovým fragmentem.

V některých provedeních zahrnuje konstrukt nukleové kyseliny polynukleotid tohoto vynálezu, operativně spojený s alespoň jednou vhodnou regulační sekvencí ve stejné nebo obrácené orientaci. Regulační sekvence obvykle sami nekódují genové produkty. Místo toho, působí regulační sekvence na úroveň exprese kódující sekvence. Příklady regulačních sekvencí jsou v oboru dobře známé a zahrnují, ne pouze, minimální promotory a promotory genů, které jsou indukovány v reakci na elicitory. Přirozené regulační sekvence zde uvedených polynukleotidů mohou být odborníky snadno izolovány a použity v konstruktech tohoto vynálezu. Jinými příklady vhodných regulačních sekvencí jsou enhancery či enhancerům podobné úseky, introny, 3'- nekódující oblasti jako póly A sekvence a jiné zde diskutované regulační sekvence. Techniky molekulární biologie pro přípravu chimerních genů jsou v oboru známé.

9 9 9

9

9999 99 • 9 9 999 «999

9 9 9 9999 9 99 9

9999 99 999 999

99 99 99 999 99 9 9

Polypeptidy tohoto vynálezu mají od asi 250 do asi 550 aminokyselin, např. od asi 300 aminokyselin do asi 508 aminokyselin, od asi 308 aminokyselin do asi 500 aminokyselin. Polypeptidy tohoto vynálezu typicky obsahují proteinkinázové domény, stejně jako domény obsahující vazebné místo pro vápník. Takovéto domény zahrnují např. aminokyseliny 2 až 7, 42 až 49, 191 až 202, 227 až 238, 264 až 274 a 297 až 307 na obrázku 3.

Aminokyselinové sekvence tohoto polypeptidu mohou zahrnovat vyvozenou aminokyselinovou sekvenci z obrázku 3. V jiných provedeních zahrnuje polypeptid tohoto vynálezu aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě identická se sekvencí na obrázku 3, např. z asi 80 % či více, nebo z asi 90 % či více, nebo z 95 % či více. Obecně, konzervativní aminokyselinové substituce nebo substituce podobných aminokyselin, které neovlivňují funkci proteinu, jsou tolerovány. Podobné aminokyseliny jsou takové aminokyseliny, které mají podobnou velikost a/nebo nábojové vlastnosti. Například, izoleucin a valin jsou podobné aminokyseliny. Podobnost mezi páry aminokyselin byla v oboru stanovena řadou způsobů. Například, Dayhoff et al. (1978) v Atlas of Protein Sequence and Structure, díl 5, dodatek 3, str. 345-352, poskytuje tabulky četnosti substitucí aminokyselin, které mohou být použity jako měřítko aminokyselinové podobnosti. Proteinkinázové domény a domény obsahující vazebné místo pro vápník mohou být upraveny konzervativními substitucemi, ale obecně jsou zachovány beze změn v aminokyselinové sekvenci. „Izolovaný“ polypeptid je exprimován a produkován takovým způsobem a v takovém prostředí, které jsou odlišné od způsobu a prostředí, ve kterém je polypeptid přirozeně exprimován a produkován. Například, polypeptid je izolován, když je exprimován a produkován v bakterii v bakteriích nebo houbách. Podobně, polypeptid • · · ··· · · · · • · · ····· »··· • · · · · · · · ··· ···

Λ ······» » « ·β ·· ·· ··· ·· ·· je izolován, když je gen, který ho kóduje, operativně spojen s chimerním regulačním úsekem a když je exprimován v pletivu nebo druhu, kde tento polypeptid není přirozeně exprimován. Dále, polypeptid je izolován, když je gen, který ho kóduje, operativně spojen s chimerním regulačním úsekem a když je exprimován v pletivu nebo druhu, kde je tento polypeptid přirozeně exprimován, ale ve větších množstvích. Polypeptid tohoto vynálezu může být také izolován standardními purifikačními metodami tak, aby byl získán v asi 80% či vyšší čistotě, nebo 90% či vyšší čistotě, nebo 95% či vyšší čistotě.

V některých provedeních je polypeptid tohoto vynálezu analogem nebo variantou polypeptidu, který zahrnuje vyvozenou aminokyselinovou sekvenci z obrázku 3.

Takováto analoga a varianty zahrnují, např. přirozeně se objevující alelické varianty, nepřirozeně se objevující alelické varianty, deleční varianty a inzerční varianty, které se podstatně funkčně neliší od polypeptidu.

Polypeptid tohoto vynálezu může obsahovat sekvenci ukázanou na obrázku 3 a rovněž boční C-terminální a N-terminální sekvence, kódované stejným genem jako je ten, který obsahuje nukleotidovou sekvenci SEK. I. Č. I. Alternativou je produkce chimerního polypeptidu z genu, kde jsou spojeny ve čtecím rámci nukleotidy z 5'oblasti jednoho CDPK genu s nukleotidy z 3'oblasti druhého GDPK genu a tím vzniká chimerní gen, který kóduje chimerní polypeptid. Ilustrativním příkladem chimerního CDPK polypeptidu je polypeptid, který je exprimován polynukleotidem, který kóduje aminokyseliny 1 až 156 z N-terminální oblasti CDPK genu sóji (obr. 4), po nichž následuje aminokyselinová sekvence z obr. 3 a dále aminokyseliny 465 až 508 z C-terminální části stejného CDPK genu sóji, kde všechny • · · «φφφφ φφφφ • · · · · φ φ · φφφ φφ φ _η c ······> φ φ ·· ·· ** ··· ·φ φφ jsou fúzované ve čtecím rámci.

Transgenní rostlina tohoto vynálezu obsahuje konstrukt nukleové kyseliny, jak je zde popsán. Takovýto konstrukt je zaveden do rostlinné buňky a je získána alespoň jedna transgenní rostlina. Semena produkovaná transgenní rostlinou se pro získání rostlin, homozygotních v tomto konstruktu, mohou nechat vyrůst a samoskřížit (nebo skřížit a samoskřížit). Semena mohou být analyzována za účelem nalezení těch homozygotů, u kterých dochází k požadované expresi tohoto konstrukt. Transgenní rostliny mohou být zavedeny do programu pěstování, za účelem např. přírůstků semen, zavedení těchto nových konstruktů do jiných linií nebo druhů nebo další selekce jiných požadovaných rysů. Druhou možností je získání transgenních rostlin vegetativním rozmnožováním transformovaných rostlinných buněk, u těch druhů, u kterých se tyto techniky dají provádět.

Když je zde použit, označuje termín transgenní rostlina také potomstvo původní transgenní rostliny. Potomstvo zahrnuje potomky konkrétních rostlin nebo buněčných linií, např. semena vyvinutá na běžné rostlině. Potomstvo běžné rostliny také zahrnuje semena vzniklá na rostlinách F_1? F₂, F₃ a následných generací, nebo semena vzniklá na rostlinách B_b B₂ , B₃ a následných generací.

V některých provedeních obsahují transgenní rostliny konstrukt, který zahrnuje polynukleotid tohoto vynálezu, operativně spojený v sense orientaci se vhodným regulačním úsekem, takže je produkována sense mRNA. Je-li to požadováno, může být do tohoto konstruktu začleněn gen pro selektovatelný markér za účelem usnadnění identifikace transformovaných buněk nebo pletiv.

Inhibice těchto nových CDPK genů v rostlinách je také užitečná. Například inhibice exprese CDPK genu krátce před sklizní semen může umožnit snadnější vnik rostlinných patogenů do rostlinných • · • · |f ······· · · iv «· ·» ·· ··· ·· ·· vegetativních pletiv a tím snížení rostlinné biomasy, která brání mechanickému sklízení semen. Regulovaná inhibice exprese genu CDPK může být dosažena pomocí operativního spojení polynukleotidu tohoto vynálezu v antisense orientaci se vhodným indukovatelným regulačním úsekem. Viz např. U.S. Patent 5 453 566. Stejného efektu se dá dosáhnout kosupresí, to jest, exprese celé nebo části kódující sekvence nového CDPK genu v sense orientaci může potlačit odpovídající endogenní CDPK geny. Viz např. WO 94/11516.

V některých provedeních zahrnuje konstrukt zde popsaný polynukleotid, operativně spojený s minimálním promotorem. Takovýto konstrukt, když je zaveden do a exprimován v rostlině, může umožnit nízkou úroveň konstitutivní exprese polynukleotidu, což má za následek zesílenou systémovou obranou reakci rostliny. Minimální promotor obsahuje DNA sekvenční signály pro vazbu RNA polymerázy a iniciaci transkripce. Obecně, transkripce řízená minimálním promotorem je nízká a neodpovídá pozitivně ani negativně na okolní nebo vývojové signály v rostlinném pletivu. Příkladem minimálního promotoru, který je vhodný pro použití v rostlinách, je zkrácený promotor CaMV 35S, který obsahuje úsek od -90 do +8 z 35S transkripční jednotky.

Transkripční regulační sekvence mohou být použity pro řízení genové exprese v suspenzních kulturách. Například EAS4 promotor zahrnující signály pro iniciaci transkripce, indukovatelný úsek pro regulaci transkripce a transkripci zesilující úsek, může být použit pro zprostředkování indukovatelné exprese uvedené kódující sekvence v transgenních rostlinách nebo suspenzních buněčných kulturách. Viz U.S. Application Seriál No. 08/577 483. Když je to požadováno, je exprese kódující sekvence zájmu indukována aplikací elicitoru nebo jiného indukujícího signálu.

·· ···· • · · · · · ···· • · · ····· ···· • · ··· · · · ······ ······* · ,

1/ ·· ·· · · · »· · · ··

Transgenní techniky, pro použití v tomto vynálezu, zahrnují také agrobakteriem zprostředkovanou transformaci, elektroporaci a balistickou metodu transformace. Ilustrativní příklady transformačních technik jsou popsány v U. S. Patent 5 204 253 (balistická metoda) a U.S. Patent 5 188 958 (Agrobacterium). Transformační metody využívající Ti a Ri plazmidy agrobakteria spp. využívají obvykle podvojnými vektory. Walkerpeach C. et al., v Plant Molecular Biology Manual s., Gelvin a R. Schilperoort, ed., Kluwer Dordrecht, Cl : 1-19 (1994).

V některých provedeních může být indukovatelná transkripční regulační sekvence spojena s promotorovou sekvencí funkční v rostlinách, z nichž obě jsou operativně spojeny s polynukleotidem tohoto vynálezu. Když je takovýto regulační úsek spojen s promotorem, je obecně použit zkrácený (nebo minimální) promotor, např. zkrácený 35S promotor z viru mozaiky květáku (CaMV). Použity mohou být také zkrácené verze jiných konstitutivních promotorů, např. genů T-DNA A. tumefaciens jako jsou nos, ocs a mas, a genů rostlinných virů jako je CaMV 19S gen.

V oboru jsou dobře známé techniky zavedení DNA do jednoděložných stejně jako dvouděložných rostlin, stejně jako techniky kultivace rostlinných pletiv a regenerace těchto pletiv. Mezi jednoděložné rostliny, které byly úspěšně transformovány a regenerovány, patří pšenici, kukuřici, žito, rýži a chřest. Viz. např. U. S. Patent No. 5 484 965 a 5 550 318. Byly připraveny transgenní pletiva osiky a byly regenerovány transgenní rostliny. Transformován byl také topol. Je také dosažitelná technologie pro manipulace, transformaci a regenerace krytosemenných rostlin. Viz. např. U. S. Patent No. 5 122 466 a U. S. Patent No. 5 041 382.

Způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje zavedení konstruktu nukleové • · · · · · 0 0 9·9· ·« • · · · · · · · · · ·· 0 0 0 0 0« «049 • · 4 4 4 4 · 9 «44 499 ,0 4 4 4 4 4 4 4 44 «· 0· 00 000 «0 9« kyseliny do rostlinné buňky a vytvoření transgenní rostliny z takovéto transformované buňky. Exprese polynukleotidu, přítomného v tomto konstruktu, změní fenotypické vyjádření rezistenci k nemocem v rostlině, např. v rostlině je vytvořeno nové fenotypické vyjádření rezistence k nemocem nebo je existující fenotypické vyjádření rezistence k nemocem zesíleno.

Fenotypické vyjádření rezistence k nemocem zahrnuje úroveň a načasování obranné reakce v transgenní rostlině. V pokusech, prováděných za účelem zjištění zda byla rezistence k nemocem změněna, se typicky na transgenní rostlinu aplikují sloučeniny, které běžně vyvolávají obrannou reakci, paralelně s aplikací stejných sloučenin na kontrolní rostlinu. Kontrolní rostlina je obvykle ze stejné rodičovské linie jako ta, do které byl zaveden nový konstrukt nukleové kyseliny. Rezistence k nemocem je v rostlině vytvořena nebo zesílena expresí polynukleotidu tohoto vynálezu, kdež je u transgenní rostliny vyšší stupeň rezistence než je odpovídající rezistence u kontrolní rostliny. Rezistence k nemocem může být měřena s ohledem na konkrétního patogena, např. Phytophora spp. Rezistence k nemocem může být také měřena s ohledem na několik patogenů, za účelem zjištění zesílené systémové obranné reakce.

U transgenních rostlin, kde má být indukována exprese CDPK kódující sekvence operativně spojené s regulačním úsekem řízeným elicitorem, musí obvykle elicitor projít kutikulou rostliny, aby měl indukční účinek. Pro usnadnění nebo umožnění vniku elicitoru do rostlinného pletiva může být toto pletivo poraněno. Pro účinnou indukci exprese může být použita velká řada indukčních sloučenin, včetně elicitoru a jiných chemických signálních molekul, jako je kombinace ethylen- a methyjasmonátu.

Způsob použití polynukleotidu tohoto vynálezu zahrnuje hybridizaci ·· ··· · • · · · · · ···· • · · ····· ···· • · · · · · ·· ··· ··· ιλ ··»··«» 9 9

99 9· 99 999 99 99 tohoto polynukleotidu s DNA nebo RNA nějaké rostliny. Hybridizace může být provedena např. tak, jak jest popsáno výše. Tento způsob dále zahrnuje kroky identifikace segmentu rostlinné DNA nebo RNA, který se vyznačuje významným stupněm sekvenční shody s tímto polynukleotidem, např. 70% sekvenční shodou, přednostně 80% sekvenční shodou, 90% sekvenční shodou nebo 95% sekvenční shodou. Tento segment může být identifikován pomocí elektroforetické separace rostlinné DNA nebo RNA a za použití značené polynukleotidové sondy, což má za následek vznik viditelného pruhu v pozici homologního segmentu. Segmenty mohou být vytvořeny např. mechanickou fragmentací nebo štěpením restrikční endonukleázou. Segment může být krátký až 100 bp (nukleotidů), ale obvykle jsou segmenty dlouhé alespoň 1000 bp a mohou být dlouhé 10000 bp či více.

Takovýto způsob může dále zahrnovat kroky klonování alespoň části segmentu DNA nebo RNA, včetně, ale ne pouze, DNA ohraničující tento homologní segment. Takovéto ohraničující DNA mohou zahrnovat promotory, enhancery, transkripční regulační úseky a polyA sekvence. Ohraničující DNA může být buď na 5'nebo 3' straně od homologního segmentu a přednostně zahrnuje 300, 600 nebo 1000 bp za kódující sekvencí, protože regulační úseky se obecně nacházejí v tomto rozmezí.

Promotory a jiné regulační úseky citlivé k elicitorů nebo patogenu, ohraničující zde popsané nové polynukleotidy, jsou obzvláště užitečné, protože takovéto úseky umožňují velmi rychlou indukci genové exprese po působení patogena nebo elicitorů. Takovéto regulační úseky mohou být operativně spojeny s užitečnými geny pro umožnění rychlé produkce požadovaných sloučenin. Např. takovéto regulační úseky mohou být použity pro řízení exprese genů kódující ·· « · · · protilátky, koagulační faktory, antigenní peptidy, virové replikázy nebo obalové proteiny, a enzymy zahrnuté v syntéze sekundárních metabolitů (jako např. biosyntéze izoprenoidů). Viz např. U. S. Patent

612 487; U. S. Patent 5 484 719 a U. S. Application Ser. No.

08/577483 vyplněná 22. prosince 1995.

Po zavedení chimerního genu, jehož součástí je regulační úsek citliví k elicitoru nebo patogenu, do rostliny, může být exprese chimerního genového produktu indukována příslušným patogenem nebo elicitorem. Rychle dojde k produkci požadovaného genového produktu (nebo jeho enzymatického koncového produktu) a může být získán požadovaný produkt.

Tento vynález bude dále popsán v následujících příkladech, které neomezují rozsah tohoto vynálezu popsaný v nárocích.

Příklady provedení vynálezu

V následujících příkladech může být využíváno mnoho technik, které jsou dobře známé a přístupné odborníkům v oboru molekulární biologie, manipulací rekombinantní DNA v rostlinných pletivech a kultivace a regenerace transgenních rostlin. Enzymy byly získány z komerčních zdrojů a byly použity podle prodejcových pokynů nebo jejich v oboru známých obměn. Činidla, pufry a kultivační podmínky jsou v oboru také známé. Zkratky a názvosloví, když jsou zde použity, jsou považovány za standardní v oboru a jsou běžně používány v profesionálních časopisech, jako jsou ty zde citované.

Příklad 1

Klonování tabákové CDPK cDNA

Elicitor parasiticein byl připraven expresí gemu parAl . z druhu ·· · · ·· ··· · ·· ·· • · · 9 9 9 9 · 9 9

9 99999 9999 • 9 9 9 9 9 99 999999 «, 9999999 9 9

Z 1 99 99 99 999 99 9 9

Phytophora v buňkách E. coli a izolací genového produktu z periplazmatického prostoru

Genomová DNA z Phytophora kmen O byla izolována z mycelia v podstatě tak, jak je popsáno v Xu J. et al., Trends in Genetics 10 : 226-227 (1994). DNA byla rozdělena na fragmenty a byla použita jako templát pro PCR amplifikaci genu parAl za použití primerů, které byly navrženy podle sekvence parAl, která byla publikována v Kamour s. et al., Mol. Plant-Microb Interact, 6 : 573-581 (1993). PCR produkt parAl byl kolonován do pBluescriptu (Stratagene, San Diego, CA) a sekvence tohoto produktu byla získána sekvencováním dvouřetězcové DNA za použití metody využívající terminace řetězce dideoxynukleotidem.

ParAl insert v pBluescriptu byl amplifikován pomocí PCR, za použití primerů, které vytvořily N-terminální histidinovou kotvu a proteinkinázové místo na 5' konci tohoto genu. PCR produkt byl ligován do expresního vektoru pET28b (Novagene, Medisone, WI) a po ověření DNA sekvence fúzovaného parAl byly tímto pET28b konstruktem transformovány buňky E. coli BL21.

Kultura buněk BL21 obsahující fúzovaný parAl rostla při 37 °C v přítomnosti kanamycinu do OD₆₀o = 0,3· Poté bylo přidáno IPTG (lmM) a kultura byla inkubována po dobu dalších 5 hodin při 27 °C.

Periplazmatické proteiny byly připraveny pomocí osmotického šoku v podstatě tak, jak jest popsáno v Ausubel F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989). Buňky (1,5 ml) byly sklizeny centrifugací, resuspendovány v 500 pl roztoku, který obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20% sacharose, lmM EDTA, a byly inkubovány při třepání dalších 10 min při pokojové teplotě. Po centrifugací byly pelety resuspendovány v 200 pl ledového MgSO4 »· «·9· ·· ·»·· • · · · · ··· · · · · • · · · » · ·» ······ ······ · · β ·· ·· ·· ··· ·· ·· (5mM) a následovala inkubace při třepání po dobu 10 minut při 4 °C.

Směs byla centrifugována a výsledný supernatant (obsahující periplazmatické proteiny) byl přenesen na Ni ⁺⁺ kolonu. ParAl protein byl na této koloně purifikován podle pokynů výrobce. Koncentrace proteinu v parAl extraktu byl určena Bradfordovou metodou.

Na suspenzní kultury buněk Nicotiana tabacum L. cv. KY14 bylo během fáze rychlého růstu působeno parasiticeinem v konečné koncentraci 2 μί/ml za účelem indukce genů stresové reakce. Paralelní suspenzní buněčné kultury, na které nabylo působeno parasiticeinem, sloužily jako kontroly. Buňky byly shromážděny jemnou vakuovou filtrací 0, 30 , 60 a 120 minut po přidání elicitoru.

Z tabákových buněk, na která bylo působeno elicitorem i těch, na které nebylo působeno ničím, byla vyizolována totální RNA a byla použita jako templát pro TDDRT-PCR (targeted differential display reverse transcriptase PCR). První řetězec cDNA byl vytvořen za použití cDNA cycle soupravy od Invitrogen (San Diego, CA). První řetězce cDNA byly poté použity jako templáty pro PCR. PCR reakce byla provedena za typických podmínek, jak jsou popsány v PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis M., Gelfand D, Sminsky J. a White

T., ed. Academie Press Inc., San Diego, CA , (1990), s výjimkou toho, že reasociační teplota byla 58 °C. PCR primery byl FokinB (GTTGACTCCCTACCCTCTT) a RecallV (GGTACTTAGGAAGTGTTACGGG). Viz obrázek 1. PCR produkty byly odděleny elektroforézou na 1% (w/v)agarózovém gelu a produkty, které byly větší než asi 800 párů baží (bp) z kultury, rta kterou bylo působeno po dobu 60 minut, byly purifikovány elektroelucí na DE-81 papír (Whatman). Konce purifikovaných PCR produktů byly doplněny Klenowovým fragmentem, ligovány do EcoRV místa pBluescriptu a transformovány do E. coli. TB1.

····

9 9 ··· ····

9 9 9 9 999 9 9 9 9 99 9999 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·· ·· ··· ·· ··

Ampicilin rezistentní TB1 kolonie byly testovány na přítomnost DNA fragmentu >800 bp, vloženého do pBluescriptu. Sekvence jednoho takového insertu byla určena metodou dideoxynukleotidové terminace podle Sanger et al., (1977) Proč. Ntl. Acad. Sci. USA 74 : 8073-8077, pomocí soupravy Sequenase® od United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) nebo automatického na fuorescenci založeného systému (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvence tohoto insertu ve vektoru byla určena na obou řetězcích. Plazmid obsahující tento insert byl označen jako pCDPK-1.

Nukleotidová sekvence tohoto insertu v plazmidu pCDPK-1 je ukázána na obrázku 2 a odvozená aminokyselinová sekvence tohoto insertu je ukázána na obrázku 3. Odvozená aminokyselinová sekvence byla srovnána s aminokyselinovými sekvencemi rostlinných genů v databázích GenBank, EMBL a Swiss Prot. Homologie byla nalezena s rostlinnými CDPK polypeptidy, včetně polypeptidů z Glycine max, Arabidopsis thaliana, Vigna radiata, Zae mays a Cucurbita pepo.

Za použití programu BLASTP a BLOSUM62 byly identifikovány dva úseky homologie se serin/treonin proteinkinázovými doménami v aminoterminální části polypeptidů a čtyři úseky homologie s Ca ⁺⁴vazebnými doménami v karboxyterminální části polypeptidů. Obrázek 4 ukazuje srovnání aminokyselinové sekvence z obrázku 3 a CDPK aminokyselinové sekvence sóji (Genbnak Accession No : M64987). Aminokyselinová sekvence tabákových vazebných míst vápníku byla podobná aminokyselinové sekvenci odpovídajících míst v CDPK sóji. V ostatních částech sekvence byly však významné rozdíly. Srovnání ukazuje, že je existuje 78% celková shoda sekvence mezi CDPK sóji sCDPK-1.

Program BLASTN byl použit pro srovnání nukleotidové sekvence pCDPK-1 s nukleotidovými sekvencemi v různých databází. Na ·· 9 999 ·· ···· 99 ·· ·· · · 9 · 9 9 9 9 • · · · ···· · ·· · •9 9999 99 999 999 _ , 9999999 99

9 9 9 9 99 999 99 99 základě nukleotidových sekvencí jiných CDPK genů a délky jimi kódovaných polypeptidů se má za to, že insert nukleové kyseliny přítomný v pCDPK-1 postrádá asi 560 bp na 5' konci CDPK-1 kódující sekvence a asi 130 bpna3' konci CDPK-1 kódující sekvence.

Příklad 2

Izolace klonu cDNA plné délky

Pro získání klonu, který obsahuje cDNA plné délky, byla použita metoda RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) na templátu, kterým byla polyA+ RNA, připravená z tabákových buněk po indukci elicitorem. PolyA+ RNA byla připravena tak, jak jest popsáno v příkladě 1. Pro amplifikáci 3' konce CDPK kódující sekvence byl použit primer, mající sekvenci GAC AAG GAC GGG AGT GGG TAT (Primer A, uvnitř CDPK-1) a primer mající sekvenci GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT (dT₁₇ adapter-primer). Reverzní transkriptázová reakce byla provedena za použití 2 μΐ lOx RTC pufru, 10 jednotek RNasinu (Promega Biotech), 0,5 pg dT₁₇adapter-primeru a 10 jednotek AMV reverzní transkriptázi (Life Science) v celkovém objemu 3,5 μΐ, jak jest popsáno ve Frohman M., PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, supra, str. 2838. PCR amplifikační reakce byla provedena za použití 5μ1 lOx PCR pufru, 5μ1 DMSO, 5μ1 1 Οχ dNTP (15 mM každý), 30 μΐ H₂O, 1 μΐ adapter-primeru (25 pmol, GAC TCG AGT CGA CAT CG), Ιμΐ primeru A a 1 -5μΐ cDNA. Časy cyklu byly takové, jak jest uvedena ve Froman, supra.

5' konec CDPK kódující sekvence byl klonován tak, že byla provedena reverzní transkripce, jak jest popsáno výše, za použití 10 pmol primeru B (AGG GGC TAC GTA GTA AGG ACT) místo d,₇ adapterprimeru. cDNA produkt byl prodloužen pomocí terminální transferázy a dATP, jak jest popsáno ve Frohman, supra, a poté byl amplifikován pomocí PCR, jak jest popsáno výše, s 10 pmol dTj₇ adapter-primeru, pmol adapter-primeru a 10 pmol primeru C (ATT CTC AGG CTT

AAG GTC CCT). PCR byla provedeno za standardních podmínek.

Beck et al., (1994), Arch. Biochem. Biophys. 3 15: 523-525.

Amplifikované 3'a 5' konce byly na tupo klonovány do pBluecriptu SK (Stratagene) a byly spojeny s pCDPK-1 insertem pomocí běžných technik molekulární biologie za vzniku cDNA plné délky tabákové kódující sekvence. DNA sekvence cDNA plné délky byla určena pomocí metody terminace řetězce dideoxynukloetidem, jak jest popsáno v příkladu 1.

Příklad 3

Indukce CDPK-homologní RNA v tabákových suspenzních kulturách DNA insert v pCDPK-1 byl použit jako sonda pro sledování indukce genové exprese v odpovědi na elicitor. Na suspenzní kultury buněk Nicotiana tabacum L. cv. KY14 bylo působeno parasiticeinem po dobu 0, 0,5, 1, 2, 6 a 12 hodin, jak je popsáno v příkladě 1. Byla izolována totální RNA a byla elektroforeticky rozdělena na 1% agarózovém gelu. Insert z pCDPK-1 byl radioaktivně označen pomocí metody náhodných primerů a nechal se hybridizovat s RNA rozdělenou na gelu, jak jest popsáno v Sambrook J. et al., supra. Před působením elicitoru nebyla detekována žádná mRNA, hybridizující s CDPK-l·, zatímco raRNA, která s CDPK-l hybridizovala, byla snadno detekována po působení elicitoru po dobu 0,5, 1 a 2 hodiny. Po 6 a 12 hodinovém působení elicitoru nebyla detekovatelná žádná mRNA hybridizující s CDPK-l, což naznačuje, že po asi 6 hodinách klesla exprese genu CDPK-l na nedetekovatelné úrovně.

···· · · · * • · · · · · ···· · ·· · • · · ··· ··· • · · · • · · · · · · • ·

Příklad 4

Vytvoření chimerního CDPK genu

CDPK gen byl vytvořen z : chemicky syntetizované DNA kódující aminokyseliny 1 až 156 z CDPK genu ze sóji z obrázku 6, chemicky syntetizované DNA kódující aminokyseliny 465 až 508 z CDPK genu ze sóji z obrázku 6 a CDPK insertu z pCDPK-1. Tyto tři DNA byly ligovány pomocí běžných technik molekulární biologie za vzniku chimerní CDPK kódující sekvence, která měla aminokyseliny 1 až 156 z CDPK ze sóji na aminoterminálním konci fúzované ve čtecím rámci s aminokyselinami 1 až 307 z tabákové CDPK (obr. 3), který byl dále fúzován ve čtecím rámci s aminokyselinami 465 až 508 z CDPK ze sóji na karboxyterminálním konci.

Tato chimerní kódující sekvence byla v sense orientaci inserována do agrobakteriálního podvojného vektoru, obsahujícího minimální 35S a EAS4 indukovatelný regulační úsek. Operativní spojení tohoto regulačního úseku, promotoru a kódující sekvence bylo potvrzeno určením DNA sekvence spojovacích úseků a expresí v transgenních rostlinách.

Příklad 5

Příprava transgenních rostlin

Transformované rostlinná buněčná linie byla vytvořena za použití upraveného transformačního protokolu pro Agrobacterium tumefaciens. Byly připraveny konstrukty nukleových kyselin, obsahující CDPK cDNA plné délky z příkladu 3 nebo chimerní CDPK kódující sekvenci z příkladu 4. Rekombinatní konstrukty obsahující tyto sekvence, které měly být zavedeny do rostlin, byly přeneseny do kmenu A. tumefaciens GV3850 triparentálním spojením s E.cóli TB1 (pRK2013). Listy N. tabacum v řadě stádií růstu byly nařezány na ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · • · · · ···· · ·· · • · · · · * ·· ······ ······· · · ' «··· ····· · · · · části o ploše 1 cm² a byly ponořeny do suspenze buněk agrobakteria (asi 10⁴ až 10⁵ buněk na ml). Po 3 až 10 minutách byly části listů omyty ve sterilní vodě za účelem odstranění přebytečných bakteriálních buněk a zredukování problémů s růstem přebytečných bakterií na těchto částech listů. Po krátké době sušení (30 až 60 sekund) byly tyto části listů umístěny na povrch media Plant Tissue Culture Medium bez antibiotik, za účelem podpoření infekce pletiva a přenosu DNA z bakterie do rostlinné tkáně. Plant Tissue Culture Medium obsahuje na 1 litr : 4,31 g směsi Murashige and Skoog Basal Salts Mixture (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), 2,5 g benzylaminopurinu (rozpuštěného v 1 N NaOH), 10 ml 0,1 mg/ml roztoku kyseliny indoloctové, 30 g sacharosy, 2 ml roztoku Gamborg's Vitamin Solution (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) a 8 g agaru. Hodnota pH byla upravena na hodnotu mezi 5,5 a 5,9 pomocí NaOH. Po 2 dnech byly části listů přeneseny na Plant Tissue Culture Medium obsahující 300 pg/ml kanamycinu, 500 pl/ml mefoxinu (Merck, Rahway, NJ). Kanamycin selektuje transformovaná rostlinná pletiva a mefoxinu selektuje proti agrobakteriu.

Jestliže je použit patogenem indukovatelný regulační úsek, tak může být nutné minimalizování vystavení pletiva buňkám agrobakteria během transformace, protože buňky agrobakteria mohou po zavedení do rostlinných buněk sami tento úsek indukovat. Obdobně, balistická technika pro zavedení DNA obsahující sebevražedné geny pod regulační kontrolou indukovatelného transkripčního regulačního úseku je užitečnou alternativní transformační technikou, protože zde není nutné použití buněk agrobakteria či enzymů štěpících buněčnou stěnu hub (jak je tomu při tvorbě protoplastů pro elektroporaci), což by mohlo vést k indukci kódující sekvence pod kontrolou tohoto regulačního úseku.

···· ·· · · · · · · · · • ··· · · · · • »> · · · · · · · · · · • 9 · « · · ·· ······ ······ · · ·

Ζθ <α· «0 ·· ··· ·* ··

Transgenní rostliny byly vytvořeny v podstatě tak, jak jest popsáno v Horsch et al., (1985), Science 227 : 1229-1231.

Příklad 6

Elicitorem a patogenem indukovatelná exprese chimerního CDPK genu v transgenním tabáku

Aktivity CDPK konstruktů z příkladu 7 jsou měřeny v transgenních rostlinách tabáku, na které je působeno buď elicitorem nebo patogenem. Jako kontroly jsou také vytvořeny transgenní rostliny tabáku, které exprimují reportérový gen GUS pod kontrolou promotoru 35S z viru mozaiky květáku (CaMV). Fj semena z regenerovaných transgenních rostlin se nechala klíčit na médiu obsahujícím 100 mg/1 kanamycinu. Výsledné kanamycin rezistentní rostliny byly následně přeneseny na půdu a nechaly se růst ve skleníku. Polovina rostlin byla testována na expresi CDPK genu za indukčních podmínek, např. při intracelulární aplikaci elicitoru nebo celulázy do transgenních rostlin. Elicitor nebo celulázy byly aplikovány mechanickou pipetou. Jako kontrola sloužily zbylé rostliny, na které bylo působeno roztokem postrádajícím celulázu nebo elicitor. Tabáková tkáň byla v některých pokusech poraněna skalpelem za účelem usnadnění vystavení indukční sloučenině.

Příklad 7

Identifikace CDPK homologních sekvencí

Genomová DNA z tabákových listů byla izolována tak, jak je popsáno v Murray a Thopson (1980), Nucleic Acids Research 8 : 4321-4325. Po štěpení alikvót požadovanými restrikčními enzymy, byly vzorky naštěpené DNA elektroforeticky rozděleny na 0,8% agarózovém gelu. DNA rozdělené podle velikosti byly přeneseny na nylonové membrány.

fl · ·· · ·«· ···· • fl · · · · · · · · · · __ ·· ···· ········ ··♦···· ·· ·· · · ·· ··· ·· · ·

DNA bloty byly hybridizovány s CDPK cDNA insertem velikosti 900 bp z příkladu 1, který byl radioaktivně označen pomocí metody náhodných primerů. Hybridizace byla provedena při 60 °C v pufru fosforečnanu sodného při pH 8,0, 0,7% SDS, 1% hovězím sérovém albuminu a lmM EDTA. Blot byl poté dvakrát promyt při 45 °C 2X SSC, 0,1% SDS a dvakrát 0,2X SSC, 0,1% SDS (IX SSC je 0,15 M NaCI, 0,015 M citran sodný pH 7,0). Poměrné hybridizační intensity různých pruhů na membráně byly vypočteny z autoradiogramů za použití videodensitometru (MillGen/Bioreserch, Ann Arbor, MI).

Pro identifikaci polynukleotidů majících homologní sekvenci s tabákovou CDPK a zjištění zřejmého počtu kopií těchto sekvencí na genom byly provedeny Southernovy hybridizační pokusy za použití cílové DNA, izolované z jiných rostlinných druhů, a tabákových CDPK sond. Restrikčními endonukleázami štěpené genomové DNA různých rostlinných druhů byly rozděleny elektroforézou na agarózovém gelu (0,8% agaróze) a poté byly přeneseny na membránu ¹Hybond-N⁺ (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) Radioaktivně značené sondy, obsahující kódující sekvence pCDPK-1 byly hybridizovány se štěpenou genomovou DNA v podstatě tak, jak jest popsáno v Sombrook et al., (1989, supra. Byly použity málo přísné podmínky (hybridizace v 4X SSC, při 65 °C s promytím alespoň v IX SSC při 65 °C).

Alternativou je provedení PCR za použití cílové DNA jako templátu a primerů, odvozených od vysoce konzervovaných úseků pCDPK-1 kódující sekvence.

Příklad 8

Genomová DNA ohraničující CDPK kódující sekvenci cDNA klon popsaný v příkladě 1 byl použit jako hybridizační sonda ·· ···· ·· ···· ·· ·· · · · · · · · · · • * · · · · · · * · · · • » ··· · ·· ♦ »···· __ ·...··· ·· 30 «»·· ·»··. ·»*· pro prohledávání genomové knihovny N. tabacum cv. NK326 ve vektoru XEMBL3 (Clontech, Palo Alto, CA). Klony genomové DNA, které byly sekvenčně shodné s tabákovou CDPK z příkladu 1 ze 70 % nebo více byly identifikovány za použití rutinních subklonovacích postupů. Nukleotidové sekvence těchto klonovaných insertů nukleových kyselin byly zjištěny za použití rutinních metod sekvenování DNA.

Jeden z klonů genomové DNA měl kódující sekvenci plné délky, kterou obsahuje CDPK kódující sekvence z příkladu 1. Tento klon také obsahuje DNA sousedící na 5' s kódující sekvencí z příkladu 1. Testování nukleotidové sekvence této 5' ohraničující DNA v tomto klonu odhalilo údajný ATG kodon, stejně jako jeden nebo více údajných regulačních úseků upstream od tohoto start kodonu a do asi 1000 bp od tohoto start kodonu.

I

Jiná provedení

Rozumí se, že zatímco byl tento vynález popsán ve spojení s jeho detailním popisem, je předcházející popis považován za ilustrativní a neomezuje rozsah tohoto vynálezu, který je definován rozsahem přiložených nároků. Jiné podoby, výhody a modifikace jsou v rozsahu následujících nároků.

Přehled obrázků na výkresech.

Obrázek 1 představuje nukleotidovou sekvenci primeru FokinB a RecalIV.

Obrázek 2 představuje DNA sekvenci (SEK.I. C. : 1) klonu částečné cDNA, izolované ze suspenzní buněčné kultury odvozené od explantátu tabákového kultivaru KY14 po růstu v přítomnosti • · · « 9 9 · · · · 9 9 · • φ · 9 9 9 9 9 · · · ·

9 9 · 9 9 99 999999 οι 9999999 99

99*9 99999 9999 elicitinu parasiticeinu.

Obrázek 3 představuje vyvozenou aminokyselinovou sekvenci z DNA sekvence na obrázku 2 za použití standardního jednopísmenného aminokyselinového kódu.

Obrázek 4 je schématické porovnání aminokyselinová sekvence z obrázku 3 se sekvencí CDPK sóji.

I ·· ···· ·· ···· ·· ·· · · · · » · • · · ····· ·· • · · a » · · · · · · oo ·····* · ♦ «« · · ·· ·· · ··

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) ŽADATEL : University of Kentucky Research Foundation (ii) NÁZEV VYNÁLEZU : IZOLOVANÉ

POLYNUKLEOTIDY, JIMI KÓDOVANÉ PROTEINKINÁZY, JE OBSAHUJÍCÍ KONSTRUKTY A TRANSGENNÍ ROSTLINY A ZPŮSOB JEJICH POUŽITÍ.

(iii) POČET SEKVENCÍ : 11 (iv) ADRESA (SPOJENÍ) (A) ADRESÁT : Fish &Richardson P. C., P. A.

(B) ULICE : 60 South Sixth Street, Suitě 3300 (C) MĚSTO : Minneapolis (D) STÁT : MN (E) ZEMĚ : USA (F) KÓD : 55402 (v) POČÍTAČEM ZPRACOVATELNÁ FORMA (A) MEDIUM : Disketa (B) POČÍTAČ : kompatibilní s IBM (C) OPERAČNÍ SYSTÉM : DOS (D) SOFTWARE : FastSEQ pro Windows verze 2.0 (vi) SOUČASNÁ DATA PŘIHLÁŠKY :

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY :

(B) DATUM VYPLNĚNÍ :

··· ·· · · · · • » · · • · · · · · • » · » · (C) KLASIFIKACE :

(vii) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY :

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY : PCT/US98/14109 (B) DATUM VYPLNĚNÍ : 7.7. 98 (vii) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY :

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY : 08/889 655 (B) DATUM VYPLNĚNÍ : 8.7. 98 (viii) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/AGENTOVI :

(A) JMÉNO: Lundquist Roland C (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO : 37 875 (C) ČÍSLO OSVĚDČENÍ : 07678/020CS1 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE :

(A) TELEFON : 612-335-5050 (B) TELEFAX : 612-288-9696 (C) TELEX :

(2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 1 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 921 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : dva (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : cDNA • · (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 1

AGGGACCTTA

AAAGAGTAAG

GCCACCGACT

GGACATAGTA

GGGAGTCCTT

TGGGAGTGAC

GTATGGAGTG

TTTCATGGCC

GACAGTGAGC

CAAGAGTGAC

CCTTGGCCTA

TGAGCAAGAC

CCTAAGAGGA

AGACGAGAAT

ATAGCCCCTG

ATTCAGTGCC

ATGAATAAGA

TGAGGAGGAG

ATAGTAGGGC

CGTAACCTTC

TTCCATCTTA

TGAGATAAAG

GACCTTATGG

GGAGTTCGTA

ACCGCCGCCA

TGCCTTCAGT

TATCATGACA

AGCCCTTGAG

GAGTTCGGGG

CACCGACAAT

GATGGGCAAA

921

AGCCTGAGAA

TCGGGCTTAG

120

ACTACGTAGC

180

CCGGGGTAAT

240

CTGGGGTAGC

300

CCATAAGTGA

360

GGCTTACCGC

420

ACAAGCCTCT

480

TAAAGAAGAT

540

TTAAGGAGAT

600

AGCAAGGGCT

660

ACGCCGCCGA

720

TGCATCTTAA

780

AGGACGGGAG

840

TACCTGACAC

900

TAGATTATGG

TTTCCTTTTC

TGTATTCTAT

CCCTGAGGTA

ACTTTACACC

CCTTCAAATA

GAGTGCCAAG

CCATGAGGTA

TGGGCCTGCC

GGCCCTTAGG

GTTCAAGATG

TAAGAGGGTA

CGTAGACAAT

TAAGATAAAG

TGGGTATATA

CAGTCTTGAG

G

AGTGCCGACG

AAGCCTGGGC

CTTAGGAAGT

CTTCTTTGTG

CTTCATGGGG

GACCTTATAA

CTTAGGCATC

GTACTTAGTA

GTAATAGCCG

GACACCGACA

GGGAGTCAAC

AGTGGGACCA

AGGGAGGACC

GAGGTAGACG

GACATGATAA

ACTTCATGGT

AAAAGTTCAC

GTTACGGGCC

GGGCCCCTCC

ACCTTGACTT

GGAAGATGCT

CTTGGATAGT

GGCTTAAGCA

AGAGGCTTAG

ATAGTGGGAC

TTGGGGAGAG

TAGACTATGG

ATCTTGTAAG

AGCTTAGGCA

AGGAGGTAGA (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 307 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 2 ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · ♦ · · · • · · * ···· · · · · • · ··· · · · ······ ······· · ·« ·· ·· ··· ·· ··

Arg

Asp

Leu

Lys

Pro Glu

Asn

Phe

Leu

Phe

Ser

Ala

Asp

Phe

Met

1

5

10

15

Val

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Val

Phe

Tyr

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Ile

Val

Gly

Ser

Pro

Tyr

Val

Ala

Pro

35

40

45

Glu

Val

Leu

Arg

Lys

Cys

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Ala

50

55

60

Gly

Val

Ile

Leu

Tyr

Thr

Leu

Cys

Gly

Ala

Pro

Phe

Met

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Glu

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Gin

Ile

Leu

His

Gly

Asp

Leu

Asp

85

90

95

Phe

Lys

Ser

Asp

Pro

Trp

Pro

Thr

Ile

Ser

Glu

Ser

Ala

Lys

Asp

Leu

100

105

110

Ile

Arg

Lys

Met

Leu

Glu

Gin

Asp

Pro

Lys

Arg

Leu

Thr

Ala

His

115

120

125

Glu

Val

Leu

Arg

His

Pro

Trp

Ile

Val

Asp

Glu

Asn

Ile

Ala

Pro

Asp

130

135

140

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

Arg

Leu

Lys

Gin

Phe

Ser

Ala

145

150

155

160

Met

Asn

Lys

Ile

Lys

Met

Ala

Leu

Arg

Val

Ile

Ala

Glu

Arg

Leu

165

170

175

Ser

Glu

Ile

Val

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Met

Asp

Thr

180

185

190

Asp

Asn

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Phe

His

Leu

Lys

Gin

Gly

Leu

Lys

195

200

205

Arg

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Gly

Glu

Ser

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Met

Asp

210

215

220

Ala

Asp

Val

Asp

Asn

Ser

Gly

Thr

Ile

Asp

Tyr

Gly

Glu

Phe

Val

225

230

235

240

Thr

Ala

Met

His

Leu

Asn

Lys

I 1 e

Ly s

Arg

Glu

Asp

His

Leu

Val

245

250

255

Ser

Ala

Phe

Ser

Tyr

His

Zřsp

Lys

A s ρ

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ile

Glu

Val

260

265

270

Asp

Glu

Leu

Arg

Gin

Ala

Leu

Glu

Phe

Gly

Vál

Pro

Asp

Thr

Ser

275

280

285

Leu

Glu

Asp

Meť

Ile

Lys

Glu

Val

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

Gly

Gin

Ile

295

300

290

Asp Tyr Gly 305 ·· ···· ·0 ···· 99 ·· • · · ··· · · · · • · · · 9 99 9 9 9 9 9 99 9999 99 999 999

9 9 9 9 9 9 · · ·♦ ·· ·· ··· ·· *· (2) INFORMACE Ο SEK. I.Č. : 3 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 22 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 3

GGTACTTAGG AAGTGTTACG GG (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 4 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

i (A) DÉLKA : 19 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 4

GTTGACTCCC TACCCTCTT (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 5 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 512 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 5

Met Ala Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ser Thr Thr Thr Asn Val Val

Thr

1

5

10

15

Leu Glu

Lys

Ala

Ala 20

Trp

Val

Leu

Pro

Gin 25

Arg

Thr

Gin

Asn

Ile 30

Arg

Val Thr

Tyr

Glu 35

Val

Gly

Arg

Lys

Leu 40

Gly

Gin

Gly

Gin

Phe 45

Gly

Thr

Phe Ser

Glu 50

Cys

Thr

Arg

Ala 55

Ser

Gly

Lys

Phe 60

Ala

Cys

Lys

Ile Trp 65 80

Pro

Lys

Arg

Lys

Leu 70

Leu

Cys

Lys

Glu

Asp 75

Tyr

Glu

Asp

Val

Arg Val

Glu

Ile

Gin

Ile 85

Met

His

Leu

Ser 90

Glu

His

Ala

Asn

Val 95

Arg Met

Ile

Glu

Gly 100

Thr

Tyr

Glu

Asp

Ser 105

Thr

Ala

Val

His

Leu 110

Val

Glu Gly

Leu

Cys 115

Glu

Gly

Glu

Leu 120

Phe

Asp

Arg

Ile

Val 125

Gin

Lys

His Glu

Tyr 130

Ser

Glu

Arg

Gin

Ala 135

Ala

Arg

Leu

Ile

Lys 140

Thr

Ile

Val

Val Lys 145 160

Val

Glu

Ala

Cys

His 150

Ser

Leu

Gly

Val

Met 1 55

His

Arg

Asp

Leu

Pro Lys

Glu

Asn

Phe

Leu 165

Phe

Asp

Thr

Ile

Asp 170

Glu

Asp

Ala

Lys

Leu 175

Ala Phe

Thr

Asp

Phe 180

Gly

Leu

Ser

Val

Phe 185

Tyr

Lys

Pro

Gl y

Glu 190

Ser

Cys Arg

Asp

Val 195

Val

Gly

Ser

Pro

Tyr 200

Tyr

Val·

Ala

P r o

Glu 205

Val

Leu

Lys Leu

Leu 210

Tyr

Gly

Pro

Glu

Ser 215

Asp

Val

Trp

Ser

Ala 220

Gly

Val

Ile

Tyr Pro 225 240

Ile

Leu

Ser

Gly 230

Val

Pro

Phe

Trp Ala 235

Glu

Ser

Glu

Gly Glu

Ile

Phe

Arg

Gin 245

Ile

Leu

Gly

Lys 250

Leu

Asp

Phe

His

Ser 255

Pro Met

Trp

Pro

Ser

Ile

Ser

Asp

Ser

Ala

Lys

Asp

Leu

Ile

Arg

Lys

99 9 ·· · 9 9 9 · · · · ·· 9 99999 9999

9 999 9 99 999999

999999 9 9 9

Leu Asp Gin Asn Arg 275	Pro Lys	Thr Arg Leu Thr Ala His Glu Val	Leu
280	285
His Pro Trp Ile	Val Asp	Asp Asn Ile Ala	Pro Asp Lys Pro	Leu
Asp
290		295	300
Ser Ala Val Leu	Ser Arg	Leu Lys Gin Phe	Ser Ala Met Asn	Lys
Leu
305	310		315
320
Lys Lys Met Ala	Leu Arg	Val Ile Ala Glu	Arg Leu Ser Glu	Glu
Glu
	325	330		335
Ile Gly Gly Leu	Lys Glu	Leu Phe Lys Met	Ile Asp Thr Asp	Asn
Ser
340		345	350
Gly Thr Ile Thr	Phe Asp	Glu Leu Lys Asp	Gly Leu Lys Asp	Gly
Leu
355		360	365
Lys Arg Val Gly	Ser Glu	Leu Met Glu Ser	Glu Ile Lys Asp	Leu
Met
370		375	380
Asp Ala Ala Asp	Ile Asp	Lys Ser Gly Thr	Ile Asp Tyr Gly	Glu
Phe
385	390		395
400
Ile' Ala Ala Thr	Val His	Leu Asn Lys Leu	Glu Arg Glu Glu	Asn
Leu
	405	410		415
Val Ser Ala Phe	Ser Tyr	Phe Asp Lys Asp	Gly Ser Gly Tyr	Ile
Thr
420		425	430
Leu Asp Glu Ile	Gin Gin	Ala Cys Lys Asp	Phe Gly Leu Asp	Asp
Ile
435		440	445
His Ile Asp Asp	Met Ile	Lys Glu Ile Asp	Gin Asp Asn Asp	Gly
Gin
450		455	460
Ile Asp Tyr Gly	Glu Phe	Ala Ala Met Met	Arg Lys Gly Asn	Gly
Gly
465	470		475
480
Ile Gly Arg Arg	Thr Met	Arg Lys Thr Leu	Asn Leu Arg Asp	Ala
Leu
	485	490		495
Gly Leu Val Asp	Asn Gly	Ser Asn Gin Val	Ile Glu Gly Tyr	Phe
Lys
500		505	510
(2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 6

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ /jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 6

GACAAGGACG GGAGTGGGTA T (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 7 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 35 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 7

GACTCGAGTC GACATCGATT _{ττγτψψψττγ τψψτψ} (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 8 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 17 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 8 GACTCGAGTA GACATCG (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 9

0000 • · 00 0 0 • 0 · · · · · · · ·· · 00 0000 00 000 000 0 0 0 0 0 0 0 00 *« ·· ·· ··· ·· ·· (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 9

AGGGGCTACG TAGTAAGGAC T (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 10 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 21 párů baží (B) TYP : nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ : jeden (D) TOPOLOGIE : lineární

I (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 10

ATTCTCAGGC TTAAGGTCCC T (2) INFORMACE O SEK. I.Č. : 11 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE :

(A) DÉLKA : 308 aminokyselin (B) TYP : aminokyselina (D) TOPOLOGIE : lineární (ii) TYP MOLEKULY : protein (xi) POPIS SEKVENCE : SEK. I. Č. : 11 ·· ··· · • · ··

Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Phe Leu Phe Ser Ala Asp Asp Phe Met

1

5

10

15

Val

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Asp

Phe

Gly

Leu

Ser

Val

Phe

Tyr

Lys

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Ile

Val

Gly

Ser

Pro

Tyr

Val

Ala

Pro

35

40

45

Glu

Val

Leu

Arg

Lys

Cys

Tyr

Gly

Pro

Gly

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Ala

50

55

60

Gly

Val

Ile

Leu

Tyr

Thr

Leu

Cys

Gly

Ala

Pro

Phe

Met

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Glu

Pro

Gly

Val

Ala

Leu

Gin

Ile

Leu

His

Gly

Asp

Leu

Asp

85

90

95

Phe

Lys

Ser

Asp

Pro

Trp

Pro

Thr

Ile

Ser

Glu

Ser

Ala

Lys

Asp

Leu

100

105

110

Ile

Arg

Lys

Met

Leu

Glu

Gin

Asp

Pro

Lys

Arg

Leu

Thr

Ala

His

115

120

125

Glu

Val

Leu

Arg

His

Pro

Trp

Ile

Val

Asp

Glu

Asn

Ile

Ala

Pro

Asp

130

135

140

Lys

Pro

Leu

Gly

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

Arg

Leu

Lys

Gin

Phe

Ser

Ala

145

150

155

160

Met

Asn

Lys

Ile

Lys

Met

Ala

Leu

Arg

Val

Ile

Ala

Glu

Arg

Leu

165

170

175

Ser

Glu

Ile

Val

Gly

Leu

Lys

Glu

Met

Phe

Lys

Met

Ile

Asp

180

185

190

Thr

Asp

Asn

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Phe

His

Leu

Lys

Asp

Gly

Leu

195

200

205

Lys

Arg

Val

Gly

Ser

Gin

Leu

Gly

Glu

Ser

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Met

210

215

220

Asp

Ala

Asp

Val

Asp

Asn

Ser

Gly

Thr

Ile

Asp

Tyr

Gly

Glu

Phe

225

230

235

240

Val

Thr

Ala

A1 a

Met

His

Leu

Asn

Lys

Ile

Lys

Arg

Glu

Asp

His

Leu

245

250

255

Val

Ser

Ala

Phe

Ser

Tyr

His

Asp

Lys

Asp

Gly

Se r

Gly

Tyr

Ile

Glu

260

265

270

Val

Asp

Glu

Ile

Arg

Gin

Ala

Leu

Glu

Phe

Gly

Val

Pro

Asp

Thr

275

280

285

Ser

Leu

Glu

Asp

Met

Ile

Lys

Glu

Val

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

Gly

Gin

290

295

300

Ile

Asp

Tyr

Gly

305 ý>íW-?7 ·· ····

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

a) nukleotidovou sekvenci SEK.I. Č. : 1;

b) RNA analog SEK.I. Č. : 1;

c) polynukleotid obsahující sekvenci nukleové kyseliny, která je komplementární k a) nebo b) nebo ;

d) fragment nukleové kyseliny z a), b) nebo c), který je dlouhý alespoň 20 nukleotidů a který za přísných podmínek hybridizuje s genomovou DNA kódující polypeptid z obrázku 3.
2. Polynukleotid nároku 1, kde nukleotidy 1 až 170 z obrázku 2.
3. Polynukleotid nároku 1, kde nukleotidy 160 až 560 z obrázku 2.
4. Polynukleotid nároku 1, kde nukleotidy 550 až 920 z obrázku 2.

tento polynukleotid obsahuje tento polynukleotid obsahuje 1 tento polynukleotid obsahuje
5. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující polynukleotid nároku 1.
6. Konstrukt nukleové kyseliny nároku 5, který dále obsahuje regulační úsek operativně spojený se zmíněným polynukleotidem.
7. Konstrukt nukleové kyseliny nároku 6, kde je zmíněný regulační úsek indukovatelný regulační úsek.
8. Konstrukt nukleové kyseliny nároku 7, kde je zmíněný regulační • 4 0··0 ·· <···· • 0 « 4 · 4 úsek indukovaný v reakci na rostlinného patogena.

4 · ·

40 999

99 99
9 4 4 9

4 0 0 9

99 9 · 99

9 4

0· 0«

9. Transgenní rostlina, obsahující konstrukt nukleové kyseliny obsahující polynukleotid nároku 1.
10. Rostlina nároku 9, kde zmíněný konstrukt dále obsahuje regulační úsek operativně spojený se zmíněným polynukleotidem.
11. Rostlina nároku 10, kde je zmíněný regulační úsek indukovatelný regulační úsek.
12. Rostlina nároku 11, kde je zmíněný regulační úsek indukovaný v reakci na rostlinného patogena.
13. Rostlina nároku 12, kde je zmíněný regulační úsek indukovaný v reakci na elicitor.
14. Rostlina nároku 9, kde je tato rostlina dvouděložnou rostlinou.
15. Rostlina nároku 14, kde tato rostlina patří do čeledi Solanaceae.
16. Rostlina nároku 15, kde tato rostlina je tabáková rostlina.
17. Rostlina nároku 16, kde tato rostlina je Nicotiana tabacum.
18. Transgenní rostlina, která obsahuje polynukleotid exprimující polypeptid, který má od asi 250 do asi 550 aminokyselin, kde zmíněný polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která je v podstatě identická s aminokyselinovou sekvencí z obrázku 3.

·· ···· ·« ···· • · • ··· ·· ·· • · · -» • · · · • fc*· ··· • · ·· ··
19. Rostlina nároku 18, kde zmíněný polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci z obrázku 3.
20. Rostlina nároku 19, kde je tato rostlina dvouděložnou rostlinou.
21. Rostlina nároku 20, kde tato rostlina patří do čeledi Solanaceae.
22. Způsob použití polynukleotidu, kde tento způsob zahrnuje krok hybridizace polynukleotidu nároku 1 s DNA nebo RNA z nějaké rostliny.
23. Způsob nároku 22, který dále zahrnuje krok indentifikace segmentu zmíněné rostlinné DNA nebo RNA, který se vyznačuje asi 70% nebo vyšší sekvenční shodou se zmíněným polynukleotidem.
24. Způsob nároku 23, který dále zahrnuje krok klonování alespoň části zmíněného DNA nebo RNA segmentu.
25. Způsob nároku 24, kde zmíněná klonovaná část dále obsahuje DNA ohraničující zmíněný segment, který se vyznačuje asi 70% nebo vyšší sekvenční shodou.
26. Způsob změny rezistence k nemocem u rostliny, kde tento způsob