CZ74799A3

CZ74799A3 - Rozprašovací nádobka

Info

Publication number: CZ74799A3
Application number: CZ99747A
Authority: CZ
Inventors: Rolf Schiestel
Original assignee: Peter Kwasny Gmbh
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-05
Publication date: 1999-11-17
Also published as: DE19636221A1; US5957341A; WO1998009887A1; NO320865B1; EP0925236A1; EP0925236B1; AU738425B2; DE29617635U1; CA2264696A1; TR199900502T2; NO991075D0; CZ296725B6; NO991075L; CA2264696C; PL332142A1; ES2191196T3; DE19636221C2; AU4382397A; ATE231094T1; DE59709163D1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká zavedení chemických činidel do buněk. Vynález zvláště popisuje kompozice a způsoby intracelulárního zavedení chemických činidel do specifického typu buněk, které exprimují receptor CR2 .

Dosavadní stav techniky

Z hlediska použitelnosti při léčení rakoviny vzbudili značnou pozornost toxiny, které směřují na povrchové buněčné receptory nebo na antigeny na nádorových buňkách. Tyto toxiny například popisují I. Pastan & D. FitzGerald v publikaci Recombinant Toxins for Cancer Treatment, 254 Science 1173 (1991); Anderson et al. v U.S. patentech č. 5,169,933 a 5, 135,736; Thorpe et al. v U.S. patentu č. 5, 165, 923; Jansen et al. v U.S. patentu č. 4,906,469; Frankel v U.S. patentu č. 4,962,188; Uhr et al. v U.S. patentu č. 4,792,447; Masuho et al. v U.S. patentech č. 4,450,154 a 4,350,626. Tato činidla obsahují část, jako je buněčný růstový faktor nebo protein schopný vázat se na buněčný antigen, která se váže na rostlinný nebo bakteriální toxin. Mechanizmus usmrcení buněk se liší od běžné chemoterapie, a tak se potenciálně redukuje nebo eliminuje zkřížená odolnost na běžná chemoterapeutická činidla.

Membránový glykoprotein CR2, který je také známý pod označením CD21, se vyskytuje na zralých lymfocytech (B buňky) a na jistých epiteliálních buňkách, jako jsou epiteliální buňky lidského hltanu, lidské folikulární dendritické buňky a epitel děložního čípku. Tento membránový glykoprotein funguje jako receptor pro Epstein-Barrové virus (EBV) a pro fragmenty komplementu C3d/C3dg, jak se popisuje v publikaci N. Miller & L.M. Hutt-Fletcher, 66 J. Virol. 3409 (1990). Uvedený receptor je 145 kD velký membránový glykoprotein, který mimo své vazebné funkce se také podílí na aktivaci B buňky. Receptor se popisuje například v publikaci G.R. Nemerow, et al, Identification and characterization of Epstein-Barr virus receptor on human B lymphocytes and its relationship to the C3d komplement receptor (CR2), 55 J. Virol. 347 (1985). Infekce B buněk Epstein-Barrové virem (EBV) se iniciuje navázáním obalového glykoproteinu viru na receptor CR2, následuje internalizace receptoru CR2 a endocytóza viriónů. Tento proces se popisuje v publikaci Tedder et al. (1986), Epstein-Barr virus binding induces internalization of the C3d receptor: a novel immunotoxin delivery system, 137 J. Immunol. 1387 (1986). Epiteliální buňky, které nesou receptor CR2, také váží Epstein-Barrové virus (EBV), ale infekce zřejmě probíhá odlišným mechanizmem, než je receptorem zprostředkovaná endocytóza.

Nemerow et al. v publikaci Identification of gp350 as the viral glycoprotein mediating attachment of Epstein-Barr virus (EBV) to the EBV/C3d receptor of B cells: sequence homology of gp350 and C3 complement fragment C3d, 61 J. Virol. 1416 (1987), určil oblast podobnosti sekvence aminokyseliny mezi fragmentem komplementu C3dg a virovým obalového glykoproteinem gp350/220. Tato oblast zahrnuje oblast ležící blízko N-konce virového obalového glykoproteinu gp350/220 (Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu; SEQ ID č:2) , která odpovídá sekvenci fragmentu komplementu C3dg (Glu-AspPro-Gly-Lys-Gln-Leu-Tyr-Asn-Val-Glu; SEQ ID č:2) . Nemerow et al. v publikaci Identifikation of epitope in the major envelope protein of Epstein-Barr virus that mediates viral binding to the B lymphocyte EBV receptor (CR2), 56 Cell 369 (1989), popisuje navázáni syntetického tetradekapeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci označenou jako SEQ ID č: 1, na čištěný receptor CR2 a na B buňky, jenž exprimuji receptor CR2 . Syntetický peptid také blokuje navázání rekombinantniho virového obalového glykoproteinu gp350/220 nebo fragmentu komplementu C3dg na receptor CR2 B buněk. Podobný syntetický peptid inhibuje in vitro infekci EpsteinBarrové virem. Analýza zkomolených a substituovaných analogů peptidu ukázala, že epitop Epstein-Barrové viru (EBV), který umožňuje vazbu na receptor CR2, je obsažen v sekvenci GluAsp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (SEQ ID č:l). Kratší peptid vykazuje omezenou schopnost vazby, ačkoliv peptid se sekvencí Glu-Asp-Pro-Gly (SEQ ID č:3) si zachovává významnou vazebnou aktivitu. Peptid, který má v této oblasti zaměněnou jednu aminokyselinu, prolin nahrazuje glycin, také vykazuje sníženou vazebnou aktivitu na receptor CR2.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje kompozice pro intracelulární zavedení vybraných chemických činidel do specifického typu buňky, jde o buňky exprimujici receptor CR2. Vazba na tento receptor spouští receptorem sprostředkovanou endocytózu.

Předmětem vynálezu jsou také způsoby přípravy a použití kompozic pro intracelulární zavedení vybraných chemických činidel do buněk, které exprimuji receptor CR2.

Vynález dále popisuje kompozice a způsoby pro intracelulárně zaváděná vybraná chemická činidla, taková jako jsou cytotoxiny, transformující nukleové kyseliny, regulátory genů, značící látky, antigeny, léčiva a podobně, do buněk , které exprimuji receptor CR2.

Vynález poskytuje peptidové ligandy, které mohou být spojeny s vybranými chemickými činidly a umožňují navázání chemických činidel na receptory CR2 a endocytózu těchto chemických činidel.

Tyto a další provedení vynálezu se uskutečňují poskytnutím kompozice pro specifické intracelulární zavedení chemického činidla do buňky, která nese receptor CR2, v populaci buněk obsahující buňky bez exprimovaného receptoru CR2. Tato kompozice obsahuje ligand (GBEL), který je schopný se navázat na receptor CR2 a vyvolat receptorem zprostředkovanou endocytózu. Dále kompozice obsahuje chemické činidlo vázané na ligand, přičemž chemické činidlo po jeho intracelulárním zavedení do buňky, která nese receptor CR2, je schopné vyvolat žádaný účinek. Zralé B lymfocyty jsou buňky, které nesou receptor CR2, a jsou cílovými buňkami pro tyto kompozice. Chemická činidla, která se mohou zavádět do takových buněk, zahrnují cytotoxiny, transformující nukleové kyseliny, regulátory genů, značící látky, antigeny a léčiva. Ligand (GBEL) a chemické činidlo se mohou vzájemně vázat a/nebo se mohou vázat na další funkční části prostřednictvím mezerníků. Mezerník může být buď biologicky rozložitelný, jako jsou určité peptidy, nebo biologicky nerozložitelný. Kompozice může dále obsahovat systém nosičů, které jsou vybraný ze skupiny zahrnující ve vodě rozpustné polyméry, lipozómy a částice.

Kompozice se používají in vitro, kdy na populaci buněk působí účinné množství kompozice za podmínek, při kterých se a ligand (CBEL) váže na receptor CR2 a vyvolává endocytózu kompozice, která je navázána na receptor. V případě použití in vivo systémově podává účinné množství kompozice tak, že ligand (CBEL) je v kontaktu s receptorem CR2 zralých B lymfocytů, váže se na něj a pak vyvolá endocytózu kompozice.

Jestliže chemické činidlo vnikne do buňky začne účinně působit.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky 1A a 1B znázorňuji chemickou konjugaci ligandu (CBEL) s chemickým činidlem, které má volnou merkaptoskupinu, vzniká kompozice podle vynálezu. Symbol TM označuje teplotu místnosti.

Obrázky 2A až 2B znázorňují jednotlivé kroky konstrukce plazmidu pro expresi fúzního proteinu, který obsahuje ligand (CBEL) a chemické činidlo, kterým je peptid podle vynálezu.

Obrázek 3 znázorňuje srovnání účinku působení in vitro fúzního proteinu CBEL-ricin A v různých koncentracích na B buňky, které nesou receptor CR2 (tmavé sloupce), a T buňky, které nenesou receptor CR2 (světlé sloupce), podle vynálezu. Na ose x jsou vyneseny koncentrace fúzního proteinu v μg/ml a na ose y je vyneseno % buněk schopných samostatné existence po expozici.

Termín peptid označuje peptidy libovolné délky a zahrnuje i proteiny.

Termíny polypeptid a oligopeptid se zde užívají bez omezení velikosti, pokud není určitá velikost určena jinak.

Termíny ligand vázající se na receptor CR2 a indukující endocytózu nebo CBEL označují kompozici schopnou vázat se na receptor CR2 (CD21) a způsobovat internalizaci endocytózou receptoru a ligandu (CBEL) navázaného na receptoru. Podle vynálezu se ligandy (CBEL) spojují s řadou funkčních molekul tak, že při endocytóze ligandů (CBEL) je řada připojených funkčních molekul také internalizována do buněk, které nesou receptor CR2.

Ze současným poznatků vyplývá, že ligand (CBEL) může pocházet z membránového glykoproteinu Epstein-Barrové viru gp350/220 a obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID č:l a lemovaci sekvence; z peptidů fragmentu komplementu C3dg, které obsahuji sekvenci uvedenou v SEQ ID č:2 a lemující sekvence; nebo z peptidů, které vykazují podstatnou homologii s těmito látkami. Termínem peptidy s podstatnou homologii se míní peptidy, které si zachovávají schopnost vázat se na receptory CR2 a vyvolat receptorem zprostředkovanou endocytózu, ačkoliv mohou zahrnovat lemující sekvence nebo mohou tvořit zkomoleniny, deleční varianty nebo substituční varianty sekvencí popsaných v SEQ ID č:l nebo v SEQ ID č:2. Sekvence popsaná jako SEQ ID č:3 se jeví být minimálně nutná pro vytvoření vazby na receptor a pro vyvolání receptorem zprostředkované endocytózy. Substituční varianty jsou ty peptidy, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků se konzervativně nahradí. Konzervativní náhrada se definuje jako záměna jednoho aminokyselinového zbytku za jiný, přičemž peptid si zachová svojí funkčnost. V tomto případě jde o schopnost vázat se na receptor CR2 a vyvolat endocytózu kompozice vázané na receptoru. Aminokyselinové zbytky patřící do určitých konzervativních substitučních skupin se mohou někdy nahradit jiným aminokyselinovým zbytkem ze stejné skupiny. Jedno takové substituční seskupení se popisuje v publikaci M. Jimenez-Montano & L. Zamora-Cortina, Evalutionary model for the generation of amino acid sequences and its application to the study of mammal alpha-hemoglobin chains, Proc. Vllth Int'l Biophysics Congress, Mexico City (1981), patří sem: Pro, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Gin, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Cys, He, Leu, Met, Val a Phe, Trp, Tyr. U dalších variant, které se považují za podstatně homologní, dochází k nahrazení D-aminokyselin přirozeně se vyskytující L-aminokyselinou, k nahrazení aminokyselinových derivátů takových, jako jsou ty, které obsahují další postranní řetězce, a dále k nahrazení nestandardních aminokyselin, což jsou a-aminokyseliny, které se v proteinech vyskytují pouze řídce nebo se vůbec nevyskytují. Pouze funkčnost limituje primární strukturu ligandu (CBEL).

Termín chemické činidlo popisuje a zahrnuje libovolnou látku, která vykazuje po internalizaci do B lymfocytu, pomocí endocytózy, žádaný účinek. Po internalizaci do B buněk mají určitá chemická činidla tyto fyziologické účinky: cytotoxický účinek nebo ovlivňují regulaci genů těchto buněk.

Transformující nukleová kyselina (RNK nebo DNK) se po internalizaci do buňky replikuje a/nebo se v buňce exprimuje. Další nukleové kyseliny mohou v buňkách spolu s regulačními sekvencemi nebo regulačními faktory na sebe vzájemně působit, což ovlivňuje žadaným způsobem expresi genu v buňce. Zjištění značící látky po jejím zavedení do buňky umožňuje určení těch buněk, ve kterých jsou internalizovány kompozice podle vynálezu. Antigeny, jež se zavedly do vnitřního prostoru buňky, mohou vyvolat specifickou imunní odezvu. Léčiva nebo farmakologicky aktivní látky se používají pro zlepšení patogenních účinků nebo dalších typů poruch. Zvláště výhodná chemická činidla zahrnují polypeptidy, některá taková chemická činidla jsou aktivními fragmenty biologicky aktivních proteinů nebo jsou specificky antigenními fragmenty (například epitopy) antigenních proteinů. Chemická činidla zahrnují cytotoxiny, regulátory genů, transformující nukleové kyseliny, značící látky, antigeny, léčiva a podobně.

Termín nosič označuje ve vodě rozpustné polyméry, částice nebo lipozómy. Takové nosiče obsahují několik míst, na které se mohou připojit jeden nebo více ligandů (CBEL) a/nebo chemické činidlo. Zmíněné nosiče zvyšují velikost molekuly kompozic a mohou jim poskytnout přidanou selektivitu a/nebo stabilitu. Selektivita roste, protože kompozice obsahující nosič jsou příliš velké na to, aby vstoupily do buňky pasivní difúzí a proto jsou omezeny vstupovat do buněk pomocí receptorem zprostředkované endocytózy. Nosiče obsahující ve vodě rozpustné polyméry se mohou používat k navázání ligandů peptidu, chemických činidel a dalších funkčních molekul. Zřídil se potenciál pro použití takových nosičů pro cílené zavádění léčiv, jak se popisuje například v publikacích J. Kopeček, 5 Biomaterials 19 (1984); E. Schacht et al., Polysacharides as Drug Carriers, in ControlledRelease Technology 188 (P.I. Lee & W.R. Good, eds., 1987); F. Hudecz et al., Carrier design: cytotoxicity and immunogenicity of synthetic branched polypeptides with poly(L-lysine) backbone, 19 J. Controlled Release 231 (1992); Z. Brich et al., Preparation and characterization of a water solubla dextran immunoconjugate of doxorubicin and the monoclonal antibody (ABL364), 19 J. Controlled Release 245 (1992). Pak ilustrativní ve vodě rozpustné polyméry zahrnují dextran, inulin, poly(L-lysin), syntetické polyméry obsahující methakrylamid a podobně.

Termín léčivo nebo farmakologicky aktivní činidlo označuje libovolný chemický materiál nebo sloučeninu, jenž je vhodná pro intracelulární zavedení do B buňky nesoucí receptor CR2 a která v takové buňce vyvolá žádaný biologický nebo farmakologický účinek.

Termínem účinné množství se míní množství, které umožňuje dosažení žádaného účinku. Například, žádaný účinek kompozice, která obsahuje jako chemické činidlo cytotoxin, může být usmrcení zvoleného podílu zralých B buněk v daném časovém úseku. Účinné množství kompozice je takové množství, při kterém se dosáhne tohoto žádaného výsledku a takové množství může stanovit odborník rutinním způsobem.

Kompozice podle vynálezu umožňují specifické intracelulární zavedení chemického činidla do buňky nesoucí receptor CR2 v populaci buněk zahrnující buňky bez receptoru CR2 . Kompozice obsahuje ligand (GBEL), který je schopný se vázat na receptor CR2 a vyvolat receptorem zprostředkovanou endocytózu, a chemické činidlo spojené s ligandem (GBEL), kde chemické činidlo je schopné, po intracelulárním zavedení do buňky nesoucí receptor CR2, vyvolat žádaný účinek. Zvláště zralé B buňky jsou cílovými buňkami těchto kompozic. Chemická činidla se vybírají ze skupiny obsahující cytotoxiny, transformující nukleové kyseliny, regulátory genů, značící látky, antigeny, léčiva a podobně. Ligand (GBEL) může být připojen k chemickému činidlu bez omezení kovalentní vazbou, elektrostatickou interakcí, hydrofobní interakcí, fyzikální kapsolací a podobně. Ligand (CBEL) se může spojit s chemickým činidlem přímo nebo přes jiné funkční části. Kompozice pak mohou dále obsahovat mezerník, který spojuje ligand (CBEL) a chemiké činidlo a je vsunutý mezi ně. Takový mezerník může být biologicky rozložitelný nebo není biologicky rozložitelný. Preferuje se peptidový mezerník. Kompozice podle vynálezu mohou dále obsahovat nosič vybraný ze skupiny obsahující ve vodě rozpustné polyméry, lipozómy a částice. V případě, že nosič je ve vodě rozpustný polymér, kompozice se charakterizuje vzorcem:

[L-S_a]_b - C - [S_e-A]_fve kterém

L je ligand (CBEL) schopný se vázat na receptor CR2 a vyvolat jeho endocytózu,

A představuje chemické činidlo,

S označuje mezerník,

C představuje ve vodě rozpustný polymér, jehož funkční skupiny jsou slučitelné s ligandem, s chemickým činidlem a s mezernikem pomocí tvořících se kovalentních vazeb, a má hodnotu 0 nebo 1, e má hodnotu 0 nebo 1, b je celé číslo, které má hodnotu nejméně 1, f je celé číslo, které má hodnotu nejméně 1.

Takový ve vodě rozpustný polymér je vybraný ze skupiny obsahující dextran, inulin, poly(L-lysin), polyméry obsahující methakrylamid a podobně.

Ligand (GBEL) podle vynálezu zprostředkovává vazbu kompozice na receptor CR2 na zralých B buňkách a tím spouští internalizaci kompozic endocytózou. Chemické činidlo poskytuje prostředníky pro dosažení žádaného účinku v B buňkách. Chemická činidla například obsahují cytotoxiny, zahrnující radionukleotidy, za účelem selektivního usmrcení nebo oslabení buněk, které nesou receptor CR2; dále obsahují antigeny za účelem vyvolání žádané imunní odezvy; nukleové kyseliny, které genově transformují nebo regulují expresi genu v B buňkách; léčiva nebo farmakologicky aktivní činidla za účelem dosažení zvoleného léčebného účinku; značící látky, které fungují na principu fluorescence, radioaktivity a magnetizmu a umožňují vyhledat buňky, jenž pojmuly kompozice a podobně.

Kompozice podle vynálezu dále obsahují ve vodě rozpustné polymérní nosiče, které umožňují, že většina ligandů (CBEL) a/nebo chemických činidel se zvolenými funkcemi se mohou vázat dohromady a tak vytvářet komplexní molekuly. Na takové nosiče se váže nejméně jedno chemické činidlo a nejméně jeden ligand (CBEL), výhodný počet ligandů (CBEL) spojených s chemickými činidly je v rozmezí 1 až do přibližně 1000. Takové nosiče zvýšuji velikost molekul kompozic a mohou poskytovat funkčním částem přidanou selektivitu a/nebo stabilitu, čehož se bez nosiče nedosáhne. Biologicky rozložitelné nebo biologicky nerozložitelné mezerníky výhodně zprostředkovávají spojování ligandů (CBEL) a/nebo chemických činidel. Jejich relativní náchylnost nebo odolnost k hydrolýze a/nebo k enzymatickému štěpení uvnitř B buněk hraje důležitou roli při jejich výběru. Tato selektivita poskytuje odborníkovi možnost výběru mezerníku na základě toho, zda je nejvýhodnější mít v buňce chemické činidlo stále spojené s nosičem nebo má být z nosiče uvolněno vnitrobuněčnou enzymatickou aktivitou. Použití lipozómů a částic jako nosičů nezávisí na použití ve vodě rozpustných polymérních nosičů.

V některých provedeních vynálezu se kompozice sestavují chemickým spojením ligandu (CBEL) a chemického činidla. Termínem chemickým spojením ligandu (CBEL) a chemického činidla se míní kovalentní spojení ligandu (CBEL) a chemického činidla buď přímo nebo cestou spojování částí. Ve zvláštních provedeních vynálezu, kde chemické činidlo je peptid, se používá spojování částí k vytvoření vazby mezi funkčními skupinami na ligandech (CBEL) a chemickým činidlem. Například, kompozice obsahující ligand (CBEL) a chemické činidlo, kterým je peptid, se tvoří spojením merkaptoskupiny nesenou chemickým činidlem a aminoskupiny na ligandu (CBEL) přes heterobifunkční křížový spojovník. Například, na obrázcích 1A a 1B je znázorněno reakční schéma chemického spojení ligandu (CBEL) a ricinu A přes maleinimidový křížový spojovník. Vedle maleinimidových křížových spojovníků, které se používají při chemickém spojení ligandů (CBEL) a chemického činidla obsahující merkaptoskupinu, se dále mohou používat jako křížové spojovníky halogenacetylová skupina, alkylhalogenid, alkylsulfonát, a,β-nenasycený karbonyl nebo α, β-nenasycené sulfonové části. V případě chemického spojení ligandů a chemického činidla obsahujícího aminové skupiny se mohou použít jako křížové spojovníky aktivní estery. Uplatňují se i další spojovací části, což závisí na tom, která funkční skupina(y) nesená ligandy (CBEL) a chemickým činidlem je dostupná.

Kompozice se podle vynálezu také vytvářejí v genově manipilovaném organizmu, jako je E. coli, ve formě fúzního proteinu. A sice, pomocí genového inženýrství se může vytvořit hybridní gen obsahující sekvenci nukleotidů kódující ligand (CBEL) a sekvenci nukleotidů kódující chemické činidlo peptid. Tento hybridní gen se může vnést do organizmu, tak že se exprimuje fúzní protein, který je kódován hybridním genem. Fúzní protein se pak čistí standardními metodami, které zahrnují afinitní chromatografii.

Fúzní proteiny obsahující ligand (CBEL) a chemické činidlo peptid podle vynálezu se mohou také tvořit chemickou syntézou.

V případě, že kompozice se podle vynálezu produkují ve formě fúzních proteinů, ligand (CBEL) a chemické činidlo peptid mohou spolu bezprostředně sousedit, což znamená, že Ckonec ligandu (CBEL) se váže přímo na N-konec chemického činidla a naopak. V jiném případě fúzní protein může také obsahovat další aminokyselinové zbytky, které se nachází mezi ligandem (CBEL) a chemickým činidlem. Tyto přidané aminokyselinové zbytky slouží jako mezerník mezi ligandem (CBEL) a chemickým činidlem peptidem. Zpravidla se preferují krátké ligandy peptidu, protože se s krátkými peptidy snadněji manipuluje a protože přítomnost přidaných aminokyselinových zbytků, a zvláště podstatný počet těchto aminokyselinových zbytků, může rušit funkci ligandu peptidu vyvolat internalizace chemického činidla endocytózou.

Kompozice podle vynálezu mohou dále obsahovat místa štěpitelná proteázou, která jsou umístěna tak, že po zavedení kompozice do buňky, se může chemické činidlo oddělit od ligandu (CBEL) proteolýzou místa štěpení. Taková štěpitelná místa se přirozeně objevují ve virovém membránovém glykoproteinu gp350/220 přilehlém k segmentu sekvence uvedené v SEQ ID č:l, tak se ligandová část kompozice může vhodně rozšířit, aby zahrnula tyto místa štěpení. Mezerník citlivý na proteázu se může přidat do kompozice bez ohledu nato, zda kompozice se syntetizuje chemicky nebo se jedná o exprimovaný peptid genově manipulovaného organizmu. Jestliže kompozice je exprimovaný peptid, nukleotidy kódující mezerník citlivý na proteázu se mohou vložit do hybridního genu mezi segmenty kódující ligand (CBEL) a chemické činidlo peptid pomocí metody, která je dobře známa v oboru.

Dále vynález popisuje způsob, kterým se specificky ovlivňuje žádaná aktivita v buňkách exprimujících receptor CR2 zahrnutých v populaci buněk bez exprese receptoru CR2. Populace buněk přichází postupně do kontaktu s kompozicí, která obsahuje ligand (CBEL) spojený s chemickým činidlem, jenž intracelulárně řídí takovou aktivitu. Kompozice podle vynálezu se ve směsné populaci buněk selektivně vaze na buňky exprimující receptor CR2, vyvolá se endocytóza kompozice a chemické činidlo v buňkách exprimujících CR2 receptor aktivně působí.

Vynález využívá, není-li jinak uvedeno, standardní způsoby manipulace peptidů a nukleových kyselin za účelem exprese peptidu. Způsoby konjugace oligopeptidu a oligonukleotidů jsou v oboru známy a popisují se například v publikacích T.Zhu et al., 3 Antisense Res. Dev. 265 (1993); T. Zhu et al., 89 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 7934 (1992); P. Rigaudy et al., 49 Cancer Res. 1836 (1989) .

Jak je shora uvedeno, vynález popisuje peptidy, které v kompozici obsahující také chemická činidla vystupují jako ligandy (GBEL). Chemická činidla kompozice mohou být také peptidy nebo mohou peptidy obsahovat. Peptidy podle vynálezu se mohou tvořit libovolnými způsoby, mezi něž patří organická syntéza a genové inženýrství. Metody chemické syntézy peptidů se například popisují v piblikacích B. Merrifield et al., 21 Biochemistry 5020-31 (1982); Houghten, 82 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 5131-35 (1985). Metody chemické konjugace peptidů s dalšími molekulami jsou dobře známy v oboru.

Fúzní protein podle vynálezu může být vytvořen expresí nukleové kyseliny ve vhodné hostitelské buňce. Nukleová kyselina obsahuje oligonukleotid kódující ligand (GBEL), jak je shora uvedeno, a oligonukleotid kódující chemické činidlo peptid. Tyto metody produkující rekombinantní fúzní proteiny jsou dobře známy v oboru a jsou obecně popsány například v publikaci J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., 1989). Činidla vhodná pro aplikaci těchto metod, jako jsou restrikční enzymy a podobně, jsou dobře známa v oboru a jsou komerčně dostupná od několika dodavatelů.

Dále se popisuje vytvoření kompozic obsahujících ligand (CBEL) a chemické činidlo peptid podle vynálezu s odvoláním na příklady, v nichž ligand (CBEL) je spojen s cytotoxickým chemickým činidlem, kterým je peptid ricin A. Ricin je toxický glykoprotein, který produkuje rostlina Ricinus coímnunis. Skládá se ze dvou podjednotek, z řetězce A a z řetězce B, z nichž každá má molekulární váhu okolo 30 kD, vázaných dohromady disulfidovou vazbou. Ricin se syntetizuje jako velký prekurzor, jehož zpracováním vzniknou zralé ricinové podjednotky, řetězce A a B. A řetězec je enzym, který štěpí glykosidovou vazbu v 28S ribozomální RNK, čímž se zruší schopnost ribozómů syntetizovat protein. V publikaci S. Olsen et al., Ribosome inactivation by the toxic lectins abrin and ricin, 60 Eur. J. Biochem. 281 (1975) se uvádí, že A řetězec může inaktivovat okolo 1500 ribozómů za minutu, což znamená, že jediná internalizovaná molekula ricinu A je pro buňku smrtící. B řetězec se váže na části galaktózy na povrchu buňky, což je jev nutný pro internalizaci ricinu. Odstranění B řetězce zabraňuje A řetězci vstoupit do buňky, čímž jej učiní inaktivním. Spojení A řetězce ricinu s ligandem (CBEL) umožňuje A řetězci molekuly ricinu vstup do buňky pomocí receptorem zprostředkované endocytózy, výsledkem čehož je aktivní cytotoxin.

Příklady provedení vynálezu

V příkladu 1 se kompozice tvoří chemickou konjugací; a v příkladu 2 se kompozice tvoří jako rekombinantni fúzní protein.

Příklad 1

Chemická konjugace ligandu (CBEL) a ricinu A.

Chemická konjugace ligandu (CBEL) mající aminokyselinovou sekvenci Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (SEQ ID č:l) s cytotoxickým chemickým činidlem, kterým je peptid ricin A, pro ilustraci proběhla ve dvouch stupních, jak ukazují obrázky 1A a 1B.

V prvním stupni se ligand (CBEL) (připravený firmou Peptide International, Kentucky, USA) aktivuje reakcí s esterem m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysulfosukcinimidu (sulfo-MBS; Pierce, Rockford, Illinois, USA) v podstatě podle instrukcí výrobce. Ve stručnosti, ligand (GBEL) se smíchá se sulfo-MBS v molárním poměru 1:10 v tlumívém roztoku PBS (20 mM fosforečnan sodný, 0,15 M chlorid sodný, pH7) . Směs se nechá stát dvě hodiny při teplotě místnosti a výsledný aktivovaný peptid se vyčistí podle standardních metod kapalinovou chromatografií (FPLC) za použití Superose 12 (Pharmacia).

Ve druhém stupni peptid aktivovaný maleinimidem reagoval s deglykosylovaným ricinem A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA). Tyto reagencie se smíchají v molárním poměru 1:5 v tlumí vém roztoku PBS a směs se nechá stát 2 h. při teplotě místnosti. Nezreagované molekuly peptidu se od konjugátu ligand (GBEL)-ricin A odstraní dialýzou probíhající přes noc při teplotě 4°C přes membránu s hraniční hodnotou 6 až 8 kilodaltonů.

Molekulární váha výsledné kompozice je okolo 32 kD a odhadla se pomocí gelové elektroforézy na 10% SDS-PAGE gelu (10 % agaróza rozpuštěná v pufru, kterým je upravený roztok dodecylsulfátu sodného), jak se popisuje v publikaci U. Laemmli, 227 Nature 680 (1970) . Kompozice připravená podle tohoto příkladu obsahuje jeden ligand (GBEL) na jednu molekulu ricinu A. Trojrozměrné počítačové modelování ukazuje, že ligand (GBEL) je nejpravděpodobněji vázán k Cys zbytku na C-konci molekuly ricinu A, protože Cys zbytek Nkonce je uvnitř stočené molekuly ricinu A.

Příklad 2

Rekombinantni protein obsahující ligand (GBEL) a ricin A

Fúzní protein obsahující ligand (CBEL) mající aminokyselinovou sekvenci Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (SEQ ID č:1) a cytotoxické chemické činidlo, kterým je peptid ricin A, se tvoří prostřednictvím genového inženýrství. Ve stručnosti, fúzní protein v tomto příkladu vzniká vložením syntetického oligonukleotidu, který kóduje ligand (GBEL), do expresivního vektoru vhodného pro mikroorganizmus E. coli downstream od polynukleotidu (po směru překladu), který kóduje ricin A, následnou expresí s vysokým výtěžkem fúzního proteinu v hostitelském organizmu E. coli. Fúzní protein se čistí z buněčného lyzátu afinitní chromatografií.

S odvoláním na obrázky 2A až 2D fúzní protein obsahující ligand (CBEL) a ricin A se produkuje genovým inženýrstvím jak je dále uvedeno. Expresivní vektor pTrcHis B vhodný pro mikroorganizmus E. coli (Invitrogen, San Diego, California) (obr. 2A) , který obsahuje vícenásobné klónovací místo (MCS) downstream (po směru překladu) počátečního místa translace (ATG), se štěpí restrikčními endonukleázami Ncol a BamHI a výsledné kohézní konce se působením T4 DNK polymerázy změnily na tupé konce. Tento lineární fragment se znovu ligoval za vzniku vektoru pTrc B (obr. 2B) . Z plazmidu pAKG (plazmid pAKG poskytl Robert Weaver, University of Kansas, Lawrence; a je popsán v publikaci R.C. Hailing et al., 13 Nucleic Acids Res. 8019 (1985)) se izoluje BamHI-Kpnl fragment, který je 863 bp velký a kóduje ricin A. Tento fragment se klonuje do plazmidu pTrc B, jenž se štěpil restriktázami BamHI a KpnI. Výsledná konstrukce se štěpí restriktázou BamHI a pomocí T4 DNK polymerázy se upravují kohézní konce na tupé a lineární fragment se znovu liguje za vzniku správného čtecího rámce pro translaci klonovaného genu (obr. 2C).

Výsledný upravený vektor pTrc B obsahující sekvenci kódující ricin A se dále štěpí restriktázami KpnI a EcoRI za účelem ligace následujícího syntetického oligonukleotidu, který obsahuje nukleotidové zbytky kódující ligand (CBEL) a kohézní konce slučitelné s KpnI a EcoRI klónovacími místy.

SEQ	ID	č:	4)	5' -	CA	AAT	TTT	AAT	GAA	GAT	CCT
SEQ	ID	č:	5)	3'- CAT	GGT	TTA	AAA	TTA	CTT	CTA	GGA
SEQ	ID	č:	6)			Asn	Phe	Asn	G1U	Asp	Pro
SEQ	ID	č:	4)	GGT	TTT	TTC	AAT	GTT	GAG	CAT	CAT
SEQ	ID	č:	5)	CCA	AAA	AAG	TTA	CAA	CTC	GTA	GTA
SEQ	ID	č:	6)	Gly	Phe	Phe	Asn	Val	Glu	His	His
SEQ	ID	č:	4)	CAT	CAT	CAT	CAT	TAA	G	-3'
SEQ	ID	č:	5)	GTA	GTA	GTA	GTA	ATT	CTT	AA	-5'
SEQ	ID	č:	6)	His	His	His	His

Výsledný vektor (Obr. 2D) obsahuje hybridní gen kódující fúzní protein ricin A - proteázové místo - ligand - His 6, kde proteázové místo značí místo štěpitelné proteázou nebo mezerník citlivý na proteázu jak je shora popsáno, ligand značí ligand (CBEL) a His 6 značí oblast šesti po sobě jdoucích His zbytků, jejichž funkce bude popsána níže. Výsledný plazmid se používá k transformaci buněk E. coli a vybrané trans formanty se kultivují v LB mediu jak se uvádí v publikace J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972). Buňky se pak lyžují a rekombinantní fúzní protein se čistí afinitní chromatografií na koloně obsahující pryskyřici obohacenou niklem (PROBOND, Invitrogen, San Diego, California). Šest His zbytků na C-konci fúzního proteinu se elektrostaticky váže na atomy niklu, které se nacházejí na PROBOND pryskyřici. Pryskyřice obsahující navázaný fúzní protein se promývá, aby se odstranily nečistoty. Elektrostatické vazby se pak rozruší a fúzní protein se vymývá elučním pufrem obsahujícím imidizol. His zbytky se z pryskyřice obohacené niklem vytěsní tímto pufrem. Při čištění fúzního proteinu se postupuje podle návodu výrobce.

Příklad 3

Fúzní protein obsahující ligand (CBEL) mající aminokyselinovou sekvenci Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (SEQ ID č:l) a cytotoxické chemické činidlo, kterým je peptid ricin A, se tvoří prostřednictvím genového inženýrství jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že oblast obsahující šest po sobě jdoucích His zbytků se vynechá. Do restriktázami EcoRI a KpnI štěpeného upraveného vektoru pTrc B se liguje následující syntetický oligonukleotid, který obsahuje nukleotidové zbytky kódující ligand (CBEL) a kohézní konce slučitelné s KpnI a EcoRI klónovacími místy.

(SEQ	ID	č:7)		5'-	CA	AAT	TTT	AAT	ATC	CAT	CTC
(SEQ	ID	č: 8)	3' -	CAT	GGT	TTA	AAA	TTA	TAG	GTA	GAG
(SEQ	ID	č: 9)				Asn	Phe	Asn	lie	His	Leu
(SEQ	ID	č:7)		ACG	GGT	GAA	GAT	CCT	GGT	TTT	TTC
SEQ	ID	č: 8)		TGC	CCA	CTT	CTA	GGA	CCA	AAA	AAG
SEQ	ID	č:9)		Thr	Glu	Glu	Asp	Pro	Gly	Phe	Phe
SEQ	ID	č:7)		AAT	GTT	GAG	TAA	G	-3'
SEQ	ID	č: 8)		TTA	CAA	CTC	ATT	CTT	AA	-5'
SEQ	ID	č: 9)		Asn	Val	Glu

Výsledný vektor obsahuje hybridní gen kódující fúzní protein ricin A - proteázové místo - ligand (CBEL), kde proteázové místo značí místo štěpitelné proteázou nebo mezerník citlivý na proteázu jak je shora popsáno. Výsledný plazmid se používá k transformaci buněk E. coll a vybrané transformanty se kultivuji v LB mediu. Za účelem izolace exprimováného proteinu se buňky lyžuji kultivací s lysozymem (1 mg/ml) v prostředí 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,8 a sonikací ve třech minutových intervalech. Fúzní protein je za těchto podmínek nerozpustný na rozdíl od většiny proteinů, které se vyskytují v buňkách E. coli. Lyzát se odstřeďuje při 9 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Výsledná sedlina obsahující fúzní protein se před opětným odstředěním resuspenduje a sonikuje po dobu 1 minuty. Jednotlivé kroky resuspenzace, sonikace a odstředění se třikrát opakují. Konečná sedlina obsahující poměrně čistý fúzní protein se rozpustí v roztoku, který obsahuje 6 M močovinu a 5 M dithiothreitol. Rozpuštěný fúzní protein se renaturuje sekvenční dialýzou proti 4M močovině; 2 M močovině; a pufru, který obsahuje 20mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný a jehož pH je 7,8.

Příklad 4

Fúzní protein obsahující ligand (CBEL) mající aminokyselinovou sekvenci Glu-Asp-Pro-Gly-Phe-Phe-Asn-Val-Glu (SEQ ID č:l) a cytotoxické chemické činidlo, kterým je peptid ricin A, se tvoří prostřednictvím genového inženýrství jako v příkladu 2 s výjimkou, že do fúzního proteinu je zaveden další cysteinový zbytek. Tato konstrukce poskytuje vyšší výtěžky získatelného fúzního proteinu ve srovnání s příkladem 2, protože volný cysteinový zbytek na C^—konci řetězce ricinu A může tvořit intramolekulární disulfidovou vazbu s novým cysteinovým zbytkem místo s proteinem mikroorganizmu E. coli. Expresivní vektor pTrcHis A (Invitrogen, San Diego, California), který je vhodný pro E. coli, a který je podobný vektoru pTrcHis B na obrázku 2A až na odlišný čtecí rámec, se štěpí restrikčními endonukleázami Ncol a BamHI. Syntetická

DNK, jenž kóduje šest po sobě jdoucích histidinových zbytků a má Ncol a BamHI kohézní konce, se pak liguje do tohoto vektoru. Plazmid pAKG se štěpí restriktázou BamHI a uvolněný 893 bp velký fragment se získá elektroelucí po elektroforéza v agarózovém gelu. Tento fragment se liguje do upraveného vektoru pTrcHis A, který se štěpí restriktázou BamHI a telecí intestinální alkalickou fosfatázou. Ligační smě se použije k transformaci kmene E. coli XL-1 (Stratagene, La Jolla, California). Dále se izolují transformanty a štěpením restriktázou BglII se určí orientace BamHI fragmentu ve vektoru. DNK z transformantu, která nese gen pro ricin A ve správné orientaci pro translaci, se štěpí restriktázami Sací a EcoRI. Do této DNK se liguje následující syntetický oligonukleotid, jenž obsahuje nukleotidové zbytky kódující ligand (CBEL) a kohézní konce slučitelné s Sací a EcoRI klónovacími místy.

SEQ

ID

č:

10)

5' -

C

GAA

GAT

CCT

GGT

TTT

SEQ

ID

č:

11)

3' -

TC

GAG

CTT

CTA

GGA

CCA

AAA

SEQ

ID

č:

1)

Glu

Asp

Pro

Gly

Phe

SEQ

ID

č:

10)

TTC

AAT

GTT

GAG

TAA

G

-3'

SEQ

ID

č:

11)

AAG

TTA

CAA

CTC

ATT

CTT

AA

-5

SEQ

ID

č:

1)

Phe

Asn

Val

Glu

Ligovaná DNK se transformuje do expresivního hostitelského E. coli kmene BLR (Novagen, Madison, Wisconsin), který je recA pozitivní, ale postrádá geny proteáz ion a ompt.

Za účelem izolace rekombinantního proteinu se kultivují transformované buňky v přítomnosti ampicilínu při teplotě 37°C. Když hodnota optické hustoty (měří se při vlnové délce 600 nm) kultury dosáhne rozmezí od 0,6 až do 0,8, přidá se takové množství isopropylthiogalaktosidu (IPTG), že konečná koncentrace je 1 mM. Isopropylthiogalaktosid (IPTG) vyvolává expresi genů. Po dalších třech hodinách růstu se buňky získají z media a suspendují se v tlumívém roztoku, který obsahuje 10 mM Tris HC1 s pH7,6, 100 mM chlorid draselný, mM EDTA, 10 mM 2-merkaptoethanol, 0,05 % Nonidet P-40 a 0,5 mg/ml lysozymu. Po patnácti minutové inkubaci v ledové lázni se výsledný lyzát sonikuje v přítomnosti 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluoridu a odstřeďuje se při 9 000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při teplotě 4°C. Rozpustné proteiny se sráží síranem amonným (přidává se takové množství až dojde ke 40 % nasycení), sraženina se rozpustí a dialyzuje se proti pufru obsahujícímu 10 mM Tris HC1 s pH7,4 a 100 mM chlorid draselný. Dialyzát se nanese na kolonu se silným anexem (Q Sepharose Fast Flow, Pharmacia) , která se ekvilibruje stejným pufrem. Za těchto podmínek se většina bakteriálních proteinů váže na kolonu a frakce, která se neváže, obsahuje v podstatě čistý rekombinantní protein. Rekombinantní protein se dále čistí dialýzou proti roztoku obsahujícímu 4 M močovinu, 20 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, jehož pH je 7,8. Dialyzát prochází kolonou obsahující pryskyřici obohacenou niklem (PROBOND pryskyřice) a ta pětkrát promývá roztokem obsahujícím 4 M močovinu, 20 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, 5 mM imidizol, pH roztoku je 6,0. Šest histidinových zbytků v rembinantnim proteinu způsobuje, že se rekombinantní protein váže afinitní interakcí na pryskyřici. Kolona se promyje ještě dvakrát pufrem, který se liší pouze v koncentraci imidizolu, jež vzroste na 30 mM. Rekombinantní protein se vymývá do pufru, který se liší pouze tím, že koncentrace imidizolu je 300 mM. Vymytý protein se pak renaturuje a stáčí se první dialýzou proti 2 M močovině a pak proti roztoku obsahujícímu 20 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, jehož pH je 7,8.

Přiklad 5

Cílené zavedení cytotoxinu do B buněk.

Pro ilustraci cíleného zavedení chemického činidla do B buněk exprimujících receptor CR2 se zde popisuje použití kompozic ligandu (CBEL) a chemického činidla podle vynálezu s odvoláním na příklady, ve kterých se kompozice ricinu A a ligandu (CBEL) zavádí do Raji B lymfoblastoidních buněk in vitro. Výsledkem je specifický cytotoxický účinek na B buňky exprimuj id receptor CR2 .

Při předběžném předvedení se kultivuje 1 x 10⁶ CR2 ⁺ Ráji B lymfoblastoidních buněk (symbol CR2⁺ znamená, že buňky exprimuji receptor CR2) po dobu 24 hodin při teplotě 37°C v 1 ml media RPMI 1640 (Hyclone, Logan, Utah) bez další úpravy nebo v 1 ml media obsahující 20 μg kompozice ricin A-ligand (CBEL), jak se uvádí v příkladu 1 nebo v 1 ml media obsahující samotný ricin A. Po inkubacích se mrtvé buňky určí barvením trypanovou modří a počítají se hemacytometrem za použití invertního mikroskopu. Trypanová modř vniká do mrtvých buněk a zbarvujej je namodro. Část buněk se dvakrát ředí v 0,4 % barvivu trypanové modři (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) a před počítáním se inkubují po dobu 5 minut. Procento buněk schopných samostatné existence se vypočítá podle algoritmu: počet neobarvených buněk na jednotku objemu děleno celkovým počtem obarvených a neobarvených buněk násobeno stem.

Buňky, na něž působí samotný ricin A a kontrolní buňky se jeví být nepoškozeny. Okolo 99% buněk, na něž působí kompozice ricin A-ligand (CBEL) umírá (1% buněk přežívá). Vzhledem k tomu, že ricin A působí toxicky pouze když je internalizovaný do buňky, tyto výsledky ukazují, že kompozice ricin A-ligand (CBEL) podle vynálezu vede k internalizaci cytotoxického chemického činidla.

Příklad 6

Účinek rekombinantního fúzního proteinu ligand (CBEL)ricin A, podle příkladu 2, se testuje na CR2⁺ lidských B lymfoblastoidních buňkách (Ráji) (symbol CR2⁺ znamená, že buňky exprimuji receptor CR2) a CR2” T (HSB2) buňkách (symbol CR2‘ znamená, že buňky neexprimují CR2 receptor), jak je popsáno dále. Suspenze buněk (počet buněk v suspenzi je 1 x 10^s) se dokonale smíchá s proměnnými koncentracemi čištěného rekombinantního fúzního proteinu v 1 ml media a inkubuje se po dobu 24 hodin při teplotě 37°C. Po té se hodnotí schopnost buněk samostatně existovat pomocí barvení buněk trypanovou modří jako v příkladu 5. Jak ukazuje obrázek 3, odpověď buněk exprimující receptor Cr2 (CR2⁺) (tmavé sloupce) na působení konjugátu závisí na jeho dávce, zatímco buňky bez exprese receptoru CR2 (CR2) (světlé sloupce) nejsou uvedeným působením ovlivněny. Jestliže koncentrace fúzního proteinu je 50 μg/ml, přežívá méně než 10% B buněk exprimujících receptor CR2 a 100% buněk bez exprese receptoru CR2. Působení na oba typy buněk buď samotným ligandem (CBEL) nebo rekombinantním ricinem A nemá žádný účinek, což podporuje závěr, že toxický účinek rekombinantního fúzního proteinu ligand (CBEL)-ricin A na buňky exprimující receptor CR2 je výsledkem internalizace rekombinantního fúzního proteinu přes receptor CR2 na B buňkách.

Příklad 7

Postupuje se podle postupu popsaném v příkladu 6 s výjimkou, že procento buněk schopných samostatné existence se určí kolorimetrickým způsobem použitím tetrazoliové sloučeniny (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3 karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazoliová vnitřní sůl; MTS)) a činidla, které váže elektrony (fenazinmethosulfat; PMS). Činidlo MTS je buňkami biologicky redukováno na formazan, který je rozpustný v mediu pro kultivaci tkáňových kultur. Absorbance formazanu se měří při vlnové délce 490 nm přímo na testovacích destičkách, jež obsahují 96 jamek, bez dalšího zpracování. Množství formazanu měřené absorbancí při vlnové délce 490 nm je přímo úměrné počtu živých buněk v kultuře. Činidla použitá při MTS testu dodala firma Promega Corp. (Madison, Wisconsin). Výsledky získané tímto způsobem jsou v podstatě shodné s výsledky uvedenými v příkladu 6.

Příklad 8

Účinek rekombinantiho fúzního proteinu ligand (CBEL)ricin A, podle příkladu 3, se testuje na CR2⁺ lidských B lymfoblastoidních buňkách (Ráji) (symbol CR2⁺ znamená, že buňky exprimují receptor CR2) a CR2“ lidských T (HSB2) buňkách (symbol CR2” znamená, že buňky neexprimují receptor CR2) podle postupu popsaném v příkladu 6. Výsledky jsou v podstatě podobné těm uvedeným v příkladu 6.

Příklad 9

Účinek rekombinantiho fúzního proteinu ligand (CBEL)ricin A, podle příkladu 4, se testuje na CR2⁺ lidských B lymfoblastoidních buňkách (Ráji) (symbol CR2⁺ znamená, že buňky exprimují receptor CR2) a CR2~ lidských T (HSB2) buňkách (symbol CR2~ znamená, že buňky neexprimují receptor CR2) podle postupu popsaném v příkladu 6. Výsledky jsou v podstatě podobné těm uvedeným v příkladu 6.

Kompozice ligand (CBEL)-chemické činidlo podle vynálezu se používá pro cílově specifické zavedení chemického činidla do buněk exprimujících receptor CR2 . Obvykle k tomu dochází, když jsou buňky exprimující receptor CR2 v kontaktu s kompozicí za podmínek, při kterých ligand CBEL vyvolá endocytózu kompozice do buněk exprimujících receptor CR2 . Chemické činidlo pak působí na cílové buňky nebo v cílových buňkách, do kterých se kompozice internalizuje. Požadovaný účinek aktivního činidla se může omezit na ty buňky, které mají CR2⁺ fenotyp (exprimují receptor CR2).

Například kompozice ligand (CBEL)-cytotoxické činidlo podle vynálezu se používá in vivo jako účinný antinádorové agents, které selektivně zabijí CR2⁺ B buňky (B buňky exprimující receptor CR2). Výhodné je systémové podávání kompozice subjektu. Typické způsoby aplikace kompozice jsou subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní injekce nebo intraperitonální podávání. Injekční přípravky se pro tyto účely připravují v běžných formách, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze nebo jako pevné formy vhodné pro přípravu kapalných roztoků nebo suspenzí před použitím nebo jako emulze. Pro přípravu těchto forem se používá například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol a podobně; dále se může přidat, je-li to vyžadováno, malé množství pomocných látek, jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, tlumící roztoky a podobně.

Ke kontaktu buněk s kompozicí může dojít in vivo nebo in vitro. Buňky exprimující receptor CR2 mohou tvořit (a ve většině případů se očekává, že tvoří) subpopulaci smíšené populace buněčných tupů; ligand peptidů podle vynálezu může zprostředkovat receptor CR2-specifickou endocytózu konjugátu do buněk exprimujících receptor CR2.

Chemické činidlo může vykazovat v cílových buňkách libovolný z rozličných žádaných účinků. Jak bylo dříve zmíněno, v některých zvláště výhodných provedeních vynálezu chemické činidlo působí na buňku pouze, když anebo hlavně, když je internalizováno do buňky.

Příklad 10

Cílené zavedení ligandu (CBEL)-antigenního činidla do B buněk.

Kompozice obsahující ligand (CBEL) a antigen podle vynálezu se podává teplokrevným zvířatům za účelem cíleného vyvolání imunní odezvy v CR2 ⁺ buňkách (symbol CR2⁺ značí buňky exprimující receptor CR2). Ligand (CBEL) zajišťuje receptorem CR2 zprostředkovanou internalizaci atigenu do buněk a může v cílových buňkách vyvolat aktivaci komplementu, jejíž průběh není závislý na protilátkách. Což znamená, že podle vynálezu cílové buňky mohou být indukovány za účelem vyvolání imunní odezvy na antigen, s kterým se nikdy nesetkaly.

Chemická konjugace ligandu (CBEL), který má aminokyselinovou sekvenci popsanou jako SEQ ID č:2, se aktivuje a pak se ligand spojuje s kuřecím lysozymem (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) způsobem popsaným v příkladu 1. Konjugát ligand (CBEL)-lysozym podává myši systémovým způsobem. C3dg CBEL (SEQ ID č:2) (C3dg CBEL je ligand odvozený z peptidů fragmentu komplementu C3dg) poskytuje vazebnou specifitu k myšším B buňkám a vyvolává receptorem CR2 zprostředkovanou endocytózu konjugátu. Konjugát pak pomocí cílových B buněk vyvolá imunní odezvu na epitopy vzniklé na konjugátu, zahrnujícíjící epitopy, které se nachází pouze na lysozymové části konjugátu. Výsledky tohoto přikladu se mohou v podstatě duplikovat sestavením fúzniho proteinu ligand (CBEL)-lysozym.

Příklad 11

Způsob léčení leukemie lidské B buňky spočívá v (a) získání kompozice podle vynálezu obsahující ligand (CBEL) takový, jako je ligand odvozený z membránového glykoproteinu Epstein-Barrové viru (EBV CBEL; SEQ ID č:l) nebo peptid vykazující s ním podstatnou homologii, a cytotoxin takový jako je ricin A, a (b) systémové podávání účinného množství kompozice. Zmíněná kompozice se například připravuje způsobem popsáným v příkladu 3. EBV CBEL směřuje do zralých lidských B buněk a ricin A vykazuje cytotoxický účinek na libovolnou buňku, do které je zaveden. Účinné množství kompozice se jedinci podává systémovým způsobem. Kompozice tedy vstupuje do krevního řečiště a spojuje se s B buňkami. Ligand (CBEL) způsobuje, že se kompozice váže na receptor CR2 na B buňkách a vyvolá internalizaci kompozice endocytózou. Cytotoxin ricin A pak usmrtí buňky rozrušením ribozómů. Tento proces snižuje počet maligních B buněk v těle jedince, čímž vykazuje pozitivní účinek v léčbě této nemoci.

Příklad 12

Při léčení autoimunních nemocí, například erytématozní lupus nebo revmatoidni artritida, se postupuje stejným způsobem jako v příkladu 11. Cytotoxin působí po své internalizaci do B buněk jejich smrt, čímž snižuje počet B buněk produkujících autoprotilátky a vykazuje pozitivní účinek při léčení uvedených nemocí.

Seznam sekvenci

Informace o sekvenci č. 1 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) znázornění sekvence SEQ ID č: 1

Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu

5

Informace o sekvenci č. 2 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 11 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) znázornění sekvence SEQ ID č: 2

Glu Asp Pro Gly Lys Asn Leu Tyr Asn Val Glu 1 5 10

Informace o sekvenci č. 3 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 4 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) znázornění sekvence SEQ ID č: 3

Glu Asp Pro Gly

Informace o sekvenci č. 4 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 60 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:4

CAAATTTTAA TGAAGATCCT GGTTTTTTCA ATGTTGAGCA TCATCATCAT CATCATTAAG 60

Informace o sekvenci č. 5 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 68 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:5

AATTCTTAAT GATGATGATG ATGATGCTCA ACATTGAAAA AACCAGGATC TTCATTAAAA

TTTGGTAC 68

Informace o sekvenci č. 6 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 18 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) znázornění sekvence SEQ ID č: 6

Asn Phe Asn Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu His His 1 5 10

His His His His

Informace o sekvenci č. 7 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 57 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:7

CAAATTTTAA TATCCATCTC ACGGGTGAAG ATCCTGGTTT TTTCAATGTT GAGTAAG 57

Informace o sekvenci č. 8 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 65 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:8

AATTCTTACT CAACATTGAA AAAACCAGGA TCTTCACCCG TGAGATGGAT ATTAAAATTT 60 GGTAC 65

Informace o sekvenci č. 9 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 17 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) znázornění sekvence SEQ ID č: 9

Asn Phe Asn lie His leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe 1 5 10

Asn Val Glu 15

Informace o sekvenci č. 10 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 32 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:10

CGAAGATCCT GGTTTTTTCA ATGTTGAGTA AG 32

Informace o sekvenci č. 11 (i) charakteristiky sekvence:

(A) délka: 40 párů bázi (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězová (D) topologie: lineární (xi) znázornění sekvence SEQ ID č:ll aattcttact caacattgaa aaaaccagga tcttcgagct 40

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice pro specifické intracelulárni zavedení chemického činidla do buňky nesoucí receptor CR2 v populaci buněk zahrnující buňky bez receptoru CR2, přičemž kompozice v podstatě obsahuje ligand schopný vázat se na zmíněný receptor CR2 a vyvolat receptorem zprostředkovanou endocytózu a chemické činidlo spojené se zmíněným ligandem, vyznačující se tím, že uvedené chemické činidlo je schopné vyvolat žádaný účinek, když je intracelulárně zavedeno do zmíněné buňky nesoucí receptor
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněná buňka nesoucí receptor CR2 je B lymfocyt.
3. Kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že zmíněný ligand obsahuje peptid s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID č:l, SEQ ID č:2, SEQ ID č:3, SEQ ID č:6, SEQ ID č:9.
4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo je vybráno ze skupiny obsahující cytotoxiny, transformující nukleové kyseliny, regulátory genů, značící látky, antigeny a léčiva.
5. Kompozice podle nároku 4 dále obsahuje mezerník kovalentně vázaný na zmíněný ligand a zmíněné chemické činidlo, přičemž je mezi ně vsunutý.

SUBSTITUTE SHEET
6. Kompozice vyznačující se biologicky rozložitelný. podle tím. ž e nároku 5, zmíněný mezerník je
7. Kompozice vyznačuj i obsahuje peptid. c i se podle tím, ž e nároku zmíněný 6, mezerník
8. Kompozice vyznačuj i c i se podle tím, ž e nároku ligand je 7, peptid, který má sekvenci zde uvedenou jako SEQ ID č:l a zmíněné chemické činidlo je ricin A.
9. Kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že zmíněný mezerník není biologicky rozložitelný.
10. Kompozice podle nároku 4 dále obsahuje nosič vybraný ze skupiny obsahující ve vodě rozpustné polyméry, lipozómy a částice.
11. Kompozice podle nároku 10, vyznačující se tím, že zmíněný nosič je ve vodě rozpustný polymer a zmíněná kompozice se charakterizuje vzorcem:

[L-S_a]b - C - [S_e-A]_fve kterém

L je zmíněný ligand schopný vázat se na receptor CR2 a vyvolat jeho endocytózu,

A představuje zmíněné chemické činidlo,

S označuje mezerník,

C představuje zmíněný ve vodě rozpustný polymér, jehož funkční skupiny jsou slučitelné se zmíněným ligandem, s chemickým činidlem a s mezerníkem pomocí tvořících se kovalentních vazeb, a má hodnotu 0 nebo 1, e má hodnotu 0 nebo 1, b je celé číslo, které má hodnotu nejméně1, f je celé číslo, které má hodnotu nejméně1.
12. Kompozice podle nároku11, vyznačující se tím, že C je vybrán ze skupiny obsahující dextran, inulin, poly(L-lysin), syntetické polyméry obsahující methakrylamid.
13. Způsob specificky zavádějící chemické činidlo in vitro do buňky nesoucí receptor CR2 v populaci buněk zahrnující buňky bez receptoru CR2, vyznačující se tím, že (a) poskytuje kompozice pro specifické intracelulární zavedení chemického činidla do buňky nesoucí receptor CR2 v populaci buněk zahrnující buňky bez receptoru CR2, přičemž kompozice v podstatě obsahuje ligand schopný vázat se na zmíněný receptor CR2 a vyvolat receptorem zprostředkovanou endocytózu a chemické činidlo spojené se zmíněným ligandem je schopné po své internalizaci do zmíněné buňky nesoucí receptor CR2 vyvolat žádaný účinek; a (b) umožňuje,že zmíněná populace buněk přichází do kontaktu s účinným množstvím kompozice za podmínek, při kterých se ligand váže na zmíněný receptor CR2 nacházející se na buňkách nesoucích receptor CR2 a vyvolává endocytózu zmíněné kompozice.

SUBSTITUTE SHEET
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že zmíněná buňka nesoucí receptor CR2 je B lymfocyt.
15. způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že zmíněný ligand obsahuje peptid s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID č:1, SEQ ID č:2, SEQ ID č:3, SEQ ID č:6, SEQ ID č: 9.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo je vybrané ze skupiny obsahující cytotoxiny, transformující nukleové kyseliny, regulátory genů, značící látky, antigeny a léčiva.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že zmíněná kompozice dále obsahuje mezerník kovalentně vázaný na zmíněný ligand a zmíněné chemické činidlo, přičemž mezerník je mezi ně vsunutý.
18. Způsob podle vyznačující se tím, biologicky rozložitelný.

nároku 17, ž e zmíněný mezerník je
19. Způsob vyznačuj ící obsahuje peptid. podle se tím, ž e nároku zmíněný 18, mezerník
20. Způsob vyznačuj ící podle se tím, ž e nároku zmíněný 19, ligand je ——— ™„ —----SUBSTITUTE SHEET peptid, který má sekvenci zde uvedenou jako SEQ ID č:l a zmíněné chemické činidlo je ricin A.
21. Způsob podle nároku17, vyznačující se tím, že zmíněný mezerník není biologicky rozložitelný.
22. Způsob podle nároku16, vyznačující se tím, že zmíněná kompozice dále obsahuje nosič vybraný ze skupiny obsahující ve vodě rozpustné polyméry, lipozómy a částice.
23. Způsob podle nároku22, vyznačující se tím, že zmíněný nosič je ve vodě rozpustný polymér a zmíněná kompozice se charakterizuje vzorcem:

[L-S_a]b - C - [Se-A]_f ve kterém

L je zmíněný ligand schopný vázat se na receptor CR2 a vyvolat jeho endocytózu,

A představuje zmíněné chemické činidlo,

S označuje mezerník,

C představuje zmíněný ve vodě rozpustný polymér, jehož funkční skupiny jsou slučitelné se zmíněným ligandem, s chemickým činidlem a s mezerníkem pomocí tvořících se kovalentních vazeb, a má hodnotu 0 nebo 1, e má hodnotu 0 nebo 1, b je celé číslo, které má hodnotu nejméně1, f je celé číslo, které má hodnotu nejméně1.
24. Způsob podle nároku23, vyznačující se tím, že C je vybrán ze

SUBSTITUTE SHEET

dextran, inulin^ pqly (ž-1 ysiM, syntetické methakrylamid. — skupiny obsahující polyméry obsahující
25. Rekombinantní vektor přizpůsobený pro transformaci hostitele, přičemž zmíněný vektor nese segment DNK kódující fúzní protein, který obsahuje ligand vázající se na receptor CR2 a vyvolávající endocytózu a chemické činidlo.
26. Rekombinantní vektor podle nároku 3/, vyznačující se tím, že zmíněný vektor zahrnuje plazmid.
27. Rekombinantní vektor podle nároku 38, vyznačující se tím, že zmíněný ligand obsahuje peptid s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID č:l, SEQ ID č:2, SEQ ID č:3, SEQ ID č:6, SEQ ID č:9 a sekvence vykazující s nimi podstatnou homologii.
28. Rekombinantní vektor podle nároku 39, vyznačující se tím, že zmíněný ligand má aminokyselinovou sekvenci zde uvedenou jako SEQ ID č:l.
29. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, činidlo obsahuje cytotoxin.
30. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, obsahuje ricin A.
31. Rekombinantní vektor vyznačující se tím, činidlo obsahuje antigen.

podle nároku 40, ž e zmíněné chemické podle nároku 41, ž e zmíněný cytotoxin podle nároku 40, ž e zmíněné chemické
32. Rekombinantní vektor podle nároku vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo je vybráno ze skupiny obsahující regulátory genů, značící látky a léčiva.
33. Segment DNK kódující fúzní protein, který obsahuje ligand vázající se na receptor CR2 a vyvolávající endocytózu a chemické činidlo.
34. Segment DNK podle nároku 45, vyznačující se tím, že zmíněný ligand obsahuje peptid s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující SEQ ID č:l, SEQ ID č:2, SEQ ID č:3, SEQ ID č:6, SEQ ID č:9 a sekvence vykazující s nimi podstatnou homologii.
35. Segment DNK podle nároku 46, vyznačující se tím, že zmíněný ligand má aminokyselinovou sekvenci zde uvedenou jako SEQ ID č:l.
36. Segment DNK podle nároku 47, vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo obsahuje cytotoxin.
37. Segment DNK podle nároku 48, vyznačující se tím, že zmíněný cytotoxin obsahuje ricin A.
38. Segment DNK podle nároku 47, vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo obsahuje antigen.
39. Segment DNK podle nároku 47, vyznačující se tím, že zmíněné chemické činidlo je vybráno ze skupiny obsahující regulátory genů, značící látky a léčiva.