CZ9602009A3 - Proteins v within a region of antigenic receptor of t cells and processes for preparing thereof - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se obecně týká oblasti imunologie a medicíny a týká se plně rekombinantních proteinů V oblasti receptoru T buněk (TCR), expresních vektorů pro produkci komerčně využitelného množství rekombinantních proteinů V regionu antigenního receptoru T buněk a metod užití plně rekombinantních proteinů V regionu antigenního receptoru T buněk k diagnose a léčbě chorob nebo poruch imunitního systému.

Dosavadní stav techniky

1.ANTIGENNÍ RECEPTOR T BUNĚK

Imunitní odpověd na cizorodé antigeny je rozdělena do protilátkové odpovědi, zprostředkované B buňkami a buněčné imunity, zprostředkované T buňkami. Receptorové molekuly užívané B buňkami k rozpoznání antigenu jsou imunoglobuliny.které rozpoznávají konformační epitopy na globulárních proteinech. Antigení receptory na T buňkách mají vztah k imunoglobulinúm, ale váží zpracovanou antigenní molekulu v asociaci s molekulami hlavního histokompatibilního systému (MHC) (Dembic et al.,1986,Imunol.Today,7:308) .

TCR geny,stejně jako imunoglobulinové geny,sestávají z kódujících regionú(nebo genových segmentů),které se přeskupují během vývoje T buňky (Chien et al.,1984,Nátuře,312:31-35,Hedrick et al.,1984,Nátuře,308:

149-153.Yanagi et al.,1984,Nátuře,308:145-149). Lokus lidského ^řetězce receptorů T buněk byl rozsáhle studován od klonování první cDNA kódující =j řetězec (Yanagi,Y.et al.1984, Nátuře, 308:145-149, Hedrick et al.1184, Nátuře, 308:149-152 , Siu et al1984,Cel 1,37: 393-401) . Tento lokus je komplex genů obsahující oblasti kódující známé regiony nebo domény ^řetězce: variabilní (V), diversity(D),a joining (J) domény. Tyto kódující regiony se v somatických buňkách účastní na přestavbě spolu s oblastmi kódujícími konstantní (C) doménu (Chien et al.,1984,

Nátuře,309:322-326). In šitu studie identifikovaly umístění TCR^i lokusu na chromosomu 7 v 7q35 (Isobe et al.,

1985,Science,228:580).Podle novějších hodnocení se tento komplex rozkládá na více než 600kb a obsahuje 70-80 segmentů regionu (Concannon et al.,1986 , Proč.Nat1.Acad Sci.

USA,83:6598-6602,Ti 11inghas et al1986,Science,

223:879-883, Kimura et al1987,Eur.J.Immunol17:375-383,Lai et al, 1988, Nátuře,331:543-546). Tyto genové segmenty V regionu sousedí se dvěma tandemově organisovanými regiony,z nichž každý zahrnuje D a C genový segment následovaný nakupením šesti nebo sedmi genovými segmenty J regionu (Tunnacliffe et al,1985,Nucleic Acid res.,13:

6651-6661, Toyonaga et al.,1985,Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,92: 8624-8628).Po úspěšné přestavbě V,D a J kódujících regionú(genových segmentů) se translatovaný polypeptid ^řetězce páruje s TCR a řetězcem a může být exprivován na povrchu T buněk (zmíněno Kronenbergem at al.,1986,Ann.Rev.Immuno1.,4:529-591).

TCR a a δ lokus jsou vedle na chromosomu 14. TCR δ kódující regiony jsou úplně uvnitř a genového lokusu (Satyanarayna et al.,1988, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 85:

8166-8170,Chien et al.,1987,Nátuře,330: 722-727, Elliot et al.,1988, Nátuře,1985,331:627-631). Odhaduje se, že je minimálně 45 - 50 Va kódujících regionů (Becker et al.,1985, Nátuře, 317:430-434), zatímco je pouze přibližně 10 Vó kódujících regionů (Chien et al,1987,supra).V periferní krvi se jeví být dva VÓ kódující regiony predominantně exprivovány, jmenovitě Vó 1 a Vó 2.

Gama TCR gen byl prvně identifikován u myší (Saito et al, Nátuře,309: 757-762,Kranz et al.,1985,

Nátuře,313,762-755,Hayday et al.,1985, Cel 1,40:259-269) a poté u lidí (Lefranc et al., 1985,Nátuře,316: 464-466,Murre et al,1985, Nátuře, 316:549-552).Lidský gama TCR lokus se patrně sestává z 5 až deseti V,pěti J a dvou C kódujících regionů (Dialynas et al.,1986, Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,83:2619) .

TCR diversita a tak specifita T buněk,je odvozena z několika pramenů (Barth et al,1985, Nátuře,316:

517-523,Fink et al,1986, Nátuře, 321:219-225):multiplicity genových segmentů germinativních linií (Chien et al.,1984,Nátuře,309:322-326, Malissen et al,1984,Cel1,37:

1101-1110.Gascoigne et al.1984,Nátuře, 310:387-391,Kavaler et al., 1984,Nátuře,310:421-423,Siu et a 1,1984,Nátuře,31 1:344-349,Pattern et al.,1984,Nature,312:40-46),kombi natoriálni diversitou způsobenou nahromaděním různých V, D a J kódujících regionů (Siu et al,1984,Cell 37:393-401,Goverman et al,1985,Cell,40:859-867),a junkční flexibi1itou,diversitou N regionu a užitím bud hromadných D regionů nebo kteréhokoliv ze tří translačních čtecích rámečků pro ϋβ segmenty.TCR diversita patrně nepramení z mechanismu somatické hypermutace pozorované pro imunoglobuliny (Barth et al, supra.)Výsledkem tohoto mechanismu je , že TCR jsou generovány s odlišnostmi v jejich amino-terminálních nebo N-terminálních doménách ( t.j.jsou konstruovány z kombinací V,D a J kódujících regionů),ale jinde se shodují, zahrnujíc v to jejich karboxy - terminální nebo C-terminálnl domény (které tvoří konstantní regiony TCR). V souladu s tím je generován extremně široký repertoár TCR molekul.

Studie struktury a diversity variabilních kódujících regionů lidských TCR ^3 řetězců vedly k rozdělení těchto kódujících regionů do odlišných podrodin V regionu (Tillinghast et al.1986, Science,223: 879-883, Concannon et al

1986, Proč.Nat1.Acad.Sci.USA 83:6598-6602, Boerst et al.,1987, J.Immunol,139:1952-1959). Každá z podrodin V regionu může být charakterisována shodou sekvencí a obsahuje podobné kódující regiony vykazujíc tak větší než 75% podobnost v DNA sekvenci. Například,šestnáct myších V sekvencí bylo kategorizováno do čtrnácti odlišných podrodin ustanovenou , ale jednoduchou numerickou nomenklaturou pro genové segmenty (viz Barth et al,1985, The Murine T Cell receptor Employs a limited repertoire of expressed gene segments, Nátuře,316:517-523). V souladu s touto nomenklaturou členové podrodiny sdílí první číslici a liší se v druhé,proto

V|$8.1, Vjj?8.2 a V$8.3 jsou členy V$8 podrodiny. Podobný systém byl navržen pro lidské kódující regiony. U lidí bylo přibližně 60 V$ kódujících regionů rozděleno do alespoň 24 rodin. (Toyonaga a Mak, 1988, Ann.Pav.Immunol. 5:585,Wilson et al.,1988,Immunol.Rev.,101:149,a

Robinson.M.A.,1991,J.Imrouno1.,146:4392).

2. T BURKY V AUTOIMUNITě

T buňky hrají osovou roli v diferenciaci a regulaci efektorových mechanismů v imunitním systému (Paul et al,

1987, Science,195: 1293-1300). Společné rozpoznávání antigenu a molekul hlavního histokompatibilního systému musí být specifické a precisně regulované, protože nevhodná imunitní odpověčf vede k autoimunitě. Několik laboratoři studovalo choroby, ve kterých se jeví být nevhodná imunitní odpověčf, jako je autoimunita a některé formy imunodef iciencí ,a určovalo roli T buněk v patogenesi takovýchto chorob.

Některé nežádoucí imunitní odpovědi jsou charakterisovány klonálni nebo oligoklonální expansí zvláštní TCR komposice jako například při malignitách,které vedou k T - buněčným leukémiím nebo lymfomúm.(viz, např.Jack et al., 1990, Am.J.Pathol.,136:17, Nitta et al., 1990 ,

Science,249:672,a Yoshino et al.1991,Int.J.Cancer,47:654). V T buněčných leukémiích a lymfomech hraje TCR roli jako unikátní nádorový markér,protože je stabilně přestavován a presentován na povrchu buněk. Zvláštní TCR komposice je také naznačena u orgánových štěpů,jejichž T lymfocyty mají TCR reaktivní s MHC antigeny jednotlivých dárců,například dárců kostní dřeně.

Několik skupin popsalo selektivní expresi TCR V regionu v jistých autoimunitnich situacích. Například Grunvald et al. zmínil přednostní expresi V α 2.3 genového produktu na CD 4+ buňkách z bronchoalveolární laváže ve srovnání s lymfocyty z periferní krve u pacientů se sarkoidosou (Grunvald et al,1992, Eur.J.Immunol.,22: 129). U Kawasakiho choroby byla zmíněna přednostní expanse V^2 a V^8 T buněk v počátku nemoci (Abe J.,et al.,1992, Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,89:4066)

Revmatoidní artritis (RA) byla široce studována z těchto hledisek.Někteří výzkumníci zmínili přednostnou expansi jistých podskupin T buněk ,t.j. DerSimonian et al.,1993,J.Exp.Med.,177:1623 (preferenční expanse T buněk nesoucích V alfa 12.1 v CD8+ T lymfocytech periferní krve),Stamenkovic et al.,1988, Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,85:1179 (T buňky infiltrující synoviální membránu kultivované IL2 byly oligoklonální při Southern blot analýze), Paliard et al,1991.Science,253:325 (hypotesa.že superantigenem aktivované V,J14 T buňky, včetně autoreaktivních T buněk,expandují klonálně a migrují do synoviální tekutiny RA pacientů), Howell et al.,1991 , Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 88:10921 (zmiňuje užití jednotlivých genů V$3,14,al7 V regionu T buněk v IL 2R+ buňkách ze synoviální tekutiny RA pacientů).Uematsu et al,1991, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88:8534 (užití oligoklonální geny V oblasti T buněk v T buňkách synoviální tekutiny jednotlivých RA individuí).Mezinárodní Patentová Publikace WO 90/06758 ( implikace νβ3,9 a 10 u RA).

Zánětlivé střevní choroby byly také široce studovány.Několik skupin zmínilo expansi populace T buněk nebo preferenční užití genu V regionu TCR t.j. Posnett et al.1990,

J.Clin.Irívest,85:1770, Spencer et al.,1991,

J.Clin.Patho1.,44:915, Treidosiewitz et al.,1991,

Clin.Exp.Immuno1.84: 440, Van Kerckhove et al.,1992,J.Exp.Med.,175: 57. Jiní popsali preferenční využití TCR V genu u Mycobacterium leprae (van Shooten et al.,1992 Proč.Nati.Acad.Sci.USA 89:11244, Wang et al.,1993,

Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 90:188.

Roztroušená sklerosa (MS) je autoimunitní onemocnění charakterisované infiltrací centrálního nervového systému mononukleáry a demyelinizací.Ačkoliv je patogenese MS neznámá,při vzniku choroby se uplatňují jak vlivy genetické tak vlivy prostředí. Hlavní složky genetické predisposice zahrnují asociaci choroby s jednotlivými haplotypy třídy II hlavního histokompatibilniho komplexu (MHC) (Terasaid et al.,1976,Science, 1933:1245-1247,,Ho et al.,1982,

Imunnogenetics, 15:509-517, Spielman et al.,1982,Epidemial.Rev.,4: 45-65,Francis et al.,1986, Lancet,1:211, Elian et al.,1987, Disease

Markers,5:89-99,Urban et al.,1988,Cell, 54: 577-592,Vandebark et al., 1989, Nátuře,341:541-544, Howell et al.,1989,

Science, 246:668-670).

Bylo ukázáno, že T buňky isolované z cerebrospinálního moku pacientů trpících MS využívají omezenou sadu genů V regionu TCR. Demonstrace in vivo aktivovaných T buněk specifických k myeli basickému proteinu (MBP) implikovala MBP reaktivní MBP reaktivní T buňky v patogenesi onemocnění (Wucherpfenig.K.W.et al.,1990, Science, 248: 1016-1019) .Studie s využitím amplifikace cDNA polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) s TCR νβ primery ukázala, že MBP reaktivní T buněčné linie využívají pouze omezené množství Vp kódujících regionů (Wucherpfennig.K.W.,et al., 1990,supra (Vpl7 a v menším rozsahu Vpl2 jsou často využívané k rozpoznání imunodominantního regionu lidského autoantigenu MBP).Oksenberg J.R., et al., Nátuře, 362:68-70 (přestavba V{35.2 a/nebo Vp5.3 genů byla detekována v mozcích pacientů s jistým HLA fenotypem),Kotzin,B.L., 1991, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88:9161-9165 (přednostní užití $ řetězců variabilního regionu 5.2/5.3 a menším rozsahu Vfó 6.1 pozorované mezi MBP specifickými klony od pacientů s MS). Výsledky některých studií také naznačují, že je omezená exprese genů TCR Va v MS mozkových lézích (Oksenberg J.R. et al., 1990,

Nátuře,345:344-346).

3.PŘÍSTUPY K TERAPII ZPROSTŘEDKOVANÉ T BURKAMI

V minulosti byly snahy selektivně ovlivnit T buněčnou populaci jednotlivce zaměřeny na vakcinaci celými živými nebo atenuovanými T lymfoeyty (pro přehled tohoto přístupu viz Cohen,I.R.,1986, Immunol.Rev.,94:5-21) ,nebo s peptidovou vakcinou založenou na selekci specifické části peptidu TCR V regionu. Tyto přístupy byly založeny na novém zjištění, že potenciálně patogenní T buňky preferenčně užívají limitovanou sadu V kódujících regionů. Přístup vyvinutý Cohenem užívá živé nebo atenuované T buňky jako vakcinu k léčbě nebo prevenci,inter alia, experimentální autoimunitní encephalomyelitidy (EAE). Nicméně,tento přístup je omezen závislostí na isolaci klonů pro onemocnění specifických T buněk: je nezbytné léčit každého pacienta jeho vlastními expandovanými buňkami, jak vyžaduje šitá na míru nebo individuální terapie.(viz. Zhang, et al.,1993,Science,261:1451)

Jiní předpokládali terapeutické užití TCR peptidů založených na využití TCR V regionu ( Offner Η.,1991.Science,251:430( léčba peptidy založenými na TCR νβ8 aminokyselinových sekvencích redukovala vážnost choroby a akcelerovala zotavení u krys Lewis),Hashim,G.A.,et al,1992,

J.Immunol.,149:2803-2809,Ofner .H.et al.,1992,J.Immuno1.,

148: 1706-1711,Offner H.et al.,1991,J.Immunol.,146:4165-417,ale viz.Sun,

D. , 1992,Cel 1.Immunol.,141:200-210).Tyto peptidy jsou všeobecně krátké peptidy,obvykle mezi 8-25 aminokyselinami délky, a výjmečně délky větší než 30 aminokyselin.Například 21 aminokyselinový peptid přítomný na TCR řetězci asociovaný s EAE byl užit k prevenci EAE u krys Lewis ( Vandenbark A.A. et al.,1989, Nátuře,341:541-544,Vandenbark A.A.,International Patent Publication WO 91/01133, viz také

Janeway, C.A.1989, Nátuře,341: 482-483). Jiní popsali, že ještě kratší peptidy o 8-11 aminokyselinách, korespondující s částí β řetězce VDJ regionu nebo J alfa regionu se ukazují být efektivní jako vakciny pro bud prevenci nebo redukci vážnosti EAE na krysím modelu (Howel.M.D., et al,1989,

Science,246:668-671, Howel.M.D.et al., Mezinárodní patentová publikacee WO 92/12996).

Peptidy odvozené od TCR proteinů byly obecně vybrány jako kandidáti pro autoimunitní terapeutika vzhledem ke snadné peptidové syntese a vzhledem k tomu, že žádná z metod nebyla dříve vhodná pro produkci delších proteinů TCR V regionu v dostatečném množství a se signifikantní biologickou aktivitou. Ještě důležitější je to, že hlavní nedostatek malých syntetických peptidů je ten, že jejich užití vyžaduje předpovězení jednotlivé sekvence, která bude efektivní v modulování imunitní odpovědi. Určení musí být provedeno jako antigenní a imunogenní vlastnosti navrženého peptidů, jako například výskyt v hypervariabilním nebo komplementaritu určujícím regionu(CDR) V regionu. Navíc, velikost navrhovaných peptidů odvozených z jednotlivých TCR musí počítat s udržením správné epitopové struktury k navození aktivity

T supresorových buněk nebo k navození uvolnění protilátek namířených proti subpopulaci T buněk nesoucí jednotlivý TCR (se kterým peptid koresponduje). Peptidy takových vlastností vyžadují značný čas a výzkum, a mnoha případech zamýšlené terapie u lidí nemohou být nezbytné experimenty provedeny z humáních nebo etických důvodů.

Navíc, aby se získala specifická antigenní odpověd prostřednictvím regulačních T buněk musí být peptid navázán na MHC molekuly jednotlivce. MHC antigeny přítomné na povrchu buněk mají polymorfní regiony ve kterých jsou specifické alely asociovány s jednotlivými individui. Navíc,jednot1ivci budou mít dva haplotypy, což znamená, že zde budou dvě odlišné alely jednotlivého MHC antigenu pro stejný lokus. Ne všechny peptidy mají kapacitu pro vazbu na MHC antigeny, a ani všechny MHC antigeny se neváží na jednotlivé peptidy, protože existuje množství MHC antigenů pro každý haplotyp. Proto vhodnost takového peptidového přístupu k T buňkami zprostředkované terapii musí být determinována k haplotypu každého jednotlivce, vyžadujíc tak vytvoření peptidů pro jednotlivé pacienty.

4.PRODUKCE SOLUBILNÍCH ANTIGENNÍCH RECEPTORů T BUREK

Produkce většího množství solubilních TCR proteinů rekombinantní technikou byly problematické z několika důvodů.Hlavní překážkou při produkci solubilního antigenního receptoru T buněk je sekrece v nepřítomnosti transmembránového regionu (Traunecker A. et al., 1986, Immunol.

Today,10:29-32). Jeden výzkumník byl schopen ukázat sekreci celé délky monomerního β řetězce myšího TCR včetně V,

D a J regionu následovanou zkrácenou formou 0β regionu. Metodika využívala výhody homologie mezi karboxylovým koncem lehkého řetězce imunoglobulinu a sekvencí okolo Cys 241 v TCRB řetězci.Výsledný konstrukt využíval chimérického genu kódujícího sekvenci k-řetězce úvodního peptidů od MPC 11 a rearanžovaný VDJ exon.Výs1edný konstrukt byl exprivován v savčích buňkách a byl detekován v buněčném supernatantu.Metoda nebyla přesvědčivá,nicméně, znamenala získání plné délky proteinu V regionu za nepřítomnosti cizích proteinových sekvencί,protože sekrece byla závislá na přítomnosti zkráceného 9« exonu (Gasgoigne ,N.,1990, J.Biol.Chem.,265 (16):9296-9301).

Jiná skupina se pokoušela dosáhnout exprese solubilní formy TCRB řetězců v biochemicky signifikantním množství expresí rekombinantního TCR heterodimeru ukotveného fosfatidyl inositol glykanovou vazbou.Metoda produkovala malé (0.5mg) ; Ý ,τ>

množství celého TCR řetězce, který vyžadoval štěpení od povrchu transfektovaných buněk fosfatidyl inositol specifickou fosfolipasou C ( Lin,A.Y.,1990,Science,249:677- 679).

Jiní produkovali chimérické molekuly mícháním variabilních a konstantních domén myšího TCR s konstantní oblastí lehkého řetězce Aimunoglobulinu.Výzkumníci byli schopni dosáhnout malého množství secernované solubilní formy heterodimerického aTCR (Gregoire C. et al.,1991, Proč.Nat1.Acad.Sci.USA 88:8077-8081). Gregoire et al. předvedli myší chiméru sestávající se z Ca a Va genů KB5-C2 spojených s C regionem kapa lehkých řetězců monoklonální protilátky S105. Také předvedli VpCpC kapa chiméru.Obě byly transfektovány do savčích B - myelomových buněk , které neexprivovali lehké ani těžké řetězce nativních imunoglobulinů ( viz též Weber,S., et al.,1992, Nátuře,356:793-795).

Novotný et al.,1991, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88: 8646-8650, demonstrovali metodu pro produkci solubilního TCR s antigen-kombinujícími vlastnostmi.Syntetický oligo linker byl klonován do C konce Vp a N konce Va regionu vytvářejíc tím jednořetězcový Vp Va. Vzniklý expresní vektor kóduje pelB leader následovaný okamžitě v rámečku Vp,linkerem.a

V alfa segmenty.Exprese konstruktu je pod kontro1ou lacZ promotoru a je proto IPTG-indukovatelná.

Nedávno jedna skupina ukázala sekreci malého množství

V regionu T buněčného receptorů fušovaného k karboxy

- terminálnímu polyhistidinovému ocasu. Plasmidy obsahují pelB leader a jsou pod kontrolou chemicky indukovaného promotoru ( Ward, E.S.,1991, Scan.J.Immuno134:215-220).

Práce nicméně selhává v popisu jak získat proteiny V regionu antigeního receptorů T buněk při absenci fusního partnera nebo jak získat komerčně využitelné množství receptoru V regionu.

Proto je zde velká potřeba agens a farmaceutických komposic, které mají vlastnosti specificity pro cílenou autoimunitní odpověd, predvídatelnosti v jejich selekci a výhodnosti a reprodukovatelnosti přípravy.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká výše zmíněných problémů tím, že poskytuje poprvé úspěšnou produkci universálního agens pro léčbu uvedenými T buňkami zprostředkovaných chorob, ve kterých jsou implikovány podskupiny T buněk. Přesněji, vynález poskytuje využitelné množství kompletních proteinů V regionu TCR, které mohou být přirozeně zpracovány, poskytujíce tak mnohotně aktivní fragmenty pro in vivo zpracování,a presentované antigen presentujícími buňkami každého jedince, za eliminace potřeby na míru šitých terapeutických agens. Také je poskytována třída rekombinantních expresních vektorů pro produkci proteinů V regionu TCR v bakteriích. Rekombinantní proteiny V regionu TCR tohoto vynálezu jsou využitelné v léčbě, prevenci nebo supresi imunitních chorob. V jiném využití mohou být TCR molekulykombinovány ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem pro užití jako terapeutická komposice. V jiném využití mohou být nárokované proteiny V regionu TCR užity diagnosticky k charakterisaci jednotlivých imunitních chorob. Proteiny TCR V regionu předkládaného vynálezu mohou být užity jako diagnostické sondy vzhledem k jejich schopnosti vázat se s autoproti látkami. Výhodou předkládaného vynálezu je to, že proteiny V regionu antigenního receptoru T buněk jsou exprivovány v nepřítomnosti fúsních proteinů nebo afinitních koncovek. Další výhodou předkládaného vynálezu je to, že proteiny V regionu TCR jsou produkovány v komerčně přijatelném množství, které je použitelné k přípravě kompozic, které jsou terapeuticky efektivní v léčbě autoimunitních chorob zprotředkovaných T buňkami.

Vynález dále poskytuje expresní vektor pro produkci čisté kompletní molekuly V regionu TCR. Expresní vektor vynálezu zahrnuje jako základní jednotku kódující region pro V region antigenního receptorů T buněk. TCR kódující region vynálezu molekula nukieové kyseliny kódující kompletní protein V regionu TCR. Ve výhodném provedení zahrnuje TCR kódující region strukturální kódující sekvence pro νβ5.3 region.

Expresní vektory zde popsané poskytují prostředky pro indukovatelnou expresi proteinů V regionu TCR.V preferovaném provedení je kódující sekvence pro V region antigenního receptorů T buněk pod trankripční kontrolou indukovatelného bakteriálního promotoru. V souladu s tímto vynálezem je indukovatelný bakteriální promotor subjektem bud chemické, nebo termální regulace. Nejlépe je indukovatelný bakteriální promotor subjektem termální indukce.

V jednom uplatnění zahrnuje expresní vektor předkládaného vynálezu regulační geny kódující proteiny schopné vazby na promotor a tak schopné potlačovat transkripci s indukovatelného promotoru. V preferovaném provedení je promotor odvozen z E.coli lac operonu a regulační geny obsahují funkční mutaci E.coli láci represorového genu. Tento mutantní láci gen (laclts) kóduje teplotně sensitivní represorický protein a užití těchto laclts genů dovoluje termální indukci promotoru. V preferovaném provedení je indukovatelným bakteriálním promotorem trc promotor a termální indukce je poskytnuta laclts regulačním genem.

V jednom provedení je regulační gen umístěn na kotransformovaném vektoru. V jiném provedení je regulační gen umístěn na chromosomech hostitelských bakteriálních buněk. V preferovaném provedení je regulační gen umístěn na rekombinantním expresním vektoru. V dalším preferovaném provedení transkripční směr mutantního láci genu je stejné orientace jako strukturální gen antigeního receptorů T buněk, který má být exprivován.

Rekombinantní expresní vektory předkládaného vynálezu mohou výhodně obsahovat kódující sekvence pro leader nebo signální peptid. Taková leader sekvence, fušovaná v rámečku a 5f do kódujícího regionu TCR V regionu, který má být exprivován, řídí syntesu proteinu V regionu TCR majícího N-terminální leader peptid, který postupně řídí sekreci rekombinantního proteinu přes membránu hostitelské buňky. Jiné provedení předkládaného vynálezu nevyužívá leader sekvence a žádoucí produkt V regionu je isolován z buněk.t.j. extrakcí moče.

V preferovaném provedení obsahuje rekombinantní expresní vektor předkládaného vynálezu v 5^f -3Γ směru: trc promotor, vazebné místo pro ribosom,vol itelnou leader sekvenci, kódující region pro kompletní V region antigenního receptorů T buněk, stop kodon, jeden nebo více transkripčních terminátorů, laclts regulační gen tak, že směr transkripce je stejný jako pro kódující region V regionu antigeního receptorů T buněk, bakteriální zdroj replikace a gen resistence pro tetracyklin.

Tento vynález také poskytuje metody pro produkci proteinů

V regionu TCR v signifikantně větším množství než dříve popsané.

Předkládaný vynález poskytuje kompozice a metody pro léčbu pacientů majících imunitní poruchy. Taková léčba zahrnuje podání kompozic v souladu s tímto vynálezem subjektů, které potřebují takovou léčbu, v množství a dobu vhodnou pro regulaci řečených poruch imunity. Výhodou presentovaného vynálezu je to, že kompozice vynálezu dovolují léčbu imunitních poruch bez potřeby selekce jednot1ivýcyh peptidových fragmentů a bez upravovování jednotlivých kompozic pro jednotlivé léčené jedince.

Vynález se také týká užití proteinů kompletního V regionu antigeního receptorů T buněk v terapii autoimunitnich chorob a poruch. Ve specifickém provedení se vynález týká užití kopletního Vp5.3 proteinu vc terapii. V jiném provedení poskytuj vynález kompletní proteiny V regionu antigeního receptorů T buněk ve výrobě léku pro léčbu autoimunitnich chorob a poruch. Tak je v jednom provedení vynález schopný užít kompletní proteiny V regionu ve výrobě léčiva pro léčbu imunitních chorob jako je MS.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr.l. Kompletní nukleotidové sekvence [SEQ ID NO.25 a SEQ ID NO.26] a aminokyselinová sekvence [SEQ ID NO.27] kompletního Vp5.3 proteinu vynálezu.

Obr.2. Plasmidová mapa ρΚΤΒ-νβ5.3.Tento plasmid obsahuje

Ptrc.trc promotor,glO,glO leader genový segment z bakteriofágu

T7.SD1, vazebné místo pro ribosomy 1,MC,minicistron kódující vazebné místo pro ribosom 2 (SD2)AAG GAG (viz SEQ ID NO.28 pro /ϊ kompletní nukleotidovou sekvenci minicistronu) a peptid Met Tyr Arg Leů Asn Lys Glu Glu ( SEQ ID NO.29), STII ,STII leader sekvence, V05.3,V0573 kódující region, T1T2,transkripční terminátory rrnB operonu, laclts gen kódující teplotně sensitivní lac represor, Ori, zdroj replikace a Tet⁵,gen resistence na tetracyklin.

Předkládaný vynález popisuje rekombinantní expresní vektory a metody pro dostatečnou produkci většího množství proteinů V regionu antigenního receptorů T buněk a jejich využití, zahrnujíc v to diagnosu, léčbu, prevenci nebo supresi imunitních chorob nebo poruch.

Pro produkci vysokých hladin kompletních proteinů V regionu TCR byla vyvinuta serie vektorů.Navíc je poskytnuta metoda pro produkci komerčně využitelného množství kompletních rekombinantních proteinů V regionu TCR užitím expresních vektorů předkládaného vynálezu. Metody a expresní vektory předkládaného vynálezu jsou unikátní díky tomu, že poskytují produkci kompletní V region antigenního receptorů T buněk v nepřítomnosti jiných proteinových sekvencí nebo fusních partnerů. Jak je detailně popsáno v podstatě vynálezu,supra,V region antigenního receptorů T buněk byl, v minulosti produkován pouze jako část většího proteinu a ve velmi nízké úrovni. Tyto cizí proteiny mohou způsobovat nežádoucí imunogenicitu, jsou -li užity in vivo, a jsou často označeny povolovacími úřady jako nedovolené znečištění. Dříve čištěné proteiny V regionu zahrnují jiné regiony TCR, jako je C region,fušovaný s V regionem. Jiné konstruované expresní systémy poskytovaly TCR V region jako chimérický protein, t.j.V region fušovaný na část imunoglobulinové molekuly.

Expresní vektory a metody tohoto vynálezu poskytují dále zvýšené hladiny exprese proteinů V regionu antigenního receptoru T buněk. Primární úmyslem při produkci proteinu , který má komerční využití, například ve výzkumu,diagnostice a terapii,je vyrobení komerčně využitelného množství proteinu. Předkládaný vynález proto poskytuje zvýšenou produkc proteinů V regionu TCR.Předkládaný vynález umožňuje produkci proteinů V regionu ve větším množství,t.j. od 1 do 500 mg /1 bakteriální kultury,nebo více. Výhodně je úroveň produkce proteinů alespoň 100 mg/litr. V nejpreferovanějším provedení předkládaný vynález poskytuje produkci alespoň 300 mg Ϋβ proteinu na litr bakteriální buněčné kultury.

Metody a expresní vektory předkládaného vynálezu umožňují produkci proteinů V regionu TCR za absence cizích proteinových sekvencí. Vynález tak eliminuje několik kroků spojených se získáváním purifikovaných proteinů V regionu TCR, pokud je připravovaný podle předešlého. V jednom provedení umožňuje vynález expresy zvýšeného množství proteinů V regionu termální indukcí,která vylučuje nezbytnost eliminování chemických inducerů,jako je IPTG. Protože proteiny V regionu TCR jsou produkovány v souladu s vynálezem bez přítomnosti cizích proteinů, umožňuje vynález zjednodušenou produkci relativně čistých produktů. Vynález eliminuje další zpracovatelské kroky, jako je zavedení enzymů nebo chemických reagens do systému vyloučení proteinů jako jsou jakékoliv fušované non-TCR peptidové segmenty nebo afinitní konečky.Takové manipulace nejsou pouze vhodné pouze k redukci množství nabytého V region produktu, také vkládají elementy .které musí být eliminovány,t.j. dalšími purifikačními kroky.

1. V REGION ANTIGENíHO RECEPTORU T BUN£K

Protein V regionu antigeního receptoru T buněk předkládaného vynálezu je kompletní V region antigenního receptoru T buněk. Kompletní protein V regionu TCR je kódovaný kódujícím regionem pro V region antigeního receptoru

T buněk. Kódující region TCRV regionu je nukleotidová sekvence kódující kompletní protein V regionu antigeního receptoru T buněk. V rozsahu tohoto vynálezu zahrnuje V region variabilní region antigeního receptoru T buněk. V rozšířeném pohledu mohou být poznatky tohoto vynálezu aplikovány k získání zvýšené exprese TCR proteinu včetně V regionu a navíc, celý nebo část D a/nebo J regionu. Proteiny V regionu TCR jsou produkované za nepřítomnosti cizých proteinových sekvencí, jako je například, jiný TCR region, tak jako konstantní region, transmembránový region nebo cytoplasmatický region. Navíc, protein V regionu TCR vynálezu je produkován v nepřítomnosti non-TCR fusních partnerů, jako jsou afinitní konečky. Navíc, protein V regionu TCR není produkován jako součást většího chimérického proteinu obsahujícího část jiné proteinové molekuly jako je imunoglobulinový protein.

Rozpoznání toho, že DNA sekvence kódující jeden z komplementaritu určujících regionů (CDR) V regionu receptoru T buněk může aktuálně překlenout známé spojení mezi

V a D kódujícími regiony (tak jako v případě CDR 3 νβ5.3) jak je zde použito, celá délka kódujícího regionu V regionu může zahrnovat celou kódující sekvenci takového CDR, který překlenuje V-D spojení,část takového CDR, který je pouze umístěn ve známém V regionu nebo žádnou ze sekvencí kódujících takový CDR. Navíc,kompletní protein V regionu antigenního receptoru T buněk předkládaného vynálezu může být jakýkoliv

V region antigenního receptoru T buněk a není omezen pouze na V3 regiony (t.j.,V regiony TCR β řetězce). Proto, proteiny

V regionu antigeního receptoru T buněk mohou být variabilní regiony alfa podjednotky,beta podjednotky , delta podjednotky nebo gama podjednotky.

V preferovaném provedení je protein V regionu TCR jakýkoliv V region antigeního receptoru T buňky,pro který je vhodná kompletní kódující sekvence. Metody pro získání kompletní kódující sekvence předkládaného vynálezu jsou v oboru dobře známé. DNA sekvence domén lidského V regionu mohou být izolovány podle dobře známých postupů z celé řady lidských buněk.Výhodně jsou těmito buňkami T lymfocyty periferní krve.

DNA sekvence předkládaného vynálezu mohou být připraveny různými cestami. Je preferováno, aby DNA sekvence V regionů antigeních receptoru T buněk byly připravovány polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) užitím DNA sekvencí kódujících intaktní TCR jako templátú. Lidský V β region může být připraven například cestou amplifikace cDNA připravené z lidských lymfocytů periferní krve stimulovaných anti-CD3 protilátkou, podle postupu Choie et al.,1989,

Proč.Nati.Acad.Sci.USA 86:8941-8945.

V jednom aspektu předkládaného vynálezu je získán kompletní V region antigeního receptoru T buněk z jakéhokoliv klonu obsahujícího kompletní sekvenci.Například ,některé sekvence V regionu TCR a cDNA klony obsahující kompletní kódující regiony jsou popsané Concannonem et al.,

1986,Proč.Nati.Acad.Sci.USA 83:6598-6602.

Preferované proteiny V regionu TCR předkládaného vynálezu jsou ty , které jsou implikované u imunitních choorob a poruch,konkrétně Vy^ 8.1 (Kawasakiho choroba, viz.,Abe et al.,1992, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 89:4066),V$ 6.1 (lepra, viz.Wang et al.,1993 Proč.Nati.Acad.Sci.USA 90: 188,^

5.1 (lymská nemoc, viz.Lahesma et al.

1993,J.Immunol.,150:4125), Vp 5.2,nebo Vp 5.3 nebo Vp 6.1 (roztroušená sklerosa, viz. Kotzin et al.,1991

Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88:9161),Vp 2.1 nebo Vp 3.1 ( revmatoidní artritida viz Uematsu et al.,1991,Proč.Nati.Acad.Sci.USA 88: 8534). (Viz také Hafler ,D.A. et al.,1988,J.Exp.Med.,167:1313, a Mantgazza R.et al.,1990,Autoimunity,3: 431).

TCR exprivovaný klony T buněk u autoimunitních chorob nebo klony T buněk odpovídajících na jednotlivé autoantigeny mohou být identifikovány užitím TCR specifických protilátek, například polyklonálních, monoklonálních nebo chimérických protilátek, které jsou specifické pro TCR variabilní segment spolu s metodou značení protilátek, jako je fluorescenční mikroskopie, průtoková cytometrie, imunocytochemie nebo jiné techniky v oboru dobře známé. Takové protilátky jsou popsány pro množství alfa a/nebo beta řetězců V regionů TCR ( viz .například mezinárodní patentová publikace WO 90/06758).

Alternativně může být DNA nebo m RNA klonu T buněk označena přímo, nebo po amplifikaci PCR ( Synha et al.,1988, Science, 239:1026, Saiki et al.,1986 Nátuře,324:163), a specificky hybridisována probami nukleových kyselin pro různé rodiny TCR genů užitím hybridizačních metod v oboru dobře známých.TCR sekvence nebo jejich části mohou být získány přímo z amplifikované, rearanžované DNA nebo mRNA.

Exprese jednotlivých TCR může být také identifikována určením sekvence nukleových kyselin kódujících alespoň část TCR, například po klonování TCR V genu, nebo určením aminokyselinové sekvence alespoň části TCR proteinu.Je zjevné, že jakýkoliv z výše zmíněných přístupů, nebo jiné přístupy v oboru známé, povedou k identifikaci TCR exprivovaného na T buňkách nebo liniích T buftek.

Příklady molekulárních přístupů užitých ke korelaci TCR genové exprese při onemocněních zahrnují:

(1) produkci a analýzu cDNA knihoven získaných s chorobou spojených T buněk od jednoho nebo více subjektů majících tuto chorobu,aby se určila přítomnost frekventně užívaných nebo dominantních TCR genů.

(2) Southern analýzu vzorků choroby k určení specifického genového polymorfismu (t.j.RFLP) nebo existence oligoklonálních TCR přestaveb.

(3) analýzu vzorků choroby cDNA syntesou.PCR amplifikaci, a slot blot hybridizací,a (4) in šitu hybridisací nukleových kyselin nukleových kyselin

T buněk TCR probami bez předešlé kultivace těchto buněk.

Preferované proteiny V regionu TCR zahrnují Vp 8.1,Vp 5.2,nebo Vp 5.3.Dvouvláknová cDNA kódující Vp 5.3 a aminokyselinová sekvence pro VP 5.3 jsou ukázány na obrázku 1 ( Viz SEQ ID NOS 25,26 a 27).

Klony V regionu antigeního receptoru T buněk mohou být zavedeny do expresních vektorů předkládaného vynálezu metodami v oboru dobře známými. Například,z cDNA klonu je V region syntetizován PCR inkorporováním iniciačního ATG do

5* konce. Může být syntetizováno jakékoli vhodné restrikční místo, které inkorporuje iniciační kodon a rekonstituuje 5* kódující region V regionu. V preferovaném provedení je restrikčním místem Ncol místo. Stop kodon a vhodné restrikční místo jsou vloženy do 3^řkonce kódující sekvence pro V region tak, že může být subklonována do vektoru.

Mělo by být jasné, že metodologie tohoto vynálezu může být užita k přípravě kompletních V regionů TCR odvozených ze zvířecích druhů jiných než humáních.

2.EXPRESNÍ VEKTORY

Rekombinantním expresním vektorem v rozsahu tohoto vynálezu je piasmid,který obsahuje exogení DNA ve formě nukleové kyseliny kódující V region TCR.ktereý má být exprivován.Rekombinantní expresní vektor předkládaného vynálezu je vložen do buněk bakteriálního hostitele například transformací a transformanty,které exprivují požadovaný protein V regionu, jsou izolované a klonované.

Předkládaný vynález se týká expresních vektorů obsahujících DNA sekvenci kódující pro kompletní protein

V regionu TCR.Výhodně, proteiny V regionu TCR jsou ty proteiny antigeních receptorťi T buněk, které jsou zde popsány. Expresní vektor v rozsahu tohoto vynálezu je piasmid, obsahující geny

V regionu TCR, které mají být exprivovány, pod transkripční a translační kontrolou regulačních elementů, jako je například promotor, vazebné místo pro ribosomy a trankripční terminátor. Navíc obsahuje zdroj replikace pro stabilní replikaci bakterie. Také výhodně obsahuje geny kódující resistenci na antibiotika usnadňující selekci transformovaných buněk nesoucích piasmid. Exprese klonovaných sekvencí se vyskytuje, je-li expresní vektor vložen do vhodné hostitelské buňky.

Expresní vektory užité v předkládaném vynálezu jsou často ve formě plasmidů. Plasmidy znamenají cirkulární dvouvláknové DNA sekvence, které nejsou integrovány do chromosomú. Expresní vektory předkládaného vynálezu mohou také obsahovat jiné DNA sekvence, jako například leader nebo signální sekvence, které jsou užitečné pro zaměření nebo stabilitu expresních produktů a/nebo regulační sekvence, které umožňují modulaci genové exprese,například odpovědí na změnu teploty nebo změnu složení kultivačního media.

Expresní vektory obsahují jednu nebo více kontrolních sekvencí funkčně vázaných na sekvence kódující V region TCR. Termín funkčně vázaný v rozsahu tohoto vynálezu znamená, že jedna sekvence nukleových kyselin, která má regulační funkci pro genovou expresi nebo kóduje funkční proteinovou doménu, je kovalentně vázaná na bud 3^r , nebo 5^r , ke druhé sekvenci nukleových kyselin kódujících protein tak, že regulační funkce použita na druhou sekvenci nukleových kyselin nebo kódovaných funkčních domén bude fušována do rámečku k proteinu kódovanému druhou nukleovou kyselinou. Takové regulační funkce pro genovou expresi obvykle zahrnují iniciaci transkripce, terminaci transkripce a zpracování mRNA transkriptů. Sekvence nukleových kyselin, které vykazují takové regulační funkce na genovou expresi, zahrnují promotory transkripce,transkripční terminátory a signály mRNA zpracování. Funkční domény, které mohou být funkčně vázané k jiným proteinům zahrnují například leader nebo signální peptidy, které dovolují transport proteinů přes buněčnou membránu.

V jednom provedení může být promotorem indukovatelný promotor. V preferovaném provedení je promotor takový, že může být regulován přítomností nebo absencí jistých komponent media. V oboru zkušení poznají, že některé bakteriální promotorové subjekty ke kon^trole přítomnosti nebo absence jistých komponent media, mohou být užity ve spojení s expresními vektory předkládaného vynálezu. Je preferováno aby , . 1' J',t . .V promotorem byl silný bakteriální promotor jako je lac promotor, tac promotor a tře promotor. Proto v jednom provedení je ve vektoru tohoto vynálezu promotorem pro kódující sekvenci V regionu TCR subjekt regulovaný přítomností nebo absencí isopropyl-p-D-thiagalaktopyranosid ( IPTG), spontání chemická induktorová molekula lac,tac a trc promotorů. V preferovaném aspektu je IPTG - indukovatelným promotorem lac promotor nebo tac promotor. V preferovanějším provedení je IPTG-indukovatelným promotorem trc promotor (Brosius et al.,1985,J.Bio 1.Chem.,260:3539-3541),který je podobný tac promotoru, derivovanému fúzí 10-regionu lac UV5 promotoru s -35 regionu tryptofanového operonu (de Boer et al.,1983, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 80:21-25, Amann et al.,1983, Gene,25:167-178). Trc promotor je shodný s tac promotorem s výjimkou jednoho páru baží v promotoru (Brosius et al.,(1985)supra).

V dalším provedení je expresní vektor předkládaného vynálezu modifikován tak,aby umožňoval sekreční expresi kompletního proteinu V regionu TCR vynálezu teplotním posunem.Podle tohoto provedení umožňuje expresní vektor expresi proteinu V regionu TCR za absence chemických induktorú,což vylučuje potřebu užití takových elementů jako je IPTG a řetězce bakteriálního hostitele obsahující láci nebo laďgeny. Preferované provedení expresních vektorů předkládaného vynálezu zahrnují regulační geny .které umožňují termální expresi. Regulační genovou sekvencí je nejlépe laclts gen, který kóduje teplotně sensitivní lac represor.

V dalším preferovaném provedení je laclts gen lokalizován proximálně od a po řetězci od transkripčního terminátoru, a trankripční směr je stejný jako u kódující sekvence

V regionu.

Navíc, expresní plasmidy tohoto vynálezu výhodně obsahují jeden nebo více selektovatelných markérů.Výhodně vede selektovatelný genetický markér k resistenci na antibiotika jako je ampicilin, kanamycin nebo tetracyklin. Nejvýhodněji je selektovatelným markérem gen resistence na tetracyklin.

Dále, vektory obsahují bakteriální zdroj replikace.

V preferovaném provedení je zdroj replikace odvozen od pBR322. Expresní vektor také obsahuje vazebné místo pro ribosomy a transkripční terminátor rrnB ribosomálního RNA operonu E.coli ( Brosius et al.,Plasmid,6: 112-118).

V preferovaném provedení expresní vektor předkládaného vynálezu obsahuje jako základní elementy v 5^r-31 směru: DNA sekvenci, která obsahuje promotor a operátor, DNA sekvenci, která obsahuje vazebné místo pro ribosomy pro předložení mRNA požadovaného genu schopného vazby na ribosomy v hostitelské buňce, ATG iniciační kodon nebo DNA sekvenci, která je konvertována do ATG iniciačního kodonu po inserci požadovaného genu do vektoru,restrikční místo pro inserci požadovaného genu v rámečku s ATG iniciačním kodonem nebo multiplikované klonující místo obsahující několik restrikčních míst pro inserci vhodného genu nebo kódujícího regionu .který má být exprivován,sekvenci nukleových kyselin kódující sekvenci

V regionu antigeního receptorů T buněk,která má být exprivovaná, a transkripční terminátor, který slouží k účinému ukončení transkripce. Vektor také obsahuje DNA sekvence, které obsahují zdroj replikace z bakteriálního plasmidu schopného autonomní replikace v hostitelských buňkách a DNA sekvence, které obsahují geny asociované se selektovatelnými nebo identifikovatelnými fenotypickými rysy,které se manifestují, jestliže je vektor přítomen v hostiteli. Expresní vektor může volitelně obsahovat signální nebo leader kódující sekvence funkčně vázané,t.j. fušované v rámečku, na 5Γ konec sekvence nukleových kyselin kódující V region TCR tak,že translace leader sekvence - TCR V region sekvence vede k leader peptid-V region TCR fusnímu proteinu, ve kterém leader peptid na amino konci fusního proteinu řídí sekreci proteinu V regionu TCR přes membránu hostitelské buňky. V jistém preferovaném provedení obsahuje expresní vektor regulační gen pro expresi sekretovaného proteinu teplotním posunem.

V preferovanějším provedení obsahuje expresní vektor následující základní elementy v 5*-3Γ směru: trc promotor , který je složen z -10 regionu lac UV 5 promotoru fušovanému s -35 regionem tryptofanového operonu ( de Boer et al,supra, Amann et al.(1983) supra),silné ribozom vázající místo,kódující region V regionu TCR .který má být exprivován, dva transkripční terminátory z rrnB ribosomálního RNA operonu,lácits gen kódující pro teplotně sensitivní lac represor, pBR322 zdroj replikace, a gen resistence pro tetracyklin. Příklad takového preferovaného provedení .expresní vektor pKBi-V0 5.3 byl uložen podle Budapešťské smlouvy v American Type Culture Collection (ATCC) pod přírůstkovým číslem 69739 6.ledna 1995.

Expresní vektory předkládaného vynálezu mohou obsahovat leader sekvence kódující signální peptidy funkčně vázané na kódující region V regionu TCR.V expresi bude řídit amino terminální koncový peptid sekreci proteinu V regionu TCR přes membránu hostitelské buňky, do periplasmy kultivačního media. Odborník pozná, že množství leader sekvencí může být užito ve spojením s expresním vektorem předkládaného vynálezu. Vhodnou leader sekvencí je pelB signální sekvence z E.carotovora (Lei et al.,1987,J.Bacteriology,169:437926

4383). Jiná vhodná leader sekvence je termostabilni enterotoxin II (ST II) signální sekvence E.coli (Morioka-Fujimoto et al., 1991, Biol.Chem., 266:1728-1732).

V jednom provedení obsahuje expresní systém STII leader sekvenci, a kódující region pro V region je PCR syntetizován tak,aby obsahoval vhodné restrikční místo v 3Γkonci a zapracované Mlul místo na 5^f konci a tak může vhodně vázat Mlul místo inkorporované do 3^f konce STII leaderu. Proto v dalším preferovaném provedení obsahuje expresní vektor ve směru 5^r. - 3^r :trc promotor .který se skládá z -10 regionu lac UV 5 promotoru fušovanému s -35 regionem tryptofanového operonu, silné ribosom vázající místo, STII leader,kódující region V regionu antigeního receptorů T buněk,který má být exprivován,transkripční terminátor z rrnB operonu,laclts gen kódující teplotně sensitivní lac represor,pBR322 zdroj replikace a gen resistence pro tetracyklin.V nejpreferovanějším užití je vektorem ρΚΒ-νβ5.3.

Expresní vektor předkládaného vynálezu může být konstruován užitím standartních technik známých v oboru (Viz. Maniatis et al..Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY,1982).

Předkládaný vynález se navíc zabývá hostitelskými buňkami obsahujícími expresní vektor, který obsahuje DNA sekvenci pro kompletní V region TCR.Navíc, preferované hostitelské buňky obsahují expresní vektor, zahrnující jednu nebo více kontrolních DNA sekvencí schopných přímé replikace a nebo exprese DNA sekvence kódující pro kompletní protein V regionu antigeního receptorů T buněk. Vhodné hostitelské buňky zahrnují prokaryotické hostitelské buňky, v preferovaném provedení jsou prokaryotickými hostitelskými buňkami bakteriální hostitelské buňky, nejlépe E.coli buňki. Odborníci pochopí z okamžité aplikace,že užití jednotlivých expresních vektorů ovlivní výběr hostitelských kmenů vybraných pro produkci kódující pro kompletních proteinů V regionu TCR. Například, expresní vektory podrobené chemické indukci v rozsahu tohoto vynálezu, bakteriální hostitelské kmeny, které nesou láci nebo lac I^gen, který reguluje trc promotor, jsou zejmena využívány. V expresních vektorech v rozsahu tohoto vynálezu jsou preferovány takové, které obsahují genové regulační sekvecence jako laclts gen,který poskytuje teplotně sensitivní represor.a takové bakteriální hostitelské kmeny , které nenesou divoký typ láci nebo láci'* geny. Zejména je preferována hostitelská buňka LJ24.

V jistém provedení neobsahuje expresní vektor předkládaného vynálezu leader sekvenci.V jistém preferovaném provedení je bakteriálním hostitelským kmenem E.coli BL21,nebo lépe proteasa deficientní E.coli kmeny , jako je SG21163,SG22094,SG21173.

Expresní vektory předkládaného vynálezu mohou být zavedeny do hostitelských buněk různými metodami známými v oboru,které se mohou měnit v závislosti na typu celulárního hostitele. Například, působení chloridu vápenatého nebo elektrokorporace jsou všeobecně požívány pro prokaryotické buňky.(Viz obecně, Maniatis.et al.,Molecular Cloning:

A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY (1982).)

Když byl exprivovaný vektor jednou vložen do vhodné hostitelské buňky.hostitelská buňka může být kultivována za podmínek dovolujících expresi značného množství V regionu TCR.

Hostitelská buňka obsahující expresní vektor .který obsahuje DNA sekvenci kódující pro proteiny V regionu TCR může být identifikována jakoukoliv vhodnou metodou.V následujících příkladech,například,je produkce proteinů V regionu TCR detekována imunologicky užitím imunozkoušky.

Alternativně, hostitelská buňka obsahující expresní vektor předkládaného vynálezu může být identifikována hodnocením hladiny transkripce DNA V regionu TCR měřením specifických transkriptů V regionu TCR v hostitelské buňce ( t.j. northern blot analýsa). V ještě další metodě může být hostitelská buňka obsahující expresní vektory předkládaného vynálezu identifikována DNA-DNA hybridizací za použití prob komplementárních ke kódujícím sekvencím V regionu TCR vektoru.

DNA sekvence předkládaného vynálezu, expresní vektory nebo DNA molekuly mohou být určeny různými metodami známými v oboru. Například dideoxydovou řetězovou terminační metodou jak ji popisuje Sanger et al.,1977, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 74:5463-5467.

Následující příklady poskytují a užívají jednu nebo více detekčních metod popsaných výše,odborníci mohou ,bez přehnaného experimentování,snadno vybrat kombinace expresních vektorů a hostitelských buněk,které poskytují optimální expresi proteinů V regionu TCR.Kombinací jednotlivého hostitelského kmenu s jednotlivým expresním vektorem tohoto vynálezu je možné získat relativně vysokou úroveň exprese kompletního proteinu receptorů T buňky.Výhodně je úroveň exprese kompletního proteinu V regionu TCR alespoň 300 mg na litr kul tury.Takové hladiny mohou být získány například užitím preferovaného provedení ve kterém je E.coli SG21173 bakteriálním hostitelským kmenem a pKBi-V05.3 expresním vektorem (viz příklady,infra).Takové kombinace hostitelů a expresních vektorů tohoto vynálezu dovolují produkci signifikantní kvantity kompletního proteinu V regionu TCR při menších nákladech , než bylo možné dříve.

Jakmile jsou exprivovány mohou být proteiny vynálezu purifikovány v souladu se standartními procedurami.včetně precipitace amonium sulfátem,afinitní chromatografiί, kolonovou chromatografiί, gelovou elektroforesou a pod. (viz,obecně,Scopes,R., Protein Purification, Springer-Verlag,NY(1982).)

V preferovaném provedení je V region antigeního receptoru T buňky solubilní.Tímto je míněno, že V region antigeního receptoru T buňky je solubilní ve vodném systému.Solubilni protein je všeobecně charakterisován selháním sedimentace při pokojové teplotě při vysoké G-síle centrifugace (100 000 x g) z vodného pufru.Solubi1 i ta je zejmena důležitá pro zjednodušení purifikace V region antigeního receptoru T buňky z produkujících buněk.Vodné pufry užité v proteinové chemii typicky mají pufrovací sloučeninu pro udržení určitého pH.(typicky v mezích fysiologického rozmezí okolo pH 5-9),poskytují jednotlivé ionizované řetězce ( typicky mezi asi 10 mM a 500 mM), a často zahrnují proteasový inhibitor a střední detergent.Příkladem standartních pufrů jsou fosfátový pufrovaný sůl, Tris - pufrovaná sůl,a množství pufrů užívaných k izolaci proteinů.(viz,obecně,Methods in Enzymology, Mahlers and Cordes Biological Chemistry (2d Ed.),Harper and Row.New York (1966).)

3. UŽITÍ PROTEINŮ ANTIGENÍHO RECEPTORU T BURKY

Předkládaný vynález poskytuje poprvé prostředky pro dostatečnou a ekonomickou produkci diagnosticky, terapeuticky a vědecky užitečného množství proteinů V regionu TCR,který není fusním proteinem ani není navázán na cizí sekvence,jako jsou afinitní konečky.

A. Užití ve výzkumu a diagnostice

Proteiny V regionu TCR předkládaného vynálezu jsou využitelné ve strukturálních a funkčních studiích antigeního receptoru T buněk (TCR).Vedle nabídky substrátu nebo vazebné domény pro specifické formy TCR mohou tyto proteiny sloužit jako jako prostředky pro konformační studie,t.j.pro přiblížení nativní konformace různých částí receptoru T buněk.

Proteiny V regionu T buněk mohou také být použity jako diagnostické proby.V jednom preferovaném provedení mohou být proteiny V regionu TCR předkládaného vynálezu užity pro určení množství nebo přítomnosti jistých podrodin V regionu TCR v biologickém vzorku.Jedna taková zkouška je popsána Ritterhausem ,C.W. v,Internátional Patent Publication WO 92/08981 pod názvem Therapeutic and Diagnostic Methods Using Total Leukocyte Surface Antigens.Předkládaný vynález poskytuje metody pro diagnosu imunitních chorob jako je roztroušená sklerosa, detekcí specifických podskupin T buněk asociovaných s chorobou.

V jiném provedení může být předkládaný vynález použit ke generaci signifikantního množství proteinů V regionu antigeního receptoru T buněk pro užití v produkci proti látek.Proti látky mohou být připraveny použitím mnoha technik v oboru známých.Pro produkci monoklonálních protilátek (MAb)může být použita jakákoliv metoda , která poskytuje produkci protilátkové molekuly kontinuálními buněčnými liniemi v kultuře.Tato metoda zahrnuje, ale není tím omezena , hybridizační techniky originálně popsané Kohlerem a Milsteinem,1975,Nátuře,256: 495-497),nověji hybridizačni techniky lidských B buněk ( Kozbor et al,1983,

Immunol.Today,4:72,EBV techniky ( Cole et al..Monoclonal Antibodies and cancer Therapy.Alan R.Liss, lne.,pp.77-96(1985),a trauma techniky .Pro přehled metod produkce protilátek viz:Hartlaw,E.,et al., Antibodies:A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,(1988).

Proteiny V regionu TCR vynálezu mohou být užity jako diagnostické proby vzhledem k jejich schopnosti reagovat s autoprotilátkami v biologických vzorcích.

Předkládaný vynález také předkládá značené deriváty proteinů V regionu TCR , které mohou být detekovány vhodnými monitory,jako je scintilační Geigrova komůrka , nebo radiografický film.Takové deriváty zahrnují např.

¹²⁵I,¹³¹I,¹⁴C,³⁵S,³H,¹¹²In,⁹⁹M,Tc a podobně, pro in vitro a in vivo diagnostické účely.

B. TERAPEUTICKÉ VYUŽITÍ

Jak bylo zmíněno výše,tento vynález je spojen s imunitními chorobami.

Termín imunitní choroby zde označuje chorby , ve kterých je imunitní systém zapojen do patogenese choroby ,nebo ve kterých vhodná stimulace imunitního systému může vést s ochraně před chorobou. Relevantní choroby zahrnují,ale nejsou těmito omezeny ,autoimunitni choroby, neoplastické choroby,infekční choroby , hypersensitivitu , transplantaci,reakci štěpu proti hostiteli,a degenerativní choroby nervového systernu.Autoimunitni choroby zahrnují, ale nejsou jimi omezeny , artritidu,jako je revmatoidní artritis.I typ diabetů, juvenilní diabetes,roztroušenou sklerosu , autoimunitní tyreoiditis (Hashimotovu tyreoiditis).myastenii gravis, systémový lupus erytematodes ( SLE),Sjogrenův syndrom, Gravesovu chorobu,Adisonovu chorobu,Goodpesteurův syndrom,sklerodermii, dermatomyositidu, myxedem,polymyositidu, perniciosní anemii,zánět 1ivé střevní choroby včetně Crohnovi nemoci a autoimunitní atrofické gastritidy, a autoimunitní hemolytickou anemii.Neoplastické choroby zahrnují , ale nejsou jimi omezeny,lymfoproliferativní choroby jako jsou leukemie, lymfomy, Non-Hodgkinské lymfomy a Hodgkinské lymfomy, a karcinomy jako je karcinom prsu,tlustého střeva, plic, jater, pankreasu, melanom, karcinom ledvin,atd.Infekční choroby zahrnují , ale nejsou jimi omezeny.virové infekce způsobené viry jako HIV,HSV,EBV,CMV,Influenza, Hepatitis A,B,nebo C; mykotické infekce jako jsou ty způsobené kvasinkami rodu Candida, parasitární infekce jako jsou ty , které způsobují schisostoma, filarie,nematoda,trichinela nebo protozoa jako trypanosomy způsobující spavou nemoc,plasmodium způsobující malarii nebo leishmanie způsobující leishmaniosu, a bakteriální infekce jako například ty, které způsobují mykobakterie, corynobakterie nebo staphylococcus.Hypersensitivní choroby zahrnují , ale nejsou jimi omezeny, Typ I hypersensitivity,jako je kontakt s alergenem, který vede k alergii,Typ II hypersensitivity jako je u Goodpasteurova syndromu a myastenie gravis.

Terapeutické užití proteinů V regionu TCR tohoto vynálezu je založeno na korelaci mezi specifickými imunitními chorobami a preferenční expresí určitého proteinu V regionu buněčného receptoru T buněk nebo určité sekvence kódující protein

V regionu TCR.Ačkoliv by předkládaný vynález neměl být limitován určitou vědeckou teorií,V regiony TCR jsou užitečné zčásti proto , že mohou být užity k regulaci imunitní odpovědi u jednotlivců.Specificky , tam kde přítomnost nebo abnormálně vysoká exprese jednotlivého V regionu koreluje s jednotlivou imunitní chorobou,lze léčit jednotlivce neutralisací T buněk nesoucích určitý protein V regionu.Navíc zavedení proteinu V regionu TCR může ovlivnit imunosupresívní funkce stimulací regulačních T buněk,které budou specificky reagovat s T buňkami nesoucími cílový T region.Je také pravděpodobné, že proteiny V regionu TCR mohou zvyšovat proti látkovou odpověd,která bude specificky interagovat s cílovým V regionem na T buňkách a zpětně regulovat imunitní odpověd.

Kompletní proteiny V regionu antigenního receptoru T buněk předkládaného vynálezu poskytují jasné výhody v léčbě imunitních chorob.Před předkládaným vynálezem zahrnovali terapeutické možnosti imunitních chorob souvisejících se specifickými T buňkami: (a) žádnou léčbu s možným spontáním vyléčením,(b) léčbu peptidy korespondujícími k jednotlivým segmentům V regionu antigeního receptoru T buněk,(c) nespecifickou léčbu ,jako je léčba steroidy nebo nesteroidními protizánětlivými agens. Nicméně , žádný z těchto přístupů nedovoluje výhody předkládaného vynálezu. Terapeutické metody předkládaného vynálezu mají jasné výhody proti předešlým metodám léčby imunitních chorob v tom, že metody předkládaného vynálezu jsou zaměřeny pouze na jednotlivou podskupinu T buněk nesoucí určitý V region a mohou být užity u různého rozsahu postižených jedinců, protože vynález umožňuje eliminaci potřeby selektovat jednotlivé peptidy vztažené k MHC haplotypúm jednotlivých individuí. Metoda předkládaného vynálezu se těsněji přibližuje cíly modulace pouze těch T buněk , které mají vztah k chorobě a ušetření nebo neovlivnění jiných T buněk subjektu. Vynález tak dosahuje vyšší specificity terapie mezi širší populací.

V preferovaném provedení může být kompletní protein

V regionu antigeního receptoru T buněk užit k down- regulaci nebo eliminaci podskupin T buněk , které vykazují TCR inkorporující stejné V regiony.Proteiny V regionu antigeního receptoru T buněk mohou být užity v terapeutických situacích k modulování aktivity těch T buněk , které nesou cílový

V region nebo indukování neodpovídavosti v populaci aktivně odpovídajících T buněk nesoucích cílový V region.V této situaci je antigení receptor T buněk užit jako terapeutická komposice v subjektu.

Specifické proteiny V regionu antigeního receptoru T buněk asociované s danou chorobou jsou identifikovány jakoukoli z množství technik v oboru dobře známých.Genetický přístup s použitím pacientů s myastenia gravis nebo roztroušenou sklerosou byl popsán Oksenbergem , J.R.,et al, ,1989,Proč.Nati.Acad.Sci.USA,86:988-992.

Termínem léčba v předkládaném vynálezu je míněna prevence, suprese nebo léčba choroby. Prevence zahrnuje podání protektivní komposice před vznikem choroby.Tak, například ,u zvířecího modelu experimentální autoimunitní encephalomye1 itidy, EAE, úspěšné podání protektivní kompozice před podáním encephalitogenu, který indukuje chorobu,vede k prevenci choroby.

Suprese zahrnuje podání kompozice po indukci,ale před klinickou aparencí choroby.Tak,při užití EAE příkladu, úspěšné podání protektivní komposice po injekci encephalitogenu ,ale před neurologickými symptomy, vede k supresi onemocnění.

Léčba zahrnuje podání protektivní komposice po objevení se nemoci. Na příkladu EAE, úspěšné podání protektivní komposice po injekci encephalitogenu a po klinických příznacích vede k léčbě nemoci.

Pro měření preventivního, supresivního a terapeutického benefitu proteinu V regionu TCR předkládaného vynálezu byly měřěny jisté klinické výsledky.Zejména byla měřena alterace proliferarivní odpovědi lymfocytů in vitro.Zkoušky pro měření terapúeutického benefitu jednotlivých proteinů V regionu jsou v oboru známé.

Zvířecí modelové systémy, které mohou být použity ke skríningu efektivity proteinů v protekci nebo léčbě jsou dosažitelné. Systémový lupus erytematodes ( SLE) je testován na susceptibilnich myších jak popisuje Knight et al. ,1978,J.Exp.Med,147:1653 a Reinersten et al.,1978,299:515.Myastenia gravis (MG) je testována na SJL/J myšších samicích indukcí choroby solubilním AChR proteinem z jiných druhů jak popsal Lindstrom et al.,1988,

Adv.Immuno1.,42:233-284. Artritis je indukovaná na vnímavém kmenu myší injekcí II typu kolagenu jak popisuje Stuart et al.,1984,Ann.Rev.Immunol42:233-284. Adjuvantní artritida je indukována vnímavým krysám injekcí Mykobakterialního proteinu tepelného šoku jak popisuje Van Edan et al.,1988,Nátuře,331:171-173.Thyreoiditis je indukována myším podáním thyreoglobulinu jak popisuje Maro et al.,1980,152:1115-1120. Insulin dependentní diabetes mellitus (IDDM) se vyskytuje přirozeně nebo může být indukován u jistých kmenů myší jako jsou ty , které popsal Kanasawa et al.,(1984). EAE u myší a krys poskytuje model pro MS u lidí.V tomto modelu je demyelinisační choroba indukována podáním myelin basického proteinu (MBP) ja/;popisuje

Paterson.P.Y..Textbook of Immunopathology,(Mischer et al. , eds.),Grune and Stratton, New York,pp.179-213 (1986).McFarlin.D.E.,et al.,1973,Science,179:478-480: a Satoh,J,et al.,1987,J.Immunol.,138:179-184.

Samozřejmě,identické proteiny nemusí být účinné u lidí protože nemusí korespondovat s vhodnými místy na lidském s chorobou asociovaném TCR.Je srozumitelné , že může být požadována taková modifikace proteinové sekvence určené na zvířecím modelu, aby léčila subjekty náležící k jinému druhu včetně lidí.

4. FARMACEUTICKÉ KOMPOSICE OBSAHUJÍCÍ V REGION ANTIGENÍHO RECEPTORU T BUNĚK

Proteiny a kompozice předkládaného vynálezu , nebo jejich funkční deriváty jsou vhodné pro přípravu farmaceutických komposic.Farmaceutické kompozice předkládaného vynálezu mohou být podány jakýmkoli zvířatům, u kterých jsou zkušenosti s benefičními efekty kompozice vynálezu. Přední mezi takovými živočichy jsou lidé, ačkoliv vynález nemá v úmyslu být tak omezený.

Farmaceutické kompozice předkládaného vynálezu mohou být podávány jakýmikoliv prostředky , které dosahují zamýšleného účelu.Například, podání může být paranterální, subkutánní, intravenosní, intradermální, intramuskulární, intraperitonealní, transdermální nebo bukální cestou. Alternativně,nebo konkurentně, může být podání cestou orální.

Proteiny a farmaceutické komposice mohou být podány parenterálně bolusovou injekcí nebo graduální perfusí během doby.

Podaná dávka bude závislá na věku,pohlaví,zdravotním stavu a váze recipienta ,typu konkurentní léčby, je-li nějaká, frekvenci léčby a povaze požadovaného efektu.Dávkové rozsahy pro podání komposicí předkládaného vynálezu jsou dostatečná množství umožňující produkci požadovaného efektu,čímž je například dosažená imunitní odpověd na proteiny měřená oddálenou hypersensitivitou (DTH) nebo produkcí protilátek a signifikantní prevenci, supresi nebo léčbu imunitní choroby. Dávky by neměly být příliš vysoké, aby nezpůsobovaly vedlejší účinky,jako je nežádoucí zkřížená reakce, generál isovaná imunosuprese, anafylaktická reakce a pod.

Preferované dávky u lidí jsou v rozsahu 0.001-1 mg/kg tělesné hmotnosti.

Navíc k proteinům předkládaného vynálezu, které jsou samy farmaceuticky aktivní mohou farmaceutické komposice obsahovat vhodný farmaceuticky akceptovatelný nosič obsahující excipienty a auxi1iaria,která usnadňují zapracování aktivní sloučeniny do preparátů,které mohou být užity farmaceuticky.Preferované sloučeniny zahrnují inklusi adjuvans, jako je oxid hlinitý, nebo jiná adjuvans v oboru známá.( Viz. např. Warren et al.,1986,Ann.Rev.Immunol., 4:369-388, Chedid.L,1986, Feder.Proč.,45:2531-2560.)

Ke zvýšení dostupnosti nebo bioaktivity mohou být proteiny inkorporovány do liposomů užitím metod a sloučenin v oboru známých.

Přípravky které mohou být podány orálně ve formě tablet a kapslí, přípravky, které mohou být podány rektálně, jako jsou čípky, a přípravky ve formě roztoků pro injekce nebo orální podání obsahují 0.001 až 99 procent , lépe od 0.01 do procent aktivní sloučeniny , společně s excipientem.

Vhodnými excipienty jsou zejmena plnidla jako jsou sacharidy.například laktosa nebo sucrosa.manitol nebo sorbitol celulosové přípravky a/nebo fosforečnan vápenatý například trikalciurafosfát nebo hydrogenfosforečnan vápenatý,stejně jako pojivá jako škrobová pasta,za užití , například kukuřičného škrobu,rýžového škrobu, bramborového škrobu, želatiny, tragantu, methylcelulosy , hydroxypropylmetylcelulosy.karboxymethylcelulosy sodné a/nebo polyvinylpyrolidonu.

Další farmaceutické preparáty , které mohou být použity orálně zahrnují zasouvací plnící kapsle vyrobené ze želatiny,stejně jako měkké,uzavíratelné kapsle vyrobené ze želatiny a plasticizéry jako je glycerol nebo sorbitol. Zasouvací plnící kapsle mohou obsahovat aktivní sloučeninu ve formě granulí, které mohou být smíchány s plnidly jako je laktosa, pojivý jako je škrob,a/nebo lumbrikanty jako je talek nebo stearát hořečnatý a popřípadě stabilizátory. V měkkých kapslích je aktivní sloučenina preferovaně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodné tekutině,jako jsou mastné oleje,nebo tekutý parafín.Navíc může být přidán stabilizátor.

Možné farmaceutické komposice, které mohou být použity rektálně, například čípky,které se setávají z kombinace jedné či více aktivních sloučenin a čípkové base.Vhodnými čípkovými basemi jsou, například, přírodní nebo syntetické triglyceridy, nebo parafinové uhlovodíky.

Navíc je také možné užít želatinové rektální kapsle,které se skládají z kombinace aktivní sloučeniny s baží. Možnými materiály pro báze jsou, například, tekuté triglyceridy,polyethylen glykol, nebo parafinové uhlovodíky.

Vhodné přípravky pro parenterální užití zahrnují vodné roztoky proteinů ve formě rozpustné ve vodě,například ve formě solí ve vodě rozpustných.Navíc, suspense proteinů může být podána jako injekce vhodné olejové suspense.Vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula zahrnují mastné oleje,například,sezamový olej,nebo syntetické estery mastných kyselin,například etyloleát nebo triglyceridy.Vodné injekční suspense obsahují substance, které zvyšují viskozitu suspense jako, například, karboxymethylcelulosu sodnou .sorbitol, a/nebo dextran. Volitelně může suspense také obsahovat stabi1izátor.

Proteiny jsou připraveny užitím konvenčně farmaceuticky přijatelných vehikul pro injekční podání. Tato vehikula jsou netoxická a terapeut ická,a množství formulací je dáno v Remington^r s Pharmaceutical Sciences (Martin,E.W.,ed.) Mack Publishing Co.Easton,PA (1990).Nelimitujícími příklady excipientů jsou voda, salinický roztok,Ringrúv roztok,roztok dextrosy,a Hankův vyvážený roztok.Formulace podle vynálezu mohou také obsahovat malé množství aditiv jako jsou substance udržující isotonicitu, fyziologické pH a stabilitu.

Proteiny podle vynálezu jsou preferovaně formulovány v purifikované formě ze jména prosté agregátů a jiného proteinového materiálu,preferovaně v koncentraci od l.Ong/ml do 100 mg/ml.

Účinné dávky proteinů tohoto vynálezu pro užití v prevenci, supresí,nebo terapii imunitních chorob jsou v rozmezí od 1 ng do 100 mg/kg tělesné hmotnosti. Preferované rozmezí dávky je od ÍOng do lOmg /kg tělesné hmotnosti. Ještě preferovanější rozmezí dávky je od lOOng do lmg/kg tělesné hmotnosti.

Metody ke zvýšení účinnosti proteinů jsou v oboru známé. Tyto techniky mohou být použity v konjunkci s proteiny předkládaného vynálezu.

Následující příklady jsou nabídnuty pro ilustraci, ale nejsou limitující.

Příklady provedení vynálezu

Následující obecné techniky jsou užity v celých následujících příkladech.

1. Materiál a metody obecně

A. Bakterie, plasmidy a obecné metody

Escherichia coli GM 2929, methylasa negativní, a E coli LJ 24 ( lac delece)(Rasmussen et al.

1991,J.Bacteriology,173:6390-6397) byly darované Dr.Martinem Marinus-em, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA. E.coli JM 109( Yanisch - Peron et al.,1985,Gene,33:103-119) byly získány od Promega Corporation,Madison.WI (USA).BL21 (lon,ompT) (Wood,W.Β.,1966,J.Mo1. Biol.16:118-133,Studier and

Moffatt,1986,J.Mol.Biol.,189:113-130) byly získány od Novagen, Madison,WI(USA).SG 22094 (lon,clp),SG 21163 (lon,htpr)a SG 21173 (Ion,htpr,clp)byly darovány Dr. Susan Gottesman,

National Institutes of Health, Bethesda.MD(USA).Tyto Gotesmanové kmeny měly deleci láci genu.Bakterie byly vytvořeny kompetentními pro transformaci Morrisonovou metodou

1979, Meth.Enzymology,68:326-331, nebo byly získány (DH5 alfa) od GibcoBRL.Gaitherburg,MD(USA).

pKK233-2 (Amann a Brosius,1985,Gene,40:183-190) byl získán od Pharmacia, Piscataway, NJ (USA). pBR322 (Bolivar et al.,1977,Gene, 2: 95-113) byl získán od New England

Biolabs, Beverly, MA (USA). pBluescript II KS+ (Alting-Mees et al.,1992, Meth.Enzymology,216:483 - 495) byl získán od Stratagene,La Jolla.CA (USA). pDC952 obsahující argU(dnaY)gen (Lindsey et al.,1989,J.Bacteriology,171:6197-6250) byl darován Dr.Jamesem R.Walkerem, University of Texas, Austin.TX. pSE 420 (Brosius,1992, Meth.Enzymology,216:469-483) a pKK480-3 (Brosius, (1992) supra) daroval Dr.Jurgen Brosius,Mount Sinai School of Medicine, New York,NY. pUCts (Bukrinsky et al.,1988,Gene,70: 415-417) byl získán od Michaila I.Bukrinskeho přes Jurgena Brosiuse.

Plasmidové konstrukce byly získány standartními procedurami (Sambrook et al..Molecular Cloning:A Laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York (1989)). DNA restrikční a modifikační enzymy byly získány od New England

Biolabs, pokud není uvedeno jinak, a byly užity podle specifikací výrobce. Syntetické oligonukleotidy byly získány od Operon Technologies, lne.,Alameda,CA (USA),není-1i uvedeno jinak. Oligonukleotidy byly tepelně zpracovány smíšením ekvimolárních koncentrací komplementárních oligonukleotidů v 10 mM Tris pH 8.0, 5 mM MgCH a umístěny ve 100 °C na 5 min a potom pomalu ochlazovány na 25 °C.Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla provedena (Saiki et al.,1988,Science,239:487-491) v zařázení Perkin Elmer Cetus

DNA Thermal Cykler,užitím Gene Amp reagent kitu ( The Perkin

- Elmer Corporation, Norwalk.CT (USA)). DNA sekvencování využívá dideoxynukleotidovou řetězovou terminační metodu (Sanger et al., 1977, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 74:5463-5467) užitím Sequenase kitu (U.S.Biochemical, Cleveland, OH (USA)). Všechna chemická reagens byla nejvyšší dosažené čistoty.

B.Růst a indukce buněčných kultur

Pro chemicky indukované kultury bylo použito zmražených glycerolových živných roztoků k inokulování 5-25 ml 2XYT media ( 16 g Bacto- Tryptone(Difco 0123),10 g Bacto- Yeast extraktu (Difco 0127),lOg NaCl.pH 7.2-7.4, na litr vody) obsahující 6 pg/ml tetracyklinu,které byly kultivovány přes noc při 37 °C, 280 rpm. 1/100 objemu kultivované kultury pak byla užita k inokulování do každé ze dvou 125ml lahviček obsahujících 25 ml 2XYT media plus 6 pg/ ml tetracyklinu. Kultury rostly při 37°C,280rpm dokud Aseo nebylo 0.5-1.0 absorbančních jednotek,a pak indukovány 1 mM isopropyl-p-D-thiogalactopyramosidu (IPTG), a kultivovány další 2 hodiny.

Pro termální indukci kultury rostly při 30 °C,280 rpm dokud Aseonebylo 0.5-1.0 absorbančních jednotek.Potom byla jedna kultura udržována při 30 °C, a jiná byla indukována přesunutím do vodní lázně o 42 °C,a pak kultivována 2 hodiny.Alternativně byla kultura indukována růstem při 30 °C dokud A580 nebylo 0.3-0.6 absorbančních jednotek a potom byla rozdělena na dva stejné díly, jeden byl udržována na 30 °C a druhý byl kultivován při 42 °C.

K vyzkoušení výsledků indukce byly odebrány duplikátní vzorky ekvivalentní 1 ml buněk při As80= 1.0 (tj.

předpokládané As8O=3.0, pokud bylo odebráno 333 pl kultury).

Vzorky byly centrifugovány na Eppendorfově mikrocentrifuze při 14,000 x g,l min, supernatant byl odstraněn a buněčné pelety byly uskladněny při -20 °C.

C. Stabilitní studie

Bakterie byly postupně naočkovány do jednotlivých kolonií a jednotlivé kolonie ze tří ploten byly inokulovány do 200 ml XYT media obsahujícího 6 pg/ml tetracyklinu. Kultura rostla do A580= 0.5-1.0 absorbančních jednotek, a 60 ml bylo odebráno, smícháno se 40ml glycerolu a 1 ml alikvoty byly rozděleny do 100 lahviček k uskladnění při -80 °C.Zbytek kultury byl rozdělen do dvou alikvotních částí: jedna byla inkubována neindukovaná a druhá byla indukovaná přidáním IPTG nebo posunem teploty. Obě kultury rostly další dvě hodiny. Vzorky ekvivalentní lml kultury při As80= 1.0 byly odebrány před a 2 h po indukci, a zkoušeny na Asso absorbanci, pH a produkci proteinů EIA, akrylamidovou gelovou elektroforesou a Western blottingem.

Tři lahvičky ze zmražené banky byly testovány paralelně na bakteriální růst a produkci proteinů. Každá lahvička (lml) byla užita k inokulací 200ml 2XYT media plus 6 ug/ml tetracyklinu, a inkubována do As80=0.5-1.0 absorbančních jednotek. Potom byla kultura rozdělena do dvou alikvotních částí,jedna byla inkubována neindukovaná, a druhá byla indukována chemicky nebo termálně.Vzorky ekvivalentní lml kultury při As8O=1.0 byly odebrány z obou kultur před a 2 h po indukci a zkoušeny jak je popsáno výše.

Pro stabilitní studie byly odebrány 1 ml alikvoty z jedné ze tří paralelních kultur před indukcí, ředěny 1/1000 v 2XYT mediu a 20 μΐ nebo 200 μΐ bylo inokulováno do 200 ml 2XYT media plus tetracyklin, a kultivováno do A580=0.5-i.0 absorbančních jednotek. Potom byla kultura rozdělena do dvou alikvotních částí, jedna byla indukována,a obě byly kultivovány další dvě hodiny.Vzorky ekvivalentní lml kultury při As80=1.0 byly odebrány před a 2 h po indukci a zkoušeny jak je popsáno výše.

D. Frakcionace buněk.

Buňky byly peletovány centrifugací 7000 x g, 7 min a supernatant (kultivační medium) byl recentrifugován při 14000 x g , 5 min, před elektroforesou. Buněčné pelety byly resuspendovány ve 20% (hmotn./objem) sacharoze, 0.3 M Tris-HCl pH 8.0,lmM EDTA za užití 1/5 inicialního objemu kultury, inkubovány při 25 °C 15 min a centrifugovány při 6000 x g, 7 min. Supernatant byl oddělen a proteiny uložené v periplasmě byly uvolněny osmotickým šokem (Nossal and Heppel,1966,J.Bio 1.Chem., 241:3055-3062) resuspendováním do 1/5 orginálního objemu studené vody a inkubováním při 0 °C , min.Po centrifugací při 9000 x g,10 min byl odebrán supernatant (periplasmatická frakce), buněčné pelety byly resuspendovány do IX TST (25 mM Tris-HCl pH 8.0,200 mM NaCl, lml EDTA, lOml/litr Tween 20), rozrušeny ultrazvukem , centrifugovány při 12000 x g ,15 min a supernatant byl uložen (solubilní frakce cytosolu).

E. Polyakrylamidová gelová e1ektroforesa

Zmražené buněčné pelety E. colui byly resuspendovány v 70 μΐ vody intensivním vortexováním nebo sonikací při 0 °C (Sonic Dismembrator.Model 301, ARTEK Systems Corporation) třikrát vždy po dobu 5 sekund, při nastavení síly 0.4.

Rozrušené buňky byly smíchány s 70 μΐ 2X plnícího pufru(125mM

Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% glycerol, 10% β-merkaptoetanol, 0.002% bromfenolová modř) (Laemmli,

1970,Nátuře,227:680-685).Vzorky byly inkubovány při 100 °C, 5 min, centrifugovány při 14000 x g, 30 sekund a 10-15 μΐ alikvoty byly zavedeny do připraveného 16% nebo 10—20% akrylamidového Tricine gelu ( Novex, San Diego,CA(USA)) a vyvíjeny v reservoárovém pufru od stejné firmy. Elektroforesa byla při konstantním napětí 125 V, nebo 45 mA konstantního proudu, na dva gely, asi 2 h, dokud bromfenolové modré barvivo nebylo na konci gelu. Markéry byly předem označené standardy proteinů nízké molekulární hmotnosti (SE 130024, Integrated Separation Systems, Nartick.MA (USA)) užité v 1 μΐ na dráhu. Gely byly barveny přes noc v 10% kyselině octové, 25% metanolu, 0.025% Coomassie Briliant Blue R.

F. Western blott analysa

Po separaci SDS-PAGE byly proteiny imunodetekovány (Towbin et al1979,Proč.Nat1.Acad. Sci.USA,76:4350-4354) pomocí elektrotransferu do polivinyliden difluoridových (PVDF) membrán (Immobilon-P,Mi11ipore,Bedfort,MA(USA)) užitím Semi-Dry elektroblotteru ( Integrated Separation Systems). Proteiny byly transferovány při 10 mA na cm² membrány 1-3 h a membrány byly blokovány přes noc v blokujícím pufru (IX PBS,2% sušené mléko,0.1% Tween-20).

Membrány byly promývány třikrát, pokaždé 5 min v IX PBS,

0.1% Tween-20,nás ledovalo trojí promývání , pokaždé 5 min. v IX PBS a pak byly ponořeny do křenová peroxidasa (HRP)-konjugovaná monoklonální anti-V β 5.3 protilátka (13A2-HRP,0.25 mg/ml) ředění 1:3000 v 1 X PBS, 0.1%

Tween-20. Po jemném promíchání po dobu 2 hodin byly membrány promývány jak je popsáno výše, a proteiny byly visualisovány

Enhanced Chemiluminiscence assay (Amersham, Arlington

Heights,IL(USA)) podle instrukcí výrobce. Exposice filmu byla od 5 sekund do 1 minuty.

G. Enzymová immunoesej.

Zmražené buněčné pelety byly resuspendovány intensivním vortexováním v 20 μΐ 8M močoviny Tris-HCl,pH 8.5,(Marston and Hartley,1990, Meth.Enzymology,182:264-276) a VP 5.3 byl kvantifikován enzymoimunoesejí následovně:

Nunc Immuno Maxisorp plotny (VWR 62409-002) byly potaženy 100 μΐ/jamku 4C2 IgG v 4 pg/ml v PBS,a přes noc uskladněny při 4 °C. Potahovací roztok byl odstraněn a blokující pufr ( 1% kaseinový hydrolysát v PBS,0.05% Tween-20) byl přidán v množství 200 μΐ/jamku. Plotny byly inkubovány při pokojové teplotě 2 h, 150 rpm a potom promývány 3x promývacím pufrem (PBS,0.05% Tween - 20). Vzorky (ředěné 1/2000 nebo 1/32000) a νβ 5.3 standardy v blokujícím pufru byly přidány v množství 100 μΐ/jamku, a inkubovány při pokojové teplotě 90 min, 150 rpm.Plotny byly promývány 3x promývacím pufrem,a

HRP-konjugáty anti-VP 5.3 monoklonální protilátky (13A2-HRP) ředěné 1/500 v blokujícím pufru plus fetální hovězí sérum byly přidány v množství 100 μΐ/jamku (0.5 pg/ml). Plotny byly inkubovány při pokojové teplotě 90 min, 150 rpm, třikrát promývány a byl přidán O-feny1enediamin (OPD) substrát v množství 100 μΐ/jamku. Po 30 minutách byla reakce ukončena přidáním 50 μΐ 2N H2SO4 na jamku. Absorbance byla měřena při 490 nm minus absorbance pozadí při 650 nm. Prázdné jamky neobsahovaly vzorek.

2. KONSTRUKCE PLASMIDŮ

Příklad 1

Konstrukce pK2D

Prvním bodem pro expresi proteinů V regionu antigenního receptorů T buněk vynálezu byla konstrukce plasmidů, který obsahuje vlastní regulační elementy pro expresi proteinů V regionu antigeního receptorů T buněk. Tyto elementy zahrnují promotor, dva terminátory transkripce, zdroj replikace pro stabilní replikaci v bakteriích. Navíc, protože jsou regulační oblasti asociované s výrobou proteinů, pro které je možnou indikací použijí in vivo v terapeutické podobě, byl vybrán gen kódující resistenci na tetracyklin pro usnadnění selekce plasmid nesoucích buněk.Konečně , úvodní expresní vektor vyžaduje multiplikovatelné klonující místo, strategicky umístěné k usnadnění klonování preferovaných kódujících regionů vynálezu do expresního vektoru.Následující příklad popisuje unikátní úvodní plasmid vynálezu.

Prvním bodem konstrukce preferovaného expresního vektoru byl pKK233-2 (4.6 kb) , popsaný infra. Ncol restrikční místo bylo konvertováno na Spěl místo následovně: pKK233-2 byl natráven Ncol a výsledný 5^přesahující konec byl odstraněn inkubací s mung beán nukleasou při 25 °C po 30 min.Plasmidy byly extrahovány dvakrát fenol-chloroformem, precipitovány etanolem v přítomnosti 2 M octanu amonného, a resuspendovány ve vodě.Po defosforylaci bakteriální alkalickou fosfatásou (GibcoBRL) byl vektor ligován na syntetický Spěl linker ( 1085,New England Biolabs) a ligační směs byla transformována do DH5a kompetentních buněk k získání vektoru pKK233-2A.

Dále byl tetracyklinový gen znovu zaveden následovně :

pKK233-2A (4.6 kb) byl natráven EcoRI a Sall za získání dvou fragmentů, 279 bp a 4321 bp. Dva fragmenty byly separovány gelovou elektroforesou na agarose, a delší fragment byl purifikován z agarosy užitím Geneclean kitu (BIO 101,La Jolla,CA(USA)). 651-bp fragment obsahující amino-terminální kódující region tetracyklinového genu byl excidován EcoRI a Sall z pBR322, a ligován na 4321-bp fragment pKK233-2A.Výsledný plasmid pK2B (4,97 kb) dával resistenci na tetracyklin E. coli DH5a buňkám, a byl dále modifikován k deleci části β-laktamasového genu a konversi HindlII místa do SacII místa následovně:

DNA fragment v rozsahu od jediného Spe I místa do 3Γ konce transkripčního terminátoru byl PCR syntetizován užitím pK2B jako templátu.5* sense primer obsahoval následující rozpoznávající sekvenci pro Spel.Pstl a SacII v 5f-3f· směru:

51- TATAATGACTAGTCGCTGCAGCCAACCGCGG-3^r (SEQ ID NO 1)

3fantisense primer obsahující Seal místo podtržen:

5'- GTCCTAGAGTACTGAGCGGATAC - 3Γ (SEQ ID NO 2) ng pKB DNA templátu byl smíchán v reakčním objemu obsahujícím 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl₂,100 pg želatiny, 200 každého deoxynukleotidu (dATP,dCTP,dGTP,dTTP),1 μΜ každého ze dvou primerů,a 2.5 jednotkou AmpliTaq DNA polymerasy. Finální reakční objem byl 100 μΐ,překrytý 100 μΐ minerálního oleje.DNA byla denaturována při 95 °C 2 min, a amplifikace byla dosažena 30 cykly 1 min denaturace při 95 °C, 1 min při 60 °C pro tepelné zpracování a 1 min při 72 °C pro extenzi primeru. Amplifikovaná DNA byla analyzována na 1% agarosovém gelu v 40 mM Tris-HCl pH 7.8,5 mM Na Acetatu.l mM EDTA.

Výsledný 485-bp PCR syntetizovaný fragment byl tráven Spěl a Seal, a ligován na 4129-bp fragment , který byl získán digesci pK2B Spěl a Seal za vytvoření plasmidu nazvaného pK2C.

Plasmid pK2C (4.6 kb) byl dále modifikován tak , aby obsahoval multiplikované klonující mí sto.Nejprve byl pK2C natráven Spěl a SacII a ligován na dvojřetězcový syntetický oligonukleotid obsahující 15 restrikčních míst.Toto multiplikované klonující místo (MCS) bylo formováno tepelným zpracováním ekvimolárních koncentrací dvou komplementárních syntetických oligonukleotidů,91 a 97 bp dlouhých,majících následující sekvenci:

5' - GGCTCGAGCCTAGGCTGCAGCCCGGGGCGCGCGCGGCCGCAGGCC TTTAATTAAGAGCTCCGGACCGCACAATGTGGGCGCGCCCTTAAGA - 3' [SEQ ID NO 3]

5' - CTAGTCTTAAGGGCGCGCCCACATTGTGCGGTCCGGAGCTCTTAA TTAAAGGCCTGCGGCCGCGCGCGCCCCGGGCTGCAGCCTAGGCTCGAG CCGC - 3' [SEQ ID NO 4]

MCS kóduje následující místa pro restrikční enzymy: Spěl, AflII, AscI, DralII, Rsrll, Sací, PacI, Stul, Notl, BssHII, Xmal, Pstl, AvrlI, Xhol a SacII. Ligační směs byla transformována do metylása-negativní E. coli GM2929. Výsledný plasmid pK2D (4.67 kb) byl částečně sekvencován ,aby se zajistila integrita in vitro syntetizovaných regionů.

Výsledky

Počátečním plasmidem byl pKK233-2, který obsahoval následující elementy:trc promotor (Brosius et al.,(1985) supra),který je podobný tac promotoru odvozenému fúsí 10 i,.,.

regionu lacUV5 promotoru s -35 regionem tryptofanového promotoru (de Boer et al.,(1983),supra, Amann et al.,(1983), supra). Plasmid také obsahuje ribosomové vazebné místo následované klonujícím místem pro tři unikátní restrikční enzymy (Ncol,Pstl a HindlII), následované transkripčními terminátory rrnB ribosomálního RNA operonu

E.coli ( Brosius et al.,1981.Plasmid,

6:112-118).Navíc,pKK233-2 obsahuje β-laktamosový gen pro ampici1inovou resistencí,pBR322 zdroj replikace,a malý nefunkční karboxy - terminální fragment z genu tetracyklinové resistence.

pKK233-2 byl modifikován tak, aby bylo zrušeno Ncol místo, obnoven gen tetracyklinové resistence, oddělen segment β-latamasového kódujícího regionu (tak inaktivujíc gen),a připojeno multiplikované klonující místo sestávající z 15 restrikčních míst, a tak byl vyprodukován pK2D.

Příklad 2

Plasmid pK2D byl dále modifikován k inkorporování bud pelB signální sekvence z Erwinia carotovora (Lei et al.,1987,J.Bacteriology,169:4379-4383) ,nebo terraostabilni enterotoxin II (STII) signální sekvence z Escherichía coli ( Morioka - Fujimoto et al1991,J.Biol.Chem.,266:1728-1732)

Konstrukce pK-pelB

Plasmid pK2D (4.67 kb) byl následovně zpracován tak, aby zahrnoval ribosomové vazebné místo ( Shine et Dalgarno,1974 Proč.Nat1.Acad.Sci. USA,71:1342-1346,Shine et Dalgarno,

1975, Nátuře,254:34-38,Steitz and

Jakeš,1975,Proč.Nati.Acad.Sci.USA,72:4734-4738) a pelB signální sekvenci z E.carotovora (Lei et al.,(1987)supra) k vytvoření plasmidu pK-pelB (4.74 kb) :

pK2D byl tráven Spěl a Sací umístěnými v MCS, a vektor byl ligován do dvou komplementárních syntetických oligonukleotidu,103bp a 95bp dlouhých,majících sekvence uvedené níže. Tiché mutace (malá písmena) byly uvedeny do pelB sekvence,aby se vytvořila Ncol restrikční místo (podtržené),a tak se usnadnilo následné subklonování νβ 5.3 genové sekvence.

! 5' - CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATACC ^! TATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCA

GGcATGGGCGAGGT - 3' [SEQ ID NO 5]

5' - CGGGCATgGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCT GCCGTAGGCAATAGGTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGA ATTTA - 3' [SEQ ID NO 6]

Konstrukce pK-STII

Plasmid pK2D byl následně zpracován tak, aby obsahoval ribosomové vazebné místo a signální sekvenci termostabilního enterotoxinu (STII) E.coli (Morioka -Fujimoto et al.,(1991),supra):

pK2D byl tráven Spěl a DralII umístěnými v MCS a vektor byl ligován do dvou komplementárních syntetických oligonukleotidů,105bp a 98bp dlouhých,majících sekvence uvedené níže. Tiché mutace (malá písmena) byly uvedeny do STII sekvence, aby se vytvořila Mlul a DralII restrikční místa (podtržená),a tak se usnadnilo následné subklonován! Vp 5.3 genové sekvence.

5’ - CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAAAAGAA TATAGCATTCCTACTAGCTTCAATGTTCGTCTTCTCTATTGCAACTA ACGCgTACGCaCATT - 3* [SEQ ID NO 7]

5' - GtGCGTAcGCGTTAGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGCT AGTAGGAATGCTATATTCTTTTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATA GAATTTA - 3’ [SEQ ID NO 8]

Příklad 3

Plasmidy obsahující signální sekvence z Příkladu 2 supra byly dále modifikovány tak,aby obsahovaly dva regulační elementy.

Konstrukce pKT-pelB

Plasmid pK-pelB byl dále modifikován k vytvoření pKT-pelB (4.8kb) tak, aby obsahoval dva regulační elementy upstream od pelB leaderu.Tyto elementy jsou translační enhancery z bakteriofágového T7 genu 10 (glO), mini-cistron ATG TAT CGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA (SEQ ID NO.28),kódující pro 8 aminokyselinový zbytek. Inserce dvou regulačních elementů byla dosažena digescí pK2D Spěl a Sací, následovanou ligaci vektoru do syntetických oligonukleotidu kódujících pro glO sekvenci, ribosomové vazebné místo, mini-cistron a pelB leader,v 5^- 3^ směru. Oligonukleotidy byly syntetisovány jako dvě komplementární sady 71-89 merú, které mohou být ligovány cestou komplementárních 9bp přesahů mezi páry oligonukleotidů. Dva komplementární páry oligonukleotidů byly označeny pár A (oligos J5A+J6A,89bp a 76bp) a pár B (oligos J5B + J6B,71bp a 76bp),a mají následující sekvenci:

J5A

5’ - CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAA

AGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA - 3' [SEQ ID NO 9] J6A

5' - CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTA

ATAATAAAGTTAATCGATGCCCAATTCCGGA - 3' [SEQ ID NO 10]

J5B

5’ - ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC

GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGCT - 3' [SEQ ID NO 11]

J6B

5’ - CGGCCATGGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTG CCGTAGGCAATAGGTATTTCATTATTTATTC - 3' [SEQ ID NO 12]

Konstrukce pKT-STII

Plasmid pK-STII byl dále modifikován k vytvoření pKT-STII (4.8kb) tak,aby obsahoval stejné dva regulační elementy jako pKT-pelB. pK2D byl tráven Spěl a DralII a vektoru byl ligován do syntetických oligonukleotidů kódujících pro glO sekvenci,ribosomové vazebné místo, mini-cistron a STII leader,v 5^r- 3^r směru.Oligonukleotidy byly syntetisovány jako dvě komplementární sady 73-89 merů,které mohou být ligovány cestou komplementárních 9bp přesahů mezi páry oligonukleotidů

Dva komplementární páry oligonukleotidů byly označeny pár

A ( oligos J5A+J6A,89bp a 76bp) a pár B (oligos J5C + J6C, 73bp a 76bp),a mají následující sekvenci:

J5A

5’ - ctagtccggaattgggcatcgattaactttattattaaaaattaa AGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA - 3' [SEQ ID NO 9] J6A

5' - CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTA

ATAATAAAGTTAATCGATGCCCAATTCCGGA - 3' [SEQ ID NO 10]

I5C

5' - ATGAAAAAGAATATAGCATTCCTACTAGCTTCAATGTTCGTCTT

CTCTATTGCAACTAACGGGTACGCACATT - 3' [SEQ ID NO 13]

J6C

5' - GTGCGTACGCGTTAGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGC

TAGTAGGAATGCTATATTCTTTTTCATTATTTATTC - 3' [SEQ ID NO 14]

Příklad 4

Konstrukce pK-pelB-Vp 5.3

Dalším krokem v expresi proteinů VP 5.3 antigeního receptoru T buněk byla inkorporace Vp 5.3 sekvence do plasmidů obsahujících signální sekvence jak je popsáno v Příkladu 2 supra.

Kompletní nukleotidová sekvence Vp 5.3 byla generována následovně: DNA sekvence VP 5.3 klonu 12A1 byla originálně publikována Leidenem et al.(Proc. Nati. Acad. Sci.

USA,83:4456-4460) a později částečně opravena ( Leiden et al.,1986,Molec.Cell Biol.,6:3207-3214). Tento klon 12A1 postrádal nukleotidy kódující pro čtyři N-terminální aminokyselinová residua,a navíc, vyvozená N-terminální aminokyselinová residua klonu 12AÍ nebyla správná.

N-terminální aminokyselinové sekvence Vp 5.3 (HPB-ALL) byly publikované Jonesem et al., 1985, Science,227:311-314)bez specifikace prvního N-terminálního aminokyselinového zbytku, který bylo později určen jako glycin (Jeff Leiden,nepublikováno). Užitím dřívějších informací o sekvenci byl rekonstruován kompletní VP 5.3 rekombinantními DNA technikami. Výsledný piasmid (pBB-Vp 5.3) byl zdrojem VP 5.3 sekvence pro následující příklady.Kompletní nukleotidová sekvence kódující pro Vp 5.3 a předpokládaná aminokyselinová sekvence byly publikoval nověji Plaza et al.,(1991,

J.Immunol.,147:4360-4365).(Viz.také Obr.l,SEQ ID NOS. 25,26 a 27 zde).

Vp 5.3 byl PCR syntetizován užitím pBB-Vp 5.3 (6.2kb) jako templátu. 5f sense primer obsahoval místo pro restrikční enzym Ncol (podtržené):

5Γ - TAATTAGCCATGGCCGGCGTAACCCAATCTCCG - 3' [SEQ ID NO 15]

3^r antisense primer byl komplementární k regionu downstream od Pstl místa vektoru:

5Γ- CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC -3' [SEQ ID NO 16]

Výsledný VP 5.3 fragment byl tupě zakončen užitím Klenow fragmentu DNA polymerasy I, a ligován do defosforylovaného EcoRV místa pBluescript II KS+ za získání plasmidů pBL-pelB-VP 5.3. Vp 5.3 insert byl excidován digescí Ncol a Pstl, purifikován z agarosy, a ligován do Ncol a Pstl míst pK-pelB,za získání plasmidů pK-pelB-Vp 5.3 (5kb).

Konstrukce pK-STII-Υβ 5.3 νβ 5.3 byl PCR syntetizován užitím ρΒΒ-νβ 5.3 (6.2kb) jako templátu. 5¹ sense primer obsahoval místo pro restrikční enzym Mlul (podtržené):

5f - GAAATTAACGCGTACGCAGGCGTAACCCAATCTC -V [SEQ ID NO 17]

3^ř antisense primer byl komplementární k regionu downstream od Pstl místa vektoru:

5[ - CCAGTGCCAAGCTTGCATGCG -37 [SEQ ID NO 18]

Výsledný νβ 5.3 fragment byl tupě zakončen užitím Klenow fragmentu DNA polymerasy I, a ligován do defosforylovaného EcoRV místa pBluescript II KS+ za získání plasmidú pBL-STII-νβ 5.3(5 kb).

Konstrukce _PK-STII-VB5.3 νβ5.3 byl PCR-syntetizován za použití ρΒΒ-νβ5.3 (6,2 kb) jako templátu. 5'-sense primer, obsahující Mlul restrikční enzymové místo, podtrženo:

5' - GAAATTAACGCGTACGCAGGCGTAACCCAATCTr - 3' [SEQ ID NO 17]

3'antisenseprimer byl komplementární k downstream oblasti Pstl místa ve vektoru:

5' - CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC - 3' [SEQ ID NO 18]

Výsledný νβ 5.3 fragment byl tupě zakončen Klenovowým fragmentem DNA polymerasy I a ligován do deforforylovaného

EcoRV místa pBluescript II KS+ za získání plasmidú pBL-STII-VB5.3. νβ5.3 insert byl excidován digesci Mlul a Pstl, purifikován z agarosy, a ligován do Mlul a Pstl míst pK STII za získání plasmidu pK-STII-VP 5.3 (5kb).

Výsledky νβ 5.3 fušovaný s pelB nebo STII leadery byl exprivován v E.coli JM 109 (tabulka 1).Indukce byla 2 h a výtěžky νβ

5.3 byly měřeny EIA.

Tabulka 1

Exprese a kompartmentace νβ5.3 i

! pK-pelB-VB5.3 pK-STII-VD5.3

Kompartment	0 mM IPTG	1 mM IPTG	OmMIPTG	1 mM IPTG
Supernatant	0 pg/ml	1.3 pg/ml	0.5 pg/ml	2.2 pg/ml
Periplasnu-	0.9	4.6	N.D.	5.5
Cytosol	9.9	mimo stupnici (1:40)	2.0 mimo -í stupnici (1

Oba leadery byly funkční, ačkoliv většina exprivovaného proteinu byla lokalisována intracelulárně.

Příklad 5

Tento příklad upřesňuje plasmid obsahující leader sekvenci a dva regulační elementy (glO a mini-cistron) , jakož i νβ

5.3 sekvenci.

Konstrukce pKT-pelB-νβ 5.3

Plasmid pKT-pelB-νβ 5.3 byl konstruován excisí νβ 5.3 insertu z _PK-_PelB-V0 5.3 užitím Ncol a Pstl , a ligací do Ncol a Pstl míst pKT-pelB.

Konstrukce pKT-STII-V0 5.3

Plasmid pKT-STII-V0 5.3 byl konstruován podobně excisí V0

5.3 insertu z pK-STII-V0 5.3 užitím Mlul a Pstl a ligací do Mlul a Pstl míst pKT-STII.

Všechny následující plasmidové konstrukty užívají STII signální sekvenci. Proto tam, kde není signální sekvence specifikována, je myšleno užití STII sekvence.

Výs1edky pKT-V0 5.3

Plasmid pK-STII-V0 5.3 (Příklad 4) byl modifikován tak, aby obsahoval dva regulační elementy upstream od STII leaderu, a tak vytvořil pKT-V0 5.3. Těmito elementy jsou translační enhancer z bakteriofágového T7 genu 10 (glO), a mini-cistron kódující 8 aminokyselinových residuí.U obou elementů bylo demonstrováno, že zvyšují účinost translace mnohých genů (Schoner et al.,1984 Proč. atl. Acad. Sci.

USA,81:5403-5407, Schoner et al.,1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA,83:8506-8510, Olins et al.,1988, Gene,73:227-235,01ins a Rangwala,1989,J.Biol.Chem.,264:16973-16976).

pKT-VP 5.3 poskytoval 8 krát vyšší proteinový výnos než pK-STII-Vp 5.3 (Příklad 4) v E.coli JM109 za podmínek IPTG indukce.Uvedené EIA hodnoty jsou přibližné vzhledem k nedostupnosti čistých V0 5.3 standartú v této době.pKT-V0

5.3 se ukázal stabilním v E. coli JM109.

Příklad 6

Konstrukce pKTB-Vp 5.3

Další modifikace pKT-VP 5.3 (Příklad 5) pro sekretovanou expresi vyžadovala eliminaci potřeby IPTG pro indukci.Existence laclts genu kódujícího pro teplotně sensitivní lac represor (Bukrinsky et al.,1988, Gene,70:415-417) umožnila kontrolu genové exprese z trc promotoru zvýšením teploty z 30 °C na 42 °C. Toto by mělo předejít potřebě užití IPTG nebo bakteriálních kmenů nesoucích láci nebo lacls geny.

laclts gen byl excidován z pUCts digesci EcoRI.1.7 kb fragment obsahující celý laclts kódující region a jeho asociované regulační elementy,doprovázené vektorovou sekvencí, byly tupě zakončeny Klenowem, a ligovány do defosforylovaného Seal místa,lokal izovaného downstream od rrnB operonu v pKT-VP 5.3,za vzniku plasmidu pKTB-VP 5.3 (6.8kb).Orientace laclts genu byla určena restrikčním mapováním.

Výs1edky laclts gen byl insertován v jedné nebo druhé orientaci downstream od rrnB transkripčních terminátorů v pKT-Vp 5.3 za vytvoření pKTB-Vp 5.3 (Obr.2).Tento byl exprivován v E.coli LJ24 (láci delece) a protein byl analyzován Coomassie Blue barvením na akrylamidovém gelu (Laemmli,(1970),supra) a Western blotem (Towbin et al.,(1979),supra).Jedna orientace laclts genu(transkripční směr směrem k Amp³regionu) jasně vedla k vyššímu výnosu Vp 5.3 než reversní orientace.

Putativní Vp 5.3 proužek získaný z extraktů všech buněčných pelet byl elektrotransferován do Immobilon-P membrán a visualisován Coomassie Blue barvením.Proužek byl excidován a podroben NH2- terminálnímu aminokyselinovému sekvencování (Matsudaira ,1987,J.Biol.Chem.,262:10035-10038) za výnosu všech 10 aminokyselinových residuí. Toto precisně ukázalo sekvence N-terminálních 10 aminokyselinových residuí zpracovaného Vp 5.3, t.j. žádné leader sekvence nebyly detegovány.

Plasmid byl také exprivován termální indukcí ve třech různých bakteriálních kmenech,kde každý z nich obsahoval vyšší hladiny endogeního lac represoru,t.j. LJ24<DH5 alfa<JM109. Supernatanty z indukovaných kultur byly zkoušeny na Vp 5.3 expresi EIA (Tabulka 2).

Tabulka 2 ρΚΤΒ-νβ5.3 exprese v různých bakteriálních kmenech

Buňky byly indukovány 2 h a výtěžky VP5.3 (pgml) byly měřeny v supernatantu kultury

Plasmid regulace	E.coli	host. indukce	neinduk.	induk.
pKTB-Vp5.3	laclts	JMI 09 (lacP)	42°C	N.D.		0.5
ρΚΤΒ-νβ5.3	laclts	DH5<x (láci)	42°C	N.D.		5.0
ρΚΤΒ-νβ5.3	lachs	LJ24 (álacl)	42°C	N.D.		5.2
pKT-Vp5.3	lacF	JMI 09	2mM IPTG	0		0.9
pKT	lacF	JMI 09	. 42°C	N.D.		0

Data jsou v souladu s Western blot pozorováním a předpokládanými výs1edky,t.j. vyšší expresní hladina byla dosažena v LJ24 ( láci) a nižší v JM 109 (lacls).Poměrně nízká množství Vp 5.3 měřená v supernatantu kultury vycházejí z faktu , že E.coli běžně nesecernuje proteiny do media.Jak ukazuje Tabulka 1,většina exprivovaného νβ 5.3 je zadržována v periplasmě.

DNA sekvencování laclts genu

Celá kódující sekvence teplotně indukovatelného laclts genu plus upstream 80 nukleotidů včetně promotoru byla sekvencována a srovnána s publikovanými sekvencemi IPTG-indukovatelného láci genu (Farabaugh,1978,Nátuře,274:765-769). Promotorový region byl identický k témuž u láci, ale ne lacH genu (Calos M.P,1978, Nátuře, 274:762-765).

laclts genová sekvence vykazovala otevřený čtecí rámeček 1080 nukleotidů kódujících 360 aminokyselin, a lišila se od lad genu v nukleotidu #559 (s odkazem na první nukleotid start kodonu),který byl změněn z G na A,tak způsobujíc změnu aminokyselinového zbytku #187 z glycinu (GGC) na serin (AGC).Tato změna jediného aminokyselinového zbytku uděluje termální sensitivitu lac represorovému proteinu.

Navíc, publikované sekvence láci genu (Farabaugh, (1978)supra),stejně jako sekvence objevená v Genebank (lokus ECOLAC) obsahují chybu v posici #857 :nukleotid #857 by měl být T místo C, který by měl tvořit zbytek #286 kódující pro Leucin (TTA) místo Šeřinu (TCA). Přechod C-T vkládá Hpal místo do 3* konce láci genu, který byl dříve ukázán restrikčním mapováním (Brosius,1992. Meth. Enzymology.,216:469-483).Mělo by být zmíněno, že u Farabaugha,(1978) supra, je stejný kodon (TCA) chybně popsán jako kódující Leucin místo Šeřinu.

Příklad 7

Konstrukce pKTB

Plasmid pKTB-Vp 5.3 (6.7kb) byl tráven Sáli a Pstl , a 5.42kb fragment byl purifikován z agarosy užitím Geneclean Kitu (BIO 101). Plasmid pKT-STII (4.8kb) byl tráven Sáli a Pstl a l.lSkb fragment byl podobně purifikován a ligován na 5.42kb fragment za vzniku plasmidu pKTB (6.56kb).

Příklad 8

Konstrukce ρΚΒ-νβ 5.3

Tento plasmid je identický k pKTB-VP 5.3 minus dva regulační elementy,t.j. glO translační enhancer a mini-cistron.Plasmid pKTB (6.56kb) byl tráven Sáli a Pstl a větší fragment (5.4kb) byl purifikován z agarosy užitím Geneclean Kitu (BIO 101).Plasmid ρΚ-Vp 5.3(4.9kb) byl tráven Sáli a Pstl a 1.3kb fragment byl stejně purifikován a ligován na 5.4 kb fragment za vzniku plasmidu pKB- νβ 5.3 6.7kb).

Výsledky pKB-Vp 5.3

Jak je diskutováno výše, přidání dvou regulačních elementů,t.j.glO genového segmentu a mini-cistronu vykazuje zvýšení Vp 5.3 výnosu za podmínek IPTG indukce.Chtěl i jsme odstranit tyto dva elementy z pKTB-VP 5.3 vektoru a znovu přezkoušet výnos za podmínek termální indukce.Srovnání pKTB-Vp 5.3 a pKT-Vp 5.3 akrylamidovou elektroforesou a Western blottingem ukázalo,že výnos νβ 5.3 byl neovlivněn odstraněním těchto dvou elementů.EIA měření ureových extraktů celých buněk ukázalo,že pKB-Vp 5.3 produkuje více proteinu než ρΚΤΒ-νβ 5.3 ,je-li exprivován v E.coli LJ24.

Tabulka 3

Exprese Vp5.3 v různých bakteriálních kmenech

Piasmid	LJ2 4	SG22094	SG21163	SG21173
PKT3-VB5.3 + leader + glO/MC	SO	80	20	30
pK3-Vň5.3 + leader - glO/MC	110	50	40	20
pKT3i-Vň5.3 - leader + glO/MC	6	100	100	100
pX3i-V35.3 - leader	10	170	130	390

-glO/MC indukční perioda: 2 h při 42 °C objem kultury: 25 ml

Leader? STII glO: T7 genlO

MC: minicistron vzorky: extrakty celých buněk moči

Vp5.3 výtěžky (mg/litr), založené na jednotky/ml aproximací, měřeno pomocí EIA. 1 mg Vp5.3 je přibližně ekvivalentní 1 x 10⁷ jednotek.

Plasmid pKB-νβ 5.3 byl demonstrován stabilním pro fermentaci

Příklad 9

Konstrukce pKB

Plasmid pKTB (6.56kb) byl tráven Sall a Pstl , a velký fragment (5.4kb) byl purifikován z agarosy užitím Geneclean Kitu (BIO 101). Plasmid pK-STII (4.75kb) byl tráven Sall a Pstl a 1.1 kb fragment byl podobně purifikován a ligován na 5.4 kb fragment za vzniku plasmidu pKB (6.5kb).

Příklad 10

Konstrukce pKTBi

Tento plasmid je identický k pKTB minus STU signální sekvence. pKTB (6.56kb) byl tráven Spěl a Xmal a ligován do dvojřetězcového syntetického oligonukleotidu kódujícího pro glO translační enhancer, ribosomové vazebné místo a mini-cistron obsahující druhé ribosomové vazebné místo. Restrikční místa pro Ncol, DralII a Xmal byla označena na 3^rkonci.Dva komplementární oligonukleotidy měly následující sekvence:

5' - CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTA AAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC ATGGCACATTGTGCGGTCCGC · 3' [SEQIDNO 19]

5' - CCGGGCGGACCGCACAATGTGCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTA ATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGTTA ATCGATGCCCAATTCCGGA - 3' [SEQ ID NO 20]

Příklad 11

Konstrukce pKBi

Tento plasmid je identický k pKB minus STII signální sekvence.pKTB (6.56kb) byl tráven Spěl a DralII a ligován do dvojřetězcového syntetického oligonukleotidu obsahujícího ribosomové vazebné místo a Ncol a DralII místa označená na 31 konci.Dva komplementární oligonukleotidy měly následující sekvence:

5’ - CTAGTAAATTATATTTAAAGGAGGAATAAACCATGGCACATT - 3’ [SEQ ID NO 21]

5' - GTGCCATGGTTTATTCCTCCTTTAAATATAATTTA - 3' [SEQ ID NO 22]

Příklad 12

Konstrukce pKTBi-Vp 5.3

Tento plasmid je identický k pKTB-Vp 5.3 minus STII signální sekvence. pKTBi (6.4kb) byl tráven Xmal a Ncol a ligován do PCR syntetizovaného V0 5.3 užitím pKTB~V0 5.3 jako templátu. 5^ř sense primer obsahoval místo pro restrikční enzym Ncol (podtržené):

5' - TATAGTCCATGGGCGTAACC - 3^ [SEQ ID NO 23]

3^r antisense primer obsahoval Xmal místo (podtržené):

5( - AACTTCCCGGGTTATCATTAGCTGC - 3f, [SEQ ID NO 24]

Výsledky pKTBi-Vp 5.3

Paralelně s výše zmíněnou prací byl STII leader odstraněn z expresního plasmidu.Protože většina exprivovaného Vp 5.3 je zadržována intracelulárně (také viz níže),bylo očekáváno ,že rozsah tohoto konstruktu by mohl přinášet heterogení populaci Vp 5.3 molekul,t.j. plus a minus leader, která by mohla komplikovat následnou purifikaci zpracovaného νβ 5.3.Proto byl STII leader odstraněn za vzniku ρΚΤΒΐ-νβ 5.3 pro intracelulární expresi. U exprivovaného νβ 5.3 je očekáváno ,že obsahuje N-terminální methionin,ačkoliv tato aminokyselina může být odstraněna endogeními methionin aminopeptidasami (Ben-Bassat et al.,1987,J.Bacteriology, 169:751-757, Baneyx and Georgiou,Expression of Proteolytically Sensitive Polypeptides in Escherichia coli, ve Stability of Protein Pharmaceuticals,Part A:Chemical and Physical Pathways of

Protein Degradation (Tim J. Ahern and Mark

C.Manning,eds.) , Plenům Press,New York, str.69-108 (1992)), jak bylo pozorováno pro ρΚΒί-νβ 5.3 (níže).

pKTBi-νβ 5.3 byl kompletován, ale selhal v expresi signifikantních hladin proteinu v E.coli LJ24 (viz.Tabulku 3,supra). Celý νβ 5.3 insert byl sekvenován a determinován jako jednoznačně správný. Plasmidové DNA izolovaná po indukci a analyzovaná restrikční digescí se jevila nealterovanou.

Jedno možné vysvětlení pro zjevné selhání LJ24 kmenu obsahujícího pKTBi-νβ 5.3 pro expresi signifikantních hladin νβ 5.3 proteinů je,že absence leader peptidů destabi1 isuje intracelulární νβ 5.3 protein a vede k jeho rychlé proteolýze.

Proto byl pKTBi-νβ 5.3 transformován do proteasa def icientní ch kmenů SG22094 (1 orf , clj/ ) , a BL21 (lon> ,ompTř)» které dávaly nižší výtěžek tak, aby SG22904 > BL21. Vliv různých indukčních teplot na výtěžek byl také zkoušen, a pro oba kmeny bylo 42 °C optimálních. Navíc zde nebylo signifikantní zvýšení produkce mezi 2 h a 5 h.

pKTBi-νβ 5.3 byl exprivován ve dvou dalších proteasa deficientních kmenech: SG21163 (lon^.htpr* ) a SG21173 (Ion*, htpr\,clpT). Výsledky jsou sumarizovány v Tabulce 3 (supra).

Mělo by být zmíněno, že kmeny LJ24, SG22094, SG21163 a SG21174 neprodukují endogení lac represor, protože lac gen je deletován u všech těchto kmenů. Tak divoký typ lac represoru neinterferuje s termální indukcí tře promotoru.Předchozí příklady ukazují, že νβ 5.3 konstrukty bez signálního peptidu mohou být snadno exprivovány v proteasa deficientních hostitelích, resultujíc tak v produkci signifikantního množství νβ 5.3 proteinu.

Příklad 13

Konstrukce ρΚΒί-νβ 5.3

Tento plasmid je identický k ρΚΤΒί-νβ 5.3 minus glO element a mini-cistron (SEQ ID NO.28).Plasmid pKBi (6.43kb) byl tráven Ncol a Sáli a 970 bp fragment byl purifikován z agarosy.ρΚΤΒΐ-νβ 5.3 (6.75 kb) byl tráven Ncol a Sáli a 5.68 kb fragment byl stejně purifikován a ligován na 970 bp fragment za vzniku plasmidů pKBi-νβ 5.3 (6.64 kb).

Výsledky

Tento na leadery chudý νβ 5.3 konstrukt minus dva regulační elementy byl úspěšně exprivován v proteasa deficientních kmenech, naše pozorování jsou shodná s těmi pro ρΚΤΒΐ-νβ 5.3. pKBi-νβ 5.3 byl exprivován ve dvou dalších proteasa deficientních kmenech : SG21163 (ΙοηΓ ,htprf) a SG21173 (lor/ ,htpr( ,clpf)· Výsledky jsou sumarizovány v Tabulce 3. pKBi-νβ 5.3 důsledně produkoval více proteinu než pKTBi-Vp 5.3 ve všech testovaných kmenech (Tabulka 3).

N-terminální sekvenování exprivovaného proteinu ukázalo,že prvních 17 aminokyselinových residuí odpovídá očekávané νβ 5.3 sekvenci a terminální methioninový zbytek nebyl přítomen.Plasmid byl také demonstrován jako stabilní.

Rozsah předkládaného vynálezu není omezen specifickými provedeními zde popsanými. Samozřejmě,různé modifikace vynálezu k těm, které jsou zde popsány se stanou zjevnými odborníkům v oboru z předešlého popisu a připojených obrázků. Takové modifikace jsou uvažovány jako spadající do rozsahu připojených nároků. Různé publikace jsou inkorporovány referencemi v jejich plném znění.

náhradní list

Seznam sekvencí (1) Obecná informace:

(i) Pihlašovatel: T Cell Sciences, lne (ii) Název vynálezu:Proteiny V regionu antigenního receptorů T buněk a metody jejich přípravy (iii) Počet sekvencí: 29 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresa: T Cell Sciences, lne.

(B) Ulice: 115 Fourth Avenue (C) Město: Needham (D) Stát: Massachusetts (E) Země: Spojené státy americké (F) ZIP: 02194-2725 (v) Počítačově čtecí forma:

(A) Typ media: disketa, 3,50 inch, paměť 1,44 Mb (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: MS-DOS (Software: WordPerfect 6.0 (vi) údaje o přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Data prioritní přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: 08/181,492 (B) Datum podání: 13.leden 1994 náhradní list (viii) Zástupce/agent-informace:

(A) Jméno: Yankwich Leon R (B) Číslo registrace: 30,237 (C) Referenční/por.číslo: TCS-203-PCT (94,664-A) (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 617-345-9100 (B) Telefax: 617-345-9111 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

TATAATGACT AGTCGCTGCA GCCAACCGCG GCTG 34 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

í

I GTCCTAGAGT ACTGAGCGGA TAC 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 91 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GGCTCGAGCC TAGGCTGCAG CCCGGGGCGC GCGCGGCCGC AGGCCTTTAA 50

TTAAGAGCTC CGGACCGCAC AATGTGGGCG CGCCCTTAAG A 91 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 97 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

CTAGTCTTAA GGGCGCGCCC ACATTGTGCG GTCCGGAGCT CTTAATTAAA 50

GGCCTGCGGC CGCGCGCGCC CCGGGCTGCA GCCTAGGCTC GAGCCGC 97 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 103 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

i ! CTAGTAAATT CTATTTCAAG GAGACAGTCA TAATGAAATA CCTATTGCCT t

ACGGCAGCCG CTGGATTGTT ATTACTCGGT GCCCAACCAG CCATGGCCGA

GCT > 103

100 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 95 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA GGCAATAGGT ATTTCATTAT GACTGTCTCC TTGAAATAGA ATTTA (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 105 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

CTAGTAAATT ctatttcaag gagacagtca taatgaaaaa gaatatagca

TTCCTACTAG CTTCAATGTT CGTCTTCTCT ATTGCAACTA ACGCGTACGC • 17'

ACATT

105 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 98 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

GTGCGTACGC GTTAGTTGCA ATAGAGAAGA CGAACATTGA AGCTAGTAGG 50

AATGCTATAT TCTTTTTCAT TATGACTGTC TCCTTGAAAT AGAATTTA 98 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 89 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

• (ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

CTAGTCCGGA ATTGGGCATC GATTAACTTT ATTATTAAAA ATTAAAGAGG TATATATTAA TGTATCGATT AAATAAGGAG GAATAAATA 89 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 76 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10: CTCCTTATTT AATCGATACA TTAATATATA CCTCTTTAAT TTTTAATAAT

I AAAGTTAATC GATGCCCAAT TCCGGA 76 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 71 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC

CCAACCAGCC ATGGCCGAGC T 71 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 76 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

CGGCCATC-GC TC-GTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA C-GCAATAGGT ATTTCATTAT TTATTC 76 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 73 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

! ATGAAAAAGA ATATAGCATT CCTACTAGCT TCAATGTTCG TCTTCTCTAT i TGCAACTAAC GCGTACGCAC ATT 73 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 79 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

GTGCGTACGC GTT/fGTÍGCA ATAGAGAAGA CGAACATTGA AGCTAGTAGG 50

AATGCTATAT TCTTJTTTCAT TATTTATTC 7 9 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

TAATTAGCCA TGGCCGGCGT AACCCAATCT CCG ³³ (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

CCAGTGCCAA GCTTGCATGC C 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

i GAAATTAACG CGTACGCAGG CGTAACCCAA TCTC (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

CCAGTGCCAA GCTTGCATGC C 21 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 110 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

CTAGTCCGGA ATTGGGCATC GATTAACTTT ATTATTAAAA ATTAAAGAGG 50 •

TATATATTAA TGTATCGATT AAATAAGGAG GAATAAACCA TGGCACATTG ·.( 100

TGCGGTCCGC 110 *· (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 110 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

CCGGGCGGAC CGCACAATGT GCCATGGTTT ATTCCTCCTT ATTTAATCGA TACATTAATA TATACCTCTT TAATTTTTAA TAATAAAGTT AATCGATGCC CAATTCCGGA HO (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 42 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Ant. i-sen se :

(i x) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

CTAGTAAATT ATATTTAAAG GAGGAATAAA CCATGGCACA TT ⁴² (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 35 párů bází

100 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22: GTGCCATGGT TTATTCCTCC TTTAAATATA ATTTA 35 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 20 páru bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

TATAGTCCAT GGGCGTAACC ²⁰ (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: syntetický oligonukleotid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

AACTTCCCGG GTTATCATTA GCTGC 25

I (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 276 páru bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

GGC

GTA

ACC

CAA

TCT

CCG

ACT

CAC

CTG

ATC

AAA

ACG

AGA

39

GGA

CAG

CAC

GTG

ACT

CTG

AGA

TGC

TCT

CCT

ATC

TCT

GGG

73

CAC

AAG

AGT

GTG

TCC

TGG

TAC

CAA

CAG

GTC

CTG

C-GT

CAG

117

GGG

CCC

CAG

TTT

ATC

TTT

CAG

TAT

TAT

GAG

AAA

GAA

GAG

15 6

AGA

GGA

AGA

GGA

AAC

TTC

CCT

GAT

CGA

TTC

TCA

GCT

CGC .

195

CAG

TTC

CCT

AAC

TAT

AGC

TCT

GAG

CTG

AAT

GTG

AAC

GCC

234

TTG

TTG

CTG

GGG

GAC

TCG

GCC

CTG

TAT

CTC

TGT

GCC

AGC

273

AGC 276 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 276 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

CCG

CAT

TGG

GTT

AGA

GGC

TGA

GTG

GAC

TAG

TTT

Jtgc

TCT

39

CCT

GTC

GTG

CAC

TGA

GAC

TCT

ACG

AGA

GGA

TAG

AGA

CCC

73

GTG

TTC

TCA

CAC

AGG

ACC

ATG

GTT

GTC

CAG

GAC

>CCA

GTC

117

CCC

GGG

GTC

AAA

TAG

AAA

GTC

ATA

ATA

CTC

TTT

CTT

CTC

155

TCT

CCT

TCT

CCT

TTG

AAG

GGA

CTA

GCT

AAG

AGT

CGA

GCG

195

GTC

AAG

GGA

TTG

ATA

TCG

AGA

CTC

GAC

TTA

CAC

TTG

CGG

234

AAC

AAC

GAC

CCC

CTG

AGC

CGG

GAC

ATA

GAG

ACA

CGG

TCG

273

(2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 92 párů bází (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(x

i) :

Popi

s s

ekvence

: SEQ I

D N

0:

27:

Gly

Val

Thr

Gin

Ser

Pro

Thr

His

Leu

lle

Lys

Thr

Arg

Gly

Gin

1

5

10

15

His

Val

Thr

Leu

Arg

cys

Ser

Pro

lle

Ser

Gly

His

Lys

Ser

Val

20

25

30

Ser

Trp

Tyr

Gin

Gin

Val

Leu

Gly

Gin

Gly

Pro

Gin

Phe

lle

Phe

35

40

45

Gin

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Glu

Glu

Arg

Gly

Arg

Gly

Asn

Phe

Pro

Asd

50

55

60*

Arg

Phe

Ser

Al a

Arg

Gin

Phe

Pro

Asn

Tyr

Ser

Ser

Glu

Leu

Asn

65

70

75

Val

Asn

Ala

Leu

Leu

Leu

Gly

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr

Leu

Cys

Ala

80

85

90

Ser

Ser

92

(2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28

ATG TAT CGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA 2 (2) Informace o SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 8 párů bází (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetický:

(iv) Anti-sense:

(ix) Rys:

(A) Jméno:

(B) Lokace:

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29

Met Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu

Claims (32)

1. Způsob produkce kompletních rekombinantních proteinů

V regionu antigeního receptoru T buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje

a) transformování kompetentních bakteriálních hostitelských buněk rekombinantním expresním vektorem obsahujícím region kódující kompletní protein

V regionu antigeního receptoru T buňky a indukovatelný bakteriální promotor.

b) indukci indukovatelného bakteriálního promotoru v tranformovaných bakteriálních buňkách kroku a), a

c) získání kompletního rekombinantního proteinu V regionu antigeního receptoru T buňky prostého cizích proteinových sekvencí.

2. Způsob podle nároku l.vyznačující se tím, Že indukovatelný bakteriální promotor je vybrán ze skupiny sestávající z chemicky regulovaných promotorů a termálně regulovaných promotorů.

3. Způsob podle nároku 2,vyznačuj ící se tím, že expresní vektor dále obsahuje regulační genovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z láci, lacl^ a laclts genu.

4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, laclts gen je ve stejné orientaci jako kódující region T pro proteiny V regionu antigenního receptoru T buněk.

5. Způsob podle nároku l.vyznačující se tím, že bakteriální promotor je vybrán ze skupiny sestávající z lac promotoru, tac promotoru a trc promotoru.

6. Způsob podle nároku 5,vyznačující se tím, že bakteriální hostitelský kmen je proteasa deficientní kmen.

7. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, rekombinantní expresní vektor dále zahrnuje leader sekvenci.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že leader sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z termostabilního enterotoxinu STII leaderu z Escherichia coli a pelB leaderu z Erwinia carotovora.

9. Způsob podle nároku 8,vyznaču jící se tím, že rekombinantní expresní vektor dále zahrnuje leader sekvenci odvozenou od STII leader sekvence E.coli a kompetentní bakteriální hostitelskou buňkou je buňka,- která nenese láci nebo lacB gen.

10. Způsob podle nároku 1,vyznaču jící se tím, že bakteriálním hostitelským kmenem je kmen proteasa def icientní.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že proteasa deficientní kmen je selektován ze skupiny sestávající z SG21163 a SG21173.

12. Způsob podle nároku 1,vyznaču jící se tím, že kde expresní vektor dále zahrnuje regulační elementy glO a mini-cistronovou sekvenci (SEQ ID NO.28).

13. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že rekombinantní expresní vektor dále zahrnuje :

·· ···· · ·· ·· ···· ·· · · · · · ·· · • · · ······ • · · · ········ • · · · · · ··

99 9 ··· ·· ·· *

a) trc promotor jako indukovatelný bakteriální promotor

b) ribosomové vazebné místo

c) transkripční terminátor

d) laclts regulační genovou sekvenci

e) pBR322 zdroj replikace

f) gen tetracyklinové resistence.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že rekombinantní expresní vektor je vybrán ze skupiny sestávající z pKTBi-V0 5.3,a pKBi-V0 5.3.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že rekombinantní expresní vektor dále zahrnuje leader sekvenci.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že rekombinantní expresní vektor je vybrán ze skupiny sestávající z pK-V0 5.3, pKT-V0 5.3,pKTB-V0 5.3,a pKB-V0 5.3.

17. Expresní vektor zahrnující indukovatelný bakteriální promotor pod kontrolou laclts genu, kde řečený laclts gen kontroluje expresi regionu kódujícího pro kompletní protein

V regionu antigeního receptorů T buňky.

18. Expresní vektor nároku 17, kde indukovatelný bakteriální promotor je vybrán ze skupiny sestávající z lac promotoru,tac promotoru a trc promotoru.

19. Expresní vektor nároku 18, který dále zahrnuje leader sekvenci.

20. Expresní vektor,podle nároku 17, který zahrnuje v 5ť3^r směru:

a) trc promotor .. _;

b) ribosomové vazebné místo

c) region kódující kompletní protein V regionu antigeního receptorů T buněk

d) transkripční terminátor

e) laclts regulační genovou sekvenci

f) pBR322 zdroj replikace a

g) gen tetracyklinové resistence.

11. Expresní vektor podle nároku 17, kde uvedený vektor je rybrán ze skupiny, zahrnující pK-STII-V05.3, ρΚΤ-νβ5.3, ίΚΤΒ-νβ5.3, ρΚΤΒΐ-νβ5.3 a ρΚΒί-νβ5.3.

22. Bakteriální buňka transformovaná expresním vektorem podle nároku 17.

23. Bakteriální buňka podle nároku 22, která produkuje alespoň 300 miligramů rekombinantního kopletního proteinu νβ regionu antigenního receptorů T buněk na litr buněčné kultury.

24. Izolovaný kompletní protein V regionu antigeního receptorů T buněk produkovaný podle nároku 13.

25. Farmaceutická kompozice, vyznačující se t í m, že zahrnuje kompletní protein V regionu antigeního receptorů T buněk.

26. Farmaceutická kompozice nároku 25, vyznačuj ící se t í m, že proteinem V regionu antigeního receptorů je νβ 5.3 protein a má vzorec: aminokyseliny 1 až 92 aminokyselinové sekvence ID No.27.

27.Použití v podstatě čistého T buněčného antigenního receptoru proteinu V regionu podle nároku 31, kde s imunitou spojenou chorobou je roztroušená sklerosa.

28. Použití v podstatě čistého T buněčného antigenního receptoru proteinu V regionu podle nároku 28, kde kompletním proteinem V regionu antigeního receptoru T buněk je Vp 5.3 a má vzorec:

aminokyseliny 1 až 92 aminokyselinové sekvence ID No.27.

29. Izolovaný kompletní protein Vp 5.3 antigeního receptoru T buněk mající vzorec: aminokyseliny 1 až 92 aminokyselinové sekvence ID No.27.

30. Použití v podstatě čistého proteinu V regionu antigeního receptoru T buněk pro výrobu léčiv pro léčbu imunitních chorob.

31. Izolovaný kompletní protein V regionu antigenního receptoru T buněk podle nároku 24 nebo 30 pro použití v terapii .

32. Izolovaný kompletní protein V regionu antigenního receptoru T buněk podle nároku 24 nebo 30 pro použití v diagnostice s imunitou spojených chorob.

33. Způsob diagnostiky imunitních chorob zahrnující užití kompletního rekombinantního proteinu V regionu antigeního receptoru T buněk k detekci přítomnosti jednotlivých subpopulací T buněk asociovaných s imunitními chorobami nebo přítomnost autoproti látek rozpoznávajících jednotlivé proteiny V regionu v biologických vzorcích od pacientů.