CZ86697A3 - Molecular system for making loops - Google Patents

Molecular system for making loops Download PDF

Info

Publication number
CZ86697A3
CZ86697A3 CZ97866A CZ86697A CZ86697A3 CZ 86697 A3 CZ86697 A3 CZ 86697A3 CZ 97866 A CZ97866 A CZ 97866A CZ 86697 A CZ86697 A CZ 86697A CZ 86697 A3 CZ86697 A3 CZ 86697A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
oligonucleotide
complements
loop
attached
nucleotides
Prior art date
Application number
CZ97866A
Other languages
English (en)
Inventor
Sydney Brenner
Original Assignee
Lynx Therapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lynx Therapeutics filed Critical Lynx Therapeutics
Publication of CZ86697A3 publication Critical patent/CZ86697A3/cs

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B80/00—Linkers or spacers specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. traceless linkers or safety-catch linkers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/005—Beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/0054—Means for coding or tagging the apparatus or the reagents
    • B01J2219/00572—Chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/0063—Other, e.g. van der Waals forces, hydrogen bonding
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00639—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium
    • B01J2219/00641—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being trapped in or bound to a porous medium the porous medium being continuous, e.g. porous oxide substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00646—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports
    • B01J2219/00648—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being bound to beads immobilised on the solid supports by the use of solid beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Magnetic Heads (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Control Of Driving Devices And Active Controlling Of Vehicle (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Air Transport Of Granular Materials (AREA)
  • Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
  • Multiple-Way Valves (AREA)

Description

Vynález se obecně týká metod pro identifikaci, třídění a/nebo sledování molekul, zejmena polynukleotidů, oligonukleotidovými značkami, a zejmena metody pro třídění polynukleotidů prostřednictvím specifické hybridizace na oligonukleotidové smyčky.
Dosavadní stav techniky
Specifická hybridizace oligonukleotidů a jejich analogů je základním procesem, který je využíván v širokém rozsahu výzkumných, lékařských a průmyslových aplikací, včetně identifikace s chorobou asociovaných polynukleotidů v diagnostických zkouškách, vyšetřování klonů pro nové cílené polynukleotidy, identifikace specifických polynukleotidů ve skvrnách (blotech) směsí polynukleotidů, amplifikace specifických cílových polynukleotidů, terapeutického blokování nevhodně exprivovaných genů, DNA sekvencování a pod., např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989); Keller a Manak, DNA probes, 2. vydání (Stockton Press, New York, 1993); Milligan et al., J.Med. Chem., 36:1923 - 1937 (1993); Drmanac et al., Science, 260: 1649 1652 (1993); Bains, J.DNA Sequencing and Mapping, 4: 143 150 (1993).
Specifická hybridizace byla také navržena jako metoda pro sledování, získávání a identifikaci sloučenin značených oligonukleotidovými smyčkami. Například, u mnohotného DNA sekvencování jsou o 1igonukleotidové smyčky použity pro identifikaci elektroforeticky separovaných proužků v gelu, které se skládají z DNA fragmentů generovaných ve stejné sekvenční reakci. Tímto způsobem mohou být DNA fragmenty z mnoha sekvenčních reakcí separovány na stejné linii gelu, která je pak blotována se separátním solidním materiálem, na kterém jsou fragmentové proužky ze separátních sekvenačních reakcí vizualizovány o 1igonukleotidovými probami, které specificky hybridizují na komplementární smyčky, Church et al., Science, 240: 185 - 188 (1988). Stejné použití o 1igonukleotidových smyček bylo také navrženo pro identifikaci výbušnin, silně znečišťujících látek, jako je surová nafta, a nyní pro prevenci a detekci padělků, např. jak popsal Dollinger, str. 265 - 274 v Mullis et al., vyd. The Polymerasa Chain Reaction (Birkhauser, Boston, 1994). Nověji byly systémy, využívající oligonukleotidových smyček, také navrženy jako prostředek pro manipulaci a identifikaci jednotlivých molekul v komplexních kombinatoriálních chemických knihovnách, jako je například vyšetřování takových knihoven na kandidáty léčiv, Brenner and Lerner, Proč. Nati. Acad. Sci. 89:5381 - 5383 (1992); Alper,
Science, 264: 1399 - 1401; a Needels et al., proč. Nati.
Acad Sci 90:10700 - 10704 (1993).
Úspěšná realizace takových smyčkových schémat závisí z větší části na úspěšném dosažení specifické hybridizace mezi smyčkou a její komplementární probou.
To znamená, že aby oligonukleotidové smyčky úspěšně identifikovaly substanci, musí být počet falešně negativních a falešně pozitivních signálů minimalizován. Naneštěstí nejsou takové falešné signály neobvyklé díky tomu, že párování baží a volné energie řazení baží se velmi liší mezi nukleotidy v duplexní a triplexní struktuře. Například, duplex skládající se z opakované sekvence deoxyadeninu (A) a thymidinu (T) vázaný na svůj komplement může mít menší stabilitu než duplex stejné délky, skládající se z opakující se sekvence deoxyguanidinu (G) a deoxycytidinu (C) vázaný na částečně kompementární cíl obsahující chybné párování. Tak, byla-li požadovaná sloučenina z velké kombinatoriální chemické knihovny spojena s vytvořeným oligonukleotidem, bude existovat signifikantní pravděpodobnost, že za hybridi začnich podmínek projektovaných k detekci přesně padnoucích AT-bohatých duplexů, bude možné delegovat nežádoucí sloučeniny značené GC bohatými oligonukleotidy --dokonce v chybně spárovaných duplexech --- spolu s přesně spárovanými duplexy skládajícími se z AT-bohatých smyček. V molekulárním systému pro vytváření smyček navrženém Brennerem et al. (citován výše) byl příbuzný problém mis-hybridizace těsně příbuzných smyček řešen upotřebením takzvaných comma-less kódu, který potvrzuje, že proba mimo registr (nebo posunuta v rámečku) s ohledem na její komplementární smyčku může vést k duplexu s jedním nebo více chybnými párováními pro každý z jejích pěti nebo více výrazů o třech bazích, neboli kodonů.
Ačkoliv jsou dostupná činidla, jako je tetrametylamonium chlorid, pro negaci odlišností specifické stability baží oligonukleotidových duplexů, je účinek takovýchto činidel často omezený a jejich přítomnost může být inkompatibilni s, nebo jí činí obtížnější, další manipulací s vybranou sloučeninou, např. její amplifikaci polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) nebo jí podobnou.
Takové problémy činí simultání použití mnohočetných hybridizačních prob v analýze mnohotných nebo komplexních genetických lokusů, např. prostřednictvím mnohonásobné PCR, reversním tečkovým blotingem a pod., velmi obtížným. Výsledkem bylo, že se začalo používat přímé sekvencování jistých lokusů, např. HLA genů, jako spolehlivá alternativa k nepřímým metodám využívajícím specifické hybridizace pro identifikaci genotypů, např. Gyllensten et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 85: 7652 - 7656 (1988).
Schopnost tříděné klonovat a identicky spojovat DNA fragmenty na odlišných nosičích pevné fáze by měla usnadnit takové sekvencování, zejmena je-li spojena s metodologií sekvencování nezaloženého na gelu, simultáně aplikovatelné na mnoho vzorků paralelně.
Ve světle výše uvedeného by mělo být užitečné, bude-li dosažitelný oligonukleotidový systém vytváření smyček, který poskytuje větší repertoár smyček, ale také minimalizuje výskyt falešně pozitivních a falešně negativních signálů bez potřeby použití specifických činidel pro narušení přirozeného párování bází a odlišností volné energie řazení baží. Takový systém pro vytváření smyček najde uplatnění v mnoha oblastech, včetně konstrukce a použití kombinatoriálních chemických knihoven, mapování velkého rozsahu a sekvencování DNA, genetické identifikace, lékařské diagnostiky a podobně.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí molekulárního systému pro vytváření smyček pro sledování, získávání a identifikaci sloučenin.
Jiným předmětem mého vynálezu je poskytnutí metody pro třídění identických molekul, nebo podtříd molekul, zejména polynukleotidů, na povrchu materiálu pevné fáze specifickou hybridizací oligonukleotidových smyček a jejich komplementů.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí kombinatoriální chemické knihovny, jejíž sloučeniny jsou identifikovány specifickou hybridizací oligonukleotidových smyček a jejich komplementu.
Ještě dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí systému pro vytváření smyček a třídění mnoha tisíc fragmentů, zejmena náhodně přesahujících fragmentů, cílového polynukleotidu pro simultání analýzu a/nebo sekvencování.
Jiným předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí rychlé a důvěryhodné metody pro sekvencování cílových polynukleotidů majících délku v rozsahu několika stovek párů bázi až několika desítek tisíc párů bází.
Předložený vynález dosahuje těchto a jiných předmětů poskytnutím metody a materiálu pro sledování, identifikaci a/neho třídění tříd nebo subpopulací molekul použitím oligonukleotidových smyček. 01igonukleotidová smyčka podle vynálezu se skládá z velkého množství podjednotek, kde každá podjednotka se skládá z oligonukleotidu o 3 až 4 nukleotidech délky. Podjednotky o 1 igonukleotidové smyčky jsou vybrány z minimálně zkříženě hybridi zující sady. V takové sadě obsahuje duplex nebo triplex, skládající se z podjednotky sady a komplementu, jakékoliv jiné podjednotky sady alespoň dvoje chybné párování. Jinými slovy, podjednotka minimálně zkříženě hybridi zující sady nejlépe vytváří duplex nebo tripex, mající dvě chybná párování s komplementem jakékoliv jiné jednotky stejné sady. Počet oligonukleotidových smyček dosažitelných v jednotlivém provedení závisí na počtu podjednotek na smyčku a na délce podjednotky. Počet je obecně menší než počet všech možných sekvencí délky smyčky, která by pro smyčku o n nukleotidech délky měla být 4n.
Lépe, podjednotkami jsou oligonukleotidy o 4 až 5 nukleotidech délky.
V jednom aspektu vynálezu, komplementy o 1 igonukleotidových smyček připojené na nosič pevné fáze jsou použity pro třídění polynukleotidů ze směsi polynukleotidů obsahujících smyčku. V tomto provedení jsou komplementy oligonukleotidových smyček syntetizovány na povrchu nosiče pevné fáze, jako jsou mikroskopické korálky nebo specifické lokace na matici lokací syntézy na jednom nosiči, jako v tom případě, jsou-li populace identických sekvencí produkovány ve specifických regionech. To znamená, že povrch každého nosiče, v případě korálků, nebo každý region v případě matice, je odvozen od pouze jednoho typu komplementu, který má určitou sekvenci. Populace takových korálků nebo regionů obsahuje repertoár komplementů s odlišnými sekvencemi, kde velikost repertoáru závisí na
L počtu podjednotek na oligonukleotidovou smyčku a délce použitých podjednotek. Obdobně, polynukleotidy, které mají být tříděny, obsahují oligonukleotidovou smyčku v repertoáru, takže identické polynukleotidy mají stejnou smyčku a odlišné polynukleotidy mají odlišné smyčky. Jak je důkladněji vysvětleno dále, této podmínky je dosaženo odebráním dostatečně malého vzorku označených oligonukleotidů ze všech označených oligonukleotidů. Tak jsou-li smíseny populace nosičů a polynukleotidy za podmínek, dovolujících specifickou hybridizaci oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy, je subpopulace identických polynukleotidů tříděna na jednotlivých korálcích nebo regionech. Subpopulace polynukleotidů pak může být zpracovávána na nosičích pevné fáze mikro-biochemickými technikami.
Obecně zahrnuje metoda podle mého vynálezu následující kroky: (a) připojení oligonukleotidové smyčky z repertoáru smyček na každou molekulu v populaci molekul (i) tak, že v podstatě všechny stejné molekuly nebo stejné subpopulace molekul v populaci mají připojené stejné o 1igonukleotidové smyčky a v podstatě všechny odlišné molekuly nebo odlišné subpopulace molekul v populaci mají připojené odlišné oligonukleotidové smyčky a (ii) tak, že každá oligonukleotidová smyčka z repertoáru zahrnuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z o 1igonukleotidu, majícího délku od tří do šesti nukleotidů nebo od tří do šesti párů bází, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridi zující sady; a (b) třídění molekul nebo subpopulací molekul v populaci specifickou hybridizaci oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy.
Důležitým aspektem předloženého vynálezu je použití oligonukleotidových smyček ke třídění polynukleotidů pro paralelní určování sekvence. Výhodně je takové sekvencování provedeno následujícími kroky: (a) generování množství fragmentů z cílového po 1ynuk1eotidu, které pokrývají cílový polynukleotid; (b) připojení oligonukleotidové smyčky z repertoáru smyček na každý fragment tohoto množství tak, že (i) v podstatě všechny stejné fragmenty mají připojené stejné oligonukleotidové smyčky a v podstatě všechny odlišné fragmenty mají připojené odlišné o 1igonukleotidové smyčky a (ii) že každá oligonukleotidová smyčka z repertoáru obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka tohoto množství se skládá z oligonukleotidu, majícího délku od tří do šesti nukeotidů nebo od tří do šesti párů bází, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridi zující sady; a (b) třídění molekul nebo subpopulací molekul v populaci specifickou hybridizací oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy; (c) určení nukleotidové sekvence části každého fragmentu z tohoto množství, výhodně metodou sekvencování jednotlivých bází jak je popsána níže; a (d) určení nukleotidové sekvence cílového nukleotidu shromážděním sekvencí fragmentů.
Předložený vynález překlenuje klíčový problém deficitu nových metod připojování nebo značení molekul o 1igonukleotidy; kódováním sekvencí smyček podle vynálezu je stabilita jakýchkoliv chybně spárovaných duplexů nebo triplexů mezi smyčkou a komplementem pro jinou smyčku o mnoho nižší než stabilita jakéhokoliv přesně spárovaného duplexu mezi smyčkou a jejím vlastním komplementem. Tak je eliminován problém nepřesného třídění způsobeného tím, že
L chybně spárované duplexy GC-bohatách smyček jsou stabilnější než přesně spárované AT-bohaté smyčky.
Při použití v kombinaci s nosiči pevné fáze, jako jsou mikroskopické korálky, předložený vynález poskytuje snadno automatizovaný systém pro zpracování a třídění o 1 igonukleotidů, který je zejména upotřebitelný v široké škále paralelních operací, jako je široká škála DNA sekvencování, kde je sekvencováno a/nebo analyzováno mnoho cílových polynuk1eotidů nebo mnoho segmentů jednoho cílového polynukleotidu simultáně.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek la - lc ilustruje struktury značených prob využitých v preferované metodě single base sekvencování, které mohou být použity ve vynálezu.
Obrázek 2 ilustruje relativní umístění rozpoznávacího místa pro nukleasu, ligačního místa a štěpícího místa v ligovaném komplexu vytvořeném mezi cílovým polynukleotidem a použitou probou v preferované metodě single base sekvencování.
Obrázek 3 je průtokový diagram ilustrující obecný algoritmus pro generování minimálně zkříženě hybridi zujících sad.
Obrázek 4 ilustruje schéma pro syntézu a použití kombinatoriální chemické knihovny, ve které jsou sloučeniny, které jsou členy, značeny oligonukleotidovými smyčkami podle vynálezu.
Obrázek 5 na diagramu ilustruje přístroj pro provádění paralelních operací, jako je sekvencování polynukleotidů, podle vynálezu.
Def inice:
Komplement nebo komplement smyčky jak je zde použito v odkazu na oligonukleotidové smyčky označuje o 1igonuk1eotid, na který o 1 igonukleotidová smyčka specificky hyhridizuje za tvorby přesně spárovaných duplexů nebo triplexů. V provedení, kde specifická hybridizace vede ke triplexu, může být oligonukleotid bud dvouřetězcový nebo jednořetězcový.
Tak, jsou-li vytvářeny triplexy, je míněn termín komplement tak, že zahrnuje bud dvouřetězcový komplement jednořetězcové oligonukleotidové smyčky nebo jednořetězcový komplement dvouřetězcové oligonukleotidové smyčky.
Termín oligonukleotid jak je zde použit zahrnuje lineární oligomery přirozených nebo modifikovaných monomerů nebo řetězců genů, včetně deoxyribonukleosidů, ribonukleosidů, jejich α-anomerních forem, peptidových nukleových kyselin (PNA) a pod., schopných specifické vazby na cílový polynukleotid prostřednictvím patřičných interakcí monomer - monomer, jako je Watson-Crick typ párování bází, řazení bází, Hoogsteenovy nebo reverzní Hoogsteenovy typy párování bází a podobně. Obvykle jsou monomery navázány fosfodiesterovými vazbami nebo jejich analogy za tvorby oligonukleotidů velikosti od několika jednotek monomerů, např. 3 - 4-, do několika desítek jednotek monomerů. Je-li oligonukleotid reprezentován sekvencí písmen, jako je ATGCCTG, je to míněno tak, že zleva doprava je nukleotid ve směru 5' - 3' a že A označuje deoxyadenosin, C označuje deoxycytidin, G označuje doexyguanosin a T označuje thymidin, pokud není označeno jinak. Analoga fosfodiesterových vazeb zahrnují fosforothioátovou, fosforodithioátovou, fosforoani1idátovou, fosforoamidátovou vazbu a pod. Obvykle oligonukleotidy podle vynálezu zahrnují čtyři přirozené nukleotidy; nicméně, mohou také zahrnovat nepřirozená analoga nukleotidů. Odborníkům je jasné, že mohou-li být využity oligonukleotidy, mající přirozené nebo nepřirozené nukleotidy, budou například při požadavku zpracování enzymy požadovány obvykle oligonukleotidy skládající se z přirozených nukleotidů.
Přesně spárovaný s odkazem na duplex znamená, že polynebo oligonukleotidový řetězec tvořící duplex vytváří dvouřetězovou strukturu s jiným tak, že každý nukleotid v každém řetězci podléhá Watson-Crickovu párování baží s nukleotidem v druhém řetězci. Termín také zahrnuje použití párování nukleosidových analogů, jako je deoxyinosin, nukleosidy se 2 aminopurinovými bázemi a podobně. S ohledem na triplex termín znamená, že se triplex skládá z přesně spárovaného duplexu a třetího řetězce, ve kterém každý nukleotid podléhá Hoogsteenově nebo reversní Hoogsteenově asociaci s párem bází přesně spárovaného duplexu. Naopak, chybné spárování v duplexu mezi smyčkou a oligonukleotidem znamená, že pár nebo triplet nukleotidů v duplexu nebo triplexu selhává ve tvorbě Watson-Crickovy a/nebo Hoogsteenovy nebo reversní Hoogsteenovy vazby.
Jak je zde použito, zahrnuje nukleosid přirozené nukleosidy, včetně 2'-deoxy a 2'-hydroxyl forem, např. jak popsal Korngerg and Baker, DNA Replication, 2. vyd.
(Freeman, San Francisko, 1992). Analoga s odkazem na nukleosidy zahrnují syntetické nukleosidy, mající modifikované skupiny bází a/nebo modifikované skupiny cukrů, např. jak popsal Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley,
New York, 1980); Uhlman and Peyman, Chemical Eewiews, 90:
543 - 584 (1990) a podobně, s jednou výhradou, a to že jsou schopné specifické hybridizace. Taková analoga zahrnují syntetické nukleosidy projektované pro zvýšení vazebných vlastností, redukci degenerace, zvýšení specificity a podobně.
Vynález poskytuje metodu pro značení a třídění molekul, zejmena polynukleotidů, za použití oligonukleotidových smyček. Oligonukleotidové smyčky podle vynálezu zahrnují množstvý výrazů” nebo podjednotek vybraných z minimálně zkříženě hybridi zující sady podjednotek. Podjednotky takovéto sady nemohou tvořit duplexy nebo triplexy s komplementem jiné podjednotky stejné sady s méně než dvěma chybně spárovanými nukleotidy. Tak, sekvence jakýchkoli dvou oligonukleotidových smyček z repertoáru, které vytvářejí duplex, si nikdy nebudou bližší než když se liší ve dvou nukleotidech. V jednotlivých provedeních, mohou být sekvence jakýchkoliv dvou oligonukleotidových smyček repertoáru ještě dále rozlišeny, například projektováním minimálně zkříženě hybrid i zující sady tak, že podjednotky nemohou vytvářet duplex s komplementem jiné podjednotky stejné sady s alespoň třemi chybně spárovanýmy nukleotidy, a tak dále. V takovém provedení je dosaženo větší specificity, ale celkový repertoár smyček je menší. Tak, pro smyčky dané délky a velikosti výrazu musí být provedena výměna požadovaného většího stupně specificity a velikostí požadovaného repertoáru. Vynález je zejmena využitelný ve značení a třídění polynukleotidů pro paralelní operace, jako je sekvencování, identifikaci nebo jiné typy analýzy.
Konstrukce oligonukleotidových smyček z minimálně zkříženě hybridizující sady podjednotek
Sekvence nukleotidů podjednotek pro jakoukoliv minimálně zkříženě hybridizující sadu jsou konvenčně počítány jednoduchým počítačovým programem podle obecného algoritmu zobrazeného na Obr. 3, a jak je příkladem doloženo a programu minhx, jehož zdroj kódu je uveden v Příloze I. Minhx zpracovává všechny minimálně zkříženě hybridizující sady mající podjednotky složené ze tří druhů nukleotidů a mající délku čtyř nukleotidů.
Algoritmus Obr. 3 je realizován pomocí první definující charakteristiky podjednotek minimálně zkříženě hybridizující sady, např. délky, počtu lišících se bází mezi členy, a složení, např. jestli se skládají z dvou, tří nebo čtyř druhů bází. Tabulka Mn, n=l, je generována (100) tak, aby se skládala ze všech možných sekvencí dané délky a složení.
Vždy, když má následující podjednotka požadovaný počet chybných párování pro členství v minimálně zkříženě hybridizující sadě, je uložena v nové tabulce Mn+i (125), která také obsahuje podjednotky dříve vyhrané v dřívějším proběhlém kroku 120. Například, v první sadě srovnání bude M2 obsahovat Si, v druhé sadě srovnání bude M3 obsahovat Si a S2, ve třetí sadě srovnání bude M4 obsahovat Si, S2 a S3, a tak dále. Obdobně, srovnání tabulce Mj bude mezi Sj a všemi následujícími podjednotkami v Sj. Všimněte si, že každá následující tabulka Mn+i je menší než předcházející díky eliminaci podjednotek v následném kroku 130. Poté, co byly všechny podjednotky tabulky Mn srovnány (140) je stará tabulka nahrazena novou tabulkou Mn+i, a je započato následující kolo srovnávání. Proces končí (160), když je tabulka Mn naplněna tak, že neobsahuje žádné následující podjednotky ke srovnání s vybranými podjednotkami Si, např. Mn=Mn +1.
Preferovaně, minimálně zkříženě hybridizující sady zahrnují podjednotky, které tvoři přibližně stejný příspěvek pro stabilitu duplexu jako každá jiná podjednotka v sadě. Tímto způsobem je stabilita přesně spárovaných duplexů mezi každou podjednotkou a jejím komplementem přibližně stejná. Návod pro výběr takových sad je poskytnut publikovanými technikami pro selekci optimálních PCR primerů kalkulování stability duplexů, např. Rychlík et al., Nucleic Acids Res. 17: 8543 - 8551 (1989) a 18: 6409 - 6412 (1990); Breslauer et al. , Proč. Nati. Acad. Sci., 83: 3746 - 3750 (1986); Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26: 227 - 259 (1991); a podobně. Pro kratší smyčky, např. okolo 30 nukleotidů nebo méně, je preferován algoritmus popsaný Rychlíkem a Wetmurem, a pro delší smyčky, např. okolo 30 35 nukleotidů nebo větší může být použit algoritmus popsaný Sugsem et al., str. 683 - 693 v Brown, vyd., ICN-UCLA Symp. Dev. Biol., Vol. 23 (Academie Press, New York, 1981). Je jasné, že je mnoho odborníkům dosažitelných přístupů projektování sad minimálně zkříženě hyhridizujících pro podjednotek v rozsahu vynálezu. Například, pro minimalizaci ovlivnění různých energií řazení bází terminálních nukleotidů při sestavování podjednotek mohou být poskytnuty podjednotky mající stejné terminální nukleotidy. Tímto způsobem, jsou-li podjednotky připojeny, bude součet energií řazení bází všech připojených terminálních nukleotidů stejný, což redukuje nebo eliminuje variabilitu v teplotě tání smyček.
V preferovaném provedení jsou minimálně zkříženě hybridizující sady takové, jejichž podjednotky jsou vyrobeny ze tří nebo čtyř přirozených nukleotidů. Jak bude uvedeno důkladněji dále, absence jednoho typu nukleotidu v oligonukleotidové smyčce dovoluje zavedení cílových po 1ynukeotidů na nosič pevné fáze za použití 5'—3' exonukleasové aktivity DNA polymerasy. Dále je uveden příklad minimálně zkříženě hybridizující sady podjednotek, kde každá podjednotka obsahuje čtyři nukleotidy vybrané ze skupiny skládající se z A, G a T:
Tabulka 1
Výraz: wi
Sekvence: GATT
Výraz: ws
W2 W3 W4
TGAT TAGA TTTG
W6 W7 W8
Sekvence:
GTAA
AGTA
ATGT
AAAG
V této sadě bude každý člen vytvářet duplexy mající tř chybně spárované báze s komplementem každého jiného člena.
Další příklady minimálně zkříženě hybridizujících sad jsou uvedeny v Tabulce 2, níže. Je jasné, že mohou být generovány další sady substitucí různých skupin nukleotidů, nebo za použití podsad známých minimálně zkříženě hybridizujících sad.
Tabulka II
Příklady minimálně zkříženě hybridizujících sad 4-mer pod j ednotek.
Sada 1 Sada 2 Sada 3 Sada 4 Sada 5 Sada 6
CATT ACCC AAAC AAAG AACA AACG
CTAA AGGG ACCA ACCA ACAC ACAA
TCAT CACG AGGG AGGC AGGG AGGC
ACTA CCGA CACG CACC CAAG CAAC
TACA CGAC CCGC CCGG CCGC CCGG
TTTC GAGC CGAA CGAA CGCA CGCA
ATCT GCAG GAGA GAGA GAGA GAGA
AAAC GGCA GCAG GCAC GCCG GCCC
AAAA GGCC GGCG GGAC GGAG
Sada 7 Sada 8 Sada 9 Sada 10 Sada 11 Sada 12
AAGA AAGC AAGG ACAG ACCG ACGA
ACAC ACAA ACAA AACA AAAA AAAC.
AGCG AGCG AGCC AGGC AGGC AGCG
CAAG CAAG CAAC CAAC CACC CACA
CCCA CCCC CCCG CCGA CCGA CCAG
CGGC CGGA CGGA CGCG CGAG CGGC
GACC GACA GACA GAGG GAGG GAGG
GCGG GCGG GCGC GCCC GCAC GCCC
GGAA GGAC GGAG GGAA GGCA GGAA
01igonukleotidové smyčky podle vynálezu a jej ich
komplementy jsou běžně syntetizovány na automatizovaném DNA
syntet i zéru , např. Applied Biosystems, lne. (Foster City,
Calif ornia) model 392 nebo 394 DNA/RNA syntetizer, za
použití standardních chemikálií, jako je chemikálie
fosforamidit, např . popsaná v následujících odkazech:
Beucage and Iyer, Tetrahedron, 48; 2223 - 2311 (1992) ; Molk
et al., U.S .Patent 4908460; Koster et al. , U.S. Patent
4725677; Caruthers et al., U.S . patent 4415732, 4458066
a 4937679 a podobn ě. Alternativní chemikálie, např. vedoucí
k nepřirozeným řetězcovým skupinám, jako je fosforothioát, fosforoamidát a podobně, mohou být také použity umožňují-li, aby vzniklé o 1 igonukleotidy byly schopné specifické hybridizace. V některých provedeních mohou smyčky obsahovat přirozeně se vyskytující nukleotidy, které dovolují zpracování nebo manipulaci enzymy, zatímco korespondující komplementy smyček mohou obsahovat přirozeně se nevyskytující analoga nukleotidů, jako jsou peptidové nukleové kyseliny, nebo podobné sloučeniny, které navozují tvorbu stabilnějších duplexů v průběhu třídění.
Jsou-li jako nosiče použity mikročástice, je repertoár oligonukleotidových smyček a komplementů smyček preferovaně generován podjednotkovým způsobem syntézy cestou štěp a míchej techniky, např. jak popsal Shortle et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/US93/03418. Stručně, základní jednotkou syntézy je podjednotka oligonukleotidové smyčky. Preferovaně je použita fosforamiditová chemikálie a 3' fosforamiditové o 1igonukleotidy jsou připraveny pro každou podjednotku minimálně zkříženě hybridizující sady, např. pro první sadu uvedenou výše bude osm 4-mer '-fosřoramidi tů. Syntéza probíhá jak popsal Shortle et al . nebo v přímé analogii s technikami upotřebenými ke generování různých oligonukleotidových knihoven za použití nukleosidových monomerů, např. jak je popsáno v Telenius et al., Genomics, 13: 718 - 725 (1992); Welsh et al., Nucleic Acids Research, 19: 5275 - 5279 (1991); Grothues et al., Nucleic Acids Research, 21; 1321 - 1322 (1993); Hartley, evropská patentová přihláška 90304496.4; Lam et al., Nátuře, 354: 82 - 84 (1991); Zuckerman et al., Int. J. Pept. Protein Research, 40: 498 - 507 (1992), a podobně. Obecně tyto techniky požadují aplikaci směsí aktivovaných monomerů do rostoucích oligonukleotidů během kroků spojování.
Dvouřetězcové formy smyček mohou být vyrobeny separátní syntézou komplementárních řetězců následovanou smícháním za podmínek dovolujících tvorbu duplexu. Alternativně, dvouřetězcové smyčky mohou být tvořeny nejprve syntézou jednořetězcového repertoáru navázaného na známou oligonukleotidovou sekvenci, která slouží jako místo pro vazbu primeru. Druhý řetězec je potom syntetizován kombinováním jednořetězcového repertoáru s primerem a rozšířením polymerasou. Tento pozdější přístup popsal Oliphant et al., 44: 177 - 183 (1986). Takové duplexní smyčky pak mohou být insertovány do klonujících vektorů spolu s cílovými polynukleotidy pro třídění a manipulaci cílového polynukleotidů podle vynálezu.
V provedení, kde se vyskytuje specifická hybridizace cestou tvorby triplexů, sleduje kódování sekvencí smyček stejné principy jako pro duplex vytvářející smyčky; nicméně, jsou zde jistá omezení ve výběru sekvencí podjednotek.
Obecně, asociace třetího řetězce prostřednictvím Hoogsteenova typu vazby je nejstabilnější mezi homopyrimidin-homopurin dráhami v dvouřetězcovém cíli.
Obvykle tvoři triplety bází T-A*T nebo C-G*C motivy (kde indikuje Watson-Crickovo párování a indikuje Hoogsteenův typ vazby); nicméně, jiné motivy jsou také možné. Například, Hoogsteenovo párování bází umožňuje paralelní a antiparalelni orientace mezi třetím řetězcem (Hoogsteenovým řetězcem) a řetězcem duplexu bohatým na purin, na který se třetí řetězec váže, v závislosti na podmínkách a složení řetězců. V literatuře existuje rozsáhlý návod pro selekci vhodných sekvencí, orientace, podmínek, typu nukleosidů (např. jestli jsou použity ribosové nebo deoxyribosové nukleosidy), modifikaci bází (např. methylovaný cytosin, a podobně) pro maximalizaci, nebo jinou regulaci, stability triplexů, jak je požadována v jednotlivých provedeních, např. Roberts et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 88: 9397 9401 (1991); Roberts et al., Science, 258: 1463 - 1466 (1992); Distefano et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 90: 1179 1183 (1993); Mergny et al., Biochemistry, 30: 9791 - 9798 (1991); Cheng et al., J.Am. Chem. Soc., 114: 4465 - 4474 (1992); Beal a Dervan, Nucleic Acids Research, 20: 2773 2776 (1992); Beal a Dervan, J.Am. Chem. Soc. 114: 4976 4982 (1992); Giovannangeli et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89: 8631 — 8635 (1992); Moser a Dervan, Science, 238: 645
- 650 (1987); Mc Shan et al., J.Biol. Chem., 267: 5712 5721 (1992); Yoon et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89: 3840 3844 (1992); Blume et al., Nucleic Acids Research, 20: 1777
- 1784(1992); Thuong a Helene, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 666 - 690 (1990) a podobně. Podmínky pro teplotní hybridizace jednořetězcových nebo duplexních smyček s jejich jednořetězcovými nebo duplexními komplementy jsou dobře známé, například Ji et al., Anal. Chem. 65: 1323 - 1328 (1993) .
01igonukleotidové smyčky podle vynálezu mohou mít délku v rozsahu od 12 do 60 nukleotidů nebo párů bází. Preferovaně mají oligonukleotidové smyčky délku v rozsahu od 18 do 40 nukleotidů nebo párů bází. Ještě lépe mají oligonukleotidové smyčky délku v rozsahu od 25 do 40 nukleotidů nebo párů bázi. V oblasti preferovaného a více preferovaného počtu podjednotek může být rozsah vyjádřen následovně:
Tabulka 3 *· Počet podjednotek ve smyčce v preferovaném provedení
Monomery v podjednotce nukleotidy v oligonukleotidové smyčce
3 4-20 (12 - 60) podj ednot. 6-13 (18 - 40) podj ednot. (25 - 40) 8-13 podjednot
4 3-15 podj ednot. 4-10 podj ednot. 6-10 podjednot
5 2-12 podj ednot. 3-8 podj ednot. 5-8 podjednot.
6 2-10 podj ednot. 3-6 podj ednot. 4-6 podjednot.
Nejpreferovaněji jsou oligonukeotidové smyčky jednořetězcové a specifická hybridizace se vyskytuje prostřednictvím Watson-Crickova párování s komplementem smyčky.
Připojení smyček na molekuly
01igonukleotidové smyčky mohou být připojeny na mnoho odlišných tříd molekul celou řadou reaktivních skupin v oboru dobře známých, např. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, lne., Eugene, 1992); Khanna et al., U.S. Patent 4318846; a podobně. Tabulka IV poskytuje příklady skupin a opačných reaktivních skupin, které mohou být obsaženy na molekulárních smyčkách nebo na požadovaných molekulách. Při společné reakci skupin a jejich reaktantů, v některých případech po aktivaci, je vytvářena vazebná skupina. Navíc, jak je přesněji popsáno níže, smyčky mohou být syntetizovány simultáně s molekulami podrobujícími se selekci za vytváření kombinatoriálních
chemických knihoven.
Tabulka IV
Reaktivní skupiny a vazebné skupiny j e j i ch protěj š í reaktanty a vzniklé
Reaktivní opačná vazebná
funkce funkce skupina
-nh2 -COOH -CO-NH-
-nh2 -NCO -NHCONH-
-nh2 -NCS -NHCSNH-
-nh2 N- // -fJH lf ty ú—\\ ty ŇH—
-SH -C=C-CO- -S-C-C-CO-
-nh2 -CHO -CH2NH-
-nh2 -SO2CJ -so2nh-
-OH -OP(NCHíCH3)2)2 -OP(=O)(O)O-
-OP(=O)(O)S -NHC(=O)CH2Br -NHC(=O)CH2SP(=O)(O)O-
Třída molekul zejmena vhodných pro generování kombinatoriálních chemických knihoven zahrnuje lineární polymerní molekuly vzorce:
- (M -L)nkde L je vazebná skupina a M je monomer, který může být vybrán ze široké škály chemických struktur pro poskytnutí velkého rozsahu funkcí od té, že slouží jako inertní nesterická bránící spacerová skupina až do poskytnutí reaktivní funkční skupiny, která může sloužit jako bod větvení pro připojení jiných složek, místo pro připojení značek, místo pro připojení oligonukleotidů nebo jejich vazebných polymerů pro hybridizaci nebo vazbu na terapeutický cíl, nebo jako místo pro připojení jiných skupin pro ovlivnění rozpustnosti, navození tvorby duplexů a/nebo triplexů, jako jsou interkalatory, alkylační činidla, a podobně. Sekvence, a tak i složení, takové lineární polymerní molekuly může být kodováno uvnitř polynukleotidu připojeného na smyčku, jak uvádí Brenner and Lerner (citován výše). Nicméně, po selekci, místo amplifikace a pak sekvencování smyčky vybrané molekuly, může být smyčka sama nebo další kódující segment sekvencována přímo za použití takzvaného single base přístupu popsaného níže, po uvolnění požadované molekuly, např. restrikčním trávením místa zapracovaného do smyčky. Je zřejmé, že jakákoliv molekula produkovaná sekvencí kroků chemické reakce kompatibilních se simultání syntézou skupin smyček může být použita v generování kombinatoriálních knihoven.
Běžně existuje široká diversita fosfát-vázaných monomerů dosažitelných pro generování kombinatoriálních knihoven.
Následující odkazy popisují několik fosforamiditových *· a/nebo hydrogenfosfonátových monomerů vhodných pro použití v předkládaném vynálezu a poskytují návod pro jejich syntézu *· a zahrnutí do oligonukleotidů: Newton et al., Nucleic Acids
Research, 21: 1155 - 1162 (1993); Griffin et al., J.Am.
Chem. Soc., 114: 7976 - 7982 (1992); Jaschke et al., Tetrahedron Letters, 34: 301 - 304 (1992); Ma et al., mezinárodní patentová přihláška PCT/CA92/00423; Zon et al., mezinárodní patentová přihláška PCT/US90/06630; Durand et al., Nucleic Acids Research, 18: 6353 - 6359 (1990);
Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 8768 - 8772 (1992); Urdea et al., U.SpPatent 5093232; Ruth, U.S.patent 4948882; Cruickshank, U.S. patent 5091519; Haralambidis et al., Nucleic Acids Research, 15; 4857 - 4876 (1987) a pod. Přesněji, M může být přímý řetězec, cyklické, nebo větvené organické molekulární struktury, obsahující od 1 do 20 atomů uhlíku a od 0 do 10 heteroatomů vyhraných ze skupiny skládající se z kyslíku, dusíku a síry. Preferovaně je M alkyl, alkóxy, alkenyl nebo aryl osahující od 1 do 16 atomů uhlíku; heterocyklus má od 3 do 8 atomů uhlíku a od ' 1 do 3 heteroatomů vybraných ze skupiny, skládající se z kyslíku, dusíku a síry; glykosyl; nebo nukleosidyl.
* Preferovaněji je M alkyl, alkóxy, alkenyl, nebo aryl obsahující od 1 do 8 atomů uhlíku; glykosyl; nebo nukleos idyl.
Preferovaně je L fosforem(V) vázaná skupina, kterou může být fosfodiester, fosfotriester, methyl nebo ethyl fosfonát, fosforothioát, fosforodithioát, fosforoamidat a podobně. Obecně jsou preferovány vazby odvozené od fosforoamiditových nebo hydrogenfosfonátových prekurzorů, takže lineární polymerové jednotky podle vynálezu mohou být konvenčně syntetizovány komerčními automatizovanými DNA syntetizéry, např. Appliaed Biosystems, lne., (Foster City, CA) model 394, nebo podobným.
n se může významně lišit v závislosti na charakteru L a M. Obykle se n liší od 3 do 100. Je-li M nukleosid nebo jeho analog nebo monomer rozsahu nukleosidu a L je fosforová (V) vazba, pak se n pohybuje od asi 12 do asi 100. Preferovaně, je-li M nukleosid nebo jeho analog nebo monomer rozsahu nukleosidu a L je fosforová (V) vazba, pak se n pohybuje od asi 12 do asi 40.
Peptidy jsou jinou preferovanou třídou molekul, na kter jsou připojovány smyčky podle vynálezu. Syntéza peptid-o1igonukleotid konjugátů, které mohou být použity ve vynálezu je uvedena v Nielsen et al., J.Am. Chem.Soc., 115: 9812 - 9813 (1993); Haralambidis et al (citován výše) a mezinárodní patentová přihláška PCT/AU88/004417; Truffert et al., Tetrahedron Letters, 35: 2353 - 2356 (1994); de la Torre et al., Tetrahedron Letters, 35: 2733 - 2736 (1994); a podobně. Preferovaně jsou konjugáty peptid-oligonukleotid syntetizovány podle postupu popsaného níže. Peptidy syntetizované podle vynálezu se mohou skládat z přirozených aminokyselinových monomerů nebo nepřirozených monomerů, včetně D isomerů přirozených aminokyselin a podobně.
Kombinatoriální chemické knihovny
Kombinatoriální chemické knihovny využívající smyček podle vynálezu jsou preferovaně připraveny podle metody popsané Nielsenem et al (citován výše) a ilustrované na Obr.
pro určité provedení. Stručně, nosič-pevná fáze- jako je CPG, je derivatizován se štěpitelným linkerem. který je kompatibilní jak s chemikáliemi použitými k syntéze smyček, tak chemikáliemi použitými k syntéze molekul, které budou podrobeny nějakému procesu selekce. Preferovaně, smyčky jsou syntetizovány za použití fosforamiditové chemie jak bylo popsáno výše a s modifikací doporučenou Nielsenem et al. (citován výše); t.j. DMT-5'-O-chráněný 3'fosforamidit-derivat izované podjednotky, mající ethyl-chráněné fosfitové a fosfátové skupiny jsou přidány v každém cyklu syntézy. Sloučeniny knihovny jsou preferovaně monomery mající Fmoc—nebo ekvivalent—chránící skupiny maskující funkce, na které bude následující monomer navázán. Vhodný linker pro chemický postup využívající jak DMT, tak Fmoc chránící skupiny (označené zde jako sarkosinové linkery) je popsán Brownem et al., J.Chem. Soc. Chem. Commun., 1989: 891 - 893, což je zde uvedeno jako odkaz.
Obrázek 4 ilustruje schéma pro generování kombinatoriální chemické knihovny peptidů konjugovaných s oligonukleotidovými smyčkami. Nosič pevné fáze 200 je derivatizován sarkosin linkerem 205 (příkladem doložený ve vzorci níže) jak uvádí Nielsen et al. (citován výše), který má rozšířené vazebné skupiny pro usnadnění přístupu činidla.
(CPG)-NHC(O)CN(CH3)C(O)CH2CH2C(O)O(CH2)6NHC(O)CH2 (O-DMT)NC(O)-CH2O(CH2CH2O)2CH2CH2NHC(O)CH2O(CH2CH2O)2ch2
CH2NH-Fmoc
Zde CPG reprezentuje kontrolovaný-porézní skleněný nosič, DMT reprezentuje dimethoxytri tyl, a Fmoc reprezentuje 9-fluorenylmethoxykarbony1.
V preferovaném provedení je oligonukleotidový segment 214 iniciálně syntetizován tak, že ve dvouřetězcové formě je poskytnuto místo pro restrikční endonukleasu pro štěpení sloučenin knihovny po třídění na mikročástice, nebo jako substrát. Syntéza probíhá následujícím alternativním podáním podjednotek Si,S2,S3 a podobně, za vytvoření smyčky 212, a její korespondující monomery sloučenin knihovny Ai,A2,A3 a tak dále, za vytvoření sloučeniny 216 knihovny. Je využita technika štěp a míchej pro generování rozmanitosti s1oučenin.
Podjednotky v minimálně zkříženě hybridizující sadě kódují monomer přidaný v sloučenině knihovny. Tak devět daných výrazů může jednoznačně kodovat sloučeniny knihovny konstruované z devíti monomerů. Jestliže je akceptovatelná nějaká nejednoznačnost, pak jedna podjednotka může kodovat více než jeden monomer.
Po dokončení syntesy je produkt štěpen a chránící skupiny odstraněny (220) za vzniku označené sloučeniny knihovny 225, která potom podléhá selekci 230, např. vazbou na předem určený cíl 235, jako je protein. Podsada sloučenin knihovny shromážděná z procesu selekce 230 je potom tříděna (240) na nosič pevné fáze 245 prostřednictvím svých smyčkových skupin (komplementární podjednotky a nukleotidy jsou vytištěny kurzívou). Po ligaci odštěpené části o 1 igonuk1eotidu 242 na komplement 250 smyčky za vzniku restrikčního místa 255, je konjugát tráven korespondující restrikční endonukleasou za štěpení sloučeniny knihovny, peptidu v příkladu 4, z o 1igonukleotidové skupiny. Sekvence smyčky, a proto identita sloučeniny knihovny, je potom určena preferovanou technikou sekvencování jedné báze podle vynálezu, popsané níže.
Nosiče pevné fáze
Nosiče pevné fáze pro použití ve vynálezu mohou mít velk množství forem, včetně mikročástic, korálků a membrán, blán, ploten, mikrozpracovaných štěpin a podobně. Obdobně, nosiče pevné fáze podle vynálezu mohou obsahovat širokou škálu sloučenin, včetně skla, plastů, silikonu, alkenthiolátem derivat izované zlata, celulosy, nízkozesítěného a vysokozesítěného polystyrenu, silikagelu, polyamidu a podobně.
Preferovaně je použita populace jednotlivých částic tak, že každá má uniformní potažení, nebo populaci, komplementárních sekvencí stejné smyčky (a žádné jiné), nebo je využit jeden nebo několik nosičů s prostorově oddělenými regiony, kde každý obsahuje jednotné potažení, nebo populaci, komplementárních sekvencí ke stejné smyčce (a žádné jiné). V dalším provedení se může plocha regionů velmi .·* lišit podle jednotlivých aplikací; obvykle je plocha regionů od několika pm2, např. 3-5, do několika stovek pm2, např. 100 - 500. Preferovaně jsou takové regiony prostorově oddělené, takže signály generované určitým dějem, např. fluorescentní emisí, mohou být odlišeny v sousedních regionech za pomoci použitého detekčního systému. V některých aplikacích může být žádoucí mít regiony s uniformním potažením více než jedním komplementem smyčky, např. pro simultání sekvenční analýzu, nebo pro přesunutí separátně označených molekul do těsné blízkosti.
Komplementy smyček mohou být užity s nosičem pevné fáze tak, že jsou na něm syntetizovány, nebo mohou být syntetizovány separátně a pak připojeny na nosič pevné fáze pro použití, jak například popsal Lund et al., Nucleic Acids Research, 16: 10861 - 10880 (1988); Albretsen et al., Anal. Biochem., 189: 40 - 50 (1990); Wolf et al., Nucleic Acids Research, 15: 2911 - 2926 (1987); Ghosh et al., Nucleic Acids Research, 15: 5353 - 5372 (1987). Preferovaně jsou komplementy smyček syntetizovány na a použity s stejným nosičem pevné fáze, který může zahrnovat širokou škálu forem a různé vazebné skupiny. Takový nosič může zahrnovat mikročástice nebo matice, nebo matrice, regionů, ve kterých je syntetizována uniformní populace komplementů smyček. Široká škála mikročásticových nosičů může být použita ve vynálezu, včetně mikročástic vyrobených z kontrolovaného porézního skla (CPG), vysoce zesítěného polystyrenu, akrylických kopolymerů, celulosy, nylonu, dextranu, latexu, polyacroleinu, a podobně, jak je popsáno v následujících odkazech: Meth. Enzymol., Section A, str. 11 - 147, vol. 44 (Academie Press, New York, 1976); U.S.Patent 4678814;
4413070; a 4046720; a Pon. Chapter 16 v Agrawal, editor, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 (Humana Press, Totowa, NJ, 1993). Mikročásticové nosiče dále zahrnují komerčně dosažitelné nukleosid - derivatizované CPG a polystyrénové korálky (např. dostupné od Applied Biosystems, Foster City, CA); derivat izované magnetické korálky, polystyren roubovaný s polyethylenglykolem (např. TentaGel ™, Rapp Polymere, Tubingen Germany); a podobně. Výběr vlastností nosiče, jako je materiál, poréznost, velikost, tvar a podobně, a typ použité vazebné skupiny závisý na podmínkách, za kterých jsou smyčky použity. Například, v aplikaci vyžadující následovně zpracování enzymy jsou preferovány nosiče a linkery, které minimalizují sterické překážky (zábrany) enzymů a usnadňují přístup k substrátu. Jiné důležité faktory brané v úvahu při selekci většiny vhodných mikročásticových nosičů zahrnují uniformitu velikosti, účinost jako nosič syntézy, stupeň, na kterém je povrchová plocha známá a optické vlastnosti, např. jak je popsáno podrobněji níže, světlé hladké korálky poskytují instrumentální výhodu při manipulaci s velkým množstvím korálků na povrchu.
Příklady vazebných skupin pro připojení a/nebo syntézu smyček na povrchu mikročástic jsou popsány v Pon et al., Biotechniques, 6; 768 - 775 (1988); Webb, U.S.patent 4659774; Barany et al., mezinárodní patentová přihláška PCT/US91/06103; Brown et al., Chem. Soc. Commun., 1989: 891 - 893; Damha et al., Nucleic Acids Research, 18: 3813 - 3821 (1990); Beattie et al., Clinical Chemistry, 39: 719 - 722 (1993); Maskos and Southern, Nucleic Acids Research, 20:
1679 - 1684 (1992), a podobně.
Jak je uvedeno výše, komplementy smyček mohou být také syntetizovány na jednom (nebo několika) nosičích pevné fáze za vytvoření matice regionů uniformně potažených komplementy smyček. To znamená, že uvnitř každého regionu v takové matici je syntetizován stejný komplement smyčky. Techniky pro syntetizování takových matic jsou popsány v McGall et al., mezinárodní přihláška PCT/US93/03767; Pease et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 5022 - 5026 (1994); Southern a Maskos, mezinárodní přihláška PCT/GB89/01114; Maskos a Southern (citovaní výše); Southern et al., Genomics, 13:
1088 - 1017 (1992); a Maskos a Southern, Nucleic Acids Research, 21: 4663 - 4669 (1993).
Preferovaně je vynález uskutečněn za využití mikročástic nebo korálků uniformně potažených komplementy stejné smyčkové sekvence. Mikročásticové nosiče a metody kovalentni nebo nekovalentní vazby oligonukleotidů na jejich povrch jsou dobře známé, a jsou příklady doloženy v následujících odkazech: Beaucage a Iyer (citovaní výše); Gait, editor,
01igonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); a odkazy citované výše. Obecně, velikost a tvar mikročástic není zásadní; nicméně jsou preferovány mikročástice velikosti od několika, například 1 - 2 do několika stovek, například 200 - 1000 pm v průměru, jelikož usnadňují konstrukci a manipulaci širokého repertoáru oligonukleotidových smyček s minimálním použitím činidla a vzorku.
V některých preferovaných aplikacích jsou využity jako nosiče pevné fáze ve vynálezu komerčně dostupné kontrolované porézní skleněné nosiče (CPG) nebo polystyrénové nosiče.
Takové nosiče jsou dostupné se báze-labilními linkery s a připojenými iniciálními nukleosidy, např. od Applied Biosystems (Foster City, CA). Preferovaně mají použité mikročástice póry velikosti od 500 do 1000 Angstromů.
V jiné preferované aplikaci jsou použity neporézní mikročástice pro své optické vlastnosti, které mohou být výhodné při sledování velkého počtu mikročástic na dvojrozměrném nosiči, jako je mikroskopická blána. Jednotlivými preferovanými neporezními mikročásticemi jsou glycidal methakrylátové (GMA) korálky dostupné od Bangs Laboratries (Carmel, IN). Takové mikročástice jsou využitelné v různých velikostech a derivatizované různými vazebnými skupinami pro syntézu smyček nebo komplementů smyček. Preferovaně, pro rozsáhlou paralelní manipulaci označených mikročástic jsou využity GMA korálky 5 μιη v průměru.
Připojení cílových oligonukleotidů na mikročástice
Důležitým aspektem vynálezu je tříděni populace identických polynukleotidů, například z cDNA knihovny, a jejich připojení na mikročástice nebo oddělené regiony nosičů pevné fáze tak, že každá mikročástice nebo region má pouze jeden typ polynukleotidů. Tato další podmínka může být v podstatě splněna ligací repertoáru smyček na populaci polynukleotidů. Ligační produkty jsou potom klonovány, amplifikovány a rozděleny do vzorků. Pokud je vzorek dostatečně malý, jak je podrobněji popsáno níže, budou v podstatě všechny konjugáty smyčka-polynukleotid výsledné knihovny jedinečné. To znamená, ža každý polynukleotid má jedinečnou smyčku a naopak. Polynukleotidy jsou potom tříděny hybridizací smyček na jejich komplementy.
Repertoár o 1 igonukleotidových smyček může být ligován na populaci polynukleotidů různými způsoby, jako je přímá enzymatická ligace, amplifikace, např. cestou PCR, za použití primerů obsahujících sekvence smyček, a podobně. Iniciální ligační krok produkuje velmi širokou populaci konjugátů smyčka-polynukleotid tak, že jednotlivá smyčka je obecně připojena na mnoho odlišných polynukleotidů. . nicméně, při použití dostatečně malého vzorku konjugátů může být pravděpodobnost získání double, např. stejná smyčka na dva odlišné polynukleotidy, zanedbatelná. (Povšimněme si, že je také možno získat odlišné smyčky se stejným nukleotidem ve vzorku. Tento případ jednoduše vede ke zpracování polynukleotidů, například sekvencování, dvakrát, takže obvykle není problematický). Jak je podrobněji popsáno níže, pravděpodobnost získání získání double ve vzorku může být hodnocena Poissonovou distribucí, protože počet konjugátů ve vzorku bude vysoký, například tisíce a více, a pravděpodobnost selektování jednotlivých smyček bude malá, protože repertoár smyček je velký, například desetitisíce nebo více. Obecně, větší vzorek zamená větší pravděpodobnost získání double. Tak existuje plánovaná záměna mezi selekcí velkého vzorku konjugátů smyčka-polynukleotid—který například umožňuje adekvátní pokrytí cílového polynukleotidů v obecných operacích sekvencování, a selekcí malého vzorku, který umožňuje, že je přítomen minimální počet doubles. Ve většině provedení přidává přítomnost double pouze další zdroj poruch nebo, v případě sekvencování, menší komplikaci v zobrazení a signálním zpracování, kdy mikročástice dávající mnohotné fluorescentní signály mohou být ignorovány. Jak je zde použito termín v podstatě všechny ve vztahu k připojení smyček na molekuly, zejmena polynukleotidy, odráží statistické vlastnosti vzorkovacích postupu využitých pro získání populace smyčka-polynukleotid, která je v podstatě prostá doubless Význam v podstatě všechny v aktuálních procentech konjugátů smyčka-polynukleotid závisí na tom, jaké smyčky byly použity. Preferovaně, pro sekvencování nukleových kyselin, znamená termín v podstatě všechny to, že alespoň osmdesát procent smyček má připojený jednotlivý oligonukleotid. Preferovaněji to znamená, že alespoň devadesát procent smyček má připojený jednotlivý oligonukleotid. Ještě preferovaněji to znamená, že alespoň devadesát pět procent smyček má připojený jednotlivý oligonukleotid.
A nejpreferovaněji to znamená, že alespoň devadesát devět procent smyček má připojený jednotlivý oligonukleotid.
Preferovaně, skládá-li se populace polynukleotidů z messengerové RNA (mRNA) jsou oligonukleotidové smyčky připojeny reversní transkripcí mRNA se sadou primerů obsahujících komplementy smyčkových sekvencí. Příklad sady takových primerů může mít následující sekvenci:
5'- mRNA - (A)n - 3' (T)i9GG(W,W,W,C)9ACCAGCTGATC- 5'- biotin kde (W,W,W,C)9 reprezentuje sekvenci oligonukleotidové smyčky o devíti podjednotkách po čtyřech nukleotidech a (W,W,W,C) representuje podjednotku sekvencí uvedených výše, například W reprezentuje T nebo A. Podtržené sekvence identifikují volitelné místo pro restrikční endonukleasu, které může být použito pro uvolnění polynukleotidu z připojení na nosič pevné fáze prostřednictvím biotinu, je-li použit. Pro výše uvedený primer může mít komplement připojený na mikročástici vzorec
5' - (G , W, W , W) 9TGG - linker - mikročástice
Po reverzní transkripci je mRNA odstraněna, např. trávením RNAsou H, a druhý řetězec cDNA je syntetizován, například za užití primeru následujícího vzorce:
5' - NRRGATCYNNN - 3' kde N je jeden z A, T, G nebo C; R je nukleotid obsahující purin a Y je nukleotid obsahující pyrimidin. Tento určitý primer vytváří Bst Yl restrikční místo ve výsledné dvojřetězcové DNA, které, spolu s Sal I místem, usnadňuje klonování do vektoru s, například, Bam Hl a Xho I místy. Po Bst Yl a Sal I trávení bude mít příkladný konjugát vzorec:
5' - RCGACCA(C,W,W,W)9GG(T)19 - cDNA - NNNR
GGT(G,W,W,W(9CC(A)19 - rDNA - NNNYCTAG - 5'
Preferovaně, je-li využita metoda sekvencování založená na ligase, jsou Bst Yl a Sal I trávené fragmenty klonovány do Bam ΗΙ/Xho I tráveného vektoru majícího následující restrikční místa jedné kopie:
5’ - GAGGATGCCTTTATGGATCCACTCGAGATCCCAATCCA - 3'
Fok I BamHI Xhol
Toto přidává Fokl místo, které umožňuje iniciaci procesu sekvencování detailněji popsaného dále.
Obecná metoda pro odhalení jednořetězcové smyčky po amplifikaci vyžaduje trávení cílového polynukleotid obsahujícího konjugátu T4 DNA polymerasou s 5'-3* exonukleasovou aktivitou, nebo podobným enzymem. Je-li použita za přítomnosti jednoho nukleosid trifosfátu, pak taková polymerasa bude štěpit nukleotidy od 3' přerušených konců přítomných na netemplátovém řetězci dvouřetězcového fragmentu dokud komplement jednoho nukleosid tirfosfátu není dosažen na templátovém řetězci. Jestliže je takový nukleotid dosažen, 5'- 3' trávení se účinně zastaví, jelikož rozšířená aktivita polymeras přidává nukleotidy ve vyšším stupni, než excizní aktivita odstraňuje nukleotidy. Následně jsou smyčky konstruované se třemi nukleotidy snadno připraveny pro zavedení na nosiče pevné fáze.
Technika může být také použita pro preferenční methylaci spodních Fok I míst cílového polynukleotidu a přitom ponechání jednoho Fok I místa v konci polynukleotidu nemethylováného. Nejprve je terminální Fok I místo učiněno jednořetězcovým za použití polymerasy s deoxycytidin trifosfátem. Dvouřetězcová část fragmentu je potom methylována, po čemž je jednořetězcový konec doplněn DNA polymerasou za přítomnosti všech čtyř nukleosid trifosfátů, a tak se regeneruje Fok I místo. Je zřejmé, že tento postup může být zevšeobecněn na jiné endonukleasy než Fok I.
Poté, co jsou oligonukleotidové smyčky připraveny pro specifickou hybridizaci, např. převedením na jeden řetězec jak je popsáno výše, jsou polynukleotidy smíseny s mikročásticemi obsahujícími komplementární sekvence smyček za podmínek, které umožňují vznik přesně spárovaných duplexů mezi smyčkami a jejich komplementy. V literatuře existuji rozsáhlé popisy pro vytvoření takových podmínek. Příklady odkazů, které zahrnují takové popisy, jsou: Wetmur ,
Critical Eewiews in Biochemistry and Molecular Biology, 26:
227 - 259 (1991); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání (Cold Spring Harbor Laboratory, New York) a podobně. Preferovaně jsou podmínky hybridizace dostatečně přísné, takže pouze přesně spárované sekvence vytváří stabilní duplexy. Za takových podmínek jsou polynukleotidy specificky hybridizované na své smyčky ligovány na komplementární sekvence připojené na mikročástice. Nakonec jsou mikročástice promyty pro odstranění neligovaných polynukleotidů.
Jsou-li použity CPG mikročástice konvenčně využívané jako nosiče syntézy, pak je hustota komplementů smyček na povrchu mikročástic typicky vyšší, než je nezbytné pro některé operace sekvencování. To znamená, že v těch přístupech sekvencování, které vyžadují následující ošetření připojených polynukleotidů různými enzymy mohou hustě umístěné polynukleotidy mít tendenci inhibovat přístup relativně velkých enzymů k polynukleotidům. V takových případech jsou polynukleotidy preferovaně smíseny s mikročásticemi tak, že komplementy smyček jsou přítomny v signifikantním přebytku, např. od 10:1 do 100:1, nebo větším, vůči polynukleotidům. Toto zajišťuje, že hustota po lynukleotidů na povrchu mikročástic nebude tak vysoká, aby inhibovala přístup enzymů. Preferovaně je průměrný interpolynukleotidový prostor na povrchu mikročástice v rozmezí 30 - 100 nm. Návod pro výběr poměrů pro standartní CPG nosiče a Ballotiniho korálky (typ pevných skleněných nosičů) je dán v Maskos a Southern, Nucleic Acids Research, 20: 1679 - 1684 (1992). Preferovaně, pro aplikaci v sekvencování, jsou standardní CPG korálky o průměru 20 50 pm pokryty asi 105 polynukleotidy a GMA korálky o průměru asi 5 - 10 pm jsou pokryty několika desítkami tisíci polynukleotidů, např. 4 x 104 až 6 x 104.
Výše uvedená metoda může být použita pro mapování mRNA populace, pokud je spojena s paralelní metodou sekvencování popsanou níže. Určitá informace o sekvenci je získána simultáně z velkého vzorku, např. deseti až sto tisíc, cDNA připojených na separátní mikročástice jak je popsané ve výše uvedené metodě. Frekvence distribuce určitých sekvencí může identifikovat mRNA populace z různých buněk nebo typů tkání, stejně jako od chorobných tkání, jako jsou rakovině tkáně. Takové mRNA otisky jsou využitelné pro monitorování a diagnostiku chorobných stavů, např. mezinárodní přihláška PCT/US95/21944, která popisuje použití exprese sekvence smyček (EST) za stejným účelem.
Jednobázové DNA sekvencování (Single Base DNA Sequencing)
Předkládaný vynález může být využit v konvenčních metodách DNA sekvencování, např. jak popisuje Hultman et al., Nucleic Acids Research, 17: 4937 - 4946 (1989).
Nicméně, pro paralelní, nebo simultání sekvencování mnoha polynukleotidů jsou následující odkazy: Cheeseman, U.S. patent 5302509; mezinárodní přihláška WO 91/06678; Rosenthal et al., mezinárodní přihláška WO 93/21340; Canard et al., Gene, 148: 1-6 (1994); a Metzker et al . , Nucleic Acids Research, 22: 4259 - 4267 (1994).
Single base metoda sekvencování DNA, která je vhodná pro použití v předkládaném vynálezu a která nevyžaduje elektroforetickou separaci DNA fragmentů je popsána v mezinárodní přihlášce PCT/US95/03678. Metoda zahrnuje následující kroky: (a) ligaci proby na konec polynukleotidů mající přesahující konec za vytvoření ligovaného komplexu, kde proba má komplementární přesahující konec k přesahujícímu konci polynukleotidů a kde má proba rozpoznávací místo pro nukleasu; (b) odstranění neligované proby z ligovaného komplexu; (c) identifikaci jednoho nebo více nukleotidů v přesahujícím konci polynukleotidů pomocí identity ligované proby; (d) štěpení ligovaného konce nukleasou; a (e) opakování kroků (a) až (d) do té doby, dokud není určena sekvence polynukleotidů. Jak je přesněji popsáno níže, identifikace jednoho nebo více nukleotidů může být provedena bud před, nebo po štěpení ligovaného komplexu z cílového polynukleotidů. Preferovaně, jsou-li využity přirozené proteinové endonukleasy, zahrnuje metoda dále krok methylace cílového polynukleotidů na počátku operace sekvencování.
Důležitým rysem metody je proba ligovaná na cílový polynukleotid. Preferovaný vzorec proby je ukázán na Obrázku la. Obecně jsou proby dvouřetězcové DNA s přesahujícím řetězcem v jednom konci 10. Proby obsahují alespoň jedno nukleasové rozpoznávací místo 12 a mezerový region 14 mezi rozpoznávacím místem a přesahujícím koncem 10. Preferovaně proba také obsahuje značku 16, která je v tomto určitém provedeni vyznačena na konci opačném k přesahujícímu řetězci. Proby mohou hýt značeny různými prostředky a na různých místech, jediným omezením je, že prostředek vyhraný ke značení nesmí interferovat s krokem ligace nebo s rozpoznáním proby nukleasou.
Není zásadní, jestli je přesahující řetězec 10 proby 5' 3' konec. Nicméně je důležité, aby přesahující řetězce cílového polynukleotidu a proby byly schopné tvořit přesně spárované duplexy a tak umožnily specifickou ligaci.
Jestliže jsou přesahující řetězce cílového polynukleotidu a proby různých délek, může být vzniklá mezera vyplněna polymerasou před ligaci, například jako tomu je v gapLCR popsané v Backman et al., evropská patentová přihláška 91100959.5. Preferovaně je počet nukleotidů v příslušných přesahujících řetězcích shodný, takže jsou oba řetězce proby a cílového polynukleotidu schopny ligace bez kroku vyplňování. Preferovaně je přesahující řetězec proby dlouhý od 2 do 6 nukleotidů. Jak je ukázáno níže, větší délka přesahujícího řetězce odpovídá větší komplexitě směsi prob, která je aplikována na cílový polynukleotid během každého cyklu ligace a štěpení.
Komplementární řetězce prob jsou běžně syntetizovány na automatickém DNA syntetizéru, např. Applied Biosystems, lne. (Foster City, California) model 392 nebo 394 DNA/RNA Synthesizer, za použití běžných chemikálií. Po synteze jsou komplementární řetězce kombinovány za tvorby dvouřetězcové proby. Obecně, přesahující konec proby je syntetizován jako směs, takže každá možná sekvence je reprezentována v přesahující části. Například, jestliže se přesahující část skládá ze čtyř nukleotidů, jsou v jednom provedení čtyři směsi připraveny následujícím způsobem:
X1X2. ............XiNNNA
X1X2. ............X i NNNC
X1X2. ............XiNNNG, a
X1X2. ............X i NNNT
kde NNN representuje každý možný 3-mer a X representuje duplex vytvářející část řetězce. Tak každá ze čtyř výše uvedených prob obsahuje 43 nebo 64 odlišných sekvencí; nebo, jinými slovy, každá ze čtyř prob má degeneraci 64. Například, X1X2...XiNNNA obsahuje následující sekvence:
X1X2. ...........XiAAAA
X1X2. X1X2. ...........XiAACA ...........XiAAGA
X1X2. ...........XiAATA
X1X2. ...........XiACAA
X1X2. ...........XiTGTA
X1X2. ...........XiTTAA
X1X2. X1X2. ...........XiTTCA ...........XiTTGA
X1X2 . ...........XiTTTA
Takové směsi jsou snadno syntetizovány za použití dobře známých technik, např. jak je popsáno v.Telenius et al., (citován výše). Obecně tyto techniky vyžadují aplikaci směsi aktivovaných monomerů k rostoucím oligonukleotidům během kroku spojování tam, kde je požadováno zavedení degenerace.
V některých provedeních může být žádoucí redukce degenerace prob. Tohoto může být dosaženo užitím degeneraci redukujících analog, jako je deoxyinosin, 2-aminopurin, a podobně, např. jak je uvedeno v Kong Thoo Lin et al.,
Nucleic Acids Research, 20: 5149 - 5152, nebo U.S. patent 5002867.
Preferovaně, pro oligonukleotidy s fosfodiesterovou vazbou, je duplex vytvářející region proby asi 12 až 30 párů baží dlouhý; lépe je jeho délka mezi 15 až 25 páry baží.
Jestliže jsou ve vynálezu použity konvenční ligasy, jak je přesněji popsáno níže. může být 5' konec proby fosforylován v některých provedeních. 5' monofosfát může být připojen na druhý oligonukleotid bud chemicky nebo enzymaticky pomocí kinasy, např. Sambrook et al. (citován výše). Chemická fosforylace je popsána v Horn a Urdea, Tetrahedron Lett., 27: 4705 (1986) a činidla pro provedení popsaných protokolů jsou komerčně dostupná, např.
5r Phosphate-ON™ od Clontech Laboratories (Palo Alto, California). Tak mohou mít proby v některých provedeních vzorec;
5r X1X2............
Y1Y2............
XiTTGA
YiP kde Y jsou komplementární nukleotidy pro X a p je monofosfátová skupina.
Výše uvedené proby mohou být značeny množstvím způsobů, včetně přímého nebo nepřímého připojení radioaktivních skupin, fluorescentních skupin, kolorimetrických skupin, chemiluminiscentních markérů a podobně. Mnoho podrobných článků o metodách pro značení DNA a konstrukci DNA prob poskytuje návod použitelný pro konstrukci prob podle vynálezu. Takové články zahrnují Kricka, vydavatel, Nonisotopic DNA Probe Techniques (Academics Press, San Diego, 1992); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes an Reseaerch Chemicals (Molecular Probes, lne., Eugene, 1992); Keller and Manak, DNA Probes, 2.vydání (Stockton Press, New York, 1993); a Eckstein, vydavatel, 01igonukleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Kessler, vydavatel, Nonradioactive Labeling and Detection of Biomelecules (Springer-Verlag, Berlin, 1992); Wetmur (citován výše); a podobně.
Preferovaně jsou proby značeny jedním nebo více fluorescentními barvivý, např. jak popisuje Menchen et al.,
U.S. patent 5188934; Begot et al., mezinárodní patentová přihláška PCT/US90/05565.
Podle metody je proba ligována na konec cílového polynukleotidu za tvorby ligovaného komplexu v každém cyklu ligace a štěpení. Ligovaný komplex je dvouřetězcová struktura vytvořená poté. co jsou přesahující řetězce cílového polynukleotidu a proby tepelně zpracovány a alespoň jeden pár shodně orientovaných řetězců proby a cíle je ligován, např. prostřednictvím kovalentní vazby, jeden na druhý. Ligace může být provedena bud enzymaticky, nebo chemicky. Chemické metody jsou v oboru dobře známé, např.
Ferris et al., Nucleosides & Nucleotides, 8: 407 - 414 (1989); Shabarova et al., Nucleic Acids Research, 19: 4247 4251 (1991); a podobně. Preferovaně je, nicméně, ligace provedena enzymaticky za použití ligasy ve standardním protokolu. Je známo mnoho ligás a jsou vhodné pro použití v předkládaném vynálezu, např. Lehman, Science, 186: 790 - 797 (1974); Engler et al., DNA Ligases, str. 3-30 v Boyer, vydavatel, The Enzymes, Vol. 15B (Academics Press, New York, 1982); a podobně. Preferované ligasy zahrnují T4 DNA ligasu, T7 DNA ligasu, E.coli DNA ligasu, Taq ligasu, Pfu ligasu, a Tth ligasu. Protokoly pro jejich použití jsou dobře známé, např. Sambrook et al., (citován výše); Barany, PCR Methods and Applications, 1: 5 - 16 (1991); Marsh et al.,
Strategies, 5: 73 - 76 (1992) a podobně. Obecně vyžaduje ligasa, aby byla přítomna 5'fosfátová skupina pro ligaci na 3'hydroxyl sousedního řetězce. Tohoto je běžně dosaženo pro alespoň jeden řetězec cílového polynukleotidů tím, že je vybrána nukleasa, která ponechává 5'fosfát, například Fok I.
V jednom provedení metody sekvencování využívající nefosforylovaných prob krok ligace zahrnuje (i) ligaci proby na cílový polynukleotid ligasou tak, že je tvořen ligovaný komplex mající zářez na řetězci, (ii) fosforylaci 5' hydroxylu na zářezu kinasou za použití konvenčních protokolů, např. Sambrook et al (citován výše), a (iii) opět ligaci ke kovalentnímu spojení řetězců v zářezu, t.j. pro odstranění zářezu.
Zařízení pro pozorování enzymatických procesů a/nebo vazebných pochodů na povrchu mikročástic.
Předmětem vynálezu je třídění identických molekul, zejmena polynukleotidů, na povrchu mikročástic prostřednictvím specifické hybridizace smyček a jejich komplementů. Pokud je takové třídění provedeno může být přítomnost molekul a operace na nich provedené detegována množstvím způsobů v závislosti na vlastnostech připojených molekul, na tom, zda jsou mikročástice detegovány separátně, nebo po dávkách, na tom, zda je požadováno opakované měření, a podobně. Typicky jsou tříděné molekuly vystaveny ligandům pro navázání, například při vývoji léčiv, nebo jsou podrobeny chemickým nebo enzymatickým procesům, například při sekvencování polynukleotidů. V obou těchto použitích je často požadováno simultánní pozorování signálů korespondujícím takovým dějům nebo procesům na velkém počtu mikročástic. Mikročástice nesoucí tříděné molekuly (zde označováno jako zavedené na mikročástice) samy dodávají takovou škálu paralelních operací, např. jak demonstroval Lam et al. (citován výše).
Preferovaně, jsou-li použity signály generující světlo, např. chemiluminiscence, fluorescence a podobně, jsou k detekci dějů nebo procesů zavedené mikročástice umístěny na plošný substrát, např. skleněnou blánu, pro vyšetření snímacím systémem, např. jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US91/09217, PCT/NL90/00081 a PCT/US95/01886. Snímací systém by měl být schopný reprodukovatelně snímat substrát a definovat umístění každé mikročástice v předem definovaném regionu prostřednictvím koordinovaného systému. V aplikacích sekvencování polynukleotidů je důležité, aby poziční identifikace mikročástic byla opakovatelná v následujících snímacích krocích.
Takové snímací systémy mohou být konstruovány z komerčně dosažitelných součástek, např. x-y translační tabulky kontrolované digitálním počítačem použité spolu s detekčním systémem obsahujícím jednu nebo více fotonásobičů, nebo alternativně CCD matici, a vhodnou optikou, např. pro excitaci, shromáždění a třídění fluorescentních signálů. V některých provedeních může být žádoucí konfokální optický systém. Příklad snímacího systému vhodného pro použití ve čtyř-barevném sekvencování je ilustrován na diagramu na Obr.
5. Substrát 300, například mikroskopická blána s fixovanými mikročásticemi, je umístěn do x-y translační tabulky 302, která je připojena na a kontrolována vhodně programovaným digitálním počítačem, který může být jakýmkoliv z množství komerčně dosažitelných osobních počítačů, například na 486-založené přístroje nebo PowerPC model 7100 nebo 8100 dostupné od Apple Computer (Cupertino, CA). Počítačový software pro tabulkovou translaci a funkci shromaždování dat může být poskytnut komerčně dostupným laboratorním softwarem, jako je Lab Windows, dostupný od National Instruments.
Substrát 300 a tabulka 302 jsou operativně spojeny s mikroskopem 306 majícím jednu nebo více čoček objektivu 308, které jsou schopny shromáždění a dopravy světla k mikročásticím fixovaným na substrátu 300. Paprsek excitace 310 ze zdroje světla 312, kterým je preferovaně laser, je namířen na dělič světla, např. diochroické zrcadlo, který opět zaměřuje pole přes mikroskop 306 a čočky objektivu 308, které, postupně, zacílí paprsek na substrát 300. čočky 308 shromáždují fluorescenci 316 emitovanou mikročásticemi a zaměřují ji přes dělič světla 314 na signál distribuující optiku 318, která, postupně, zaměřuje fluorescenci na jednu nebo více vhodných opto-elektronických nástrojů pro konvertování některých vlastností fluorescence, např. intensity, doby životnosti, a podobně, na elektrický signál. Signál distribuující optika 318 může zahrnout množství složek standardních v oboru, jako jsou pásmová propustnost, optická vlákna, rotační zrcadla, pevně umístěná zrcadla a čočky, difrakční mřížky, a podobně. Jak je ilustrováno na Obrázku 5, signál distribuující optika 318 zaměřuje fluorescenci 316 na čtyři oddělené fotonásobiče, 330, 332, 334, a 336, jejichž výstup je potom zaměřen na pre-amps a počítače fotonů, 35, 352, 354, a 356. Výstup počítačů fotonů je potom shromážděn počítačem 304, kde může být uložen, analyzován a prohlížen na videu 360. Alternativně může být signál distribuující optikou 318 difrakční mřížka, který zaměřuje fluorescentní signál 318 na CCD mat ici.
Stabilita a reprodukovatelnost poziční lokalizace ve snímání bude určena, ve větší míře, rozlišením separace těsně umístěných mikročástic. Preferovaně bude snímací systém schopný rozlišit těsně rozmístěné mikročástice, např. oddělené průměrem částice nebo menším. Tak, pro většinu aplikací, např. pro použití CPG mikročástic, by měl mít snímací systém schopnost rozlišit částice alespoň v rozsahu 10 - 100 pm. Ačkoliv vyšší rozlišovací schopnost může být žádoucí v některých provedeních, ale při vyšší rozlišovací schopnosti bude čas požadovaný ke kompletnímu snímání substrátu narůstat; tak musí být v některých provedeních udělán kompromis mezi rychlostí a rozlišovací schopností.
Prodloužení snímacího času může být dosaženo systémem, který pouze snímá pozice, o kterých je známo, že tam jsou umístěny mikročástice, např. z počátečního kompletního snímku.
Preferovaně je velikost mikročástic a rozlišovací schopnost snímacího systému vybrána tak, aby dovolila rozlišení fluorescentně značených mikročástic náhodně uspořádaných na ploše v hustotě asi deset až sto tisíc mikročástic na cm2.
V aplikacích sekvencování mohou být zavedené mikročástice fixovány na povrch substrátu množstvím způsobů. Fixace by měla být dostatečně silná, aby umožnila vystavení mikročástic opakovaným cyklům vystavení činidlům a promytí bez signifikantní ztráty. Je-li substrátem sklo, může být jeho povrch derivat izován alkylamino linkerem za použití komerčně dosažitelných činidel, např. Pierce Chemical, která mohou být postupně zkříženě navázána na avidin, opět za použití konvenčních chemikálií, za vytvoření avidinovaného povrchu. Biotinová skupina může být umístěna na zavedené mikročástice množstvím způsobů, například, frakce, např. 10 - 15 procent, klonovacích vektorů použitých pro připojení smyček na polynukleotidy je zpracována tak, aby obsahovaly jedinečné restrikční místo (poskytující lepivé konce) bezprostředně sousedící s polynukleotidovým insertem na opačném konci polynukleotidu, než je smyčka. Místo je excidováno s polynukleotidem a smyčkou pro zavedení na mikročástice. Po zavedení bude okolo 10 - 15 procent zavedených polynukleotidů mít jedinečné restrikční místo distálně od povrchu mikročástice. Po trávení asociovanou restrikční endonukleasou je vhodný dvouřetězcový adaptor obsahující biotinovou skupinu ligován do lepivého konce. Výsledná mikročástice je potom umístěna na avidinovaný povrch skla, kde je fixována cestou biotin-avidinových vazeb.
Při využití sekvencování ligací je alternativně a preferovaně v počátečním ligačním kroku aplikována směs prob na zavedené mikročástice: frakce prob obsahuje typ lis restrikčních rozpoznávacích míst, jak je požadováno pro metodě sekvencování, a frakce prob nemá taková rozpoznávací místo, ale místo toho obsahuje biotinovou skupinu ve svém neligačním konci. Preferovaně obsahuje směs okolo 10 - 15 procent biotinylovaných prob.
V ještě jiné alternativě, při aplikování DNA-zavedených mikročástic na skleněný substrát může DNA nespecificky adsorbovat na skleněný povrch po několik hodin, např. 24 hodin, kde inkubace vytvoří vazbu dostatečně silnou pro umožnění opakovaného vystavení činidlům a promytí bez signifikantní ztráty mikročástic. Preferovaně je takovým skleněným substrátem průtoková komůrka, která může obsahovat kanál vyleptaný ve skleněné bláně. Preferovaně je takový kanál uzavřený, takže tekutina může být pumpována skrz a má hloubku dostatečně blízkou průměru mikročástic, takže pouze jedna vrstva mikročástic putuje definovanou pozorovací oblastí.
Paralení sekvencování
Systém pro vytváření smyček podle vynálezu může být použit v single base metodě sekvencování pro sekvencování polynukleotidů delších než několik kílobází. Systém pro vytváření smyček umožňuje třídění mnoha tisíc fragmentů cílového polynukleotidu na jednom nebo více nosičích pevné fáze a jejich simultánní sekvencování. V souladu s preferovaným provedením metody je část každého tříděného fragmentu sekvencována v postupným způsobem na každé z mnoha tisíc zavedených mikročástic, které jsou fixovány na běžný substrát---jako je mikroskopická blána---asociovaný se snímacím systémem nebo obrazovým analytickým systémem, jak je popsáno výše. Velikost části sekvencovaných fragmentů závisý na několika faktorech, jako je počet generovaných a tříděných fragmentů, délka cílového polynukleotidu, rychlost a přesnost použité single base metody, počtu mikročástic a/nebo jednotlivých regionů, které mohou být monitorovány simultáně, a podobně. Preferovaně je identifikováno 12 - 50 bázi v každé mikročástici nebo regionu; a lépe je identifikováno 18 - 30 baží v každé mikročástici nebo regionu. S touto informací je sekvence cílového polynukleotidu určena porovnáním fragmentů o 12 - 50 baží prostřednictvím jejich překrývajících se regionů, např. jak popisuje U.S. patent 5002867. Následující odkazy poskytují další návod pro určení části fragmentů, které musí být sekvencovány pro úspěšnou rekonstrukci cílového polynukleotidu dané délky: Lander end Waterman, Genomics, 2: 231 - 239 (1988); Drmanac et al., Genomics, 4: 114 - 128 (1989); Bains, DNA Sequencing and Mapping, 4: 143 - 150 (1993); Bains, Genomics, 11: 294 - 301 (1991); Drmanac et al., J. Biomolecular Structure and Dynamics, 8: 1085 - 1102 (1991); a Pevzner, J. Biomolecular Structure and Dynamics,
7: 63 - 73 (1989). Preferovaně je délka cílového polynukleotidu mezi 1 kilobází a 50 kilobázemi. Lépe je délka cílového polynukleotidu mezi 10 kilobází a 40 kilobázemi. Lander and Waterman (citovaní výše) poskytují návod zabývající se vztahem mezi počtem fragmentů, které jsou sekvencovány (t.j. velikostí vzorku), množstvím informace o sekvenci získané z každého fragmentu, a pravděpodobností, že cílový polynukleotid může být rekonstruován z jednotlivých sekvencí bez mezer, nebo ostrůvků. Pro předkládaný vynález je maximální velikost polynukleotidu, který může být získán pro danou velikost vzorku a velikost sekvencí fragmentů ukázána níže:
Velikost Přibliž, maximální délka cílového polynukleotidu vzorku bází/fragment 50 bází/fragment
1000 3 kilobáze 4 kilobáze
10000 22 kilobáze 32 kilobáze
20000 40 kilobází 65 kilobáz í
30000 60 kilobází 85 kilobází
100000 180 kilobází 300 ki1obází
Fragmenty mohou hýt generovány z cílového polynukleotidu množstvím způsobů, včetně takzvaných přímých přístupů, kde jeden využívá generování sady fragmentů pokrývajících cílový polynukleotid s minimálními přesahy, a takzvaných brokovnicového přístupu, kde jsou generovány náhodně přesahující fragmenty. Preferovaně jsou využity brokovnicové přístupy pro generování fragmentů, jelikož jsou jednodušší a inherentní nadbytečnost. Například, náhodně přesahující fragmenty pokrývající cílový polynukleotid jsou generovány v následujícím běžném brokovnicovém protokolu sekvencování, např. jak je popsáno v Sambrook et al., (citován výše). Jak je zde použito znamená pokrytý v tomto kontextu to, že každá část sekvence cílového polynukleotidu je reprezentována v každém stupni velikosti, například ve všech fragmentech délky mezi 100 a 200 párů baží, generovaných fragmentů. Stručně, s cílovým polynukleotidem jako inzertem ve vhodném klonujícím vektoru, například lambda fágu, je vektor expandován, purifikován a tráven vhodnými restrikčními enzymy za získání 10 - 15 pg purifikovaného insertu Typicky vede protokol k asi 500 - 1000 subklonům na mikrogram počáteční DNA. Insert je separován z fragmentů vektoru preparativní gelovou elektrofořežou, je odstraněn konvenčními metodami a resuspendován ve standardním pufru, jako je TE (Tris-EDTA). Restrikční enzymy vybrané k excizi insertu z vektoru výhodně ponechávají na insertu lepivé konce, takže může být ligován samostatně v přípravku pro generování náhodně přesahujících fragmentů. Jak je vysvětleno v Sambrook et al., (citován výše), cirkularizovaná DNA dává lepší náhodnou distribuci fragmentů než lineární DNA ve fragmentačních metodách využitých dále. Po samostatné ligaci insertu, např. T4 ligasou za použití konvenčních protokolů, je purifikovaný ligovaný insert fragmentován podle standardních protokolů, např. sonikací nebo trávením DNA-asou I za přítomnosti Mn++. Po fragmentaci jsou konce fragmentů opraveny, např. jak je popsáno v Sambrook et al (citován výše), a opravené fragmenty jsou separovány podle velikosti za použití gelové elektroforesy. Fragmenty v rozsahu 300 - 500 párů bází jsou vybrány a eluovány z gelu běžnými prostředky, a jsou ligovány do smyčku-nesoucího vektoru jak je popsáno výše za tvorby knihovny konjugátů smyčka-fragment.
Jak je popsáno výše, vzorek obsahující několik tisíc konjugátů smyčka-fragment je odebrán z knihovny a expandován, potom jsou inserty smyčka-fragment excidovány z vektoru a připraveny pro specifickou hybridizaci s komplementy smyček na mikročásticích, jak je popsáno výše. V závislosti na velikosti cílového polynukleotidu mohou být z knihovny smyčka-fragment odebrány vícečetné vzorky a mohou být odděleně expandovány, zavedeny na mikročástice a sekvencovány. Počet vybraných doubles bude záviset na frakci repertoáru smyček representované ve vzorku.
(Pravděpodobnost získání triples---tří různých polynukleotidů se stejnou smyčkou---nebo více může být bezpečně ignorována). Jak je zmíněno výše, pravděpodobnost doubles ve vzorku může být hodnocena z Poissonovy distribuce p(double)=m2e“B/2, kde m je frakce repertoáru smyček ve vzorku. Tabulka V níže uvádí pravděpodobnosti získání doubles ve vzorku pro danou velikost smyček, velikost vzorku, a repertoár diversity.
Tabulka V
Počet výrazů Velikost Velikost Frakce Pravděpodobnost
ve smyčce ze sady repertoáru smyček vzorku repertoáru vzorku double
8 výrazů
7 2,1x106 3000 1,43x10-3 10-6
8 1,68xl07 3x10^ 1,78x10-3 1,6x10-6
3000 1,78x10-4 1,6x10-8
9 1,34xl08 3x105 2,24x10-3 2,5x10-6
3x104 2,24x10-4 2,5x10-8
10 1,07x10 3x106 2,8x10-3 3,9x10-6
3x105 2,8x10-4 3,9x10-8
V každém případě jsou potom zavedené mikročástice rozptýleny a fixovány na skleněnou mikroskopickou blánu, preferovaně prostřednictvím spojení avidin-biotin. Preferovaně je alespoň 15 - 20 nukleotidů z každého náhodného fragmentu sekvencováno simultáně single base metodou. Sekvence pro cílový polynukleotid je potom rekonstruována porovnáním jednotlivých sekvencí z náhodných fragmentů prostřednictvím jejich přesahujících částí, za použití stejného algoritmu jako byl použit pro sestavení kontingencí, nebo jako je vyvinut pro sekvencování hybridizaci, jak je popsáno ve výše uvedených odkazech.
Kity pro provedení metod podle vynálezu
Vynález obsahuje kity pro provedení různých provedení vynálezu. Preferovaně kity podle vynálezu zahrnují repertoár komplementu smyček připojených na nosič pevné fáze. Navíc, kity podle vynálezu mohou zahrnovat korespondující repertoár smyček, například jako primerů pro amplifikaci tříděných polynukleotidu nebo jako elementů klonujících vektorů, které také mohou být použity pro amplifikaci tříděných polynukleotidu. Preferovaně je repertoár komplementů smyček připojen na mikročástice. Kity mohou také obsahovat vhodné pufry pro enzymatické zpracování, detekční chemikálie, např. flurescentní nebo chemilumiscentní smyčky a podobně, instrukce pro použití, enzymy pro zpracování, jako jsou ligasy, polymerasy, transferasy, a tak dále. V důležitém provedení pro sekvencování mohou kity také obsahovat substráty, jako jsou avidinované mikroskopické blány, pro fixaci zavedených mikročástic pro zpracování
Identifikace nových polynukleotidů v cDNA knihovnách
Nové polynukleotidy v cDNA knihovnách mohou být identifikovány prostřednictvím konstrukce knihovny cDNA molekul připojených na mikročástice, jak je popsáno výše.
Velká frakce, nebo celá knihovna, může pak být sekvencována paralelně. Po izolaci rnRNA, a snad po normalizaci populace jak míní Soares et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 91: 9228 —
9232 (1994), a podobné odkazy, může být následující primer hybridizován na polyA konce pro syntézu prvního řetězce reversní transkriptasou za použití běžných protokolů:
5'-rnRNA-(A)n-3' (T)is-(primer místo)-GG(W,W,W,C)9ACCAGCTGATC-5' kde (W,W,W,C)9 representuje smyčku jak je popsána výše, ACCAGCTGATC je volitelná sekvence vytvářející restrikční místo ve dvouřetězcové formě, a primer místo je sekvence běžná pro všechny členy knihovny, která je později použita jako primer vázající místo pro amplifikaci požadovaných polynukleotidů PCR.
Po reverzní transkripci a syntéze druhého řetězce běžnými technikami jsou dvouřetězcové fragmenty inzertovány do klonovacího vektoru jak je popsáno výše a jsou amplifikovány.
Amplifikovaná knihovna je potom vzorkována a vzorek je amplifikován. Klonovací vektory z amplifikovaného vzorku jsou izolovány, a připojené cDNA fragmenty jsou excidovány a purifikovány. Po zpracování smyčky na jednořetězcovou prostřednictvím polymerasy jak je popsáno výše jsou fragmenty methylovány a tříděny na mikročástice podle vynálezu.
Preferovaně, jak je popsáno výše, je klonující vektor konstruován tak, že připojená cDNA může být excidována endonukleasou, jako je
Fok I, což umožni okamžité sekvencování preferovanou single base metodou po třídění a ligaci na mikročástice.
Postupné sekvencování je potom provedeno simultánně pro celou knihovnu, nebo jednu nebo více větších frakcí knihovny, podle vynálezu dokud není identifikován dostatečný počet nukleotidů každé cDNA pro jedinečné zastoupení v genomu organismu, ze kterého je knihovna odvozena.
Například, jestliže je knihovna odvozena pro savčí mRNA, pak se očekává, že náhodně vybrané sekvence délky 14 - 15 nukleotidů mají jedinečné zastoupení mezi 2-3 megabázemi typického savčího genomu. Pochopitelně že identifikace o mnoho méně nukleotidů by měla být dostatečná pro jedinečné zastoupení v knihovně odvozené od bakterií, nebo od jiných nižších organismů. Preferovaně je identifikováno alespoň 20 - 30 nukleotidů pro zajištění jedinečného zastoupení a umožnění konstrukce vhodného primeru jak je popsáno níže. Zapsané sekvence pak mohou být srovnány se známými sekvencemi pro identifikaci jedinečné cDNA.
Jedinečná cDNA je potom izolována běžnými technikami, např. konstrukcí proby z PCR amplikonu produkovaného primery zaměřenými na počáteční místo a části cDNA, jejíž sekvence byla určena. Proba pak může být použita pro identifikaci cDNA v knihovně za použití běžného protokolu vyšetření.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Třídění mnohotných cílových polynukleotidů odvozených od
PUC19
Směsi tří cílových konjugátů polynukleotid - smyčka byly získány následovně: Nejprve bylo syntetizováno následujících šest oligonukleotidů a byly kombinovány po párech za vytvoření tag 1, tag 2, a tag 3.
51-pTCGACC(wi) (W2)(W3)(w*)(ws)(we)(w7)(we)(wi)A
GG(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)TTCGAp-5'
Tag 1
5'-pTCGACC(Wď)(W7)(we)(wi)(W2)(W6)(W4)(W2)(wi)A
GG(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)TTCGAp-5'
Tag 2 '-pTCGACC (W3 ) (W2) (wi) (wi) (W5) (W8) (we) (W4) (W4)A (**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)TTCGAp-5'
Tag 3 kde p indikuje monofosfát, wí reprezentuje podjednotky definované v Tabulce I, a termín (**) reprezentuje jejich příslušné komplementy. pUC19 je tráven Sal I a Hind III, větší fragment je purifikován a separátně ligován se smyčkami 1, 2 a 3 za vytvoření pUC19-í, pUC19-2 a pUC19-3, v příslušném pořadí. Tři rekombinanty jsou separátně amplifikovány a izolovány, po čemž je pUC19-l tráven Hind III a Aat I, pUC19-2 je tráven Hind III a Ssp I a pUC19-3 je tráven Hind III a Xmn I. Malé fragmenty jsou izolovány za použití běžných protokolů za vzniku tří dvouřetězcových fragmentů okolo 250, 375 a 575 párů bází délky, podle příslušnosti, a každý má přerušený 3'řetězec připojený ke smyčce a tupý nebo 3'přesahující řetězec na opačném konci. Přibližně 12 nmol každého fragmentu je smíseno s 5 jednotkami T4 DNA polymerasy ve výrobcem doporučeném reakčním pufru obsahujícím 33 μΜ deoxycytosin trifosfátu. Reakční směs je inkubována při 37 °C po 30 minut a potom je reakce zastavena umístěním na led. Fragmenty jsou potom purifikovány běžnými prostředky.
CPG mikročástice (37 - 74 mm velikost částice, 500 Angstrom velikost póru, Pierce Chemical) jsou derivatizovány linkerem popsaným Maskosem a Southernem, Nucleic Acids Research, 20: 1679 - 1684 (1992). Po separování do tří aliquot jsou komplementy smyček 1, 2 a 3 syntetizovány na mikročásticích za použití běžného automatizovaného DNA syntetizeru, např. model 392 DNA syntetizeru (Applied Biosystems, Foster City, California). Přibližně 1 mg každé odlišně derivatizované mikročástice je umístěn ve zvláštní nádobě.
T4 DNA polymerasou ošetřené fragmenty excidované z pUC19-l, -2 a -3 jsou resuspendovány v 50 μΐ výrobcem doporučeného pufru pro Taq DNA ligasu (New England Biolabs). Směs je potom rovnoměrně rozdělena do tří nádob obsahujících 1 mg každé derivatizované CPG mikročástice. 5 jednotek Taq DNA ligasy je přidáno do každé nádoby, a potom jsou inkubovány při 55 °C po 15 minut. Reakce je zastavena umístěním na ledě a mikročástice jsou promyty několikrát opakovanou centrifugací a resuspendací v TE. Nakonec jsou mikročástice resuspendovány v Nde I reakčním pufru (New
England Biolabs), kde jsou připojené polynukleotidy tráveny. Po separaci z mikročástic jsou polynukleotidové fragmenty uvolněné Nde I trávením fluorescentně značeny inkubací se Sequenase DNA polymerasou a fluorescentně značeny thymidin trifosfátem (Applied Biosystems, Foster City, CA). Fragmenty jsou potom odděleně analyzovány na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu za použiti Applied Biosystems model 373 DNA sekvenátoru.
Příklad 2
Paralelní sekvencování SV40 fragmentů
Repertoár 36-mer smyček skládajících se z devíti
4- nukleotidových podjednotek vybraných z Tabulky 1 je připraven odděleným syntetizováním smyček a komplementů smyček přístupem štěp a míchej, jak je popsáno výše. Repertoár je syntetizován tak, aby dovoloval ligaci do Smal/HindlII tráveného M13mpl9. Tak, jako v Příkladu 1, jedna sada oligonukleotidů začíná s přidáním A po kterém následuje devět kol štěp a míchej syntézy, kde je oligonukleotid rozšířen podjednotkovým způsobem prostřednictvím 3| - fosforamiditem derivatizovaných 4-merů korespondujících k podjednotkám Tabulky 1. Syntéza je potom dokončena nukleotid-nukleotid adicí jedné poloviny Sma I rozpoznávajícího místa (GGG), dvou C a
5- monofosfátu, například pomocí Phosphate-ON činidla dostupného od Clontech Laboratories (Palo Alto, CA). Jiná sada oligonukleotidů začíná s přidáním tří C (část Sma I rozpoznávacího místa) a dvou G, po kterém následuje devět kol štěp a míchej syntézy, kde je oligonukleotid rozšířen podjednotkovým způsobem prostřednictvím 3'- fosforamiditem derivat izovaných 4-merů korespondujících ke komplementům podjednotek Tabulky 1. Syntéza je potom dokončena nukleotid-nukleotid adicí Hind III rozpoznávacího místa a 5'- monofosfátu. Po separaci z nosičů syntesy jsou oligonukleotidy smíseny za podmínek dovolujících tvorbu následujících duplexů:
5'-pGGGCC(wi)(wí)(wí)(wí)(wí)(wí)(wí)(wí)(wí)A
CCCGG(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)(**)TTCGAp-5'
Směs duplexů je potom ligována do Smal/HindlII tráveného M13mpl9. Repertoár komplementů smyček je syntetizován na CPG mikročásticích jak je popsáno výše.
Je připraven další následující adaptor, který obsahuje Fok I místo a části Eco RI a Sma I míst:
5'- pAATTCGGATGATGCATGCATCGACCC
GCCTACTACGTACGTAGCTGGGp-5'
Eco RI Fok I Sma I
Adaptor je ligován do Eco Rl/Sma I tráveného M13 popsaného výše.
Separátně je SV40 DNA fragmentována sonikací podle protokolu daného v Sambrook et al (citován výše). Vzniklé fragmenty jsou opraveny za použití standardních protokolů a separovány podle velikosti. Jsou selektovány fragmenty v rozsahu 300 - 500 párů bází a jsou ligovány do Sma I tráveného M13 popsaného výše za vytvoření knihovny konjugátů fragment-smyčka, která je potom amplifikována. Vzorek, obsahující několik tisíc odlišných fragment-smyčka konjugátů je odebrán z knihovny, dále amplifikován a fragment-smyčka inzerty jsou excidovány trávením Eco RI a Hind III. Excidované fragment-smyčka konjugáty jsou ošetřeny T4 DNA polymerasou za přítomnosti deoxycytidin trifosfátu, jak je popsáno v Příkladu 1, pro vystavení oligonukleotidových smyček specifické hybridizaci na CPG mikročástice.
Po hybridizaci a ligaci, jak je popsáno v Příkladu 1, jsou zavedené mikročástice ošetřeny Fok I za produkce 4-nukleotidových přesahujících řetězců předem určené sekvence. Směs 10:1 (proba 1 : proba 2) následujících prob je ligována na polynukleotidy na mikročásticích.
Proba 1 FAM-ATCGGATGAC
TAGCCTACTGAGCT
Proba 2 biotin-ATCGGATGAC
TAGCCTACTGAGCT
FAM reprezentuje fluorescentní barvivo připojené na 5'hydroxyl horního řetězce Proby 1 prostřednictvím aminofosfátového linkeru dosažitelného od Applied Biosystems (Aminolinker). Biotin může být také připojen prostřednictvím aminolinkerové skupiny a volitelně může být dále rozšířen pomocí polyoxyethylenového linkeru, např. Jaschke et al., (citován výše).
Zavedené mikročástice jsou potom umístěny na povrchu avidinované skleněné blány, na kterou a ze které mohou být činidla a promývací roztoky dopraveny a odstraněny.
Avidinovaná blána s připojenými mikročásticemi je vyšetřována snímacím fluorescentním mikroskopem (např. Zeiss Axioskop vybavený Newport Model PM500-C kontrolorem pohybu, a 520 nm emisním filtrem s dlouhým průchodem, nebo podobný přístroj). Excitační paprsek a fluorescentní emise jsou dopraveny a shromážděny přes stejnou čočku objektivu. Excitační paprsek a sebraná fluorescence jsou separovány dichroickým zrcadlem, která zaměřuje shromážděnou fluorescenci pomocí serie pásmových propustí a na foton-počítací přístroj korespondující monitorovaným fluoroforům, který například zahrnuje Hamamatsu model 9403-02 fotomultiplikátor, Stanford Research Systems model SR445 amplifikátor a model SR430 multikanálový reduktor, a digitální počítač, například na bázi 486 založený počítač. Počítač generuje dvourozměrnou mapu blány, která zaznamenává umístění mikročástic.
Po štěpení Fok I pro odstranění iniciální proby, jsou polynukleotidy na připojených mikročásticích podrobeny 20 cyklům ligace proby, promytí. detekce, štěpení a promytí, v souladu s preferovanou metodou single base sekvencování popsanou níže. Během každého kroku detekce nahrává snímací systém fluorescentní emisi korespondující bázi identifikované na každé mikročástici. Reakce a promytí jsou obecně provedeny pufry podle doporučení výrobce (New England Biolabs) pro použité enzymy, pokud není uvedeno jinak.
Standartní pufry jsou také popsány v Sambrook et al.
(citován výše).
Pro přidání k cílovým polynukleotidům jsou poskytnuty následující čtyři sady smíchaných prob.
TAMRA - ATCGGATGACATCAAC
TAGCCTACTGTAGTTGANNN
FAM - ATCGGATGACATCAAC
TAGCCTACTGTAGTTGCNNN
ROX - ATCGGATGACATCAAC
TAGCCTACTGTAGTTGGNNN
JOE - ATCGGATGACATCAAC
TAGCCTACTGTAGTTGTNNN kde TAMRA, FAM, ROX a JOE jsou spektrálně rozlišitelné fluorescentní značky připojené prostřednictvím Aminolinkeru II (vše od Applied Biosystems, lne., Foster City, CA); tučně vytištěné nukleotidy jsou rozpoznávací místa pro Fok I endonukleasu a N reprezentuje jakýkoliv ze čtyř nukleotidů A, C, G, T. TAMRA (tetraměthylrhodamin), FAM (fluorescein), ROX (rhodamin X), a JOE (27'-dimethoxy-45'-dichlorfluorescein) a jejich připojení k oligonukleotidům je také popsáno v Fung et al., U.S. patent 4855225.
Výše uvedené proby jsou inkubovány v přibližně asi 5 molárním přebytku konců cílového polynukleotidu následovně: proby jsou inkubovány po 60 minut při 16 °C s 200 jednotkami T4 DNA ligasy a zakotveným cílovým polynukleotidem v T4 DNA ligasovém pufru; po promytí je cílový polynukleotid inkubován se 100 jednotkami T4 polynukleotid kinasy ve výrobcem doporučeném pufru po 30 minut při 37 °C, promyt a znovu inkubován po 30 minut při 16 °C s 200 jednotkami T4 DNA ligasy a zakotveným polynukleotidem v T4 DNA ligasovém pufru. Promytí je provedeno opakovaným propláchnutím objemu promývacího pufru přes blánu, např. TE, jak je popsáno v Sambrook et al (citován výše). Po cyklu 1igace-fosforylaceligace a konečném promytí jsou připojené mikročástice snímány na přítomnost fluorescentní značky, a její umístění a charakteristika je náhrávána snímacím systémem. Značený cílový polynukleotid, t.j. ligovaný komplex, je potom inkubován s 10 jednotkami Fok I ve výrobcem doporučeném pufru po 30 minut při 37 °C, a potom následuje promytí v TE Výsledkem je, že cílový polynukleotid je zkrácen o jeden nukleotid na každém řetězci a je připraven pro další cyklus ligace a štěpení. Proces pokračuje, dokud není identifikováno dvacet nukleotidů.
Dodatek I
Příkladný počítačový program pro generování minimálně zkříženě reagujících sad.
Program minxh c
c c
integer*2 subl(6),msetl(1000,6),mset2(1000,6) dimension nbase(6) c
c write(*,*)1ENTER SUBUNIT LENGTH' read(100)nsub
100 formát(il) open(1,file='sub4.dat',form=*formatteď,status='new') c c
nset=0 do 7000 ml=l,3 do 7000 m2=l,3 do 7000 m3=l,3 do 7000 m4=l,3 subl (1) =ml subl(2)=m2 subl(3)=m3 subl(4)=m4 c
c ndiff=3 c c c Generate set of subunits differing from c subl by at least ndiff nucleotides.
c Savé in msetl.
c c
= 1 do 900 j=l,nsub
900 msetl(1,j)=subl(j) c
c do 1000 kl=l,3 do 1000 k2=l,3 do 1000 k3=l,3 do 1000 k4=l,3 c
c nbase(l)=kl nbase(2)=k2 nbase{3)=k3 nbase(4)=k4 c
n=G
1200 c
c c
c c
G c
c c
G do 1200 jxl,nsub if (subl(j) .eq.l .and. nbaseíjΪ .ne.1 .or. subl{j).eq.2 .and. nbaseíj).ne.2 .or. subl(j).eq.3 .and. nbase{j).ne.3) then n=n+l endif continue if ín.ge.ndiff} then
If number of mismatches is greater chán or equal to ndiff then record subunit in matrix mset
1100 c
c
1000 c
c
33=33+1 do 1100 i=l,nsub msetl(j j,i)=nbase(i) endif continue
1325 c
c c
c c
c c
c c
c c
c
G c
£ c
c c
c c
1700 do 1325 j2=l,nsub mset2(1,j2)=msetl(1,j2) mset2(2,j 2)=msetl(2,j2)
Compare subunit 2 from msetl with eačh successive subunit in msetl, i.e. 3, 4,5, ... etc. Savé those with mismatches .ge. ndiff in matrix mset2 starting at position 2.
Next transfer contents of mset2 into msetl and start comparisons again this time starting with subunit 3. Continue ur.til all subunits undergo the comparisons.
npass=0 continue kk=npass+2 npass=npass+I do 1500 m=npass+2,jj
1600
1625
1500 c
c c
c c
c c
2000 c
c
7009
7008
7010
120
7000 c
n=0 do 1600 j=l,nsub if(msetl(npass+l,j),eq.1.and.msetl(m,j).ne.l.or. msetl(npass+1,j).eq.2.and.msecl(m,j).ne.2.or. msetl(npass+1,j).eq.3.and.msecl(m, j).ne.3) Chen n=n+l endif concinue if(n.ge.ndiff) then kk=kk+l do 1625 i=l,nsub mset2(kk,i)=msetl(m,i) endi f continue kk is che number of subunits stored in mset2
Transfer contents of mset2 into msetl for next pass.
do 2000 k=l,kk do 2000 m=l,nsub msetl(k,m)=mset2(k,m) if(kk.lt.jj) then jj=kk goto 1700 endif nset=nset+l write(l,7009) formát(/) do 7008 k=l,kk write(l,7010)(msetl(k,m),m=l,nsub) formát(4il) write(’r,*) write(*,120) kk.nset formát(lx,’Subunits in set=',i5,2x,'Set No=‘,i5) continue close(1) end
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: Sydney Brenner (ii) Název vynálezu: Molekulární systém pro vytváření smyček (iii) Počet sekvencí: 5 (iv) Adresa pro korespondenci
(A) Adresa: Stephen C. Macevicz, Lynx Therapeutics,
(B) Ulice: 3832 Bay Center Plače
(C) Město: Hayward
(D) Stát: California
(E) Země: USA
(F) ZIP: 94545
Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: 3,5 palce disketa
(B) Počítač: IBM PC compatibilní
(C) Operační systém: Windows 3.1/DOS 5 .0
(D) Software : Microsoft Word for Windows, verse 2.0
(vi) nynější data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: 08/322348 (B) Datum podání: 13.10.94 (vii) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: 08/358810 (B) Datum podání: 19.12.94 (viii) Informace o zástupci/agentovi (A) Jméno: Stephen C. MAcevicz (B) Registrační číslo: 30285 (C) číslo registrace/dokladu: cbd3wo (ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: (510) 670-9365 (B) Telefax: (510) 670-9302 (2) informace pro sekvenci č.l:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 38 nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 1:
GAGGATGCCT TTATGGATCC ACTCGAGATC CCAATCCA (2) informace pro sekvenci č.2:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 26 nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 2:
AATTCGGATG ATGCATGCAT CGACCC 26 (2) informace pro sekvenci č.3:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 14 nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: jednoduchý (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 3:
TAGCCTACTG AGCT 14 (2) informace pro sekvenci č.4:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 16 nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 4:
ATCGGATGAC ATCAAC (2) informace pro sekvenci č.5:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) délka: 11 nukleotidů (B) typ: nukleová kyselina (C) typ řetězce: dvojitý (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID No: 5:

Claims (64)

1. Způsob třídění molekul nebo subpopulací molekul z populace molekul vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
(a) připojení oligonukleotidové smyčky z repertoáru smyček na každou molekulu v populaci molekul (i) tak, že v podstatě všechny stejné molekuly nebo subpopulace molekul v populaci mají připojenou stejnou oligonukleotidovou smyčku a v podstatě všechny odlišné molekuly nebo odlišné subpopulace molekul v populaci mají připojenou odlišnou oligonukleotidovou smyčku a (ii) tak, že každá oligonukleotidová smyčka z repertoáru obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z oligonukleotidu majícího délku od tří do šesti nukleotidů nebo od tří do šesti párů bází, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridizující sady; a (b) třídění molekul nebo subpopulací molekul z populace specifickou hybridizací oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy.
2. Způsob podle nároku 1,vyznaču jící se t í m, že uvedenou molekulou nebo subpopulací molekul je polynukleotid nebo subpopulace polynukleotidů.
3. Způsob podle nároku 2,vyznačuj ící se t í m, že uvedené komplementy uvedených oligonukleotidových smyček jsou připojeny na nosič pevné fáze.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je mikročástice, která má na sebe připojenou uniformní populaci uvedených komplementů.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t í m, že uvedená oligonukleotidová smyčka a uvedený komplement jsou jednořetězcové oligonukleotidy.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se t í m, že uvedený polynukleotid nebo subpopulace polynukleotidů má délku v rozmezí od 50 do 5000 nukleotidů.
7. Způsob podle nároku 5,vyznaču jící se t í m, že uvedená mikročástice je vybrána ze skupiny skládající se z skleněných mikročástic, magnetických korálků, glycidalmethakrylátových mikročástic, polystyrénových mikročástic.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t í m, že průměr uvedené mikročástice je mezi 1 a 100 pm.
9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je plošný substrát mající množství prostorové oddělených regionů, majících na sebe připojenu uniformní populaci uvedených komplementů.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se t í m, že různé uvedené prostorové oddělené povrchové regiony uvedeného množství mají uniformní populaci různých uvedených komplementů.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m, že uvedený plošný substrát je vybrán ze skupiny skládající se ze skla, silikonu a plastu.
12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že uvedenou molekulou nebo uvedenou subpopulací molekul je polypeptid nebo subpopulace polypeptidů.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m, že uvedené komplementy uvedených oligonukleotidových smyček jsou připojeny na nosič pevné fáze.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m, že uvedený oligonukleotid a uvedený komplement jsou jednořetězcové oligonukleotidy.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je mikročástice mající na sebe připojenou uniformní populaci uvedených komplementů.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m, že uvedená mikročástice je vybrána ze skupiny skládající se z skleněných mikročástic, magnetických korálků, polystyrénových mikročástic.
17. Způsob podle nároku 16,vyznačuj ící se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je plošný substrát mající množství prostorové oddělených regionů majících na sebe připojenu uniformní populaci uvedených komplementů.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t í m, že různé uvedené prostorové oddělené povrchové regiony uvedeného množství mají uniformní populaci různých uvedených komplementů.
19. Způsob podle nároku 18,vyznaču jící se t í m, že uvedený plošný substrát je vybrán ze skupiny skládající se ze skla, silikonu a plastu.
20. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že uvedenou molekulou nebo uvedenou subpopulací molekul je lineární polymer vzorce:
-(M-L)nkde:
L je fosfor (V) vazebná skupina;
M je přímo řetězecová, cyklická nebo rozvětvená organická molekulární struktura obsahující od 1 do 20 atomů uhlíku a od 0 do 10 heteroatomů vybraných ze skupiny skládající se z kyslíku, dusíku a síry; a n je v rozsahu od 3 do 100.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že M je alkyl, alkoxy, alkenyl nebo aryl obsahující od 1 do 16 atomů uhlíku, nebo heterocyklus mající od 3 do 8 atomů uhlíku a od 1 do tří heteroatomů vybraných ze skupiny skládající se z kyslíku, dusíku a síry.
22. Způsob podle nároku 21,vyznačuj ící se t í m, že uvedené komplementy uvedených nukleotidových smyček jsou připojeny na nosič pevné fáze.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je mikročástice mající na sebe připojenou uniformní populaci uvedených komplementů.
24. Způsob podle nároku 23,vyznačuj ící se t i m, že uvedená mikročástice je vybrána ze skupiny skládající se z skleněných mikročástic, magnetických korálků, polystyrénových mikročástic.
25. Způsob podle nároku 22,vyznačuj ící se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je plošný substrát mající množství prostorové nepřekrývajících se povrchových regionů, které mají na sebe připojenu uniformní populaci uvedených komplementů uvedených oligonukleotidových smyček.
26. Způsob podle nároku 25,vyznačuj ící se t í m, že různé uvedené prostorové oddělené povrchové regiony uvedeného množství mají uniformní populaci různých uvedených komplementů.
27. Způsob určení nukleotidové sekvence cílového polynukleotidů vyznačující se tím, že uvedený způsob obsahuje kroky:
generování množství fragmentů z cílového polynukleotidů, které pokryjí cílový polynukleotid;
připojení oligonukleotidové smyčky z repertoáru smyček na každý fragment množství (i) tak, že v podstatě všechny stejné fragmenty mají připojenou stejnou oligonukleotidovou smyčku a v podstatě všechny odlišné fragmenty mají připojenou odlišnou oligonukleotidovou smyčku a (ii) tak, že každá oligonukleotidová smyčka z repertoáru obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z oligonukleotidu majícíhio délku od tří do šesti nukleotidů nebo od tří do šesti párů bází, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridizující sady; a třídění fregmentů specifickou hybridizaci oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy;
určení nukieotidové sekvence části každého fragmentu z množství; a určení nukieotidové sekvence cílového polynukleotidů porovnáním sekvencí fragmentů.
28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t í m, že uvedené komplementy uvedených oligonukleotidových smyček jsou připojeny na nosič pevné fáze.
29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m, že uvedené oligonukleotidové smyčky a uvedené komplementy jsou jednořetězcové oligonukleotidy.
30. Způsob podle nároku 29, vyznačující t í m, že uvedený krok generování produkuje náhodně přesahující fragmenty zmíněného cílového polynukleotidů.
31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se t í m, že uvedený krok určení uvedené nukleotidové sekvence uvedených fragmentů je proveden simultánně pro uvedené množství fragmentů metodou single base sekvencování.
32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se t í m, že uvedené části každého uvedeného fragmentu obsahují od 12 do 50 nukleotidů.
33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se t í m, že uvedené části každého uvedeného fragmentu obsahují od 12 do 25 nukleotidů.
34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se t í m, že uvedený cílový polynukleotid je délky mezi jednou a padesáti kilobázemi.
35. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m, že uvedeným nosičem pevné fáze je množství mikročástic, kde každá má na sebe připojenou uniformní populaci uvedených komplementů.
36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se t í m, že po uvedeném kroku třídění je množství mikročástic fixováno na plošný substrát.
37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se t í m, že uvedené množství mikročástic je rozloženo náhodně na povrchu uvedeného plošného substrátu v hustotě od asi 1000 mikročástic do asi 100000 mikročástic na centimetr čtvereční.
38. Kompozice vyznačující se tím, že zahrnuj e nosič pevné fáze, který má jeden nebo více prostorově oddělených regionů;a uniformní populaci komplementů oligonukleotidových smyček kovalentně vázaných na nosič pevné fáze v alespoň jednom nebo více prostorově oddělených regionech, kde komplementy oligonukleotidové smyčky obsahují množství podjednotek, kde každá podjednotka se skládá z oligonukleotidu majícího délku od tří do šesti nukleotidů a každá podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě reagující sady.
39. Kompozice podle nároku 38 vyznačující se t í m, že uvedené množství uvedených podjednotek je v rozsahu od 4 do 10.
40. Kompozice podle nároku 39 vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je mikročástice mající jednotlivé prostorově oddělené regiony.
41. Kompozice podle nároku 40 vyznačuj ící se t í m, že uvedená mikročástice je vybrána ze skupiny skládající se z skleněných mikročástic, magnetických korálků, polystyrénových mikročástic.
42. Způsob klasifikace populace polynukleotidů, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky: připojení oligonukleotidové smyčky na každý polynukleotid populace (i) tak, že v podstatě všechny stejné polynukleotidy mají připojenou stejnou oligonukleotidovou smyčku a v podstatě všechny odlišné polynukleotidy mají připojenou odlišnou oligonukleotidovou smyčku a (ii) tak, že každá oligonukleotidová smyčka obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z oligonukleotidu majícího délku od tří do šesti nukleotidů, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridizující sady; a třídění polynukleotidů specifickou hybridizací oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy;
určení nukleotidové sekvence části každého tříděného polynukleotidu; a klasifikace populace polynukleotidů podle frekvence distribuce částí sekvencí polynukleotidů.
43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se t í m, že uvedené komplementy uvedených oligonukleotidových smyček jsou kovalentně připojeny na nosič pevné fáze.
44. Způsob podle nároku 43,vyznačuj ící se t í m, že uvedeným nosičem pevné fáze je mikročástice a že na každou uvedenou mikročástici je připojena uniformní populace uvedených komplementů.
45. Způsob podle nároku 44,vyznačuj ící se t í m, že uvedenou populací polynukleotidů je cDNA knihovna.
46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se t í m, že uvedené části každého uvedených polynukleotidů jsou v rozsahu od 12 do 50 nukleotidů.
47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se t í m, že uvedené části každého uvedených polynukleotidů jsou v rozsahu od 12 do 25 nukleotidů.
48. Repertoár oligonukleotidových smyček, kde repertoár je vybrán ze skupiny skládající se z oligonukleotidů vzorce:
S1S2S3...Sn kde každé Si až Sn jsou podjednotky skládající se z oligonukleotidů majících délku od tří do šesti nukleotidů a jsou vybrány z minimálně zkříženě reagující sady; a n je v rozsahu od 4 do 10.
49. Repertoár podle nároku 48, vyznačující se t í m, že uvedené podednotky se skládají z oligonukleotidů majícího délku od čtyř do pěti nukleotidů a kde n je v rozsahu od 6 do 9.
50. Repertoár klonujících vektorů pro připojení oligonukleotidových smyček na polynukleotidy, kde repertoár má dvouřetězcové elementy vzorce:
S1S 2S3...Sn kde každé Si až Sn jsou podjednotky skládající se z oligonukleotidů majících délku od tří do šesti nukleotidů a jsou vybrány z minimálně zkříženě reagující sady; a n je v rozsahu od 4 do 10.
51, Repertoár podle nároku 50,vyznačující se t í ni, že uvedený dvouřetězcový element je sousedící k regionu polylinkeru obsahujícímu jedno nebo více štěpících míst pro restrikční endonukleasu pro inserci uvedených polynukleotidů do uvedeného klonujícího vektoru.
52. Způsob třídění směsi polynukleotidů, vyznačující se tím, že obsahuje kroky:
poskytnutí roztoku obsahujícího směs polynukleotidů, kde má každý polynukleotid směsi připojenou oligonukleotidovou smyčku z repertoáru smyček, kde každá oligonukleotidová smyčka z repertoáru obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z oligonukleotidů majícího délku od tří do šesti nukleotidů, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridi zující sady;
vzorkování směsi polynukleotidů za vytvoření subpopulace polynukleotidů, kde v podstatě všechny polynukleotidy stejné sekvence mají připojenou stejnou oligonukleotidovou smyčku a v podstatě všechny polynukleotidy odlišné sekvence mají připojenou odlišnou oligonukleotidovou smyčku; a kontaktování subpopulace s jedním nebo více nosiči pevné fáze, které mají na sebe připojeny komplementy oligonukleotidových smyček za podmínek navozujících tvorbu přesně spárovaných duplexů mezi oligonukleotidovými smyčkami a jejich příslušnými komplementy.
53. Způsob podle nároku 52 vyznačující se t í m, že uvedeným nosičem pevné fáze je mikročástice která má na sebe připojenou uniformní populaci uvedených komplementů.
54. Způsob podle nároku 53 vyznačující se tím, že uvedená oligonukleotidová smyčka a uvedený komplement jsou jednořetězcové oligonukleotidy.
55. Způsob podle nároku 54 vyznačující se t í m, že uvedený polynukleotid má délku v rozsahu od 50 do 5000 nukleotidů.
56. Způsob podle nároku 55 vyznačuj ící se t í m, že uvedená mikročástice je vybrána ze skupiny skládající se z skleněných mikročástic, magnetických korálků, polystyrénových mikročástic.
57. Způsob podle nároku 56 vyznačující se t í m, že uvedený nosič pevné fáze je plošný substrát mající množství prostorové oddělených povrchových regionů, které mají na sebe připojenu uniformní populaci uvedených komplementů.
58. Způsob podle nároku 57 vyznačuj ící se t í m, že různé uvedené prostorové oddělené povrchové regiony uvedeného množství mají uniformní populaci různých uvedených komplementů.
59. Způsob generování jednořetězcového segmentu předem určené délky na konci dvouřetězcové DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
poskytnutí 5' řetězce na konci dvouřetězcové DNA tak, že 5' řetězec je složen z nukleotidů vybraných z první skupiny skládající se ze tří nebo méně druhů nukleotidů a tak, že předem určená délka 5' řetězce je definována přítomností druhého nukleotidu takového typu, který není přítomen v první skupině, na jeho 3' konci; a vystavení konce dvouřetězcové DNA T4 DNA polymerase za přítomnosti nukleosid trifosfátu druhého nukleotidu.
60. Způsob detegování nových cDNA molekul v cDNA knihovně, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
tvorbu cDNA knihovny z populace mENA molekul, kde každá cDNA molekula v cDNA knihovně má připojenou oligonukleotidovou smyčku (i) tak, že v podstatě všechny stejné cDNA molekuly mají připojenou stejnou oligonukleotidovou smyčku a v podstatě všechny odlišné cDNA molekuly mají připojenou odlišnou oligonukleotidovou smyčku a (i i) tak, že každá oligonukleotidová smyčka obsahuje množství podjednotek a každá podjednotka z tohoto množství se skládá z oligonukleotidu majícího délku od tří do šesti nukleotidů, kde podjednotka je vybrána z minimálně zkříženě hybridi zující sady; a třídění cDNA molekul specifickou hybridizaci oligonukleotidových smyček s jejich příslušnými komplementy;
určení nukieotidové sekvence části každé tříděné cDNA molekuly; a identifikace nových cDNA molekul srovnáním nukieotidové sekvence částí tříděných cDNA molekul se sekvencemi známých cDNA molekul.
61. Způsob podle nároku 60 vyznačující se t í m, že uvedené komplementy uvedených oligonukleotidových smyček jsou kovalentně připojeny na nosič pevné fáze.
62. Způsob podle nároku 61 vyznaču jící se t í m, že uvedeným nosičem pevné fáze je mikročástice a že na každou mikročástici je připojena uniformní populace uvedených komplementů.
63. Způsob podle nároku 62 vyznačující se t í m, že uvedená část uvedené cDNA molekuly je v rozsahu od 12 do 50 nukleotidů.
64. Způsob podle nároku 63 vyznačující se t í m, že uvedená část uvedené cDNA molekuly je v rozsahu od 12 do 25 nukleotidů.
CZ97866A 1994-10-13 1995-10-12 Molecular system for making loops CZ86697A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US32234894A 1994-10-13 1994-10-13
US08/358,810 US5604097A (en) 1994-10-13 1994-12-19 Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
PCT/US1995/012791 WO1996012014A1 (en) 1994-10-13 1995-10-12 Molecular tagging system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ86697A3 true CZ86697A3 (en) 1997-09-17

Family

ID=26983370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ97866A CZ86697A3 (en) 1994-10-13 1995-10-12 Molecular system for making loops

Country Status (13)

Country Link
US (4) US5604097A (cs)
EP (3) EP1724348A3 (cs)
JP (6) JP4206130B2 (cs)
KR (2) KR970707279A (cs)
AT (1) ATE323159T1 (cs)
AU (2) AU712929B2 (cs)
CA (1) CA2202167C (cs)
CZ (1) CZ86697A3 (cs)
DE (1) DE69534930T2 (cs)
FI (1) FI971473A7 (cs)
HU (1) HUT77916A (cs)
NO (1) NO971644L (cs)
WO (1) WO1996012014A1 (cs)

Families Citing this family (535)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
EP0834575B1 (en) 1990-12-06 2001-11-28 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Identification of nucleic acids in samples
US7375198B2 (en) * 1993-10-26 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Modified nucleic acid probes
US6156501A (en) * 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
WO2000033244A2 (en) * 1998-11-27 2000-06-08 Synaptics (Uk) Limited Position sensor
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US6013445A (en) * 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US6654505B2 (en) 1994-10-13 2003-11-25 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
US6974666B1 (en) * 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
AU718357B2 (en) * 1995-06-07 2000-04-13 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
EP0832287B1 (en) * 1995-06-07 2007-10-10 Solexa, Inc Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5780231A (en) * 1995-11-17 1998-07-14 Lynx Therapeutics, Inc. DNA extension and analysis with rolling primers
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6458530B1 (en) * 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
US5948615A (en) * 1996-04-16 1999-09-07 Hitachi, Ltd. Method for analysis of nucleic acid and DNA primer sets for use therein
US7144119B2 (en) * 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6958245B2 (en) 1996-04-25 2005-10-25 Bioarray Solutions Ltd. Array cytometry
US7041510B2 (en) 1996-04-25 2006-05-09 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US6387707B1 (en) * 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
CA2255599C (en) 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US6048691A (en) * 1996-05-13 2000-04-11 Motorola, Inc. Method and system for performing a binding assay
EP2369007B1 (en) 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
PL331513A1 (en) * 1996-06-06 1999-07-19 Lynx Therapeutics Method of sequencing, by a ligand effect, specific encoded adapters and composition containing double-string oligonucleotidic adapters
AU4428497A (en) 1996-09-20 1998-04-14 James P. Demers Spatially addressable combinatorial chemical arrays in cd-rom format
GB9620769D0 (en) * 1996-10-04 1996-11-20 Brax Genomics Ltd Nucleic acid sequencing
US6258533B1 (en) * 1996-11-01 2001-07-10 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
US5858671A (en) * 1996-11-01 1999-01-12 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
US6133436A (en) 1996-11-06 2000-10-17 Sequenom, Inc. Beads bound to a solid support and to nucleic acids
US6060240A (en) * 1996-12-13 2000-05-09 Arcaris, Inc. Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
GB9708606D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Webster Andrew Sequencing
US6007990A (en) * 1997-04-29 1999-12-28 Levine; Robert A. Detection and quantification of one or more nucleotide sequence target analytes in a sample using spatially localized target analyte replication
EP0981535A4 (en) * 1997-05-12 2000-11-29 Life Technologies Inc Methods for production and purification of nucleic acid molecules
JP4294740B2 (ja) * 1997-05-23 2009-07-15 ソレクサ・インコーポレイテッド 分析物の系列的プロセシングのためのシステムおよび装置
US6969488B2 (en) * 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
WO1998055657A1 (en) * 1997-06-05 1998-12-10 Cellstore Methods and reagents for indexing and encoding nucleic acids
US6096496A (en) * 1997-06-19 2000-08-01 Frankel; Robert D. Supports incorporating vertical cavity emitting lasers and tracking apparatus for use in combinatorial synthesis
ATE289358T1 (de) 1997-06-27 2005-03-15 Lynx Therapeutics Inc Verfahren zur restriktionskarten-analyse von polynukleotiden
WO1999004042A1 (en) * 1997-07-16 1999-01-28 Burden David W Synthetic oligonucleotide-peptide conjugates and methods of use
US6607878B2 (en) 1997-10-06 2003-08-19 Stratagene Collections of uniquely tagged molecules
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6136537A (en) * 1998-02-23 2000-10-24 Macevicz; Stephen C. Gene expression analysis
US6054276A (en) * 1998-02-23 2000-04-25 Macevicz; Stephen C. DNA restriction site mapping
US6019896A (en) * 1998-03-06 2000-02-01 Molecular Dynamics, Inc. Method for using a quality metric to assess the quality of biochemical separations
WO1999047643A1 (en) * 1998-03-18 1999-09-23 Quark Biotech, Inc. Selection subtraction approach to gene identification
AU3572799A (en) * 1998-04-24 1999-11-16 Genova Pharmaceuticals Corporation Function-based gene discovery
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
CN1306629A (zh) * 1998-05-13 2001-08-01 光谱科学公司 微型激光小珠及其结构,以及相关方法
EP1090293B2 (en) 1998-06-24 2019-01-23 Illumina, Inc. Decoding of array sensors with microspheres
US7399844B2 (en) * 1998-07-09 2008-07-15 Agilent Technologies, Inc. Method and reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids
US20040106110A1 (en) * 1998-07-30 2004-06-03 Solexa, Ltd. Preparation of polynucleotide arrays
US20100130368A1 (en) * 1998-07-30 2010-05-27 Shankar Balasubramanian Method and system for sequencing polynucleotides
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) * 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
CA2346989A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Dna-templated combinatorial library chemistry
US6480791B1 (en) * 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
EP1127161B1 (en) * 1998-11-02 2006-02-01 Solexa, Inc Method for making complementary oligonucleotide tag sets
WO2000034527A2 (en) 1998-12-11 2000-06-15 The Regents Of The University Of California Targeted molecular bar codes
NO986133D0 (no) * 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
CA2372131A1 (en) * 1999-02-22 2000-08-31 Sydney Brenner Polymorphic dna fragments and uses thereof
GB9905807D0 (en) * 1999-03-12 1999-05-05 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Analysis of differential gene expression
AU3519900A (en) * 1999-03-19 2000-10-09 Aclara Biosciences, Inc. Methods for single nucleotide polymorphism detection
JP2002539849A (ja) * 1999-03-26 2002-11-26 ホワイトヘッド インスチチュート フォアー バイオメディカル リサーチ ユニバーサルアレイ
JP2002540802A (ja) 1999-04-06 2002-12-03 イェール ユニバーシティ 配列標識の固定されたアドレス分析
US20060275782A1 (en) * 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
EP1190100B1 (en) 1999-05-20 2012-07-25 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US20020042081A1 (en) * 2000-10-10 2002-04-11 Eric Henderson Evaluating binding affinities by force stratification and force panning
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US20030186311A1 (en) * 1999-05-21 2003-10-02 Bioforce Nanosciences, Inc. Parallel analysis of molecular interactions
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US6573369B2 (en) * 1999-05-21 2003-06-03 Bioforce Nanosciences, Inc. Method and apparatus for solid state molecular analysis
US20030073250A1 (en) * 1999-05-21 2003-04-17 Eric Henderson Method and apparatus for solid state molecular analysis
US8137906B2 (en) 1999-06-07 2012-03-20 Sloning Biotechnology Gmbh Method for the synthesis of DNA fragments
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6465183B2 (en) 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
WO2001012855A2 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 Yale University Binary encoded sequence tags
CA2382157C (en) 1999-08-18 2012-04-03 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
AU6788100A (en) * 1999-08-20 2001-03-19 Luminex Corporation Liquid array technology
US7244559B2 (en) * 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) * 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001020043A1 (en) * 1999-09-17 2001-03-22 Affymetrix, Inc. Method of cluster analysis of gene expression profiles
US6428957B1 (en) 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6235483B1 (en) * 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
WO2001057268A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7611869B2 (en) * 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7582420B2 (en) * 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
DK1259643T3 (da) * 2000-02-07 2009-02-23 Illumina Inc Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming
US7955794B2 (en) * 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7361488B2 (en) * 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
ATE412774T1 (de) 2000-02-16 2008-11-15 Illumina Inc Parallele genotypisierung mehrerer patientenproben
US6783985B1 (en) 2000-02-18 2004-08-31 Elitra Pharmaceuticals Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
US6749756B1 (en) * 2000-02-18 2004-06-15 University Of Pittsburgh Reaction and separation methods
US6897015B2 (en) * 2000-03-07 2005-05-24 Bioforce Nanosciences, Inc. Device and method of use for detection and characterization of pathogens and biological materials
US7157564B1 (en) 2000-04-06 2007-01-02 Affymetrix, Inc. Tag nucleic acids and probe arrays
US6839562B2 (en) * 2000-04-11 2005-01-04 Telecommunication Systems, Inc. Intelligent delivery agent for short message distribution center
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
AU7125401A (en) * 2000-05-19 2001-12-03 David J Marshall Materials and methods for detection of nucleic acids
WO2001094625A2 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Tm Bioscience Corporation Capture moieties for nucleic acids and uses thereof
DE60117556T2 (de) * 2000-06-21 2006-11-02 Bioarray Solutions Ltd. Multianalytische molekularanalyse durch verwendung anwendungsspezifischer zufallspartikelarrays
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
CA2411794A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Molecular Staging, Inc. Signal amplification with lollipop probes
US6911204B2 (en) 2000-08-11 2005-06-28 Favrille, Inc. Method and composition for altering a B cell mediated pathology
WO2002014553A2 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Favrille, Inc. A molecular vector identification system
CA2419159A1 (en) * 2000-08-11 2002-02-21 Agilix Corporation Ultra-sensitive detection systems
US7008769B2 (en) * 2000-08-15 2006-03-07 Bioforce Nanosciences, Inc. Nanoscale molecular arrayer
GB0021367D0 (en) * 2000-09-01 2000-10-18 Sec Dep Of The Home Department Improvements in and relating to marking
US7057704B2 (en) * 2000-09-17 2006-06-06 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
AU1317502A (en) 2000-10-14 2002-04-29 Eragen Biosciences Inc Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases
US20030045005A1 (en) * 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
DE60131903T2 (de) * 2000-10-24 2008-11-27 The Board of Trustees of the Leland S. Stanford Junior University, Palo Alto Direkte multiplex charakterisierung von genomischer dna
US20040018491A1 (en) * 2000-10-26 2004-01-29 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
WO2002061133A2 (en) * 2000-11-09 2002-08-08 Yale University Nucleic acid detection using structured probes
JP4516273B2 (ja) * 2000-11-15 2010-08-04 ミナーヴァ・バイオテクノロジーズ・コーポレーション オリゴヌクレオチド識別子
US20030180953A1 (en) * 2000-12-29 2003-09-25 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Gene disruption methodologies for drug target discovery
US20030049616A1 (en) * 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
US6958217B2 (en) * 2001-01-24 2005-10-25 Genomic Expression Aps Single-stranded polynucleotide tags
US7226737B2 (en) 2001-01-25 2007-06-05 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
ES2382542T3 (es) * 2001-01-25 2012-06-11 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Polinucleótidos para su utilización como etiquetas y complementos de etiqueta, fabricación y utilización de los mismos
DE60222628T2 (de) * 2001-01-30 2008-07-17 Solexa Ltd., Saffron Walden Herstellung von matrizen aus polynukleotiden
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
EP1390468A4 (en) * 2001-04-23 2004-09-22 Elitra Pharmaceuticals Inc IDENTIFICATION OF ESSENTIAL GENES OF ASPERGILLUS FUMIGATUS AND METHOD OF USE
EP1262563A3 (en) * 2001-05-31 2003-02-05 Takara Bio Inc. Method for immobilizing DNA on a surface
US20070184436A1 (en) * 2001-06-07 2007-08-09 Joel Myerson Generic capture probe arrays
EP1401850A1 (en) 2001-06-20 2004-03-31 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US20060234231A1 (en) * 2001-06-20 2006-10-19 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
AU2002329606A1 (en) * 2001-07-17 2003-03-03 Bioforce Nanosciences, Inc. Combined molecular blinding detection through force microscopy and mass spectrometry
US6872529B2 (en) * 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US7297778B2 (en) * 2001-07-25 2007-11-20 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US7026123B1 (en) * 2001-08-29 2006-04-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. UTR tag assay for gene function discovery
US7042488B2 (en) 2001-09-27 2006-05-09 Fujinon Corporation Electronic endoscope for highlighting blood vessel
US20030148335A1 (en) * 2001-10-10 2003-08-07 Li Shen Detecting targets by unique identifier nucleotide tags
US6767733B1 (en) 2001-10-10 2004-07-27 Pritest, Inc. Portable biosensor apparatus with controlled flow
CA2497740C (en) 2001-10-15 2011-06-21 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by probe elongation-mediated detection
US7132236B2 (en) * 2001-10-25 2006-11-07 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for optimized hybridization using modified solutions
JPWO2003038091A1 (ja) * 2001-10-29 2005-04-07 独立行政法人科学技術振興機構 ミスハイブリダイゼーションを回避しうるオリゴヌクレオチド配列とその設計方法
CA2466861A1 (en) * 2001-11-06 2003-07-10 Agilix Corporation Sensitive coded detection systems
EP1314783B1 (de) * 2001-11-22 2008-11-19 Sloning BioTechnology GmbH Nukleinsäure-Linker und deren Verwendung in der Gensynthese
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US20040020993A1 (en) * 2001-12-28 2004-02-05 Green Larry R. Method for luminescent identification and calibration
US10731151B2 (en) 2002-03-15 2020-08-04 Nuevolution A/S Method for synthesising templated molecules
AU2003214031A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
AU2003234255A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-10 Lynx Therapeutics, Inc. Constant length signatures for parallel sequencing of polynucleotides
US20040060987A1 (en) * 2002-05-07 2004-04-01 Green Larry R. Digital image analysis method for enhanced and optimized signals in fluorophore detection
US20050239193A1 (en) * 2002-05-30 2005-10-27 Bioforce Nanosciences, Inc. Device and method of use for detection and characterization of microorganisms and microparticles
WO2004001074A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Lynx Therapeutics, Inc. Method for detecting foreign dna in a host genome
US20050186573A1 (en) * 2002-07-24 2005-08-25 Janeczko Richard A. Polynucleotides for use as tags and tag complements in the detection of nucleic acid sequences
EP1539980B1 (en) * 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S Library of complexes comprising small non-peptide molecules and double-stranded oligonucleotides identifying the molecules
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
WO2004018497A2 (en) 2002-08-23 2004-03-04 Solexa Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US20040043384A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-04 Oleinikov Andrew V. In vitro protein translation microarray device
US7157228B2 (en) 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US8791053B2 (en) * 2002-09-27 2014-07-29 Mpm-Holding Aps Spatially encoded polymer matrix
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
EP2348124B1 (en) 2002-10-30 2013-12-11 Nuevolution A/S Synthesis of a bifunctional complex
US20040086892A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
AU2003298655A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 Bioarray Solutions, Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
WO2004056994A2 (en) 2002-12-19 2004-07-08 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
KR20050100367A (ko) * 2003-01-02 2005-10-18 바이오포스 나노사이언스, 인크. 소용적 샘플 내의 분자 분석용 방법 및 장치
WO2004065550A2 (en) * 2003-01-17 2004-08-05 Eragen Biosciences, Inc. Nucleic acid amplification using non-standard bases
WO2004065000A1 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
US7575865B2 (en) * 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
CA2513899C (en) * 2003-01-29 2013-03-26 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US20060134624A1 (en) * 2003-02-06 2006-06-22 Salerno John C Polymerase-based protocols for the introductions of deletions and insertions
US20060228786A1 (en) * 2003-02-06 2006-10-12 Salerno John C Polymerase-based protocols for the introduction of deletions and insertions
US20060234238A1 (en) * 2003-02-06 2006-10-19 Salerno John C Polymerase-based protocols for generating chimeric oligonucleotides
US20060257876A1 (en) * 2003-02-06 2006-11-16 Rensselaer Polytechnis Institute Polymerase-based protocols for generating chimeric and combinatorial...
US20070026397A1 (en) 2003-02-21 2007-02-01 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
WO2004074501A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S A method for obtaining structural information about an encoded molecule
US6943768B2 (en) 2003-02-21 2005-09-13 Xtellus Inc. Thermal control system for liquid crystal cell
US7915201B2 (en) 2003-03-20 2011-03-29 Nuevolution A/S Ligational encoding of small molecules
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
AU2004227353B2 (en) * 2003-04-01 2010-02-25 Luminex Corporation Polymerase inhibitor and method of using same
US7195875B2 (en) * 2003-04-18 2007-03-27 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide pairs for multiplexed binding assays
JP2004355294A (ja) * 2003-05-29 2004-12-16 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 情報担体としてのｄｎａ符号の設計方法
US20040259118A1 (en) * 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
EP1660858A4 (en) * 2003-07-21 2007-10-24 Amplified Proteomics Inc MULTIPLEX analyte
WO2005026686A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-24 Compass Genetics, Llc Multiplexed analytical platform
EP1685380A2 (en) * 2003-09-18 2006-08-02 Parallele Bioscience, Inc. System and methods for enhancing signal-to-noise ratios of microarray-based measurements
US7927796B2 (en) * 2003-09-18 2011-04-19 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
US11118215B2 (en) * 2003-09-18 2021-09-14 Nuevolution A/S Method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
CA2539824C (en) * 2003-09-22 2015-02-03 Xinwen Wang Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
US20050089916A1 (en) * 2003-10-28 2005-04-28 Xiongwu Xia Allele assignment and probe selection in multiplexed assays of polymorphic targets
CA2544041C (en) 2003-10-28 2015-12-08 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
CA2544202C (en) 2003-10-29 2012-07-24 Bioarray Solutions Ltd. Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna
US20050094807A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-05 John Silzel Accuracy array assay system and method
EP1687406B1 (en) * 2003-11-10 2010-01-27 Geneohm Sciences, Inc. Nucleic acid detection method having increased sensitivity
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
EP1701785A1 (en) 2004-01-07 2006-09-20 Solexa Ltd. Modified molecular arrays
WO2005071110A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 Lingvitae As Improving polynucleotide ligation reactions
ES2353302T3 (es) 2004-01-23 2011-03-01 Sloning Biotechnology Gmbh Producción enzimática de novo de moléculas de ácido nucleico.
WO2005081776A2 (en) * 2004-01-30 2005-09-09 Eragen Biosciences, Inc. Materials and methods for the detection of sars
US20080108515A1 (en) * 2004-02-10 2008-05-08 Gormley Niall A Arrayed polynucleotides
GB0402895D0 (en) * 2004-02-10 2004-03-17 Solexa Ltd Arrayed polynucleotides
WO2005080604A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Compass Genetics, Llc Genetic analysis by sequence-specific sorting
WO2005078122A2 (en) * 2004-02-17 2005-08-25 Nuevolution A/S Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation
WO2005080605A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Helicos Biosciences Corporation Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences
WO2005085477A1 (en) * 2004-03-02 2005-09-15 Orion Genomics Llc Differential enzymatic fragmentation by whole genome amplification
DE602005017370D1 (de) 2004-03-22 2009-12-10 Nuevolution As Ligationscodierung unter verwendung von oligonukleotidbausteinen
EP1582599A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-05 Takara Bio Inc. Method for purifying microbeads
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US20050266447A1 (en) * 2004-04-19 2005-12-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for identifying activators of gene transcription
WO2005111242A2 (en) * 2004-05-10 2005-11-24 Parallele Bioscience, Inc. Digital profiling of polynucleotide populations
US7622281B2 (en) * 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US7635562B2 (en) 2004-05-25 2009-12-22 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
EP2290073A3 (en) 2004-05-28 2011-08-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
US7363170B2 (en) * 2004-07-09 2008-04-22 Bio Array Solutions Ltd. Transfusion registry network providing real-time interaction between users and providers of genetically characterized blood products
US20060019304A1 (en) * 2004-07-26 2006-01-26 Paul Hardenbol Simultaneous analysis of multiple genomes
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
US7642055B2 (en) 2004-09-21 2010-01-05 Applied Biosystems, Llc Two-color real-time/end-point quantitation of microRNAs (miRNAs)
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US20060099626A1 (en) * 2004-10-27 2006-05-11 Harbury Pehr B DNA-templated combinatorial library device and method for use
EP2302055B1 (en) 2004-11-12 2014-08-27 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
ATE390562T1 (de) * 2004-11-19 2008-04-15 Ebm Papst St Georgen Gmbh & Co Anordnung mit einem luefter und einer pumpe
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
EP2230316A1 (en) 2005-02-01 2010-09-22 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
EP2241637A1 (en) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
CA2596117A1 (en) * 2005-02-03 2006-08-10 Perkinelmer Las, Inc. Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US7407757B2 (en) * 2005-02-10 2008-08-05 Population Genetics Technologies Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060204971A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Varde Shobha A Oligonucleotides for multiplexed binding assays
WO2006099604A2 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Compass Genetics, Llc Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
WO2006101913A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-28 Eragen Biosciences, Inc. Methods for detecting multiple species and subspecies of neiserria
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US8293472B2 (en) 2005-06-07 2012-10-23 Luminex Corporation Methods for detection and typing of nucleic acids
EP3257949A1 (en) 2005-06-15 2017-12-20 Complete Genomics Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
WO2007025594A1 (en) * 2005-07-07 2007-03-08 Pamgene Bv Method for detection and quantification of target nucleic acids in a sample
US20070172429A1 (en) * 2005-08-12 2007-07-26 Xiaolian Gao Labeling compositions and methods of use for deterrent trackability
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
PT3305900T (pt) 2005-12-01 2021-10-27 Nuevolution As Métodos de codificação enzimática para síntese eficaz de bibliotecas grandes
WO2007081385A2 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
WO2007087310A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Nucleic acid analysis using sequence tokens
WO2007087312A2 (en) * 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
US7397546B2 (en) 2006-03-08 2008-07-08 Helicos Biosciences Corporation Systems and methods for reducing detected intensity non-uniformity in a laser beam
US20070264694A1 (en) * 2006-04-07 2007-11-15 Eragen Biosciences, Inc. Use of non-standard bases and proximity effects for gene assembly and conversion of non-standard bases to standard bases during dna synthesis
CN101495654A (zh) * 2006-04-19 2009-07-29 阿普里拉股份有限公司 无凝胶珠基测序的试剂、方法和文库
EP2530167A1 (en) 2006-05-11 2012-12-05 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US7910695B2 (en) * 2006-06-29 2011-03-22 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
US7879975B2 (en) * 2006-06-29 2011-02-01 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
US7777002B2 (en) * 2006-06-29 2010-08-17 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
US7993873B2 (en) * 2006-06-29 2011-08-09 The Invention Science Fund I, Llc Apparatus for arbitrary peptide synthesis
US7923533B2 (en) * 2006-06-29 2011-04-12 The Invention Science Fund I, Llc Methods for arbitrary peptide synthesis
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
US20090002703A1 (en) * 2006-08-16 2009-01-01 Craig Edward Parman Methods and systems for quantifying isobaric labels and peptides
US8053191B2 (en) 2006-08-31 2011-11-08 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
US20090131348A1 (en) 2006-09-19 2009-05-21 Emmanuel Labourier Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
WO2008036776A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CN102851369B (zh) 2006-12-13 2015-01-21 卢米耐克斯公司 用于实时pcr多重分析的系统和方法
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
AR066922A1 (es) 2007-06-08 2009-09-23 Monsanto Technology Llc Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido
EP2171097A2 (en) * 2007-06-29 2010-04-07 Population Genetics Technologies LTD. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
US8124336B2 (en) * 2007-09-26 2012-02-28 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for reducing the complexity of a nucleic acid sample
EP2215245A2 (en) * 2007-11-02 2010-08-11 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. One-step target detection assay
EP2218019A4 (en) * 2007-11-02 2012-04-18 Hunch Inc INTERACTIVE AUTOMATIC LEARNING ADVICE INSTALLATION
US8815576B2 (en) * 2007-12-27 2014-08-26 Lawrence Livermore National Security, Llc. Chip-based sequencing nucleic acids
US9115352B2 (en) 2008-03-31 2015-08-25 Sloning Biotechnology Gmbh Method for the preparation of a nucleic acid library
US9249455B2 (en) * 2008-04-18 2016-02-02 Luminex Corporation Methods for detection and quantification of small RNA
JP2009268665A (ja) * 2008-05-07 2009-11-19 Canon Inc 吸入装置
WO2009137807A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
WO2010028288A2 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
EP2364368B1 (en) 2008-11-07 2014-01-15 Sequenta, Inc. Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8691510B2 (en) 2008-11-07 2014-04-08 Sequenta, Inc. Sequence analysis of complex amplicons
ES2726702T3 (es) 2009-01-15 2019-10-08 Adaptive Biotechnologies Corp Perfilado de la inmunidad adaptativa y métodos para la generación de anticuerpos monoclonales
ES2638324T3 (es) 2009-02-13 2017-10-19 X-Chem, Inc. Métodos de creación y examen de bibliotecas codificadas por ADN
WO2010111231A1 (en) 2009-03-23 2010-09-30 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
CN102625850B (zh) 2009-04-03 2014-11-26 蒂莫西·Z·刘 多重核酸检测方法和系统
US12129514B2 (en) 2009-04-30 2024-10-29 Molecular Loop Biosolutions, Llc Methods and compositions for evaluating genetic markers
EP2425240A4 (en) 2009-04-30 2012-12-12 Good Start Genetics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR EVALUATING GENETIC MARKERS
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
WO2010151416A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
US9587270B2 (en) 2009-06-29 2017-03-07 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
US10385391B2 (en) 2009-09-22 2019-08-20 President And Fellows Of Harvard College Entangled mate sequencing
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
CA2778449C (en) * 2009-10-23 2017-06-20 Luminex Corporation Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP4484577A3 (en) 2010-02-12 2025-03-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
EP2542678B1 (en) 2010-03-04 2017-04-12 InteRNA Technologies B.V. A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS THERAPEUTIC USES IN CANCER ASSOCIATED WITH EMT
EP3540059A1 (en) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
US20110262989A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Nanomr, Inc. Isolating a target analyte from a body fluid
US8841104B2 (en) 2010-04-21 2014-09-23 Nanomr, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US9476812B2 (en) 2010-04-21 2016-10-25 Dna Electronics, Inc. Methods for isolating a target analyte from a heterogeneous sample
US8278049B2 (en) * 2010-04-26 2012-10-02 Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago Selective enrichment of CpG islands
EP2567226B1 (en) 2010-05-06 2016-08-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
EP2591106A1 (en) 2010-07-06 2013-05-15 InteRNA Technologies B.V. Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
ES2523140T3 (es) 2010-09-21 2014-11-21 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
WO2012050920A1 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2633069B1 (en) * 2010-10-26 2015-07-01 Illumina, Inc. Sequencing methods
WO2012064975A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
CN103502448B (zh) 2010-11-12 2017-03-29 Gen9股份有限公司 核酸合成的方法和设备
BR112013012265A2 (pt) 2010-11-17 2016-08-02 Asuragen Inc mirnas como biomarcadores para distinguir neoplasmas de tireoide benignos de malignos
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
EP3412778A1 (en) 2011-02-11 2018-12-12 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
EP2681566A2 (en) 2011-02-28 2014-01-08 University of Iowa Research Foundation Anti-müllerian hormone changes in pregnancy and prediction ofadverse pregnancy outcomes and gender
US10501779B2 (en) 2011-05-12 2019-12-10 President And Fellows Of Harvard College Oligonucleotide trapping
EP3216872B1 (en) 2011-06-02 2020-04-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
CN103732744A (zh) * 2011-06-15 2014-04-16 Gen9股份有限公司 制备性体外克隆的方法
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
LT2944693T (lt) 2011-08-26 2019-08-26 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
IN2014CN02574A (cs) 2011-09-07 2015-06-26 Chem Inc X
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
KR20140066782A (ko) 2011-09-29 2014-06-02 루미넥스 코포레이션 가수분해 프로브
CA2852665A1 (en) 2011-10-17 2013-04-25 Good Start Genetics, Inc. Analysis methods
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
WO2013063519A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
WO2013063544A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Asuragen, Inc. Mirnas as diagnostic biomarkers to distinguish benign from malignant thyroid tumors
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
WO2013096802A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
EP3309262B1 (en) 2012-02-24 2019-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
CA2865575C (en) 2012-02-27 2024-01-16 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
EP2820174B1 (en) 2012-02-27 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
WO2013128281A1 (en) 2012-02-28 2013-09-06 Population Genetics Technologies Ltd Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
EP3372694A1 (en) 2012-03-05 2018-09-12 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
CA2871505C (en) 2012-04-24 2021-10-12 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
EP2844768B1 (en) 2012-04-30 2019-03-13 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
HUE029357T2 (en) 2012-05-08 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Preparations and devices for measuring and calibrating amplification distortion in multiplex PCR reactions
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
WO2013188756A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 The University Of Chicago Oligonucleotide-mediated quantitative multiplexed immunoassays
IL236303B (en) 2012-06-25 2022-07-01 Gen9 Inc Methods for high-throughput nucleic acid assembly and sequencing
WO2014007623A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Interna Technologies B.V. Diagnostic portfolio and its uses
SG10201907347YA (en) 2012-07-13 2019-09-27 X Chem Inc Dna-encoded libraries having encoding oligonucleotide linkages not readable by polymerases
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
EP3330384B1 (en) 2012-10-01 2019-09-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
WO2014055117A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
US9365896B2 (en) 2012-10-19 2016-06-14 Agilent Technologies, Inc. Addition of an adaptor by invasive cleavage
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US9804069B2 (en) 2012-12-19 2017-10-31 Dnae Group Holdings Limited Methods for degrading nucleic acid
US9434940B2 (en) 2012-12-19 2016-09-06 Dna Electronics, Inc. Methods for universal target capture
US9995742B2 (en) 2012-12-19 2018-06-12 Dnae Group Holdings Limited Sample entry
US9599610B2 (en) 2012-12-19 2017-03-21 Dnae Group Holdings Limited Target capture system
US9551704B2 (en) 2012-12-19 2017-01-24 Dna Electronics, Inc. Target detection
US10000557B2 (en) 2012-12-19 2018-06-19 Dnae Group Holdings Limited Methods for raising antibodies
US10597710B2 (en) 2012-12-21 2020-03-24 New England Biolabs, Inc. Ligase activity
US10597650B2 (en) 2012-12-21 2020-03-24 New England Biolabs, Inc. Ligase activity
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
EP2971159B1 (en) 2013-03-14 2019-05-08 Molecular Loop Biosolutions, LLC Methods for analyzing nucleic acids
CA2907377A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Baylor Research Institute Tissue and blood-based mirna biomarkers for the diagnosis, prognosis and metastasis-predictive potential in colorectal cancer
US9540685B2 (en) 2013-03-15 2017-01-10 President And Fellows Of Harvard College Methods of identifying homologous genes using FISH
US9944992B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 The University Of Chicago Methods and compositions related to T-cell activity
WO2014139596A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina Cambridge Limited Modified nucleosides or nucleotides
US9758835B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Baylor Research Institute Ulcerative colitis (UC)-associated colorectal neoplasia markers
US20160068894A1 (en) 2013-04-04 2016-03-10 Georgia State University Research Foundation, Inc. RNA Microchip Detection Using Nanoparticle-Assisted Signal Amplification
WO2014172288A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
SG11201508985VA (en) 2013-05-23 2015-12-30 Univ Leland Stanford Junior Transposition into native chromatin for personal epigenomics
WO2014197377A2 (en) 2013-06-03 2014-12-11 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
EP3011056B1 (en) 2013-06-19 2019-03-06 Luminex Corporation Real-time multiplexed hydrolysis probe assay
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
CN105555971B (zh) 2013-08-09 2017-08-29 卢米耐克斯公司 用于在核酸测定中改善熔链分辨和多重性的探针
CA3112661A1 (en) 2013-08-19 2015-02-26 Abbott Molecular Inc. Nucleotide analogs
ES2764096T3 (es) 2013-08-19 2020-06-02 Abbott Molecular Inc Bibliotecas de secuenciación de próxima generación
KR102758333B1 (ko) 2013-08-28 2025-01-23 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
EP3058096A1 (en) 2013-10-18 2016-08-24 Good Start Genetics, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
WO2015060609A2 (ko) 2013-10-21 2015-04-30 주식회사 바이오이즈 올리고뉴클레오타이드를 이용한 생체분자의 분석방법 및 장치
EP3062252A4 (en) 2013-10-22 2017-06-07 KIM, Sung-Chun Marker for generating binding information on biomolecules and nucleic acids, preparation method therefor, and method and apparatus for analyzing biomolecule by using same
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
ES2660989T3 (es) 2013-12-28 2018-03-27 Guardant Health, Inc. Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
WO2015103367A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 Raindance Technologies, Inc. System and method for detection of rna species
WO2015105179A1 (ja) 2014-01-10 2015-07-16 国立大学法人京都大学 タンパク質と高次構造を含むｒｎａとの相互作用を検出するためのｒｎａマイクロアレイ
WO2015134787A2 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
US11053548B2 (en) 2014-05-12 2021-07-06 Good Start Genetics, Inc. Methods for detecting aneuploidy
EP3180449B1 (en) 2014-08-11 2019-10-09 Luminex Corporation Probes for improved melt discrimination and multiplexing in nucleic acid assays
US10093967B2 (en) 2014-08-12 2018-10-09 The Regents Of The University Of Michigan Detection of nucleic acids
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
WO2016025818A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Good Start Genetics, Inc. Systems and methods for genetic analysis
EP3183358B1 (en) 2014-08-19 2020-10-07 President and Fellows of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
EP3842544A1 (en) * 2014-09-05 2021-06-30 QIAGEN GmbH Preparation of adapter-ligated amplicons
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
JP2017536087A (ja) 2014-09-24 2017-12-07 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝子アッセイのロバストネスを増大させるためのプロセス制御
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
CA3002133A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Good Start Genetics, Inc. Pre-implantation genetic screening and aneuploidy detection
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10000799B2 (en) 2014-11-04 2018-06-19 Boreal Genomics, Inc. Methods of sequencing with linked fragments
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
AU2015353581A1 (en) 2014-11-25 2017-06-15 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
WO2016112073A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Good Start Genetics, Inc. Screening for structural variants
EP3245304B1 (en) 2015-01-16 2021-06-30 Seqwell, Inc. Normalized iterative barcoding and sequencing of dna collections
EP3259371B1 (en) 2015-02-19 2020-09-02 Becton, Dickinson and Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
US10246702B1 (en) 2015-02-23 2019-04-02 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods for labeling target nucleic acid molecules
CA2976580A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
WO2016160844A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for combinatorial barcoding
EP3277294B1 (en) 2015-04-01 2024-05-15 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
EP4582556A3 (en) 2015-04-23 2025-10-08 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
EP3307908B1 (en) 2015-06-09 2019-09-11 Life Technologies Corporation Methods for molecular tagging
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
KR102753113B1 (ko) 2015-09-18 2025-01-09 바나디스 다이아그노스틱스 Dna 샘플의 분석을 위한 프로브 세트 및 이의 사용 방법
US10465232B1 (en) 2015-10-08 2019-11-05 Trace Genomics, Inc. Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection
SG11201805119QA (en) 2015-12-17 2018-07-30 Guardant Health Inc Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
US9931638B2 (en) 2016-02-24 2018-04-03 Latonya Stewart Garbage disposal cleaning system
US10961573B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
WO2017168332A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
JP7129343B2 (ja) 2016-05-02 2022-09-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 正確な分子バーコーディング
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
ES2979395T3 (es) 2016-05-26 2024-09-25 Becton Dickinson Co Métodos de ajuste del recuento de etiquetas moleculares
US10240196B2 (en) 2016-05-27 2019-03-26 Agilent Technologies, Inc. Transposase-random priming DNA sample preparation
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US11046995B2 (en) 2016-08-16 2021-06-29 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (FLASH)
US11198910B2 (en) 2016-09-02 2021-12-14 New England Biolabs, Inc. Analysis of chromatin using a nicking enzyme
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018057928A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Grail, Inc. Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries
CN109791157B (zh) 2016-09-26 2022-06-07 贝克顿迪金森公司 使用具有条形码化的寡核苷酸序列的试剂测量蛋白质表达
IL266197B2 (en) 2016-10-24 2024-03-01 Geneinfosec Inc Hiding information contained within nucleic acids
US10822651B2 (en) 2016-10-28 2020-11-03 Grail, Inc. Methods for single-stranded nucleic acid library preparation
US11164659B2 (en) 2016-11-08 2021-11-02 Becton, Dickinson And Company Methods for expression profile classification
JP7228510B2 (ja) 2016-11-08 2023-02-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 細胞標識分類の方法
US11268137B2 (en) 2016-12-09 2022-03-08 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
EP3551768B1 (en) 2016-12-12 2024-03-06 Grail, LLC Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries
WO2018119399A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Grail, Inc. Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters
ES2961580T3 (es) 2017-01-13 2024-03-12 Cellular Res Inc Revestimiento hidrófilo de canales de fluidos
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
WO2018165309A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 The Regents Of The University Of Michigan Analyte detection
US11274344B2 (en) 2017-03-30 2022-03-15 Grail, Inc. Enhanced ligation in sequencing library preparation
WO2018183942A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification
WO2018183897A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
US10914729B2 (en) 2017-05-22 2021-02-09 The Trustees Of Princeton University Methods for detecting protein binding sequences and tagging nucleic acids
US11459603B2 (en) * 2017-05-23 2022-10-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Target mediated in situ signal amplification with dual interacting hairpin probes
CN110719959B (zh) 2017-06-05 2021-08-06 贝克顿迪金森公司 针对单细胞的样品索引
WO2018229547A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Genome Research Limited Duplex sequencing using direct repeat molecules
US11180804B2 (en) 2017-07-25 2021-11-23 Massachusetts Institute Of Technology In situ ATAC sequencing
US20190076814A1 (en) 2017-09-11 2019-03-14 Synthego Corporation Biopolymer synthesis system and method
CN111566212A (zh) 2017-11-03 2020-08-21 因特尔纳技术有限公司 miRNA分子，等同物，安塔够妙或其来源用于治疗和/或诊断与神经元缺陷相关的病症和/或疾病或用于神经元生成和/或再生
WO2019104155A2 (en) 2017-11-22 2019-05-31 The University Of Chicago Chemical probe-dependent evaluation of protein activity and uses thereof
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
US11414656B2 (en) 2017-12-15 2022-08-16 Grail, Inc. Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction
EP3728636B1 (en) 2017-12-19 2024-09-11 Becton, Dickinson and Company Particles associated with oligonucleotides
WO2019126803A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Grail, Inc. Error removal using improved library preparation methods
EP3731959B1 (en) 2017-12-29 2025-10-08 Clear Labs, Inc. Automated priming and library loading device
EP3553182A1 (en) 2018-04-11 2019-10-16 Université de Bourgogne Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
KR102209178B1 (ko) * 2018-07-17 2021-01-29 이윤경 유전체 및 유전체 정보의 보존 및 활용을 위한 방법
US12098419B2 (en) 2018-08-23 2024-09-24 Ncan Genomics, Inc. Linked target capture and ligation
ES2992135T3 (es) 2018-10-01 2024-12-09 Becton Dickinson Co Determinar secuencias de transcripción 5’
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
SG11202105441WA (en) 2018-12-13 2021-06-29 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
EP4538389A3 (en) 2019-01-03 2025-07-30 Ncan Genomics, Inc. Linked target capture
WO2020141143A1 (en) 2019-01-03 2020-07-09 Dna Script One pot synthesis of sets of oligonucleotides
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
ES2945227T3 (es) 2019-01-23 2023-06-29 Becton Dickinson Co Oligonucleótidos asociados con anticuerpos
WO2020167920A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cellular Research, Inc. Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
ES2953889T3 (es) 2019-03-14 2023-11-16 Genome Res Ltd Método para secuenciar una repetición directa
EP3947727A4 (en) 2019-04-05 2023-01-04 Board of Regents, The University of Texas System METHODS AND APPLICATIONS OF CELL BARCODING
JP7566775B2 (ja) 2019-04-12 2024-10-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 筋肉量及び酸化的代謝を増加させるための組成物及び方法
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN120099137A (zh) 2019-07-22 2025-06-06 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
JP7522189B2 (ja) 2019-11-08 2024-07-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
WO2021146219A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Cell capture using du-containing oligonucleotides
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
WO2021155057A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
WO2021173719A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Becton, Dickinson And Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
US11661625B2 (en) 2020-05-14 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Primers for immune repertoire profiling
US12157913B2 (en) 2020-06-02 2024-12-03 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
US12391940B2 (en) 2020-07-31 2025-08-19 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
WO2023012521A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Inivata Limited Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
WO2022029688A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Inivata Ltd. Highly sensitive method for detecting cancer dna in a sample
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
CN116685850A (zh) 2020-12-15 2023-09-01 贝克顿迪金森公司 单细胞分泌组分析
US12576400B2 (en) 2021-01-08 2026-03-17 Cellanome, Inc. Methods for incubating and analyzing a cell in a compartment of a fluidic device
AU2022205377A1 (en) 2021-01-08 2023-07-20 Cellanome, Inc. Devices and methods for analyzing biological samples
WO2023059599A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Online base call compression
EP4547839A1 (en) 2022-06-30 2025-05-07 Kapa Biosystems, Inc. Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins
WO2024028794A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Temple Therapeutics BV Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders
WO2025104680A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Dna accessibility for the assessment of male fertility
WO2025158200A1 (en) 2024-01-25 2025-07-31 Pixelgen Technologies Ab Method for spatial mapping of cell targets
WO2025212586A1 (en) 2024-04-02 2025-10-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. High throughput inramolecular consensus reads
WO2025248505A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Wayne State University Methods for treating endometrial and ovarian hyperproliferative disorders
WO2026019976A1 (en) 2024-07-17 2026-01-22 The Broad Institute, Inc. Universal covalent crosslinker for antibody-oligo conjugates

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4046720A (en) 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4318846A (en) 1979-09-07 1982-03-09 Syva Company Novel ether substituted fluorescein polyamino acid compounds as fluorescers and quenchers
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4413070A (en) 1981-03-30 1983-11-01 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4678814A (en) 1981-03-30 1987-07-07 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5206143A (en) 1985-11-01 1993-04-27 Smithkline Beecham Corporation Method and reagents for performing subset analysis using quantitative differences in fluorescence intensity
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
US5093232A (en) 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
FR2596761B1 (fr) 1986-04-08 1988-05-20 Commissariat Energie Atomique Derives de nucleosides et leur utilisation pour la synthese d'oligonucleotides
US5091519A (en) 1986-05-01 1992-02-25 Amoco Corporation Nucleotide compositions with linking groups
ZA877772B (en) * 1986-10-23 1988-04-20 Amoco Corporation Target and background capture methods and apparatus for affinity assays
SE458968B (sv) 1987-06-16 1989-05-22 Wallac Oy Biospecifikt analysfoerfarande foer flera analyter i vilket ingaar partikelraekning och maerkning med fluorescerande maerksubstanser
US4942124A (en) * 1987-08-11 1990-07-17 President And Fellows Of Harvard College Multiplex sequencing
EP0304845A3 (en) * 1987-08-28 1991-03-06 Profile Diagnostic Sciences Inc. Method and kit for assaying gene expressions
WO1989003849A1 (en) 1987-10-28 1989-05-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology Oligonucleotide-polyamide conjugates
US5104791A (en) 1988-02-09 1992-04-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Particle counting nucleic acid hybridization assays
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US5002867A (en) 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
GB8822228D0 (en) * 1988-09-21 1988-10-26 Southern E M Support-bound oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
JPH02299598A (ja) * 1989-04-14 1990-12-11 Ro Inst For Molecular Genetics & Geneteic Res 微視的サイズの別個の粒子と結合している核酸試料中のごく短い配列の全部または一部のオリゴヌクレチドプローブとのハイブリダイゼーションによる決定法
US5043272A (en) 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5302509A (en) * 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
US5366860A (en) 1989-09-29 1994-11-22 Applied Biosystems, Inc. Spectrally resolvable rhodamine dyes for nucleic acid sequence determination
WO1991006678A1 (en) 1989-10-26 1991-05-16 Sri International Dna sequencing
US5188934A (en) 1989-11-14 1993-02-23 Applied Biosystems, Inc. 4,7-dichlorofluorescein dyes as molecular probes
WO1991007092A1 (en) 1989-11-17 1991-05-30 Applied Biosystems, Inc. Poly(alkyl and alkenyl phosphate)s and their thiophosphate and selenophosphate derivatives as antiviral agents
CA2035010C (en) 1990-01-26 1996-12-10 Keith C. Backman Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
CA2036946C (en) * 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
JP3306063B2 (ja) * 1990-08-24 2002-07-24 イグジス， インコーポレイテッド ランダムコドンを有するオリゴヌクレオチドを合成する方法
DE69120821T2 (de) 1990-08-31 1997-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota, Minneapolis, Minn. Polyethylenglykol-Derivate für Festphasenanwendungen
EP0834575B1 (en) * 1990-12-06 2001-11-28 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Identification of nucleic acids in samples
JPH057490A (ja) * 1991-05-25 1993-01-19 Sumitomo Electric Ind Ltd Ｄｎａ断片の分取法
WO1993002360A1 (en) 1991-07-16 1993-02-04 Transmed Biotech Incorporated Methods and compositions for simultaneous analysis of multiple analytes
WO1993005183A1 (en) * 1991-09-09 1993-03-18 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
US5770358A (en) * 1991-09-18 1998-06-23 Affymax Technologies N.V. Tagged synthetic oligomer libraries
CA2119927A1 (en) 1991-09-27 1993-04-01 Michael Y.-X. Ma Duplex-forming polynucleotide conjugates
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
FI943054A7 (fi) * 1991-12-24 1994-08-22 Tepnel Medical Ltd Nukleiinihapposekvenssien manipulointi
EP0675966B1 (en) * 1992-02-19 2004-10-06 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
CA2133554C (en) * 1992-04-15 2009-07-14 David R. Shortle Synthesis of diverse and useful collections of oligonucleotides
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
DE69313611T2 (de) 1992-07-02 1998-01-08 Erkki Soini Biospezifisches multiparameter-analyseverfahren
GB9214873D0 (en) * 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Process for categorising nucleotide sequence populations
WO1994002515A1 (en) * 1992-07-21 1994-02-03 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
KR100310939B1 (ko) * 1992-10-01 2002-06-20 추후제출 태그로암호화한복합조합화학라이브러리
US5482836A (en) * 1993-01-14 1996-01-09 The Regents Of The University Of California DNA purification by triplex-affinity capture and affinity capture electrophoresis
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
GB9401200D0 (en) * 1994-01-21 1994-03-16 Medical Res Council Sequencing of nucleic acids
US5631734A (en) 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
EP1813684A3 (en) 1994-02-14 2009-11-18 Smithkline Beecham Corporation Differently expressed genes in healthy and diseased subjects
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990022543A (ko) 1999-03-25
JP2005065704A (ja) 2005-03-17
JP4712822B2 (ja) 2011-06-29
JP4480544B2 (ja) 2010-06-16
EP0793718B1 (en) 2006-04-12
CA2202167C (en) 2003-12-16
JP2008301806A (ja) 2008-12-18
NO971644D0 (no) 1997-04-10
USRE39793E1 (en) 2007-08-21
US5604097A (en) 1997-02-18
JP2006320321A (ja) 2006-11-30
ATE323159T1 (de) 2006-04-15
FI971473L (fi) 1997-06-04
HUT77916A (hu) 1998-10-28
AU5266399A (en) 1999-12-09
FI971473A7 (fi) 1997-06-04
JP2005052146A (ja) 2005-03-03
DE69534930T2 (de) 2007-01-11
JP2004089198A (ja) 2004-03-25
KR970707279A (ko) 1997-12-01
AU784741B2 (en) 2006-06-08
AU4277896A (en) 1996-05-06
US5654413A (en) 1997-08-05
WO1996012014A1 (en) 1996-04-25
JP4206130B2 (ja) 2009-01-07
DE69534930D1 (de) 2006-05-24
NO971644L (no) 1997-06-02
EP0793718A1 (en) 1997-09-10
FI971473A0 (fi) 1997-04-09
EP1724348A3 (en) 2008-10-08
US5635400A (en) 1997-06-03
JPH10507357A (ja) 1998-07-21
JP4480380B2 (ja) 2010-06-16
CA2202167A1 (en) 1996-04-25
EP1724348A2 (en) 2006-11-22
AU712929B2 (en) 1999-11-18
EP2110445A2 (en) 2009-10-21
EP2110445A3 (en) 2010-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ86697A3 (en) Molecular system for making loops
EP0952216B1 (en) Solid phase supports with PNA and amidate tag compliments
US6352828B1 (en) Oligonucleotide tags for sorting and identification
EP1967592B1 (en) Method of improving the efficiency of polynucleotide sequencing
US6280935B1 (en) Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
WO1996041011A1 (en) Oligonucleotide tags for sorting and identification
CA2441634A1 (en) Molecular tagging system

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic