CZ85393A3 - Stabilized active analogs of growth hormone releasing factors - Google Patents

Description

Vynález se týká peptidů ovlivňujících činnost podvěsku mozkového u lidí a jiných živočichů, především savců. Jmenovitě je tento vynález zaměřen na peptidy, které podporují uvolňování růstového hormonu hypofýzou. Peptidy podle tohoto vynálezu jsou účinné in vivo, stálejší v plazmě a vybrané peptidy jsou stálejší i ve vodném prostředí při neutrálním pH než přirozené řetězce těchto látek.

Dosavadní stav techniky

Fyziologové věděli již. dávno, že hypothalamus kontroluje činnost . adenohypofýzy tak, že hypothalamus produkuje zvláštní látky, které povzbuzují nebo inhibuji. vylučování různých hormonů. V roce 1982 byly izolovány z lidských tumorů slinivky lidské pankreatické.(rakovinné) faktory (hpGRF). Byly vyčištěny, charakterizovány , syntetizovány a zjistilo se, že podněcují, uvolňování růstového hormonu (GH) hypofýzou. Guillemin R. , a j.: Science 218,585-585(1982). Od té doby byly též charakterizovány a syntetizovány odpovídající hypothalamické faktory uvolňující GH (GRF) u jiných druhů, včetně krys, vepřů, ovcí, skotu a koz i lidí.

Bylo zjištěno, že lidský hypothalamický GRF (hGRF) má stejné složení jako phGRF. a to: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-PheThr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-LysLeu-Leu-Gln-Asp-1le-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-

G1u-Arg-G1y-A1a-Arg-A1a-Arg-Leu-NH2.

Krysí GRF (rGRF) má, jak bylo zjištěno, skupinu Ser v poloze 8 a vzorec: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Arg-11e-Leu-G1y-G1n-Leu-Tyr-A1a-Arg-Lys-Leu-Leu-Hi s-G1 uΓ.1e-Met-As n-Arg-G1n-G1n-G1y-G1u-Arg-Asn-G1n-G1u-G1u-G 1n-ArgSer-Arg-Phe-Asn-OH. (Viz na příklad US patent 4,595,676).

Bylo zjištěno ,že hovězí GRF (bGRF) má.vzorec H-Tyr-AiaAsp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-LeuSer-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1e-Met-Asn-Arg-G1n-G1n-G1yG1u-Arg-Asn-G1n-G1u-G1n-G1y-A1a-Lys-Va1-Arg-Leu-NH 2.

Vepřový GRF má skupinu Ser v poloze 28.

Bylo sděleno, že přírodní řetězce GRF jsou rychle deaktivovány enzymy krevní plazmy. Ry„chlý.„r.oxpad-.je vyvolán arušením vazby 2-3 peptidu dipeptidylpeptidázou, typ IV (DPP-IV), která byla; dříve též označována jako dipeptidýiaminopeptidáza-IV. Frohman, L.A. aj . : J.Clin. Invest. 78., 906-913 (1986).

Metabolická stabilita GRF a různé metody ochrany GRF peptidů proti účinku dipeptidylpeptidázy byly studovány mezi jinými Felix aj.: Syntéza a biologická aktivita nových lineárních a Cyklických analogů GRF v Peptides. Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G.R.Marshal1, ESCOM Sci. Publishers, Leiden,str. 465-467,(1988). Sdělili, že GRF analogy, substituované desNHj-Tyr v poloze 1 a nebo D-Ala v poloze 2.mají zvýšenou stabilitu N koncových skupin vůči enzymatické degradaci. Tato informace byla nedávno potvrzena Frohmanem a j., Dipeptidylpeptidáza-IV a trypsinu podobná enzymatická degradace hormonu uvolňujícího lidský růstový- hormon v plazmě. J. Cli-n. Invest. 83, 1533-1540 (1989). Mimo to posledně jmenovaná skupina ukázala, že N-acetylace a N-methylace N-koncové skupiny tyrosinu nebo substituce D-Tyr-1 v GRF úplně inhibují hydrolýzu v poloze 2-3. Na druhé straně, alfa methylace Tyr-1 pouze částečně bránila degradaci DFP-IV.

Murphy, W.A. a Coy D.H., Dlouhodobě účinné alkylované analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon, Peptide Research 1, 36-41, (1988), popisují analogy GRF, které ukazuji zvýšenou odolnost vůči enzymatické* degradaci jako. důsledek N-alkyláce postranních skupin lysinů v peptidovém řetězci.

Řetězce přirozeného . GRF mají v poloze 15 Gly zbytek. Je známo, že analogy s Ala nebo Leu v poloze 15 mají zvýšenou schopnost uvolňovat GH. Viz na příklad US patenty 4,649,131 a 4,, 73.4,.399.-jakož i^L-i-ng-N .- -aj .'--Quo -vadis Symposium, Sanofi Group, 29-30. květen 1985, Toulouse-Labege (str. 309-322).

....Subsý-ituce Gly^-lS'Val / nebo álfa-aminoisomáselnou kyselinou rovněž zvyšovaly účinnost GRF'analogů, Felix\j.„^Syntéza a biologická účinnost nových analogů faktoru uvolňujícího růstový hormon, v Peptides 1986, Walter de Gruyter and Co., Berlin-New York, str. 481-484 (1987).

A. M. Felix informoval o plánu syntetizovat analogy se zvýšenou anebo prodlouženou biologickou účinností zahrnující přípravu a testování Ala¹⁵h-GRF(1-29)ΝΗϊ a desNHj.-Tyr¹, „ D-Ala^, Ala*shGRF(1-29)NH2. Viz na příklad US patenty 4,649,131 a 4,734,399 jakož i A.M. Felix, E.P. Heimer, T.F. Mowles,· H. Bisenbeis, P. Leung, T.J..Lambros, M. Ahmad, C.T. Wang a Paul Brazeau: Syntéza a biologická.účinnost nových analogů'faktoru uvolňujícího růstový hormon, v Peptides

1986,'' Walter de 'Gruyter and Co., Berlin-New York, str.

4B1-484 (1987), Felix A.M,, Wang C.T, Heimer E., Fournier Á., Bolin D., Ahmad Μ. , Lambros T., Mowles T. a Miller L : Syntéza a biologická aktivita nových lineárních a cyklických analogů.GRF v Peptides. Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G.R.Marshal1, ESCOM Sci. Publishers, Leiden,str. 465-467,(1988), D. Peticlerc, H. Lapierre, G. Pelletier, P. Dubreuil, P. Gaudreau, T. Mowles, A.. Felix a P. Brazeau: Účinek .aktivních analogů lidského faktoru uvolňujícího růstový hormon (.hGRF) na uvolňováni růstového hormonu (GH) a produkci mléka u dojných krav. Meeting Abstract P223, 82nd Meeting American Dairy Sci. Assn., Columbia,

MO, 21-24 června 1987.

Analog GRF, modifikovaný Ser-2> jakož i dalších osm jiI*· Λ** . —'I··?' án Touém aj.: Amfifilní analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon (GRF): struki

TV ných modifikací téže molekuly, je pops tura peptidů a biologická aktivita in vivo. Biochem. Biophys. Rés. Commun. 139, 763-770 (1986). Tento analog má 165V aktivitu in vivo u ovcí ve srovnáni s bGRF(1-44)NH2.

US patent 4,734,399 popisuje GRF analogy, které mají Ala, N-methy1-D-Ala nebo D-Ala v poloze 2 a Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval nebo beta-Ala v poloze 15. Viz též US patent '4,649,131.

Evropská patentová přihláška Coy a Murphy, číslo publikace 0 198' 214, Application Number 86100127.9 popisuje analogy GRF s Leu nebo Phe v poloze 2 spolu s GRF peptidy, které jsou v poloze 2 substituované různými aminokyselinami přirozeně se nevyskytujícími s L nebo D-konfigurací.

Analogy GRF s velmi nízkou biologickou aktivitou, které mají Sar2 a Pro2 popisuje Coy aj.: Strategie návrhu syntetických analogu a antagonistů faktoru uvolňujícího růstový hormon, Peptides, Vol. 7, Suppl. 49-52 (1986).

Ling aj.: Analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon se . silnou, antagonistickou ..aktivitou v Peptides, Chemistry and Biology, Proc.lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G.R.Marshal1, ESCCM Sči. Publishers, Leiden,str. 484-486,(1988) informovali o řadě. analogů GRF substituovaných bud Arg nebo různými D-aminokyselinami v poloze 2. Všechny jsou méně účinné než , základní hormon'a některé z nich vykazovaly antagonistickou aktivitu.

.Předchozí vynález představuje syntetické GRF polypeptidy, které mají· zbytek. Ser .na. místě.· aminokyselin normálně., na-léza-., ných v poloze 8 a 28 polypeptidů jako prostředek inhibující chemický rozklad (deaminaci) ve vodném prostředí. Viz US patentovou přihlášku pořadové číslo 07-303,518, podanou 27. ledna 1989, a· pořadové číslo 07-323-,955 z 15., března.. 1989 . Rovněž A.R. Friedman, A,K.IchhpuraniD.M. Brown, R.M. Hillman, L.F. Krabili, R.A. Martin, H.A. Zurcher-Neely a D.M. Guido: Degradace analogů faktoru uvolňujícího růstový hormon v neutrálním vodném roztoku se vysvětluje deaminaci asparaginových zbytků. Náhrada asparaginových skupin serinem stabilizuje. Int. J. Peptide Protein Res.37, 14-20 (1991).

*1

Předchozí vynález popisuje syntetické GRF polypeptidy, které mají substituován zbytek cysteové kyseliny (Cya) místo

.....am.i.no.ky.s.e.,1 i,ny„...v._polpz,e., R3..A. Viz US patentovou přihlášku pořadové číslo 07-150,301, podanou 29. ledna 1988, a pořadové čislo 89-00245 z 27. ledna 1989.

Analog* hGRF s 29 aminokyselinami byl navržen G. Velicebim aj . Proč. Nati. Aca-. Sci. USA, Vol. 83, 5397-5399 (1986).

Má prvých šest aminokyselin u aminového konce stejných a liší se od přirozeného peptidu 13 aminokyselinami ve zbytku řetězce včetně zahrnutí Ser skupiny v poloze Θ. Amidová forma a forma volné kyseliny. analogu mají vzorec:H-Tyr-AlaAsp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tyr-Arg-Arg-Leu-Leu-Ala-Gln-Leur

Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-Leu-Leu-Ala-Arg-NH;/OH. Když byla ověřována jejich schopnost stimulovat uvolňování růstového hormonu GH v primárních kulturách buněk krysích předních hypofýz, amidový analog byl 1,57 krát silnější než hGRF(1-40J0H, zatím co volná kyselá forma měla jen 1/6 účinnosti ve stejném pokusu.

Valeaj. (US patentová přihláška pořadové číslo 053,23-3, podaná 22. května,1987 popisuje 31 zbytkové analogy hGRF, které využívají skupinu v poloze 31 s postranním funkcionář lizovaným řetězcem, který může být spojen s zvláštním proteinem. Analogy hGRF s 31 skupinami mohou též mít substituce jiných skupin, které se objevují v přirozeném řetězci GRF, jako Asn nebo Ser v poloze 6, Phe v poloze 10 nebo Ala-v poloze 15. Asn nebo Ser mohou být v poloze 28.

Je známo,že za určitých okolností jsou v přítomnosti vody deamidovány Asn skupiny polypeptidů. Avšak neni jasné, co ovlivňuje rychlosti deamidace. Na příklad v polypeptidu trypsinu jsou deamidovány jen některé Asn skupiny s částečnou sekvencí Asn-Ser, zatím co jiné deamidovány nejsou. Viz Xossia'koff A.A. : Science 240, 191-194 (1988).

Evropská patentová přihláška číslo 86308337.4, číslo publikace- 0 220 958 popisuje třídu sloučenin, které mají vzorec

H-X-Pro-Pepti.d, ve kterých X je zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny, Pro znamená přirozeně se vyskytující aminokyselinu prolin a Peptid je řetězec zbytků aminokyselin definovaný biologicky aktivním peptidem nebo proteinem.

Příklady H-X-Pro-Peptidů zahrnuji Met-Pro(faktor uvolňující růstový hormon), který může být chemicky převeden na GRF.

Analogy peptidů, které nejsou GŘF a jsou rozšířeny na t

N konci, určené pro různé účely, byly též popsány. Na příklad: M.A. Tallon .......aj.: Biochem.26,7767-7774 (1987) připravili synteticky analogy alfa reprodukčního faktoru kvasinek rozšířené na N konci s Ala, Glu-Ala, Ala-Glu-Ala nebo Glu-Ala-Glu-Ala . Tyto peptidy jsou používány při studiu vztahů mezi strukturou a aktivitou.

D. Andreu-aj.: 2Oth Eur. Peptide Symp. -Tubingen., NSR,.

4-9. září. 19.88, Symposium . Abs.tracts, s.33 syntetizovali celou,. sekvenci 64.aminokyselin prekur.sorové formy-analogu-^cecropinu A spolu s mnoha kratšími peptidy, odpovídajícími předpokládaným reakčním. meziproduktům:. Mezi. nimi .byl . úplný řetězec cecropinu rozšířený o Ala-Pro-Gly-Pro na N. konci. Byl použit k důkazu, že se rozšiřující část opravdu štěpí čištěným enzymatickým.preparátem podobným dipeptidylpeptidá-

ze,	získaným z kokonů bource cecropia. Viz	též H. Boman
a j	: J. .Biol. Chem. 264, 5852-5860 (1989).	•
G.	Kreil aj.: Eur. J. Biochem.,111, 49-58	(1980) inf.ormu-
jí ,	že melittin, hlavni složka včelího	jedu je odvozen

z pro-melittinu. Řetězec pro-melittinu se skládá z šesti X-Pro a pěti X-Ala opakovaných dipeptidických skupin. Výsledky, prezentované, KreileirT aj . naznačují, že konverse prekursorů na produkt může probíhat postupným štěpením dipeptidových jednotek'enzymem typu dipeptidylpeptidázy IV, . .přítomným v extraktech , z , j edových .ž l.áz .. ... ________ .

- δ -

c.	Mollay aj. Eur. J	. Biochem.,	160. 31-	35 (1986): Caeru-
lein	a xenopsin jsou	dva peptidy	na.lezené	v kožních sekre-
těch	Xenopus . laevis..	První má	sekvenci	Phe-Ala-Asp-Gly

a druhý Ser-Ala-Glu-Ala na rozšíření N koncové skupiny jejich odpovídajících prekursorů. Dipeptidylpeptidáza typu IV, izolovaná, z výměšků žabí kůže má specifitu vyžadovanou pro štěpeni těchto rozšíření N konců, . což vede ke konečným produktům.

D, Julius aj . Cell,32,. 839-852 (1983): Sacharomyces cervisiae alfa buňky vylučují jako kopulačni feromon alfa faktor peptid s 13 aminokyselinami. Nekopulující mutanti alfa buněk, kteří nemají dipeptidylpeptidázu vázanou na membrány, neprodukují normální alfa faktor, ale vylučuji řadu nedokonale připravených forem se strukturami Glu-Ala-Glu-Alaalfa-faktor nebo Asp-Ala-Glu-Ala-alfa-faktor, které mají výrazně sníženou biologickou aktivitu. Ukázalo se, že dipeptiff, dylpeptidáza 'vázaná na membrány je nezbytná pro normální zpracováni prekursorů alfa faktoru a že tato reakce může omezovat rychlost zrání alfa faktoru v normálních alfa buňkách kvasinek.

C.L. Choy aj. Eur. J. Biochem., 160, 267-272 (1986): Prekursor proteinu zabraňující zmrznutí novofoundlandského zimního platýze obsahuje čtyři opakované sekvence X-Pro a sedm 'X-Ala na koncové N skupině. Ačkoliv reakce prekursorů nebyly studovány, autoři uvažují, že k modifikaci prekursorů by mohlo docházet v plazmě účinkem. enzymu podobného dipeptidylpeptidáze,který by postupně odbourával dipeptidové jednotky prodlužující části a uvolňoval protein zabraňující mrznutí.

Až po prioritním datu základní patentové přihlášky Suhr aj. podali zprávu o izolaci a charakterizaci celé délky klonu cDNA kódujícího myši GRF. Předvídalo se, že zralý myši GRF je peptid s 42 aminokyselinovými skupinami a volným karboxylovým koncem. Tento peptid má valinovou skupinu v poloze

2. Ta jej odlišuje od GRF jiných druhů, které mají všechny Ala v poloze 2. Viz Mol '.“-Endocrinology, 3, 1693-1700 (1989).

Na základě úvah jiných autorů byly připraveny analogy GRF se substitucí Leu¹- /jmenovitě Thr? Ala¹⁵ Leu¹⁹Leu²⁷-bGRF(l-29)NHí, trifluoracetátová sůl, sloučenina čislo 3, Leu^{1 9} .'Leu²⁷ bGRF(1-29)NH; trif luoracetát, Ala¹5 Leu¹⁷ Leu²⁷ bGRF(1-29)ΝΗ; trifluoracetát/. Při testováni, uvolňováni růstového hormonu in .vitro za použiti buněk krysí-přední hypofýzy byly Leu¹⁹ analogy /jmenovitě Thr²¹ Ala^1ELeu¹⁹Leu²⁷-bGRF (.1-29)NH2 trif luoracetát, sloučenina číslo 3, Leu¹⁹ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH2 trif luoracetát:, Thr² Leu^{1 9} Leu²⁷bGRF(l-29)NH2 i trif.luoracetát Ala¹⁵ Leu¹⁹ Leu²⁷ bGRF(1-29)NH2 trifluorar cetát významně méně aktivní než odpovídající. Ala¹⁹ analogy..

Při zkoušeni, in vivo na rostoucích volech v dávce 10 pmol/kg nebylo množství GH uvolněné Leu¹⁹ analogy během 2 hodinového sledováni významně odlišné (p menši než 0,05) od sloučenin s Ala¹⁹ . Při sledování stability v hovězí plazmě byly sloučeniny s Leu¹⁹ stálejší než Ala¹⁹ analogy.

V molekule GRF je poloha 19 v oblasti, .která je vřetenová v prostředí podobnému membráně.: Clore G.M., Martin S.R. a Gronenborn · A.H.: J.Mol. Biol. 191,553-561 (1986). Není známo, zda úloha Ala¹⁹ skupiny v molekulách GRF je strukturní nebo zda je to receptor dotykového zbytku. Sáto K., Hotta Μ. , /Kagegama J. , Chiang T;C. , Hu H.Y. , Do-ng M-.H; a-Ling N. :

Biochem. Biophys. Res. Commun. 149 (2) 531-537 (1987),

Schiffer M. a Edmundson A.B.: Biophys. J.7,121 (1967), Substituce D-Ala¹’ za Ala¹⁵.v hGRF(1-29)ΝΗ; snížila standardní schopnost uvolňovat GH in vitro na 6% analogu s L-Ala¹⁹ při pokusu s buňkami krysí hypofýzy,. Tatáž substituce v Nle²⁷rGRF(l-29)NH2 snížila účinnost na 10% standardu v soustavě buněk hovězí hypofýzy a totožná substituce v Nle⁷⁷rGRF(1-29)NH? snížila účinnost na 30% standardu v soustavě buněk krysí hypofýzy: Rivier J.: Second International Symposium on Vasointestinal Peptide and Related Peptides, Cap ď Agde, Francie, 1985. Naopak analog GRF se

Ser¹⁷ byl stejně účinný jako hGRF(1-40) v pokusu se standar, >· ·' dním uvolňováním buňkami krysí hypofýzy: Velicebi G., Patthi

S. a Kaiser T.E.: Struktura a biologická aktivita analogů faktoru uvolňujícího růstový hormon, které mají potencionální amfifilní vřetenové karboxylové konce. Proč. Nati. Aca.

- '4

Sel.' USA, Vol. 83, 5397-5399 (1986). ,. · , Getzoff uvedl·, že v peptidovém modelu myohemerythrinu mohou Ala, Ile, Seř -a Thr substituovat Val beze ztráty vázáni protilátek, ale peptid substituovaný Leu má sníženou vazebnou schopnost. (Getzoff E.D., Gysin H.M., Rodda S.J., Alexander Η., Tainer J.A. a Lerner R.A.: Mechanizmus vázáni protilátek k proteinu. Science, 235,, 1191-1196 ,(1987).

WO 90/15821 (publikované 27 prosince 1990 tedy po datu priority předmětu této přihlášky) ' popisuje různé GRF peptidy, které mají Thr, Val nebo Ile skupiny místo zbytků aminokyselin normálně nalézaných v poloze 2, Ala v poloze 19 v kombinaci s jednou z následujících aminokyselin Ala, Val, Leu Ile nebo Gly v poloze 15. GRF peptid může mít pří11 padne zbytek Ser na místě zbytku aminokyseliny, která normálně bývá v polohách 8 a 28 polypeptidu.

Mimo to mohou být případně GRF peptidy rozšířeny na N konci alkyly Cj-Cj, benzylem, H(Y-X)_r, nebo H(Y-X)_m(Yi-Xi)p kde Y a Y^ jsou stejné nebo různé přirozeně se vyskytující aminokyseliny, s výhodou Tyr nebo Asp, X a X¹, stejné nebo různé, jsou vybrány z Thr, Ser nebo Ala, s výhodou Thr nebo Ser, n je 1-10, m je 1-5, p je 1-5.

E.F. Heilmer aj. (12th Am. Peptide Symposium, Cambridge, MA,16-22. června 1991), abstrakt číslo 32 v symposiálním Program and Abstract oznámil, že Val 2 zvyšuje odolnost -mGRF vůči štěpeni dipeptídylpeptidázou IV. Byla zveřejněna ráda analogů: hGRF. s modifikacemi v poloze 2, s důrazem na Val*. V sekci ; posterů· byly též uvedeny GRF. analogy s. Gly* ,

I1e² a Leu²

Podstata· vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je polypeptid podněcující uvolňování růstového hormonu hypofýzou (GRF peptid), který má Val nebo Ile v poloze 19. GRF peptid dle vynálezu bude mít Gly, Thr; Val nebo Ile zbytek místo zbytku aminokyseliny, který se normálně nalézá v poloze 2 v kombinaci s jednou z následujících aminokyselin Ala, Val, Leu, Ile nebo Gly v poloze 15. Ve výhodném provedení GRF peptid může mít Ser zbytek místo zbytku aminokyseliny, který sě normálně nachází' v polohách 8 a '28 polypeptidu. Navíc mohou být GRF peptidy dle tohoto vynálezu rozšířeny na N konci alkylem Ci-Ct, benzylem .(.X-Y.) (Xl-Y)_n., kde n je Q až. 20., přednostně 0 až 10,

X je jakákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina,Y je alanin, serin, threonin nebo prolin a když n=0, potom Y je vybrán ze skupiny tvořené alaninem, serinem nebo threoninem,

Xi je každá přirozeně se vyskytující aminokyselina s výjimkou prolinu nebo hydroxyprolinu.

Peptidy podle předloženého vynálezu jsou účinné in vivo a jsou mnohem odolnější proti štěpeni enzymy krevní plazmy než řetěz'ce přírodních GRF. Navíc jsou sloučeniny substituované Ser⁵ a Ser7³ chráněny proti deamidaci ve vodném prostředí a jsou chemicky mnohem stálejší.

. Termín GRF peptid, tak jak je užíván v popisu a nárocích, znamená známý- polypeptid, který- má délku mezí 27 až 44 zbytků a’který způsobuje uvolňování růstového hormonu hypbfýzou. Příklady GRF peptidů jsou přirozené nebo syntetické polypeptidy ' popsané v US patentech 4,517,181, 4,518,586,.

4,528,190, 4,563,352, 4,585,756, 4,595,676, 4,605,643,

4,610,976, 4,626,976, 4,628,043, 4,684)987, 4,843,064 a v US patentové přihlášce pořadové číslo 89/00245, podané 27) ledna 1989. Všechny jsou sem zahrnuty tímto odkazem, Felix

A.M. , Wahg C.T, Heimeř E. , Fournier A., Bolin D., Ahmad M., Lambros T., Mowles T. a Miller L : Syntéza a biologická aktivita nových lineárních a cyklických analogů GRF v Peptides. Chemistry and Biology, Froc.lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G.R.Marshal1, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, str. 465-467,(1988). Tou J.S., Kaempfe L.A., Vineyard B.D., Buo-. nomoF.C., Della-Fera M.A.,Baile C.A.:Amfifilní analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon (GRF): Struktura peptidů a biologická aktivita in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 139, 763-770 (1986), Termín GRF peptidy zahrnuje jejich netoxické sol i .

Nomenklatura používaná při definování GRF peptidů je podle knihy Schróder a Lubke: Peptides, Academie Press (1965),

--..přičemž se., v souladu s konvenční reprezentací aminoskupina při N konci objevuje vlevo a karboxylová skupina na C konci vpravo. Jestliže má zbytek aminokyseliny isomerní formy, je uváděna L-forma, pokud není výslovně uvedeno jinak.Tento vynález uvádí analogy GRF peptidů, které mají následující vzorce: R-Rí-R^-Rj-Ala-Ile-Phe-Thr-R-Ser-Tyr-Arg-Ri;-Ri3 Leu-Ři5-Gln-Leu-Riε-Rla-Arg-R;1-R22“Leu-Gln-R2s-I le-R27R-2 &-Arg-Gln-Gln~Gly-Glu~R₃ 4-R3 3.-G1 n-G 1 u-R 3 _g-R₃« 4 o-Arg-Rí ?Arg-Leu-2., kde

R je H, C1-C5 alkyl nebo benzyl, s .výhodou H,.

Ri je Tyr nebo His, s výhodou Tyr,

R? je Gly, Thr, Val nebo lle, s výhodou Val nebo lle,

R₃ je Asp·,Glu nebo· Cys, s výhodou Asp,

R₈ je Asp nebo Ser, s výhodou Ser/

Ri: je Lys, N-epsilon-alky1- nebo N-epsi1on-benzy1-Lys nebo Arg,s výhodou Lys nebo N-epsilon-alkyl nebo N-epsilonbenzyl-Lys v případě,že R je C1-C5 alkyl nebo benzyl,

Ri3 je Val nebo lle, s výhodou Val,

Ris je Ala, Val, Leu, lle nebo Gly, s výhodou Ala, Val, . Leu nebo lle, nejlépe Ala,

Ris je Ser nebo Tyr, s.výhodou Ser,

.... R.i.q.... j.e.. Val .nebo ..lle,. _s výhodou Val,

R21' je Lys; N-epsilon-alkyl- nebo N-epsilon-benzy1-Lys. nebo Arg,.. s výhodou Lys nebo N-epsilon-alky1 nebo N-epsilonbenzyl-Lys, pokud je R Ci~C= alkyl nebo benzyl,

Rí2 je Ala nebo Leu, s výhodou Leu,

R25	je	Asp	nebo	Glu,	s výhodou Asp,
R ; 7	je	Met,	Ile	nebo	Leu, s výhodou	Leu
R? e	je	Asn	nebo	Ser,	s výhodou Ser,
R 3 4	je	Ser	nebo	Arg,	s výhodou Arg,
R 3 5	je	Asn	nebo	Ser,	s výhodou ASn,
R 3 8	je	Arg	nebo	Gin,	s výhodou Gin,
R 3 0	je	Gly	nebo	Arg,	s výhodou Gly, .
P-4 0	je	Ala	nebo	Ser,	s výhodou Ala,
R4 2	je	Ala,	Val	nebo	Phe, s výhodou	Val

Z znamená karboxylový konec zbytku aminokyseliny na C konci a je to skupina -COOR_a, ~CR-_aQ, -CONHNHR_a, -CONRaRb nebo -CHíORa s R_a a Rb , které jsou Ci-Ce alkyly nebo vodík, nebo jejich biologicky aktivní fragment rozšířený od R~ na N-konci k jakémukoliv zbytku v kterékoliv poloze mezi 27 až 44 jako její C konec, případně jejich Hse(lakton), HseOH nebo HseNR_aRb a jejich netoxické soli,

R_a je s výhodou vodík (Η),

Rbje s výhodou ethyl.

Příklady Ci-C_B alkylů, jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, oktyl a jejich isomerní formy. Zkratka iPr se vztahuje na isopropyl.

Zkratka Bzl se používá pro benzyl.

Některé z možných realizací vynálezu jsou GRF peptidy, ve kterých Ri? je Val nebo Ile včetně peptidů Thr-Ala¹⁵Val¹⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH;

Thr²Ala¹⁵11e¹⁷Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂

Val²Ala:?Ile-³Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂

I.le²Alai5iiei ⁷Leu^{2 7}bGRF( 1-29)NH;

Val²A1a¹⁵Val¹⁷Leu²⁷bGRF(1-29)NH2

Ile²Ala¹«Val¹’Leu2⁷bGRF(1-29)NH₂

Gly²Ala¹«Val¹«Leu^{2 7}bGRF(1-29)NH?

Gly²Ala¹³II&¹«Leu²⁷bGRF(l-29)NHEt s výhodou peptidy

Thr2Ser8Ala13Val1«Leu2 7Ser2 «Hse3°bGRF(l-	-30)NH2
Thr2SersAlai«Va117Leu27 Ser2«Hse33bGRF(1-	-33)NH2
Thr2 Ser a Ala i 5VaP «Leu2 7 Ser2 sHse3 7bGRF( 1-	-37)NH2
Thr2Ser«Ala1«Val1«Leu27Ser2«Kse*«bGRF(1-	-44)NH2
Thr2 Ser«Ala1 sile1 «Leu2 7 Ser2 «Hse 8 «'bGRF( 1-	-3O)NH2
Thr2Ser6Ala1sílel9Leu2 7 Šer28Hse33bGRF(1-	-33)NH2
Thr2Ser8Ala1«Ile1«Leu27Ser2«Hse3 7bGRF(1-	-37)NH2 nebo·
Thr2Ser8Ala1 sile1 7Leu2 7Ser2 8Hse^bGRF( 1-	-44)NH2 ještě lepe
Ile2Ser8Ala1«Val19Leu2Ser2 «Hse3°bGRF(1-	-3O)NH2 - -
Thr2 Ser8 Ala13 Val.19 Leu27 Ser2 eHse3 °bGRF( 1;	-3O)NHEt·.
Ile2Ser«Ala1«Val19Leu27Ser2 «Hse3 3bGRFfl-	-33)NH/
Ile2 Ser8Ala13Val19Leu27Ser28Hse33bGRF(1-	-33)NHEt
Thr2Ser«Ala1«Val19Leu2 7Ser2 «Hae3 3bGRF(1-	-33)NHEt
Ile2Ser8Ala1 5 Val1 «Leu2 7 Ser2 «Hse·3·.7 bGRF ( 1-	-37)NH2'
I le2Ser«Ala1 3Val1 «Leu2 7Ser2 8Hseý^bGRF(l-	’44)NH2
Val2Ser8Ala13Val1«Leu2 7Ser28Hse3°bGRF(1-	-3O)NH2
ValíSerSAla13Val1«Leu2 7Ser2 «Hse3 3bGRF(1-	-33)NH2
Val2Ser8Ala13Val1«Leu2 7Ser28Hse37 bGRF(1-	-37)NH2
Val2 Ser «Ala13 Val19Leu2 7 Ser2 eHse4 4bGRF(l-	-44)NH2
Ile2Ser«Ala1 «Ile19Leu2 7Ser2 8Hse30bGRF(l-·	*30)NH-
Ile2Ser«Ala1«Ile19Leu2 7 Ser2 «Hse3 3bGRF (1-	-33)NH2
Ile2Ser8Ala1«Ile1?Leu27 Ser2«Hse37bGRF(1-	-37)NH2
1le2 Ser«Ala1«1le15Leu27Ser2 «Hse4 4bGRF(1-	-44)NH2
Val2 Ser8Ala1«Ile1«Leu2 7 Ser2 «Hse3 °bGRF(1-	-3O)NH2
Val2Ser8Ala1 «Ile1 9Leu2 7 Ser2 «Hse3 3bGRF(.1-	-33)NH2
Val2 S er8 A-l a-1 «11 e1 « Leu·2 7 S er2'«Hs e3 7 bGRF (1	=37 )N H-2 -

Val ‘Ser a Ala i * 11 e i ⁹ Leu^{2 7} Ser ^{2 3}Hse«< bGRF( 1-44 )NH₂

Val²Ser⁶Ala^{1 5}Ilei⁹Leu²⁷Ser^2eHse³⁷bGRF(1-37)NH-n-propy1 nebo jejich netoxické soli

Nej lepším GRF peptidem podle tohoto vynálezu je Val 2 SeraAla i aval ¹’Leu2⁷Ser 2 SHses°bGRF(l-30)NHEt.

Jinou možností realizace tohoto vynálezu jsou peptidy rozšířené na N konci. Mezi nimi jsou na příklad N-alfa(Tyr-Ala-Phe-Pro-Phe-Ala)Tyr¹ Thr²Ser³Ala¹³1le¹⁷Leu^{2 7} Ser^2ebGRF(1-29)NH₂ ' .

,Ν-al fa (Leu-Pro-Gly-Pro-Tyr-Ala)Tyr¹ Thr² Ser³Ala¹ - Vak ⁷Leu^{2 7} Ser²⁸bGRF(1-29)NH?

N-alfa-(Ala-Fro-Gly-Pro-Tyr-Ser)₂Tyr¹Val²SerSAla^l3Ile¹⁹ Leu²⁷Ser^2EHse³²⁷bGRF(1-32)NH₂ 4'

N-alfa(Leu-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Ala)Tyr¹Ile^er^Ala¹sval¹⁹Leu² T Ser²8bGRF(1-29)NH₂

N-alfa(His-Ala-Tyr-Pro-Tyr-Ala)Tyr¹Ile ²Ser^fAla¹³Ile¹⁹Leu^{2 73} ' Ser²⁶bGRF(1-29)NH2 -.i

N-alfa(Glu-Pro-Phe-Ala-Tyr-Pro-His-Ala)Tyr¹1le² SersAla¹³ Val¹⁹ Leu²⁷Ser^2EbGRF(1-29)NH₂

N-alfa(His-Pro-His-Pro-His-Ala-Tyr-Ala)Tyr¹Thr²Ser8Ala¹³Val¹⁹ Leu²⁷Ser²«bGRF(l-37)NH₂

N-alfa(Tyr-Ala-Gly“Pro-Leu-Pro-Phe-Ala)Tyr²IleíSerSAla¹³Val¹⁹ Leu²⁷Ser²®Hse³²bGRF(1-32)NH₂

N-alfa(Val-Pro-Arg-Pro-Phe-Pro-Tyr-Ala)Tyr¹1le²Ser^sAla^{2 3}Val¹⁹ Leu²⁷ Ser^2sHse³³bGRF(1-33)NHEt

N-alfa(Arg-Přo-Tyr-Ala-Ile-Pro-Phe-Ala)Tyr¹IlerSer^Ala¹³Val¹⁹ Leu^{2 7}Ser^{2 3}Hse³ <>bGRF( l-30)NHEt

N-alfa(Tyr-Ala)₄Tyr¹ Val²Ser8Ala³³Val¹⁹Leu^{2 7}Ser^{2 E}Hse^{3 4} t

bGRF(l-34)NHCH_s

N-al fa (11 e-Pro-G lu-A 1 a-Tyr-Ala) Tyr¹11 eSer ^ε Ala^{1 5} Val ^{1 9} Leu^{1 7}

Ser^{7 s}bGRF(1-37)NH2

Další realizací tohoto vynálezu jsou libovolné shora uvedené modifikace, ve kterých Asp v poloze 3 ai nebo 25 je nahrazeno Cya, s výhodou v poloze 3.

Sloučeniny s Val’⁹ a Ile¹⁹ podle tohoto vynálezu jsou stejně aktivní ( a někdy i aktivnější) při uvolňování GH in vitro (buňky krysí hypofýzy) než jejich odpovídající protějšky s Ala¹⁹ (Tabulka I a Obrázek 1). Jsou.však stálejší vůči proteolýze při inkubaci v hovězí plazmě. Důkazy o zvýšené metabolické stabilitě sloučenin dle tohoto vynálezu (ve srovnání s přirozeným GRF řetězcem představovaným Leu⁷⁷ bGRF(1-29)NH?) jsou uvedeny v Tabulce II, kde jsou shrnuty údaje o stabilitě in vitro. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou aktivnější in vivo v dávce 10 pmol/kg než Leu¹⁹ analogy, viz Obrázek 2 a zpravidla uvolňují vice růstového hormonu se stabilnějším účinkem než Ala¹⁹ a. Leu¹⁹ analogy při zkouškách na kastrovaných býcích při dávce 30 pmol/kg (Ta- .

f bulka III). Na obrázcích 1 a 2 (sloučeniny byly použity jako trifluoracetátové soli) T2 znamená Thr¹,' A15 znamená Ala¹/

L27 znamená Leu¹⁷, L19 znamená Leu¹⁹, V19 znamená Val¹⁹ a 1119 znamená Ile¹⁹.

. Zvýšená účinnost sloučenin podle tohoto vynálezu, u nichž je R Val nebo Ile je doložena v Tabulce .III a na Obrázku 2.,

Na přiklad znalec pozná z relativní účinnosti in vivo (při dávce 10 pmol/kg, Obrázek 2), . že Thr-SerSAla^Val—Leu¹'⁷Ser¹sbGRF(1-29)NH₂ trifluoracetát a Thr^SerSAla¹^Ile¹⁹Leu⁷⁷ Ser-8bGRF(1-29)NH; trifluoracetát, stejně jako Val¹⁹ a Ile¹⁹ sloučeniny (v dávce 30 pmol/kg, Tabulka III) jsou bioaktiv18 nější než přirozený GRF.

Pro účely komerční produkce se dává přednost karboxylovému konci tvořenému homoserinem, laktonem nebo amidem homosek řinu, případně sekundárnímu či terciárnímu Ci~Cs alkylamidu homoserinu (s výhodou Ci-Cí-alkylamidu).

Syntetické analogy GRF peptidů se připraví vhodnou metodou, včetně metod popsaných v US patentu 4,529,595.(s1oupec 2, řádek 35 až sloupec 5, řádek 64) a v US patentu 4,689,318 (sloupec 2, řádek 23 až sloupec 9, řádek 13), oba jsou sem zahrnuty tímto odkazem.

Postup A představuje jednu metodu pro přípravu analogů GRF peptidů podle tohoto vynálezu.

•POSTUP A .

Peptidy se syntetizují technikou pevné fáze .v syntetizáto-v ru peptidů Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie) pomocí syntetických cyklů dodaných x touže firmou. Boc aminokyseliny a ostatní reagenty byly do-r dány Applied Biosystems a jinými komerčními dodavateli. Používal se sekvenční; dvojitý kopulační protokol na. výchozí p-methylbenzhydrylamino pryskyřici pro syntézu C koncových amidů karboxylové kyseliny.Pro syntézu C koncových kyselin se užívala odpovídající PAM pryskyřice, asparagin, glutamin a arginin jsou spojovány pomocí předem připravených symetrických anhydridů Boc aminokyselin.

Používají se následující ochrany pobočného řetězce:

Arg,tesy1

Asp, benzyl

Cys, 4-methylbenzy1 '

Glu, benzyl ‘ _ΐχ ·.

Ser, benzyl

Thr, benzyl

Tyr, 4-bromocarbobenzoxy Lys, 4-chlorocarbobenzoxy.

Odstraněni ochrany Boc se dosáhne trifluoroctovou kyselinou (TFA) v methylenchloridu. Pokud se mají získat Hse analogy, zabuduje se pomoci pevné fáze Met a potom se modifikuje bromkyanidem po štěpení HF dobře známými metodami. Štěpení bromkyanidem převádí Met na peptid s Hse laktonem na C konci. Ten lze převést ňa peptid s Hse amidem účinkem vhodného aminu v rozpouštědle, jako je methanol nebo dimethylformamid.. . Analogy s Hse laktonem, HseOH, HseNR_aRt· na C konci lze připravit metodami, popsanými Kempem aj. BIOTECHNOLOGY, Vol. 4, str. 565-568- (1986). Po skončeni··syntézy jsou peptidy zbaveny ochrany a odděleny od pryskyřice bezvodým fluorovodíkem obsahujícím - 10% p-kresolu. Štěpení skupin chrání cích·, pobočné skupiny a peptidu- od pryskyřice se provádí při 0°C nebo níže, s výhodou při -20°C po třicet minut s následujícími třiceti minutami při O^c. Po odstraněni HF sě peptid s pryskyřicí promyjí ethérem a peptid extrahuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Před čistěním se cystein obsažený v surových pepťidech okysličuje na^: odpovídající kyselinu pomocí perkyseliny mravenči při -10°C až 10°C,.s výhodou při O^C jak je popsáno v Steward aj. Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984,- str. , 113.. Konverze -na Hse · laktony a . Hse' amidy na C konci byla popsána výše.

Čistění se, provádí iontovou výměnnou chromatografií na ka* tionaktivní koloně Synchroprep S-3GG (SynC-hrom--Inc. Lir.den,

Indiana). Peptid se nanáší s použitím ústoje 20 mi 1imolárního TRIS (pH 6,8) v 20% acetonitrilu a vymývá s použitím gradientu 0-0.3 molárního chloridu sodného v témže rozpouštědle.Sloučeniny se dále čistí a zbaví solí kapalnou chromatografií s reversní fází na koloně Vydac C-18 (Separations Group, Hesperia, Kalifornie) s použitím gradientů voda:acetonitri1, obě fáze obsahující 0.1% TFA. Vhodné frakce se spoji a lyofilizuji. Získá se žádaný GRF peptid.ve formě trifluoracetátové soli. Trifluoracetát lze převést na jiné soli, pokud je to žádoucí, známými metodami iontové výměny .

Peptidy se hydrolyzují 24 .hodin za vakua v parní fázi v přístroji Pico-Tag Work .Station (Waters) s použitím stabilně vroucí HCl (Pierce) v přítomnosti fenolu jako čisticí látky při 1100C. Hydrolyzáty se analyzují na.pří stroj i Beckman Amino Acid Analyzer,Model 6300. Složení peptidů se vypočítá s použitím známé koncentrace norleucinu jako vnitřního standardu.

Hmotová spektra byla získána pomocí přístroje Applied Biosystems Time of. Flight Mass Spectrometer.

Příklady

Příklad 1 '

Příprava Thr² Al a¹' Val¹ · Leu^{2 7} bGRF (1-29)NH; trif1uoracetátu, sloučenina č.l.

Syntéza analogu GŘF peptidů, který má vzorec: H-Tyr-Thr-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAla-G1n-Leu-Ser-Val-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1e-Leu-Asn-Arg —NH2 (jako trifluoracetát) se provádí postupně podle postupu A. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v zá- 21 vorkách: Asp 4.06(4), Thrl.57(2), Ser 1.64(2), Glu 2.10(2),

Ala 2.25(2), Val 2.00(2), Ile 1.68(2), Leu 5.15(5), Tyr

1.88(2), Phe 0.94(1), Lys 2.00(2), Arg 2,94(3).

Příklad 2

Příprava Thr^Ala¹⁵Val¹⁹Leu^?7bGRF(l-29)NH2 triíluoracetátu, sloučenina č.2'

Syntéza analogu GRF peptidu, který má vzorec: H-Tyr-Thr-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuA1a-G1n-Leu-Ser-I1e-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp-I1e-Leu-Asn-Arge —NH₂ (jako trifluoracetát) se provádí postupně podle postupu A. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v závorkách: Asp. 4.09 (4) , Thr.l., 98 (2) , Ser 1.64(2),.Glu 2.05(2), Ala- 2.25(2), Val 1.0(1), Ile 2.84(3), Leu 5.07(5), Tyr.. 1.87(2), Phe 0.94(2), Lys.1.97(2), Arg 2.94(3).

Příklad 3

Pří.prava;· ThrAAla^{1 5}Va.l¹⁹Leu^{7 7}bGRF(l-29)NH;?' trif luoracetatu, sloučenina, č.3

Syntéza analogu GRF peptidu, který má vzorec: H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuA1a-G1n-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1e-Leu-Asn-Arge -NH₂ (jako trifluoracetát) se provádí postupně podle postupu A. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v závorkách: Asp 4.08(4), Thrl.87(2), Ser 1.72(2), Glu 2.07(2), Ala 1.93(2), Val 1.04(1), Ile 1.88(2), Leu 6.11(6), Tyr 1.90(2), Phe 0.93(1), Lys 2.03(2), Arg 3.09(3).

Příklad 4'

Příprava Val^Ala¹^Leu¹⁹Leu^;7bGRF(1-29)NH? trifluoracetatu, sloučenina č.4.

Syntéza analogu GRF peptidu, který má vzorec:

H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAla-Gln-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1 e-Leu-Asn-Arg —NH; (jako trifluóracetát) se provádí postupně podle postupu A. Hmotová spektrální analýza (metodou. Cf252 desorpce plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3454.6, teorie

3452.1.Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v závorkách.: . Asp 4.01(4), Thr 0.93(1), Ser 1.68(2), Glu 2.03(2), Ala 2.00(2), Val 1.85(2), Ile 1.88(2), Leu 6.11(6), Tyr 1.94(2)., Phe 0.94(1), Lys 1.97(2), Arg 3.11(3).

Příklad 5

Příprava I1e~Alai⁵Leui⁹Leu²⁷bGRF(1-29)NH2 trifluoracetátu, sloučenina- č.5. .

'Ví¹

Syntéza analogu GRF peptidu; který má vzorec: ./ H-Tyr-I1e-Asp-A1a-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Va1-Leu-·A1a-G1n-Leu-Ser-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp~I1e-Leu-Asn-Arg -NH₂ (jako trifluóracetát) se provádí postupně podle postupu a

A. Hmotová spektrální analýza (metodou Cf252 desorpce plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3468.6, teorie 3466.1. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v závorkách: Asp

4.02(4),	Thr	0.94(1),	Ser 1.67(2), ' Glu 2.05(2),	Ala
2.00(2),'	. Val	0.94(1),	Ile 1.83(2), Leu . 6.12(6),	Tyr
1.94(2),	Phe	0.95(1), Lys	1.99(2), Arg 3.13(3).
Příklad 6
Příprava	Val	-’Alai sile*’Leu27bGRF(l-29)NH2 trif luoracetátu,

sloučenina č.6.

Syntéza analogu GRF peptidu,. který má.vzorec: H-Tyr-Val-Asp-Ala-I1e-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAT a-G1n-Leu-Ser-11e-Arg-Lýs-Leu-Leu-G1n-Asp-I1e-Leu-Asn-Arg —NH; (jako trifluóracetát) se provádí postupně podle postupu

A. Hmotová spektrální analýza (metodou Cf252 desorpce plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3453.4, teorie 3452.1. Výsled23

ky analýzy aminokyselin,	teoretické hodnoty v závorkách:	Asp
4.03(4),	Thr	0.94(1),	Ser 1.69(2),. Glu 2.03(2),	Ala
2.01(2),	Val	1.89(2),	Ile 2.85(3), Leu 5.11(5),	Tyr
1.95(2),	Phe 0	:95(1), Lys	1.99(2), Arg 3.08(3).
Příklad	7
Příprava	Ile2	Ala1^Ile2-Leu27bGRF(1-29)NH2 trifluoracetátu,

sloučenina č.7.

Syntéza'analogu GRF peptidů, který má vzorec:

H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAla-Gln-Leu-Ser.-11 e-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-I1 e-Leu-Asn-Arg -NH? (jako trifluoracetát) se provádí postupně podle postupu A. . Hmotová spektrální analýza (metodou Cf252 desorpce'plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3469.7, teorie 3466.1. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické .hodnoty v závorkách: Asp 4.03(4), Thr 0.94(1), Ser 1.69(2), Glu 2.06(2), Ala

2.04(2), Val 0.94(1), Ile 3.78(4), Leu 5.11(5), Tyr

1.94(2), Phe 0.95(1); Lys 1.98(2), Arg 3.09(3).

Přiklad 8

Příprava Val²Ala⁷⁵Val¹⁷Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂ trifluoracetátu, sloučenina č.8.

Syntéza analogu GRF peptidů, který má vzorec: H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAia-G1n-Leu-Ser-Va1-Arg-Lys-Leu-Leu-G1 η-Asp-11e-Leu-Asn-Arg -NH? (jako trif luoracetát). se provádí postupně podle postupu A. Hmotová spektrální analýza (metodou Cf252 desorpce plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3440.6, teorie 3438.1. Výsledky ariá Týž y aminokyselin', teoretické hodnoty v závorkách: Asp

4.02(4),	Thr	0.93(1), Ser 1.67(2),	Glu	2.03(2),	Ala
2.00(2),	Val	2.78(3), Ile 1.86(2),	Leu	5.09(5),	Tyr
1.92(2),	Phe 1,	.04(1), Lys 1.98(2), Arg 3	.05(3)	*

Příklad 9

Příprava IIe2Ala¹³ Val¹⁷Leu⁷⁷bGRF(1-29)NH₂ trifluoracetátu, s1oučenina č . 9.

Syntéza analogu GRF peptidů, který má vzorec:

H-Tyr-I le-Asp-Á'la-I íe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-LeuAla-G 1n-Leu-Ser-Val-Arg-Lys-Leu-Leu-G1n-Asp-I1e-Leu-Asn-Arg -NH; (jako trifluóracetát) se provádí postupně podle postupu A. Hmotová spektrální analýza (metodou Cf252 desorpce plazmy) m/z pro(M+H)⁺: pozorováno 3454.9 teorie 3452.1. Výsledky analýzy aminokyselin, teoretické hodnoty v závorkách: Asp

4.02(4),	Thr	0.93(1) ,	Ser 1.69(2),	Glu	2.04(2),	Ala
2.06(2),	Val	1.86(2),	Ile 2.84(3) ,	Leu	5.10(5) ,	Tyr
1.94(2),	Phe 0.	.94(1), Lys	1.98(2), Arg 3,	.07(3)		!>

S použitím postupné syntézy podle postupu a lze rovněž připravit následující peptidy:'

Ile?SerSAlai-Val 1’Leu2^{S * 7}Ser28Hse^{3 *}°bGRF(l-30)NH₂

Ile²Ser³Ala¹³Val¹⁷Leu2⁷ Ser2eHse³³bGRF(1-33)NH₂

Ile²Ser®Ala¹Wal1- Leu²⁷ Ser⁷f Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂

Ile^Ser^Ala¹⁵Val^1?Leu^{2 7}Ser-^sHse< ⁴bGRF(1-44)NH₂

VaPSerSAlai³Val^{3 7}Leu^{2 7}Ser² *Hse³ °bGRF(l-30 )NH₂

Val 2SersAla 1³Val 1⁷Leu^{2 7}Ser2 ³Hse^{3 3}bGRF(1-33)NH;

Val 2SersAla1³Val¹³Leu^{7 7}Ser2eHse³⁷bGRF(l-37)NH₂

Val²Ser³Ala¹³Val¹7Leu2⁷Ser2&Hse44bGRF(l-44)NH2 e 2 Ser^s Al.a¹⁵11 e ^{1 7}Leu^{3 7}Ser 2 ³Hse³ obGRF( 1-30 )NH₂

IleíSerSAla¹Ule¹^Leu^{3 7}Ser2&Hse^{3 3}bGRF(1-33)NH₂

Rle^SerSAla¹ ^Ile^{1 7}Leu'2⁷Ser^{2 e}Hse³⁷bGRF(l-37)NHj

I le ² Ser “Ala^{1 3}Ile³ ?Leu^{2 7}Ser²⁸Hse« ⁴bGRF(l-44)NH_;·

Val²Ser⁸Ala³⁸Ile³’Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(l-3O)NH?

Val²Ser⁸Ala³511ei⁷Leu²⁷ Ser²⁸Hse³³bGRF(1-33)NH2

Val²Ser⁸Ala³5Hei?Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH2

Val²Ser⁸Ala³³Ilei’Leu²²Ser^{2 B}Hse^{4 4}bGRF(1-44)NH₂

Thr²Ser⁶Ala^{3 3}Val^{3 7}Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ĎbGRF(1-30)NH₂

Thr² Ser⁸ Ala i ³ Val ^{3 7} Leu^{2 7} Ser^{2 8}Hse'^{3 3}bGRF( 1-33)NH₂

Thr² Ser⁸Ala i ³Val^{2 7}Leu^{2 7} Ser^{2 8}Hse^{3 7}bGRF(1-37)NH₂

Thr² Ser⁸Ala i ³Val 1⁷Leu^{2 7} Ser^{2 8}Hse⁴⁴bGRF(1-44)NH₂

Thr²Ser⁸Ala^{3 3}Ile^{3 7}Leu^{2 7}Ser^{2 8}Hse³ °bGRF( l-30)NH₂

Thr²Ser⁸Alai³Ilei'Leu²⁷ Ser²⁶Hse³³bGRF(1-33)NH₂

Thr² Ser⁸Ala i³Ile²?Leu²⁷ Šer²⁸Hse³⁷bGRF(1-37)NH₂

Thr²Ser⁸Ala^{2 3}Ile^{3 7}Leu^{2 7}Ser^{2 8}Hse^{4 4}bGRF(1-44)NH₂

Thr²Ser⁸Ala³³Val³?Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁸bGRF(l—30)NHEť

Thr²Ser⁸Ala³³Vali^sLeu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NHEt

Ile² Ser⁸Ala³³Val^{3 7}Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(l-3O)NHEt

Ile²Ser⁸Ala^{3 3}Val^{3 ?}Leu^{2 7}Ser ^{2 e}Hse^{3 3}bGRF( l-33.)NHEt. '

Val ²Ser⁸Ala^{3 3}1 le^{3 7}Leu^{2 7}Ser^{2 8}Hse^{3 7}bGRF( 1-37·) NH-n-propyl

Postup B .

Vedle přípravy GRF analogů technikou pevné fáze mohou být tyto. analogy získány metodou rekombinantní DNA podle postupu popsaného pro Leu²⁷bGRF(l-44)0H (evropská patentová přihláška 0212531)s následujícími úpravami v segmentu DNA kódující v Leu²⁷bGRF(1-44)OH jsou kodony pro Ala², Asn⁸, Gly³³ a Asn²⁸ nahrazeny kodony : na příklad (ACT) Thr² nebo (ATT) Ile² nebo (GTT) Val²’, (AGT)'Ser⁸, (GCT) Ala³³, (AGT) Ser’²⁸.

Navíc pro GRF analogy obsahující Cya³ se kodon GAT (Asp³) nahradí kodonem TGT pro Cys³. Po vytvořeni proteinu a reakci s bromkyanem v mravenčí kyselině, jak je popsáno ve shora uvedené evropské patentové přihlášce se.přidá k roztoku peroxid vodíku asi při O^C k oxidaci zbytku Cys na Cya.

Peptid se pak čistí popsanými metodami.

Mimo to se pro analogy GRF rozšířené na N konci přidají DNA segmenty, kódující rozšířeni na N konci, takto: (TATACT) pro .Tyr-Thr, .(TATACT)_n pro . (Tyr-Thr)_n, (TATAGT)_n pro (Tyr-Ser)_n nebo (TATAGTTATACT) pro Tyr-Ser-Tyr-Thr nebo (TATACTTATAGT) pro Tyr-Thr-Tyr-Ser, (GATGCT) pro Asp-Ala atd. Gen pro prekursorový protein se vloží do výrazového vektoru E. Coli. Po vytvořeni proteinu se provede izolace z materiálu a rozklad bromkyanidem v mravenči kyselině tak, jak je popsáno v zmíněné evropské patentové přihlášce, Mr,a- u věnčí kyselina se odstraní sníženým tlakem a surový polypep- ý 5 tiď se pak čistí, popsanými metodami. „ '

Sloučeniny podle tohoto vynálezu lze připravit;známými technikami rekombinantni DNA, protože tyto peptidy jsou $ složeny pouze z přirozeně se vyskytujících aminokyselin.>;.V tom je rozdíl vůči známým analogům, které obsahuji skupiny nekódované DNA, jako jsou D-Ála . a nebo desaminoTyr, a budou vyžadovat pro jakoukoliv produkci ve velkém měřítku nákladnou chemickou syntézu nebo kombinaci genetického inženýrství s chemickými postupy.

Rekombinantni výchozí mikroorganismy používané v tomto vynálezu se připraví technikami rekombinantni DNA, které.jsou _t dobře známé odborníkům a jsou popsané na příklad v T. Maniatis:. Molecular,'Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) a v B. Perbal: A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley, New York. (1984). Tyto knihy jsou zahr.nuty do popisu touto referencí. ,

Analogy s Hse laktonem, HseOH, HseNR_éRb na C konci lze připravit metodami popsanými Kempem aj. BIOTECHNOLOGY, Vol

4, str.- 565-568' (1986) .

POSTUP C

Tento postup se týká GRF analogů podle tohoto vynálezu, alkylovaných na dusíku. Peptidy se připraví bud chemickou nebo biochemickou metodou (postup A nebo B). N-alkylace se pak dosáhne známými metodami, např. Murphy, W.A. a Coy D.H., Dlouhodobě Účinné alkylovaná analogy faktoru uvolňujícího růstový hormon, Peptide Research 1, 36-41, (1988), V.Sythyamoorthy aj. Reduktivní methylace neurotoxinů botulinu.Typů A a B, Mol. Cell. Biochem. 83, 65-72, (1988).

Postupem C lze též připravit následující peptidy: N-epsilon-iPr-Tyr¹Thr²Ser6N-epsilon-iPrLys¹'² > - ³Val¹ sile³ ’ Leu?⁷Ser^2ebGRF(1-29)NH2

N-epsilon-iFr-Tyr³Thr²Ser⁸N-epsilon-iPr-Lys³² -²³Ala³^Val³’ Leu²⁷bGRF(l-40)NH₂

N-epsilon-Bz1-Tyr³ Thr²Ser⁵N-epsilon-Bz1-Lys^{3 2} - ²¹Val ³'Ile³⁹

11e^{2 7} Ser^{2 8}bGRF(1-32)NH2

N-epsilon-iPr-Tyr³11e²Ser^N-epsilon-ipr-Lys¹² > ²³Ala³$Val¹⁵ Leu²⁷ Ser²ebGRF(1-40)NH;

N-epsi1on-Bz1-Tyr³ Val²SerθN-epsi1on-Bz1-Lys ^{3 2} - ^{2 3} Val^{3 5}Val^{3 7} e ^{2 7}Ser^{2 fi}bGRF(1-32 )NH.;

Všechny syntetické GRF peptidy podle tohoto vynálezu, včetně peptidů připravených v příkladech se považuji za biologicky aktivní a užitečné pro stimulaci uvolňování GH hypofýzou.

Dávky mezi asi 10 nanogramy a asi 5 mikrogramy těchto peptidů ná kilogram tělesné hmotnosti se'považujΪ 'za zvláště účinně pro vyvoláni sekrece GH. Stimulace vylučování GH těmito, peptidy by měla vést k odpovídajícímu zvýšení růstu u lidí, skotu a jiných zvířat s normálními hladinami GH. Mimo to by podávání mělo změnit obsah tuku v těle a .upravit jiné metabolické, imunologické a vývojové procesy, které závisí na GH. Na příklad mohou být toto. analogy užitečné jako prostředky stimulující anabolické procesy u člověka ve stavech podobných následkům popálení. V jiném příkladě mohou být tyto analogy podávány, komerčním teplokrevným zvířatům, jako kuřatům, krůtám, prasatům, kozám, skotu a ovcím, a mohou být používány v rybářství pro chov ryb a jiných chladnokrevných mořských živočichů, např. mořských želv a úhořů, ,íl>L· a obojživelníků k urychleni růstu a zvýšeni poměru proteinů k tuku, získaného podáváním účinných dávek peptidů. Tyto analogy se mohou používat ke .stimulaci imunitních funkcí u lidí a zvířat pro léčení cukrovky vznikající z abnormální produkce růstového hormonu, či pro zlepšení hojeni kostí, ran a .spálenin, nebo při osteoporéze. Také lze použít tyto »

analogy pro povzbuzení růstu vlasů.

Denní-dávky mezi 10 nanogramy/kg a asi 50 mikrogra.my/kg tělesné hmotnosti se považují za .zvláště účinné pro zvýšení laktace, růstu a stimulaci imunitních funkci.

Pro podáváni lidem a zvířatům by tyto syntetické peptidy měly mít čistotu alespoň asi 93% a s výhodou alespoň 98%. Tyto syntetické peptidy nebo jejich netoxické soli, kombinované : s farmakologicky nebo veterinárně přijatelným nosičem do formy farmaceutického přípravku, s výhodou pro prodloužené uvolňováni, se podávají zvířatům a lidem bud intravenosně, podkožně, přes kůži nebo nosní sliznici.. Lékař je může použít pro stimulaci uvolňování GH, pokud léčený pacient takovou terapii potřebuje. Vhodné dávkováni bude záviset na zdravotním stavu a délce požadované léčby.

Takové peptidy se často podávají ve formě nejedovatých solí, jako jsou kyselé adiční soli nebo kovové komplexy, třeba se zinkem, železem a podobně,(pro potřeby aplikace jsou pdvažovány za soli). Jako adiční soli lze jmenovat hydrochlorid, hydrobromid, síran, maleát, octan, citran, benzoan, jantaran, jablečnan, askorbát, vinan atd. V případě, že aktivní složka se má podat v isotonickém roztoku, soli mohou ovlivnit fosfátové a jiné ústoje.

Peptidy by se měly podávat lidem za dohledu lékaře a farmaceutické přípravky budou obvykle obsahovat peptid spolu s konvenčním, pevným či kapalným farmaceuticky přijatelným nosičem. Základní dávka obyčejně bude od asi 100 nanogramů do asi 50 mikrogramů peptidů na kilogram tělesné hmotnosti pacienta.

Ačkoliv vynález byl popsán s .ohledem na formy, kterým se dává přednost, budiž rozuměno, že lze uskutečnit různé změny a úpravy, které jsou zřejmé osobám zběhlým v oboru, aniž by se vybočilo z rozsahu jeho nároků. Na přiklad lze. provést modifikaci peptidového řetězce vynecháním jednoho nebo dvou zbytků od C konce peptidů podle současně známé experimentální praxe, což vede k peptidům, které si zachovávají značnou část své biologické účinnosti. Proto takové peptidy spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Mimo to lze substituovat C konec a nebo N konec peptidů, a nebo lze přirozené se vyskytující zbytky substituovat za jejich obecné ekvivalenty, jak je Všeobecně známo ~ v peptidové chemii. T-ak- lz-e na přiklad vyrobit jiné analogy se zvýšenou odolností vůči proteolýze a při tom mající alespoň podstatnou část účinnosti polypepI tidů dle nároku, aniž by se . dostaly z rozsahu vynálezu,i lustrovaného sloučeninami 1 až 15. Rovněž známé substituce karboxylové skupiny na C konci, např. nižší alkylamidy, vedou k ekvivalentním.molekulám.

Způsoby, které byly popsány shora lze vyrobit GRF peptidy obecného vzorce

Rí-Ri-R¹2^-R3“Ala-Ile-Phe-Thr-Rs-Ser-Tyr-Arg-R¹i_Z-Ri3-LeuR15 —θ1n-Leu-Ri5 —R1g—Arg—R- 21 —R 2 2—Leu—G1n—R2 5 — Ile—R;7 —R23 —

Arg—G1n-G1n—G1y—Glu—R3 4 —R3 3—Gin—Glu—R3 g —R3 9—R4 o —Arg—R« 2“ Arg-Leu-Z, kde

Ri je (X-Y)~(Xi-Y)_n 5 n 0-20, s výhodou 0-10 a X je přirozeně se vyskytující aminokyselina, Y je alanin, serin, .. threonin nebo prolin a v případě, že n =0, pak je Y vybrán ze skupiny tvořené alaninem, serinem nebo threoninem, Xi je kterákoliv přirozeně se vyskytující aminokyselina s výjimkou prolinu nebo hydroxyprolinu . Ri je Tyr nebo His,'

R2 je Gly, Thr, Val nebo Ile,

Ra je Asp,Glu nebo Cya,·

Rs	je i	Asn	nebo S	er,
Rx	2 je	Lys	, nebo	Arg,
Ri	3 je	Val	nebo	Ile,
Ri	5 je	Ala	, Val	, Leu,
Ri	s, je	Ser	nebo	Tyr,
Ri	9 je	Val	nebo	Ile,
R;	1 je	Lys	, nebo	Arg,
R2	2 je	Ala	nebo	Leu,

R 2 5	je	Asp,	Glu	nebo	Cya,
R 2 7	je	Met,	Ile	nebo	Leu,
R2 8	je	Asn	nebo	Ser,
R3 4	je	Ser	nebo	Arg,
R3 3	je	Asn	nebo	Ser,
R3 8	je	Arg	nebo	Gin,
R 3 9	je	Gly	nebo	Arg,
R 4 0	je	Ala	nebo	Ser,
R4 2	je	Ala,	Val	nebo	Phe,

Z znamená karboxylový konec zbytku aminokyseliny na C konci a je to skupina -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CONR_aRt nebo -CHíORa s R_a a Rb , kterě jsou CrCs alkyly nebo vodík, nebo jejich biologicky .aktivní fragment, rozšířený od R na N-konci ke kterémukoliv zbytku v kterékoliv poloze mezi 27 až 44 jako její C konec, případné jejich Hse(lakton), HseOH nebo HseNR_aRt a jejích netoxické soli'. Tyto modifikace lze připravit podle současně- známých experimentálních postupů.. Protože si zachovávají podstatnou část biologické aktivity původního peptidů, jsou tyto modifikace považovány za součást vynálezu.

Rozšiřující část GRF peptidů podle tohoto vynálezu má řetězec aminokyselin odpovídající vzorci (X-Y)-(X¹-Y)_n n zde představuje počet lineárně spojených X-Y skupin, toto čislo je od 0 do 20, s výhodou od 0 do 10 skupin.

X je vybrána ze skupiny tvořené všemi přirozené se vyskytujícími aminokyselinami,

Y je vybrána ze skupiny tvořené prolinem, alaninem, seririěm a threóninem, pouze v případě, že η -O., pak je Y vybrána ze skupiny tvořené alaninem, serinem nebo threoninem,

X¹ je vybrána ze skupiny tvořené kteroukoliv přirozeně se vyskytující aminokyselinou s výjimkou prolinu nebo hydroxyprolinu.

Podle tohoto vzorce v případě, že n=l, jsou zde dvě skut piny Y. Dále je možné mít až dvacetjednu Y skupinu a dvacet X¹ skupin v jednom provedeni. Jednotlivé zbytky Y a X¹ mohou být libovolné aminokyseliny z příslušné skupiny, ze které mají být vybrány. To znamená, že jednotlivé zbytky Y nemusí být stejné v daném provedeni. Podobně i v provedení vynálezu '5 více než jednou X¹ skupinou každá jednotlivá X¹ skupina může být kterákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu a hyd’ * roxyprolinu, . bez ohledu na charakter jiných zbytků ΧΛ . zVšechny jednptlivé Y a X¹ zbytky musí odpovídat pravidlům pro danou specifickou skupinu a stačí, aby různé jednotlivé zbytky v určených polohách odpovídaly pravidlům stanoveným shora. _v in vitro krysího GH z kultur buněk

Koncentrace analogu nM

0.01 0.1 1 10

Tabulka I

Účinek analogů bGRF na vylučováni krysí přední hypofýzy’

Sloučenina čislo.....

Název (jako trifluoracetát)

- — - bez Leu² Ile2Alai Ile^Ala¹ Val²Ala² Val²Ala⁷ Thr²Alai Thr^Alai ThríAla¹ Ile²Alai Val²AIa² Thr²Alai dávková-ni⁷bGRF(l-29 iVal i⁹Leu² sílel“Leu² sval i⁹Leu² sile¹⁹Leu² sval¹-Leu² sVal¹⁹Leu² sLeu²⁷bGRF sLeu¹⁹Leu² SLeu¹⁹Leu² SLeu¹⁹Leu²

GRF-.....

)NH₂ ⁷bGRF(l~29 ⁷bGRF(l-29 ⁷bGRF(l-29 ⁷bGRF(l-29 ⁷bGRF(l-29 ⁷bGRF(l-29 (1-29)NH₂ ⁷bGRF(1-29 ⁷bGRF(l~29 ⁷bGRF(l-29 )NH₂ )NH₂ )nh₂ )NH₂ )nh₂ )NH₂ )nh₂ )nh₂ )nh₂

1963 347,4 c 55989 5162f 4629* .4141^d 3852* 2541* 2833b

1963* d 7561^d 120829 9ll006f Č11832¹ =10686^f

9252* b 6263^c c 5831^c . 5835* .3976b • · 2443*

1963*15172*

17230*

9169801'

9165789

16370*

16138* •^d13122^d

13378^d

12298^d

9540* •4483b

1963*

16506*

17272^d

16455

13012b * Množství rGH vyloučeného z kultur buněk hypofýzy se měřilo radioimunotestem a je vyjádřeno v ng na. vzorek za 4 hodiny. Podmínky?testu.jsou popsány v Frohman.aj.Methods Enzymol. 124, 371 (1986).

a,b,c,d,e,f,g v daném sloupci jsou výsledky odlišné proti jiným indexům na hladiněvýznamnosti pod 0.05.

Poznámka:. Substituce Leu¹⁹ měla zhoršující, účinek na schopnost uvolňovat GH, zatím co Val¹⁷ a Ile¹⁷ modifikace vedly k analogům se sníženou účinnos“tí. Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂ še používal jako zkušební standard.

Tabulka II

Stabilita GRF peptidů substituovaných v poloze 19 v plasmě in vitro

Sloučenina číslo	Jméno (jako trifluoracetát)	ti,2(hod
1 2	Leu27bGRF(1-29)NH Thr2Ala1sval19Leu27bGRF(1-29)NH2 Thr2Ala1sval19Leu27hGRF(1-29)NH2 ThríAla1 Wal19Leu2 7bGRF( 1-29)NH2 -·- - -Thr 2-Ai-a-1.- s-Leuí-^Leu-í-^bGR-FC-l—29-) NH-2 .....	0.6’ 4.9* 14.7* 6.6b -.......1-2.3 * ..........

* Průměrná hodnota tří nezávislých pokusů (každý se dělal třikrát) a,b,c Sloučeniny s různými indexy se liší na hladině meší než 0.05.

Tabulka III

Odezva sérového GH Holšteinských kastrátů na injekce GRF analogů s různými substitucemi v polohách 2 a 19 schématu

X²Ala²⁵X²^Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂

Řádka	Sloučenina	Jméno'*	Podíl.	Maximum
číslo	číslo	(jako trifluoracetát	v %	(ng/ml)
1 .	-	Voda	0ů	11.7®
2	A	bGRF(1-44)NH2	83b	73.2®
3	B	Thr2Ala25£eu27bGRF(1-29)NH	100i>	75.7 ?-
4	3	Thr2Ala2SLeui9Leu27bGRF(1~29)NH2	100b	83.5®
5	4	Val2Ala25Leui7Leu27bGRF(l-29)NH2	92b	70.9®
6 .	5	Ile2Ala25Leu29Leu27bGRF(1-29)NH2	92b	42.8®
7	1	Thr2Ala2 *VaH 9Leu2 7bGRF(1-29)NH2	92 b	79.6®
8	8	Val2Ala2 5Val27Leu2 7bGRF(1-29)NH2	100 b	69.4®
9	9	Ile2Ala25Val27Leu2 7bGRF(1-29)NH2	'92b	72.7®
10	2	Thr2Ala2sile29Leu27bGRF(1-29)NH2	92b	60.7®
11	6 .	Val2Ala2 sile2’Leu2 7bGRF(l-29)NH2	92b	78\'7®
12	7	Ile2Ala25ilei7Leu27bGRF(1-29)NH2	100b	49,.5°
13		SEM	5	l&.7í
14,		P hodnota.	0.0001	0.75

* Prezentovaná data zahrnují pouze zvířata, která reagovala s

na injekce GRF ;** GRF analogy byly podávány ve formě intravenosních injekcí .30 pmol GRF/kg 2hodiny před krmením.

*** Heterogenita variace (Hartleyův test F-max), hodnota -P a její index jsou počítány z logaritmické transformace dat. abcde Hodnoty s různými indexy ve sloupci jsou významně rozdílné (P menší než 0.05).

^f SEM při podávání GRF bylo 12.7 ng/ml, zatím co SEM u kontrol

Řádka číslo	Doba do max. minut .........	Plocha (jednotek)	Jako %A	Jako %B •
0-lh .....	- l-2h	0--2h · -
1	22“ b c	0.51“	0.50“	1 “	44	28
2	. 12“	0.73b	0.56“	2.29b	100	' 64
3	18 “ b c	2.56«	1.04*« d	3.60«	157	íoo-
4	17“ b c	2.43*«	0.77“*	3.20'b c	140	89
5	21 b c	2.16bc	0.91“*«	3.07*«	134	85
6	15°bc	1.43b	0.95“*	2.38b	104	66
7	19 “ b c	2.75	1,35cde	4.10«	179	'114
8	15“b	2.30bc	1.48*«d	3.77bc	165	105
9	22 b =	2.28*«	1.96*	4.25«	186	118 .
10	22bc	' 2.04*«	1,19 b t d	3.23«	141	90
11	2 0 “ b c	2.63*«	1.74de	4.37«	191	121
12	24«	1.56*«	1.36«dĚ	2.91*«	127	81
13	49	0.33	0.23	0.48
14	0.32	0.0001	0.0001 _	0.0001

s vodou bylo 45.2 ng/kg

-9 SEM při podáváni GRF bylo 4 minuty, zatím co SEM u kontrol s vodou bylo 14 minut.

Obrázek i

Účinek analogů Thr²Ala¹-Leu²⁷bGRF(1-29)NH₂ na -uvolňování. růstového hormonu GH v kulturách buněk krysí hypofýzy in vitro. Pokus se prováděl, podle postupu Frohmana a Downse, Methods Enzyniol . 124, 371-339 (1986). Leu¹¹⁵ substituce měla zhoubný účinek; na schopnost analogů GRF uvolňovat GH, zatím co Val¹7 á Ile¹⁹ modifikace ' vedly k analogům- s bud zvýšenou nebo nezměněnou' bioaktivitou in vitro ve srovnáni.

s Thr²Ala^1JLeu²⁷bGRF(1^-29)NH;. Leu²⁷bGRF(1-29)NH? sloužil jako pokusný standard.

Obrázek 2

Průměrné''“koncentrace“ ·. sérového^--r-ůsto-vého - hormonu... GH. ...u..

Holsteinských' . kastrátů krmených' otrubami po intravenosni injekci 10 pmol/kg GRF analogů. Pokus se prováděl podle popisu Moseley aj.J. Endocrinol, 117, 252-259 (1988) , Hovězí

GRF(1-44)NH₃ se používal jako pokusný standard. .

Claims (3)

1. GRF peptid s Val nebo Ile v místo,zbytku aminokyseliny, která se normálně nalézá v poloze 19, Gly, Thr, Val nebo Ile zbytek místo zbytku aminokyseliny, který se normálně nalézá v poloze 2, a s jednou aminokyselinou ze skupiny- aminokyselin Ala, Val, Leu, Ile nebo Gly v poloze 15.

2. GRF peptid podle nároku 1, vyznačený, tím, že aminokyselina v poloze 2 je Thr, Val nebo Ile.

3. GRF peptid podle nároku 1 obecného vzorce R-Ri-Rí-Rs-Ala-Ile-Phe-Thr-Re-Ser-Tyr-Arg-R¹i2-R1j-LeuR;5—G1n-Leu—R·g —Ri7 —Arg—R¹21-R 72 —Leu—G1n—R2 5 — 11e—R2 7 —R ? p — Arg-G 1 n-Gln-Gly—Glu-R3 4 — R3 5— Gin-Glu—Rg 8-R3 9-R4 o“Arg—R4.2Arg-Leu-Z, kde

R je H, Ci-C= alkyl nebo benzyl,

Ri je Tyr nebo His,

R? je Gly, Thr, Val nebo Ile,

R3 je Asp,Glu nebo Cya,

Rg je Asn nebo Ser,

R12 je Lys, nebo Arg, nebo N-epsilon-alky1 nebo N-epsilon-benzyl-Lys v případě,že R je C1-C5 alkyl nebo benzyl,

Ri3 je Val nebo Ile,

R15' je Ala, Val, Leu, Ile, nebo Gly,.

Rie je Ser nebo Tyr,

R1 <? je Val nebo Ile,

R?i je Lys, nebo Arg,nebo N-epsilon-alky1 nebo N-epsi39 lon-benzy1-Lys v případě,že R je C1-C5 alkyl nebo benzyl,

R₂ 2 je Ala nebo Leu, R2 5 je Asp, Glu, 1 - R2 7 je Met, I-le nebo Leu, . R 2 ε je Asn nebo Ser, Ra 4 je Ser nebo Arg, Raa je Asn nebo Ser, Ra e je Arg nebo Gin, R 3 9 jS Gly nebo Arg, R4 0 je Ala nebo Ser, R42 je Ala, Val nebo Phe, a

Z znamená karboxyl.ovou část zbytku aminokyseliny na C konci a jeto skupina -COOR._a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CONR_aRb nebo -CH₂OR_a s R_a a Rb , které jsou Cj-Ce alkyl nebo vodík, nebo jejich biologicky aktivní fragment, rozšířený od R na, N-konci ke zbytku v kterékoliv poloze mezi 27 až 44 jako její C konec, případně jejich Hse(lakton), HseOH nebo- HseNR«Sd. a jejich netoxické soli.

GRF peptid podle nároku 3, vyznačený tím, že R2 je Thr,

Val nebo Ile.