JPH10507357A - 分子タグ化システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドタグの使用により、分子の種類または亜集団を探知し、同定し、および／または分類する方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドタグは各々、最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択される、長さが３〜６ヌクレオチドの複数のサブユニットからなる。最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユニットは、同じセットの任意の他のサブユニットの相補物と２つ以上のミスマッチを有する二重鎖または三重鎖を形成する。特定の実施態様で有効なオリゴヌクレオチドタグの数は、１タグ当たりのサブユニットの数およびサブユニットの長さに依存する。本発明の重要な局面は、ポリヌクレオチドに結合されるタグとその相補物とを特異的にハイブリダイズすることにより、固相支持体上でポリヌクレオチドを分類するためにオリゴヌクレオチドタグを使用することである。この実施態様は、ポリヌクレオチドを操作および選別するための、特に大規模並行操作（例えば、大規模DNA配列決定、mRNAフィンガープリンティングなど）において有用な容易に自動化されたシステムを提供する。このシステムでは、多くの標的ポリヌクレオチドまたは単一標的ポリヌクレオチドの多くのセグメントが、同時に配列決定される。

Description

【発明の詳細な説明】 分子タグ化システム 発明の分野 本発明は、一般にはオリゴヌクレオチドラベルで分子(特にポリヌクレオチド) を同定、分類、および／または探知するための方法に関し、より詳細にはオリゴ ヌクレオチドタグへの特異的ハイブリダイゼーションによりポリヌクレオチドを 分類する方法に関する。 背景 オリゴヌクレオチドおよびそのアナログの特異的ハイブリダイゼーションは、 広く多様な研究的適用、医学的適用および産業的適用で用いられている基礎的な プロセス(診断アッセイにおける疾患関連のポリヌクレオチドの同定、新規の標 的ポリヌクレオチドのクローンのスクリーニング、ポリヌクレオチド混合物のブ ロットにおける特異的ポリヌクレオチドの同定、特異的な標的ポリヌクレオチド の増幅、不適切に発現された遺伝子の治療的ブロッキング、DNA配列決定などを 含む)である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual． 第２版(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1989)；KellerおよびManak 、DNA Probes、第２版(Stockton Press．New York，1993)；Milliganら、J.Med. Chem．36:1923-1937(1993)；Drmanacら、Science，260:1649-1652(1993)；Bains J．DNA Sequencing and Mapping，4:143-150(1993))。 特異的ハイブリダイゼーションはまた、オリゴヌクレオチドタグで標識された 化合物を探知、回収、および同定する方法として提案されている。例えば、複数 のDNA配列決定において、オリゴヌクレオチドタグは、同じ配列決定反応におい て生じるDNAフラグメントからなるゲル上の電気泳動的に分離されたバンドを同 定するために用いられる。このように、多くの配列決定反応由来のDNAフラグメ ントが、ゲルの同じレーンで分離され、次いで異なる固相物質でブロットされる 。そこでは、異なる配列決定反応由来のフラグメントバンドが、相補的なタグに 特 異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブで可視化される(Church ら、Science，240:185-188(1988))。オリゴヌクレオチドタグの同様の用途はま た、爆発物、潜在的な汚染物質(例えば、原油)、および模造品の防止または検出 のために通貨を同定するために提供されてきた(例えば、Dollinger、265-274頁 、Mullisら編、The Polymerase Chain Reaction(Birkhauser，Boston，1994)に レビューされた)。さらに最近、オリゴヌクレオチドタグを用いるシステムはま た、複雑なコンビナトリアルケミカルライブラリー中の個々の分子を操作および 同定する方法として(例えば、このような薬物候補物のライブラリーのスクリー ニングを助けるために)提案されている(BrennerおよびLerner．Proc.Natl.Acad. Sci.、89:5381-5383(1992)：Alper．Science、264:1399-1401(1994)：およびNee delsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、90:10700-10704(1993))。 このようなタグ化スキームをうまく実施することは、タグとその相補的プロー ブとの間での特異的なハイブリダイゼーションの達成における成功に大部分依存 している。すなわち、オリゴヌクレオチドタグが基質をうまく同定するためには 、擬陽性および擬陰性のシグナルの数を最小限にしなければならない。不幸にも 、このような偽のシグナルは希ではない。なぜなら塩基対形成および塩基の積み 重ね(base stacking)の自由エネルギーは二重鎖または三重鎖構造におけるヌク レオチドのあいだで広く変化するからである。例えば、その相補物に結合したデ オキシアデニン(A)およびチミジン(T)の繰り返し配列からなる二重鎖は、ミスマ ッチを含む部分的に相補的な標的に結合したデオキシグアニジン(G)およびデオ キシシチジン(C)の繰り返し配列からなる同じ長さの二重鎖より安定性が低い可 能性がある。従って、大きなコンビナトリアルケミカルライブラリー由来の所望 の化合物が前者のオリゴヌクレオチドでタグ化された場合、完全にマッチしたAT に富む二重鎖を検出するように設計されたハイブリダイゼーション条件下では、 GCに富むオリゴヌクレオチドで標識された所望されない化合物(ミスマッチした 二重鎖においてさえ)が、ATに富むタグからなる完全にマッチした二重鎖ととも に検出されるという重大な可能性が存在する。Brennerら(上記)により提案され た分子タグ化システムでは、親密に関連するタグの関連するミスハイブリダイゼ ーションの問題は、いわゆる「無限(comma-less)」コードを用いることにより処 理 され、これはその相補的タグについて登録をはずれた(またはフレームシフトし た)プローブが、その５またはそれ以上の３塩基ワードまたは「コドン」のおの おのについて１つまたはそれ以上のミスマッチを有する二重鎖を生じることを保 証する。 たとえ塩化テトラメチルアンモニウムのような試薬がオリゴヌクレオチド二重 鎖の塩基特異的安定性の相違を無効にするために利用可能であるとしても、この ような試薬の効果はしばしば限定され、そしてその存在は選択された化合物のさ らなる操作(例えば、ポリメーラーゼ連鎖反応(PCR)などによる増幅)を不可能に し得るか、またはより困難にし得る。 このような問題は、例えば多数回PCR、リバースドットブロッティングなどを 介する多数のまたは複合した遺伝子座の分析における多数のハイブリダイゼーシ ョンプローブの同時使用を非常に困難にしている。その結果、例えばHLA遺伝子 のような特定の座の直接配列決定は、遺伝子型の同定のための特異的ハイブリダ イゼーションを用いる間接的な方法に対する信頼し得る代替法として奨励される (例えば、Gyllenstenら、Proc.Natl.Acad.Sci.,85:7652-7656(1988))。 異なる固相支持体上で、クローン化されかつ同様にタグ化されたDNAを分類す る能力は、特に、並行して多くのサンプルに同時に適用し得る非ゲルベースの配 列決定方法と連結される場合に、このような配列決定を促進する。 上記を考慮すると、多くのタグのレパートリーを提供するが、また天然の塩基 対形成および塩基の積み重ねの自由エネルギーの差違を変化させるための特別な 試薬を用いる必要はなく、擬陽性および擬陰性のシグナルの発生を最小限にする オリゴヌクレオチドベースのタグ化システムが利用可能である場合、これは有用 である。このようなタグ化システムにより、コンビナトリアルケミカルライブラ リーの構築および使用、DNAの大スケールのマッピングおよび配列決定、遺伝子 同定、医学診断薬などを含む多くの領域での適用が見い出される。 発明の要旨 本発明の目的は、化合物の探知、回収、および同定のための分子タグ化システ ムを提供することである。 本発明の別の目的は、オリゴヌクレオチドタグおよびその相補物の特異的ハイ ブリダイゼーションにより固相物質の表面上の同一の分子、または分子のサブク ラス(特にポリヌクレオチド)を分類するための方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、コンビナトリアルケミカルライブラリーを提供する ことであり、それらのメンバー化合物は、オリゴヌクレオチドタグおよびその相 補物の特異的ハイブリダイゼーションにより同定される。 本発明のなおさらなる目的は、同時分析および／または配列決定用の標的ポリ ヌクレオチドの数千ものフラグメント(特にランダムに重複するフラグメント)を タグ化および分類するためのシステムを提供することである。 本発明の別の目的は、数百塩基対から数万塩基対の範囲の長さを有する標的ポ リヌクレオチドを配列決定するための迅速かつ信頼できる方法を提供することで ある。 本発明は、オリゴヌクレオチドタグの使用により分子の種類または亜集団を探 知、同定、および／または分類するための方法および物質を提供することにより 、これらおよび他の目的を達成する。本発明のオリゴヌクレオチドタグは多くの サブユニットからなり、各サブユニットは３から６ヌクレオチド長のオリゴヌク レオチドからなる。オリゴヌクレオチドタグのサブユニットは、最少に交差ハイ ブリダイズしているセット（minimally cross-hybridizing set）から選択され る。このようなセットでは、このセットのサブユニットおよびこのセットの任意 の他のサブユニットの相補物からなる二重鎖または三重鎖は少なくとも２つのミ スマッチを含む。言い換えると、最少に交差ハイブリダイズしているセットのサ ブユニットは最良でも、同じセットの任意の他のサブユニットの相補物と２つの ミスマッチを有する二重鎖または三重鎖を形成する。特定の実施態様に用いられ 得るオリゴヌクレオチドタグの数は、タグあたりのサブユニット数およびサブユ ニットの長さに依存する。その数は、一般的にタグの長さの全ての可能性のある 配列の数（１つのタグがｎヌクレオチド長であるタグの数は４ⁿである）よりず っと少ない。より好ましくは、サブユニットは４から５ヌクレオチド長のオリゴ ヌクレオチドである。 本発明の１つの局面において、固相支持体に結合したオリゴヌクレオチドタグ の相補物は、ポリヌクレオチドをそれぞれタグを含むポリヌクレオチドの混合物 から分類するために用いられる。この実施態様では、オリゴヌクレオチドタグの 相補物は、同一配列の集団が特定の領域で産生されるように、微細ビーズのよう な固相支持体の表面上、または単一の支持体上の合成位置のアレイ(array)上の 特定の位置で合成される。すなわち、各支持体(ビーズの場合)または各領域(ア レイの場合)の表面は、特定の配列を有する唯一のタイプの相補物によって誘導 体化される。このようなビーズ集団または領域集団は別個の配列を有する相補物 のレパートリーを含み、そのレパートリーのサイズはオリゴヌクレオチドタグあ たりのサブユニットの数および用いられたサブユニットの長さに依存する。同様 に、分類すべきポリヌクレオチドは、同一のポリヌクレオチドが同じタグを有し 、そして異なるポリヌクレオチドが異なるタグを有するようにレパートリー中の オリゴヌクレオチドタグをおのおの含む。下記でより十分に説明するように、こ の条件は、タグ化されたポリヌクレオチドの完全なアンサンブルからタグ化され たポリヌクレオチドの十分に小さいサンプルを取ることにより達成される。従っ て、支持体およびポリヌクレオチドの集団がそれぞれの相補物とオリゴヌクレオ チドタグの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合される場合 、同一ポリヌクレオチドの亜集団は特定のビーズまたは領域上に分類される。次 いでポリヌクレオチドの亜集団はミクロ生化学的技法により固相支持体上で操作 され得る。 一般的に、本発明の方法は以下の工程を包含する：(a)分子集団中の各分子に タグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグを結合して、(i)集団中の実 質的に全ての同じ分子または分子の同じ亜集団は結合した同じオリゴヌクレオチ ドタグを有し、そして集団中の実質的に全ての異なる分子または分子の異なる亜 集団は結合した異なるオリゴヌクレオチドタグを有し、ならびに(ii)レパートリ ー由来の各オリゴヌクレオチドタグは多数のサブユニットを含有し、そして多数 の各サブユニットは３から６ヌクレオチドまたは３から６塩基対の長さを有する オリゴヌクレオチドからなり、そのサブユニットが最少に交差ハイブリダイズし ているセットから選択される、工程：および(b)それらのそれぞれの相補物とオ リゴヌクレオチドタグを特異的にハイブリダイズすることにより、集団の分子ま たは分子の亜集団を分類する、工程。 本発明の重要な局面は、並行する配列決定のためにポリヌクレオチドを分類す るためのオリゴヌクレオチドタグの使用である。好ましくは、このような配列決 定は以下の工程により行われる：(a)標的ポリヌクレオチドをカバーする多数の フラグメントを標的ポリヌクレオチドから生成する、工程；(b)タグのレパート リー由来のオリゴヌクレオチドタグをその多数の各フラグメントに結合して、(i )実質的に全ての同じフラグメントは、結合した同じオリゴヌクレオチドタグを 有し、そして実質的に全ての異なるフラグメントは、結合した異なるオリゴヌク レオチドタグを有し、ならびに(ii)そのレパートリー由来の各オリゴヌクレオチ ドタグは多数のサブユニットを含有し、そして多数の各サブユニットは３から６ ヌクレオチドまたは３から６塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり 、そのサブユニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択される 、工程； それらのそれぞれの相補物とオリゴヌクレオチドタグを特異的にハイブリダイ ズすることによりフラグメントを分類する、工程；(c)下記のように、好ましく は単一塩基配列決定方法により、多数の各フラグメントの一部のヌクレオチド配 列を決定する工程；ならびに(d)標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、 フラグメントの配列を対照することにより決定する、工程。 本発明は、オリゴヌクレオチドで分子をタグ化または標識する現在の方法の鍵 となる欠点を克服する。本発明に従ってタグの配列をコードすることにより、タ グと別のタグに対する相補物との間でミスマッチした任意の二重鎖または三重鎖 の安定性は、タグとそれ自身の相補物との間で完全にマッチした任意の二重鎖の 安定性よりはるかに低い。従って、不正確な分類の問題は、GCに富むタグのミス マッチした二重鎖が完全にマッチしたATに富むタグよりも安定であるため、除去 される。 微細ビーズのような固相支持体と組み合わせて用いた場合、本発明は、大スケ ールのDNA配列決定のような大スケールの並行操作において特に有用なポリヌク レオチドを操作および分類するための容易な自動化システムを提供する。ここで は、多くの標的ポリヌクレオチドまたは単一標的ポリヌクレオチドの多くの部分 が同時に配列決定および／または分析される。 図面の簡単な説明 図1a-1cは、本発明で用いられ得る「単一塩基」配列決定の好ましい方法にお いて用いられる標識されたプローブの構造を例示する。 図２は、好ましい「単一塩基」配列決定方法において用いられた標的ポリヌク レオチドとプローブとの間で形成された連結された複合体中のヌクレアーゼ認識 部位、連結部位および切断部位の相対的な位置を例示する。 図３は、最少に交差ハイブリダイズしているセットを生じるための一般的なア ルゴリズムを例示するフローチャートである。 図４は、コンビナトリアルケミカルライブラリーを合成および使用するための スキームを例示し、ここでメンバー化合物は本発明に従ってオリゴヌクレオチド タグで標識される。 図５は、本発明に従ってポリヌクレオチド配列決定のような並行操作を行うた めの装置を図で例示する。 定義 オリゴヌクレオチドタグに関して本明細書中に用いられる「相補物」または「 タグ相補物」は、オリゴヌクレオチドタグが特異的にハイブリダイズして完全に マッチした二重鎖または三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドをいう。特異的ハ イブリダイゼーションが三重鎖を生じる実施態様では、オリゴヌクレオチドタグ は２本鎖または１本鎖のいずれかであることが選択され得る。従って、三重鎖が 形成される場合、用語「相補物」は、１本鎖オリゴヌクレオチドタグの２本鎖相 補物または２本鎖オリゴヌクレオチドタグの一本鎖相補物のいずれかを包含する ことを意味する。 本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、モノマー-モノマー相 互作用の通常のパターン(例えば、Watson-Crick型の塩基対形成、塩基の積み重 ね、Hoogsteenまたは逆Hoogsteen型の塩基対形成など)を介して標的ポリヌクレ オチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは連結物 (デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのαアノマー型、ペプ チド核酸(PNA)などを含む)の直鎖オリゴマーを含む。通常、モノマーはホスホジ エステル結合またはそのアナログにより連結され、少しのモノマーユニット(例 えば３〜４)から数十のモノマーユニットの大きさの範囲にわたってオリゴヌク レオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが一連の文字(例えば、「ATGCCTG」) により示される場合はいつも、ヌクレオチドは左から右に5'→3'の順であり、他 に記載されない限り、「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチ ジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、および「T」はチミジンを示す ことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログは、ホスホロチオエート、 ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを含む 。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは４つの天然のヌクレオチドを包含する； しかし、それらは非天然のヌクレオチドアナログも含有し得る。天然または非天 然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが用いられ得る場合(例えば、酵 素によりプロセスされる必要がある場合)、通常天然のヌクレオチドからなるオ リゴヌクレオチドが必要であることは当業者には明らかである。 二重鎖に関して「完全にマッチした」は、各鎖中の全てのヌクレオチドが他鎖 中のヌクレオチドとWatson-Crick塩基対形成を受けるように、二重鎖を作るポリ ヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、互いに２本鎖構造を形成するこ とを意味する。この用語はまた、用いられ得るヌクレオシドアナログ(例えば、 デオキシイノシン、２-アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど)の対形成を 含む。三重鎖に関しては、この用語は三重鎖が完全にマッチした二重鎖および第 ３鎖からなり、ここで、全てのヌクレオチドが完全にマッチした二重鎖の塩基対 とHoogsteenまたは逆Hoogsteen会合を受けることを意味する。逆に、二重鎖にお けるタグとオリゴヌクレオチドとの間の「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖 におけるヌクレオチドの対またはトリプレット(triplet)がWatson-Crickおよび ／またはHoogsteenおよび／または逆Hoogsteen結合を受け損なうことを意味する 。 本明細書中に用いられる「ヌクレオシド」は、2'-デオキシ型および2'-ヒドロ キシル型(例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版(Freeman，S an Francisco，1992)に記載されたように)を含む天然ヌクレオシドを含む。ヌ クレオシドに関して「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変さ れた糖部分を有する合成ヌクレオシド(例えば、Scheit，Nucleotide Analogs(Jo hn Wiley，New York，1980)；UhlmanおよびPeyman，Chemical Reviews，90:543- 584(1990)などに記載された)を、それらが特異的ハイブリダイゼーションをし得 るという条件つきで含む。このようなアナログは、結合特性を増強し、退化を低 減し、特異性を増すなどのように設計された合成ヌクレオシドを包含する。 発明の詳細な説明 本発明は、分子(特にポリヌクレオチド)をオリゴヌクレオチドタグを用いるこ とにより標識および分類する方法を提供する。本発明のオリゴヌクレオチドタグ は、サブユニットの最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択される多 数の「ワード」またはサブユニットを包含する。このようなセットのサブユニッ トは、２つより少なくミスマッチしたヌクレオチドを有する同じセットの別のサ ブユニットの相補物と二重鎖または三重鎖を形成し得ない。従って、二重鎖を形 成するレパートリーの任意の２つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、２ヌクレ オチドの異なりより「厳密(close)」でない。特定の実施態様では、レパートリ ーの任意の２つのオリゴヌクレオチドタグの配列は、例えばサブユニットが３つ より少なくミスマッチしたヌクレオチドを有する同じセットの別のサブユニット の相補物と二重鎖を形成し得ないように最少に交差ハイブリダイズしているセッ トを設計することなどにより、「さらに」離れることさえあり得る。このような 実施態様では、より大きい特異性が達成されるが、タグの総レパートリーはより 小さい。従って、一定の長さおよびワードサイズのタグについて、所望の特異性 の程度と所望のレパートリーのサイズとの間で取引がされるに違いない。本発明 は、配列決定、フィンガープリンティング、または他のタイプの分析のような並 行操作のためにポリヌクレオチドを標識および分類するのに特に有用である。 サブユニットの最少に交差ハイブリダイズしているセットからの オリゴヌクレオチドタグの構築 任意の最少に交差ハイブリダイズしているセット用のサブユニットのヌクレオ チド配列は、図３に図示した一般アルゴリズムに従い、そしてソースコードが付 表Iに挙げられるプログラムminhxにより例示されたような簡単なコンピュータプ ログラムにより便利に計算される。minhxは、３種のヌクレオチドからなるサブ ユニットを有し、そして４の長さを有する全ての最少に交差ハイブリダイズして いるセットを算定する。 図３のアルゴリズムは最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユニッ トの特性、すなわちメンバー間の塩基の長さ、数の差異、および組成(例えば、 ２、３、または４種の塩基からなる)を最初に定義することにより実施される。 一定の長さおよび組成の全ての可能性のある配列からなるテーブルM_n・n=1が生 じる(100)。最初のサブユニットS₁を選択し、そしてテーブルの最後までi=n+1で ある連続するサブユニットS_iと比較する(120)。連続するサブユニットが最少に 交差ハイブリダイズしているセットのメンバーであるために必要なミスマッチの 数を有する場合はいつも、新たなテーブルM_n+1(125)にたくわえられ、これは前 述の工程120までの経路で以前に選択されたサブユニットをも含む。例えば、比 較の第一セットでは、M₂はS₁を含む：比較の第二セットでは、M₃はS₁およびS₂を 含む：比較の第三セットでは、M₄はS₁、S₂、およびS₃を含む：など。同様に、テ ーブルM_jにおける比較は、S_jと全ての連続サブユニットM_jとの間にある。各連続 するテーブルM_n+1は、サブユニットが工程130までの連続する経路において除去 されるので、その前の物より小さいことに気を付ける。テーブルM_nの全てのサブ ユニットが比較された(140)後に、古いテーブルは新たなテーブルM_n+1に置き換 わり、そして次のラウンドの比較が開始される。選択されたサブユニットS_iに比 較するための連続するサブユニットを含まないテーブルM_n(すなわちM_n=M_n+1)が 達する場合、プロセスは停止する(160)。 好ましくは、最少に交差ハイブリダイズしているセットはセットの全ての他の サブユニットのように二重鎖安定性にほぼ等しい寄与をするサブユニットを含有 する。このように、全てのサブユニットとその相補物との間で完全にマッチした 二重鎖の安定性はほぼ等しい。このようなセットを選択するためのガイダンスは 至適なPCRプライマーの選択および二重鎖安定性の計算についての報告された技 術により提供される、例えばRychlikら、Nucleic Acids Research,17:8543-8551 (1989)および18:6409-6412(1990)：Breslauerら、Proc.Natl.Acad.Sci.，83:374 6-3750(1986)：Wetmur，Crit．Rev．Biochem．Mol.Blol.，26:227-259(1991)な ど。より短いタグ(例えば、約30ヌクレオチドまたはそれより少ない)について、 RychlikおよびWetmurにより記載されたアルゴリズムが好ましく、より長いタグ( 例えば、約30〜35ヌクレオチドまたはそれより大きい)については、Suggsら、Br own編のICN-UCLA Symp．Dev．Biol.，第23巻(Academic Press，New York，1981) の683-693頁に開示された演算法が便利に用いられ得る。明らかに、本発明の範 囲内で最少に交差ハイブリダイズしているサブユニットのセットを設計するため に当業者に利用可能な多くのアプローチがある。例えば、サブユニットを組み立 てる場合、末端ヌクレオチドの異なる塩基の積み重ねエネルギーの影響を最小に するために、サブユニットは同じ末端ヌクレオチドを有するように提供され得る 。このように、サブユニットを連結する場合、全ての隣接する末端ヌクレオチド の塩基の積み重ねエネルギーの総量は同じであり、これによりタグ融解温度の多 様性が低減または除去される。 最少に交差ハイブリダイズしているセットの好ましい実施態様は、そのサブユ ニットが４つの天然ヌクレオチドのうちの３つからなるセットである。下記でよ り詳細に述べるように、オリゴヌクレオチドタグ中のヌクレオチドの１タイプの ヌクレオチドの欠損は、DNAポリメラーゼの5'→3'エクソヌクレアーゼ活性の使 用により標的ポリヌクレオチドが固相支持体上にロードされることを可能にする 。以下は、Ａ、Ｇ、およびＴからなる群から選択される４つのヌクレオチドをお のおの含有するサブユニットの最少に交差ハイブリダイズしているセットの例で ある： このセットでは、各メンバーは全ての他のメンバーの相補物と３つミスマッチし た塩基を有する二重鎖を形成する。 さらなる模範的な最少に交差ハイブリダイズしているセットが下記の表Iに挙 げられる。明らかに、さらなるセットは異なるグループのヌクレオチドを置換す ることにより、または公知の最少に交差ハイブリダイズしているセットのサブユ ニットを用いることにより生じ得る。 本発明のオリゴヌクレオチドタグおよびそれらの相補物は、自動化DNA合成機( 例えば、Applied Biosystems，Inc.(Foster City，California)モデル392または 394型DNA／RNA合成機)で、ホスホルアミダイトケミストリーのような標準ケミス トリー(例えば、以下の参考文献で開示される)を用いて便利に合成される：Beau cageおよびIyer．Tetrahedron．48:2223-2311(1992)；Molkoら、米国特許第4,98 0,460号；Kosterら、米国特許第4,725,677号；Caruthersら、米国特許第4,415,7 32号；第4,458,066号；および第4,973,679号；など。得られたオリゴヌクレオチ ドが特異的ハイブリダイゼーションをし得るという条件で、別のケミストリー( 例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートなどのような非天然骨格基(b ackbone group)で生じる)も用いられ得る。いくつかの実施態様では、タグは 酵素によりプロセスまたは操作され得る天然に存在するヌクレオチドを含有し得 、対応するタグ相補物は、分類の間、より安定な二重鎖の形成を促進するペプチ ド核酸または同様の化合物のような非天然ヌクレオチドアナログを含有し得る。 微粒子が支持体として用いられる場合、オリゴヌクレオチドタグおよびタグ相 補物のレパートリーは、好ましくは、例えば、Shortleら、国際特許出願PCT/US9 3/03418に開示されるような「分裂および混合(split and mix)」技術を介するサ ブユニット様式(Subunit-Wise)合成により生じる。簡単に述べると、合成の基本 ユニットは、オリゴヌクレオチドタグのサブユニットである。好ましくは、ホス ホルアミダイトケミストリーを用い、3'ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド が最少に交差ハイブリダイズしているセット(例えば、上記に最初に挙げたセッ トについて、８つの４マー3'-ホスホルアミダイトがある)における各サブユニッ ト用に調製される。合成は、Shortleらにより開示されたように、またはヌクレ オシドモノマーを用いる種々のオリゴヌクレオチドライブラリーを生じるために 用いられた技術（例えば、Teleniusら、Genomics，13:718-725(1992)；Welshら 、Nucleic Acids Research，19:5275-5279(1991)；Grothuesら、Nucleic Acids Research，21:1321-1322(1993)；Hartley、ヨーロッパ特許出願第90304496.4号 ；Lamら、Nature，354;82-84(1991)；Zuckermanら、Int．J．Pept．Protein Res earch，40:498-507(1992)；などに開示された）に直接類似してプロセスされる 。一般的に、これらの技術はカップリング工程の間、成長するオリゴヌクレオチ ドへの活性化されたモノマーの混合物の適用を単に必要とする。 ２本鎖型のタグは、相補物鎖を別個に合成し、続いて二重鎖形成を可能にする 条件下で混合することにより作製され得る。あるいは、２本鎖タグは、プライマ ー結合部位として働く公知のオリゴヌクレオチド配列に連結した一本鎖レパート リーを最初に合成することにより形成され得る。次いで、第２の鎖はプライマー と一本鎖レパートリーとを結合し、ポリメラーゼで伸長することにより合成され る。この後者のアプローチは、Oliphantら、Gene，44:177-183(1986)に記載され る。次いで、このような二重鎖タグは、本発明に従って標的ポリヌクレオチドの 分類および操作用の標的ポリヌクレオチドと一緒にクローニングベクターに挿入 され得る。 特異的なハイブリダイゼーションが三重鎖形成を経て起きる実施態様では、タ グ配列のコード化は、二重鎖形成タグについての原理と同じ原理に従う。しかし 、サブユニット配列の選択において、さらなる制約が存在する。一般に、結合の Hoogsteen型を経た第３鎖の会合は、２本鎖標的においてホモピリミジン−ホモ プリントラックに沿って最も安定である。通常、塩基トリプレットは、T-A^*Tま たはC-G^*Cモチーフ（ここで、「-」はWatson-Crick対形成を示し、そして「^*」 は結合のHoogsteen型を示す）を形成する。しかし、他のモチーフもまた可能で ある。例えば、Hoogsteen塩基対形成は、鎖の状態および組成に依存して、第３ 鎖（Hoogsteen鎖）と第３鎖に結合する二重鎖のプリンに富む鎖との間に平行お よび逆平行（antiparallel）の配向を可能にする。特定の実施態様で所望される ように、三重鎖の安定性を最大にするか、またはそうでなければ調節するための 、適切な配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドま たはデオキシリボースヌクレオシドのどちらが用いられるか）、塩基修飾(例え ば、メチル化シトシンなど)の選択についての広範囲にわたるガイダンスが文献 中に見られる。例えば、Robertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、88:9397-9401(1991) ；Robertsら、Science、258:1463-1466(1992)；Distefanoら、Proc.Natl.Acad.S ci.、90:1179-1183(1993)；Mergnyら、Biochemistry、30:9791-9798(1991)；Che ngら、J.Am.Chem.Soc.、114:4465-4474(1992)；BealおよびDervan、Nncleic Aci ds Research、20:2773-2776(1992)；BealおよびDervan、J.Am.Chem.Soc.、114:4 976-4982(1992)；Giovannangeliら、Proc.Natl.Acad.Sci.、89:8631-8635(1992) ；MoserおよびDervan、Science、238:645-650(1987)；McShanら、J.Biol.Chem. 、267:5712-5721(1992)；Yoonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、89:3840-3844(1992)； Blumeら、Nucleic Acids Research、20:1777-1784(1992)；ThuongおよびHelene 、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.、32:666-690(1993)など。１本鎖タグまたは二重鎖 タグをそれらの１本鎖相補物または二重鎖相補物にアニールするための条件は、 周知である（例えば、Jiら、Anal.Chem.、65:1323-1328(1993)）。 本発明のオリゴヌクレオチドタグは、12から60までのヌクレオチドまたは塩基 対を長さの範囲とし得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドタグは、18から40ま でのヌクレオチドまたは塩基対を長さの範囲とする。さらに好ましくは、オリゴ ヌクレオチドタグは、25から40までのヌクレオチドまたは塩基対を長さの範囲と する。サブユニットの好ましい数およびさらに好ましい数に関して、それらの範 囲は、以下のように表され得る： 最も好ましくは、オリゴヌクレオチドタグが１本鎖であり、そして特異的なハイ ブリダイゼーションが、タグ相補物とのWatson-Crick対形成により起こる。 分子へのタグの結合 オリゴヌクレオチドタグは、当該分野で周知の種々の反応性官能基により、多 くの異なる種類の分子に結合し得る（例えば、Haugland，Handbook of Fluoresc ent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes，Inc.，Eugene，1992 ）；Khannaら、米国特許第4,318,846号など）。表IVは、オリゴヌクレオチドタ グまたは目的の分子上に存在し得る、例となる官能基およびカウンターパート反 応基を提供する。官能基およびカウンターパート反応体がともに反応する場合、 いくつかの場合では活性化の後に結合基が形成される。さらに、以下により十分 に記載されるように、タグは、選択された分子と同時に合成され、コンビナトリ アルケミカルライブラリーを形成し得る。 コンビナトリアルケミカルライブラリーの生成において特に都合の良い分子の 種類は、以下の形態の線形ポリマー分子を含む： −(Ｍ−Ｌ)_n− ここで、Ｌはリンカー（linker）部分であり、そしてＭは、広い範囲の化学構造 から選択され得、不活性な非立体的に障害となるスペーサー部分として働くこと から、他の成分に結合する分岐点、標識に結合するための部位：オリゴヌクレオ チドに結合するための部位、あるいは治療標的にハイブリダイズまたは結合する ための他の結合ポリマー：または溶解性、二重鎖および／または三重鎖形成の促 進に影響を与える他の基を結合するための部位として働き得る反応性官能基を提 供することまでの範囲の機能を提供するモノマー（例えば、インターカレーター 、アルキル化剤など）である。このような線形ポリマー分子の配列およびその結 果の組成は、BrennerおよびLerner（上記）により教示されたように、タグに結 合するポリヌクレオチド内にコードされ得る。しかし、選択事象後、選択分子の タグを増幅し、次に配列決定する代わりに、タグそれ自体または付加コードセグ メントは、目的の分子の放出後、例えば、タグ中の操作された部位の制限消化に より、直接的に（いわゆる以下に記載の「単一塩基」アプローチを用いて）配列 決定され得る。明らかに、タグ部位の同時合成と両立できる一連のケミストリー 工程により生産される任意の分子は、コンビナトリアルライブラリーの生成に用 いられ得る。 都合良く、コンビナトリアルライブラリーの生成に用いられ得る広い多様性の ホスフェート結合モノマーが存在する。以下の参考文献は、本発明での使用に適 する、いくつかのホスホルアミダイトおよび／または水素ホスホネートモノマー を開示し、そしてそれらの合成およびオリゴヌクレオチドへの包含に対するガイ ダンスを提供する：Newtonら、Nucleic Acids Research、21:1155-1162(1993)； Griffinら、J.Am.Chem.Soc.、114:7976-7982(1992)；Jaschkeら、Tetrahedron L etters、34:301-304(1992)；Maら、国際出願PCT/CA92/00423；Zonら、国際出願P CT/US90/06630；Durandら、Nucleic Acids Research、18:6353-6359(1990)；Sal unkheら、J.Am.Chem.Soc.、114:8768-8772(1992)；Urdeaら、米国特許第5,093,2 32号；Ruth、米国特許第4,948,882号；Cruickshank、米国特許第5,091,519号；H aralambidisら、Nucleic Acids Research、15:4857-4876(1987)など。さらに特 に、Ｍは、１〜20個の炭素原子、ならびに酸素、窒素、およびイオウからなる群 から選択される０〜10個のヘテロ原子を有する直鎖、環式、または分枝有機分子 構造であり得る。好ましくは、Ｍは、１〜16個の炭素原子を有するアルキル、ア ルコキシ、アルケニル、またはアリール；３〜８個の炭素原子および酸素、窒素 、およびイオウからなる群から選択される１〜３個のヘテロ原子を有するヘテロ 環；グリコシル；またはヌクレオシジルである。さらに好ましくは、Ｍは、１〜 ８個の炭素原子を有する、アルキル、アルコキシ、アルケニル、またはアリー ル；グリコシル；またはヌクレオシジルである。 好ましくは、Ｌはリン(V)結合基であり、このリン結合基は、ホシホジエステ ル、ホスホトリエステル、メチルホスホネートまたはエチルホスホネート、ホス ホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートなどであり得る。 一般に、ホスホルアミダイトまたは水素ホスホネート前駆体由来の結合が好まし く、そのため本発明の線形ポリマー単位は、市販の自動化DNA合成機（例えば、A pplied Biosystems,Inc.(Foster City,CA)モデル394など）で都合良く合成され 得る。 ｎは、ＭおよびＬの性質に依存して顕著に変化し得る。通常、ｎは、約３から 約100まで変化する。Ｍが、ヌクレオシドまたはそのアナログまたはヌクレオシ ドサイズのモノマーであり、そしてＬがリン(V)結合の場合、その時ｎは約12か ら約100まで変化する。好ましくは、Ｍが、ヌクレオシドまたはそのアナログま たはヌクレオシドサイズのモノマーであり、そしてＬがリン(V)結合の場合、そ の時ｎは約12から約40まで変化する。 ペプチドは、本発明のタグに結合する別の好ましい種類の分子である。本発明 で用いられ得るペプチド−オリゴヌクレオチド結合体の合成は、Nielsenら、J.A m.Chem.Soc.、115:9812-9813(1993)；Haralambidisら（上記）および国際特許出 願PCT/AU88/004417；Truffertら、Tetrahedron Letters、35:2353-2356(1994)； de la Torreら、Tetrahedron Letters、35:2733-2736(1994)などの参考文献で教 示されている。好ましくは、ペプチド−オリゴヌクレオチド結合体は、下記のよ うに合成される。本発明に従って合成されたペプチドは、天然アミノ酸モノマー または非天然モノマー（天然アミノ酸のＤ異性体などを含む）からなり得る。 コンビナトリアルケミカルライブラリー 本発明のタグを用いるコンビナトリアルケミカルライブラリーは、好ましくは 、Nielsenら（上記）で開示され、そして詳細な実施態様のために図４で図解さ れた方法により調製される。簡単にいえば、固相支持体（例えば、CPG）は、タ グを合成するために用いられるケミストリーおよびいくつかの選択プロセスを経 る分子を合成するために用いられるケミストリーの両方に適合する切断可能なリ ン カーで誘導体化される。好ましくは、タグは、上記のようなホスホルアミダイト ケミストリーを用いて、およびNeilsenら（上記）により推奨される改変（すな わち、メチル保護ホスファイトおよびホスフェート部分を有するDMT-5'-O-保護3 '-ホスホルアミダイト-誘導体化サブユニットが、各合成サイクルに加えられる ）により合成される。ライブラリー化合物は、好ましくは、Fmocまたは同等物（ 連続モノマーをカップリングする官能基をマスクする保護基）を有するモノマー である。DMTおよびFmoc保護基（本明細書中でサルコシンリンカーという）の両 方を用いるケミストリーに対する適切なリンカーは、Brownら、J.Chem.Soc.Chem .Commun.、1989:891-893により開示され、この開示は、参考として援用される。 図４は、オリゴヌクレオチドタグと結合するペプチドのコンビナトリアルケミ カルライブラリーを生成するためのスキームを例示する。固相支持体200は、Nie lsenら（上記）により教示されるようにサルコシンリンカー205（以下の式で例 示される）により誘導体化され、このリンカーは、試薬の接近を促進する伸長結 合部分を有する。 ここで、「CPG」は、徐放性の多孔性ガラス支持体を表す。「DMT」はジメトキシ トリチルを表し、そして、「Fmoc」は、9-フルオレニルメトキシカルボニルを表 す。好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドセグメント214は、最初に合成 され、そのため２本鎖の形態で、微粒子または基質の様なものの上で分類した後 に、制限エンドヌクレアーゼ部位が、ライブラリー化合物を切断するために提供 される。連続したサブユニットＳ₁、Ｓ₂、Ｓ₃などの代替的な付加により、合成 は進行してタグ212を形成し、そしてそれらの対応するライブラリー化合物モノ マーＡ₁、Ａ₂、Ａ₃などにより、合成は進行してライブラリー化合物216を形成す る。「分裂および混合」技術を用ると、多様性が生まれる。 最少に交差ハイブリダイズしているセット中のサブユニットは、ライブラリー 化合物中に加えられたモノマーをコードする。従って、９ワードのセットは、９ つのモノマーから構築されるライブラリー化合物を曖昧性なしにコードし得る。 いくつかの曖昧さが受容可能であれば、単一のサブユニットは、１つより多いモ ノマーをコードし得る。 合成が完了した後、産物は、切断および脱保護され（220）、タグライブラリ ー化合物225を形成し、次いで、この化合物は選択230（例えば、タンパク質のよ うな予定された標的235への結合）を受ける。次いで、選択プロセス230から回収 されたライブラリー化合物のサブセットは、固相支持体245上で、そのタグ部分 （そこでは、相補的サブユニットおよびヌクレオチドがイタリック体で示される ）を介して分類される（240）。オリゴヌクレオチドスプリント242をタグ相補物 250に結合し、制限部位255を形成した後、結合体は、対応する制限エンドヌクレ アーゼで消化され、ライブラリー化合物（図４の実施例中のペプチド）をオリゴ ヌクレオチド部分から切断する。次いで、タグの配列、それゆえライブラリー化 合物の同定は、以下に記載の本発明の好ましい単一塩基配列決定技術により決定 される。 固相支持体 本発明で用いられる固相支持体は、広い種類の形態を有し得、例えば、微粒子 、ビーズ、および膜、スライド、プレート、ミクロマシーンドチップ（micromac hined chip）などが挙げられる。同様に、本発明の固相支持体は、広い種類の組 成物を含み得、例えば、ガラス、プラスチック、シリコン、アルカンチオレート 誘導体化金（alkanethiolate-derivatized gold）、セルロース、低架橋ポリス チレンおよび高架橋ポリスチレン、シリカゲル、ポリアミドなどが挙げられる。 好ましくは、分離した粒子の集団のいずれかは、各々が同じタグ（および他はな し）への相補的配列の、均一のコーティング（または集団）を有するように用い られ、あるいは、単一支持体または数個の支持体は、各々が同じタグ（および他 はなし）への相補的配列の、均一のコーティング（または集団）を含む、空間的 に分離した領域で用いられる。後者の実施態様では、領域の面積は、特別な適用 に従って変化し得、通常、数(例えば、3〜5)μm²から数百(例えば、100〜500) μm²の面積の領域範囲である。好ましくは、このような領域は、空間的に分離さ れ、そのため隣接領域での事象（例えば、蛍光発光）により発生されるシグナル が、用いられる検出システムにより解明され得る。いくつかの適用では、１つよ り多いタグ相補物（例えば、同時配列分析、または別々にタグ化された分子を極 めて近接に持ってくるための）の均一コーティングの領域を有することが、望ま しくあり得る。 タグ相補物は、その上でタグ相補物が合成される固相支持体と共に用いられ得 、あるいは、別々に合成され得、そして使用のために固相支持体に結合され得る 。例えば、このことは以下に開示される：Lundら、Nucleic Acids Research、16 :10861-10880(1988)；Albretsenら、Anal.Biochem.、189:40-50(1990)；Wolfら 、Nucleic Acids Research、15:2911-2926(1987)；またはGhoshら、Nucleic Aci ds Research、15:5353-5372(1987)。好ましくは、タグ相補物は、同じ固相支持 体上で合成され、そして同じ固相支持体と共に用いられ得、それは、種々の形態 を含み、そして種々の結合部分を含み得る。このような支持体は、タグ相補物の 均一集団が合成される領域の微粒子、またはアレイ、またはマトリックスを含み 得る。広い種類の微粒子支持体が、本発明で用いられ得、例えば、徐放性の多孔 性ガラス（CPG）、高架橋ポリスチレン、アクリルコポリマー、セルロース、ナ イロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどにより作製される微 粒子が挙げられ、以下の模範的な参考文献中に開示されている：Meth.Enzymol. 、Section A、11-147頁、第44巻（Academic Press、New York、1976）；米国特 許第4,678,814号；第4,413,070号；および第4,046,720号；ならびにPon、19章、 Agrawal(編)、Methods in Molecular Biology、第20巻（Humana Press、Totowa 、NJ、1993）。微粒子支持体としては、市販のヌクレオシド−誘導体化CPGおよ びポリスチレンビーズ（例えば、Applied Biosystems、Foster City、CA）；誘 導体化磁気ビーズ；ポリエチレングリコールでグラフトされたポリスチレン（例 えば、TentaGel^TM、Rapp Polymere、Tubingen Germany）などがさらに挙げられ る。支持体の特性（例えば、物質、多孔度、サイズ、形態など）の選択、および 用いられる結合部分のタイプは、タグを用いる際の条件に依存する。例えば、酵 素による連続的なプロセスを含む適用において、酵素の立体障害を最小にし、そ して基質 への接近を容易にする支持体およびリンカーが好ましい。最も適切な微粒子支持 体を選択する際に、考慮されるべき他の重要なファクターとしては、サイズの均 一性、合成支持体としての効率、既知の表面積の度合い、および光学特性（例え ば、以下により十分に説明するように、表面で多くのビーズを扱う場合、透明で 平滑なビーズは、計測的な（instrumentational）利点を提供する）が挙げられ る。 微粒子表面上でタグを結合させるおよび／または合成するための模範的な結合 部分は、以下に開示されている：Ponら、Biotechniques、6:768-775(1988)；Web b、米国特許第4,659,774号：Baranyら、国際特許出願 PCT/US91/06103；Brownら 、J.Chem.Soc.Commun.、1989:891-893；Damhaら、Nucleic Acids Research、18: 3813-3821(1990)；Beattieら、Clinical Chemistry、39:719-722(1993)；Maskos およびSouthern、Nucleic Acids Research、20:1679-1684(1992)など。 上記のように、タグ相補物はまた、単一の（または数個の）固相支持体上で合 成され得、タグ相補物で均一にコートされた領域のアレイを形成する。すなわち 、このようなアレイ中の各領域内で、同じタグ相補物が合成される。このような アレイを合成するための技術は、以下に開示される：McGallら、国際出願PCT/US 93/03767；Peaseら、Proc.Natl.Acad.Sci.、91:5022-5026(1994)；Southernおよ びMaskos、国際出願PCT/GB89/01114；MaskosおよびSouthern（上記）；Southern ら、Genomics、13:1008-1017(1992)；およびMaskosおよびSouthern、Nucleic Ac ids Research、21:4663-4669(1993)。 好ましくは、本発明は、同じタグ配列の相補物で均一にコートされた微粒子ま たはビーズを用いて実行される。微粒子支持体、およびそれらの表面とオリゴヌ クレオチドとを共有結合または非共有結合する方法は、周知であり、以下の参考 文献により例示される：BeaucageおよびIyer（上記）；Gait（編）Oligonucleot ide Synthesis；A Practical Approach（IRL Press，Oxford、1984）；および上 記の参考文献。一般に、微粒子のサイズおよび形態は重要ではない；しかし、最 少の試薬およびサンプルの使用でオリゴヌクレオチドタグの多くのレパートリー の構築および操作を容易にするので、直径数μm（例えば、1〜2μm）から数百μ m（例えば、200〜1000μm）の範囲のサイズの微粒子が好ましい。 いくつかの好ましい適用では、市販の徐放性の多孔性ガラス（CPG）またはポ リスチレン支持体が、本発明における固相支持体として用いられる。このような 支持体は、塩基不安定性のリンカーおよび結合した最初のヌクレオチド（例えば 、Applied Biosystems（Foster City、CA））を用いて有効になる。好ましくは 、500オングストローム〜1000オングストロームの間のポアサイズを有する微粒 子が用いられる。 他の好ましい適用では、小孔のない微粒子が、その光学特性のために用いられ 、この微粒子は、平面支持体（例えば、顕微鏡スライド）の上で多くの微粒子を 探知する場合、有利に用いられ得る。特に、好ましい小孔のない微粒子は、Bang s Laboratories（Carmel.IN）から入手できるグリシダルメタクリレート（glyci dal methacrylate）（GMA）である。このような微粒子は、種々のサイズで有用 であり、そしてタグまたはタグ相補物を合成するための種々の結合基で誘導体化 される。好ましくは、タグ化された微粒子の多量（massively）の平行操作のた めに、直径５μmのGMAビーズが用いられる。 標的ポリヌクレオチドの微粒子への結合 本発明の重要な局面は、同一のポリヌクレオチド（例えば、cDNAライブラリー 由来）の集団の分類、ならびに各微粒子または領域が単一種のポリヌクレオチド のみを有するような微粒子あるいは固相支持体の分離領域へのそれらの結合であ る。この後者の条件は、タグのレパートリーをポリヌクレオチドの集団へ連結す ることにより、本質的に満たされ得る。次いで、連結産物は、クローン化され、 増幅され、そしてサンプリングされる。サンプルが十分小さければ、以下により 十分に説明するように、得られたライブラリーの実質的に全てのタグポリヌクレ オチド結合体は、唯一である。すなわち、各ポリヌクレオチドは、唯一のタグを 有し、逆も同様である。次いで、ポリヌクレオチドは、タグをその相補物にハイ ブリダイズすることにより分類される。 オリゴヌクレオチドタグのレパートリーは、多くの方法（例えば、直接酵素的 連結による方法、増幅（例としてPCRによるもの）、タグ配列を含むプライマー の使用など）でポリヌクレオチドの集団に連結され得る。最初の連結工程は、タ グ−ポリヌクレオチド結合体の非常に大きな集団を産生し、そのため単一のタグ が、一般に多くの異なるポリヌクレオチドに結合する。しかし、結合体の十分小 さいサンプルを採取することにより、「ダブル」を得る可能性（すなわち、２つ の異なるポリヌクレオチド上の同じタグ）は、無視できる（サンプル中の同じポ リヌクレオチドで異なるタグを得る可能性もあることに注目。この場合、単にプ ロセスされた（例えば、２回配列された）ポリヌクレオチドを生じ、そのため、 通常問題はない）。以下により十分に説明したように、サンプル中にダブルを得 る可能性は、ポアソン分布により評価され得る。なぜなら、サンプル中の結合体 の数は大きく（例えば、千以上の桁数）、そして特別なタグを選択する可能性は 小さいからである。なぜなら、タグのレパートリーは大きい（例えば、１万以上 の桁）からである。一般に、サンプルが大きければ大きいほど、ダブルを得る可 能性は大きくなる。従って、タグ−ポリヌクレオチド結合体の大きなサンプルを 選択すること（例えば、それは、ショットガン配列決定操作における標的ポリヌ クレオチド結合体の適切な適用範囲を確かめる）と最少数のダブルが存在するこ とを確かめる小さなサンプルを選択することとの間に、設計の取引が存在する。 大部分の実施態様では、ダブルの存在は、単にノイズのさらなる供給源を加える か、または配列決定の場合、スキャニングおよびシグナルプロセシングにおける 小さな複雑化要因を加えるのみである。なぜなら、多数の蛍光シグナルを与える 微粒子が簡単に無視され得るからである。本明細書中で用いられる、タグを分子 （特に、ヌクレオチド）に結合することに関する用語「実質的に全て」は、本質 的にダブルのないタグ−分子結合体の集団を得るのに用いられるサンプリング手 法の統計的な性質を反映するつもりである。タグ−分子結合体の実際の割合に関 して、「実質的に全て」の意味は、タグがどのように用いられているかに依存す る。好ましくは、核酸配列決定において、「実質的に全て」は、少なくともタグ の80％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。より好ま しくは、少なくともタグの90％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有するこ とを意味する。さらにより好ましくは、少なくともタグの95％が、結合した唯一 のポリヌクレオチドを有することを意味する。そして、最も好ましくは、少なく ともタグの99％が、結合した唯一のポリヌクレオチドを有することを意味する。 好ましくは、ポリヌクレオチドの集団が、メッセンジャーRNA（mRNA）からな る場合、オリゴヌクレオチドタグは、mRNAをタグ配列のプライマー含有相補物の セットで逆転写することにより、結合する。このようなプライマーの模範的なセ ットは、以下の配列を有し得る： ここで、「[W,W,W,C]₉」は、４つのヌクレオチドの９つのサブユニットのオリゴ ヌクレオチドタグの配列を表し、そして「[W,W,W,C]」は、上記で挙げたサブユ ニット配列（すなわち、「Ｗ」はＴまたはＡを表す）を表す。下線を引いた部分 の配列は、任意の制限エンドヌクレアーゼ部位と同一である。その部位は、用い られる場合、ビオチンを介した固相支持体への結合からポリヌクレオチドを放出 させるのに用いられ得る。上記のプライマーに関して、微粒子に結合した相補物 は、以下の形態を有し得る： ５’−[Ｇ,Ｗ,Ｗ,Ｗ]₉ＴＧＧ−リンカー−微粒子 逆転写後、mRNAは、例えば、RNase H 消化により除去され、そして、cDNAの第 ２の鎖は、例えば、以下の形態のプライマーを用いて合成される： ５’−ＮＲＲＧＡＴＣＹＮＮＮ−３’ ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣのいずれか一つであり、Ｒはプリン含有ヌク レオチドであり、そしてＹはピリミジン含有ヌクレオチドである。この特定のプ ライマーは、得られた２本鎖DNA中にBst Yl制限部位を作り、それは、Sal I部位 とともに、例えばBam HIおよびXho I部位を用いたベクター中へのクローニング を容易にする。Bst YlおよびSal I消化の後、模範的な結合体は以下の形態を有 する： 好ましくは、リガーゼベースの配列決定の方法を用いた場合、Bst YlおよびSal I消化フラグメントが以下の単一コピー制限部位を有するBam HI-/Xho I-消化ベ クター中にクローン化される： これは、以下でより十分に議論される配列決定プロセスの開始を可能とするFok I部位を添加する。 増幅後の一本鎖のタグを露出させるための一般的な方法は、標的ポリヌクレオ チド含有結合体をT4 DNAポリメラーゼまたは同様の酵素の5'→3'エキソヌクレア ーゼ活性で消化することを含む。単一ヌクレオシドトリホスフェートの存在下で 用いられる場合、このようなポリメラーゼは、単一ヌクレオシドトリホスフェー トの相補物がテンプレート鎖に届くまで、２本鎖フラグメントの非テンプレート 鎖に存在する3'陥凹（recessed）末端からヌクレオチドを切断する。このような ヌクレオチドが届いた場合、5'→3'消化は、効果的に停止する。というのは、除 去活性がヌクレオチドを除去するより早い速度で、ポリメラーゼの伸長活性がヌ クレオチドを付加するからである。結果として、３つのヌクレオチドで構成され るタグは、固相支持体上にロードするために容易に調製される。 この技術はまた、標的ポリヌクレオチドの内部のFok I部位を選択的にメチル 化し、一方ポリヌクレオチドの末端で一本鎖のFok I部位をメチル化されないま ま残すために用いられる。最初に、末端Fok I部位は、デオキシシチジントリホ スフェートとともにポリメラーゼを用いて１本鎖とされる。次いで、フラグメン トの２本鎖部分は、メチル化され、その後、１本鎖末端は、４つ全てのヌクレオ シドトリホスフェートの存在下で、DNAポリメラーセを用いて満たされ、それに よりFok I部位を再生する。明らかに、この手順は、Fok I 以外のエンドヌクレ アーゼに一般化され得る。 オリゴヌクレオチドタグが、特定のハイブリダイゼーション（例えば、上記の ようにそれらを１本鎖にすることにより）のために調製された後、ポリヌクレオ チドは、タグとその相補物との間の完全にマッチする二重鎖の形成に有利な条件 下で、タグの相補的配列を含む微粒子と混合される。これらの条件を作るための 広範囲のガイダンスが文献中に存在する。このようなガイダンスを提供する例示 的な参考文献としては、Wetmur、Biochemistry and Molecular Biology中のCrit ical Reviews、26:227-259(1991)；Sambrookら、Molecular Cloning；A Laborat ory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1989）など が挙げられる。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件は、完全にマッチした 配列のみが安定した二重鎖を形成するのに十分にストリンジェントである。この ような条件下で、それらのタグにより特にハイブリダイズされたポリヌクレオチ ドは、微粒子に結合した相補的配列に連結される。最終的に、微粒子は洗浄され 、連結されないポリヌクレオチドが除去される。 合成支持体として通常使用されるCPG微粒子が用いられる場合、微粒子表面上 でタグ相補物の密度は、代表的にいくつかの配列決定操作に必要な密度以上であ る。すなわち、ポリヌクレオチドを種々の酵素に結合させる連続的な処理を必要 とする配列決定アプローチにおいては、空間を密にとったポリヌクレオチドは、 比較的大きな酵素のポリヌクレオチドへの接近を阻害する傾向があり得る。 このような場合、ポリヌクレオチドは、好ましくは、タグ相補物が、かなり過 剰に（例えば、ポリヌクレオチドに対して10:1から100:1まで、あるいはそれ以 上）存在するように微粒子と混合される。このことは、微粒子表面上におけるポ リヌクレオチドの密度が、酵素の接近を阻害するほど高くないことを保証する。 好ましくは、微粒子表面上のポリヌクレオチド間の平均空間は、30〜100nmの位 である。標準CPG支持体およびBallotiniビーズ（固体ガラス支持体の１種）につ いての割合の選択におけるガイダンスは、MaskosおよびSouthern、Nucleic Acid s Research、20:1679-1684(1992)中に見られる。好ましくは、配列決定の適用に おいて、そして直径20〜50μmの範囲の標準CPGビーズが、約10⁵のポリヌクレオ チドでロードされ、そして直径５〜10μmの範囲のGMAビーズが、数万（例えば、 ４×10⁴〜６×10⁴）のポリヌクレオチドでロードされる。 上記の方法は、以下に記載される平行配列決定方法とカップリングする場合、 mRNA集団をフィンガープリントするために用いられ得る。部分配列情報は、上記 の方法のような分離された微粒子に結合したcDNAの大量の（例えば、１万〜10万 ）サンプルから同時に得られる。部分配列の頻度分布は、種々の細胞または組織 型、ならびに疾患組織（例えば、ガン）からのmRNA集団を同定し得る。このよう なmRNAフィンガープリントは、病状をモニタリングおよび診断するのに有用であ る（例えば、国際出願 PCT/US95/21944。これは、同じ目的のための発現配列タ グ（EST）の使用を記載する）。 単一塩基DNA配列決定 本発明は、DNA配列決定の従来の方法、例えば、Hultmanら、Nucleic Acids Re search、17:4937-4946(1989)によって開示された方法とともに用いられ得る。し かし、複数のポリヌクレオチドの並行または同時の配列決定に関しては、以下の 参考文献が挙げられる：Cheeseman、米国特許第5,302,509号; Tsienら、国際出 願第WO 91/06678号; Rosenthalら、国際出願第WO 93/21340号; Canardら、Gene 、148:1-6(1994); およびMetzkerら、Nucleic Acids Research、22:4259-4267(1 994)。 本発明で用いられるのに適切であり、DNAフラグメントの電気泳動での分離を 必要としないDNA配列決定の「単一塩基」方法が、国際出願第PCT/US95/03678号 に記載されている。この方法は、以下の工程を包含する：(a)突出鎖を有するポ リヌクレオチドの末端にプローブを連結して連結複合体を形成する工程であって 、このプローブは、ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な突出鎖を有し、かつ 、このプローブは、ヌクレアーゼ認識部位を有する工程；(b)この連結複合体か ら非連結プローブを除去する工程；(c)連結プローブの同定によりポリヌクレオ チドの突出鎖における１つまたはそれ以上のヌクレオチドを同定する工程；(d) ヌ クレアーゼで連結複合体を切断する工程；および(e)ポリヌクレオチドのヌクレ オチド配列が決定されるまで(a)から(d)までの工程を繰り返す工程。以下にさら に記載するように、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの同定は、標的ポリヌク レオチドからの連結複合体の切断前または切断後のいずれかに行われ得る。好適 には、天然のタンパク質エンドヌクレアーゼが用いられる時は常に、この方法は 、配列決定操作の開始時に、標的ポリヌクレオチドをメチル化する工程をさらに 包含する。 この方法の重要な特徴は、標的ポリヌクレオチドに連結されるプローブである 。プローブの好適な形態は、図１ａに示されている。一般に、プローブは、一方 の末端10において突出鎖を有する二本鎖DNAである。プローブは、認識部位と突 出末端10との間に少なくとも１つのヌクレアーゼ認識部位12およびスペーサー領 域14を含む。好適には、プローブはまた、標識16を含み、これは、この特定の実 施態様において、突出鎖の反対側の末端に示されている。プローブは、種々の手 段により、そして種々の位置において標識され得、唯一の制限は、選択された標 識手段が、連結工程またはヌクレアーゼによるプローブの認識を邪魔しないとい うことである。 プローブの突出鎖10が、５'末端または３'末端であるかどうかは重要ではない 。しかし、標的ポリヌクレオチドおよびプローブの突出鎖が、完全に一致する二 重鎖を形成し得、特異的な連結を可能にすることが重要である。もし、標的ポリ ヌクレオチドおよびプローブの突出鎖が異なる長さであれば、生じるギャップは 、例えば、Backmanら、欧州特許出願第91100959.5号に開示されている「ギャッ プLCR」におけるように、連結以前にポリメラーゼによってフィルインされ得る 。好適には、プローブおよび標的ポリヌクレオチドの両方の鎖が、フィルイン工 程なしに連結され得るように、それぞれの突出鎖におけるヌクレオチドの数が同 じである。好適には、プローブの突出鎖は２〜６のヌクレオチドの長さである。 以下に示すように、突出鎖の長さが長くなるにつれて、各連結および切断サイク ルの間に、標的ポリヌクレオチドへ適用されるプローブ混合物の複雑性が増す。 プローブの相補鎖は、好都合にも、自動DNA合成機(例えば、Applied Biosyste ms、Inc.(Foster City、California)モデル 392または394 DNA/RNA Synthesiz er)上で、標準的なケミストリーを用いて合成される。合成後、相補鎖は、組み 合わされて二本鎖プローブを形成する。一般に、プローブの突出鎖は、混合物と して合成されるので、すべての可能な配列は、突出部に表される。例えば、もし 、突出部が４つのヌクレオチドからなっているなら、ある実施態様において、４ つの混合物が以下のように調製される： ここで、「NNN」は、すべての可能な３マーを表し、「X」は、鎖の二重鎖形成部 分を表す。従って、上に挙げられた４つプローブのそれぞれが、４³すなわち64 の異なる配列を含む；すなわち、言い換えれば、４つのプローブのそれぞれは、 64の縮重を有する。例えば、X₁X₂...X_iNNNAは、以下の配列を含む： このような混合物は、例えば、Teleniusら（上記）に開示されているように、周 知の技術を用いて簡単に合成される。一般に、これらの技術は、単に、縮重を導 入したい位置でのカップリング工程の間、成長しているオリゴヌクレオチドへの 活性化モノマーの混合物の適用を必要とするだけである。ある実施態様において 、プローブの縮重を減少させることが所望され得る。これは、例えばKong Thoo Linら、Nucleic Acids Research、20:5149-5152または米国特許第5,002,867号に よって教示されるように、デオキシイノシン、２-アミノプリンなどのような縮 重減少アナログを用いて達成され得る。 好適には、ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドについては、プ ローブの二重鎖形成領域は、長さが約12〜約30塩基対であり、より好適には、そ の長さは、約15〜約25塩基対である。 従来のリガーゼが本発明に用いられる場合、以下にさらに記載されるように、 プローブの５'末端が、ある実施態様においてリン酸化され得る。５'モノホスフ ェートが、化学的にまたはキナーゼを用いて酵素的に（例えば、Sambrookら（上 記））のいずれかで第２のオリゴヌクレオチドに結合され得る。化学的リン酸化 は、HornおよびUrdea、Tetrahedron Lett.、27:4705(1986)に記載され、開示さ れたプロトコルを実施するための試薬は、市販されている（例えば、Clontech L aboratories(Palo Alto、California)からの５'Phosphate-ON^TM)）。従って、あ る実施態様において、プローブは、以下の形態を有し得る： ここで、Ｙ'は、Ｘ'の相補ヌクレオチドであり、「ｐ」は、モノホスフェート基 である。 上記のプローブは、種々の方法で標識され得る（放射性部分、蛍光部分、比色 部分、化学ルミネセンスマーカーなどの直接または間接結合を含む）。DNAの標 識およびDNAプローブの構築のための方法の多くの包括的な概説が、本発明のプ ローブの構築に適用可能な指針を提供している。このような概説は、Kricka編、 Nonisotopic DNA Probe Techniques(Academic Press、San Diego、1992); Haug land、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Pr obes、Inc.、Eugene、1992); KellerおよびManak、DNA Probes、第２版(Stockto n Press、New York、1993); およびEckstein編、Oligonucleotides and Analogu es; A Practical Approach(IRL Press、Oxford、1991); Kessler編、Nonradioac tive Labeling and Detection of Biomolecules(Springer-Verlag、Berlin、199 2); Wetmur(上記); などを含む。 好適には、プローブは、１つまたはそれ以上の蛍光色素で標識される（例えば 、Menchenら、米国特許第5,188,934号； Begotら、国際出願第PCT/US90/05565号 に開示されている）。 この方法によれば、プローブは、標的ポリヌクレオチドの末端へ連結され、各 連結および切断のサイクルにおいて連結複合体を形成する。連結複合体は、標的 ポリヌクレオチドおよびプローブの突出鎖がアニールし、そして、少なくとも一 対のプローブおよび標的の同じ向きの鎖が連結された、すなわち、互いに共有結 合された後に、形成された二本鎖構造である。連結は、酵素的または化学的のい ずれかで達成され得る。化学的連結方法は、当該分野において周知である（例え ば、Ferrisら、Nucleosides & Nucleotides、8:407-414(1989); Shabarovaら、N ucleic Acids Research、19;4247-4251(1991)など）。しかし、好適には、連結 は、標準的なプロトコルにおいてリガーゼを用いて、酵素的に行われる。多くの リガーゼが公知であり、本発明の使用に適している（例えば、Lehman、Science 、186: 790-797(1974); Englerら、DNAリガーゼ、3-30頁、Boyer編、The Enzyme s、Vol.15B(Academic Press、New York、1982)など）。好適なリガーゼは、T4 D NA リガーゼ、T7 DNA リガーゼ、E．coli DNAリガーゼ、Taqリガーゼ、Pfuリガ ーゼ、およびTthリガーゼを含む。これらの使用の際のプロトコルは、周知であ る（例えば、Sambrookら(上記); Barany，PCR Methods and Applications、1:5- 16(1991)；Marshら、Strategies、5:73-76(1992)など）。一般に、リガーゼは、 ５'ホスフェート基が、接する鎖の３'水酸基への連結のために存在することを必 要とする。これは、好都合に、５'ホスフェートを残すヌクレアーゼ(例えば、Fo k I)を選択することによって、標的ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖に対 して提供される。 非リン酸化プローブを用いる配列決定方法の実施態様において、連結工程は、 (i)リガーゼで標的ポリヌクレオチドへプローブを連結させ、その結果連結複合 体が、一方の鎖上にニックを有して形成される工程；(ii)従来のプロトコルを用 いて、キナーゼでニックにおいて５'水酸基をリン酸化する工程（例えば、Sambr ookら（上記））；および(iii)再度連結を行い、ニックにおいて鎖を共有的に連 結させる、すなわち、ニックを除去する工程を包含する。 微粒子表面での酵素的プロセスおよび/または結合事象の観察装置 本発明の目的は、タグおよびその相補物の特異的ハイブリダイゼーションによ って、微粒子の表面上の同一分子、特に、ポリヌクレオチドを分類することであ る。一旦、このような分類が行われると、分子の存在またはそれらに対して行わ れる操作は、タグ化された分子の性質、微粒子が、分離して、または「バッチ」 で検出されるかどうか、反復された測定が所望であるかどうかなどに応じて、多 くの方法で検出され得る。代表的に、分類された分子は、例えば、薬物開発にお いて、結合のためにリガンドに曝されるか、または、例えば、ポリヌクレオチド 配列決定において化学的または酵素的プロセスに供される。これらの使用の両方 において、多くの微粒子上でのこのような事象またはプロセスに対応する信号を 同時に観察することがしばしば望まれる。分類された分子を担持する微粒子（本 明細書において「ロードされた」微粒子と称する）が、このような大規模な並行 操作に役立つ（例えば、Lamら（上記）に示されている）。 好適には、発光信号（例えば、化学ルミネセンス、蛍光など）が、事象または プロセスを検出するために用いられるときは常に、ロードされた微粒子は、平面 基板（例えば、ガラススライド）上に、（例えば、国際特許出願第PCT/US91/092 17号、同第PCT/NL90/00081号および同第PCT/US95/01886号に記載されているよう な）走査システムでの検査のために広がっている。走査システムは、再現性よく 基板を走査し、かつ、座標系によって、所定の領域に各微粒子の位置を規定し得 るべきである。ポリヌクレオチド配列決定応用において、微粒子の位置同定は、 連続的な走査工程において反復可能であることが重要である。 このような走査システムは、市販の構成要素（例えば、１つまたはそれ以上の 光電子増倍管、あるいは、CCDアレイおよび、例えば、蛍光信号を励起、収集お よび分類するための適切な光学機器を備える検出システムとともに用いられるデ ジタルコンピューターによって制御されるｘ−ｙ移動テーブル）から構築され得 る。ある実施態様において、共焦光学システムが所望であり得る。４色配列決定 での使用に適切な走査システムの一例が、図５に模式的に示されている。基板30 0（例えば、固定微粒子を有する顕微鏡スライド）が、ｘ−ｙ移動テーブル302上 に置かれ、これが、種々の市販のパーソナルコンピューター（例えば、Apple Co mputer(Cupertino、CA)から入手可能な486-ベースの機械またはPowerPC モデル7 100または8100）のうちのいずれかであり得る適切にプログラムされたデジタル コンピューター304に接続され、そしてそれにより制御される。テーブル移動お よびデータ収集機能のためのコンピューターソフトウェアは、National Instrum entsから入手可能なLab Windowsのような市販の実験ソフトウェアによって提供 され得る。 基板300およびテーブル302は、光を集め、基板300に固定した微粒子へ伝達し 得る１つまたはそれ以上の対物レンズ308を有する顕微鏡306と動作が連動する。 好適にはレーザーである光源312からの励起光線310が、光線スプリッター314（ 例えば、二色性ミラー）へ指向し、これが、光線を顕微鏡306および対物レンズ3 08を通して再指向し、、今度は、対物レンズが光線の焦点を基板300に合わせる 。レンズ308は、微粒子から発光された蛍光316を集め、それを光線スプリッター 314を通して信号分配光学機器318へ指向し、それが、今度は、蛍光をいくつかの 蛍光特性（例えば、強度、寿命など）を電気信号に変換するための１つまたはそ れ以上の適切な光学電気デバイスへ指向する。信号分配光学機器318は、帯域通 過フィルター、ファイバー光学機器、回転ミラー、固定位置ミラーおよびレンズ 、回折格子などのような当該分野において標準的な種々の構成要素を備える得る 。図５に図示するように、信号分配光学機器318は蛍光316を４つの分離した光電 子増倍管330、332、334および336へ向け、次いで、これらの出力は、プリアンプ およびフォトンカウンター350、352、354および356に向けられる。フォトンカウ ンターの出力は、コンピューター304によって収集され、そこで、蓄積され、分 析され、ビデオ360において観察され得る。あるいは、信号分配光学機器318は、 蛍光信号318をCCDアレイ上に向ける回折格子であり得る。 走査の際の位置付けの安定性および再現性が、間隔が密接な微粒子を分離する ための解像度をかなりの程度まで決定する。好適には、走査システムは、間隔が 密接な（例えば、１粒子直径またはそれ以下分だけ分離されている）微粒子を解 像し得るべきである。従って、ほとんどの応用に対して（例えば、CPG微粒子を 用いて）、走査システムは、少なくとも10〜100μm程度に対象物を解像する能力 を有するべきである。ある実施態様において、さらに高い解像度が所望であり得 るが、解像度が増すにつれて、基板を完全に走査するのに必要な時間が増す。従 って、ある実施態様において、速度と解像度との間で妥協が必要であり得る。走 査時間の増加は、微粒子が配置していることが知られている（例えば、最初のフ ル走査から）位置のみを走査するシステムによって達成され得る。好適には、微 粒子サイズおよび走査システム解像度が、１cm²当たり約１万〜10万の間の微粒 子の密度で平面上にランダムに配置される蛍光標識された微粒子の解像度を可能 にするように選択される。 配列決定応用において、ロードされた微粒子は、種々の方法で基板の表面に固 定され得る。固定は、微粒子が、顕著な損失なく、試薬露出および洗浄の連続的 なサイクルを行うのに十分に強力であるべきである。基板がガラスであるとき、 その表面は、市販の試薬(例えば、Pierce Chemical)を用いて、アルキルアミノ リンカーで誘導体化され得、これは次に再び従来のケミストリーを用いて、アビ ジンに架橋され、アビジン化された表面を形成し得る。ビオチン部分は、多くの 方法でロードされた微粒子に導入され得る。例えば、ポリヌクレオチドにタグを 結合するために用いられるクローニングベクターの画分（例えば、10〜15パーセ ント）が、タグの反対側のポリヌクレオチドの末端でポリヌクレオチド挿入物に 隣接して（消化において粘着末端を提供する）唯一の制限部位を含有するように 操作される。この部位は、微粒子にロードするためのポリヌクレオチドおよびタ グで切り出される。ロード後、ロードされたポリヌクレオチドの約10〜15パーセ ントが、微粒子表面から遠位の唯一の制限部位を有する。関連の制限エンドヌク レアーゼで消化後、ビオチン部分を含有している適切な二本鎖アダプターが、粘 着末端に連結される。それから、得られた微粒子が、アビジン化されたガラス表 面に広げられ、そこで、ビオチン−アビジン結合を介して固定される。 あるいは、そして好適には、連結による配列決定が用いられると、最初の連結 工程において、プローブの混合物が、ロードされた微粒子にアプライされる：プ ローブの一画分は、配列決定方法に必要であるようなIIs型制限認識部位を含み 、そしてプローブの一画分は、このような認識部位を有さないが、その代わりに 、その非連結末端においてビオチン部分を含む。好適には、混合物は、約10〜15 パーセントのビオチン化プローブを含む。 さらに別の実施態様において、DNAがロードされた微粒子が、ガラス基板に塗 布されると、DNAは、数時間（例えば、24時間）のインキュベーションで、ガラ ス表面に非特異的に吸着され、微粒子の顕著な損失なく、反復される試薬への露 出および洗浄を可能とするために十分に強力な結合を形成し得る。好適には、こ のようなガラス基板は、フローセル（flow cell）であり、これは、ガラススラ イドにエッチングされた流路を含み得る。好適には、このような流路は、流体が そこを通って吸い上げられ得るように閉じられ、かつ、微粒子の単層が規定され た観察領域内に閉じ込められるように、微粒子の直径と十分に近い深さを有する 。 並行配列決定 本発明のタグ化システムは、数キロベースまでの長さのポリヌクレオチドを配 列決定するための単一塩基配列決定方法とともに用いられ得る。タグ化システム は、標的ポリヌクレオチドの何千ものフラグメントが、１つまたはそれ以上の固 相支持体上に分類され、同時に配列決定され得ることを可能にする。この方法の 好適な実施によると、各分類されたフラグメントの一部分が、上記のような走査 システムまたは画像分析システムに関連する、顕微鏡スライドのような共通の基 板に固定された何千ものロードされた微粒子のそれぞれにおいて、段階的に配列 決定される。配列決定されたフラグメントの部分のサイズは、いくつかの要因、 例えば、生成および分類されたフラグメントの数、標的ポリヌクレオチドの長さ 、用いられた単一塩基方法の速度および正確さ、微粒子および/または同時にモ ニターされ得る別個の領域の数などに依存する。好適には、12〜50塩基が、各微 粒子または領域で同定され、さらに好適には、18〜30塩基が、各微粒子または領 域 で同定される。この情報により、標的ポリヌクレオチドの配列が、重複する領域 を介して12〜50塩基のフラグメントを対照することによって決定される（例えば 、米国特許第5,002,867号に記載されている）。以下の引例は、所与の長さの標 的ポリヌクレオチドを首尾良く再構築するために配列決定されなければならない フラグメントの部分を決定する際のさらなる指針を提供する：LanderおよびWate rman、Genomics、2:231-239(1988): Drmanacら、Genomics、4:114-128(1989): B ains、DNA Sequencing and Mapping、4: 143-150(1993): Bains、Genomics、11: 294-301(1991): Drmanacら、J.Biomolecular Structure and Dynamics、8:1085- 1102(1991): およびPevzner、J.Biomolecular Structure and Dynamics、7: 63- 73(1989)。好適には、標的ポリヌクレオチドの長さは、１キロベース〜50キロベ ースである。より好適には、長さは、10キロベース〜40キロベースである。Land erおよびWaterman（上記）は、配列決定されるフラグメントの数（すなわち、サ ンプルサイズ）、各フラグメントから得られた配列情報の量、および標的ポリヌ クレオチドが、ギャップがない部分的な配列、すなわち、「アイランド」から再 構築され得る可能性の間の相互関係に関する指針を提供する。本発明において、 所与のサンプルサイズおよびフラグメント配列のサイズで得られ得る最大のポリ ヌクレオチドサイズを以下に示す。 フラグメントは、最小の重複で標的ポリヌクレオチドをカバーするフラグメン トのセットを生成しようとする、いわゆる「直接的」なアプローチ、およびラン ダムに重複するフラグメントが生成される、いわゆる「ショットガン」アプロー チを含む、種々の方法で標的ポリヌクレオチドから生成され得る。好適には、フ ラグメント生成についての「ショットガン」アプローチが、その簡便性および固 有の縮重のために用いられる。例えば、標的ポリヌクレオチドをカバーする、ラ ンダムに重複するフラグメントは、以下の従来の「ショットガン」配列決定プロ トコルで生成される（例えば、Sambrookら（上記）に開示されている）。本明細 書に用いられるような、この文脈での「カバーする(cover)」は、標的ポリヌク レオチド配列のすべての部分が、生成されたフラグメントの各サイズ範囲（例え ば、全てのフラグメントは長さが、100塩基対〜200塩基対の範囲である）で表さ れることを意味する。簡潔には、適切なクローニングベクター（例えば、λファ ージ）における挿入物としての標的ポリヌクレオチドから始まって、ベクターは 拡大され、精製され、そして適切な制限酵素で消化され、約10〜15μgの精製さ れた挿入物を得る。代表的に、プロトコルは、１マイクログラムの開始DNA当た り約500〜1000のサブクローンをもたらす。挿入物は、調製ゲル電気泳動によっ てベクターフラグメントから分離され、従来の方法によってゲルから取り出され 、そしてTE(Tris-EDTA)のような標準的な緩衝液に再懸濁される。ベクターから 挿入物を切り出すために選択される制限酵素は、好適には、挿入物に適合性の粘 着末端を残し、これにより、挿入物が、ランダムに重複するフラグメントを生成 するために、調製において自己連結され得る。Sambrookら（上記）に説明される ように、環状化DNAは、以下に用いられる断片化方法における直鎖状DNAに比べて 、フラグメントのよりよいランダム分配を与える。挿入物を例えば、T4リガーゼ で従来のプロトコルを用いて、自己連結した後、生成された連結挿入物が、標準 的なプロトコル（例えば、Mn⁺⁺の存在下における超音波処理またはDNase I 消化 ）によって断片化される。断片化後、フラグメントの末端が、例えば、Sambrook ら（上記）に記載されるように修復され、そして修復されたフラグメントは、ゲ ル電気泳動を用いて、サイズによって分離される。300〜500塩基対の範囲のフラ グメントが選択され、従来の手段によってゲルから溶出され、上記のように、タ グを有するベクター中に連結され、タグ−フラグメント結合体のライブラリーを 形成する。 上記のように、数千のタグ−フラグメント結合体を含有するサンプルが、ライ ブラリーから採取され、そして拡大され、その後、タグ−フラグメント挿入物が ベクターから切り出され、そして上記のように、微粒子上のタグ相補物への特異 的なハイブリダイゼーションのために調製される。標的ポリヌクレオチドのサイ ズに応じて、多重サンプルが、標識−フラグメントライブラリーから採取され、 別々に拡大され、微粒子上にロードされ、そして配列決定される。選択された二 重の数は、サンプル中に表されたタグレパートリーの画分に依存する（トリプル −−同じタグを有する３つの異なるポリヌクレオチド−−または上記を得る可能 性は、安全に無視し得る）。上記のように、サンプル中のダブルの可能性は、Po isson分布 p(ダブル)＝ m²e^-m/2（ここで、ｍは、サンプル中のタグレパートリ ー画分である）から評価され得る。下の表Ｖは、所与のタグサイズ、サンプルサ イズおよびレパートリーの多様性についてサンプル中でダブルを得る可能性を挙 げている。 いずれの場合においても、次いで、ロードされた微粒子が、好適には、アビジン −ビオチン結合を介して、ガラス顕微鏡スライド上に分散、および固定される。 好適には、それぞれのランダムフラグメントの少なくとも15〜20のヌクレオチド が、単一塩基方法で同時に配列決定される。次いで、標的ポリヌクレオチドの配 列が、それらの重複する部分によって、アセンブリングコンティグに用いられる のと類似の、または上記の引例に開示されたようなハイブリダイゼーションによ り配列決定するために開発されたような、アルゴリズムを用いて、ランダムフラ グメントの部分的な配列を照合することによって再構築される。 本発明の方法を実施するためのキット 本発明は、本発明の種々の実施態様を実施するためのキットを含む。好適には 、本発明のキットは、固相支持体に結合されたタグ相補物のレパートリーを含む 。さらに、本発明のキットは、対応するタグのレパートリー（例えば、ポリヌク レオチドを増幅して分類するためのプライマーとして、またはポリヌクレオチド を増幅して分類するために用いられ得るクローニングベクターの要素として）を 含み得る。好適には、タグ相補物のレパートリーは、微粒子に結合される。キッ トはまた、酵素的プロセシング、検出ケミストリー（例えば、蛍光タグまたは化 学ルミネセンスタグ）などのための適切な緩衝液、使用説明書、プロセシング酵 素（例えば、リガーゼ、ポリメラーゼ、トランスフェラーゼなど）を含み得る。 配列決定のための重要な実施態様において、キットはまた、プロセシングのため にロードされた微粒子を固定するための、アビジン化された顕微鏡スライドのよ うな基板を含み得る。 cDNA ライブラリーにおける新規なポリヌクレオチドの同定 cDNAライブラリーにおける新規なポリヌクレオチドは、上記のように微粒子に 結合されたcDNA分子のライブラリーを構築することによって、同定され得る。次 いで、ライブラリーの大きな画分、またはライブラリー全体でさえ、部分的に並 行 に配列決定され得る。mRNAの単離、およびおそらく、Soaresら、Proc．Natl． Acad．Sci.、91:9228-9232(1994)、または同様の引例によって教示されるように 、その集団の正規化の後、以下のプライマーが、従来のプロトコルを用いて、逆 転写酵素で第１鎖の合成のためのポリＡテールにハイブリダイズされ得る： ここで、[W,W,W,C]₉は、上記のようなタグを表し、「ACCAGCTGATC」は、二本鎖 形態で制限部位を形成する任意の配列であり、そして「プライマー部位」は、PC Rによって目的のポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー結合部位として 後に用いられる、ライブラリーのすべてのメンバーに共通の配列である。 従来の技術による逆転写および第２鎖合成の後、二本鎖フラグメントが、上記 のようにクローニングベクターに挿入され、そして増幅される。次いで、増幅さ れたライブラリーがサンプリングされ、そしてサンプルは増幅する。増幅された サンプルからのクローニングベクターが単離され、そしてタグ化されたcDNAフラ グメントが切り出され、そして精製される。上記のようなポリメラーゼでタグを 一本鎖にした後、フラグメントはメチル化され、そして本発明によって微粒子上 に分類される。好適には、上記のように、クローニングベクターは、タグ化され たcDNAが、分類および微粒子への連結後に好適な単一塩基方法による即座の配列 決定を可能にする、Fok I のようなエンドヌクレアーゼで切り出され得るように 構築される。 次いで、段階的な配列決定が、本発明に従って、ライブラリー全体またはライ ブラリーの１つまたはそれ以上の大きな画分で同時に行われ、ついには、十分な 数のヌクレオチドが、ライブラリーが由来する生物のゲノムに特有の表示のため に各cDNAについて同定される。例えば、もし、ライブラリーが哺乳動物のmRNAに 由来するなら、14〜15ヌクレオチドの長さのランダムに選択された配列が、典型 的な哺乳動物のゲノムの2000〜3000メガベースの間で特有の表示を有すると予想 される。もちろん、細菌または他の下等生物に由来するライブラリーに特有の表 示には、ずっと少ないヌクレオチドの同定で十分である。好適には、少なくとも 20〜30ヌクレオチドが、特有の表示を確実にし、かつ、以下に記載するように、 適切なプライマーの構築を可能にするために同定される。次いで、表にされた配 列は、ユニークなcDNAを同定するために、既知の配列と比較され得る。 次いで、特有のcDNAは、従来の技術（例えば、プライム部位およびその配列が 決定されたcDNAの部分に関するプライマーで製造されたPCRアンプリコンからプ ローブを構築する技術）によって単離される。次いで、プローブは、従来のスク リーニングプロトコルを用いてライブラリー中のcDNAを同定するために用いられ 得る。 実施例Ｉ pUC19 由来の多重標的ポリヌクレオチドの分類 ３つの標的ポリヌクレオチドタグ結合体の混合物を、以下のように得る：まず 、以下の６つのオリゴヌクレオチドを合成し、対として組み合わせ、タグ１、タ グ２およびタグ３を形成する。 ここで、「ｐ」はモノホスフェートを示し、ｗ_iは表Ｉで定義されるサブユニッ トを表し、用語「(^**)」はそれぞれの相補物を表す。pUC19を、Sal IおよびHind IIIで消化し、大きなフラグメントを精製し、そしてタグ１、タグ２およびタグ ３で別々に連結して、それぞれ、pUC19-1、pUC19-2、pUC19-3を形成する。この ３つの組換え体を、別々に増幅し単離し、その後、pUC19-1を、Hind IIIおよびA at Iで消化し、pUC19-2をHind IIIおよびSsp Iで消化し、pUC19-3を、Hind III およびXmn Iで消化する。小さなフラグメントを従来のプロトコルを用いて単離 して、それぞれ、約250、375および575塩基対の長さの３つの二本鎖フラグメン トを得る。それぞれは、タグに隣接する陥没した３'鎖および反対側の末端に は平滑または３'突出鎖を有する。およそ12nmolの各フラグメントを、製造者が 推薦する、33μM デオキシシトシントリホスフェートを含有する反応緩衝液中で 、５ユニットのT4 DNAポリメラーゼと混合する。反応混合物を37℃で30分間イン キュベートし、その後、氷の上に置くことによって反応を止める。次いで、フラ グメントを、従来の手段で精製する。 CPG微粒子(粒子サイズ37〜74mm、孔サイズ500オングストローム、Pierce Chem ical)を、MaskosおよびSouthen、Nucleic Acids Research、20:1679-1684(1992) によって開示されたリンカーで誘導体化する。３つのアリコートに分離後、タグ １、タグ２およびタグ３の相補物を、従来の自動化されたDNA合成機（例えば、m odel 392 DNA合成機(Applied Biosystems，Foster City、CA)）を用いて、微粒 子上で合成する。異なって誘導体化された微粒子のそれぞれ約１mgを、別個の容 器に入れる。 pUC19-1、pUC19-2およびpUC19-3から切り出されたT4 DNAポリメラーゼ処理の フラグメントを、製造者推薦のTaq DNAリガーゼ(New England Biolabs)のための 緩衝液50μLに再懸濁する。次いで、混合物を、誘導体化CPG微粒子をそれぞれ１ mg含有している３つの容器に等分する。５ユニットのTaq DNAリガーゼを各容器 に添加し、その後、それらを55℃で15分間インキュベートする。氷の上に置くこ とによって反応を止め、そして微粒子を、繰り返し遠心分離およびTEに再懸濁す ることによって数回洗浄する。最後に、微粒子をNde I反応緩衝液(New England Biolabs)で再懸濁し、結合したポリヌクレオチドを消化する。微粒子からの分離 後、Nde I消化によって放出されたポリヌクレオチドフラグメントを、Sequenase DNAポリメラーゼおよびフルオレセイン標識チミジントリホスフェート(Applied Biosystems、Foster City、CA)でインキュベートすることにより、蛍光標識す る。次いで、そのフラグメントを、Applied Biosystems model 373 DNA配列決定 機を用いて、非変性ポリアクリルアミドゲル上で別々に分析する。 実施例 II SV40 フラグメントの並行配列決定 表Ｉから選択される９つの4-ヌクレオチドサブユニットからなる36マーのタグ のレパートリーを、上記のような、分裂または混合手段によって、タグおよびタ グ相補物を別々に合成することによって調製する。Sma I/Hind III消化M13mp19 に連結可能なように、レパートリーを合成する。従って、実施例Ｉと同様に、１ 組のオリゴヌクレオチドはＡの添加で開始し、９回の分裂および混合合成が続く 。このオリゴヌクレオチドを、表Ｉのサブユニットに対応して３'-ホスホルアミ ダイト誘導体化４マーによりサブユニットで伸張する。次いで、Sma I認識部位 （GGG）の半分、２つのＣおよび５'-モノホスフェートを、例えば、Clontech La boratories(Palo Alto，CA)から入手可能であるPhosphate-ON試薬を用いて、ヌ クレオチド毎に添加することで合成を完了する。他方の組のオリゴヌクレオチド は、３つのＣ(Sma I認識部位の一部)および２つのＧの添加で開始し、９回の分 裂および混合合成が続く。このオリゴヌクレオチドを、表Ｉのサブユニットの相 補物に対応して、３'-ホスホルアミダイト誘導体化４マーにより伸張する。Hind III認識部位および５'-モノホスフェートのヌクレオチド毎の添加により合成を 完了する。合成支持体からの分離後、オリゴヌクレオチドを以下の二重鎖の形成 を可能にする条件下で混合する： 次いで、二重鎖の混合物をSma I/Hind III消化M13mp19に連結する。タグ相補物 のレパートリーを上記のようにCPG微粒子上で合成する。 次に、Fok I部位ならびにEco RIおよびSma I部位の一部を含有する、以下のア ダプターを調製する： このアダプターを、上記のように、Eco RI/Sma I消化M13に連結する。 別に、Sambrookら（上記）に記載のプロトコルに従って超音波処理により、SV 40 DNAを断片化する。得られたフラグメントを標準的なプロトコルを用いて修復 し、そしてサイズによって分離する。300〜500塩基対の範囲のフラグメントを選 択し、上記のSma I消化M13に連結してフラグメント−タグ結合体のライブラリー を形成し、次いで、増幅する。数千の異なるフラグメント−結合体を含有するサ ンプルをライブラリーから取り出し、さらに増幅し、そしてフラグメント−タグ 挿入物を、Eco R およびHind IIIで消化することにより切り出す。切り出された フラグメント−タグ結合体を、実施例Ｉに記載のように、デオキシシチジントリ ホスフェートの存在下でT4 DNAポリメラーゼで処理して、特異的なハイブリダイ ゼーションのためのオリゴヌクレオチドタグをCPG微粒子に曝露する。 実施例Ｉに記載のように、ハイブリダイゼーションおよび連結後、ロードされ た微粒子をFok Iで処理して、予め決定した配列の4-ヌクレオチド突出鎖を生成 する。以下のプローブの10:1の混合物（プローブ１：プローブ２）を微粒子上の ポリヌクレオチドに連結する。 FAMは、Appiled Biosystems から入手可能なアミノホスフェートリンカー(Amino linker)を介してプローブ１の上段の鎖の５'-水酸基に結合されるフルオレセイ ンを表す。ビオチンはまた、Aminolinker部分を介して結合され得、そして必要 に応じて、ポリエチレンオキシドリンカー（例えば、Jaschkeら（上記））を介 してさらに伸張され得る。 次いで、ロードされた微粒子をアビジン化ガラススライドの表面上に堆積する 。試薬および洗浄溶液は表面上へ送達および表面上から除去され得る。結合した 微粒子を有するアビジン化スライドにより、走査型蛍光顕微鏡（例えば、Newpor t Model PM500-Cモーションコントローラー、488nmの励起光を発生するSpectra- Physics Model 2020アルゴンイオンレーザー、および520nm波長域発光フィルタ ーなどの装置を備えたZeiss Axioskop）で検査する。励起光および蛍光発光を、 同じ対物レンズを通して、それぞれ、送達および収集する。二色性ミラーによっ て 励起光および収集蛍光を分離する。二色性ミラーは、収集された蛍光を一連の帯 域フィルターを介して、モニターされている蛍光物質に対応するフォトン計数デ バイス（例えば、Hamamatsu model 9403-02光電子増倍管、Stanford Research S ystems model SR445増幅器およびmodel SR430多重チャンネルスケーラーおよび デジタルコンピューター（例えば、486-ベースのコンピューター）を備える）へ 指向する。コンピューターは、微粒子の位置を記録するスライドの二次元マップ を生成する。 最初のプローブを除去するためのFok Iでの切断後、結合微粒子上のポリヌク レオチドを、以下に記載の好適な単一塩基配列決定方法に従い、プローブ連結、 洗浄、検出、切断および洗浄工程を20サイクル行う。各検出工程において、走査 システムが、各微粒子で同定された塩基に対応する蛍光発光を記録する。一般に 、以下の反応および洗浄を、特に記載されない限り、用いる酵素のための、製造 者（New England Biolabs）の推薦する緩衝液で実施する。標準的な緩衝液もま た、Sambrookら（上記）に記載されている。 以下の４組の混合プローブを、標的ポリヌクレオチドへの添加用に提供する： ここで、TAMRA、FAM、ROXおよびJOEは、Aminolinker IIによって結合された分光 解像可能な蛍光標識である（すべて、Applied Biosystems、Inc.、Forster City 、Californiaから入手可能である）；太字のヌクレオチドは、Fok Iエンドヌク レアーゼのための認識部位であり、「N」は、４つのヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｇ 、Ｔ.のいずれか１つを表す。TAMRA（テトラメチルローダミン）、FAM（フルオ レセイン）、ROX（ローダミンＸ）、およびJOE（2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジク ロロフルオレセイン）およびそれらのオリゴヌクレオチドへの結合はまた、Fung ら 米国特許第4,855,225号に記載されている。 上記のプローブを、約５モル過剰量の標的ポリヌクレオチド末端中で、以下の ようにインキュベートする：プローブを、200ユニットのT4 DNAリガーゼおよび アンカー化標的ポリヌクレオチドとともに60分間16℃でT4 DNAリガーゼ緩衝液中 でインキュベートする：次いで、洗浄後、標的ポリヌクレオチドを、100ユニッ トのT4ポリヌクレオチドキナーゼとともに30分間37℃で製造者の推薦する緩衝液 中でインキュベートし、洗浄し、そして再度、200ユニットのT4 DNAリガーゼお よびアンカー化標的ポリヌクレオチドとともに30分間16℃でT4 DNAリガーゼ緩衝 液中でインキュベートする。洗浄は、スライド上に洗浄緩衝液（例えば、TE）を 大量に連続的に流すことによって達成される（Sambrookら（上記）に開示されて いる）。連結−リン酸化−連結のサイクルおよび最後の洗浄後、結合微粒子が、 蛍光標識の存在について走査され、その位置および特徴が走査システムによって 記録される。次いで、標識された標的ポリヌクレオチド、即ち、連結複合体を、 製造者の推薦する緩衝液中で30分間37℃で、10ユニットのFor Iとともにインキ ュベートし、その後、TE中で洗浄する。その結果、標的ポリヌクレオチドは各鎖 上で１つのヌクレオチド分短くされ、次の連結および切断サイクルのために準備 される。20のヌクレオチドが同定されるまでこのプロセスを続ける。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＳＧ 【要約の続き】 ムでは、多くの標的ポリヌクレオチドまたは単一標的ポ リヌクレオチドの多くのセグメントが、同時に配列決定 される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.１つまたはそれ以上の固相支持体上で分子集団から分子を分類する方法であ って、該方法は、以下の工程： (a)タグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグを、分子集団中の各分 子に結合する工程であって、該工程は、(i)該集団中の実質的にすべての異なる 分子または異なる亜集団分子が、異なるオリゴヌクレオチドタグを結合している ように、そして(ii)該レパートリー由来の各オリゴヌクレオチドタグが複数のサ ブユニットを包含し、そして該複数のサブユニットのそれぞれが３から６のヌク レオチドまたは３から６の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、 該サブユニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるよう に行われる工程；および (b)該オリゴヌクレオチドタグとそれぞれの相補物とを特異的にハイブリダイ ズすることにより該集団から該分子を分類する工程であって、該相補物のそれぞ れが、空間的に離れている領域において均一な集団として、１つまたはそれ以上 の固相支持体に結合される工程、 を包含する、方法。 ２.前記分子がポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。 ３.前記の１つまたはそれ以上の固相支持体が微粒子である、請求項２に記載の 方法。 ４.前記オリゴヌクレオチドタグおよび前記相補物が一本鎖オリゴヌクレオチド である、請求項３に記載の方法。 ５.前記のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの亜集団が50から5000のヌ クレオチドの範囲の長さを有する、請求項４に記載の方法。 ６.前記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズ、グリシダルメタクリレート微粒 子およびポリスチレン微粒子からなる群から選択される、請求項４に記載の方法 。 ７.前記微粒子の直径が１から100μmの間である、請求項６に記載の方法。 ８.前記固相支持体が、前記相補物の均一な集団を結合している複数の空間的に 離れた表面領域を有する平面基板である、請求項３に記載の方法。 ９.異なる前記の複数の空間的に離れた表面領域が、異なる前記相補物の均一な 集団を有する、請求項８に記載の方法。 １０.前記平面基板が、ガラス、シリコンおよびプラスチックからなる群から選 択される、請求項９に記載の方法。 １１.標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方 法は、以下の工程： 該標的ポリヌクレオチドから、該標的ポリヌクレオチドをカバーする複数のフ ラグメントを生成する工程； タグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグを、該複数のフラグメント のそれぞれに結合する工程であって、該工程は、(i)実質的にすべての異なるフ ラグメントが異なるオリゴヌクレオチドタグを結合しているように、そして、(i i)該レパートリー由来の各オリゴヌクレオチドタグが複数のサブユニットを包含 し、そして該複数のサブユニットのそれぞれが３から６のヌクレオチドまたは３ から６の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、該サブユニットが 最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるように行われる工程； 該オリゴヌクレオチドタグとそれぞれの相補物とを特異的にハイブリダイズす ることにより該フラグメントを分類する工程であって、該相補物のそれぞれが、 空間的に離れている領域において均一な集団として、１つまたはそれ以上の固相 支持体に結合される工程； 該複数のフラグメントのそれぞれの部分のヌクレオチド配列を決定する工程； および 該フラグメントの配列を対照することにより、該標的ポリヌクレオチドの該ヌ クレオチド配列を決定する工程、 を包含する、方法。 １２.前記オリゴヌクレオチドタグおよび前記相補物が一本鎖オリゴヌクレオチ ドである、請求項１１に記載の方法。 １３.前記生成工程が前記標的ポリヌクレオチドのランダムに重複するフラグメ ントを生成する、請求項１２に記載の方法。 １４.前記フラグメントの前記ヌクレオチド配列を決定する前記工程が、単一塩 基配列決定方法により、前記の複数のフラグメントについて同時に行われる、請 求項１３に記載の方法。 １５.前記フラグメントのそれぞれの前記部分が１２から５０のヌクレオチドを 含む、請求項１４に記載の方法。 １６.前記フラグメントのそれぞれの前記部分が１２から２５のヌクレオチドを 含む、請求項１５に記載の方法。 １７.前記標的ポリヌクレオチドが１から５０キロベースの間の長さである、請 求項１６に記載の方法。 １８.前記固相支持体が、前記相補物の均一な集団をそれぞれ結合している複数 の微粒子である、請求項１１に記載の方法。 １９.前記分類工程後、前記の複数の微粒子が平面基板に固定される、請求項１ ８に記載の方法。 ２０.前記の複数の微粒子が、１平方センチメートル当たり約1000微粒子から約1 00,000微粒子の間の密度で、前記平面基板の表面にランダムに配置される、請求 項１９に記載の方法。 ２１.物質の組成物であって、該組成物は： １つまたはそれ以上の空間的に離れた領域を有する固相支持体；および 該１つまたはそれ以上の空間的に離れた領域の少なくとも１つにおいて該固相 支持体に共有結合されたオリゴヌクレオチドタグ相補物の均一な集団であって、 該オリゴヌクレオチドタグ相補物は複数のサブユニットを含み、各サブユニット は３から６のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、そして 各サブユニットは最少の交差ハイブリダイズしているセットから選択される、オ リゴヌクレオチドタグ相補物の均一な集団、 を含む物質の組成物。 ２２.前記の複数のサブユニットが４から１０の範囲である、請求項２１に記載 の物質の組成物。 ２３.前記固相支持体が単一の空間的に離れた領域を有する微粒子である、請求 項２２に記載の物質の組成物。 ２４.前記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズおよびポリスチレン微粒子から なる群から選択される、請求項２３に記載の物質の組成物。 ２５.ポリヌクレオチド集団を分類する方法であって、該方法は、以下の工程： オリゴヌクレオチドタグを、該集団の各ポリヌクレオチドに結合させる工程で あって、該工程は、(i)実質的にすべての異なるポリヌクレオチドが、異なるオ リゴヌクレオチドタグを結合しているように、そして(ii)各オリゴヌクレオチド タグは複数のサブユニットを包含し、そして該複数のサブユニットのそれぞれが ３から６のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドからなり、該サブユ ニットが最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるように行われ る工程； 該オリゴヌクレオチドタグとそれぞれの相補物とを特異的にハイブリダイズす ることにより該ポリヌクレオチドを分類する工程であって、該相補物のそれぞれ が、空間的に離れている領域に均一な集団として、１つまたはそれ以上の固相支 持体に結合される工程； 該分類されたポリヌクレオチドのそれぞれの部分のヌクレオチド配列を決定す る工程；および 該ポリヌクレオチドの配列の部分の頻度分布により該ポリヌクレオチド集団を 分類する工程、 を包含する、方法。 ２６.前記固相支持体が微粒子であり、そして前記相補物の均一な集団が各該微 粒子に結合される、請求項２５に記載の方法。 ２７.前記ポリヌクレオチドの集団がcDNAライブラリーである、請求項２６に記 載の方法。 ２８.前記ポリヌクレオチドの前記部分が１２から５０のヌクレオチドの範囲で ある、請求項２７に記載の方法。 ２９.前記ポリヌクレオチドの前記部分が１２から２５のヌクレオチドの範囲で ある、請求項２８に記載の方法。 ３０.オリゴヌクレオチドタグのレパートリーであって、該レパートリーは、以 下の形態のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、レパートリー： ここで、Ｓ₁からＳ_nのそれぞれは、３から６のヌクレオチドの長さを有し、そし て最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるオリゴヌクレオチド からなるサブユニットであり；そして ｎは４から１０の範囲である、レパート リー。 ３１.前記サブユニットが４から５のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレ オチドからなり、そして前記ｎが６から９の範囲である、請求項３０に記載のレ パートリー。 ３２.オリゴヌクレオチドタグをポリヌクレオチドへ結合させるためのクローニ ングベクターのレパートリーであって、該レパートリーは、以下の形態の二本鎖 要素を有する、レパートリー： ここで、Ｓ₁からＳ_nのそれぞれは、３から６のヌクレオチドの長さを有し、そし て最少に交差ハイブリダイズしているセットから選択されるオリゴヌクレオチド からなるサブユニットであり；そして ｎは４から１０の範囲である、レパートリー。 ３３.前記二本鎖要素が、前記ポリヌクレオチドを前記クローニングベクターに 挿入するための１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むポ リリンカー領域に隣接する、請求項３２に記載のレパートリー。 ３４.ポリヌクレオチド混合物を分類する方法であって、該方法は、以下の工 程： ポリヌクレオチド混合物を含有する溶液を提供する工程であって、該混合物の 各ポリヌクレオチドはタグのレパートリー由来のオリゴヌクレオチドタグを結合 され、該レパートリー由来の各オリゴヌクレオチドタグは複数のサブユニットを 含み、該複数のサブユニットのそれぞれが３から６のヌクレオチドの長さを有す るオリゴヌクレオチドからなり、該サブユニットが最少に交差ハイブリダイズし ているセットから選択される工程； 該ポリヌクレオチド混合物をサンプリングしてポリヌクレオチドの亜集団を形 成させる工程であって、ここで異なる配列の実質的にすべてのポリヌクレオチド は異なるオリゴヌクレオチドタグを結合している；および 該オリゴヌクレオチドタグとそれぞれの相補物との間に完全に一致した二重鎖 の形成を促進する条件下で、該亜集団と該オリゴヌクレオチドタグの相補物を結 合している１つまたはそれ以上の固相支持体とを接触させる工程、 を包含する、方法。 ３５.前記固相支持体が、前記相補物の均一な集団を結合している微粒子である 、請求項３４に記載の方法。 ３６.前記オリゴヌクレオチドタグおよび前記相補物が一本鎖オリゴヌクレオチ ドである、請求項３５に記載の方法。 ３７.前記ポリヌクレオチドが50から5000のヌクレオチドの範囲の長さを有する 、請求項３６に記載の方法。 ３８.前記微粒子が、ガラス微粒子、磁気ビーズ、グリシダルメタクリレート微 粒子およびポリスチレン微粒子からなる群から選択される、請求項３７に記載の 方法。 ３９.前記固相支持体が、前記相補物の均一な集団を結合している複数の空間的 に離れた表面領域を有する平面基板である、請求項３８に記載の方法。 ４０.前記の異なる複数の空間的に離れた表面領域が、異なる前記相補物の均一 な集団を有する、請求項３９に記載の方法。