PL181072B1

PL181072B1 - Sposób wytwarzania rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu Vbeta5.3, izolowane rekombinacyjne pełnej długości białko regionu Vbeta5.3, wektor ekspresji, komórka bakteryjna i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL181072B1
Application number: PL95319374A
Authority: PL
Inventors: Savvas C. Markides; Patrick C. Kung
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 2001-05-31
Also published as: SG52342A1; NZ279605A; BR9506612A; PL319374A1; WO1995019435A2; LV11630A; EP0738322A1; FI962844A7; LV11630B; CA2181171A1; AU700661B2; FI962844L; KR970700772A; NO962921L; NZ332715A; JPH10501961A; US5552300A; CZ9602009A3; HU9601908D0; NO962921D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego pelnej dlugosci bialka regionu V ß5.3 re- ceptora antygenu komórki T wolnego od sekwencji bialek zewnetrznych lub partnerów fuzyjnych, znamienny tym, ze (a) transformuje sie kompetentna bakteryjna komórke go- spodarza rekombinacyjnym wektorem ekspresji obejmujacym region kodujacy pelnej dlu- gosci bialko regionu V ß 5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 25 i 26 i chemiczne lub termiczne regulowane promotory oraz sekwencje genu regu- latorowego lac; (b) indukuje sie indukowalny bakteryjny promotor w transformowanym bakteryjnym gospodarzu z etapu (a); oraz (c) odzyskuje sie rekombinacyjne pelnej dlugosci bialko regionu V ß5.3 receptora antygenu komórki T wolne od sekwencji bialek zewnetrz- nych lub partnerów fuzyjnych. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu Υβ5.3, izolowane rekombinacyjne pełnej długości białko regionu Υβ5.3, wektor ekspresji, komórka bakteryjna i kompozycja farmaceutyczna.

Ogólnie niniejszy wynalazek należy do dziedziny immunologii i medycyny. Białko regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T należy do rekombinacyjnych białek regionu V receptora komórki T (TCR). Wektory ekspresji według wynalazku służą do wytwarzania handlowo przydatnych ilości rekombinacyjnych białek regionu V receptora antygenu komórki T. Pełnej długości rekombinacyjnego białka regionu V receptora komórki T, w tym białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T mogą służyć do diagnozowania i leczenia chorób lub zaburzeń układu odpornościowego.

1. Receptor antygenu komórki T.

Odpowiedź immunologiczna na obce antygeny dzieli się na odporność humoralną w której pośredniczą komórki B i komórkową w której pośredniczą komórki T. Cząsteczki receptorowe na komórkach B do rozpoznawania antygenu są immunoglobulinami rozpoznającymi konformacyjne epitopy na kulistym białku. Receptory antygenu na komórkach T są spokrewnione z immunoglobulinami, ale wiążą przetwarzane cząsteczki antygenu w połączę

181 072 niu z cząsteczkami własnego głównego kompleksu histokompatybilnego (MHC) (Dembic i in., 1986, Immunol. Today, 7: 308).

Geny TCR, podobnie jak geny immunoglobuliny, składają się z regionów kodujących (lub segmentów genów), które przekształcają się w czasie ontogenezy komórki T (Chien i in., 1984, Naturę, 312: 31-33; Hedrick i in., 1984, Naturę, 308: 149-153; Yanagi i in., 1984, Naturę, 308: 145-149). Locus łańcucha β ludzkiego receptora komórki T badano dokładnie od czasu klonowania pierwszego cDNA kodującego łańcuch β (Yanagi i in., 1984, Naturę, 308: 145-149; Hedrick i in., 1984, Naturę, 308: 149-152; Siu i in., 1984, Celi, 37: 393-401). Miejsce to jest kompleksem genów złożonym z regionów kodujących znane regiony lub domeny łańcucha β: domenę zmienną (V), różniącą (D) i wiążącą (J). Te regiony kodujące biorą udział w przekształceniach komórek somatycznych z regionem kodującym stałą (C) domenę (Chien i in., 1984, Naturę, 309: 322-326). Badania in situ pozwoliły na zidentyfikowanie miejsca TCR-β na chromosomie 7 w 7q35 (Isobe i in., 1985, Science, 228: 580). W obecnych oszacowaniach kompleks ten obejmuje ponad 600 par zasad i zawiera 70 do 80 segmentów zmiennych regionów (Concannon i in., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6598-6602; Tillinghast i in., 1986, Science, 233: 879-883; Kimura i in., 1987, Eur. J. Immunol., 17: 375383; Lai i in., 1988, Naturę, 331: 543-546). Te segmenty genów regionu V sąsiadują z dwoma wspólnie zorganizowanymi regionami, z których każdy obejmuje segment genowy D i C, a następnie klaster 6 lub 7 segmentów genowych regionów J (Tunnacliffe i in., 1985, Nucleic Acids Res., 13: 6651-6661; Tovonaga i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8624-8628). Po udanych przekształceniach DNA regionów kodujących V, D i J (segmentów genowych), translowany polipeptyd łańcucha β układa się w parę z łańcuchem TCR i można go poddać ekspresji na powierzchni komórki T (przegląd Kronenberga i in., 1986, Ann. Rev. Immunol., 4: 529-591).

Miejsce a i δ TCR znajdują się obok siebie na ludzkim chromosomie 14. Regiony kodujące TCR δ znajdują się w całości w miejscu a genu (Satanarayana i in., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8166-8170; Chien i in., 1987, Naturę, 330: 722-727; Elliott i in., 1988, Naturę, 331: 627-631). Ocenia się, że istnieje minimum 45-50 regionów kodujących Va (Becker i in., 1985, Naturę, 317: 430-434), podczas gdy istnieje tylko około 10 regionów kodujących Vó (Chien i in., 1987, supra). We krwi obwodowej wydają się ulegać ekspresji dwa regiony kodujące νδ, νδΐ i VÓ2.

Gen γ TCR zidentyfikowano najpierw u myszy (Saito i in., 1984, Naturę, 309: 757-762; Kranz i in., 1985, Naturę, 313: 755-762; Hayday i in., 1985, Celi, 40: 259-269) i następnie u ludzi (Lefranc i in., 1985, Naturę, 316: 464-466; Murre i in., 1985, Naturę, 316: 549-552). Ludzkie miejsce γ TCR wydaje się składać z od 5 do 10 regionów kodujących V, 5 J i 2 C (Dialynas i in., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2619).

Różnorodność TCR, a więc specyficzność komórek T, pochodzi z kilku źródeł (Barth i in., 1985, Naturę, 316: 517-523; Fink i in., 1986, Naturę, 321: 219-225): wielości segmentów linii zarodkowych genów (Chien i in., 1984, Naturę, 309: 322-326; Malissen i in., 1984, Celi, 37: 1101-1110; Gascoigne i in., 1984, Naturę, 310: 387-391; Kavaleri in., 1984, Naturę, 310: 421-423; Siu i in., 1984, Naturę, 311: 344-349; Patten i in., 1984, Naturę, 312: 40-46); różnorodności kombinacyjnej przez składanie różnych regionów kodujących V, D i J (Siu i in., 1984, Celi, 37: 393-401; Goverman i in., 1985, Celi, 40: 859-867); i elastyczności rozgałęziania, różnorodności regionu N i zastosowania albo wielokrotnych regionów D lub dowolnej z trzech translacyjnych ramek odczytu dla segmentów ϋβ. Różnorodność TCR nie wydaje się powstawać z mechanizmu somatycznej hipermutacji obserwowanym dla immunoglobulin (Barth i in., supra). W wyniku tych mechanizmów, powstają TCR różniące się na końcu aminowym (to jest są utworzone z kombinacji regionów kodujących V, D i J) ale podobne w innych miejscach, w tym końcu karbonylowym (tworzącym stałe regiony TCR). Odpowiednio tworzy się wielki repertuar cząsteczek TCR.

Badania struktury i różnorodności zmiennych regionów kodujących łańcuch β ludzkiego TCR doprowadziło do zgrupowania regionów kodujących w różne podrodziny regionów V (Tillinghast i in., 1986, Science, 233: 879-883; Concannon i in., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6598-6602; Borst i in., 1987, J. Immunol., 139: 1952-1959). Każdąpodrodzinę regio

181 072 nu V można scharakteryzować sekwencją zgodności i zawiera ona podobne regiony kodujące wykazujące więcej niż około 75% podobieństwa w sekwencji DNA. Na przykład, 16 mysich sekwencji νβ podzielono na 14 różnych podrodzin proponowaną arbitralną ale prostą, numeryczną nomenklaturą dla segmentów genu νβ (patrz Barth i in., 1985, „The Murine T Celi Raceptor Employs a Limited Repertoire of Expressed νβ Gene Segments”, Naturę, 316: 517-523). Zgodnie z tą nomenklaturą, członkowie tej samej podrodziny mają wspólną pierwszą cyfrę i różnią się dnigą; więc νβδ.Ι, νβ8.2 i νβ8.3 są wszystkie członkami podrodziny νβ8. Podobny układ zaproponowano dla ludzkich regionów kodujących. U ludzi około 60 funkcjonalnych regionów kodujących νβ zgrupowano w co najmniej 24 rodziny (Toyonaga i Mak, 1988, Ann. Rev. Immunol., 5: 585; Wilson i in., 1988, Immunol. Rev., 101: 149 i Robinson, M.A., 1991, J. Immunol., 146: 4392).

2. Komórki T w autoodpomości.

Komórki T grają zasadniczą rolę w różnicowaniu i regulacji mechanizmów efektorowych w układzie odpornościowym (Paul i in., 1987, Science, 195: 1293-1300). Współrozpoznawanie antygenu i cząsteczek głównej histokompatybilności przez komórki T musi być specyficznie i precyzyjnie regulowane, ponieważ niewłaściwa regulacja immunologiczna sprzyja autoodpomości. Kilka laboratoriów zbadało choroby, w których wydaje się występować niewłaściwa regulacja immunologiczna, takie jak autoalergia i pewne postaci braku odporności i związało komórki T z patogenezą takich chorób.

Kilka niepożądanych odpowiedzi immunologicznych charakteryzuje się klonalną lub oligoklonalną ekspansją danego składu TCR, jak np. w stanach nowotworowych, które dały białaczkę lub chłoniaka komórki T (patrz np. Jack i in., 1990, Am. J. Pathol., 136: 17; Nitta i in., 1990, Science, 249: 672 i Yoahino i in., 1991, Int. J. Cancer, 47: 654). W białaczkach lub chłoniakach komórki T, TCR działa jako unikalny znacznik nowotworu, ponieważ jest stabilnie przekształcany i podawany na powierzchnię komórki. Szczególny skład TCR jest także związany z przyjmowaniem przeszczepu organów, których limfocyty T mają TCR reagujące z antygenami MHC dawcy, jak na przykład dawcy szpiku kostnego.

Kilka grup wykazało selektywną ekspresję regionu V TCR w pewnych autoalergicznych sytuacjach. Np. Grunwald i in. zanotowali preferencyjną ekspresję produktu genu Va2.3 w komórkach T CD4+ przy płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym w porównaniu z limfocytami krwi obwodowej pacjentów z Sarcoidosis (Grunwald, J. i in., 1992, Eur. J. Immunol., 22: 129). W chorobie Kawasaki preferencyjna ekspansja komórek T νβ2 i νβ8 została zauważona przy ataku choroby (Abe, J., i in., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4066).

Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) badano intensywnie z tego punktu widzenia. Kilku badaczy zauważyło preferencyjną ekspansję pewnych podzbiorów komórek T, np. DerSimonian i in., 1993, J. Exp. Med., 177: 1623 (preferencyjna ekspansja komórek T niosących Val2.1 w limfocytach T CD8+ krwi obwodowej); Stamenkovic i in., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1179 (komórki T infiltrujące błony maziowe hodowane w IL-2 były oligoklonalne metodą analizy Southern); Paliard i in., 1991, Science, 253: 325 (stawiający hipotezę, ze aktywowane na superantygen komórki T νβ14, w tym autoreaktywne komórki T, ekspandują klonalnie i migrują do cieczy maziowej pacjentów z RA); Howell i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10921 (zauważający szczególnie użycie genu regionu V komórki T νβ3.14 i 17 w komórkach IL-2R+ z cieczy maziowej pacjentów z RA); Uematsu i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8534 (zastosowanie genu regionu V oligoklonalnej komórki T w cieczy maziowej pojedynczego pacjenta z RA); Międzynarodowa Publikacja Patentowa WO 90/06758 (wskazująca na udział νβ3.9 i 10 w RA).

Badano też szeroko zapalenie jelit. Kilka grup zauważyło powiększoną populację komórek T lub preferencyjne stosowanie genu regionu V TCR, np. Posnett i in., 1990, J. Clin. Invest., 85: 1770; Spencer i in., 1991, J. Clin. Pathol., 44: 915; Trejdosiewicz i in., 1991, Clin. Exp. Immunol., 84: 440; Van Kerckhove i in., 1992, J. Exp. Med., 175: 57. Inni z kolei informowali o preferencyjnym stosowaniu genu regionu V TCR w Mycobacterium leprae (van Shooten i in., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11244; Wang i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:188.

181 072

Stwardnienie rozsiane (MS) jest autoalergią charakteryzującą się infiltracją centralnego układu nerwowego przez komórki jednojądrowe i demielinację. Chociaż patogeneza MS jest nieznana, zakłada się obecność czynników genetycznych i środowiskowych w procesie chorobowym. Główne składniki genetycznej predyspozycji obejmują związek choroby ze szczególną klasą II haplotypów głównego kompleksu histokompatybilności (MHC) (Terasaid i in., 1976, Science, 1933: 1245-1247; Ho i in., 1982, Immunogenetics, 15: 509-517; Spiehnan i in., 1982, Epidemial. Rev., 4: 45-65; Francis i in., 1986, Lancet, 1: 211; Elian i in., 1987, Disease Markers, 5: 89-99; Urban i in., 1988, Celi, 54: 577-592; Vanderbark i in., 1989, Naturę, 341: 541-544; Howell i in., 1989, Science, 246: 668-670).

Wykazano, że komórki T wydzielone z płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów cierpiących na MS wykorzystują ograniczony zestaw genu regionu V TCR. Wykazanie komórek T specyficznych dla in vivo aktywowanego podstawowego białka mielinowego u pacjentów z MS wskazuje na udział reagujących z MBP komórek T w patogenezie choroby (Wucherpfennig, K.W. i in., 1990, Science, 248: 1016-1019). Badania z zastosowaniem polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) wzmacniającej cDNA z primerami νβ TCR wskazały, że reagujące z MBP linie komórek T stosują tylko ograniczoną liczbę regionów kodujących νβ (Wucherpfennig, K.W. i in., 1990, supra (νβ17 i w mniejszym stopniu νβ12 są często stosowane do rozpoznawania immunodominującego regionu ludzkiego autoantygenu MBP); Oksenberg J.R. i in., 1993, Naturę, 362: 68-70 (przekształcone geny νβ5.2 i/lub νβ5.3 wykryto w mózgach pacjentów o pewnym fenotypie HLA); Kotzin B.L., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9161-9165 (skłonność do stosowania zmiennego regionu łańcucha β 5.2/5.3 i w mniejszym stopniu νβ6.1, spotykana pośród specyficznych dla MBP klonów u pacjentów z MS)). Wyniki pewnych badań także wskazują na występowanie ograniczonej ekspresji genu Va TCR w uszkodzeniach mózgu przy MS (Oksenberg J.R. i in., 1990, Naturę, 345: 344-346).

3. Podejście do terapii, w której pośredniczą komórki T.

W przeszłości, próby selektywnego zmieniania populacji komórek T opierały się na szczepieniu pełnymi żywymi lub osłabionymi limfocytami T (przegląd tego podejścia u Cohena, I.R., 1986, Immunol. Rev., 94: 5-21) lub szczepionkami peptydowymi opartymi na wyborze specyficznej części peptydu TCR regionu V. Podejścia te oparte są na obecnym poglądzie, że potencjalnie patogenne komórki T preferencyjnie wykorzystują ograniczony zestaw regionów kodujących V. Podejście opracowane przez Cohena wykorzystuje żywe lub osłabione komórki T jako szczepionki do leczenia lub zapobiegania, między innymi, doświadczalnemu alergicznemu zapaleniu mózgu i rdzenia (EAE). Jednak podejście to jest ograniczone, ponieważ zależy od wydzielenia klonów komórek T specyficznych dla choroby: konieczne jest leczenie każdego pacjenta jego własnymi powiększonymi komórkami, wymagające „przykrojonej” lub zindywidualizowanej terapii. (Patrz Zhang i in., 1993, Science, 261: 1451).

Inni proponowali lecznicze stosowanie peptydów TCR opartych na zaangażowaniu regionu V TCR (Offher, H., 1991, Science, 251: 430 (leczenie peptydem opartym na sekwencji aminokwasowej νβ8 TCR zmniejszało ostrość choroby i przyspieszało wyzdrowienie szczurów Lewis); Hashim, G.A. i in., 1992, J. Immunol., 149: 2803-2809; Offher, H. i in., 1992, J. Immunol., 148: 1706-1711; Offner, H. i in., 1991, J. Immunol., 146: 416-417; ale patrz Sun, D., 1992, Celi. Immunol., 141: 200-210). Te peptydy są zwykle krótkimi peptydami, zwykle długości 8-25 aminokwasów i rzadko ponad 30 aminokwasów. Np. 21-aminokwasowy peptyd z łańcucha TCR związanego z EAE zastosowano do zapobiegania EAE u szczurów Lewis (Vandenbark, A.A. i in., 1989, Naturę, 341: 541-544; Vandenbark, A.A., International Patent Publication WO 91/01133; patrz też Janeway, C.A., 1989, Naturę, 341: 482483). Inni donosili, że nawet krótsze peptydy o 8 lub 11 aminokwasach, odpowiadające częściom regionu VDJ lub Ja łańcucha β wykazały skuteczność jako szczepionki albo do zapobiegania, albo zmniejszania ostrości EAE w modelu szczurzym (Howell, M.D. i in., 1989, Science, 246: 668-671; Howell, M.D. i in., International Patent Publication WO 92/12996).

Peptydy pochodzące z białka TCR wybierano zwykle jako kandydatów do terapii autoalergii ze względu na łatwość syntezy peptydu i dotychczasowy brak sposobu wytwarzania dłuższego regionu V białka TCR w przydatnych ilościach o znaczącej biologicznej aktywności. Co ważniejsze, główną wadą małych syntetycznych peptydów jest to, że ich stosowanie

181 072 wymaga przewidzenia konkretnej sekwencji, która skutecznie modulowała by odpowiedź immunologiczną. Przewidywanie musi dotyczyć antygenowych lub immunogennych właściwości proponowanych peptydów, jak np. ich występowania w hiperzmiennym lub określającym komplementamość regionie (CDR) regionu V. Ponadto, rozmiary proponowanego peptydu pochodzącego z poszczególnego TCR muszą być takie, aby zachowywać właściwą strukturę epitopu, w celu pobudzenia aktywności supresyjnej komórki T lub wywołania uwalniania przeciwciał skierowanych przeciw subpopulacji komórek T niosących to szczególne TCR (któremu odpowiada peptyd). Takie zaprojektowanie peptydu wymaga znaczącego czasu i eksperymentów; i w wielu przypadkach, gdy chodzi o leczenie ludzi, nie można przeprowadzić koniecznych doświadczeń ze względów humanitarnych łub etycznych.

Ponadto, w celu wytworzenia specyficznej antygenowej odpowiedzi regulacyjnej komórki T, peptyd musi być związany z indywidualnymi cząsteczkami MHC. Takie antygeny MHC obecne na komórkach docelowych mają polimorficzne regiony, w których specyficzne allele są związane z poszczególnymi osobnikami. W większości, osobnik będzie miał 2 haplotypy, co oznacza, że wystąpią dwa różne allele poszczególnego antygenu MHC z tego samego miejsca. Nie wszystkie peptydy będą zdolne do wiązania antygenów MHC, ani nie wszystkie antygeny MHC wiążą się z dowolnym pojedynczym peptydem, ponieważ istnieje wiele antygenów MHC dla każdego haplotypu. Tak więc przydatność takiego peptydowego podejścia do mediowanej komórkami T terapii musi być określona na haplotypie każdego osobnika, co wymaga przykrawania peptydów dla indywidualnego pacjenta.

4. Wytwarzanie rozpuszczalnego receptora antygenu komórki T.

Wytwarzanie dużych ilości rozpuszczalnych białek TCR technikami rekombinacyjnymi jest problematyczne z kilku powodów. Główną przeszkodą w wytwarzaniu rozpuszczalnych receptorów antygenu komórki T jest wydzielanie pod nieobecność regionu transmembranowego (Traunecker, A. i in., 1989, Immunol. Today, 10: 29-32). Jeden z badaczy był w stanie wykazać wydzielanie monomerycznego łańcucha β o pełnej długości mysiego TCR wraz z regionami V, D i J, za którymi następowała obcięta forma regionu Cp. Metodyka wykorzystała homologię pomiędzy końcem karboksylowym lekkiego łańcucha immunoglobuliny i sekwencją wokół Cys 241 w łańcuchu TCR β. Powstały konstrukt wykorzystywał chimeryczny gen kodujący liderową sekwencję peptydową łańcucha κ z MPC-11 i przekształconego eksonu VDJ. Powstały konstrukt podlegał ekspresji w komórkach ssaków i dawał się wykrywać w supematancie komórek. Sposób nie sugeruje jednak sposobu otrzymania białka regionu V o pełnej długości pod nieobecność zewnętrznej sekwencji białkowej, ponieważ wydzielanie zależało od obecności obciętego eksonu Cp (Gasgoigne, N., 1990, J. Biol. Chem.,265 (16): 9296-9301).

Inna grupa starała się osiągnąć ekspresję rozpuszczalnej formy łańcucha p TCR w biochemicznie znaczących ilościach przez ekspresję rekombinacyjnego heterodimeru TCR zakotwiczonego wiązaniem fosfatydylowego inozytologlikanu. Sposób dawał małe (0,5 mg/zbiór) ilości pełnego łańcucha TCR, który wymagał odcięcia od powierzchni transfekowanej komórki specyficznej dla fosfatydylowego inozytolu fosfolipazy C (Lin, A.Y., 1990, Science, 249: 677-679).

Inni wytwarzali chimeryczne cząsteczki przez przemieszczanie zmiennych i stałych domen mysiego TCR ze stałym regionem lekkiego łańcucha κ immunoglobuliny. Badacze mogli uzyskać małe ilości wydzielonej rozpuszczalnej formy heterodimerycznego α P TCR (Gregoire, C. i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8077-8081). Gregoire i in. pokazali mysią chimerę złozoną z genów Ca i Va KB5-C2 związanych z regionem C lekkiego łańcucha κ monoklonalnego przeciwciała SI05. Pokazano też chimerę VPCPCk. Obie transfekuje się do mięsaka komórki B nie wykazującego ekspresji rodzimego ciężkiego lub lekkiego łańcucha immunoglobuliny (patrz też Weber, S. i in., 1992, Naturę, 356: 793-795).

Novotny i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8646-8650, pokazują sposób wytwarzania rozpuszczalnych TCR z właściwościami łączenia antygenów. Klonowano syntetyczny oligolinker do końca C regionu Vp i końca N regionu Va otrzymując jednołańcuchowy VpVa. Powstały wektor ekspresji kodował lidera pelB natychmiast przed ramką Vp, lin

181 072 kerem i segmentami Va. Ekspresja tego konstruktu przebiega pod kontrolą promotora lacZ, a więc jest indukowalna przez IPTG.

Ostatnio grupa badaczy pokazała wydzielanie małej ilości regionu V receptora komórki T sklejonego z karboksyloterminalnym polihistydynowym „ogonem”. Plazmidy zawierają lider pelB i znajdują się pod kontrolą chemicznie indukowalnego promotora (Ward, E.S., 1991, Scand. J. Immunol., 34: 215-220). W pracy nie opisano jednak, jak wytworzyć białko regionu V receptora antygenu komórki T pod nieobecność partnera fuzji lub jak wytworzyć handlowo przydatne ilości regionu V receptora.

Istnieje więc duże zapotrzebowanie na środki i kompozycje farmaceutyczne mające właściwości specyficzności wobec danej odpowiedzi autoalergicznej, przewidywalności ich doboru i dogodności i powtarzalności wytwarzania.

Podsumowanie wynalazku.

Niniejszy wynalazek rozwiązuje te problemy dzięki pierwszemu sposobowi udanego wytwarzania uniwersalnego środka do leczenia choroby, w której pośredniczą komórki T, w którą włączone są podzbiory komórek T. 1.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T wolnego od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fuzyjnych, polegający na tym, że (a) transformuje się kompetentną bakteryjną komórkę gospodarza rekombinacyjnym wektorem ekspresji obejmującym region kodujący pełnej długości białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 25 i 26 i chemiczne lub termiczne regulowane promotory oraz sekwencję genu regulatorowego lac; (b) indukuje się indukowalny bakteryjny promotor w transformowanym bakteryjnym gospodarzu z etapu (a); oraz (c) odzyskuje się rekombinacyjne pełnej długości białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T wolne od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fuzyjnych.

Korzystnie jako indukowalny bakteryjny promotor stosuje się promotor wybrany z grupy obejmującej termicznie regulowane promotory.

Także korzystnie stosuje się sekwencję genu regulatorowego wybraną z grupy obejmującej gen lad, gen lacl^q i gen laclts, a jeszcze bardziej korzystnie jako sekwencję genu regulatorowego stosuje się gen laclts.

W sposobie według wynalazku można korzystnie stosować indukowalny bakteryjny promotor wybrany z grupy obejmującej promotor lac, tac i trc.

Korzystnie także w sposobie według wynalazku stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STU) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara. Najkorzystniej, wynalazek można zrealizować gdy stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera z lidera STU E. coli i kompetentną bakteryjną komórkę gospodarza wolną od genu lad lub lacl^q, a jako szczep gospodarza można korzystnie stosować bezproteazowy bakteryjny szczep gospodarza.

Bezproteazowy szczep gospodarza w korzystnej odmianie sposobu stanowić może szczep wybrany z grupy obejmującej SG22094, SG21163 i SG1173.

W sposobie według wynalazku wektor ekspresji może obejmować ponadto element regulacyjny glO i sekwencję minicistronu (SEQ ID nr 28).

Sposób według wynalazku można korzystnie zrealizować gdy promotor bakteryjny stanowi promotor trc, sekwencję genową regulatora lac stanowi laclts i rekombinacyjny wektor ekspresji obejmuje ponadto:

(a) miejsce wiązania rybosomu;

(b) terminator transkrypcji;

(c) sekwencję genu regulacyjnego laclts;

(d) sekwencję ori replikacji pBR322; oraz (e) gen oporności na tetracyklinę.

W powyżej opisanej odmianie jako wektor korzystnie można stosować rekombinacyjny wektor ekspresji wybrany z grupy obejmującej ρΚΤΒΐ-νβ5.3 i ρΚΒΐ-νβ5.3. Bardziej korzystnie, stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera

181 072 wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STII) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara i w tym przypadku jako wektor stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji wybrany z grupy obejmującej ρΚ-8ΤΠ-Υβ5.3, ρΚΤ-Υβ5.3, ρΚΤΒ-Υβ5.3 ΐρΚΒ-νβ5.3. . , . ...

Przedmiotem wynalazku jest także izolowane pełnej długości rekombinacyjne białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o wzorze aminokwasowym 1-92 z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresji obejmujący indukowalny bakteryjny promotor pod kontrolą genu laclts, kontrolującego ekspresję regionu, który koduje pełnej długości rekombinacyjne białko regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T wolne od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fiizyjnych.

W wektorze według wynalazku indukowalny bakteryjny promotor korzystnie wybiera się z grupy obejmującej promotor lac, tac i trc, a jeszcze bardziej korzystnie jako indukowalny bakteryjny promotor stosuje się promotor trc.

Wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje ponadto sekwencję lidera wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STII) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor ekspresji, charakteryzujący się tym, że obejmuje w kierunku od 5' do 3': (a) promotor trc; (b) miejsce wiązania rybosomu; (c) region kodujący pełnej długości białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T; (d) terminator transkrypcji; (e) sekwencję genu regulacyjnego laclts; (f) sekwencję ori replikacji pBR322; oraz (g) gen oporności na tetracyklinę. W korzystnej odmianie wektora według wynalazku wybiera się go z grupy obejmującej ρΚ-8ΤΙΙ-Υβ5.3, ρΚΤ-νβ5.3, ρΚΤΒ-νβ5.3 i ρΚΒϊ-νβ5.3.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka bakteryjna, transformowana wektorem ekspresji obejmującym indukowalny bakteryjny promotor pod kontrolą genu laclts, przy czym gen laclts kontroluje ekspresję regionu kodującego pełnej długości rekombinacyjne białko regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 25 i 26 i która wytwarza co najmniej 300 miligramów rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27 na litr hodowli komórkowej.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna obejmująca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera rekombinacyjne pełnej długości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T posiadający wzór: aminokwas 1 do 92 w sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27 w ilości od 0,01 do 99%, korzystnie od 0,01 do 95% i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Sposób według wynalazku pozwala na wytwarzanie przydatnych ilości białek regionu V TCR o pełnej długości, które można przetwarzać w naturalny sposób otrzymując fragmenty o wielorakiej aktywności przy przetwarzaniu in vivo, podawane przez podające antygeny komórki każdego osobnika, eliminując zapotrzebowanie na „przykrawane” środki lecznicze.

Jak podano wyżej, przedmiotem wynalazku jest też klasa rekombinacyjnych wektorów ekspresji do wytwarzania białka regionu V TCR w bakteriach. Rekombinacyjne białka regionu V TCR są przydatne do leczenia, zapobiegania lub hamowania zaburzeń związanych z odpornością.

Cząsteczki TCR można łączyć z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem do stosowania jako lecznicza kompozycja.

Izolowane białka według wynalazku są przydatne do wytwarzania przeciwciał antyTCR. Alternatywnie, białka te można stosować diagnostycznie do charakteryzowania poszczególnych zaburzeń związanych z odpornością. Białka według wynalazku można stosować jako sondy diagnostyczne ze względu na zdolność wiązania z autoprzeciwciałami. Korzystne jest w wynalazku, że białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T ulegają ekspresji w nieobecności fuzyjnych białek lub zakończeń pokrewnych. Kolejną korzyścią z niniejszego wynalazku jest to, że białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T wytwarza się w handlowej ilości pozwalającej na wytwarzanie kompozycji, które są skuteczne w leczeniu

181 072 choroby autoalergicznej, w której pośredniczy białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor ekspresji do wytwarzania czystej cząsteczki białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o pełnej długości. Wektory ekspresji według wynalazku obejmują jako zasadniczy składnik region kodujący białka regionu Ϋβ5.3 receptora antygenu komórki T. Region kodujący TCR według wynalazku jest dowolną cząsteczką kwasu nukleinowego kodującego białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o pełnej długości.

Opisane tu wektory ekspresji są środkiem indukowalnej ekspresji białek regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T. W korzystnych odmianach, sekwencja kodująca regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T znajduje się pod transkrypcyjną kontrolą indukowalnego bakteryjnego promotora. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, indukowalny bakteryjny promotor poddaje się chemicznej lub termicznej regulacji. Najkorzystniej indukowalny bakteryjny promotor poddaje się termicznej indukcji.

W jednej z odmian wektor ekspresji według wynalazku obejmuje kod genu regulacyjnego białka zdolnego do wiązania z promotorem i dzięki temu blokującego transkrypcję indukowalnego promotora. W korzystnej odmianie, promotor pochodzi z operonu lac E. coli, a gen regulacyjny obejmuje działającą mutację genu represorowego E. coli lacl. Taki zmutowany gen lad (laclts) koduje wrażliwe na temperaturę białko represorowe i wykorzystując ten gen laclts można osiągnąć termiczną indukcję promotora. W korzystnej odmianie indukowalnym bakteryjnym promotorem jest promotor trc, a termiczną indukcję zapewnia gen regulacyjny laclts.

W jednej z odmian, gen regulacyjny znajduje się w kotransformowanym wektorze. W innej odmianie gen regulacyjny znajduje się w chromosomie bakteryjnej komórki gospodarza. W korzystnej odmianie, gen regulacyjny znajduje się w rekombinacyjnym wektorze ekspresji. W kolejnej korzystnej odmianie kierunek transkrypcji zmutowanego genu lad jest taki sam, jak strukturalnego genu receptora antygenu komórki T poddawanego ekspresji.

Rekombinacyjne wektory ekspresji według wynalazku mogą korzystnie obejmować sekwencję kodującą peptydu lidera lub sygnałowego. Taka sekwencja lidera, wtopiona w ramkę w położeniu 5' względem regionu kodującego region V TCR poddawanego ekspresji, steruje syntezą białka regionu V TCR z N-terminalnym liderem peptydowym, sterującym z kolei sekrecjąrekombinacyjnego białka przez błonę komórki gospodarza.

Inne odmiany wynalazku nie wykorzystują sekwencji lidera, a żądany produkt regionu V wydziela się z komórek, np. metodą ekstrakcji mocznikiem.

W korzystnej odmianie, rekombinacyjne wektory ekspresji według wynalazku obejmują w kierunku od 5' do 3': promotor trc, miejsce wiązania rybosomu, ewentualną sekwencję lidera, region kodujący pełnej długości region V receptora antygenu komórki T, kodon stopu, jeden lub więcej terminatorów transkrypcji, gen regulacyjny laclts, taki, że kierunek transkrypcji jest taki sam jak genu regionu V receptora antygenu komórki T, bakteryjny początek replikacji i gen oporności na tetracyklinę.

Izolowanym białkiem rekombinacyjnym według wynalazku, jako składnikiem kompozycji, można leczyć pacjentów z zaburzeniami związanymi z odpornością. Takie leczenie obejmuje podanie pacjentowi wymagającemu leczenia, kompozycji według wynalazku, w ilości i przez okres odpowiedni, w celu likwidacji takiego zaburzenia związanego z odpornością. Kompozycja według wynalazku pozwala na leczenie zaburzenia związanego z odpornością bez potrzeby dobierania konkretnego fragmentu peptydu i bez przycinania poszczególnych kompozycji do poszczególnego leczonego osobnika. Pełnej długości białka według wynalazku pozwalają na leczenie choroby lub zaburzenia autoalergicznego.

Krótki opis rysunków

Figura 1. Pełna nukleotydowa sekwencja (sekwencja nr id. 25 i sekwencja nr id. 26) i sekwencja aminokwasowa (sekwencja nr id. 27) pełnej długości białka νβ5.3 według wynalazku.

Figura 2. Plazmidowa mapa ρΚΤΒ-Υβ5.3. Plazmid zawiera Ptrc, promotor trc; glO, segment genowy lidera z bakteriofagu T7; SD1, miejsce wiązania rybosomu 1; MC, minicis

181 072 tron kodujący miejsce wiązania rybosomu 2 (SD2) AAG GAG (patrz sekwencja nr id. 28, kompletna sekwencja nukleotydowa minicistronu) i peptydem Met Tyr Arg Leu Asn Liz Glu Glu (sekwencja nr id. 29): STII, sekwencja lidera; Υβ5.3, region kodujący νβ5.3; T1T2, terminatory transkrypcji operonu rmB; gen laclts kodująćy wrażliwy na temperaturę represor lac; Ori, początek replikacji i Tet^r, gen oporności na tetracyklinę.

Szczegółowy opis wynalazku.

Przedmiotem wynalazku są rekombinacyjne wektory ekspresji i sposoby wydajnego wytwarzania dużych ilości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T. Białko to skutecznie można stosować do diagnozowania, leczenia, zapobiegania lub hamowania chorób lub zaburzeń związanych z odpornością.

Opracowano serię wektorów do wytwarzania znaczniejszych ilości pełnej długości białka regionu V TCR, w tym i białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T. Ponadto, opracowano sposób wytwarzania handlowo przydatnego pełnej długości rekombinacyjnego białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T stosując wektor ekspresji według wynalazku. Sposoby i wektory ekspresji według wynalazku są unikalne, ponieważ pozwalają na wytwarzanie pełnej długości regionu V receptora antygenu komórki T, w tym białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T według wynalazku pod nieobecność sekwencji zewnętrznego białka lub partnerów fuzyjnych.

Jak opisano w części o tle wynalazku powyżej, region V receptora antygenu komórki T był w przeszłości wytwarzany tylko jako część większego białka i w bardzo małych ilościach. Te zewnętrzne białka mogą powodować niepożądaną immunogeniczność przy stosowaniu in vivo i często są wymieniane przez badaczy problemu regulacji jako niedopuszczalne zanieczyszczenia. Wcześniej oczyszczone białka regionu V obejmowały inne regiony TCR, takie jak region C, sklejone z regionem V. Inne skonstruowane układy ekspresji dawały region V TCR jako białko chimeryczne, np. regionu V, sklejony z częścią cząsteczki immunoglobuliny.

Wektory ekspresji i sposoby według wynalazku pozwalają na podwyższenie poziomu ekspresji białka regionu V receptora antygenu komórki T. Pierwszą braną pod uwagę cechą przy wywarzaniu białka o przydatności handlowej, np. do badań, diagnostyki i leczenia, jest wytwarzanie handlowo przydatnych ilości białka.

Niniejszy wynalazek pozwala na wytwarzanie białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T w dużych ilościach, np. od 1 do 500 mg/litr kultury bakteryjnej lub więcej. Korzystnie, poziom wytwarzania białka według wynalazku wynosi co najmniej 100 mg/litr. W najkorzystniejszej odmianie, wynalazek pozwala na wytwarzanie co najmniej 300 mg białka νβ na litr kultury komórek bakterii.

Sposoby i wektory ekspresji według wynalazku pozwalają na wytwarzanie białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T pod nieobecność sekwencji zewnętrznego białka. Wynalazek eliminuje więc kilka etapów związanych z otrzymywaniem oczyszczonego białka regionu V TCR przy wytwarzaniu zgodnie z dotychczasowym stanem techniki. W pewnej odmianie, wynalazek pozwala na zwiększoną ekspresję białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T przez indukcję termiczną co pozwala uniknąć eliminacji chemicznych induktorów, takich jak IPTG.

Ponieważ białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T wytwarza się według wynalazku pod nieobecność zewnętrznego białka, wynalazek pozwała na uproszczone wytwarzanie względnie czystego produktu. Wynalazek eliminuje dodatkowe etapy przetwarzania, takie jak wprowadzanie enzymów lub reagentów chemicznych do układu, w celu wytworzenia białka wolnego od wszelkich sklejonych innych niż TCR segmentów peptydów lub spowinowaconych zakończeń. Takie manipulacje nie tylko zmniejszają ilość uzyskiwanego produktu regionu V, ale też wprowadzają elementy, które trzeba usuwać, np. w dodatkowych etapach oczyszczania.

1. Białko regionu V receptora antygenu komórki T.

Białko regionu V receptora antygenu komórki T jest dowolnym pełnej długości regionem V receptora antygenu komórki T. Białko pełnej długości regionu V TCR jest kodowane przez kodujący region V receptora antygenu komórki T. Kodujący region TCRV jest sekwencją nukleotydową kodującą pełnej długości białko regionu V receptora antygenu komórki T.

181 072

Region V obejmuje zmienny region receptora antygenu komórki T. Sposób według wynalazku można zastosować między innymi do wywoływania polepszonej ekspresji białka TCR, w tym regionu V i, dodatkowo, całości lub części regionów D i/lub J.

Białko regionu V TCR wytwarza się pod nieobecność sekwencji zewnętrznego białka, takiego jak np. inne regiony TCR, takie jak region stały, region transmembranowy lub region cytoplazmatyczny. Ponadto, białka regionu V TCR wytwarza się pod nieobecność partnerów fuzyjnych innych niż TCR, takich jak spowinowacone zakończenia. Ponadto, białka regionu V TCR nie powstająjako część większego chimerycznego białka, w tym części innych cząsteczek białka, takich jak białka immunoglobulinowe.

Stwierdzając, że sekwencja DNA kodująca jeden z określających komplementamość regionów (CDR) regionu V receptora komórki T może określić znane powiązanie pomiędzy regionami kodującymi V i D (jak w przypadku CDR3 of νβ5.3), w niniejszym opisie, kodujący region „pełnej długości” regionu V może obejmować całą kodującą sekwencję taką jak CDR wiążący V-D, część takiego CDR rezydującą tylko w znanym regionie V lub żadną z sekwencji kodujących dla takiego CDR. Ponadto, pełnej długości białko regionu V receptora antygenu komórki T może być dowolnym regionem V receptora antygenu komórki T i nie jest ograniczone tylko do regionów νβ (to jest regionów V łańcucha β TCR). Tak więc białko regionu V receptora antygenu komórki T może być zmiennym regionem podjednostki a, podjednostki β, podjednostki δ lub podjednostki γ.

Białko regionu V TCR oznacza dowolny region receptora antygenu komórki T, dla którego jest dostępna pełna sekwencja kodująca. Sposoby otrzymywania pełnej długości sekwencji kodujących według wynalazku są dobrze znane. Sekwencje DNA domeny ludzkiego regionu V można wydzielić zgodnie ze znanymi procedurami z różnych ludzkich komórek. Mogą to być komórki limfocytów T krwi obwodowej.

Sekwencje DNA stosowane w sposobie według wynalazku można wytwarzać na różne sposoby. Sekwencje DNA dla białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T można wytwarzać metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) stosując sekwencję kodującą DNA nietkniętego TCR jako wzorzec. Ludzki region νβ można wytwarzać np. wzmacniając cDNA wytworzony z limfocytów ludzkiej obwodowej krwi stymulowany przeciwciałem anty-CD3, zgodnie z procedurą Choi i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8941-8945.

W jednym z aspektów niniejszego rozwiązania, kodujący region V pełnej długości receptor antygenu komórki T otrzymuje się z dowolnego klonu zawierającego sekwencję pełnej długości. Np. kilka sekwencji regionu V TCR i klonów cDNA zawierających pełnej długości region kodujący opisuje Concannon i in., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6598-6602.

Białka regionu Ϋβ5.3 receptora antygenu komórki T według wynalazku to białka związane z chorobami lub zaburzeniami odporności, w szczególności np. νβ8.1 (choroba Kawasaki; patrz Abe i in., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4066), νβ6.1 (trąd; patrz Wang i in., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 188), νβ5.1 (choroba Lyme; patrz Lahesma i in., 1993, J. Immunol., 150: 4125), νβ5.2 lub νβ5.3, lub νβ6.1 (stwardnienie rozsiane; patrz Kotzin i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9161), νβ2.1 lub νβ3.1 (reumatoidalne zapalenie stawów; patrz Uematsu i in., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8354). (Patrz też Hafler, D.A. i in., 1988, J. Exp. Med., 167: 1313; i Mantgazza, R. i in., 1990, Autoimmunity, 3: 431).

TCR wytwarzany przez klon komórki T w chorobie autoalergicznej lub klon komórki T odpowiadający na szczególny autoantygen można zidentyfikować stosując specyficzne wobec TCR przeciwciała, np. poliklonalne, monoklonalne lub chimeryczne przeciwciała specyficzne dla zmiennego segmentu TCR, w połączeniu z metodą znakowania przeciwciała, w tym mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej, immunocytochemii lub innych technik znanych fachowcom. Takie przeciwciała opisano dla wielu regionów V łańcucha a i/lub β TCR (patrz np. międzynarodowa publikacja patentowa WO 90/06758).

Alternatywnie, DNA lub mRNA klonu komórki T można sondować bezpośrednio lub po wzmocnieniu metodą PCR (Synha i in., 1988, Science, 239: 1026; Saiki i in., 1986, Naturę, 324: 163) i specyficznej hybrydyzacji sondami kwasu nukleinowego dla różnych genów rodziny TCR, stosując sposoby hybrydyzacji znane fachowcom. Sekwencję TCR lub jej

181 072 część, można następnie otrzymać bezpośrednio ze wzmocnionego, przekształconego DNA lub mRNA. .

Ekspresję poszczególnych TCR można też zidentyfikować określając sekwencję kodującą kwasu nukleinowego co najmniej części TCR, np. po klonowaniu genu V TCR lub określając sekwencję aminokwasową co najmniej części białka TCR. Jest oczywiste, że dowolny z wymienionych sposobów lub dodatkowy sposób znany fachowcowi, pozwoli na identyfikację TCR poddanego ekspresji na komórce T, klonie lub linii komórek T.

Przykłady podejścia cząsteczkowego do korelacji ekspresji genu TCR z chorobą obejmują:

(1) wytwarzanie i analizę bibliotek cDNA otrzymanych z komórek T związanych z chorobą pochodzących od jednego lub wielu chorych, w celu stwierdzenia obecności częściej używanych lub „dominujących” genów TCR;

(2) analizę Southern próbek choroby, w celu określenia, czy występuje specyficzny genetyczny polimorfizm (np. RFLPs) lub oligoklonalne przekształcenia TCR;

(3) analizę próbek choroby metodą syntezy cDNA, wzmocnienia PCR i procedur hybrydyzacji kolonijnej; i (4) hybrydyzację in situ kwasu nukleinowego sond TCR z komórkami T bez wcześniejszego hodowania tych komórek.

Białka regionu V TCR obejmują Vp8.1, νβ5.2 lub νβ5.3. Dwuniciowe cDNA kodujące νβ5.3 i sekwencję aminokwasową Υβ5.3 pokazano na fig. 1 (patrz sekwencje nr id. 25,26 i 27).

Sam region V receptora antygenu komórki T można wprowadzić do wektorów ekspresji według wynalazku sposobami znanymi fachowcom. Np. z klonu cDNA syntetyzuje się region V metodą PCR włączając inicjujący ATG na końcu 5'. Można zsyntetyzować dowolne dogodne miejsce restrykcji mieszczące inicjujący kodon i odbudowujące kodujący region 5' regionu V. W korzystnej odmianie, miejsce restrykcji jest miejscem Ncol. Kodon stopu i odpowiednie miejsce restrykcji umieszcza się na końcu 3' kodującej sekwencji regionu V, aby można ją było subklonować w wektor.

Należy rozumieć, ze metodologię niniejszego wynalazku można stosować do wytwarzania pełnej długości regionów V TCR zwierząt, innych niż ludzie.

2. Wektory ekspresji.

Rekombinacyjny wektor ekspresji według wynalazku jest plazmidem zawierającym egzogenne DNA w postaci kodu kwasu nukleinowego regionu V TCR poddawanego ekspresji. Rekombinacyjny wektor ekspresji według wynalazku wprowadza się do komórki bakteryjnego gospodarzą np. metodą transformacji i transformanty wydziela się i klonuje osiągając ekspresję żądanego białka regionu V.

Niniejszy wynalazek zajmuje się wektorami ekspresji zawierającymi sekwencję DNA kodującą pełnej długości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T. Wektor ekspresji w zakresie niniejszego wynalazku jest plazmidem zawierającym gen regionu V TCR poddawany ekspresji pod transkrypcyjną i translacyjną kontrolą składników regulacyjnych, takich jak np. promotor, miejsce wiązania rybosomu i terminator transkrypcji. Ponadto, zawiera początek replikacji dla uzyskania stabilnej replikacji w bakteriach. Korzystnie obejmuje gen kodujący oporność na antybiotyk dla ułatwienia selekcji niosących plazmid transformantów komórki. Ekspresja klonowanej sekwencji zachodzi, gdy wektor ekspresji wprowadza się do właściwej komórki gospodarza.

Wektory ekspresji przydatne w niniejszym wynalazku mają często postać plazmidów. Plazmidy oznaczają kołowe dwuniciowe sekwencje DNA nie zintegrowane z chromosomem. Wektory ekspresji według niniejszego wynalazku mogą też zawierać inne sekwencje DNA, np. lidery lub sekwencje sygnałowe dające celowość lub trwałość produktowi ekspresji i/lub sekwencje regulacyjne pozwalające na modulację ekspresji genu, np. w odpowiedzi na zmianę temperatury lub składu środowiska wzrostu.

Wektory ekspresji zawierają jeden lub więcej sekwencji kontrolnych operatywnie związanych z sekwencją kodującą DNA dla regionu V TCR. Termin „operatywnie związany” w zakresie niniejszego wynalazku oznacza, że jedna sekwencja kwasu nukleinowego, mająca funkcję regulacyjną dla ekspresji genu lub kodująca funkcjonalną domenę białka, kowalencyjnie związana, po stronie 5' lub 3', z drugą sekwencją kwasu nukleinowego kodującą biał

181 072 ko, tak, ze wywiera działanie regulacyjne na drugą sekwencję kwasu nukleinowego lub zakodowana funkcjonalna domena będzie sklejona w ramce do białka kodowanego przez drugi kwas nukleinowy. Takie funkcje regulacyjne ekspresji genu typowo obejmują inicjację transkrypcji, terminację transkrypcji i przetwarzanie transkryptu mRNA. Sekwencje kwasu nukleinowego wywierające takie regulacyjne funkcje wobec ekspresji genów obejmują promotory transkrypcji, terminatory transkrypcji i sygnały przetwarzania mRNA. Funkcjonalne domeny, które mogą być „operatywnie związane” z innymi białkami obejmują np. lidery lub peptydy sygnałowe pozwalające na transport białek przez błony komórkowe.

W pewnej odmianie promotor może być dowolnym indukowalnym promotorem. W korzystnej odmianie, promotor jest regulowany obecnością lub nieobecnością pewnych składników środowiska. Fachowiec zrozumie, ze kilka bakteryjnych promotorów kontrolowanych obecnością lub nieobecnością pewnych składników środowiska można stosować w powiązaniu z wektorami ekspresji według wynalazku. Korzystnie promotor jest silnym bakteryjnym promotorem, takim jak promotor lac, promotor tac i promotor trc. Tak więc, w pewnej odmianie, promotor kodującej sekwencji regionu V TCR w wektorze według wynalazku poddaje się regulacji obecnością lub nieobecnością β-D-tiogalactopiranozydu izopropylu (IPTG), chemicznego induktora promotora lac, tac i trc. W korzystnych aspektach indukowalny IPTG promotor jest promotorem lac lub tac. W bardziej korzystnej odmianie, indukowalnym IPTG promotorem jest promotor trc (Brosius i in., 1985, J. Biol. Chem., 260: 3539-3541) podobny do promotora tac otrzymywanego przez sklejenie regionu -10 promotora lac UV5 regionem -35 operonu tryptofanowego (de Boer i in., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25; Amann i in., 1983, Gene, 25: 167-178). Promotor trc jest identyczny z promotorem tac, za wyjątkiem pojedynczej pary zasad (Brosius i in., 1985, supra).

W kolejnej odmianie, wektor ekspresji według wynalazku modyfikuje się, by pozwolić na ekspresję z wydzielaniem pełnej długości białka regionu V TCR według wynalazku dzięki zmianie temperatury. Zgodnie z tą odmianą, wektor ekspresji pozwala na ekspresję białka regionu V TCR w nieobecności chemicznych induktorów, co usuwa potrzebę stosowania takich składników, jak IPTG i bakteryjne szczepy gospodarzy zawierające geny lacl lub lacl^q. Korzystne odmiany wektorów ekspresji według wynalazku obejmują gen regulacyjny pozwalający na termiczną indukcję ekspresji białka. Sekwencją genu regulacyjnego najkorzystniej jest gen laclts, kodujący wrażliwy na temperaturę represor lac.

W kolejnej korzystnej odmianie gen laclts jest umieszczony obok, w dół od terminatora transkrypcji i kierunek jego transkrypcji jest taki sam, jak sekwencji kodującej region V.

Ponadto, plazmidy ekspresji według wynalazku korzystnie zawierają jeden lub więcej dobieralnych genetycznych znaczników. Korzystnie, dobieralny genetyczny znacznik nadaj e oporność na antybiotyk, taki jak ampicylina, kanamycyna lub tetracyklina. Najkorzystniej, dobieralny znacznik jest genem oporności na tetracyklinę.

Ponadto, wektor obejmuje bakteryjny początek replikacji. W korzystnej odmianie, początek replikacji pochodzi z pBR322. Wektor ekspresji zawiera też miejsce wiązania rybosomu, terminatory transkrypcji operonu RNA rybosomalnego rmB z E. coli (Brosius i in., 1981, Plasmid, 6: 112-118).

W korzystnej odmianie, wektor ekspresji według wynalazku zawiera jako zasadnicze składniki w kierunku od 5' do 3': sekwencję DNA zawierającą promotor i operator; sekwencję DNA zawierającą miejsce wiązania rybosomu, aby mRNA żądanego genu mógł się wiązać z rybosomami w komórce gospodarza; kodon inicjacji ATG lub sekwencję DNA przekształcaną w kodon inicjacji ATG po insercji żądanego genu w wektor; miejsce restrykcji do wprowadzania żądanego genu w ramkę z kodonem inicjacji ATG lub miejsce wielokrotnego klonowania zawierające kilka miejsc restrykcji do insercji właściwego genu lub kodującego regionu poddawanego ekspresji; sekwencję kodującą kwas nukleinowy regionu V receptora antygenu komórki T poddawanego ekspresji; oraz terminator transkrypcji, który służy do skutecznego kończenia transkrypcji. Wektor zawiera też sekwencję DNA zawierającą początek replikacji z bakteryjnego plazmidu zdolnego do autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza i sekwencję DNA zawierającą gen związany z wybieralnym lub identyfikowalnym fenotypowym znakiem przejawiającym się, gdy wektor znajduje się w gospodarzu.

181 072

Wektor ekspresji może ewentualnie obejmować sygnałową lub liderową kodującą sekwencję operatywnie związaną, to jest sklejoną w ramce, z końcem 5' sekwencji kwasu nukleinowego kodującej region V TCR, aby translacja sekwencji lider-region V TCR dała białko fuzyjne peptydu lidera-regionu V TCR, w którym peptyd lider na końcu aminowym białka fuzyjnego steruje sekrecją białka regionu V TCR przez błony komórkowe gospodarza. W pewnych korzystnych odmianach, wektor ekspresji zawiera gen regulacyjny pozwalający na ekspresję wydzielanego białka przez zmianę temperatury.

W korzystniejszej odmianie, wektor ekspresji obejmuje następujące zasadnicze składniki w kierunku od 5' do 3': promotor trc złożony z regionu -10 promotora lac UV5 sklejonego z regionem -35 operonu tryptofanowego (de Boer i in., supra; Amann i in. (1983), supra); silne miejsce wiązania rybosomu; region kodujący region V TCR poddawanego ekspresji; dwa terminatory transkrypcji operonu RNA rybosomalnego rmB; gen laclts kodujący wrażliwy na temperaturę represor lac; początek replikacji pBR322 i gen oporności na tetracyklinę. Przykład takiej korzystnej odmiany, wektor ekspresji ρΚΒϊ-νβ5.3 złozono zgodnie z Umową Budapeszteńską w American Type Culture Collection (ATCC) pod numerem dostępu 69739 6 stycznia 1995.

Wektory ekspresji według wynalazku mogą zawierać sekwencję lidera kodującą peptyd sygnałowy operatywnie związany z końcem 5' regionu kodującego region V TCR. W czasie ekspresji, aminoterminalny peptyd sygnałowy będzie kierował wydzielaniem białka regionu V TCR przez błony komórek gospodarza, do peryplazmy lub środowiska kultury. Fachowiec zrozumie, że z wektorem ekspresji według wynalazku można stosować wiele sekwencji lidera. Jedną przydatną sekwencją lidera jest sygnałowa sekwencja pelB z E. carotovara (Lei i in., 1987, J. Bacteriology, 169: 4379-4383). Inną dogodną sekwencją lidera jest odporna na ciepło sygnałowa sekwencja enterotoksyna II (STU) E. coli (Morioka-Fujimoto i in., 1991, J. Biol. Chem., 266: 1728-1732).

W pewnej odmianie, układ ekspresji zawiera sekwencję lidera STII, a kodujący region dla regionu V jest zsyntetyzowany metodą PCR i zawiera właściwe miejsce restrykcji na końcu 3' i wstawione miejsce Mlul na końcu 5', a więc dogodnie wiąże się z miejscem Mlul włączonym na końcu 3' lidera STII. Tak więc, w kolejnej korzystnej odmianie, wektor ekspresji obejmuje w kierunku od 5' do 3': promotor trc złożony z regionu -10 promotora lac UV5 sklejonego z regionem -35 operonu tryptofanowego; silne miejsce wiązania rybosomu; lider STII; region kodujący region V receptora antygenu komórki T poddawanego ekspresji; terminatory transkrypcji operonu RNA rybosomalnego rmB; gen laclts kodujący wrażliwy na temperaturę represor lac; początek replikacji pBR322 i gen oporności na tetracyklinę. W najkorzystniejszej odmianie, wektorem ekspresji jest ρΒΚ-Υβ5.3.

Wektory ekspresji według wynalazku można konstruować stosując standardowe techniki znane fachowcom (patrz np. Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Przedmiotem niniejszego wynalazku są dodatkowo komórki gospodarza zawierające wektor ekspresji zawierający sekwencję DNA kodującą pełnej długości region V TCR. Ponadto, korzystnie komórki gospodarza zawierają wektor ekspresji zawierający jedną lub więcej sekwencji kontrolnych DNA zdolnych do kierowania replikacją i/lub ekspresją sekwencji DNA kodujących pełnej długości białko regionu V receptora antygenu komórki T. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują prokariotyczne komórki gospodarza; a w korzystnych aspektach, prokariotyczne komórki gospodarza to komórki bakteryjne, najkorzystniej komórki E. coli. Fachowiec zrozumie z niniejszego opisu, że poszczególne użyte wektory ekspresji wpłyną na dobór szczepów gospodarzy wybranych do wytwarzania pełnej długości białka regionu V TCR. Na przykład, w wektorach ekspresji podatnych na chemiczną indukcję w zakresie niniejszego wynalazku, szczególnie przydatne są szczepy bakteryjnych gospodarzy zawierające geny lacl lub lacl^q, które regulują promotor trc. W wektorach ekspresji w zakresie niniejszego wynalazku zawierających gen regulacyjny, taki jak gen laclts, dający wrażliwy na temperaturę represor, przydatne są szczepy bakteryjnych gospodarzy nie zawierające dzikiego typu genów lacl lub lacl^q. Szczególnie korzystną komórką gospodarza jest LJ24.

181 072

W pewnych odmianach wektor ekspresji według wynalazku nie zawiera sekwencji lidera. W pewnych korzystnych odmianach bakteryjnym gospodarzem jest szczep E. coli BL21 lub korzystniej pozbawiony proteazy szczep E. coli, taki jak SG21163, SG22094 lub SG21173.

Wektory ekspresji według wynalazku można wprowadzać do komórki gospodarza różnymi znanymi sposobami, które będą się zmieniać w zależności od rodzaju komórek gospodarza. Na przykład, dla komórek prokariotycznych zwykle stosuje się działanie chlorkiem wapnia lub elektroporację (patrz ogólnie Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Po wprowadzeniu wektora ekspresji do odpowiednich komórek gospodarza, komórki gospodarza poddaje się hodowli w warunkach pozwalających na ekspresję dużych ilości regionu V TCR.

Komórki gospodarza zawierające wektor ekspresji zawierający sekwencję kodującą DNA białka regionu V TCR można zidentyfikować właściwymi środkami. W następujących przykładach, np. wytwarzanie białka regionu V wykrywa się immunologicznie stosując test immunologiczny. Alternatywnie, komórki gospodarza zawierające wektor ekspresji według wynalazku można zidentyfikować testując poziom transkrypcji DNA regionu V TCR metodą pomiaru specyficznego wobec transkryptów mRNA regionu V TCR w komórkach gospodarza (np. metodą analizy Northern). Z kolei w innym sposobie komórki zawierające wektor ekspresji według wynalazku można zidentyfikować metodą hybrydyzacji DNA-DNA stosując sondy komplementarne do sekwencji kodującej region V TCR wektora.

Sekwencje DNA według niniejszego wynalazku, wektory ekspresji lub cząsteczki DNA można określić na wiele różnych sposobów znanych fachowcom, np. metodą dideoksyterminacji łańcucha opisanąprzez Sangera i in., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467.

Korzystając z niniejszych przykładów i jednej lub więcej metod wykrywania opisanych powyżej, fachowiec może bez zbędnego eksperymentowania łatwo dobrać kombinacje wektorów ekspresji i komórek gospodarza dających optymalną ekspresję białka regionu V TCR. Łącząc poszczególny szczep gospodarza z poszczególnym wektorem ekspresji według wynalazku, możliwe jest uzyskanie względnie wysokiego poziomu ekspresji pełnej długości białka receptora komórki T. Korzystnie, poziom ekspresji pełnej długości białka regionu V TCR wynosi co najmniej 300 mg na litr kultury. Takie poziomy ekspresji można otrzymać np. stosując korzystną odmianę, w której E. coli SG21173 jest bakteryjnym szczepem gospodarza, apKBi-Vp5.3 jest wektorem ekspresji (patrz przykłady, poniżej). Takie kombinacje gospodarza i wektorów ekspresji według wynalazku pozwalają na wytwarzanie znaczących ilości pełnej długości białka receptora komórek T taniej niż dotychczas.

Po poddaniu ekspresji, białka według wynalazku można oczyścić zgodnie ze standardowymi procedurami, w tym przez strącanie siarczanem amonu, chromatografię powinowactwa, chromatografię kolumnową, żelową elektroforezę i tym podobne. (Patrz ogólnie, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)).

W korzystnej odmianie, region V receptora antygenu komórki T jest rozpuszczalny w układzie wodnym. „Rozpuszczalne” białko charakteryzuje się ogólnie brakiem sedymentacji w temperaturze pokojowej przy intensywnym odwirowaniu (100000 g) z wodnego bufora. Rozpuszczalność jest szczególnie ważna dla ułatwienia oczyszczenia białka regionu V TCR z wytwarzających komórek. Wodne bufory stosowane w chemii białek zwykle zawierają związek buforujący utrzymujący dane pH (zwykle w zakresie fizjologicznym około 5-9), dający daną siłę jonową (typowo pomiędzy około 10 mM i około 500 mM) i często zawierający inhibitor proteazy i łagodny detergent. Przykłady standardowych buforów to solanka buforowana fosforanem, solanka buforowana Tris lub jeden z wielu buforów stosowanych przy wydzielaniu białka (patrz ogólnie: Methods in Enzymology; Mahler and Cordes Biological Chemistry (wyd. 2), Harper and Row, New York (1996)).

3. Zastosowanie białek regionu V receptora antygenu komórki T.

Niniejszy wynalazek pozwala po raz pierwszy wydajnie i ekonomicznie wytwarzać diagnostycznie, leczniczo i badawczo przydatne ilości białka regionu V TCR nie będącego białkiem fiizyjnym lub związanym z zewnętrzną sekwencją taką jak spowinowacone zakończenie.

181 072

A. Zastosowanie diagnostyczne i badawcze.

Białka regionu V TCR według wynalazku są przydatne do strukturalnych i funkcjonalnych badań receptora antygenu komórki T (TCR). Poza zastosowaniem jako podłoża lub domeny wiążące specyficzne formy TCR, białka te mogą służyć jako narzędzia do badań konformacyjnych, np. służąc jako przybliżenie rodziny konformacji różnych części receptora komórki T.

Białka regionu V komórki T można też stosować jako sondy diagnostyczne. W jednej specyficznej odmianie białka regionu V TCR według niniejszego wynalazku można stosować do określania zawartości lub obecności pewnych podrodzin regionu V TCR w próbce biologicznej. Jeden taki test opisuje Rittershaus, C.W., Międzynarodowa Publikacja Patentowa WO 92/08981, zatytułowana „Therapeutic and Diagnostic Methods Using Total Leukocyte Surface Antigens”. Jako taki, niniejszy wynalazek daje sposoby diagnozowania chorób związanych z odpornością, takich jak stwardnienie rozsiane (MS), wykrywając specyficzny podzbiór komórek T związanych z chorobą.

W innej odmianie niniejszy wynalazek można stosować do wytwarzania znaczących ilości białka regionu V receptora antygenu komórki T do stosowania do wytwarzania przeciwciał. Przeciwciała można wytwarzać stosując dowolne techniki dobrze znane fachowcom. Do wytwarzania monoklonalnego przeciwciała (MAb), można stosować dowolny sposób pozwalający na wytwarzanie cząsteczek przeciwciał w ciągłej linii komórek w kulturze. Sposoby te obejmują, między innymi, techniki hybrydomowe oryginalnie opisane przez Kohlera i Milsteina, 1975, Naturę, 256: 495-497; nowsze techniki hybrydomowe ludzkich komórek B (Kozbor i in., 1983, Immunology Today, 4: 72); technikę EBV (Cole i in., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 71-96 (1985)); i techniki urazowe. Przegląd sposobów wytwarzania przeciwciał daje Hartlaw, E. i in., Antibodies: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Białka regionu V TCR według wynalazku można stosować jako sondy diagnostyczne oparte na ich zdolności do reakcji z autoprzeciwciałami obecnymi w próbce biologicznej.

Niniejszy wynalazek obejmuje też znaczone pochodne białka regionu V TCR, które można wykrywać na właściwych przyrządach obserwacyjnych, takich jak liczniki scyntylacyjne i Geigera lub film radiograficzny. Takie pochodne obejmują np. ^r25I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³⁵S, ³H, ^1Γ2Ιη, ⁹⁹M, Tc i tym podobne, dla celów diagnostycznych in vitro i in vivo.

B. Zastosowanie lecznicze.

Jak wspomniano powyżej, niniejszy wynalazek daje sposób leczenia chorób związanych z odpornością. Termin „choroby związane z odpornością” w niniejszym opisie odnosi się do chorób, w których układ odpornościowy jest wmieszany w patogenezę choroby lub w których odpowiednia stymulacja układu odpornościowego może spowodować zabezpieczenie przed chorobą. Choroby takie obejmują, między innymi, autoalergie, choroby nowotworowe, choroby zakaźne, nadwrażliwość, przeszczepy, reakcję gospodarza przeciw przeszczepowi i degeneracyjne choroby układu nerwowego. Autoalergiczne choroby obejmują, między innymi, zapalenie stawów, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, cukrzycę typu I, cukrzycę młodzieńczą, stwardnienie rozsiane, autoalergiczne zapalenie tarczycy (zapalenie tarczycy Hashimoto), myasthenia gravis, układowy liszaj rumieniowaty (SLE), syndrom Sjógrena, chorobę Gravesa, chorobę Addisona, syndrom Goodpastuer’a, twardzinę skóry, zapalenie skómo-mięśniowe, obrzęk śluzowaty, zapalenie wielomięśniowe, anemię złośliwą, zapalne choroby jelit, w tym chorobę Crohna i autoalergiczne zanikowe zapalenie żołądka i autoalergiczna anemia hemolityczna. Choroby nowotworowe obejmują, między innymi, choroby rozprzestrzeniające się przez limfę, takie jak białaczki, chłoniaki, chłoniaki nieHodgkina i Hodgkina i raki, takie jak rak piersi, okrężnicy, płuc, wątroby, trzustki, czerniak, rak nerki i tym podobne. Choroby zakaźne obejmują między innymi infekcje wirusowe powodowane przez wirusy, takie jak HIV, HSV, EBV, CMB, grypy, Hepatitis A, B lub C; grzybice, takie jak powodowane przez drożdże rodzaju Candida·, infekcje pasożytów, takie jak te powodowane przez schistosomy, filaria, nematody, trychinozy lub pierwotniaki, takie jak trypanosomy powodujące śpiączkę, plazmodia powodujące malarię lub leishmanie powodujące leishmaniasis; oraz bakteryjne infekcje, takie jak powodowane przez prątki, maczugowce

181 072 lub gronkowce. Choroby nadwrażliwościowe obejmują między innymi nadwrażliwości typu I, takie jak zetknięcia z alergenami prowadzące do alergii, nadwrażliwości typu II, takie jak występujące w syndromie Goodpasture’a i myasthenia gravis.

Terapeutyczne zastosowanie białka regionu V TCR według wynalazku opiera się na korelacji pomiędzy specyficzną chorobą związaną z odpornością i preferencyjną ekspresją poszczególnego białka regionu V receptora antygenu komórki T lub szerokim zastosowaniem szczególnej sekwencji kodującej białka regionu V TCR. Chociaż niniejszy wynalazek nie powinien się ograniczać do żadnej szczególnej teorii naukowej, regiony V TCR są przydatne częściowo, ponieważ można ich użyć do regulacji odpowiedzi immunologicznej u osobnika. W szczególności tam, gdzie obecność lub nienormalnie wysoka ekspresja szczególnego regionu V koreluje ze szczególnym związanym z odpornością zaburzeniem, można leczyć pacjenta neutralizując komórki T niosące to szczególne białko regionu V. Ponadto, wprowadzenie białka regionu V TCR może wywierać immunosupresyjne funkcje poprzez stymulację regulacyjnych komórek T, które będą specyficznie oddziaływać z komórkami T niosącymi dany region V. Jest też możliwe, że białka regionu V TCR mogą wywoływać odpowiedź przeciwciała, specyficznie oddziałującą z docelowym regionem V na komórce T i w ten sposób modulować odpowiedź immunologiczną.

Pełnej długości białka regionu V receptora antygenu komórki T według wynalazku dają znaczące korzyści przy leczeniu związanych z odpornością chorób. Przed niniejszym wynalazkiem możliwości lecznicze dla związanych z odpornością chorób z zaangażowaniem specyficznych komórek T obejmowały: (a) brak leczenia z możliwym samorzutnym wyleczeniem; (b) leczenie peptydami odpowiadającymi odrębnym segmentom regionu V receptora antygenu komórki T; (c) niespecyficzne leczenie np. sterydami lub niesterydowymi środkami przeciwzapalnymi. Jednak żaden z tych sposobów nie daje konkretnych korzyści niniejszego wynalazku. Sposoby leczenia według wynalazku dają szczególną korzyść nad dotychczasowymi sposobami leczenia związanymi z odpornością chorób polegającą na tym, że niniejsze sposoby skupiają się tylko na szczególnym podzbiorze komórek T wydzielającym szczególny region V TCR i mogą być stosowane dla szerokiego spektrum pacjentów, ponieważ wynalazek pozwala na eliminację potrzeby wybierania szczególnego peptydu opartego na haplotypie MHC danego pacjenta. Sposób według wynalazku zbliża się bardziej do celu, jakim jest modulowanie tylko komórek T związanych z chorobą, oszczędzając lub nie naruszając komórek T u pacjenta. Wynalazek pozwala więc na osiągnięcie większej specyficzności terapii w większej populacji.

W korzystnej odmianie, pełnej długości białko regionu V receptora antygenu komórki T można stosować do minimalizacji lub eliminacji podzbioru komórek T wykazujących TCR mające ten sam region V. Białko regionu V receptora antygenu komórki T można stosować przy leczeniu do modulowania aktywności komórek T niosących szukany region V lub do indukowania braku odpowiedzi w aktywnie odpowiadającej populacji komórek T niosących szukany region V. W tej sytuacji receptor antygenu komórki T stosuje się jako terapeutyczną kompozycję dla pacjenta.

Specyficzne białka regionu V receptora antygenu komórki T związane z daną chorobą identyfikuje się stosując jedną z wielu technik dobrze znanych fachowcom. Genetyczne podejście z wykorzystaniem pacjentów mających zdiagnozowaną myasthenia gravis lub stwardnienie rozsiane opisał Oksenberg, J.R. i in., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 988-992.

Termin „leczenie” w niniejszym wynalazku ma obejmować sytuacje „zapobiegania”, „hamowania” lub „leczenia” choroby. „Zapobieganie” oznacza podawanie zabezpieczającej kompozycji przed indukcją choroby. Tak więc np. w zwierzęcym modelu doświadczalnego autoalergicznego zapalenia mózgu i rdzenia, EAE, udane podawanie zabezpieczającej kompozycji przed wstrzykiwaniem encefalitogenu indukującego chorobę spowodowało „zapobieganie” chorobie.

„Hamowanie” oznacza podawanie kompozycji po indukcji choroby, ale przed klinicznym pojawieniem się choroby. Ponownie na przykładzie EAE, udane podawanie zabezpieczającej kompozycji po wstrzykiwaniu encefalitogenu, ale przed pojawieniem się neurologicznych symptomów, spowodowało „hamowanie” choroby.

181 072 „Leczenie” oznacza podawanie zabezpieczającej kompozycji po pojawieniu się choroby. Na przykładzie EAE, udane podawanie zabezpieczającej kompozycji po wstrzykiwaniu encefalitogenu i po pojawieniu się klinicznych oznak dało „leczenie” choroby.

W celu zmierzenia zapobiegawczych, hamujących lub leczniczych korzyści z białka regionu V TCR według niniejszego wynalazku, zmierzono pewne kliniczne wyniki. W szczególności, można zmierzyć zmianę w namnazaniu się limfocytów in vitro. Testy miary leczniczych korzyści ze stosowania poszczególnych białek regionu V są znane fachowcom.

Są dostępne modele zwierzęce, które można stosować do oceny skuteczności białek w chronieniu lub leczeniu choroby. Liszaj owaty rumień układowy (SLE) bada się na podatnych myszach, jak opisuje Knight i in., 1978, J. Exp. Med., 147: 1653 i Reinersten i in., 1978, 299: 515. Myasthenia gravis (MG) bada się na samcach myszy SJL/J indukując chorobę rozpuszczalnym białkiem AChR innego gatunku, jak opisuje Lindstrom i in., 1988, Adv. ImmunoL, 42: 233-284. Zapalenie stawów indukuje się u podatnego szczepu myszy wstrzykując kolagen typu II, jak opisuje Stuart i in., 1984, Ann. Rev. Immunol., 42: 233-284. Młodzieńcze zapalenie stawów indukuje się u podatnych szczurów wstrzykując białko prątków po wstrząsie cieplnym, jak opisuje Van Eden i in., 1988, Naturę, 331: 171-173. Zapalenie przysadki indukuje się u myszy podając tyroglobulinę, jak opisuje Maron i in., 1980, 152: 1115-1120. Cukrzyca insulinozależna (IDDM) występuje naturalnie lub można ją indukować u pewnych szczepów myszy, takich jak opisane przez Kanasawę i in. (1984). EAE u myszy i szczurów służy jako model MS u ludzi. W tych modelach, chorobę demielinacyjną indukuje się podając podstawowe białko mielinowe (MBP), jak opisuje Paterson, P.Y., Textbook of Immunopathology (wyd. Mischer i in.), Grune and Stratton, New York, str. 179-213 (1986); McFarlin, D.E. i in., 1973, Science, 179: 478-480 i Satoh, J. i in., 1987, J. Immunol., 138: 179-184.

Oczywiście, identyczne białka mogą nie być skuteczne u ludzi, ponieważ mogą nie odpowiadać właściwym miejscom na związanym z chorobą ludzkim TCR. Należy rozumieć, że mogą być konieczne modyfikacje sekwencji białka opracowanego na danym modelu zwierzęcym do leczenia pacjentów innych gatunków, w tym ludzi.

4. Kompozycje farmaceutyczne zawierające region V receptora antygenu komórki T.

Białka i kompozycje według wynalazku lub ich funkcjonalne pochodne, dobrze nadają się do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać każdemu zwierzęciu, które może odczuć skutki korzystnego działania kompozycji według wynalazku. Przede wszystkim chodzi o ludzi, ale wynalazek nie jest w zamierzeniu tak ograniczony.

Farmaceutyczne kompozycje według niniejszego wynalazku można podawać w dowolny sposób pozwalający na osiągnięcie żądanego celu. Np. podawanie może być pozajelitowe, podskórne, dożylne, doskóme, domięśniowe, dootrzewnowe, przezskóme lub doustne. Alternatywnie lub równolegle, podawanie może być doustne. Białka i kompozycje farmaceutyczne można podawać pozajelitowo w dużym zastrzyku lub stopniowo w postaci wlewki.

Dawkowanie będzie zależało od wieku, płci, stanu zdrowia i masy przyjmującego, rodzaju ewentualnego jednoczesnego leczenia, częstości leczenia i natury żądanego efektu. Zakresy podawanych dawek kompozycji według wynalazku są na tyle duże, aby uzyskać żądany efekt, np. osiąga się odpowiedź immunologiczną na białko mierzoną opóźnioną nadwrażliwością (DTH) wytwarzaniem przeciwciał, a związanej z odpornością chorobie znacząco zapobiega się, hamuje się ją lub leczy. Dawki nie powinny być na tyle duże, aby powodować szkodliwe skutki uboczne, takie jak niechciane reakcje krzyżowe, uogólnione hamowanie odporności, reakcje anafilaktyczne i tym podobne.

Korzystne dawki dla ludzi wahają się pomiędzy około 0,001-1 mg/kg masy ciała.

Poza białkami według wynalazku, które są same farmakologicznie aktywne, kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki będące zarobkami i substancjami pomocniczymi ułatwiającymi przetwarzanie aktywnych związków w preparaty, które można stosować farmaceutycznie. Korzystnie kompozycje obejmują jeszcze adiuwant, taki jak ałun lub inne znane substancje (patrz np. Warren i in., 1986, Ann. Rev. Immunol., 4: 369-388; Chedid, L., 1986, Feder. Proc., 45: 2531-2560).

181 072

W celu polepszenia dostępności lub bioaktywności, białka można włączać w liposomy stosując sposoby i związki znane fachowcom.

Preparaty podawane doustnie w postaci tabletek i kapsułek, preparaty podawane doodbytniczo, takie jak czopki i preparaty w postaci roztworów do zastrzyków lub doustne, zawierają około 0,001 do około 99%, korzystnie od około 0,01 do około 95% aktywnego związku (związków), wraz z zaróbką.

Odpowiednie zarobki to, w szczególności, wypełniacze, takie jak cukry, np. laktoza lub sacharoza, mannitol lub sorbitol, preparaty celulozowe i/lub fosforany wapnia, np. fosforan trójwapnia lub wodorofosforan wapnia, a także środki wiązące, takie jak pasta skrobiowa, z np. skrobią kukurydzianą pszenną ryżową ziemniaczaną żelatyną tragakantem, metylocelulozą hydroksypropylometylocelulozą karboksymetylocelulozą sodową i/lub poliwinylopirolidonem.

Inne farmaceutyczne preparaty do stosowania doustnego obejmują rozkładane kapsułki żelatynowe, a także miękkie, zatapiane kapsułki z żelatyny i plastyfikatora, takiego jak gliceryna lub sorbitol. Rozkładane kapsułki mogą zawierać aktywne związki w postaci granulek, zmieszanych ewentualnie z wypełniaczami, takimi jak laktoza, środkami wiążącymi, takimi jak skrobie i/lub środkami smarującymi, takimi jak talk lub stearynian magnezu i, ewentualnie, stabilizatorami. W miękkich kapsułkach, aktywne związki są korzystnie rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich cieczach, takich jak oleje tłuszczowe lub ciekłe parafiny. Ponadto, można dodawać stabilizatory.

Możliwe farmaceutyczne preparaty, które można stosować doodbytniczo obejmują np. czopki, które składają się z połączenia jednego lub więcej aktywnych związków z podłożem czopka. Odpowiednie podłoże to np. naturalne i syntetyczne triglicerydy lub parafinowe węglowodory. Ponadto, jest też możliwe stosowanie żelatynowych doodbytniczych kapsułek składających się z połączenia aktywnych związków z podłożem. Możliwe podłoża obejmują np. ciekłe triglicerydy, glikole polietylenowe lub parafinowe węglowodory.

Odpowiednie kompozycje do pozajelitowego podawania obejmują wodne roztwory białek w postaci rozpuszczalnej w wodzie, np. rozpuszczalnej w wodzie soli. Ponadto, można podawać zawiesiny białek jako odpowiednie zawiesiny olejowe. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub nośniki obejmują oleje tłuszczowe, np. olej sezamowy lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, np. oleinian etylu lub triglicerydy. Wodne zawiesiny do zastrzyków zawierające substancje zwiększające lepkość zawiesiny obejmują np. karboksymetylocelulozę sodową sorbitol i/lub dekstran. Ewentualnie zawiesiny mogą też zawierać stabilizatory.

Białka przygotowuje się stosując konwencjonalne farmaceutycznie dopuszczalne pozajelitowe nośniki do zastrzyków. Te nośniki są nietoksyczne i lecznicze i pewną liczbę takich preparatów opisuje Remington’s Pharmaceutical Sciences (wyd. Martin, E.W.) Mack Publishing Co. Easton, PA (1990). Nie ograniczające przykłady zarobek to wodą solanką roztwór Ringerą roztwór glukozy i zrównoważony roztwór soli Hanka. Preparaty według wynalazku mogą też zawierać małe ilości dodatków, takich jak substancje utrzymujące izotoniczność, fizjologiczne pH i stabilność.

Białka według wynalazku korzystnie komponuje się w postaci oczyszczonej, zasadniczo wolnej od agregatów i innych białek, korzystnie w stężeniu około 1,0 ng/ml do 100 mg/ml.

Skuteczne dawki białek według wynalazku do zapobiegania, hamowania lub leczenia związanych z odpornością chorób mieszczą się w zakresie od około 1 ng do 100 mg/kg masy ciała. Korzystny zakres dawek znajduje się pomiędzy około 10 ng i 10 mg/kg masy ciała. Bardziej korzystny zakres dawek znajduje się pomiędzy około 100 ng i 1 mg/kg masy ciała.

Sposoby zwiększania skuteczności białek są znane fachowcom. Te techniki można stosować w połączeniu z białkami według wynalazku.

Poniższe przykłady mają charakter ilustracyjny i nie ograniczają wynalazku.

PRZYKŁADY

W przykładach zastosowano następujące ogólne techniki.

1. Ogólne materiały i metodyka.

A. Bakterie, plazmidy i sposoby ogólne.

181 072

Escherichia coli GM2929, metylazowo negatywna i E. coli LT24 (delecja lac) (Rasmussen i in., 1991, J. Bacteriology, 173: 6390-6397) były sprezentowane przez dr Martina Marinusa, University of Massachusetts Medical Scholl, Worcester, MA. E. coli JM109 (Yanisch-Perron i in., 1985, Gene, 33: 103-119) zakupiono z Promega Corporation, Madison, WI (USA). BL21 (lon^-, ompT^-) (Wood, W.B., 1966, J. Mol. Biol., 16: 118-133; Studier i Moffatt, 1986, J. Mol. Biol., 189: 113-130) zakupiono z Novagen, Madison, WI (USA). SG22094 (lon^-, cip^-), SG21163 (lon^-, htpr^-) i SG21173 (lon^-, htpr^-, cip^-) były sprezentowane przez dr Susan Gottesman, National Institutes of Health, Bethesda, MD (USA). Szczepy Gottesman miały delecję genu lacl. Bakterie przygotowano do transformacji sposobem Morrisona, 1979, Meth. Enzymology, 68: 326-331 lub nabyto (DH5a) z GibcoBRL, Gaithersburg, MD (USA).

pKK233-2 (Amann i Brosius, 1985, Gene, 40: 183-190) nabyto z Pharmacia, Piscataway, NJ (USA). pBR322 (Bolivar i in., 1911, Gene, 2: 95-113) otrzymano z New England Biolabs, Beverly, MA (USA). pBluescript II KS+ (Alting-Mess i in., 1992, Meth. Enzymology, 216: 483-495) otrzymano z Stratagene, La Jolla, CA (USA). pDC952 zawierające gen argU (dnaY) (Lindsey i in., 1989, J. Bacteriology, 171: 6197-6205) był sprezentowany przez dr Jamesa R. Walkera, University of Texas, Austin, TX. pSE420 (Brosius, 1992, Meth. Enzymology, 216: 469-483) i pKK480-3 (Brosius (1992), supra) były sprezentowane przez dr Jurgena Brosiusa, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY. pUCts (Bukrinsky i in., 1988, Gene, 70: 415-417) otrzymano od Michaiła I. Bukrinsky’ego via Jurgen Brosius.

Konstrukty plazmidowe wykonano w standardowy sposób (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Enzymy do restrykcji i modyfikacji DNA zakupiono z New England Biolabs, jeśli nie podano inaczej i użyto zgodnie z opisem producenta. Syntetyczne oligonukleotydy zakupiono z Operon Technologies, Inc., Alameda, CA (USA), jeśli nie podano inaczej.

Oligonukleotydy zgrzano ze sobą mieszając równomolowe stężenia komplementarnych oligonukleotydów w 10 mM Tris pH 8,0, 5 mM MgCl₂ i umieszczając w temperaturze 10Ó°C na 5 minut, a następnie chłodząc powoli do 25°C. Przeprowadzono polimerazową reakcję łańcuchową (PCR) (Saiki i in., 1988, Science, 239: 487-491) w urządzeniu Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler firmy, stosując zestaw reagentów GeneAmp (The Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT (USA)). Sekwencjonowanie DNA wykorzystywało metodę dideoksynukleotydowej tenninacji łańcucha (Sanger i in., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) stosując zestaw Seąuenase (U.S. Biochemical, Cleveland, OH (USA)). Wszystkie chemiczne reagenty były najwyższej dostępnej czystości.

B. Wzrost i indukcja kultur komórek.

Dla kultur indukowanych chemicznie, użyto zamrożonego roztworu glicerynowego do zaszczepienia 5-25 ml pożywki 2ΧΥΤ (16 g Bacto-Tryptone (Difco 0123), 10 g Bacto-Yeast Extract (Difco 0127), 10 g NaCl, pH 7,2-7,4, na litr wody) zawierającego 6 pg/ml tetracykliny i pozostawiono do wzrostu przez noc w temperaturze 37°C, 280 obrotów na minutę. Typowo, 1/100 objętości kultury po nocy użyto do zaszczepienia każdej z dwu 125 ml kolb zawierających 25 ml pożywki 2ΧΥΤ z 6 pg/ml tetracykliny. Kultury hodowano w temperaturze 37°C, 280 obrotów na minutę aż Asso wynosiło 0,5-1,0 jednostek absorbancji, a następnie indukowano 1 mM β-D-tiogalaktopiranozydu izopropylu (IPTG) i pozostawiono do wzrostu na 2 godziny.

Dla termicznej indukcji kultury hodowano w temperaturze 30°C, 280 obrotów na minutę az A580 wynosiło 0,5-1,0 jednostek absorbancji. Następnie, jedną kulturę trzymano w temperaturze 30°C, a drugą indukowano przenosząc do łaźni wodnej w temperaturze 42°C i pozostawiono do wzrostu na 2 godziny. Alternatywnie, kulturę indukowano przez wzrost w temperaturze 30°C aż A580 wynosiło 0,3-0,6 jednostek absorbancji i następnie podzielono na dwie porcje; jedną trzymano w temperaturze 30°C, a drugą ogrzano do 42°C.

Aby przetestować wyniki indukcji, usunięto podwójne próbki równoważne na 1 ml komórek przy A580 = 1 (np. zakładając A580 = 3,0, usunięto 333 μΐ kultury). Próbki odwirowano w mikro wirówce Eppendorfa przy 14000 g przez minutę, supematanty odrzucono i granulki komórek przechowywano w temperaturze -20°C.

181 072

C. Badanie stabilności.

Bakterie podzielono na pojedyncze kolonie trzykrotnie i pojedynczą kolonię z trzeciej płytki użyto do zaszczepienia 200 ml pożywki 2ΧΥΤ zawierającej 6 pg/ml tetracykliny. Kultury hodowano do Asso = 0,5-1,0 jednostek absorbancji i 60 ml usunięto, zmieszano z 40 ml gliceryny i porcje 1 ml podzielono pomiędzy 100 fiolek przechowywanych w temperaturze -80°C. Pozostałość kultury podzielono na dwie porcje; jedną inkubowano bez indukcji, drugą indukowano dodając IPTG lub podnosząc temperaturę. Obie kultury pozostawiono do wzrostu przez 2 godziny. Próbki równoważne 1 ml kultury przy A580 ⁼ 1,0 usunięto przed i po 2 godzinach po indukcji i testowano na absorbancję A580, pH i wytwarzanie białka metodą EIA, elektroforezę na żelu akrylamidowym i analizę Western.

Trzy fiolki z zamrożonego banku testowano równolegle na wzrost bakterii i wytwarzanie białka. Każdą fiolkę (1 ml) użyto do zaszczepienia 200 ml pożywki 2ΧΥΤ z 6 pg/ml tetracykliny i inkubowano do A₅8o = 0,5-1,0 jednostek absorbancji. Następnie każdą kulturę podzielono na dwie porcje; jedną inkubowano bez indukcji, drugą indukowano chemicznie lub termicznie. Próbki równoważne 1 ml kultury przy Asso = 1,0 usunięto z obu kultur przed i po 2 godzinach po indukcji i testowano jak opisano powyżej.

Dla zbadania stabilności, 1 ml porcję usunięto z jednej z trzech równoległych kultur przed indukcją, rozcieńczono 1/1000 w pożywce 2ΧΥΤ i 20 μΐ lub 200 μΐ zaszczepiono do 100 ml pożywki 2ΧΥΤ z tetracykliną i pozostawiono do wzrostu do Asso = 0,5-1,0 jednostek absorbancji. Następnie kultury podzielono na dwie porcje; jedną indukowano i obie pozostawiono do wzrostu przez 2 godziny. Próbki równoważne 1 ml kultury przy A580 =1,0 usunięto przed i po 2 godzinach po indukcji i testowano jak opisano powyżej.

D. Frakcjonowanie komórek.

Komórki granulowano przez odwirowanie przy 7000 g, 3 minuty i supematant (pożywkę kultury) jeszcze raz odwirowano przy 14000, 5 minut, przed elektroforezą. Granulki komórek umieszczono w zawiesinie w 20% (wagowo) sacharozie, 0,3 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA stosując 1/5 początkowej objętości kultury, inkubowano w temperaturze 25°C przez 15 minut i odwirowano przy 6000 g, 7 minut. Supematant odrzucono i białka z peryplazmy uwolniono szokiem osmotycznym (Nossal i Heppel, 1996, J. Biol. Chem., 241: 30553062) umieszczając ponownie w 1/5 oryginalnej objętości zimnej wody i inkubując w temperaturze 0°C, 10 minut. Po odwirowaniu przy 9000 g, 10 minut, supematant zachowano (frakcja peryplazmowa); granulki komórek umieszczono w zawiesinie w 1 X TST (25 mM TrisHCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 ml/1 Tween 20), poddano działaniu ultradźwięków, odwirowano przy 12000 g, 15 minut i supematant zachowano (rozpuszczalna cytozolowa frakcja).

E. Elektroforeza na żelu poliakryloamidowym.

Zamrożone granulki komórek E. coli umieszczono w zawiesinie w 70 μΐ wody intensywnie mieszając lub działając ultradźwiękami w temperaturze 0°C (Sonic Dismembrator, Model 301, ARTEK Systems Corporation) trzykrotnie co 5 sekund, przy mocy 0,4. Rozerwane komórki zmieszano z 70 μΐ 2 X bufora obciążającego (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% gliceryny, 10% β-merkaptoetanolu, 0,002% błękitu bromofenolowego) (Laemmli, 1970, Naturę, 227: 680-685). Próbki inkubowano w temperaturze 100°C, 5 minut, odwirowano przy 14000 g, 30 sekund i porcje 10-15 μΐ umieszczono na wstępnie wylanym 16% lub 10-20% akrylamidowym żelu Tricine (Novex, San Diego, CA (USA)) i rozwijano w buforze tego samego producenta. Elektroforezę prowadzono pod stałym napięciem 125 V lub stałym prądem 45 mA, na dwu żelach, przez około 2 godziny, aż błękit bromofenolowy zniknął z żeli. Markerami były wstępnie zabarwione wzorce białkowe o niskiej masie cząsteczkowej (# SE 130024, Integrated Separation Systems, Natick, MA (USA)) w ilości 1 μΐ na ścieżkę. Żele barwiono przez noc w 10% kwasie octowym, 25% metanolu, 0,025% Coomassie Brilliant Blue R.

F. Analiza Western.

Po rozdzieleniu metodą SDS-PAGE, białka poddano immunodetekcji (Towbin i in., 1939, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 16: 4350-4354) przez elektrotransfer na membrany z difluorku poliwinylidenu (PVDF) (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA (USA)) stosując półsu181 072 chy elektrobloter (Integrated Separation Systems). Białka przenoszono przy 10 mA na cm membrany przez 1-3 godziny i membrany blokowano przez noc w buforze blokującym (1 X PBS, 2% suszonego mleka, 0,1% Tween-20).

Membrany przemyto 3 x, po 5 minut każdą, w 1 X PBS, 0,1% Tween-20, a następnie 3 x, po 5 minut każdą, w 1 X PBS, na koniec zanurzono w monoklonalnym anty-νβ5.3 przeciwciele sprzężonym z peroksydazą chrzanu (HRP) (13A2-HRP, 0,25 mg/ml) rozcieńczonym 1:3000 w 1 X PBS, 0,1% Tween-20. Po łagodnym mieszaniu przez 2 godziny, membrany przemyto jak opisano powyżej i białka uwidoczniono w teście Enhanced Chemiluminescence (Amersham, Arlington Heights, IL (USA)) zgodnie z instrukcją producenta. Film naświetlano od 5 sekund do 1 minuty.

G. Test immunologiczny enzymatyczny.

Zamrożone granulki komórek umieszczono mieszając intensywnie w zawiesinie w 20 μΐ 8 M mocznika, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 (Maraton i Hartley, 1990, Meth. Enzymology, 182: 264276) i νβ5.3 oceniono ilościowo w enzymatycznym teście immunologicznym jak następuje:

Płytki Nunc-Immuno Maxisorp (VWR # 62409-002) powleczono 100 μΐ/studzienkę 4C2 IgG przy 4 pg/ml w PBS i przechowywano w temperaturze 4°C przez noc. Roztwór powlekający odrzucono i dodano bufor blokujący (1% hydrolizatu kazeiny w PBS, 0,05% Tween20) przy 200 μΐ/studzienkę. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, 150 obrotów na minutę i następnie przemyto 3 x buforem myjącym (PBS, 0,05% Tween-20). Próbki (rozcieńczone 1/2000 do 1/32000) i wzorce Υβ5.3 w blokującym buforze dodano przy 100 μΐ/studzienkę i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 90 minut, 150 obrotów na minutę. Płytki przemyto 3 x buforem myjącym i dodano sprzężone z HRP anty-Vβ5.3 monoklonalne przeciwciało (13A2-HRP) rozcieńczone 1/500 blokującym buforem z 5% płodowej surowicy bydlęcej przy 100 μΐ/studzienkę (0,5 pg/ml). Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 90 minut, 150 obrotów na minutę, przemyto 4 x i dodano 100 μΙ/studzienkę podłożowej o-fenylenodiaminy (OPD). Po 30 minutach reakcję zakończono dodając 50 μΐ 2 N H2SO4 na studzienkę. Absorbancję zmierzono przy 490 nm minus tło absorbancji przy 1650 nm. Ślepe studzienki nie zawierały próbki.

2. Konstrukcja plazmidów.

Przykład 1. KonstrukcjapK2D.

Początkiem zadania ekspresji białek regionu V receptora antygenu komórki T według wynalazku było skonstruowanie plazmidu zawierającego właściwe składniki regulacyjne do ekspresji białka regionu V receptora antygenu komórki T. Składniki te obejmują promotor, dwa terminatory transkrypcji, początek replikacji dla stabilnej replikacji w bakteriach. Ponadto ze względu na zagadnienia regulacyjne związane z wytwarzaniem białka wskazanego do stosowania in vivo w celach leczniczych, wybrano gen kodujący oporność na tetracyklinę, w celu ułatwienia doboru komórek niosących plazmid. Na koniec, wektor ekspresji wymagał wielokrotnego miejsca klonowania, utworzonego strategicznie, w celu ułatwienia klonowania korzystnych regionów kodujących według wynalazku w wektor ekspresji. Następujący przykład opisuje unikalny początkowy plazmid według wynalazku.

Początkiem konstrukcji korzystnego wektora ekspresji był pKK233-2 (4600 par zasad), opisany poniżej. Miejsce restrykcji Ncol przekształcono w miejsce Spel w następujący sposób: pKK233-2 trawiono Ncol, a powstałe wolne końce 5' usunięto przez inkubację z nukleazą fasoli mung w temperaturze 25°C przez 30 min. Plazmid ekstrahowano 2 x fenolem z chloroformem, wytrącono etanolem w obecności 2 M octanu amonu i umieszczono w zawiesinie w wodzie. Po defosforylacji bakteryjną alkaliczną fosfatazą (GibcoBRL) wektor ligowano do syntetycznego linkera Spel (# 1085, New England Biolabs) i mieszaninę ligacyjną przetransformowano do kompetentnych komórek DH5a z wytworzeniem wektora pKK233-2A.

Następnie odtworzono gen tetracykliny w następujący sposób: pKK233-2A (4600 par zasad) trawiono EcoRl i Sali otrzymując dwa fragmenty, po 279 par zasad i 4321 par zasad każdy. Dwa fragmenty oddzielono metodą elektroforezy na żelu agarowym i duży fragment oczyszczono od agaru stosując Geneclean Kit (BIO 101, La Jolla, CA (USA)). Fragment 651 par zasad zawierający aminoterminalny kodujący region genu tetracykliny odcięto EcoRl i Sali od pBR322 i ligowano do fragmentu 4321 par zasad z pKK233-2A. Powstały plazmid

181 072 ρΚ2Β (4970 par zasad) nadawał oporność na tetracyklinę komórkom E. coli DH5a i zmodyfikowano go następnie, w celu wycięcia części genu β-laktamazy i przekształcenia miejsca Hindlll w miejsce SacII w następujący sposób.

Segment DNA wiążący unikalne miejsce Spel z końcem 3' terminatorów transkrypcji zsyntetyzowano metodą PCR stosując pK2B jako wzorzec. „Sensowny” primer 5' zawierał sekwencję rozpoznawania enzymów restrykcyjnych dla Spel, Pstl i SacII w kierunku od 5' do 3', podkreśloną:

'-TATAATGACTAGTCGCTGC AGCC AACCGCGGCTG-3' (sekw. nr id. 1).

„Bezsensowny” primer 3' zawierał miejsce SacI, podkreślone:

'-GTCCTAGAGTACTGAGCGGATAC-3' (sekw. nr id. 2).

ng wzorca DNA pK2B zmieszano z mieszaniną reakcyjną zawierającą 10 mM TrisHC1, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCh, 100 pg/ml żelatyny, 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΜ każdego z dwu primerów i 2,5 jednostki polimerazy DNA AmpliTaą. Końcowa objętość reakcji wynosiła 100 μΐ, nakryta 100 μΐ oleju mineralnego. DNA denaturowano w temperaturze 95°C przez 2 minuty i osiągnięto amplifikację przy 30 cyklach po 1 minucie w temperaturze 95°C dla denaturacji, 1 min. w temperaturze 60°C dla wygrzania 1 min. w temperaturze 72°C dla wydłużenia primera. Wzmocnione DNA zanalizowano na 1% żelu agarowym w 40 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 mM octanu sodu, 1 mM EDTA.

Powstały zsyntetyzowany metodą PCR fragment 485 par zasad trawiono Spel i SacI i ligowano do fragmentu 4129 par zasad otrzymanego przez trawienie pK2B Spel i SacI z wytworzeniem plazmidu nazwanego pK2C.

Plazmid pK2C (4600 par zasad) zmodyfikowano następnie, tak, aby zawierał wielokrotne miejsce klonowania. Najpierw pK2C trawiono Spel i SacII i ligowano do dwuniciowego syntetycznego oligonukleotydu zawierającego 15 miejsc restrykcji. To miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) utworzono wygrzewając równomolowe stężenia dwu komplementarnych syntetycznych oligonukleotydów, o długościach odpowiednio 91 i 97 par zasad i następujących sekwencjach:

’ -GGCTCGAGCCTAGGC3GCAGCCCGGC3GCGCGCGCGGCCGCAGGCCTTTAATTAAGAG

CTCCGGACCGCACAATGTGGGCGCGCCCTTAAGA-3' [sekw. nr id. 3)

5' -CTAGTCTTAAGGGCGCGCCCACATTGTGCGGTCCGGAGCTCTTAATTAAAGGCCTGCG

GCCGCGCGCGCCCCGGGCTGCAGCC3AGGCTCGAGCCGC-3' [sekw. nr id. 4]

MCS kodują następujące miejsca restrykcji enzymatycznej: Spel, AfIII, Ascl, Dralll, Rsrll, SacI, PacI, Stul, Notl, BssHII, Xmal, Pstl, AvrII, Xhol i SacII. Mieszaninę ligacyjną przetransformowano do metylazowo-negatywnej E. coli GM2929. Powstały plazmid pK2D (4670 par zasad) częściowo sekwencjonowano dla zapewnienia spójności regionów syntetyzowanych in vivo.

Wyniki.

Początkowym plazmidem był pKK233-2 o następujących składnikach: promotorze trc (Brosius i in. (1985), supra) podobnym do promotora tac pochodzącego z fuzji regionu -10 promotora lac UV5 z regionem -35 promotora tryptofanowego (de Boer i in., supra; Amann i in. (1983), supra). Plazmid zawiera też miejsce wiązania rybosomu, następnie miejsce klonowania trzech unikalnych enzymów restrykcyjnych (Ncol, Pstl i Hindlll), a następnie terminatory transkrypcji operonu RNA rybosomalnego rrnB z E. coli (Brosius i in., 1981, Plasmid, 6: 112-118). Dodatkowo, pKK233-2 zawiera gen β-laktamazy oporności na ampicylinę, początek replikacji pBR322 i mały niefunkcjonalny karboksyterminalny fragment z genu oporności na tetracyklinę.

181 072 pKK233-2 zmodyfikowano w celu usunięcia miejsca Ncol, odtworzenia genu oporności na tetracyklinę, wycięcia segmentu kodującego β-laktamazę (deaktywując gen) i wstawienia miejsca wielokrotnego klonowania złożonego z 15 miejsc restrykcji z wytworzeniem pK2D.

Przykład 2.

Plazmid pK2D zmodyfikowano dalej włączając albo sygnałową sekwencję pelB z Erwinia carotovara (Lei i in., 1987, J. Bacteriology, 169: 4379-4383) albo odporną na ciepło enterotoksynę II (STII), sygnałową sekwencję Escherichia coli (Morioka-Fujimoto i in., 1991, J. Biol. Chem., 266: 1128-1732).

Konstrukcja pK-pelB.

Plazmid pK2D (4670 par zasad) przetworzono, tak, aby obejmował miejsce wiązania rybosomu (Shine i Dalgamo, 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 1342-1346; Shine i Dalgamo, 1975, Naturę, 254: 34-38; Steitz i Jakes, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 47344738) i sygnałową sekwencję pelB z E. carotovara (Lei i in. (1987), supra) tworząc plazmid pK-pelB (4740 par zasad), w następujący sposób.

pK2D trawiono Spel i SacI z MCS i wektor ligowano do dwu komplementarnych syntetycznych oligonukleotydów, o długościach odpowiednio 103 i 95 par zasad, o pokazanych niżej sekwencjach. Cichą mutację (małe litery) wprowadzono do sekwencji pelB, w celu stworzenia miejsca restrykcji Ncol, podkreślonego, ułatwiając następne subklonowanie sekwencji genów νβ5.3.

5' -CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAG

CCGC3GGATTGT3A33ACTCGCTGCCCAACCAGCcATGGCCGAGCT-3' [sekw. nr id.

5)

5' -CGGCCATgGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATA

GGTATTTCAT3ATGACTGTC3CC3TGAAATAGAATTTA-3' [sekw. nr id. 6]

Konstrukcja pK-STII.

Plazmid pK2D przetworzono, tak, aby obejmował miejsce wiązania rybosomu i odporną na ciepło enterotoksynę (STII), sygnałową sekwencję E. coli (Morioka-Fujimoto i in. (1991), supra), w następujący sposób.

pK2D trawiono Spel i Dralll z MCS i wektor ligowano do dwu komplementarnych syntetycznych oligonukleotydów, o długościach odpowiednio 105 i 98 par zasad, o pokazanych niżej sekwencjach. Dwie ciche mutacje (małe litery) wprowadzono do sekwencji STII, w celu stworzenia miejsc restrykcji Mlul i Dralll, podkreślonych, ułatwiając następne subklonowanie νβ5.3.

5' -CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAAAAGAATATAGCATTCCT

ACTAGCTTCAATGTTCGTCTTCTCTATTGCAACTAACGCgTACGCaCATT-3' [sekw. nr id. 7]

5' -GtGCGTAcGCGT3AGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGCTAGTAGGAATGC

TATATTCTTTTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGAATTTA-3 ' [sekw. nr id. 8]

Przykład 3.

Plazmidy zawierające sygnałową sekwencję z przykładu 2 powyżej zmodyfikowano dalej, wstawiając dwa składniki regulacyjne.

Konstrukcja pKT-pelB.

Plazmid pK-pelB zmodyfikowano dalej tak, aby obejmował dwa regulacyjne składniki w górę od lidera pelB, w celu utworzenia pKT-pelB (4800 par zasad). Składnikami tymi są: składnik ułatwiający translację z genu 10 bakteriofagu T7 (glO) i minicistron, ATG TAT CGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA (sekw. nr id. 28), kodujący 8 reszt aminokwasowych. Insercję dwu regulacyjnych składników osiągnięto przez trawienie pK2D Spel i SacI, następ

181 072 nie ligację wektora do syntetycznych oligonukleotydów kodujących sekwencję glO, miejsce wiązania rybosomu, mini-cistron i lider pelB, w kierunku od 5' do 3'. Oligonukleotydy zsyntetyzowano jako dwa komplementarne zestawy 71-89 merów, które można ligować przez komplementarne nawisy 9 par zasad pomiędzy parami oligonukleotydów. Dwie komplementarne pary oligonukleotydów oznaczono jako Parę A (oligomery J5A + J6A, odpowiednio, 89 i 76 par zasad) i Parę B (oligomery J5B + J6B, odpowiednio, 71 i 76 par zasad) o następujących sekwencjach:

J5A · -CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAT^ATTAAAGAGGTATAT

ATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA-3' [sekw. nr id. 9]

J6A

5’-CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGT

TAATCGATGCCCAATTCCGGA-3' [sekw. nr id. 10]

J5B

5' -ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAAC

CAGCCATGGCCGAGCT-3' [sekw. nr id. 11]

J6B

5' -CGGCCATGGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAA

TAGGTATTTCATTATTTATTC-3' [sekw. nr id. 12)

Konstrukcja pKT-STII.

Plazmid pK-STII zmodyfikowano dalej, tak, aby obejmował te same dwa regulacyjne składniki jak pelB, w celu utworzenia pKT-STII (4800 par zasad). pK2D trawiono Spel i DraIII, następnie ligowano wektor do syntetycznych oligonukleotydów kodujących sekwencję glO, miejsce wiązania rybosomu, mini-cistron i lider STII, w kierunku od 5' do 3'. Oligonukleotydy zsyntetyzowano jako dwa komplementarne zestawy 73-89 merów, które można ligować przez komplementarne nawisy 9 par zasad pomiędzy parami oligonukleotydów. Dwie komplementarne pary oligonukleotydów oznaczono jako Parę A (oligomery J5A + J6A, odpowiednio 89 i 76 par zasad) i Parę C (oligomery J5C + J6C, odpowiednio 73 i 76 par zasad) o następujących sekwencjach:

J5A ’ -CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATAT

ATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA-3 ’ [sekw. nr id. 9]

J6A ' ¹ -CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGT

TAATCGATGCCCAATTCCGGA-3’ [sekw. nr id. 10]

J5C ’ -ATGAAAAAGAATATAGCATTCC3ACTAGCTTCAATGTTCGTCTTCTCTATTGCAA

CTAACGCGTACGCACATT-3’ [sekw. nr id. 13]

J6C ’ -GTGCGTACGCGTTAGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGCTAGTAGGAATGC

TATATTCTTTTTCATTATTTATTC-3’ [sekw. nr id. 14]

181 072

Przykład 4. Konstrukcja ρΚ-ρεΙΒ-Υβό.3.

Następnym krokiem w ekspresji białka νβ5.3 receptora antygenu komórki T było włączenie sekwencji Υβ5.3 w plazmidy zawierające sygnałowe sekwencje opisane w przykładzie 2 powyżej.

Kompletną nukleotydową sekwencję νβ5.3 wytworzono w następujący sposób: sekwencję DNA Idonu Υβ5.3 12A1 pierwotnie opublikował Leiden i in. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 4456-4460) i później częściowo poprawił (Leiden i in., 1986, Molec. Celi Biol., 6: 3307-3214). Klon 12A1 nie zawierał nukleotydów kodujących 4 Nterminałnych reszt aminokwasowych; i ponadto, wydedukowane N-terminalne reszty aminokwasowe klonu 12A1 były nieprawidłowe. N-terminalną sekwencję aminokwasową Υβ5.3 (HPB-ALL) opublikował Jones i in., (1985, Science, 227: 311-314) bez pierwszej Nterminalnej reszty aminokwasowej, którą później określono jako glicynę (Jeff Leiden, niepublikowane). Stosując powyższą informację o sekwencji zrekonstruowano kompletne Υβ5.3 technikami rekombinacji DNA. Powstały plazmid (ρΒΒ-Υβ5.3) był źródłem sekwencji Υβ5.3 w następujących przykładach. Pełnej długości nukleotydową sekwencję kodującą Υβ5.3 i przewidywaną sekwencję aminokwasową opublikował ostatnio Plaża i in. (1991, J. Immunol., 147: 4360-4365). (Patrz też fig. 1; sekw. nr id. 25, 26 i 27 w opisie).

Υβ5.3 zsyntetyzowano metodą PCR stosując ρΒΒ-Υβ5.3 (6200 par zasad) jako wzorzec. „Sensowny” primer 5' zawierał miejsce restrykcji enzymatycznej Ncol, podkreślone: 5'-TAATTAGCC ATGGCCGGCGTAACCC AATCTCCG-3' (sekw. nr id. 15).

„Bezsensowny” primer 3' był komplementarny do regionu w dół od miejsca Pstl w wektorze:

5'-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC-3' (sekw. nr id. 16).

Powstały fragment Υβ5.3 zakończono tępo stosując fragment Klenowa polimerazy I DNA i łigowano do defosforylowanego miejsca EcoRV pBluescript IIKS+ otrzymując plazmid pBLρε1Β-Υβ5.3. Insert Υβ5.3 odcięto przez trawienie Ncol i Pstl, oczyszczono z agaru i łigowano do miejsc Ncol i Pstl pK-pelB, otrzymując plazmid ρΚ-ρβ1Β-Υβ5.3 (5000 par zasad).

Konstrukcja ρΚ-8ΤΠ-Υβ5.3.

Υβ5.3 zsyntetyzowano metodą PCR stosując ρΒΒ-Υβ5.3 (6200 par zasad) jako wzorzec. „Sensowny” primer 5' zawierał miejsce restrykcji enzymatycznej Mlul, podkreślone: 5 '-GA AATTAACGCGTACGCAGGCGTAACCCAATCTC-3' (sekw. nr id. 17).

5'-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC-3' (sekw. nr id. 18).

Powstały fragment Υβ5.3 zakończono tępo stosując fragment Klenowa polimerazy I DNA i łigowano do defosforylowanego miejsca EcoRV pBluescript IIKS+ otrzymując plazmid ρΒΕ-8ΤΠ-Υβ5.3. Insert Υβ5.3 odcięto przez trawienie Mlul i Pstl, oczyszczono z agaru i łigowano do miejsc Mlul i Pstl pK-STII, otrzymując plazmid ρΚ-8ΤΠ-Υβ5.3 (5000 par zasad).

Wyniki.

Υβ5.3 sklejony z liderami pelB lub STU podlegał ekspresji w E. coli JM109 (tabela 1). Indukcja trwała 2 godziny i wydajności Υβ5.3 mierzono metodą ETA.

Tabela 1

Ekspresja i rozmieszczenie νβ5.3 ρΚ-ρε1Β-νβ5.3 ρΚ-8ΤΙΙ-νβ5.3

Rozmieszczenie	0 mM IPTG	1 mM IPTG	0 mM IPTG	1 mM IPTG
Supematant	0 pg/ml	1,3 pg/ml	0,5 pg/ml	2,2 pg/ml
Peryplazma	0,9	4,6	N.D.	5,5
Cytozol	9,9	poza skalą [1:40]	2,0	poza skalą [1:40]

Oba lidery okazały się funkcjonalne, chociaż większość poddanego ekspresji białka znajdowała się w komórkach.

181 072

Przykład 5.

Przykład wymienia plazmidy zawierające sekwencję lidera i dwa regulacyjne składniki (glO i mini-cistron), a także sekwencję Υβ5.3.

Konstrukcja ρΚΤ-ρε1Β-Υβ5.3.

Plazmid ρΚΤ-ρε1Β-Υβ5.3 skonstruowano wycinając insert Υβ5.3 z ρΚ-ρε1Β-Υβ5.3 stosując Ncol i Pstl i ligację do miejsc Ncol i Pstl pKT-pelB.

Konstrukcja ρΚΤ-8ΤΠ-Υβ5.3.

Plazmid ρΚ3-8ΤΙΙ-Υβ5.3 podobnie skonstruowano wycinając insert Υβ5.3 z pK-STIIΥβ5.3 stosując Mlul i Pstl i ligację do miejsc Mlul i Pstl pK3-STII.

Wszystkie następne konstrukty plazmidowe stosowały sekwencję sygnałową STB. Tak więc, jeśli nie wymienia się sekwencji sygnałowej, należy rozumieć, że użyto sekwencji STIL

Wyniki.

ρΚΤ-νβ5.3.

Plazmid ρΚ-8ΤΙΙ-Υβ5.3 (przykład 4) zmodyfikowano w celu włączenia 2 składników regulacyjnych w górę od lidera STU, w celu utworzenia ρΚΤ-Υβ5.3. Składnikami tymi są: składnik ułatwiający translację z genu 10 bakteriofagu T7 (glO) i mini-cistron z 8 reszt aminokwasowych. Oba składniki wykazały polepszenie translacyjnej skuteczności kilku genów (Schoner i in., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5403-5407; Schoner i in., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8506-8510; Olins i in., 1988, Gene, 73: 227-235; Olins i Rangwala, 1989, J. Biol. Chem., 264: 16973-16976).

ρΚΤ-Υβ5.3 dawał prawie 8-krotnie wyższą wydajność białka niż ρΚ-8ΤΙΙ-Υβ5.3 (przykład 4) w E coli JM109 w warunkach indukcji IPTG. Wartości EIA podawane tu są przybliżone wskutek braku w tym czasie czystego standardu Υβ5.3. ρΚΤ-Υβ5.3 okazało się trwałe w E coli JM 109.

Przykład 6. KonstrukcjaρΚΤΒ-Υβ5.3.

Kolejna modyfikacja ρΚΤ-Υβ5.3 (przykład 5) do ekspresji z sekrecją obejmowała eliminację wymagania IPTG do indukcji. Istnienie genu kodującego laclts dla wrażliwego na temperaturę represora lac (Bukrinsky i in., 1988, Gene, 70: 415-417) pozwala na kontrolowanie ekspresji genów z promotora trc przez podnoszenie temperatury od 30°C do 42°C. Nie będzie więc konieczne stosowanie IPTG lub bakteryjnych szczepów zawierających geny lacl lub lacl^q.

Gen laclts odcięto z pUCts trawieniem EcoRI. Fragment 1700 par zasad zawierający cały region kodujący laclts i związane z nim regulacyjne elementy, otoczone sekwencją wektora, zakończono tępo stosując metodę Klenowa i ligowano do defosforylowanego miejsca Scal znajdującego się w dół od operonu rmB w ρΚΤ-Υβ5.3, otrzymując plazmid pKTBΥβ5.3 (6800 par zasad). Orientację genu laclts określono restrykcyjnym mapowaniem.

Wyniki.

Gen laclts wstawiono w obu orientacjach w dół od terminatorów transkrypcji rmB wpKT-Vβ5.3, w celu utworzenia plazmidu ρΚΤΒ-Υβ5.3 (fig. 2). Podlegał on ekspresji w E. coli LJ24 (delecja lacl) i białko zanalizowano metodą barwienia Coomassie Blue na żelach akrylamidowych (Laemmli (1970), supra) i metodą analizy Western (Towbin i in. (1979), supra). Jedna z orientacji genu laclts (kierunek transkrypcji do regionu Amp⁸) dała wyraźnie wyższą wydajność Υβ5.3 niż orientacja odwrotna.

Domniemane pasmo Υβ5.3 otrzymane z ekstraktów pełnych granulek komórek przeniesiono elektrycznie na membrany Immobilon-P i uwidoczniono przez zabarwienie Coomassie Blue. Pasmo odcięto i poddano sekwencjonowaniu NH2-terminalnych aminokwasów (Matsudaira, 1987, J. Biol. Chem., 262: 10035-10038) otrzymując łącznie 10 reszt aminokwasowych. Pasowały one dokładnie do sekwencji 10 N-terminalnych reszt aminokwasowych przetwarzanego Υβ5.3, to jest nie wykryto sekwencji lidera.

Plazmid poddano też ekspresji metodą termicznej indukcji w trzech różnych bakteryjnych szczepach, z których każdy zawiera rosnącą ilość endogennego represora lac, to jest, L124 < DH5a < JM109. Supematanty z indukowanych kultur przetestowano na ekspresję Υβ5.3 metodąEIA (tabela 2).

181 072

Tabela 2

Ekspresja ρΚΤΒ-νβ5.3 w różnych szczepach bakterii

Komórki indukowano przez 2 godziny i mierzono wydajności Υβ5.3 (pg/ml) w supematantach kultury

Plazmid	Regulacja	Gospodarz E coli	Indukcja	Nieinduk.	Indukow.
ρΚΤΒ-νβ5.3	laclts	JM 109 (lacl^q)	42°C	N.D	0,5
ρΚΤΒ-νβ5.3	laclts	DH5a (lacl)	42°C	N.D.	5,0
ρΚΤΒ-νβ5.3	laclts	LJ24 (AlacI)	42°C	N.D.	5,2
ρΚΤ-νβ5 3	lacl^q	JM109	2 mM IPTG	0	0,9
ρΚΤ	lacl¹¹	JM109	42°C	N.D.	0

Dane są zgodne z analizą Western i spodziewanymi wynikami, to jest, najwyższy poziom ekspresji osiągnięto w L124 (AlacI) i najniższy w JM109 (lacl^q). Porównywalnie niskie ilości νβ5.3 zmierzone w supematantach kultury wynikają z faktu, ze E. coli nie wydala zwykle białek do środowiska. Jak pokazano w tabeli 1, zasadnicza ilość poddanego ekspresji νβ5.3 pozostaje w peryplazmie.

Sekwencjonowanie DNA genu laclts.

Całą kodującą sekwencję indukowalnego temperaturą genu laclts z górnych 80 nukleotydów, w tym promotor, poddano sekwencjonowaniu i porównano z opublikowaną sekwencją indukowalnego IPTG genu lacl (Farabaugh, 1978, Naturę, 274: 765-769). Region promotora był identyczny z regionem genu lacl, a nie lacl^q (Calos, M.P., 1978, Naturę, 274: 762765). Sekwencja genu laclts wykazała otwartą ramkę odczytu z 1080 nukleotydów kodujących 360 aminokwasów i różniła się od genu lacl na nukleotydzie # 559 (w odniesieniu do pierwszych nukleotydów kodonu startu), zmieniając się z G na A, co spowodowało zmianę reszty aminokwasowej # 187 z glicyny (GGC) na serynę (AGC). Taka zmiana w pojedynczej reszcie aminokwasowej nadaje wrażliwość termiczną białku represorowemu lac.

Ponadto opublikowana sekwencja genu lacl (Farabaugh (1978), supra), a także sekwencja z Genebank (miejsce ECOLAC) zawiera błąd na pozycji # 857: nukleotyd # 857 powinien być T, a nie C, co zmienia kod reszty # 286 na leucynę (TTA) zamiast seryny (TCA). Przejście C-T wprowadza miejsce Hpal na końcu 3' genu lacl pokazane wcześniej w mapowaniu restrykcyjnym (Brosius, 1992, Meth. Enzymol., 216: 469-483). Należy zauważyć, ze u Farabaugha (1978) supra, ten sam kodon (TCA) opisano błędnie jako kodujący leucynę zamiast seryny.

Przykład 7. KonstrukcjapKTB.

Plazmid ρΚΤΒ-Υβ5.3 (6700 par zasad) trawiono Sali i Pstl i fragment 5420 par zasad oczyszczano na agarze stosując Geneclean Kit (BIO 101). Plazmid pKT-STII (4800 par zasad) trawiono Sali i Pstl i fragment 1150 par zasad oczyszczono podobnie i ligowano do fragmentu 5420 par zasad, otrzymując plazmid pKTB (6560 par zasad).

Przykład 8. KonstrukcjaρΚΤΒ-Υβ5.3.

Plazmid jest identyczny z ρΚΤΒ-Υβ5.3 poza dwoma regulacyjnymi elementami, to jest, składnikiem ułatwiającym translację glO i mini-cistronem. Plazmid pKTB (6560 par zasad) trawiono Sali i Pstl i duży fragment (5400 par zasad) oczyszczono na agarze stosując Geneclean Kit (BIO 101). Plazmid ρΚ-Υβ5.3 (4900 par zasad) trawiono Sali i Pstl i fragment 1300 par zasad oczyszczono podobnie i ligowano do fragmentu 5400 par zasad, otrzymując plazmid ρΚΒ-Υβ5.3 (6700 par zasad).

Wyniki.

ρΚΒ-νβ5.3.

Jak opisano wyżej, dodanie dwu regulacyjnych elementów, to jest, segmentu genowego glO i mini-cistronu, wydaje się polepszać wydajność Υβ5.3 w warunkach indukcji IPTG. Chcieliśmy usunąć te dwa składniki z wektora ρΚ3Β-Υβ5.3 i zbadać ponownie wydajność Υβ5.3 w warunkach termicznej indukcji. Porównanie ρΚΤΒ-Υβ5.3 i ρΚΒ-Υβ5.3 metodą elektroforezy akryloamidowej i analizy Western wykazało, ze wydajność Υβ5.3 nie uległa zmianie przez usunięcie tych dwu składników. Pomiary EIA pełnych mocznikowych ekstraktów komórkowych wykazało, że ρΚΒ-Υβ5.3 wytwarzał więcej białka niż ρΚΤΒ-Υβ5.3 przy ekspresji w E. coli LJ24.

181 072

Tabela 3

Ekspresja Υβ5.3 w różnych szczepach bakterii

Plazmid	LJ24	SG22094	SG21163	SG21173
ρΚΤΒ-νβ5.3	90	80	20	30
+	lider
+	gl0/MC
ρΚΒ-νβ5.3	110	50	40	20
+	lider
-	glO/MC
ρΚΤΒι-νβ5.3	6	100	100	100
-	lider
+	glO/MC
ρΚΒί-νβ5.3	10	170	130	390
-	lider
-	glO/MC

Okres indukcji 2 godziny w temperaturze 42°C

Objętości kultur 25 ml

Lider STU glO gen 10 T7 MC mmi-cistron Próbki pełne mocznikowe ekstrakty komórkowe. Wydajności νβ5 3 (mg/1), oparte na przybliżeniu jednostek/ml, mierzone metodą EIA 1 mg νβ5.3 jest w przybliżeniu równoważny 1 x 10⁷ jednostek

Plazmid pKB-Vp5.3 okazał się być odporny na fermentację.

Przykład 9. KonstrukcjapKB.

Plazmid pKTB (6560 par zasad) trawiono Sali i Pstl i duży fragment (5400 par zasad) oczyszczono na agarze stosując Geneclean Kit (BIO 101). Plazmid pK-STII (4750 par zasad) trawiono Sali i Pstl i fragment 1100 par zasad oczyszczono podobnie i ligowano do fragmentu 5400 par zasad, otrzymując plazmid pKB (6500 par zasad).

Przykład 10. KonstrukcjapKTBi.

Plazmid jest identyczny z pKTB poza brakiem sygnałowej sekwencji STII. pKTB (6560 par zasad) trawiono Spel i Xmal i ligowano do dwuniciowego syntetycznego oligonukleotydu kodującego składnik ułatwiający translację glO, miejsce wiązania rybosomu i mini-cistron zawierający drugie miejsce wiązania rybosomu. Na końcu 3' zaprojektowano miejsca restrykcji Ncol, Dralll, Rsrll i Xmal. Dwa komplementarne oligonukleotydy miały następujące sekwencje:

5' -CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTA

AAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC

ATGGCACATTGTGCGGTCCGC-3' [sekw. nr id. 19]

5'-CCGGGCGGACCGCACAATGTGCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTA

AT C GAT AGAT T AAT AT AT AC C T C T T T AAT T T T T AAT AAT AAAG T T A

ATCGATGCCCAATTCCGGA-3' [sekw. nr id. 20]

181 072

Przykład 11. Konstrukcja pKBi.

Plazmid jest identyczny z pKB poza brakiem sygnałowej sekwencji STII. pKTB (6560 par zasad) trawiono Spel i Dralll i ligowano do dwuniciowego syntetycznego oligonukleotydu zawierającego miejsce wiązania rybosomu i miejsca Ncol i Dralll zaprojektowane na końcu 3'. Dwa komplementarne oligonukleotydy miały następujące sekwencje:

5' -CTAGTAAATTATATTTAAAGGAGGAATAAACCATGGCACATT-3' [sekw. nr id.

]

5'-GTGCCATGGTTTATTCCTCCTTTAAATATAATTTA-3 ' [sekw. nr id. 22]

Przykład 12. KonstrukcjapKTBi-Vp5.3.

Plazmid jest identyczny z ρΚΤΒ-Υβ5.3 poza brakiem sygnałowej sekwencji STII. pKTBi (6400 par zasad) trawiono Xmal i Ncol i ligowano do zsyntetyzowanego metodą PCR Υβ5.3 stosując ρΚΤΒ-Υβ5.3 jako wzorzec. „Sensowny” primer 5' zawierał miejsce restrykcji enzymatycznej Ncol, podkreślone: 5'-TATAGTCCATGGGCGTAACC-3' (sekw. nr id. 23).

„Bezsensowny” primer 3' zawierał miejsce Xmal, podkreślone: 5'-AACTTCCCGGGTTATCATTAGCTGC-3' (sekw. nr id. 24).

Wyniki.

_ΡΚΤΒΐ-νβ5.3.

Równolegle z powyższym przetwarzaniem, lider STII usunięto z plazmidu ekspresyjnego. Ponieważ większość poddanego ekspresji Υβ5.3 zachowuje się wewnątrz komórek (patrz tez poniżej), spodziewano się, że użycie na większą skalę tego konstruktu może dać heterogenną populację cząsteczek Ϋβ5.3, to jest, z liderem i bez, co mogłoby skomplikować dalsze oczyszczanie przetwarzanego Υβ5.3. Tak więc lider STII usunięto, w celu utworzenia pKTBiΥβ5.3 do wewnątrzkomórkowej ekspresji. Poddany ekspresji Υβ5.3 powinien zawierać Nterminalną metioninę, chociaż ten aminokwas mógłby być usuwany przez endogenne aminopeptydazy metioniny (Ben-Bassat i in., 1981, J. Bacteriology, 169: 351-757; Baneyx i Georgiou, „Expression of Proteolytically Sensitive Polypeptides in Escherichia coli”, w Stability of Protein Pharmaceuticals część A: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation (wyd. Tim J. Ahem i Mark C. Manning, Plenum Press, New York, str. 69-108 (1992)), jak zaobserwowano ό1ηρΚΒϊ-Υβ5.3 (poniżej).

ρΚΤΒί-Υβ5.3 wytworzono, ale nie powodował on ekspresji znaczących ilości białka w E. coli LJ24 (patrz tabela 3, powyżej). Cały insert Υβ5.3 sekwencjonowano i określono jako niewątpliwie poprawny. Plazmid DNA wydzielony po indukcji i analizowany przez trawienie restrykcyjne wydawał się być niezmieniony. Jedyne możliwe wytłumaczenie braku ekspresji znaczących ilości białka Υβ5.3 w szczepie L324 zawierającym ρΚΤΒΐ-Υβ5.3 to nieobecność lidera peptydu destabilizująca wewnątrzkomórkowe białko Υβ5.3 prowadząca do szybkiej proteolizy.

Tak więc, ρΚΤΒϊ-Υβ5.3 transformowano do pozbawionych proteazy szczepów SG22094 (lon^-, cip) i BL21 (lon^-, ompT), które wykazały zmniejszające się wydajności w kolejności SG22094 > BL21. Zbadano też wpływ różnych temperatur indukcji na wydajność i dla obu szczepów temperatura 42°C była optymalna. Ponadto, nie wystąpił znaczący wzrost wytwarzania pomiędzy 2 i 3 godziną.

ρΚΤΒΐ-Υβ5.3 poddano ekspresji in vivo w dodatkowych pozbawionych proteazy szczepach SG21163 (lon^-, htpr^-) i SG21173 (lon^-, htpr^-, cip^-). Wyniki podsumowano w tabeli 3 (powyżej).

Należy zauważyć, ze szczepy LJ24, SG22094, SG21163 i SG21174 nie wytwarzają endogennego represora lac, ponieważ gen lacl jest w tych szczepach wycięty. Tak więc, dzikiego typu represor lac nie wpływa na termiczną indukcję promotora. Poniższe przykłady poka

181 072 zują, że konstrukty νβ5.3 bez sygnałowego peptydu można łatwo poddać ekspresji w pozbawionych proteazy gospodarzach, pozwalając na wytwarzanie znaczących ilości białka νβ5.3.

Przykład 13. Konstrukcja ρΚΒΐ-νβ5.3.

Plazmid jest identyczny z ρΚΤΒΐ-νβ5.3 poza brakiem elementu glO i mini-cistronu (sekw. nr id. 28). Plazmid pKBi (6430 par zasad) trawiono Ncol i Sali i fragment 970 par zasad oczyszczono na agarze. ρΚΤΒΐ-νβ5.3 (6750 par zasad) trawiono Ncol i Sali i fragment 5680 par zasad oczyszczono podobnie i ligowano do fragmentu 970 par zasad, otrzymując plazmid ρΚΒΐ-νβ5.3 (6640 par zasad).

Wyniki.

ρΚΒΐ-νβ5.3.

Ten konstrukt νβ5.3 bez lidera i dwu regulacyjnych składników skutecznie poddano ekspresji w pozbawionych proteazy szczepach; nasze obserwacje są podobne jak w przypadku ρΚΤΒΐ-νβ5.3. ρΚΒϊ-νβ5.3 poddano ekspresji w dwu dodatkowych pozbawionych proteazy szczepach: SG21163 (lon^-, htpf) i SG21173 (lon^-, htpr^-, cip^-). Wyniki podsumowano w tabeli 3. ρΚΒϊ-νβ5.3 konsekwentnie wytwarzał więcej białka niż ρΚΤΒΐ-νβ5.3 u wszystkich badanych szczepów (tabela 3). N-terminalne sekwencjonowanie poddanego ekspresji białka wykazało, że pierwsze 17 reszt aminokwasowych odpowiada spodziewanej sekwencji νβ5.3 i brak jest terminalnej reszty metioniny. Plazmid też okazał się trwały.

Niniejszy wynalazek nie jest w żaden sposób ograniczony w zakresie przez specyficzne odmiany opisane tutaj. W istocie dla fachowca oczywiste będą z niniejszego opisu i dołączonych rysunków różne modyfikacje wynalazku. Takie modyfikacje mają się mieścić w zakresie załączonych zastrzeżeń. Różne publikacje dołączono w całości jako odnośniki literaturowe.

181 072

LISTA SEKWENCJI (1) OGÓLNA INFORMACJA :

(i) ZGŁASZAJĄCY:? Celi Sciences, Inc (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Białka regionu V receptora antygenu komórki T i sposoby ich wytwarzania (m) LICZBA SEKWENCJI: 29 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: T Celi Sciences, Inc.

(B) ULICA: 115 Fourth Avenue (C) MIASSTO: Needham (D) STAN: Massachusetts (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD: 02194-2725 (v) POSTAĆ DLA KOMPUTERA:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka, 3,50 cala, pojemność

1,44 MB (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Word Perfect 6.0 (vi) DANE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vn) DANE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/181492 (B) DATA ZŁOŻENIA: 13 stycznia 1994 (viii) DANE PEŁNOMOCNIKA/AGENTA:

181 072 (A) NAZWISKO: YANKWICH, Leon R.

(B) NUMER REJESTRACJI: 30,237 (C) ODNOŚNIK/NUMER AKT: TCS-203-PCT(94664-A) (IX) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 617-345-9100 (B) TELEFAK: 617-345-9111 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 1:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 par zasad (B) TYP:kwas nukleinowy (C) NIĆ:pojedyncze (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (lii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 1:

TATAATGACT AGTCGCTGCA GCCAACCGCG GCTG 34 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

181 072 (C) NIĆ: pojedynczA (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 2:

GTCCTAGAGT ACTGAGCGGA TAC 23 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 91 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 3:

181 072

GGCTCGAGCC TAGGCTGCAG CCCGGGGCGC GCGCGGCCGC AGGCCTTTAA 50

TTAAGAGCTC CGGACCGCAC AATGTGGGCG CGCCCTTAAG A 91 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 97 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 4:

CTAGTCTTAA GGGCGCGCCC ACATTGTGCG GTCCGGAGCT CTTAATTAAA 50

GGCCTGCGGC CGCGCGCGCC CCGGGCTGCA GCCTAGGCTC GAGCCGC 97 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 103 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

181 072 (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 5:

CTAGTAAATT CTATTTCAAG GAGACAGTCA TAATGAAATA CCTATTGCCT 50

ACGGCAGCCG CTGGATTGTT ATTACTCGCT GCCCAACCAG CCATGGCCGA 10 0

GCT 103 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 95 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (ni) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 6:

181 072

CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA 50

GGCAATAGGT ATTTCATTAT GACTGTCTCC TTGAAATAGA ATTTA 95 (2) INFORMACJA DLA SEKW NR ID.: 7:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 105 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (111) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 7:

CTAGTAAATT CTATTTCAAG GAGACAGTCA TAATGAAAAA GAATATAGCA 50

TTCCTACTAG CTTCAATGTT CGTCTTCTCT ATTGCAACTA ACGCGTACGC 100

ACATT 105 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 98 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

181 072 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID. : 8:

GTGCGTACGC GTTAGTTGCA ATAGAGAAGA CGAACATTGA AGCTAGTAGG 50

AATGCTATRT TCTTTTTCAT TATGACTGTC TCCTTGAAAT AGAATTTA 98 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 9:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 89 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 9:

181 072

CTAGTCCGGA ATTGGGCATC GATTAACTTT ATTATTAAAA ATTAAAGAGG 50

T AT AT ATT AA TGTATCGRTT AAATAAGGAG GAATAAATA 89 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 76 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (ni) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 10:

CTCCTTATTT AATCGATACA TTAATATATA CCTCTTTAAT ΤΤΤΤΑΆΤΆΆΤ 50

AAAGTTAATC GATGCCCAAT TCCGGA 7 6 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 11:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

181 072 (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (in) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(x) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 11:

ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC 50

CCAACCAGCC ATGGCCGAGC T 71 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 12:

(1) CHARAKTERYSTYKA. SEKWENCJI:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 12:

CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTRATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA 50

GGCAATAGGT ATTTCATTAT TTATTC 76

181 072 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 13:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 73 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 13:

ATGAAAAAGA ATATAGCATT CCTACTAGCT TCAATGTTCG TCTTCTCTAT 50

TGCAACTAAC GCGTACGCAC ATT 73 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 79 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

181 072

GTGCGTACGC GTTAGTTGCA ATAGAGAAGA

AATGCTATAT TCTTTTTCAT TATTTATTC

2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 14:

CGAACATTGA AGCTAGTAGG 50

15:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

{B) LOKACJA:

(Xl) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 15:

TAATTAGCCA TGGCCGGCGT AACCCAATCT CCG 33 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad

181 072 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 16:

CCAGTGCCAA GCTTGCATGC C 21 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 17:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (lii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 17:

181 072

GAAATTAACG CGTACGCAGG CGTAACCCAA TCTC 34 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 18:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 20:

CCGGGCGGAC CGCACAATGT GCCATGGTTT ATTCCTCCTT ATTTAATCGA 50

TACATTAATA TATACCTCTT TAATTTTTAA TAATAAAGTT AATCGATGCC 100

CAATTCCGGA 110 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (in) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

181 072 (B) LOKACJA:

(χι) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 21:

CTAGTAAATT ATRTTTAAAG GAGGAATAAA CCATGGCACA TT 42 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (li) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (in) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 22:

GTGCCATGGT TTATTCCTCC ΤΤΤΆΑΑΤΑΤΑ ATTTA 35 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

181 072 (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (111) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 23:

TATAGTCCAT GGGCGTAACC 20 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 24:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: syntetyczny oligonukleotyd (ni) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 24:

AACTTCCCGG GTTATCATTA GCTGC 25

181 072 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 25:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 276 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 25:

GGC GTA ACC CAA TCT

GGA CAG CAC GTG ACT

CAC AAG AGT GTG TCC

GGG CCC CAG TTT ATC

AGA GGA AGA GGA AAC

CAG TTC CCT AAC TAT TTG TTG CTG GGG GAC AGC 276

CCG ACT CAC CTG ATC

CTG AGA TGC TCT CCT

TGG TAC CAA CAG GTC

TTT CAG TAT TAT GAG

TTC CCT GAT CGA TTC AGC TCT GAG CTG AAT TCG GCC CTG TAT CTC

ΑΑΆ ACG AGA39

ATC TCT GGG78

CTG GGT CAG117

ΑΆΑ GAA GAG15 6

TCA GCT CGC195

GTG AAC GCC234

TGT GCC AGC273 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 26:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 276 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza

181 072 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 26:

CCG CRT TGG GTT AGR GGC TGA GTG GRC TAG TTT TGC TCT39

CCT GTC GTG CAC TGA GAC TCT ACG AGA GGA TAG AGA CCC7 8

GTG TTC TCA CAC AGG ACC ATG GTT GTC CAG GAC CCA GTC117

CCC GGG GTC RAA TAG AAA GTC ΑΤΑ ATA CTC TTT CTT CTC15 6

TCT CCT TCT CCT TTG AAG GGA CTA GCT AAG AGT CGA GCG195

GTC AAG GGA TTG ATA TCG AGA CTC GAC TTA CAC TTG CGG234

AAC AAC GAC CCC CTG AGC CGG GAC ATA GAG ACA CGG TCG273

TCG 276 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 27:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 92 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

181 072 (H) LOKACJA:

(χι) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 27:

Gil

Wal

Tre

Gin

Ser

Pro

Tre

His

Leu

Ile

Liz

Tre

Arg

Gli

Gin

1

5

10

15

His

Wal

Tre

Leu

Arg

Cys

Ser

Pro

Ile

Ser

Gli

His

Liz

Ser

Wal

20

25

30

Ser

Trp

Tyr

Gin

Wal

Leu

Gli

Gin

Gli

Pro

Gin

Fen

Ile

Fen

35

40

45

Gin

Tyr

Glu

Liz

Glu

Arg

Gli

Arg

G1 i

Asn

Fen

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Fen

Ser

Ala

Arg

Gin

Fen

Pro

Asn

Tyr

Ser

Glu

Leu

Asn

65

70

75

Wal

Asn

Ala

Leu

Gli

Asp

Ser

Ala

Leu

Tyr

Leu

Cys

Ala

85

90

Ser

92

(2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NIĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (lii) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

181 072 (A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 28:

ATG TAT CGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA 27 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID.: 29:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (m) HIPOTETYCZNA:

(iv) BEZSENSOWNA:

(ix) CECHA:

(A) NAZWA:

(B) LOKACJA:

(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID.: 29:

Met Tyr Arg Len Asn Liz Glu Glu

181 072

Fig. 1

GGC GTA ACC CAA TCT CCG ACT GAC CTG ATC AAA ACG AGA GGA CAG CCG CAT TGG GTT AGA GGC TGA CTG GAC TAG TTT TGC TCT CCT GTC Gly Val Thr Gin Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly Gin

CAC GTG ACT CTG AGA TGC TCT CCT ATC TCT GGG CAC AAG AGT GTG GTG CAC TGA GAC TCT ACG AGA GGA TAG AGA CCC GTG TTC TCA CAC His Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Lys Ser Val

TCC TGG TAC CAA CAG GTC CTG GGT CAG GGG CCC CAG TTT ATC TTT AGG ACC ATG GTT GTC CAG GAC CCA GTC CCC GGG GTC AAA TAG AAA Ser Trp Tyr Gin Gin Val Leu Gly Gin Gly Pro Gin Phe Ile Phe

CAG TAT TAT GAG AAA GAA GAG AGA GGA AGA GGA AAC TTC CCT GAT GTC ΑΤΑ ATA CTC TTT CTT CTC TCT CCT TCT CCT TTG AAG GGA CTA Gin Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro Asp

CGA TTC TCA GCT CGC CAG TTC CCT AAC TAT AGC TCT GAG CTG AAT GCT AAG AGT CGA GCG GTC AAG GGA TTG ATA TCG AGA CTC GAC TTA Arg Phe Ser Ala Arg Gin Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

GTG AAC GCC TTG TTG CTG GGG GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC CAC TTG CGG AAC AAC GAC CCC CTG AGC CGG GAC ATA GAG ACA CGG Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala

AGC AGC TCG TCG Ser Ser

[SEQ ID NO. 25]

[SEQ ID NO. 26]

[SEQ ID NO. 27]

181 072

Fig. 2

MC

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T wolnego od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fiizyjnych, znamienny tym, ze (a) transformuje się kompetentną bakteryjną komórkę gospodarza rekombinacyjnym wektorem ekspresji obejmującym region kodujący pełnej długości białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 25 i 26 i chemiczne lub termiczne regulowane promotory oraz sekwencję genu regulatorowego lac; (b) indukuje się indukowalny bakteryjny promotor w transformowanym bakteryjnym gospodarzu z etapu (a); oraz (c) odzyskuje się rekombinacyjne pełnej długości białko regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T wolne od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fuzyjnych.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się indukowalny bakteryjny promotor wybrany z grupy obejmującej termicznie regulowane promotory.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję genu regulatorowego, wybranego z grupy obejmującej gen lacl, gen lacl^q i gen laclts.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako sekwencję genu regulatorowego stosuje się gen laclts.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się indukowalny bakteryjny promotor wybrany z grupy obejmującej promotor lac, tac i trc.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STU) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara.

Ί. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera z lidera STII E. coli i kompetentną bakteryjną komórkę gospodarza wolną od genu lacl lub lacl^q.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się bezproteazowy bakteryjny szczep gospodarza.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako bezproteazowy szczep gospodarza stosuje się szczep wybrany z grupy obejmującej SG22094, SG21163 i SG1173.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wektor ekspresji obejmujący ponadto element regulacyjny glO i sekwencję minicistronu (SEQ ID nr 28).
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że promotor bakteryjny stanowi promotor trc, sekwencję genową regulatora lac stanowi laclts i rekombinacyjny wektor ekspresji obejmuje ponadto:

(a) miejsce wiązania rybosomu;

(b) terminator transkrypcji;

(c) sekwencję genu regulacyjnego laclts;

(d) sekwencję ori replikacji pBR322; oraz (e) gen oporności na tetracyklinę.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji wybrany z grupy obejmującej ρΚΤΒΐ-Ϋβ5.3 i ρΚΒΐ-νβ5.3.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, ze stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji obejmujący ponadto sekwencję lidera wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STII) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara.

181 072
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się rekombinacyjny wektor ekspresji wybrany z grupy obejmującej ρΚ-8ΤΠ-Υβ5.3, ρΚΤ-νβ5.3, pKTB-V|35.3 i pKBVp5.3. ,
15. Izolowane pełnej długości rekombinacyjne białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o wzorze aminokwasowym 1-92 z sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27.
16. Wektor ekspresji obejmujący indukowalny bakteryjny promotor pod kontrolą genu laclts, kontrolującego ekspresję regionu, który koduje pełnej długości rekombinacyjne białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T wolne od sekwencji białek zewnętrznych lub partnerów fuzyjnych.
17. Wektor ekspresji według zastrz. 16, znamienny tym, że indukowalny bakteryjny promotor wybiera się z grupy obejmującej promotor lac, tac i trc.
18. Wektor ekspresji według zastrz. 17, znamienny tym, że jako indukowalny bakteryjny promotor stosuje się promotor trc.
19. Wektor ekspresji według zastrz. 17, znamienny tym, że obejmuje ponadto sekwencję lidera wybraną z grupy obejmującej odporną na ciepło enterotoksynę II (STII) z Escherichia coli i lider pelB z Erwinia carotovara.
20. Wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje w kierunku od 5' do 3': (a) promotor trc; (b) miejsce wiązania rybosomu; (c) region kodujący pełnej długości białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T; (d) terminator transkrypcji; (e) sekwencję genu regulacyjnego laclts; (f) sekwencję ori replikacji pBR322; oraz (g) gen oporności na tetracyklinę.
21. Wektor ekspresji według zastrz. 20, znamienny tym, że wybiera się go z grupy obejmującej ρΚ-8ΤΠ-Υβ5.3, ρΚΤ-νβ5.3, ρΚΤΒ-Υβ5.3 i ρΚΒΐ-νβ5.3.
22. Komórka bakteryjna, transformowana wektorem ekspresji obejmującym indukowalny bakteryjny promotor pod kontrolą genu laclts, przy czym gen laclts kontroluje ekspresję regionu kodującego pełnej długości rekombinacyjne białko regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr 25 i 26 i która wytwarza co najmniej 300 miligramów rekombinacyjnego pełnej długości białka regionu νβ5.3 receptora antygenu komórki T o sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27 na litr hodowli komórkowej.
23. Kompozycja farmaceutyczna obejmująca czynnik aktywny oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera rekombinacyjne pełnej długości białka regionu Υβ5.3 receptora antygenu komórki T posiadającej wzór: aminokwas 1 do 92 w sekwencji aminokwasowej SEQ ID nr 27 w ilości od 0,01 do 99%, korzystnie od 0,01 do 95% i farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

♦ * *