JPH0965881A

JPH0965881A - 傷ストレス誘導性ｍａｐキナーゼおよびその遺伝子

Info

Publication number: JPH0965881A
Application number: JP7220935A
Authority: JP
Inventors: Yuko Ohashi; 祐子大橋; Shigemi Seo; 茂美瀬尾
Original assignee: NORIN SUISANSYO NOGYO SEIBUTSU SHIGEN KENKYUSHO
Current assignee: NORIN SUISANSYO NOGYO SEIBUTSU SHIGEN KENKYUSHO
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1995-08-29
Publication date: 1997-03-11
Anticipated expiration: 2015-08-29
Also published as: JP2945953B2

Abstract

(57)【要約】【課題】傷ストレス誘導性のＭＡＰキナーゼおよび該
ＭＡＰキナーゼをコードするポリヌクレオチドを提供
し、さらには、植物細胞におけるジャスモン酸合成およ
びＰＲタンパク質合成を調節する方法および手段を提供
する。【解決手段】植物における傷ストレス誘導性ＭＡＰキ
ナーゼおよび本ＭＡＰキナーゼをコードするポリヌクレ
オチド、ならびに、本ポリヌクレオチドを導入し、傷ス
トレス誘導性ＭＡＰキナーゼｍＲＮＡを誘導することに
よる、植物のジャスモン酸合成およびＰＲタンパク質合
成を調節する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物における傷ス
トレス誘導性ＭＡＰキナーゼならびに該ＭＡＰキナーゼ
をコードする遺伝子によるジャスモン酸合成および感染
特異的（ＰＲ）タンパク質合成の調節方法に関する。さ
らには、該ＭＡＰキナーゼをコードするヌクレオチド配
列またはその相補配列を有するポリヌクレオチドを導入
した組換え植物の作成に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＴＭＶ等の植物病原ウイルスあるいは植
物病原糸状菌の感染によって、健全植物では検出されな
いタンパク質群が植物において誘導されることが知られ
ている。これらタンパク質は、感染特異的（ＰＲ）タン
パク質と総称されている（VanLoon, L. C.(1985)、Plan
t Mol. Biol.、4:111-116）。例えば、タバコにおいて
は30種類以上のＰＲタンパク質が報告され、最近の研究
から、これらはいずれも何らかの機能を通して植物の病
虫害抵抗性に関与していると考えられている。

【０００３】ＰＲタンパク質は、細胞の外に分泌されて
細胞間隙に堆積し、酸性の等電点を有する酸性ＰＲタン
パク質と、塩基性の等電点を有し、細胞中の液胞に蓄積
される塩基性ＰＲタンパク質とに大別される。また、Ｐ
Ｒタンパク質は、免疫学的に関連する５つのサブグルー
プ(PR-1〜PR-5)に分類されることが報告されている（Bo
l, J. F.ら(1990)、Annu. Rev. Phytopathol.、28:113-
138）。このうち、PR-1について、その生化学的性状が
詳細に調べられている（Matsuoka, M.およびOhashi, Y.
(1984)、J. Gen. Virol.、65:2209-2215）。しかし、PR
-1の生物学的機能は完全には明らかにされていない。PR
-2およびPR-3は、各々、β-1,3-グルカナーゼ活性およ
びキチナーゼ活性を有していることが知られている（Ka
uffmann,S.ら(1985)、EMBO J.、6:3209-3212、Legrand,
M.ら(1987)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84:6750-6
754）。PR-1〜PR-5は、いずれも抗糸状菌活性を有して
いることが認められている（Alexander, D.ら(1993)、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA、90:7327-7331、Knoester,
M.ら(1995)、MPMI、8:177-180）。

【０００４】最近の遺伝子工学の進歩によって、分子生
物学的手法による植物の病虫害防除方法が多数報告され
ている。これらに関するアプローチの一つが、ＰＲタン
パク質が関与する病虫害抵抗性の増強または付与を目的
とした遺伝子組換え植物の作成である。ＰＲタンパク質
群による病虫害抵抗性植物品種を創出するために、感染
−ＰＲタンパク質生産誘導を介在する、ＰＲタンパク質
遺伝子の発現に関するシグナル伝達機構の解明が要望さ
れている。

【０００５】近年、ＰＲタンパク質の誘導には、２つの
異なるシグナル伝達経路が存在していることが明らかと
なった（Malamy, J.およびKlessig, D. F.(1992)、Plan
t J.、2:643-654）。その一方は、サリチル酸合成を介
した、酸性ＰＲタンパク質群を誘導する経路であり、他
方は、傷ストレスに基づく、ジャスモン酸合成を介した
塩基性ＰＲタンパク質群を誘導する経路である（Memeli
nk, J.ら(1990)、Plant Mol. Biol.、14:119-126、Bred
erode, F. T.ら(1991)、Plant Mol. Biol.、17:1117-11
25、Pena-Cortes, H.ら(1991)、Plant Cell、3:963-97
2、およびRyan,C. A.(1990)、Annu. Rev. Plant Physio
l.、28:425-451を参照）。最近、ある種の低分子量GTP
結合タンパク質を常時生産する組換えタバコにおいて、
傷ストレスによってサリチル酸が合成され、酸性ＰＲタ
ンパク質遺伝子が活性化されることが、明らかになった
（Sano, H.ら(1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、9
1:10556-10560）。

【０００６】しかしながら、ＰＲタンパク質群誘導に関
与するシグナル伝達機構の全容は、依然解明されていな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題を
解決するものであり、その目的とするところは、植物に
おいて傷ストレスで誘導されるＭＡＰキナーゼおよび該
キナーゼをコードするヌクレオチド配列またはその相補
配列を有するポリヌクレオチドを提供することであり、
さらには、植物細胞におけるジャスモン酸合成またはサ
リチル酸合成およびこれらのシグナル物質を介したＰＲ
タンパク質合成を調節する方法および手段を提供するこ
とである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、植物における
傷ストレス誘導性のＭＡＰキナーゼ（以下、本発明のＭ
ＡＰキナーゼという）を提供するものである。さらに詳
しくは、本発明のＭＡＰキナーゼは、アミノ酸一文字表
記によって表される、Ｔ-Ｅ-Ｙ配列におけるスレオニン
残基およびチロシン残基のリン酸化によって活性化され
るＭＡＰキナーゼであって、配列番号５によって示され
るアミノ酸配列の第１位から第２１位のアミノ酸配列を
有するＭＡＰキナーゼである。この領域は、ＭＡＰキナ
ーゼの活性化に必要なリン酸化部位（上記Ｔ-Ｅ-Ｙ配
列）を含む領域である。本発明のＭＡＰキナーゼの好ま
しい一態様は、配列番号２または配列番号４によって示
される全アミノ酸配列を有するものである。

【０００９】さらに本発明は、本発明のＭＡＰキナーゼ
をコードするヌクレオチド配列またはその相補配列を有
するポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチ
ドという）を提供する。本発明のポリヌクレオチドの好
ましい一態様は、上記ＭＡＰキナーゼをコードするヌク
レオチド配列が、配列番号１によって示されるヌクレオ
チド配列の第１１４位から第１２３８位のものである。

【００１０】さらにまた、本発明は、植物細胞における
ジャスモン酸合成を調節する方法ならびに感染特異的タ
ンパク質合成を調節する方法であって、本発明のポリヌ
クレオチドを植物細胞に導入する工程、および、該導入
されたポリヌクレオチドからＭＡＰキナーゼｍＲＮＡま
たはそのアンチセンスＲＮＡを誘導する工程、を包含す
る方法を提供する（以下、本発明の調節方法という）。
この方法によれば、塩基性または酸性のいずれのＰＲタ
ンパク質の合成も調節し得る。さらにまた、本発明は、
本発明のポリヌクレオチドを導入した組換え植物細胞お
よび植物体を提供する。本発明の実施に好ましい植物細
胞は、組織培養法および細胞またはカルスからの再分化
技術が確立している高等植物の細胞である。

【００１１】本明細書において「ＭＡＰキナーゼ」(mit
ogen-activated protein kinase)とは、およそ40〜50kD
の分子量を有し、基質中のＰＸＸＳ／ＴＰ、ＰＸＳ／Ｔ
Ｐ（アミノ酸一文字記号によって示す）等のコンセンサ
ス配列をリン酸化するセリン／スレオニンキナーゼをい
う（後藤および西田(1995)、実験医学、13(6):667-67
2）。

【００１２】本明細書において「ポリヌクレオチド」と
は、ヌクレオチドの重合体を意味するものであって、特
定の鎖長に限定されない。さらに本明細書において「Ｍ
ＡＰキナーゼ遺伝子」とは、本発明のＭＡＰキナーゼの
全アミノ酸配列または部分的に１つまたは複数のアミノ
酸残基の欠失したアミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドであって、適切な宿主
細胞内で該ヌクレオチド配列からｍＲＮＡが転写され得
るように構築されたポリヌクレオチドをいう。さらに本
明細書において「ＭＡＰキナーゼ遺伝子のアンチセンス
遺伝子」とは、上記ｍＲＮＡと相補的な配列を有するＲ
ＮＡが転写され得るように構築されたポリヌクレオチド
をいう。本発明の調節方法の実施に好適なＭＡＰキナー
ゼ遺伝子は、配列番号２または４によって示されるタバ
コ由来ＭＡＰキナーゼのアミノ酸配列と少なくとも４０
％、好ましくは５０％、より好ましくは７０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドである。配列番号２によっ
て示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、もっと
も好ましい。本発明の実施に使用されるＭＡＰキナーゼ
遺伝子は、イントロンを含み得る。

【００１３】本明細書において「感染特異的（ＰＲ）タ
ンパク質」とは、病原体感染によって生じる壊死病班形
成に伴って誘導され得るタンパク質の総称であって、あ
る特定のタンパク質に限定されない。従って、感染特異
的に誘導され得る、種々の酵素（キチナーゼ、β-1,3-
グルカナーゼ、ペルオキシダーゼ等）、プロテアーゼイ
ンヒビター等は、いずれも本明細書におけるＰＲタンパ
ク質の定義に包含される。本明細書における「植物体」
は、完全な植物個体に限定されるものではなく、カルス
を含めた植物組織培養物、分離された植物組織、種子、
花粉、等を包含する。

【００１４】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１５】本発明者は、高等植物から新たに単離した
リン酸化酵素の１種であるＭＡＰキナーゼが、ＰＲタン
パク質誘導におけるシグナル伝達経路に介在する物質で
あること、および該ＭＡＰキナーゼおよびその遺伝子が
植物細胞におけるジャスモン酸の生合成を調節する物質
であることを解明し、本発明を完成するに至った。

【００１６】ＭＡＰキナーゼは、細胞内シグナル伝達機
構において重要な役割を担うセリン／スレオニンキナー
ゼであり、種々の細胞分画物中に存在していることが知
られている（Davis, R. J.(1993)、J. Biol. Chem.、26
8:14553）。本発明者は、このようなＭＡＰキナーゼの
ホモログが、傷ストレスに応じて誘導されてくることを
見出した。

【００１７】本発明者は、機械的な傷を受けた植物体で
は発現するが、健常植物体では通常発現しない遺伝子由
来の２つのｃＤＮＡクローン「ＤＳ２２」および「ＤＳ
１８」を単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、
それらがコードするアミノ酸配列を決定した。ＤＳ２２
およびＤＳ１８の有するヌクレオチド配列を、各々、配
列番号１および３に示す。また、ＤＳ２２およびＤＳ１
８がコードするアミノ酸配列を、各々、配列番号２およ
び４に示す。表１は、この両者のアミノ酸配列の比較を
示したものである。各アミノ酸残基は一文字表記で表し
ている。アミノ酸配列上の比較から、ＤＳ２２とＤＳ１
８とは、Ｃ末端部分が高度に保存された、起源が等しい
同族のタンパク質であることが明らかとなった。

【００１８】

【表１】

【００１９】次いで、本発明者は、これらがコードする
アミノ酸配列と他の公知のポリペプチドのアミノ酸配列
との相同性の解析等によって、ＤＳ２２およびＤＳ１８
にコードされるタンパク質がＭＡＰキナーゼホモログで
あり、植物の傷ストレスに応答して迅速に誘導されるタ
ンパク質であることを見出した。本発明の特に好ましい
傷ストレス誘導性ＭＡＰキナーゼは、ＤＳ２２にコード
されるものであり、特にＷＩＰＫ(wound-induced prote
in kinase)と命名した（配列番号２）。表２は、本発明
のＭＡＰキナーゼ（ＷＩＰＫ）と他の生物種から単離さ
れた３種のＭＡＰキナーゼ（MsERK1、ATMPK1、ERK1）と
の間のアミノ酸配列比較表である。各アミノ酸残基は一
文字表記で表している。ＷＩＰＫと、ＭｓＥＲＫ１（ア
ルファルファ）、ＡＴＭＰＫ１（シロイヌナズナ）、お
よびＥＲＫ１（ラット）との間のアミノ酸配列相同性
は、各々、７１％、５４％、および４６％である。

【００２０】

【表２】

【００２１】これらのＭＡＰキナーゼ間のアミノ酸配列
上の相同性は、特に１１箇所のキナーゼコンセンサスド
メインにおいて顕著であり、さらにまた、上記のいずれ
のＭＡＰキナーゼも、ＭＡＰキナーゼの活性化に必要な
リン酸化部位Ｔ−Ｅ−Ｙ配列（ＷＩＰＫの201〜203位）
を保存している。このことは、本発明のＭＡＰキナーゼ
が、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーであることを
支持するものである。本明細書に記載の配列番号５は、
本発明のＭＡＰキナーゼが有する、活性化に必要なリン
酸化部位（Ｔ−Ｅ−Ｙ配列）を含む領域であって、配列
番号２によって示されるＷＩＰＫのアミノ酸配列の１９
３位〜２１３位に相当する。

【００２２】本発明のＭＡＰキナーゼは、植物が傷スト
レスを受けた後、きわめて短時間に誘導され得る酵素で
ある。図１に、タバコ葉表面に機械的に傷を付けた後に
誘導されるＷＩＰＫｍＲＮＡを、傷処理後、０、１、
３、１０、３０分(min)、１、３、６、１８、２４、お
よび４８時間(hr)後に測定したノーザンアッセイの結果
を示す。プローブは、³²Ｐで標識したＷＩＰＫｃＤＮＡ
である（後述の実施例１参照）。図１が示すように、本
発明のＭＡＰキナーゼは、傷処理のわずか１分後にはす
でに、傷を受けた葉（図１中段）および傷害葉に隣接し
た葉（同下段）においてＷＩＰＫｍＲＮＡの誘導が認め
られる。他方、対照とした健常植物から採取した葉（同
上段）では、ＷＩＰＫｍＲＮＡの誘導は認められない。

【００２３】本発明者は、上記実験結果から、ＷＩＰＫ
が植物の傷シグナル伝達経路の初期段階において機能す
るシグナル伝達物質であることを想到し、ＷＩＰＫをコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを
導入したトランスジェニックタバコを作成し、種々の研
究を行った。そして、 .傷ストレスによって誘導され得るＭＡＰキナーゼ
は、ジャスモン酸の合成を制御するシグナル物質である
こと； .該ＭＡＰキナーゼは、ジャスモン酸の合成を誘導
し、合成されたジャスモン酸を介して、プロテアーゼイ
ンヒビター等の塩基性ＰＲタンパク質の合成が誘導され
得ること；そして .該ＭＡＰキナーゼまたは該ＭＡＰキナーゼｍＲＮＡ
の過剰な産生は、とは逆に、内在性の遺伝子の発現を
抑制すること(co-suppression)によってジャスモン酸合
成に関して抑制的に作用し、その結果、傷ストレスによ
っては、通常働かないサリチル酸合成系が作動し、サリ
チル酸を介した酸性ＰＲタンパク質の合成が誘導され、
かつ、塩基性ＰＲタンパク質の合成が阻害され得るこ
と；を明らかとし、本発明を完成させた。

【００２４】本発明によれば、植物細胞に導入したＭＡ
Ｐキナーゼ遺伝子を発現させることによって、ジャスモ
ン酸合成を誘導し、それを介した塩基性ＰＲタンパク質
の合成を誘導することができる。他方、植物細胞に導入
したＭＡＰキナーゼ遺伝子を高発現させること、すなわ
ち、過剰量のＭＡＰキナーゼｍＲＮＡを産生させること
によって、ジャスモン酸合成を抑制し、その結果、傷等
のストレスからサリチル酸合成を介した酸性ＰＲタンパ
ク質の合成を誘導することができる。

【００２５】従って、本発明の実施により、例えば、傷
ストレスにより速やかにサリチル酸合成を介した酸性Ｐ
Ｒタンパク質の合成を誘導し得るウイルス抵抗性植物品
種、あるいはプロテアーゼインヒビター等の塩基性ＰＲ
タンパク質の合成を常時誘導し得る耐虫性植物品種を作
成し得る。さらにまた、傷害によっても塩基性プロテア
ーゼインヒビターを全く産生しない、身体にやさしい病
人食に適した食用作物品種を作成し得る。

【００２６】他方、動物においては、ＭＡＰキナーゼ
が、細胞質ホスホリパーゼＡ₂（cPLA₂）のSer-505をリ
ン酸化し、活性化したcPLA₂がリン脂質からアラキドン
酸を遊離させることによって炎症を引き起こす、シグナ
ル物質であることが知られている（Lin, L.ら(1993)、C
ell、72:269-278）。従って、本発明のＭＡＰキナーゼ
およびそれをコードするポリヌクレオチドは、ヒトを含
む動物における抗炎症薬等の治療薬および診断薬の開発
に利用され得る。

【００２７】本発明の調節方法において、ＭＡＰキナー
ゼ遺伝子またはそのアンチセンス遺伝子を発現させるた
めに使用されるプロモーター、エンハンサー等からなる
調節領域の選択に応じて、これら遺伝子からのＭＡＰキ
ナーゼｍＲＮＡまたはそのアンチセンスＲＮＡの転写が
調節され得ることは、当該分野の周知事項である。従っ
て、いわゆる当業者であれば、プロモーター、エンハン
サー等の調節遺伝子を適宜選択して本発明を実施するこ
とによって、ジャスモン酸合成量ならびに塩基性ＰＲタ
ンパク質および／または酸性ＰＲタンパク質の合成量を
調節し得る。

【００２８】

【発明の実施の形態】本発明は、以下のように実施され
得る。本発明の実施は、特に記載がない限り、分子生物
学、生化学、遺伝学、遺伝子工学、植物育種学、および
植物病理昆虫学等の分野の従来技法を用いて実施し得
る。

【００２９】（１）傷ストレス誘導性ＭＡＰキナーゼの
ｃＤＮＡクローンの単離傷つけるかもしくはタバコモザイクウイルスを接種した
タバコ葉から、ディファレンシャルスクリーニング法ま
たはサブトラクション法により、傷ストレス応答性のｃ
ＤＮＡクローンを単離する。あるいは、傷ストレスを与
えた植物体から調製したｃＤＮＡライブラリーから上記
ＤＳ１８またはＤＳ２２にコードされるｃＤＮＡ断片の
一部をプローブとして、傷ストレス誘導性ＭＡＰキナー
ゼのｃＤＮＡクローンを単離する。

【００３０】（２）ＭＡＰキナーゼの配列決定上記（１）で得られた陽性ｃＤＮＡクローンよりｃＤＮ
Ａフラグメントを取得する。次いで、当該分野で公知の
ヌクレオチド配列解析法（Sangerらのジデオキシ法等）
または市販されている自動シーケンサー（例えば、Phar
macia製A.L.F.DNA SeakuencerII）により、各ｃＤＮＡ
のヌクレオチド配列を決定する。

【００３１】（３）ポリヌクレオチドの作製本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法
により、上記単離されたｃＤＮＡ断片の全長すなわち本
発明のＭＡＰキナーゼをコードする全ヌクレオチド配列
またはその一部が欠失したヌクレオチド配列を含有する
ように構築され得る。本明細書の配列番号１に示される
ヌクレオチド配列のみからなるポリヌクレオチドを上記
ｃＤＮＡクローンＤＳ２２から切り出して使用してもよ
い。さらに上記ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＰＣＲ（ポ
リメラーゼ連鎖反応）（Saikiら(1988)、Science、230:
1350-1354）を実施し、増幅された領域のヌクレオチド
配列を使用することも容易である。本明細書に開示され
るヌクレオチド配列を基に、公知のＤＮＡ合成法（例え
ば、ホスホアミダイト法）により化学的に合成されたＤ
ＮＡ断片もまた、本発明のポリヌクレオチドとして好適
に用いられ得る。

【００３２】得られた本発明のポリヌクレオチドはその
ままもしくは適切なリンカーを連結させて以下に示す組
換えベクターの構築に利用される。

【００３３】（４）組換えベクターの構築本発明のＭＡＰキナーゼのアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドと、該アミノ
酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレ
メント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネ
ーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシ
スエレメントを包含する）とからなる外来タンパク質発
現用遺伝子構築物を有する組換えベクターの構築におい
ては、当該分野でよく理解されている種々の制限酵素に
よるポリヌクレオチド切断技法（restriction）および
ポリヌクレオチド断片連結技法（ligation）が用いられ
る。ベクターおよびその構築に使用される調節エレメン
トの種類は、宿主細胞のタイプに依存している。植物細
胞を宿主とした場合の上記ベクターの構築例を以下に説
明する。

【００３４】プロモーターとして、カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ノパリ
ン合成酵素（ＮＯＳ）プロモーター等が一般的に使用さ
れ得るがこれらに限定されない。本発明の実施におい
て、ジャスモン酸合成の誘導を促進する場合、および塩
基性ＰＲタンパク質を誘導する場合は、常時作動するプ
ロモーターの使用が好ましい。他方、ジャスモン酸合成
の誘導を抑制する場合、および傷ストレスにより酸性Ｐ
Ｒタンパク質を誘導する場合は、高発現プロモーターの
使用が好ましい。好ましい高発現プロモーターとして、
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプ
ロモーター、ノパリン合成プロモーター等が一般的に使
用されているがこれらに限定されない。部位特異的プロ
モーターの使用により、本発明の誘導方法を、植物体の
部位（組織）特異的に実施することができる。本発明の
実施に用いられ得るターミネーターは、特に限定されな
い。ＣａＭＶ３５ＳあるいはＮＯＳのターミネーター領
域が好適に使用され得る。

【００３５】ＭＡＰキナーゼ遺伝子は、本発明のポリヌ
クレオチドそれ単独で、あるいは本発明のＭＡＰキナー
ゼとの融合タンパク質を作製するのに好適な他のタンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレ
オチドと連結して、上記各調節エレメントと宿主細胞内
で作動可能なように連結して作製され得る。ＭＡＰキナ
ーゼのアンチセンス遺伝子は、本発明のＭＡＰキナーゼ
をコードするヌクレオチド配列の相補配列を有する本発
明のポリヌクレオチドそれ単独で、上記各調節エレメン
トと宿主細胞内で作動可能なように連結して作製され得
る。生産されたアンチセンスＲＮＡにより、センス鎖か
らなるｍＲＮＡの翻訳が阻害され得ることは、当業者の
周知事項である。

【００３６】上記組換えベクターは、上記遺伝子構築物
に加え、さらに選択可能なマーカー遺伝子を含有し得
る。選択可能なマーカー遺伝子は、本発明のポリヌクレ
オチドを導入された宿主細胞を選択するために使用され
る。一般に使用され得る選択可能なマーカー遺伝子は、
カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼII（ＮＴＰII）であるが、これに限定され
ない。

【００３７】作製された上記遺伝子構築物をアグロバク
テリウム属細菌を介して植物に導入し得るプラスミド
（例えばｐＢＩ系プラスミド(Clontech製)）あるいはｐ
ＵＣ系プラスミドに導入することによって本発明の組換
えベクターが構築され得る。

【００３８】（５）宿主細胞の形質転換使用する宿主細胞に依存して、その細胞に適する標準的
技法を用いて、上記ベクターによる宿主細胞の形質転換
を行い得る。

【００３９】原核生物細胞の場合、Cohen, S. N.ら(197
2)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、69、2110頁）により
報告された塩化カルシウム処理法が用いられ得る。電気
穿孔法（エレクトロポレーション）は、原核生物細胞の
他、植物細胞および動物細胞のいずれにも適用できる。

【００４０】ある種の高等植物細胞においては、アグロ
バクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tum
efaciens）を介する方法（Shaw, C. H.ら(1983)、Gen
e、23:315）が広く用いられ得る。この方法は、まず構
築したベクター（ｐＢＩ系プラスミド等）を、エレクト
ロポレーション等によってアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンスに導入し、次いで形質転換された該細菌
を、リーフディスク法（Horsch, R. B.ら(1985)、Scien
ce、227:1229-1231）等の周知の手法により、宿主植物
細胞に導入する。

【００４１】（６）再分化した形質転換植物体における
ジャスモン酸合成の調節上記形質転換された植物細胞を、植物種に対応した公知
の再分化法（例えば、タバコの場合、Horsch, R. B.ら
(1985)、Science、227:1229-1231）により再分化させ、
確立した形質転換植物体において、本発明のＭＡＰキナ
ーゼ遺伝子あるいはそのアンチセンス遺伝子を発現させ
ることによって、ジャスモン酸合成を調節する。

【００４２】以下の実施例において、本発明をさらに詳
細に説明するが、これらはなんら本発明を限定するもの
ではない。

【００４３】

【実施例】実施例１（タバコ葉からの傷ストレス誘導性ＭＡＰキナーゼｃＤ
ＮＡの単離）発芽後50日目のタバコ（Nicotiana tabacu
m cv.Samsun NN）の成熟葉に10mMリン酸バッファー(pH
7.0)に懸濁したタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）（10
μg/ml）を接種し、30℃で48時間インキュベートした。
次いで、20℃で、適当な時間、インキュベートした。20
℃で３時間放置後、上記ＴＭＶ接種成熟葉を採取し、全
ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡから、常法に基づ
いて、ポリＡ付加ＲＮＡを調製した（Ausubel, F. M.ら
の「Current Protocols in Molecular Biology」(John W
iley & Sons, Inc., NY, 1987）を参照）。ファルマシ
ア社製ｃＤＮＡ合成キットを用いて、上記ポリＡ付加Ｒ
ＮＡから合成したｃＤＮＡを、ラムダZAP IIベクター
（Stratagene製）のEcoRIサイトに挿入した。次いで、
得られたベクターを常法により、大腸菌に導入した。得
られたおよそ10⁷個のクローンのうち、10⁵クローンをデ
ィファレンシャルスクリーニングに供した。

【００４４】上記と同様にＴＭＶを接種して51時間経過
後および99時間経過後のタバコ葉を採取し、単離した各
ポリＡ付加ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡプローブを以下の
通りに作成した。１μgの上記ポリＡ付加ＲＮＡ、50mM
のトリス塩酸バッファー（pH8.3）、75mMのKCl、３mMの
MgCl₂、20mMのジチオスレイトール、1.5mMのdNTP's溶液
（ただし、dCTPは、４μMである）、オリゴｄｔ
_12-18（0.1mg/ml）、200μCiの[α-³²P]dCTP、および20
0ユニットのトリ骨髄芽球症ウイルス(avian myeloblast
osis virus)逆転写酵素（Gibco-BRL製）を含む、ラベリ
ング反応混合物30μlを37℃で１時間インキュベートし
た。組み込まれなかったヌクレオチドは、セファデック
スG-50（Pharmacia製）によって分離除去した。得られ
た標識プローブは、51時間経過後のＴＭＶ感染葉由来の
ものはプラスプローブ、99時間経過後のＴＭＶ感染葉由
来のものはマイナスプローブとして、以下のハイブリダ
イゼーションに用いた。

【００４５】５×10³個の上記クローンを含むプレート
を全部で２０枚作成し、各々から一組のナイロンメンブ
レン(Hybond-N、Amersham製）レプリカを作成した。そ
の一方を、上記プラスプローブでハイブリダイズし、他
方は上記マイナスプローブでハイブリダイズした。ハイ
ブリダイゼーションは、６×SSC、0.1％SDS、0.1％Fico
ll、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブ
ミン、および100μg/mlサケ精子ＤＮＡからなる反応溶
液中、65℃で16時間行った。反応終了後、メンブレン
は、２×SSC、0.1％SDS中で１回(25℃）、続いて0.1×S
SC、0.1％SDS中で３回(65℃）洗浄した。洗浄後、メン
ブレンを感光増強スクリーンを伴うXARフィルム（Kodak
製）に、-80℃で48時間曝した。得られたオートラジオ
グラムから、上記プラスプローブとのみハイブリダイズ
したｃＤＮＡクローンＤＳ２２およびＤＳ１８を単離し
た。

【００４６】実施例２（ｃＤＮＡクローンの配列決定およびアミノ酸配列の解
析）上記ｃＤＮＡクローンＤＳ２２およびＤＳ１８を、
ベクターpBluescriptIISK-（Stratagene製）にサブクロ
ーンした。得られたサブクローンについて、エキソヌク
レアーゼIIIを用いた通常のデリーション操作（Henikof
f, S.(1984)、Gene、28:351）を施し、ＤＳ２２および
ＤＳ１８由来の一連の欠失ｃＤＮＡ断片を作製した。得
られた一連の欠失ｃＤＮＡ断片を用いて、市販のＤＮＡ
シーケンサー(Applied Biosystems モテ゛ル373A）を製造者
の提供した使用説明書に準じて使用して、ＤＳ２２およ
びＤＳ１８にコードされるｃＤＮＡのヌクレオチド配列
を決定した。配列番号１に示す通り、ＤＳ２２は、３７
５アミノ酸残基からなる本発明のＭＡＰキナーゼＷＩＰ
Ｋ（配列番号２）をコードする領域を含む、１７２５塩
基対からなり、他方、配列番号３に示す通り、ＤＳ１８
は、４２３アミノ酸残基からなる本発明のＭＡＰキナー
ゼ（配列番号４）をコードする領域を含む、１７８６塩
基対からなることが明らかとなった。

【００４７】実施例３（ＷＩＰＫをコードするポリヌクレオチドを含む組換え
プラスミドの構築）上記ベクターにクローニングしたＤ
Ｓ２２をAseI（108位）およびAvaII（1324位）で切断し
た。得られたＷＩＰＫをコードするｃＤＮＡ断片をKlen
owフラグメントを用いて修復し、プラスミドpUC18のSma
Iサイトに挿入した。得られた組換えプラスミドは、大
腸菌に導入して増やした。この組換えプラスミドをBamH
I（5'末端）およびSacI（3'末端）で切断し、ＷＩＰＫ
をコードするｃＤＮＡ断片（5'末端に13bpおよび3'末端
に82bpの非翻訳領域を含む）を回収し、バイナリーベク
タープラスミドpBI121（Clontech製）のBamHIおよびSac
Iサイトに挿入した。得られたpBI121由来組み換えプラ
スミドを図２に示す。構築されたＭＡＰキナーゼ（ＷＩ
ＰＫ）遺伝子は、図２から明らかなように、カリフラワ
ーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター
領域(P35S;0.9kb)、本発明のＷＩＰＫをコードするポリ
ヌクレオチド(WIPK;1.2kb)、およびノパリン合成酵素の
ターミネーター領域(Tnos;0.3kb)から構成されている。
図２中のPnosは、ノパリン合成酵素のプロモーター領
域、ＮＰＴIIは、ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼII遺伝子を示す。

【００４８】実施例４（ＭＡＰキナーゼ遺伝子のタバコ細胞への導入）（１）アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンスの形質転換アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンス LBA4404株（Clontechより購入）
を250μg/mlのストレプトマイシンと50μg/mlのリファ
ンピシンを含むＬ培地中、28℃で培養した。Nagelら(19
90)（Microbiol. Lett.、67:325）の方法に従って、細
胞懸濁液を調製し、実施例３で構築したプラスミドベク
ターをエレクトロポレーションにより、上記菌株に導入
した。

【００４９】（２）ＷＩＰＫをコードするポリヌクレオ
チドのタバコ細胞への導入上記（１）で得られた形質転換アク゛ロハ゛クテリウム・チュメファシエンスL
BA4404株をＹＥＢ培地（DNA cloning第２巻、78頁）で
振とう培養（28℃、200rpm）した後、滅菌水で20倍に希
釈し、タバコ（Nicotiana Tabacum Sammsun NN）の葉片
を共存培養した。２〜３日後、抗生物質を含む培地で上
記細菌を除去し、２週間ごとに選択培地で継代し、上記
ＭＡＰキナーゼ遺伝子と共に導入されたpBI121由来のＮ
ＰＴII遺伝子発現によるカナマイシン抵抗性の有無で形
質転換したタバコ細胞を選抜し、常法によりカルスを誘
導し、植物体に再分化した。以下の実施例はいずれも、
再分化して得られたＷＩＰＫ遺伝子導入タバコのＲ１世
代のものを使用した。

【００５０】実施例５（ＷＩＰＫ遺伝子導入植物におけるＷＩＰＫ遺伝子の発
現）上記実施例４で得られたＷＩＰＫ遺伝子導入タバコ
においては、ＷＩＰＫをコードする本発明のポリヌクレ
オチドは、高発現プロモーターであるＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの制御下にあるため、常時、ＷＩＰＫｍＲＮ
Ａが大量に誘導（転写）される組換えタバコである。

【００５１】（１）ノーザン解析上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび対照として野生型
非組換えタバコを用いて、傷処理後のＷＩＰＫの誘導を
ｍＲＮＡレベルで調べた。

【００５２】発芽後５０日目のＷＩＰＫ遺伝子導入タバ
コ（TMP1S-13系統）および非組換えタバコ（Nicotiana
Tabacum Sammsun NN）の完全に展開した上位の葉の表面
を、15秒間、湿潤状態のカーボランダムで穏やかにこす
って傷を付けた。傷を付けた葉を、時間の経過（傷処理
後０分、10分、１、３、６、24時間）と共に逐次採取
し、全ＲＮＡを抽出した。ノーザン解析は、以下の通り
に実施した。

【００５３】１スロット当たり20μgの全ＲＮＡを、変
性アガロースゲル電気泳動によって展開し、常法に従っ
て、Hybond-N（Amersham製）メンブレンにブロッティン
グした。通常のランダムプライム法（Sambrookら(1989)
「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spr
ing Harbor Laboratory刊）」）により、[α-³²P]dCTP
で標識したＷＩＰＫｃＤＮＡをプローブとして用いてハ
イブリダイゼーション反応を行った（上記実施例１参
照）。反応終了後のメンブレンを、２×SSC、0.1％SDS
中で１回(15分、25℃）、続いて0.1×SSC、0.1％SDS中
で３回(20分、65℃）洗浄した。洗浄後、上記メンブレ
ンを感光増強スクリーンを伴うXARフィルム（Kodak製）
に、-80℃で48時間曝した。得られたオートラジオグラ
ムを図３に示す。非組換えタバコ(Wild-type plant)で
は、傷処理10分後にはすでに、約1.8kbの内在性ＭＡＰ
キナーゼｍＲＮＡが誘導（転写）された。他方、ＷＩＰ
Ｋ遺伝子導入タバコ(Transgenic plant)では、導入され
たＷＩＰＫ遺伝子の高発現により、導入された約1.5kb
のＷＩＰＫｍＲＮＡが常時誘導され、大量に蓄積されて
いる。逆に内在性ＭＡＰキナーゼのｍＲＮＡは、全く蓄
積されていない。

【００５４】（２）ＭＢＰリン酸化アッセイ上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび対照として野生型
非組換えタバコを用いて、傷処理後に誘導されるＭＡＰ
キナーゼ量をＭＡＰキナーゼ酵素活性を利用するミエリ
ン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）リン酸化アッセイによっ
て測定した。

【００５５】発芽後５０日目のＷＩＰＫ遺伝子導入タバ
コ（TMP1S-13系統）および非組換え野生型タバコ（Nico
tiana Tabacum Sammsun NN）の完全に展開した上位の葉
の表面を、15秒間、湿潤状態のカーボランダムで穏やか
にこすって傷を付けた。傷を付けた葉を、時間の経過
（傷処理後０分、１、３、10、30分、１、３、６、24時
間）と共に逐次採取した。採取した組織を１mlの抽出バ
ッファー（20mMのHepes-KOH(pH7.6)、２mMのCaCl₂、100
mMのKCl、１mMの酢酸マグネシウム、1mMのジチオスレイ
トール、１mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド(P
MSF)、および20mMのβ-グリセロホスフェートを含む）
と共に、スクラッパーで細かく磨砕した。このホモジネ
ートを、20,000gで30分間（４℃）遠心分離し、次い
で、100,000gで4.5時間（４℃）遠心分離した。その上
清を、粗タンパク質抽出液として迅速に使用した。この
抽出液の一部（50μgタンパク質相当）を、ＭＢＰキナ
ーゼリン酸化アッセイに供した（Mizoguchi, T.ら(199
4)、Plant J.、5:111参照）。ＭＢＰリン酸アッセイ
は、基質となるＭＢＰを分離ゲルに固め込んだゲルを用
いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動された変性タン
パク質を再生し、ゲル内の基質に対してリン酸化反応を
行わせる。ＭＢＰを基質とするキナーゼが活性化されて
いる場合は、上記ゲル中に存在するＭＢＰキナーゼ部分
が³²Pで標識されるので、その存在量をオートラジオグ
ラムで見積もることができる。

【００５６】上記アッセイの結果を図４に示す。ＷＩＰ
Ｋ遺伝子導入タバコ(Transgenic plant)は、上記（１）
で示したように、ＷＩＰＫｍＲＮＡを大量に蓄積してい
るにもかかわらず、ＷＩＰＫタンパク質は僅かしか合成
されていない。この結果は、過剰量のＷＩＰＫｍＲＮＡ
が誘導されることによって、かえってＷＩＰＫｍＲＮＡ
の翻訳を抑制し得ることを示すものである。このことは
また、対照の非組換え野生型タバコ(Wild-type plant)
においても、内在性ｍＲＮＡが多量に蓄積していること
が認められる傷処理１時間後（図３参照）において、内
在性ＭＡＰキナーゼがほとんど存在しないことからも明
らかである（図４上段参照）。

【００５７】実施例６（ＷＩＰＫ遺伝子導入植物におけるジャスモン酸合成お
よびサリチル酸合成の調節）上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タ
バコおよび対照として野生型タバコを用いて、傷処理後
のジャスモン酸およびサリチル酸の合成の推移を調べ
た。

【００５８】ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび非組換え
野生型タバコ（Nicotiana TabacumSammsun NN）の完全
に展開した上位の葉の表面を、15秒間、湿潤状態のカー
ボランダムで穏やかにこすって傷を付けた。傷を付けた
葉を、時間の経過（傷処理後、０、３、６、12、24、48
時間）と共に逐次採取し、ジャスモン酸（ＪＡ）、ジャ
スモン酸メチルエステル（ＭｅＪＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、およびサリチル酸β−グルコシド（ＳＡＧ）を定
量した。

【００５９】ＪＡおよびＭｅＪＡの定量には、10gの葉
を使用した。ＪＡおよびＭｅＪＡの定量は、最初の抽出
ステップ時に内部標準として[²H₂](±)-ＪＡおよび
[²H₂](±)-ＭｅＪＡを各２μg添加して、抽出操作にお
けるＪＡおよびＭｅＪＡの回収率を評価した（Nojiri,
H.ら(1992)、Plant Cell Physiol.、33:1225）以外は、
Creelman, R. Aら(1992)の方法（Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA、89:4938）に準じた。エーテル抽出後、イソク
ラティック（89％ヘキサン／10％酢酸エチル／１％酢
酸）シリカゲル（μBondasphere silica、５μm、3.9mm
×19cm、Waters製）を用いた高速液体クロマトグラフィ
ー（流速１ml/min）によって試料をさらに精製した。Ｍ
ｅＪＡおよびＪＡを含む画分は、各々、保持時間が５分
および10分のときに回収し、蒸発乾固し、次いで、50μ
lの酢酸エチルに再溶解した。得られた試料を、GC/MS-S
IM（ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー
−セレクテッドイオンモニタリング）によって解析し
た。この解析の前に、ＪＡをジアゾメタンを用いてメチ
ル化し、ＭｅＪＡとした。用いたGC/MS用機器は、Ultra
-1融合シリカキャピラリーカラム（25m×0.2mm、厚さ0.
33μmフェーズ、Hewlett-Packard製）を装備した「HP58
90GC」に適合した「Hewlett-Packard quadrupole MS (H
P5970B)」である。各試料を、120℃、スプリットレスモ
ードで注入した。120℃での２分間の等温待機(pause)
後、上記カラム温度を16℃／minのペースで280℃まで上
げた。キャリアガス（He）のカラム圧は40kPaで行っ
た。そして、上記GC/MS-SIMは、m/z 226、224、195、193、1
53および151においてモニタリングすることにより実施
した。電子エネルギーは、70eVであった。ＭｅＪＡの保
持時間は、およそ８分であった。元の上記葉からの抽出
物中のＪＡおよびＭｅＪＡのレベルは、m/z 224(²H₀)/2
26(²H₂)におけるピークエリアから決定した。全てのデ
ータは、損失量に関して補正した。

【００６０】ＳＡおよびＳＡＧの定量には、２gの葉を
使用した。ＳＡおよびＳＡＧの定量は、本質的にMalam
y, J.ら(1992)の方法（Plant Cell、4:359）に準じた。
高速液体クロマトグラフィーは、40℃に保持したμBond
asphere 100A、５μm、C-18(3.9mm×19cm)カラムを用い
て実施した。イソクラティック分離は、23％(v/v)メタ
ノールを含む20mM酢酸ナトリウム（pH5.0）を用いて、
１ml/minのペースで実施した。蛍光検出は、島津製「RF
-550A」モデルを用いて行った。この場合の検出限界
は、ＳＡで10pgである。全てのデータは、損失量に関し
て補正した。

【００６１】上記各定量方法によって得られた、上記Ｗ
ＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび非組換え野生型タバコに
おける傷処理後のＪＡ、ＭｅＪＡ、ＳＡ、およびＳＡＧ
産生量の推移を、各々、図５、図６、図７、および図８
に示す。各図中の白棒(WT)は、非組換え（野生型）タバ
コ、黒棒(TMS)は実施例４で得られた組換えタバコを示
す。非組換えタバコは、傷処理後速やかにＪＡおよびＭ
ｅＪＡの合成が誘導され、ＳＡおよびＳＡＧの合成は認
められなかった。他方、ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコにお
いては、ＪＡおよびＭｅＪＡの合成が抑制され、非組換
えタバコの場合とは逆に、ＳＡおよびＳＡＧの合成が傷
ストレスによって誘導された。この結果は、過剰量のＷ
ＩＰＫｍＲＮＡが誘導された結果、内在性のジャスモン
酸合成が抑制されたことを示すものであり、同時に、ジ
ャスモン酸が傷ストレスによるサリチル酸合成を抑制し
ている物質であることを示している。

【００６２】実施例７（ＷＩＰＫ遺伝子導入植物におけるＰＲタンパク質合成
の調節）上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび対照とし
て非組換え野生型タバコを用いて、傷処理後の塩基性お
よび酸性ＰＲタンパク質群の誘導をｍＲＮＡレベルで調
べた。

【００６３】発芽後50日目のＷＩＰＫ遺伝子導入タバコ
（TMP1S-13系統）および非組換え野生型タバコ（Nicoti
ana Tabacum Sammsun NN）の完全に展開した上位の葉の
表面を、15秒間、湿潤状態のカーボランダムで穏やかに
こすって傷を付けた。傷を付けた葉を、時間の経過（傷
処理後０、３、６、12、24、48時間）と共に逐次採取
し、全ＲＮＡを抽出した。ノーザン解析は、以下の通り
に実施した。

【００６４】１スロット当たり20μgの全ＲＮＡを、変
性アガロースゲル電気泳動によって展開し、常法に従っ
て、Hybond-N（Amersham製）メンブレンにブロッティン
グした。通常のランダムプライム法（Sambrookら(1989)
「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spr
ing Harbor Laboratory刊）」）により、[α-³²P]dCTP
で標識した酸性ＰＲ−１タンパク質（acidic PR-1）、
酸性ＰＲ−２タンパク質（acidic PR-2）、塩基性ＰＲ
−１タンパク質（basic PR-1）、および塩基性プロテア
ーゼインヒビターＩＩ（PI-II）の各ｃＤＮＡを、順
次、プローブとして用いた連続ハイブリダイゼーション
反応を行った。各スロットにロードしたＲＮＡを標準化
するために、上記連続ハイブリダイゼーション反応の最
後の工程として、³²Pで標識したグリセルアルデヒド-3-
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡ
をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。こ
の反応終了後のメンブレンを、２×SSC、0.1％SDS中で
１回(15分、25℃）、続いて0.1×SSC、0.1％SDS中で３
回(20分、65℃）洗浄した。洗浄後、上記メンブレンを
感光増強スクリーンを伴うXARフィルム（Kodak製）に、
-80℃で48時間曝した。得られたオートラジオグラムを
図９に示す。非組換え野生型タバコ(Wild-type plant)
では、傷処理の24時間後に、塩基性のＰＲタンパク質
（basic PR-1およびPI-II）ｍＲＮＡの誘導が認められ
る。しかしながら、ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコ(Transge
nic plant)では、塩基性ＰＲタンパク質ｍＲＮＡは、全
く誘導されず、傷処理の12〜24時間後に、酸性ＰＲタン
パク質（acidicPR-1およびPR-2）ｍＲＮＡが誘導され
た。

【００６５】実施例８（ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコを用いたバイオアッセイ）（１）タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）抵抗性の評価発芽後50日目の上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコ（TMPIS-
7系統）および対照とする非組換え野生型タバコ（Nicot
iana Tabacum Sammsun NN）の成熟葉表面に、60本の細
針の束を用いてランダムに傷を付けた。次いで、10mMリ
ン酸バッファー(pH7.0)に懸濁したＴＭＶ（10μg/ml）
を接種し、6000ルクス、20℃でインキュベートした。

【００６６】ＴＭＶ感染によって生じた病班の直径(mm)
を、感染後５、７、９、１１日目に測定することによっ
て、ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコと非組換え野生型タバコ
との間のＴＭＶ抵抗性の差異を調べた。図１０は、各測
定日における病班の測定値(mm)を平均±標準偏差で示し
たものである。図中の白抜き丸（○）および黒丸（●）
は、各々、ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコおよび非組換え野
生型タバコの測定平均値をプロットしたものである。ま
た、図１１は、ＴＭＶ感染処理後、１１日目の病徴を示
す写真である（左；野生型タバコ、右；ＷＩＰＫ遺伝子
導入タバコ）。図１０および図１１が示すように、ＷＩ
ＰＫ遺伝子導入タバコは、対照の非組換え野生型タバコ
と比べ、顕著なＴＭＶ抵抗性を示した。このことは、Ｗ
ＩＰＫ遺伝子発現によって、誘導された過剰量のＷＩＰ
ＫｍＲＮＡによって、ジャスモン酸合成が抑制され、結
果、傷ストレスによって、抗ウイルス性の酸性ＰＲタン
パク質群が誘導されたことを示している。

【００６７】（２）ハスモンヨトウ幼虫による食害検定発芽後50日目の上記ＷＩＰＫ遺伝子導入タバコ（TMPIS-
13系統）、N. glutinosa×N. debneyiの種間雑種（Ｆ
１）および対照とする非組換え野生型タバコ（Nicotian
a Tabacum Sammsun NN）の成熟葉を採取し、ハスモンヨ
トウのふ化直前の卵塊と共に、20℃、6000ルクスでイン
キュベートし、ふ化したハスモンヨトウの幼虫による食
害の程度の差異を調べた。ここで使用した、N. glutino
sa×N. debneyiの種間雑種（Ｆ１）は、ハスモンヨトウ
が好んで食するタバコである。図１２〜図１５は、各
々、ハスモンヨトウ幼虫ふ化後１、２、３、４日目の食
害の程度を示す写真である。各図中の左が、ＷＩＰＫ遺
伝子導入タバコ、中央がN. glutinosa×N. debneyiの種
間雑種（Ｆ１）、右が対照の非組換え野生型タバコであ
る。これらの図から明らかなように、ＷＩＰＫ遺伝子導
入タバコは、対照の非組換え野生型タバコに比べ、ハス
モンヨトウの食害を受けやすい性質を有している。この
ことは、本ＷＩＰＫ遺伝子導入植物において、導入され
たＷＩＰＫ遺伝子の発現によって誘導された過剰量のＷ
ＩＰＫｍＲＮＡによって、ジャスモン酸合成が抑制さ
れ、結果、傷ストレスによって、抗虫性の塩基性ＰＲタ
ンパク質であるプロテアーゼインヒビター群が誘導され
ないことを示している。

【００６８】

【発明の効果】本発明によれば、植物における傷ストレ
ス誘導性のＭＡＰキナーゼ、ならびに該キナーゼをコー
ドするヌクレオチド配列またはその相補配列を有するポ
リヌクレオチドが提供される。本発明のＭＡＰキナーゼ
は、植物の傷ストレスによるＰＲタンパク質誘導機構に
関与するジャスモン酸合成を制御するシグナル伝達物質
である。従って、本発明のＭＡＰキナーゼおよびそれを
コードするポリヌクレオチドは、ジャスモン酸合成およ
びＰＲタンパク質群の合成を調節するために使用され得
る。さらに、本発明のポリヌクレオチドが導入された、
ジャスモン酸合成およびＰＲタンパク質合成が調節され
得る植物品種が提供される。

【００６９】

【配列表】

【００７０】

【配列番号：１】配列の長さ：１７２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 TATATATACA CATATGCTCA TATTTACACT TATTACATGT TCATATGATC TTGTCTTAAT 60 TAGGCACATA TTTTTTTCTT TTCTTGAGCT AGATTAAGGA CTGAAATTAA TTC ATG 116 Met GCT GAT GCA AAT ATG GGT GCC GGT GGA GGT CAA TTC CCT GAT TTT CCT 164 Ala Asp Ala Asn Met Gly Ala Gly Gly Gly Gln Phe Pro Asp Phe Pro 5 10 15 TCG GTT TTA ACT CAC GGC GGA CAA TAT GTA CAG TTT GAT ATT TTT GGT 212 Ser Val Leu Thr His Gly Gly Gln Tyr Val Gln Phe Asp Ile Phe Gly 20 25 30 AAT TTC TTT GAG ATC ACT ACC AAG TAT CGT CCT CCT ATT ATG CCT ATT 260 Asn Phe Phe Glu Ile Thr Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ile Met Pro Ile 35 40 45 GGT CGT GGT GCT TAT GGA ATT GTC TGC TCG GTG TTG AAT ACG GAG CTG 308 Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val Leu Asn Thr Glu Leu 50 55 60 65 AAT GAG ATG GTT GCA GTT AAG AAA ATC GCG AAT GCG TTT GAT ATT TAC 356 Asn Glu Met Val Ala Val Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Ile Tyr 70 75 80 ATG GAT GCT AAG AGG ACT CTC CGT GAG ATT AAG CTC CTC CGC CAT TTA 404 Met Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Leu 85 90 95 GAC CAT GAA AAT GTA ATT GGT TTA AGA GAC GTG ATT CCT CCA CCC TTA 452 Asp His Glu Asn Val Ile Gly Leu Arg Asp Val Ile Pro Pro Pro Leu 100 105 110 CGA AGG GAG TTT TCT GAT GTT TAC ATT GCT ACT GAA CTC ATG GAT ACT 500 Arg Arg Glu Phe Ser Asp Val Tyr Ile Ala Thr Glu Leu Met Asp Thr 115 120 125 GAT CTT CAC CAA ATA ATT AGA TCC AAC CAA GGT TTA TCA GAG GAT CAC 548 Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly Leu Ser Glu Asp His 130 135 140 145 TGT CAG TAC TTC ATG TAT CAG CTC CTC CGT GGC CTA AAA TAC ATA CAT 596 Cys Gln Tyr Phe Met Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His 150 155 160 TCC GCG AAT GTT CTT CAT AGA GAT CTC AAA CCG AGC AAC CTT TTG GTA 644 Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Val 165 170 175 AAT GCA AAT TGT GAT CTT AAG ATA TGT GAC TTT GGT CTT GCT AGG CCA 692 Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Pro 180 185 190 AAC ATA GAG AAC GAG AAT ATG ACG GAA TAT GTT GTA ACC AGA TGG TAC 740 Asn Ile Glu Asn Glu Asn Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr 195 200 205 AGG GCA CCA GAG CTT TTG TTG AAC TCT TCA GAT TAC ACT GCT GCT ATA 788 Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Ile 210 215 220 225 GAT GTT TGG TCT GTC GGT TGC ATC TTC ATG GAA CTT ATG AAT AGA AAA 836 Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asn Arg Lys 230 235 240 CCT TTG TTT GGT GGA AAA GAT CAT GTA CAT CAA ATA CGC TTG TTA ACC 884 Pro Leu Phe Gly Gly Lys Asp His Val His Gln Ile Arg Leu Leu Thr 245 250 255 GAG CTT CTT GGC ACC CCA ACA GAA GCT GAT CTT GGC TTC CTC CAA AAT 932 Glu Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Ala Asp Leu Gly Phe Leu Gln Asn 260 265 270 GAA GAT GCA AAG AGA TAC ATC AGG CAA CTC CCA CAA CAT CCT CGC CAG 980 Glu Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Gln His Pro Arg Gln 275 280 285 CAG TTA GCA GAA GTT TTC CCT CAT GTG AAC CCA TTG GCT ATT GAT CTT 1028 Gln Leu Ala Glu Val Phe Pro His Val Asn Pro Leu Ala Ile Asp Leu 290 295 300 305 GTC GAT AAA ATG TTG ACA TTC GAT CCT ACT AGA AGA ATT ACA GTT GAG 1076 Val Asp Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Thr Arg Arg Ile Thr Val Glu 310 315 320 GAA GCA TTA GAT CAT CCC TAC CTT GCA AAG CTC CAC GAT GCA GGT GAC 1124 Glu Ala Leu Asp His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu His Asp Ala Gly Asp 325 330 335 GAA CCG ATC TGC CCT GTT CCA TTC TCC TTT GAC TTT GAG CAA CAA GGA 1172 Glu Pro Ile Cys Pro Val Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Gln Gly 340 345 350 ATA GGA GAA GAG CAA ATT AAG GAC ATG ATA TAT CAG GAA GCT TTG TCA 1220 Ile Gly Glu Glu Gln Ile Lys Asp Met Ile Tyr Gln Glu Ala Leu Ser 355 360 365 CTG AAT CCT GAA TAT GCT TAAACATAAG AGAAATCAAT TCTTCTTCTC 1268 Leu Asn Pro Glu Tyr Ala 370 375 CTGTTTCCCC TTTGATCTGG AGTATCTACT TTCCTACTGT GGATTTTCTT GCTCGGACCG 1328 AGCCACTCAA TGTTTTTGCT CACTGGTCAG TCCTTTGCGC AACTTGTAAT GTAAGGCAGC 1388 CTTCAATGTG CAGCCATCTA TATATCTTTT TTATTTTTTA TTTTTATTAC GGTGCTGTCT 1448 GAGCTAGCTT GTGGGCACCT TGATTATTTC ATTGGATATT GCTACCTCCC GCCAGCACAA 1508 CCATTTATAT CTCCCACTCA TTCTTATGAT TTGTATCTTG TGTGTTGTAT TCAGCTAAAA 1568 CCAATAATGG CAGGTTCCTC AACAATCATA GACACATCAT CTATGCAGAA TTCAAGTTTC 1628 TCTTTTCCAA CTTCATCTTC TTCATTCATG ACTTCTTCAT TCACTGAACT TCTTGCTTCT 1688 GATGATTATC CAACAAAGAG CAAAGGACTT GGTGATA 1725

【００７１】

【配列番号：２】配列の長さ：375 配列の型：アミノ酸配列の種類：蛋白質配列 Met Ala Asp Ala Asn Met Gly Ala Gly Gly Gly Gln Phe Pro Asp Phe 5 10 15 Pro Ser Val Leu Thr His Gly Gly Gln Tyr Val Gln Phe Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Asn Phe Phe Glu Ile Thr Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ile Met Pro 35 40 45 Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val Leu Asn Thr Glu 50 55 60 Leu Asn Glu Met Val Ala Val Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Ile 65 70 75 80 Tyr Met Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His 85 90 95 Leu Asp His Glu Asn Val Ile Gly Leu Arg Asp Val Ile Pro Pro Pro 100 105 110 Leu Arg Arg Glu Phe Ser Asp Val Tyr Ile Ala Thr Glu Leu Met Asp 115 120 125 Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly Leu Ser Glu Asp 130 135 140 His Cys Gln Tyr Phe Met Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile 145 150 155 160 His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu 165 170 175 Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg 180 185 190 Pro Asn Ile Glu Asn Glu Asn Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp 195 200 205 Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala 210 215 220 Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asn Arg 225 230 235 240 Lys Pro Leu Phe Gly Gly Lys Asp His Val His Gln Ile Arg Leu Leu 245 250 255 Thr Glu Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Ala Asp Leu Gly Phe Leu Gln 260 265 270 Asn Glu Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Gln His Pro Arg 275 280 285 Gln Gln Leu Ala Glu Val Phe Pro His Val Asn Pro Leu Ala Ile Asp 290 295 300 Leu Val Asp Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Thr Arg Arg Ile Thr Val 305 310 315 320 Glu Glu Ala Leu Asp His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu His Asp Ala Gly 325 330 335 Asp Glu Pro Ile Cys Pro Val Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Gln 340 345 350 Gly Ile Gly Glu Glu Gln Ile Lys Asp Met Ile Tyr Gln Glu Ala Leu 355 360 365 Ser Leu Asn Pro Glu Tyr Ala 370 375

【００７２】

【配列番号：３】配列の長さ：１７８６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATTTCAGTTG GGTCGATTTT ACAATGAAAC TAGTCCAACA AGACTATATA TAACATAAAA 60 AGAAGAATGT TCTCTGTCAA ACTTCAACGT CTTTAATCAA ATAAAAATAT CCAACACTAT 120 CAAATTTCTT CAGAACCCCT TAATTAATAA GATCACAAAG TTCAGAAAGA CCTTGGTTTC 180 AACACAATGG TGGA ATG CTT CAA AAT GTG GAG ACT GAA CTG TCC ACC TTT 230 Met Leu Gln Asn Val Glu Thr Glu Leu Ser Thr Phe 5 10 CTC TGT GGT GTC GAG CTT CGA CTG GCC TGG AGG AGG CAA CAG CTC AAA 278 Leu Cys Gly Val Glu Leu Arg Leu Ala Trp Arg Arg Gln Gln Leu Lys 15 20 25 GTT CTG AAC CAA ACG TCC CAA AGT GAT GCC AAG AAT TGG CAA TGC AAG 326 Val Leu Asn Gln Thr Ser Gln Ser Asp Ala Lys Asn Trp Gln Cys Lys 30 35 40 TAT AAT TCC AGG GCA GCT CCT CCT ACC AAC GCC AAA CGG AAG ATA TCT 374 Tyr Asn Ser Arg Ala Ala Pro Pro Thr Asn Ala Lys Arg Lys Ile Ser 45 50 55 60 GAA GTC ATT GCC ATT GGC CTC AAC ATG CTT CTC CTC TTC AAA GGC GGG 422 Glu Val Ile Ala Ile Gly Leu Asn Met Leu Leu Leu Phe Lys Gly Gly 65 70 75 CGC GAA TTC GCG GCC GCT TTT GGT AAT TTC TTT GAG ATC ACT ACC AAG 470 Arg Glu Phe Ala Ala Ala Phe Gly Asn Phe Phe Glu Ile Thr Thr Lys 80 85 90 TAT CGT CCT CCT ATT ATG CCT ATT GGT CGT GGT GCT TAT GGA ATT GTC 518 Tyr Arg Pro Pro Ile Met Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val 95 100 105 TGC TCG GTG TTG AAT ACG GAG CTG AAT GAG ATG GTT GCA GTT AAG AAA 566 Cys Ser Val Leu Asn Thr Glu Leu Asn Glu Met Val Ala Val Lys Lys 110 115 120 ATC GCG AAT GCG TTT GAT ATT TAC ATG GAT GCT AAG AGG ACT CTC CGT 614 Ile Ala Asn Ala Phe Asp Ile Tyr Met Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg 125 130 135 140 GAG ATT AAG CTC CTC CGC CAT TTA GAC CAT GAA AAT GTA AGA GAC GTG 662 Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Leu Asp His Glu Asn Val Arg Asp Val 145 150 155 ATT CCT CCA CCC TTA CGA GGG GAG TGT TCT GAT GTT TAC ATT GGT ACT 710 Ile Pro Pro Pro Leu Arg Gly Glu Cys Ser Asp Val Tyr Ile Gly Thr 160 165 170 GAA CTC ATG GAT ACT GAT CTT CAC CAA ATA ATT AGA TCC AAC CAA GGT 758 Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly 175 180 185 TTA TCA GAG GAT CAC TGT CAG TAC TTC ATG TAT CAG CTC CTC CGT GGC 806 Leu Ser Glu Asp His Cys Gln Tyr Phe Met Tyr Gln Leu Leu Arg Gly 190 195 200 CTA AAA TAC ATA CAT TCC GCG AAT GTT CTT CAT AGA GAT CTC AAA CCG 854 Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro 205 210 215 220 AGC AAC CTT TTG GTA AAT GCA AAT TGT GAT CTT AAG ATA TGT GAC TTT 902 Ser Asn Leu Leu Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe 225 230 235 GGT CTT GCT AGG CCA AAC ATA GAG AAC GAG AAT ATG ACG GAA TAT GTT 950 Gly Leu Ala Arg Pro Asn Ile Glu Asn Glu Asn Met Thr Glu Tyr Val 240 245 250 GTA ACC AGA TGG TAC AGG GCA CCA GAG CTT TTG TTG AAC TCT TCA GAT 998 Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp 255 260 265 TAC ACT GCT GCT ATA GAT GTT TGG TCT GTC GGT TGC ATC TTC ATG GAA 1046 Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu 270 275 280 CTT ATG AAT AGA AAA CCT TTG TTT GCT GGA AAA GAT CAT GTA CAT CAA 1094 Leu Met Asn Arg Lys Pro Leu Phe Ala Gly Lys Asp His Val His Gln 285 290 295 300 ATA CGC TTG TTA ACC GAG CTT CTT GGC ACC CCA ACA GAA GCT GAT CTT 1142 Ile Arg Leu Leu Thr Glu Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Ala Asp Leu 305 310 315 GGC TTC CTC CAA AAT GAA GAT GCA AAG AGA TAC ATC AGG CAA CTC CCA 1190 Gly Phe Leu Gln Asn Glu Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro 320 325 330 CAA CAT CCT CGC CAG GAG TTA GCA GAA GTT TTC CCT CAT GTG AAC CCA 1238 Gln His Pro Arg Gln Glu Leu Ala Glu Val Phe Pro His Val Asn Pro 335 340 345 TTG GCT ATT GAT CTT GTC GAT AAA ATG TTG ACA TTC GAT CCT ACT AGA 1286 Leu Ala Ile Asp Leu Val Asp Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Thr Arg 350 355 360 AGA ATT ACA GTT GAG GAA GCA TTA GAT CAT CCC TAC CTT GCA AAG CTC 1334 Arg Ile Thr Val Glu Glu Ala Leu Asp His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu 365 370 375 380 CAC GAT GCA GGT GAC GAA CCG ATC TGC CCT GTT CCA TTC TCC TTT GAC 1382 His Asp Ala Gly Asp Glu Pro Ile Cys Pro Val Pro Phe Ser Phe Asp 385 390 395 TTT GAG CAA CAA GGA ATA GGA GAA GAG CAA ATT AAG GAC ATG ATA TAT 1430 Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Glu Glu Gln Ile Lys Asp Met Ile Tyr 400 405 410 CAG GAA GCT TTG TCA CTG AAT CCT GAA TAT GCT TAAACATAAG AGAAATCAAT 1483 Gln Glu Ala Leu Ser Leu Asn Pro Glu Tyr Ala 415 420 TCTTCTTCTC CTGTTTCCCC TTTGATCTGG AGTATCTACT TTCCTACTGT GGATTTTCTT 1543 GCTCGGACCG AGCCACTCAA TGTTTTTGCT CACTGGTCAG TCCTTTGCGC AACTTGTAAT 1603 GTAAGGCAGC CTTCAATGTG CAGCCATCTA TATATCTTTT TTATTTTTTA TTTTTATTAC 1663 GGTGCTGTCT GAGCTAGCTT GTGGGCACCT TGATTATTTC ATTGGATATT GCTACCTCCC 1723 GCCAGCACAA CCATTTATAT CTCCCACTCA TTCTTATGAT TTGTATCTTG TGTGTTGTAT 1783 TCA 1786

【００７３】

【配列番号：４】配列の長さ：423 配列の型：アミノ酸配列の種類：蛋白質配列 Met Leu Gln Asn Val Glu Thr Glu Leu Ser Thr Phe Leu Cys Gly Val 5 10 15 Glu Leu Arg Leu Ala Trp Arg Arg Gln Gln Leu Lys Val Leu Asn Gln 20 25 30 Thr Ser Gln Ser Asp Ala Lys Asn Trp Gln Cys Lys Tyr Asn Ser Arg 35 40 45 Ala Ala Pro Pro Thr Asn Ala Lys Arg Lys Ile Ser Glu Val Ile Ala 50 55 60 Ile Gly Leu Asn Met Leu Leu Leu Phe Lys Gly Gly Arg Glu Phe Ala 65 70 75 80 Ala Ala Phe Gly Asn Phe Phe Glu Ile Thr Thr Lys Tyr Arg Pro Pro 85 90 95 Ile Met Pro Ile Gly Arg Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Val Leu 100 105 110 Asn Thr Glu Leu Asn Glu Met Val Ala Val Lys Lys Ile Ala Asn Ala 115 120 125 Phe Asp Ile Tyr Met Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu 130 135 140 Leu Arg His Leu Asp His Glu Asn Val Arg Asp Val Ile Pro Pro Pro 145 150 155 160 Leu Arg Gly Glu Cys Ser Asp Val Tyr Ile Gly Thr Glu Leu Met Asp 165 170 175 Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Gly Leu Ser Glu Asp 180 185 190 His Cys Gln Tyr Phe Met Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile 195 200 205 His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu 210 215 220 Val Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg 225 230 235 240 Pro Asn Ile Glu Asn Glu Asn Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp 245 250 255 Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala 260 265 270 Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asn Arg 275 280 285 Lys Pro Leu Phe Ala Gly Lys Asp His Val His Gln Ile Arg Leu Leu 290 295 300 Thr Glu Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu Ala Asp Leu Gly Phe Leu Gln 305 310 315 320 Asn Glu Asp Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Gln His Pro Arg 325 330 335 Gln Glu Leu Ala Glu Val Phe Pro His Val Asn Pro Leu Ala Ile Asp 340 345 350 Leu Val Asp Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Thr Arg Arg Ile Thr Val 355 360 365 Glu Glu Ala Leu Asp His Pro Tyr Leu Ala Lys Leu His Asp Ala Gly 370 375 380 Asp Glu Pro Ile Cys Pro Val Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln Gln 385 390 395 400 Gly Ile Gly Glu Glu Gln Ile Lys Asp Met Ile Tyr Gln Glu Ala Leu 405 410 415 Ser Leu Asn Pro Glu Tyr Ala 420

【００７４】

【配列番号：５】配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸配列の種類：蛋白質フラグメント型：中間部フラグメント配列 Pro Asn Ile Glu Asn Glu Asn Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp 5 10 15 Tyr Arg Ala Pro Glu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】傷処理後に誘導されたＷＩＰＫｍＲＮＡを検出
したアガロースゲル電気泳動像のオートラジオグラム写
真を示す。

【図２】ＭＡＰキナーゼ遺伝子を挿入されたｐＢＩ１２
１系プラスミドの概略を示す。

【図３】傷処理後に誘導された内在性ＭＡＰキナーゼｍ
ＲＮＡおよびＷＩＰＫｍＲＮＡを検出したアガロースゲ
ル電気泳動像のオートラジオグラム写真を示す。

【図４】誘導されたＭＡＰキナーゼを検出したポリアク
リルアミドゲル電気泳動像のオートラジオグラム写真を
示す。

【図５】傷処理後に誘導されたＪＡ産生量の推移を示
す。

【図６】傷処理後に誘導されたＭｅＪＡ産生量の推移を
示す。

【図７】傷処理後に誘導されたＳＡ産生量の推移を示
す。

【図８】傷処理後に誘導されたＳＡＧ産生量の推移を示
す。

【図９】傷処理後に誘導された塩基性および酸性ＰＲタ
ンパク質のｍＲＮＡを検出したアガロースゲル電気泳動
像のオートラジオグラム写真を示す。

【図１０】傷処理後のＴＭＶ感染によって生じた病班の
直径(mm)の推移を、平均±標準偏差で示す。

【図１１】傷処理後のＴＭＶ感染によって生じた病徴
（接種１１日目）を撮影した写真を示す。

【図１２】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害状
況（ふ化１日目）を撮影した写真を示す。

【図１３】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害状
況（ふ化２日目）を撮影した写真を示す。

【図１４】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害状
況（ふ化３日目）を撮影した写真を示す。

【図１５】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害状
況（ふ化４日目）を撮影した写真を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１２月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１１】傷処理後のＴＭＶ感染によって生じた病徴
（接種１１日目）を撮影した生物形態写真（タバコ葉）
である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１２】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害
状況（ふ化１日目）を撮影した生物形態写真（タバコ
葉）である。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１３】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害
状況（ふ化２日目）を撮影した生物形態写真（タバコ
葉）である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１４】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害
状況（ふ化３日目）を撮影した生物形態写真（タバコ
葉）である。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１５】ハスモンヨトウ幼虫によるタバコ葉の食害
状況（ふ化４日目）を撮影した生物形態写真（タバコ
葉）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｐ 7/62 7/62 19/44 19/44 21/02 Ｃ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/42 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 19/44 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｔ-Ｅ-Ｙ配列におけるスレオニン残基お
よびチロシン残基のリン酸化によって活性化されるＭＡ
Ｐキナーゼであって、配列番号５によって示されるアミ
ノ酸配列の第１位から第２１位までのアミノ酸配列を有
するＭＡＰキナーゼ。
【請求項２】配列番号２によって示されるアミノ酸配
列の第１位から第３７５位までのアミノ酸配列を有す
る、請求項１に記載のＭＡＰキナーゼ。
【請求項３】配列番号４によって示されるアミノ酸配
列の第１位から第４２３位までのアミノ酸配列を有す
る、請求項１に記載のＭＡＰキナーゼ。
【請求項４】請求項１から３のいずれかに記載のＭＡ
Ｐキナーゼをコードするヌクレオチド配列またはその相
補配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】前記ＭＡＰキナーゼをコードするヌクレ
オチド配列が、配列番号１によって示されるヌクレオチ
ド配列の第１１４位から第１２３８位までのヌクレオチ
ド配列である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】植物細胞におけるジャスモン酸合成を調
節する方法であって、請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを植物細胞
に導入する工程；および該導入されたポリヌクレオチド
からＭＡＰキナーゼｍＲＮＡまたはそのアンチセンスＲ
ＮＡを誘導する工程；を包含する、方法。
【請求項７】植物細胞における感染特異的タンパク質
合成を調節する方法であって、請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを植物細胞
に導入する工程；および該導入されたポリヌクレオチド
からＭＡＰキナーゼｍＲＮＡまたはそのアンチセンスＲ
ＮＡを誘導する工程；を包含する、方法。
【請求項８】前記感染特異的タンパク質が、１種また
はそれ以上の塩基性タンパク質である、請求項７に記載
の方法。
【請求項９】前記感染特異的タンパク質が、１種また
はそれ以上の酸性タンパク質である、請求項７に記載の
方法。
【請求項１０】請求項４または５に記載のポリヌクレ
オチドを導入した植物細胞から植物体を再分化する工程
をさらに包含する、請求項６から９のいずれかに記載の
方法。
【請求項１１】請求項４または５に記載のポリヌクレ
オチドを導入された植物細胞。
【請求項１２】請求項４または５に記載のポリヌクレ
オチドを導入された植物体。