CZ96899A3 - Syntetický gen, exprese vektoru a způsob přípravy genu - Google Patents

Description

Syntetický gen kódující protein, expresní vektor, savčí buňka a způsob přípravy syntetického genu.

Oblast techniky

Vynález se týká genů a způsobu exprese eukaryontních a virových proteinů ve vysokých koncentracích v eukaryontních buňkách.

Dosavadní stav techniky

Exprese eukaryontních genových produktů v prokaryotech je někdy omezena přítomností kodónů, které jsou velmi málo užívaný v E. coli.

Exprese takovýchto genů může být zesílena systematickým nahrazením původních kodónů kodóny, které jsou vysoce zastoupeny u prokaryontních genů a u kterých dochází k expresi proteinů ve vysokých koncentracích (Robinson a další, Nucleic Acids Res. 12: strana 6663, 1984). Všeobecně se předpokládá, že řídce se vyskytující kodóny způsobují zastavení (pausing) ribozomů, což vede k předčasnému uvolnění vznikajícího peptidového řetězce a k přerušení transkripce a translace. Dále se má za to, že zastavení ribozomů vede k vystavení 3' konce mRNA působení ribonukleáz.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje syntetické geny kódující proteiny, které jsou normálně exprimovány v savčích či dalších eukaryontních buňkách, ve kterých je nejméně jeden z nepreferovaných nebo málo preferovaných kodónů v přirozeně se vyskytujícím genu, který kóduje daný protein, nahrazen vybraným preferovaným kodónem kódujícím stejnou aminokyselinu.

Preferované kodóny jsou následující: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn(aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln(cag); Gly(ggc); His(cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc);

Phe(ttc); Ser(agc); Thr(acc); Tyr (tac); a Val (gtg). Méně preferované kodóny jsou: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc) a Arg (agg) Všechny kodóny, na které se nehodí popis preferovaných nebo méně preferovaných kodónů, jsou nepreferované kodóny. Obecně lze říci, že stupeň preference určitého kodónů se určuje podle obecného rozšíření tohoto kodónů ve vysoce exprimovaných lidských genech, tak jak je ukázáno v Tabulce 1 pod nadpisem High. Například, atc představuje ve vysoce exprimovaném savčím genu 77 % kodónů pro Ile, a proto je preferovaným kodónem pro Ile; att představuje ve vysoce exprimovaném savčím genu 18 % kodónů pro Ile, proto je méně preferovaným kodónem pro Ile. Sekvence ata představuje ve vysoce exprimovaném savčím genu pouze 5 % kodónů pro Ile. Proto je to nepreferovaný Ile kodón . Nahrazením kodónů jiným kodónem, který je obecně rozšířen ve vysoce exprimovaném lidském genu, se obvykle zvýší exprese genu v savčích buňkách. Vynález dále zahrnuje způsob nahrazení méně preferovaného kodónů kodónem preferovaným, dále pak nahrazení kodónů nepreferovanho kodónem preferovaným nebo méně preferovaným.

Pod pojmem protein normálně exprimovaný v savčí buňce rozumíme protein, který se exprimuje v savčí buňce za přirozených podmínek. Výraz protein zahrnuje geny v savčím genomu, jako jsou ty, které kódují Faktor VIII, Faktor IX, interleukiny a další proteiny. Tento

termín zahrnuje také geny, které jsou exprimovány v savčích buňkách při probíhající nemoci, jako jsou onkogeny, dále zahrnuje geny, které jsou kódovány viry ( včetně retrovirů), které se exprimují v savčích buňkách po infekci. Termínem protein normálně exprimováný v eukaryotech se myslí protein, který je exprimován v eukaryotech za přirozených podmínek. Pod tento pojmem dále také zahrnujeme geny, které se exprimují v savčích buňkách za nemoci.

Ve zvláště výhodném uspořádám vynálezu je syntetický gen schopný exprimovat savčí či eukaryotický protein v množství, které dosahuje hodnoty přinejmenším 110 %, 150 %, 200 %, 500 %, 1000 %, 5000 % nebo dokonce 10 000 % množství exprimovaného proteinu ve srovnání s množstvím proteinu exprimovaným nativním - přirozeným genem v in vitro systému kultury savčích buněk za stejných podmínek (to znamená, ve stejném typu buněk, stejných podmínkách kultivace, za použití stejného expresního vektoru).

Vhodné buněčné kultivační systémy pro měření exprese syntetického genu a odpovídající přirozený gen jsou popsány níže. Další vhodné expresní systémy využívající savčí buňky jsou dobře známy odborníkům v daném oboru a jsou popsány například ve standardních pracích z molekulární biologie, které jsou zmíněny níže. Vektory, vhodné pro expresi syntetických i přirozených kodónů, jsou popsány níže v běžných přehledných pracích. Expresí se rozumí proteinová syntéza. Exprese může být měřena pomocí protilátek specifických pro námi žádaný protein. Takovéto protilátky a způsoby měření jsou obecně známy odborníkům v daném oboru. Přirozeným genem nebo vrozeným genem se rozumí genová sekvence ( včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant), která kóduje daný protein za přirozených podmínek, to znamená vrozené nebo přirozeně se vyskytující kódující sekvence.

V dalších výhodných uspořádáních vynálezu patří nejméně 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % kodónů v přirozeném genu k nepreferovaným kodónům.

V dalších výhodných uspořádáních vynálezu je nejméně 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % nepreferovaných kodónů v přirozeném genu nahrazeno preferovanými nebo méně preferovanými kodóny.

V dalších ještě výhodnějších uspořádáních vynálezu je nejméně 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % nepreferovaných kodónů v přirozeném genu nahrazeno preferovanými kodóny.

V dalším výhodném uspořádání vynálezu je protein retrovirovým proteinem. V ještě výhodnějším provedení vynálezu je protein lentivirovým proteinem. Dokonce v ještě výhodnějším uspořádání je protein HIV proteinem . V dalších výhodných provedeních vynálezu je protein gag, pol, env, gpl20 nebo gpl60. V ještě dalším výhodném uspořádání je protein lidský Faktor VHI a protein v B oblasti deletováného lidského Faktoru VIII. V dalším výhodném uspořádání je proteinem zeleně fluoreskující protein.

V dalších výhodných uspořádáních vynálezu patří nejméně 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, % , 90 % a 95 % kodónů v syntetickém genu k preferovaným nebo méně preferovaným kodónům.

Vynález dále popisuje syntetický vektor obsahující syntetický gen.

Další výhodné uspořádání vynálezu pojednává o buňkách schopných přijmout syntetický gen. V různých výhodných uspořádáních je buňka prokaryotickou buňkou neboje savčí buňkou.

Ve ještě výhodnějších uspořádáních syntetický gen obsahuje méně než 50, méně než 40, méně než 30, méně než 20, méně než 10 nebo méně než 5 cg sekvencí.

Vynález dále uvádí způsob přípravy syntetického genu kódujícího protein, který se normálně exprimuje v savčí buňce nebo eukaryotické buňce. Způsob zahrnuje identifikaci nepreferovaných a méně preferovaných kodónů v přirozeně se vyskytujícím genu kódujícím protein a náhradu jednoho nebo více těchto nepreferovaných nebo méně preferovaných kodónů kodóny preferovanými kódujícími tutéž aminokyselinu jako nahrazený kodón.

0 0 0 0 0 <0

0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 • 0 ··· 000 · ·

Za určitých podmínek (to znamená, připustí-li se zavedení restrikčního místa) může být žádoucí nahradit nepreferovaný kodón méně preferovaným kodónem, spíše než preferovaným kodónem.

Není nezbytné nahradit všechny méně preferované kodóny nebo nepreferované kodóny kodóny preferovanými. Zvýšení exprese může být dosaženo dokonce pouze částečnou náhradou méně preferovaných kodónů nebo nepreferovaných kodónů za preferované kodóny.

Za určitých podmínek může být žádoucí nahradit nepreferovaný kodón kodónem preferovaným nebo méně preferovaným kodónem pouze částečně. Tím se dosáhne částečného zvýšení úrovně exprese.

V dalším provedení vynálezu jsou popsány vektory, včetně expresních vektorů, obsahujících jeden nebo více syntetických genů.

Pod pojmem vektor rozumíme DNA molekulu, odvozenou například z plazmidu, bakteriofága nebo savčího či hmyzího viru, do které mohou být vloženy nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor může obsahovat jedno nebo více jednotlivých restrikčních míst a může být schopen autonomní replikace v definovaném hostiteli nebo přenášejícím organismu, tak, že klonovaná sekvence je reproducibilní. Tak se expresním vektorem míní každý autonomní element schopný přímé syntézy proteinu. Takovéto expresní vektory zahrnují savčí plazmidy a viry.

Vynález dále pojednává o syntetických genových fragmentech, které kódují požadovanou část proteinu. Takovéto syntetické genové fragmenty jsou podobné syntetickým genům dle vynálezu, rozdílem je, že kódují pouze část proteinu. Takovéto genové fragmenty kódují přednostně fragmenty o nejméně 50, 100, 150 nebo 500 navazujících aminokyselinových zbytcích proteinu.

Při sesavování syntetických genů podle vynálezu je rozumné se vyhnout CpG sekvencím, protože tyto sekvence mohou způsobit genovou odmlku (silencing). Z tohoto důvodu ve výhodném uspořádání tohoto vynálezu kódující oblasti syntetických genů neobsahují sekvenci cg.

Kodonová sekvence přítomná v HIV gpl20e«v genu je také přítomna v gag a pol genech. Proto nahrazení části nepreferovaných a méně preferovaných kodónů v těchto genech kodóny preferovanými by mělo vést k vytvoření genu schopného vyšší hladiny exprese. Velká část kodónů v lidských genech kódujících Faktor VIII a Faktor IX jsou nepreferované nebo méně preferované kodóny. Nahrazení části těchto kodónů preferovanými nebo méně preferovanými kodóny by mělo vést k získání genu schopného vyšší hladiny exprese v savčích buněčných kulturách.

Syntetické geny podle vynálezu mohou být zavedeny do buněk a živých organismů. Například, pro účely genové terapie lze využít vektory (virové nebo nevirové), které mohou být užity k zavedení syntetických genů do buněk živých organismů.

Naopak, může být velmi vhodné nahradit preferované kodóny v přirozeně se vyskytujícím genu za kodóny méně preferované, což povede ke snížení exprese.

Standardní souhrné práce popisující obecné principy technologie rekombinantní DNA zahrnují: Watso a další,Molecular Biology of the Gene, díly I a II, vydalo nakladatelství Benjamin/Cummings Publishing company,Inc, Menlo Park, CA (1987); Darnell a další, Molecular Cell Biology, vydalo Scientific American Books, lne., New York, N.Y.(1986); Old a další, Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering. 2. Vydání, vydalo University California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Vydání, vydal Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); a Ausubel a další, Protocols in Molecular Biology, vydalo nakladatelství Wiley Press, New York, NY (1992).

Termín transformované buňky označuje buňky, do kterých byla ( nebo do jejich předků) zavedena pomocí rekombinantních technik DNA, vybraná DNA molekula, to znamená syntetický gen, nebo jeho část.

Termínem umístění pro expresi se míní, že DNA molekula, to znamená syntetický gen, je umístěn v sousedství DNA sekvence, která řídí transkripci a translaci této sekvence, (to znamená, usnadňuje produkci proteinu kódovaného syntetickým genem).

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek 1: označuje sekvenci syntetického genu gp 120 a syntetického gp 160, ve kterých jsou kodóny nahrazeny jinými kodóny, které byly nalezeny ve vysoce exprimovaných lidských genech.

Obrázek 2: znázorňuje schematický nákres syntetického genu gpl20 (HIV-1MN). Vyšrafované části označené 1 až 5 označují hypervariabilní oblasti. Tečkami vyplněné rámečky označují CD4 vazné místo. Je zde také znázorněn omezený počet restrikčních míst: H (Hind3), Nh (Nhel), P (Pstl), Na (Nael), M (Mlul), R (EcoRl), A (Agel) a No (Notl). Chemicky syntetizované fragmenty složící jako PCR templáty jsou znázorněny pod sekvencí gpl20, jsou situovány tak, že leží poblíž oblasti primerů použitých pro jejich amplifikaci.

Obrázek 3: je to fotografie výsledků měření transientní transfekce, což slouží k měření exprese 120gp. Gelová elektroforéza imunoprecipitovaných supematantů buněk 293T transfekovaných plazmidem exprimujícím gpl20, kódovaný IIIB izolátem HIV-1 (gp 120111b), MN izolátem HIV-1 (gpl20mn), MN izolátem HIV-1 modifikovaným substitucí endogenního vedoucího peptidu peptidem z CD5 antigenu (gpl20mnCD5L), nebo chemicky syntetizovaného genu kódujícího MN variantu HIV-1 s lidskou CD5 vedoucí sekvencí (syngpl20mn). Supernatanty byly sbírány po 12 hodin trvajícím značení, a to 60 hodin po transfekci. Supernatanty byly imunoprecipitovány CD4/IgGl fuzním proteinem a protein A Sepharosou.

Obrázek 4: je to graf znázorňující výsledky ELIS A testů užitého k měření hladiny proteinů v supematantech transientně transfekovaných buněk 293T. Supernatanty 293T buněk transfekovaných plazmidem exprimujícím gpl20 kódovaný IIIB izolátem HIV-1 (gp 120111b), MN izolátem HIV-1 (gpl20mn), MN izolátem HIV-1 modifikovaným substitucí endogenního vedoucího peptidu peptidem z CD5 antigenu (gpl20mnCD5L), nebo chemicky syntetizovaného genu kódujícího MN variantu HIV-1 s lidskou CD5 vedoucí sekvencí (syngpl20mn). Supernatanty byly sbírány po 4 dnech a testovány v gp/CD4 ELISA testech. Koncentrace gpl20 je vyjádřena v ng/ml.

Obrázek 5A: je to fotografie gelu znázorňujícího výsledky imunoprecipitačních testů užitých pro měření exprese nativního a syntetického gpl20 v přítomnosti rev v trans a RRE v cis.

V tomto pokusu byly 293T buňky transientně transfekovány 10pg plazmidu koprecipitovaného fosforečnanem vápenatým, který exprimuje: (A) syntetickou sekvenci gpl20MN a RRE v cis , (B) gpl20 část HIV-1 IIIB, (C) gpl20 část HIV-1 IIIB a RRE v cis, vše v přítomnosti nebo nepřítomnosti rev exprese. Kostrukty RRE gpl20IIIbRRE a syngpl20mnRRE byly připraveny užitím Eagl/Hpal RRE fragmentů klonovaných pomocí PCR z HIV-1 HXB2 provirového klonu. Každý gpl20 expresní plazmid byl současně transfekován s 10pg buď pCMVrev nebo CDM7 plazmidové DNA. Supernatanty byly sklízeny 60 hodin po transfekci, imunoprecipitovány pomocí CD4:IgGl fuzního proteinu a protein A agarosy. Vzorky byly dále podrobeny elektroforéze na 7% redukujícím SDS gelu. Doba expozice gelu byla prodloužena, aby se dala demonstrovat indukce gpl20IIIbrre pomocí rev.

9999

Obrázek 5B: znázorňuje kratší expozici v podobném pokuse, kde szngpl20mnrre byl podroben současné transfekci s a bez pCMVrev.

Obrázek 5C: znázorňuje schematický diagram kostruktů použitých v Obrázku 5A.

Obrázek 6: udává srovnání sekvencí původního typu genu ratTHY-1 (wt) a syntetického genu ratTHY-1 (env) sestrojeného chemickou syntézou a majícího nejběžnější kodóny nalezené v HIV-lenv genu.

Obrázek 7: znázorňuje schematický diagram syntetického genu ratTHY-1. Černě vytečkovaný blok znázorňuje signální peptid. Vyšrafovaný rámeček znázorňuje sekvence prekurzoru, který řídí připojení fosfatidylinositol glykanové kotvy. Specifická restrikční místa použitá pro připojení THY-1 konstruktu jsou značena: H (Hind3), M(Mlul), S(Sacl) a No(Notl). Místa zapojení syntetických oligonukleotidů v konstruktu jsou znázorněna v dolní části obrázku.

Obrázek 8: je graf, který znázorňuje výsledky průtokové cytometrické analýzy. V tomto pokuse byly buňky 293T podrobeny transfekci buď expresním plazmidem obsahujícím původní typ ratTHY-1 (silná čára), nebo expresním plazmiderp s obalovými kodóny ratTHYl(slabá čára), či, jak je vyznačeno tečkovanou čarou pouhým vektorem, který byl společně precipitován fosforečnanem vápenatým. Tři dny po transfekci byly buňky označeny monoklonální protilátkou 0X7 připravenou proti ratTHY-1, následovanou polyklonální protilátkou konjugovanou s FITC (FITC-anti-myší IgG).

Obrázek 9A: je fotografie gelu ilustrujícího výsledky imunoprecipitační analýzy supernatantů lidských buněk 293 T, které byly transfekovány buď syngpl20mn (A), nebo konstruktem syngpl20mn.rTHY-lenv, který obsahuje gen rTHY-lenv v 3'nepřekládané oblasti genu syngpl20mn (B). Konstrukt syngpl20mn.rTHY-lenv byl vytvořen vložením Notl adaptéru na tupý konec místa Hind3 v rTHY-lenv plazmidu.. Následně byl Notl fragment o velikosti 0.5 kb obsahující gen rTHY-lenv vložen do Notl restrikčního místa plazmidu syngpl20mn a byl testován na správnou orientaci

Supernatanty buněk značených radioaktivně³⁵S byly odebrány 72 hodin po transfekci a vysráženy CD4:IgG fuzním proteinem a protein A-agarózou. Potom byly vzorky podrobeny elektroforéze na 7% SDS-PAGE.

Obrázek 9B: znázorňuje schematický diagram konstruktů popsaných v Obrázku 9A.

Obrázek 10A: je fotografií COS buněk, které byly podrobeny transfekci vektorem a nevykazovaly žádnou GFP fluorescenci.

Obrázek 10B: je fotografií COS buněk transfekovaných expresním plazmidem CDM7 kódujícím přirozený GFP upravený tak, aby obsahoval dohodnutou sekvenci pro iniciaci translace.

Obrázek 10C: je fotografií COS buněk transfekovaných expresním plazmidem majícím stejnou hraniční sekvenci a konsenzuální (mezidruhově podobnou) sekvenci iniciace jako v Obrázku 10B, ale nesou ještě kodón optimalizované genové sekvence.

Obrázek 10D: je fotografií COS buněk transfekovaných expresním plazmidem jako v Obrázku 10C, ale nesoucí Thr aminokyselinový zbytek místo Ser v pozici 65.

Obrázek 11: znázorňuje sekvenci syntetického genu kódujícího zeleně fluoreskující proteiny (Sekvence id. č.: 40).

Obrázek 12: znázorňuje sekvenci přirozeného lidského genu pro Faktor VIII, ve chybí centrální část domény B (aminokyseliny 760 -1639, včetně) (Sekvence id.c.: 41).

Obrázek 13: znázorňuje sekvenci syntetického lidského genu pro Faktor VIII, ve chybí centrální část domény B (aminokyseliny 760 -1639, včetně ) (Sekvence id.č.: 42).

4444 ♦ 4 4··· 44 44 • 44 444 4444

4 44444 4444

4 44 4 44 444444

444 444 44

4 4 4 44 444 «4 44

Příklady provedení vynálezu

Přikladl

Konstrukce syntetických genů gpl20 obsahujících kodóny, které byly nalezeny ve vysoce exprimovaných lidských genech

Tabulka četnosti kodónů pro prekurzor virové obálky LAV subtypu HIV-1 byl vytvořen užitím softwaru vyvinutého skupinou University ve Wisconsinu (University of Wisconsin Genetics Computer Group). Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1, s vyznačením typu kodónů, které jsou převzaty ze sbírky vysoce exprimovaných lidských genů. Pro každou aminokyselinu kódovanou degenerovanými kodóny, jsou kodóny nej výhodnější pro vysokou expresi rozdílné od těch, které jsou nejvýhodější pro obálku HIV prekurzoru. Co více, dá se odvodit jednoduché pravidlo, které popisuje typ kodónů upřednostněných v obalu, které lze obecně použít: preferované kodóny maximalizují počet adeninových zbytků ve virové RNA. Pro všechny případy je jisté jedno , zeje nejčastěji je používán kodón, ve kterém je ve třetí pozici A . Ve zvláštním případě šeřinu, tři kodóny shodně dodávají do mRNA jeden adeninový zbytek, dohromady tyto tři kodóny obsahují 85 % serinových kodónů ve skutečnosti používaných pro obalové transkripty. Opravdu nápadný příklad významnosti A byl nalezen ve výběru kodónů pro arginin, ve kterém triplet AGA zahrnuje 88 % argininových kodónů.

Kromě převážné části A zbytků bylo dále nalezeno upřednostnění uridinu v degenerovaných kodónech, ve kterých ale musel být třetím zbytkem pyrimidin. Konečně, byly nalezeny určité souvislosti mezi méně často užívanými variantami, zdůvodňujícími pozorování, že dinukleotid CpG je velmi málo používán, dále, že na třetím místě se v kodónů méně často vyskytuje G, zatímco na druhém místě C, jako je tomu v kodónech pro alanin, prolin, serin a threonin. CGX triplet pro arginin nebude použit pravděpodobně vůbec.

Tabulka 1: Srovnání frekvence výskytu kodónů v HIV-1 Illb env genu a v lidských vysoce exprimovaných genech

	High	Env	High	Env
Ala				Cys
GC	C	53	27	TG	C	68	16
	T	17	18		T	32	84
	A	13	50
	G	17	5	Gin
Arg				CA	A	12	55
CG	C	37	0		G	88	45
	T	7	4
	A	6	0
	G	21	0	Glu
AG	A	10	88	GA	A	25	67
	G	18	8		G	75	33

♦ ··· ·· ·· » · · · • · · • · · · · ·

Asn				Gly
AA	c	78	30	GG	C	50	6
	T	22	70		T	12	13
					A	14	53
Asp					G	24	28
GA	c	75	33	His
	T	25	67	CA	C	79	25
					T	21	75
				De
				AT	C	77	25
					T	18	31
					A	5	44
Leu
CT	c	26	10	Ser
	T	5	7	TC	C	28	8
	A	3	17		T	13	8
	G	58	17		A	5	22
TT	A	2	30	AG	C	34	22
	G	6	20		T	10	41
Lvs				Thr
AA	A	18	68	AC	c	57	20
	G	82	32			14	22
					A	14	51
					G	15	7
Pro				Tyr
CC	C	48	27	TA	C	74	8
	T	19	14		T	26	92
	A	16	55
	G	17	5
Phe				Val
TT	C	80	26	GT	c	25	12
	T	20	74		T	7	9
					A	5	62
					G	64	18

Frekvence výskytu jednotlivých kodónů byla vypočítána pomocí programu vyvinutého na Univerzitě ve Wisconsinu ( University of Wísconsin Genetics Computer Group). Čísla reprezentují procenta případů, ve kterých byl daný kodón využit. Časnost užití kodónů v genu pro obalový protein různých izolátů HIV-1 viru je srovnatelná a vykazuje podobné hodnoty.

Za účelem přípravy genu gpl20, který by byl v savčích buňkách schopen exprese na vysoké úrovni, byl připraven syntetický gen kódující segment gpl20HIV-l, označený syngpl20mn. Sekvence tohoto syntetického genu je založena na sekvenci nejběžnějšího subtypu vyskytujícího se v Severní Americe, HIV-1 MN ( Shaw a další, Science 226: strana 1165,

1984; Gallo a další, Nátuře 321: strana 119, 1986). V tomto syntetickém genu gpl20 jsou

9999

99 99 9« 99

9 9 · · · 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

4 · · 9 4 4 4 9 · · « · 4 9 4 • 4 4 9 4 4 99 99 téměř všechny přirozené kodóny systematicky nahrazeny kodóny nejčastěji používanými ve vysoce exprimováných lidských genech (Obrázek 1). Tento syntetický gen byl složen z chemicky syntetizovaných oligonukleotidů a dosahoval délky od 150 do 200 baží. Jestliže délka chemicky syntetizovaných oligonukleotidů přesáhla délku od 120 do 150 baží, procento produktů dosahující plné délky bylo nižší a plýtval se výchozí materiál na oligonukleotidy o kratší délce. Dále také tyto kratší fragmenty inhibují klonování a proces PCR . Je proto velmi důležité užívat oligonukleotidy o určité délce. Z důvodu, aby se dal používat materiál vzniklý v syntéze bez dalšího čistění, se jednovláknové oligonukleotidy před klonováním amplifikovaly v PCR reakci. PCR produkty se čistily na agarosovém gelu a potom se používaly jako templáty v další PCR reakci. Měly-li dva sousedící fragmenty překrývající se sekvence na koncích každého fragmentu, mohly být amplifikovány společně. Takto vzniklé fragmenty, které měly velikost mezi 350 a 400 bp, byly vloženy do plazmidu odvozeného od pCDM7, který obsahoval vedoucí sekvenci z CD5 povrchové molekuly následovanou klonovacím místem vektoru (polylinkerem), který obsahoval následující restrikční místa: NhelZPstl/Mlul/EcoRlZBamHl. Každé z restrikčních míst enzymů v polylinkeru představuje místo, které je také na 3'nebo 5'konci připravených PCR fragmentů. Tak následným klonováním každého ze čtyř dlouhých fragmentů se složí celý požadovaný gen gpl20. Pro každý fragment se vytvoří tři až šest různých klonů, u kterých, než se použijí k sestavení genu, se zjistí sekvence. Schematický nákres metod použitých ke konstrukci syntetického genu gpl20 je znázorněn na Obrázku 1.

V tomto procesu se předpokládá také určitý podíl mutací. Nejčastěji nalezené mutace byly deleční, a to buď krátké (jednonukleotidové), nebo dlouhé ( nad 30 nukleotidů). V některých případech bylo nezbytné vyměnit v dané oblasti části s vlastními syntetickými adaptéry nebo kusy z dalších subklonů bez mutací. Byly optimalizovány také některé odchylky od přesného dodržování užití optimálních kodónů, a to z důvodu umístění vloženého restrikčního místa do vznikajícího genu, které by umožnilo snadnou náhradu různých segmentů (Obrázek 2). Tato jedinečná restrikční místa byla zavedena do genu v přibližně intervalech 100 baží. Přirozeně se vyskytující vedoucí sekvence v HIV byla zaměněna za vysoce účinný vedoucí peptid z lidského CD5 antigenu, čímž se usnadnila sekrece (Aruffo a další, Cell 61: strana 1303, 1990). Plazmid použitý pro konstrukci byl odvozen od savčího expresního vektoru pCDM7 přepisujícího vložený gen pod kontrolou časného silného lidského CMV promotoru.

Za účelem srovnání původních přirozených a syntetických sekvencí kódujících gpl20, byla syntetická sekvence kódující gpl20 vložena do savčího expresního vektoru a tento konstrukt byl testován v transientních transfekčních pokusech. Jako kontrola, sloužící k vyloučení odchylek v úrovni exprese mezi různými izoláty viru a artefakty vzniklými použitím odlišných vedoucích sekvencí, byly použity různé přirozeně se vyskytující geny pro gpl20. Konstrukt gpl20 HIV Illb, užitý jako kontrola, byl připraven pomocí metody PCR, kde jako templáty byly použity fragmenty obalového proteinu Sall/Xhol HIV-1 HXB2. Aby se vyloučily mutace zapříčiněné PCR, byl použit fragment KPNIZEarl, ve kterém je přibližně 1.2kb genu zaměněno za danou sekvenci z pro virového klonu. Divoké typy konstruktů gpl20, které se užívají jako kontroly, byly klonovány pomocí PCR z HIV-1 MN infikovaných C8166 buněk (AIDS Respirátory, Rockville, MD) a gpl20 byl exprimován buď s přirozeně se vyskytujícím obalovým proteinem, nebo s CD5 vedoucí sekvencí. Jelikož pro tento případ nejsou k dispozici provirové kmeny, byly testovány dva klony pro každý konstrukt, tak aby se vyloučily artefakty vzniklé z PCR reakce. K určení množství gpl20 vylučovaného v semikvantitativních supernatantech 293 T buněk, které byly podrobeny transfekci pomocí společné precipitace s fosforečnanem vápenatým , byly dále imunoprecipitovány s rozpustným íuzním proteinem typu CD4:imunoglobulÍn a protein A sepharosou.

··«« · · • · • ·

F · F ·· FFF · ffff « *

FFF

FF ·«

F F F F

F F F F

F FFF FFF

F F

F F · F

Výsledky této analýzy (Obrázek 3) ukazují, že produkt syntetického genu je exprimován ve vyšší koncentraci ve srovnání s nativními gpl20 kontrolami. Molekulové hmotnosti produktů syntetického gpl20 genu byly srovnány s kontrolními proteiny (Obrázek 3) a byly v rozsahu od 100 do 110 kd. O trochu rychlejší pohyblivost se dá vysvětlit faktem, že u některých nádorových buněčných linií, například 293T, není buď dokončena glykosylace, nebo k ní dochází ve změněném rozsahu.

K přesnějšímu porovnání výsledků exprese proteinu gpl20na kvantitativní úrovni slouží ELISA s CD imobilizovanou fází. Tato analýza ukazuje (Obrázek 4), že data získaná v ELISA testu jsou srovnatelná s daty získanými z imunoprecipitační reakce. Koncentrace gp 120 se pohybovala přibližně na 125ng/ml pro syntetický gen gpl20 a méně než hodnota pozadí (5ng/ml) pro ostatní nativní gpl20 geny. Tak se jeví, že exprese syntetického gpl20 je přinejmenším o řád vyšší, než pro přirozené geny gpl20. Nejmenší zvýšení exprese dosažené v těchto pokusech bylo 25 krát vyšší, než u kontroly.

Úloha rev v expresi gpl20

Od té doby, co bylo objeveno uplatnění vlivu rev v různých krocích exprese virových transkriptů, byla také testována možná úloha netranslačních vlivů na vylepšení exprese syntetických gpl20 genů. Zaprvé se testovaly hladiny cytoplasmické mRNA, aby se vyloučily možnosti negativních signálů vztahujících se buď ke zvýšení degradace mRNA nebo jejího zadržení v jádře,což bylo eliminováno změnou nukleotidové sekvence. Cytoplazmatická RNA byla připravena pomocí lyzovacího roztoku NP40 transientně transfekovaných buněk 293 T a následným oddělením jader pomocí centrifugace. Cytoplazmatická RNA byla po té získána z lyzátu několika násobnou extrakcí fenolem a precipitací, dále pomocí blotování a konečně pomocí hybridizace se specifickou sondou připravenou proti obalovému proteinu.

Zkráceně popsáno, cytoplazmatické buňky mRNA293, které byly podrobeny transfekci CDM, gpl20 IIIB, nebo syngpl20, byly vyizolovány 36 hodin po transfekci. Cytoplazmatická RNA z Hela buněk infikovaných přirozeně se vyskytujícím virem neštovic nebo rekombinantním virem exprimujícím gp 120111b nebo syntetický gen gpl20, byla pod kontrolou 7.5 promotoru a byla izolována 16 hodin po infekci. Stejné množství bylo naneseno na nitrocelulózovou membránu a za použití blotovacího zařízení a bylo následně podrobeno hybridizaci s náhodně značenými fragmenty 1.5 kb gp 120111b a syngpl20, nebo s lidským beta-aktinem. Množství RNA bylo kvantifikováno prohlédnutím hybridizačních membrán fosfoimagerem. Užitý postup je detailněji popsán níže.

Tento pokus demonstruje skutečnost, že není rozdíl v úrovních koncentrací mRNA v buňkách transfekovaných jak nativním, tak syntetickým gpl20 genem. Ve skutečnosti, v některých pokusech byla hladina cytoplasmatické mRNA pro syntetický gen gpl20 dokonce nižší, než pro nativní gen .

Tyto výsledky byly potvrzeny měřením exprese rekombinantního viru neštovic. Lidské buňky 293 nebo Hela buňky byly infikovány virem neštovic, který exprimoval nativní typ gp 1200111b nebo syngpl20mn, znásobily svou infekčnost nejméně desetkrát. Supernatanty byly sklízeny 24 hodin po infekci a imunoprecipitovány s imunoglobulínem proti fuznímu proteinu CD4 a pomocí protein A sepharosy. Zde užívané postupy jsou popsány podrobněji v dalším textu.

Tento pokus také potvrdil, že zvýšení exprese syntetického genu bylo pozorováno již dříve, a to když endogenní genový produkt a produkt syntetického genu byly exprimovány z rekombinantního viru neštovic pod kontrolou silného smíšeného časného a pozdního 7.5k promotoru. Protože mRNA viru neštovic jsou přepisovány a překládány v cytoplazmě, zvýšení exprese obalu syntetického genu nemůže být považováno za činitele, který vylepší přenos

0 0· 0 « 00 • · • 0

0 0

0 0 0 0

0000 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

000

0 0·

0 0 0

0 0 0

000 090 z jádra. Tento pokus byl následně opakován v dalších dvou typech lidských buněk, a to v buněčné linii 293 z rakovinných buněk ledvin a HeLa buňkách. Stejně jako v případě transfekce 293T buněk, hladiny mRNA byly podobné v buňkách 293 infikovaných jakýmkoli rekombinantním virem neštovic.

Užití kodónů u Lentivirů

Protože je zjevné, že užití kodónů má prokazatelný dopad na expresi v savčích buňkách, byla zkomán výskyt kodónů také v obalových genech u dalších retrovirů. Tato studie však neprokázala žádný jasný obecný princip kodónové preference mezi retroviry. Avšak, byly-li zkoumány viry z rodu lentivirů ( k těmto virům patří i HIV-1) samostatně, množina užitých kodónů byla téměř identická s kodóny nalezenými pro HIV-1 Byla připravena tabulka frekvence využití kodónů, která byla vytvořena z obalových glykoproteinových sekvencí různých retrovirů ( přednostně typu C) a za vynechání lentivirů. Tato tabulka byla porovnána s tabulkou frekvencí výskytu kodónů vytvořenou z obalových sekvencí čtyř lentivirů, které nebyly blízce příbuzní s HIV-1. Byly to následující viry: virus kozí artritické encefalitidy, koňský virus infekční anemie, kočičí virus imunodeficience a visna virus (Tabulka 2).

Model pro užití kodónů v lentivirech je velmi podobný obdobným zákonitostem v HIV-1, a to ve všech případech, mimo jeden. Ve všech těchto případech je kodón preferovaný v HIV-1 stejný jako preferovaný kodón u ostatních lentivirů. Výjimkou je prolin, který je kodóván u 41 % lentivirových (neposuzujeme HIV) obalových reziduí CCT , ve 40 % reziduí CCA. Tato skutenost jasně dokumentuje význam preference tripletů končících A. Model pro užití kodónů v obalových proteinech virů nepatřících k lentivirům nevykazuje podobné upřednostnění A zbytků a není zde také taková četnost asymetrického rozložení C a G zbytků vzhledem k třetí pozici, tak jak tomu bylo u vysoce se exprimujících lidských genů. Obecně se zdá, že retroviry nepatřící k lentivirům, využívají různé kodóny revnoceněji. Sdílejí stejný model s lidskými geny, které se neexprimují na tak vysoké úrovni.

Kromě tohoto obecného pravidla o rozšíření kodónů obsahujících A, kodóny lentivirů zachovávají stejně jako HIV model silné CpG zastupitelnosti, to znamená, že třetí pozice v tripletu pro alanin, prolin, serin a threonin je zřídkakdy G.

Triplety v obalech retrovirů vykazují podobnost, ale slaběji se projevují v zastupitelnosti CpG. Nejzřetelnějším rozdílem mezi lentiviry a dalšími retroviry vzhledem k rozšíření CpG leží v užití CGX varianty argininových tripletů, která je poměrně často zastoupena mezi sekvencemi kódujícími obaly retrovirů, ale není téměř nikdy přítomna mezi srovnatelnými sekvencemi lentivirů.

Rozdíly v rev závislosti mezi přirozeným a syntetickým gpl20

K objasnění, zda regulace pomocí rev je spojena s užitím kodónů v HIV-1, byl zkoumán vliv rev na expresi jak nativního, tak syntetického genu. Jelikož regulace pomocí rev vyžaduje rev-vazné místo RRE v cis, byl připraveny konstrukty, do kterých bylo vazné místo vloženo klonováním do 3 'nepřekládané oblasti jak u přirozeného, tak i u syntetického genu. Tyto plazmidy byly vpraveny transfekcí do buněk 293T společně s rev, nebo kontrolním plazmidem. Potom byly měřeny hladiny exprese gpl20 semikvantitativně pomocí imunoprecipitace v supernatantech. Tento postup je popsán podrobněji v dalším textu.

Tak, jak je ukázáno na obrázku 5A a Obrázku 5B, rev pozitivně reguluje nativní gen gpl20, ale nemá žádný vliv na expresi syntetického genu gpl20. Tudíž působení rev není patrné v příkladech, kdy chybí kódující sekvence pro endogení virové obalové sekvence.

4444 • · 44

Exprese syntetických ratTHY-1 genů s HIV obalovými kodóny

4444 44 44 • 4 4 *444 • *444 « ·· 4 • · 4 4 444 444

4 4 4 4

444 44 44

Z předchozího pokusu vyplývá, že ve skutečnosti jsou „obalové sekvence,, přítomny z důvodu rev regulace. K otestování této hypotézy byly připraveny syntetické obdoby genů kódujících malé, obvykle vysoce exprimované proteiny buněčného povrchu, jako je ratTHY-1 antigen. Syntetická verze genu ratTHY-1 byla navržena tak, aby obsahovala tytéž kodóny jako jsou užívané v HIV gpl20. V návrhu sekvence syntetického genu byla vynechána sekvence AUUUA, která je spojována s nestabilitou mRNA. Pro zjednodušení manipulace s tímto vzniklým syntetickým genem byla do něj vložena dvě restrikční místa (Obrázek 6).Tento syntetický gen s kodónem vyskytujícím se v kodónech obalu HIV (rTHY-lenv) byl připraven užitím tří oligonukleotidů obsahujících 150 až 170 baží (Obrázek 7). Na rozdíl od syngpl20mn genu, byly PCR produkty přímo klonovány a spojeny v pUC12 a následně klonovány do pCDM7.

Hladiny exprese přirozeného rTHY-1 a rTHY-1 obsahujících HIV obalové kodóny byly kvantifikovány pomocí imunofluorescence transientně transfekovaných buněk 293T. Obrázek 8 ukazuje, že velikost exprese nativního genu THY-1 je nejméně o dva řády vyšší, než hladina pozadí, kterou představuje exprese kontrolních transfekovaných buněk (pCDM7). Naproti tomu, exprese syntetického ratTHY-1 je podstaně nižší než je tomu u nativního genu (je to znázorněno posunem píků vzhledem k nižším číslům kanálu).

K důkazu skutečnosti, že do sekvence nebyly nechtěně zavedeny žádné části negativní sekvence zvyšující degradaci mRNA, byl sestaven konstrukt, ve kterém byl gen rTHY-lenv vložen na 3' konec syntetického genu gpl20 (Obrázek 9B). V tomto pokuse byly buňky 293 T transfekovány buď genem syngpl20mn nebo syngpl20/ratTHY-l env, neboli fuzním genem (syngpl20mn.rTHY-lenv). Exprese byla měřena imunoprecipitací imunoglobulínem proti fuznímu preteinu CD4 a pomocí protein A agarosy. Tento postup je popsán podrobněji v dalším textu.

Protože syntetický gen gpl20 obsahuje stop kodón, rTHY-lenv se z tohoto transkriptu nepřekládá. Kdyby byly přítomny v sekvenci negativní elementy zvyující degradaci, hladina proteinů gpl20 exprimovaných z tohoto konstruktu by měla být nižší ve srovnání s expresí z konstruktu syngpl20mn bez rTHY-lenv. Obrázek 9A ukazuje, že exprese obou konstruktů je podobná, což ukazuje na to, že nízká hladina exprese musí být spojena s translací.

Tabulka 2: Frekvence užití kodónů v obalových genech lentivirů (lenti) a dalších retro virů nepatřících k lentivirům (další)

Ala GC	C T A	Lenti 45 26 20	13 37 46	Cys TG	Další
C T	53 47	21 79
Arg				Gin	c	52	69
GC	C	14	2	CA	T	48	31
	T	6	3
	A	16	5
	G	17	3	Glu
AG	A	31	51	GA	A	57	68
	G	15	26		G	43	32

• · · · • · ·

Asn

AA	C	49	31	Gly
	T	51	69	GG	C	21	8
					T	13	9
As£					A	37	56
					G	29	26
GA	c	55	33
	T	51	69	His
				CA	C	51	38
					T	49	62
				Ile
				AT	C	38	16
					T	31	22
					A	31	6
Leu
CT	c	22	8	Ser
	T	14	9	TC	C	38	10
	A	21	16		T	17	16
	G	19	11		A	18	24
TT	A	15	41		G	6	5
	G	10	16	AG	C	13	20
					T	7	25
Lys				Thr
AA	A	60	63	AC	c	44	18
	G	40	37		T	27	20
					A	19	55
					G	10	8

Pro	Tvr
CC	C	42	14	TA	C	48	28
	T	30	41		T	52	72
	A	20	40
	G	7	5
Phe				Val
TT	C	52	25	GT	c	36	9
	T	48	75		T	17	10
					A	22	54
					G	25	27

Frekvence výskytu jednotlivých kodónů byla vypočítána pomocí programu vyvinutého na Univerzitě ve Wisconsinu ( University of Wisconsin Genetics Computer Group). Čísla reprezentují procenta případů, ve kterých byl daný kodón využít. Zastoupení kodónů u retrovirů nepatřících do skupiny lentivirů bylo převzato ze sekvencí obalu prekursoru bovine • · · · • 9 9 9 9

9 «

9 «

999 leukemia viru, viru kočičí leukemie, virus leukemie lidských T buněk typu I, lidský virus lymfotropních T -buněk typu II, izolát myšího leukemického viru (MuLV) z buněk norka, Rauscher spleen focus-forming isolate, izolát 10A1, 4070A amfotropní izolát a izolát myeloproliferativního leukemického viru, dále z krysího leukemického viru, simian sarkoma viru, simian leukemického viru T-buněk, leukemogenního retroviru T1223/B a opičího leukemického viru gibonů. Frekvence kodónů v tabulce pro lentiviry nepatřící k HIV a SIV byly sestaveny ze sekvencí prekurzorů obalů pro virus kozí artritické encefalitidy, viru koňské infekční anemie a viru kočičí imunodeficience a visna viru.

Rev-dependentní exprese syntetického genu ratTHY-1 s obalovými kodóny

K objasnění toho, zda pomocí rev lze regulovat expresi genu ratTHY-1 majícího env kodóny, byl sestaven konstrukt s rev-vazným místem na 3' konci otevřeného čtecího rámce pro ratTHY-lenv. K měření citlivosti ratTHY-lenv konstruktu majícího 3'RRE na působení rev, byly lidské 293 T buňky transfekovány společně ratTHY-lenvrre a buď CDM7 nebo pCMVrev. 60 hodin po transfekci byly buňky sklizeny do PBS pufru obsahujícího lmM EDTA a obarveny myší monoklonální protilátkou OX-7 anti rTHY-1 a sekundární protilátkou konjugovanou s FITC. Měřila se intenzita fluorescence použitím cytofluorometru EPICS XL. Tyto postupy jsou popsány podrobněji v dalším textu.

V opakovaných pokusech bylo detekováno slabé zvýšení exprese rTHY-lenv, byla -li provedena společná transfekce rev s genem rTHY-lenv. Za účelem zvýšení citlivosti testovaného systému byl sestrojen konstrukt exprimující produkt genu rTHY-lenv jako sekret.Tento konstrukt poskytuje daleko spolehlivější data, protože nashromážděné množství sekretovaného proteinu v supernatantu lépe odráží výsledek produkce proteinu po celý prodloužený časový úsek na rozdíl od proteinu exprimovanému na povrchu, jehož množství spíše odráží okamžitou rychlost produkce. Gen schopný exprese sekretované formy proteinu byl připraven pomocí PCR za použití dopředného (forward) a zpětného primeru, které přisedaly jednotlivě k 3'konci endogenní vedoucí sekvence a 5' konci sekvence motivu požadovaného pro fosfatidylinositol glykanovou kotvu. PCR produkt byl klonován do plazmidu , který vždy obsahoval CD5 vedoucí sekvenci. Takto byl připraven konstrukt, ve kterém byla vynechána membránová kotva a vedoucí sekvence zaměněna za heterologní (a pravděpodobně více účinný) vedoucí peptid. Citlivost sekretované formy ratTHY-lenv k rev se měřila pomocí imunoprecipitace supernatantů lidských 293T buněk podrobených společné transfekci s plazmidem exprimujícím sekreto vanou formu ratTHY-lenv a RRE sekvenci v cis (rTHY-lenvPI-rre) a buď CDM7 nebo pCMVrev. Konstrukt rTHY-lenvPI-RRE byl připraven pomocí PCR za použití oligonukleotidů: cgc ggg gct agc gca aag agt aat aag ttt aac ( Sekvence id. č: 38) jako dopředného primeru a olygonukleotidu: cgc gga tec ctt gta ttt tgt act aat a (Sekvence id.č. 39) jako reverzního primeru a syntetického rTHY-lenv konstruktu jako templátu. Po naštěpení enzymy Nhel a Notl byly PCR fragmenty klonovány do plazmidu obsahujícího CD5 vedoucí sekvenci a sekvence RRE. Supernatanty buněk radioaktivně značených sírou 35 byly sklízeny 72 hodin po transfekci, precipitovány monoklonální protilátkou 0X7 připravenou proti rTHY-1 a následně pomocí anti myší IgG sepharosy a rozděleny na redukujícím 12% gelu v SDS-PAGE.

V tomto pokuse byla indukce rTHY-lenv pomocí rev více nápadná a jasně prokazatelná, než v dříve popsaném pokusu a prokazatelně dokazuje, že pomocí rev je možno translačně ovlivnit transkripty, které jsou jinak potlačeny nízkým využitím kodónů.

Rev-independentní exprese fuzního imunoglobulinového proteinu rTHY-lenv ····

4444

44

K objasnění faktu, zda málo používané varianty kodónů musí být přítomny pro celou kódující sekvenci nebo zdaje dostatečné využít jen krátkou sekvenci citlivou k rev, byl připraven imunoglobulínový fuzní protein rTHY-lenv. V tomto konstruktu gen rTHY-lenv (bez sekvence motivu odpovědného za fosfatidylinositolovou glykanovou kotvu) je spojen s lidskou IgG ohebnou částí a doménami CH2 a CH3. Tento konstrukt byl připraven pomocí PCR za použití primerů obsahujících restrikční místa Nhel a BamHI a rTHY-lenv jako templátu. PCR fragmenty byly klonovány do plazmidu obsahujícího vedoucí sekvenci CD5 povrchového antigenu, ohebnou oblast a CH2 a CH3 části lidského IgGl imunoglobulinu. Následně byl klonován do plazmidu odvozeného z pCDM7 obsahujícího RRE sekvenci inzert rTHY-lenvegl.

K měření odpovědi genu rTHY-lenv/fuzní imunoglobulínový gen (rTHY-lenveglrre) na působení rev byly lidské buňky 293T podrobeny společné transfekci rTHY-lenvegl rre a buď pCDM7, nebo pCMVrev. Konstrukt rTHY-lenvegl rre byl připraven pomocí PCR za použití dopředného a zpětného primerů obsahujícími v tomto pořadí restrikční místa Nhel a BamHI. PCR fragment byl klonován do plazmidu obsahujícího CD5 vedoucí a lidskou IgGl ohebnou oblast a dále CH2 a CH3 domény. Supernatanty buněk značených sírou 35 byly sklízeny 72 hodin po transfekci, precipitovány pomocí myší monoklonální protilátky 0X7 připravené proti rTHY-1 a pomocí značené anti myší IgG sepharosy a rozděleny na redukujícím 12% gelu v SDS-PAGE. Tento postup je podrobněji popsán v dalším textu.

Stejně jako tomu bylo u produktu genu rTHY-lenvPl, také produkt exprese tohoto genu, fuzní protein rTHY-lenv/imunoglobulín, je sekretován do supernatantu. Z tohoto důvodu by měl být tento gen citlivý k rev indukci. Avšak oproti k rTHY-lenvPI, společná transfekce s rev v poloze trans nezvyšuje, nebo jen nepatrně expresi rTHY-lenvegl.

Exprese rTHY-1 imunoglobulínový fuzní protein s nativními rTHY-1 nebo HIV obalovými kodóny se měřila imunoprecipitací. Zkráceně lze tento postup popsat následovně; lidské 293T buňky byly podrobeny transfekci buď s rTHY-lenvegl (env kodóny) nebo rTHY-lwtegl (nativní kodóny). Konstrukt rTHY-lwtegl byl připraven postupem obdobným tomu, který byl použit pro rTHY-lenvegl konstrukt, s výjimkou toho, že jako templát byl použit plazmid obsahující nativní rTHY-1 gen. Supernatanty buněk značených sírou 35 byly sklízeny 72 hodin po transfekci, precipitovány pomocí myší monoklonální protilátky 0X7 připravené proti rTHY-1 a pomocí značené anti myší IgG sepharosy a rozděleny na redukujícím 12% gelu v SDS-PAGE. Tento postup je podrobněji popsán v dalším textu.

Hladiny exprimovaného rTHY-lenvegl byly nižší ve srovnání s podobným konstruktem odvozeným od nativního typu, kde byl jako fuzní partner použit rTHY-1, ale byly stále znatelně vyšší než u rTHY-lenv. Z předchozích zjištění vyplývá závěr, že obě části fuzního proteinu ovlivňují hladiny exprese. Přidání rTHY-lenv nesnižuje expresi na stejnou úroveň, jako je tomu je pro samotný rTHY-lenv. Z výše uvedeného plyne závěr, že regulace pomocí rev je zjevně neúčinná, jestliže není téměř úplně potlačena exprese proteinu.

Preference kodonů v obalových genech HIV-1

Přímé srovnání frekvence užívaní kodónů obsažených v HIV obalu a ve vysoce exprimovaných lidských genech vykazuje velké rozdíly pro všech dvacet aminokyselin. Jednoduchým měřením preference kodónů majícím statistický význam, je zjištění, že mezi devíti aminokyselinami s dvojnásobně degenerovanými kodóny, je ve všech devíti na třetí pozici v kodónů A nebo U. Pravděpodobnost, že všech devět ze dvou stejně pravděpodobných výběrů bude stejných je přibližně 0.004, a proto při jakémkoli běžném měření nemůže být výběr třetí báze považován za náhodný. Další důkaz o asymetrické preferenci kodónů byl ···· ·· ···· • · ► · · · · » · · » 4 · • 4 44· ·· ► · · · » 4 4 4 •44 444

4 ·· ·♦ nalezen mezi více degenerovanými kodóny, kde byla nalezena silná preference výběru tripletů nesoucích adenin. Toto jsou rozdíly oproti schématům platným pro vysoce exprimované geny, které upřednostňují kodóny nesoucí C, nebo méně často G na třetí pozici v kodónů s trojnásobnou nebo vícenásobnou degenerací.

Systematická náhrada přirozených kodónů kodóny z vysoce exprimovaných lidských genů dramaticky zvýšila expresi gpl20. Kvantitativní analýza provedená metodou ELIS A ukázala, že exprese syntetického genu je alespoň 25 krát vyšší ve srovnání s nativním gpl20 po transientní transfekci do lidských buněk 293 T. Hodnoty koncentrace získané metodou ELIS A byly spíše nízké. Jelikož byla ELISA metoda použita ke kvantitativnímu měření, které bylo založeno na vazbě gpl20 k CD4, bylo tak stanoveno jen množství přirozeně se vyskytujícího nedenaturovaného materiálu. Tím zřejmě může být vysvětlena nízká exprese. Měřeni hladin cytoplazmatické mRNA prokázalo, že rozdíl v expresi proteinů je způsoben rozdíly v translaci a nikoli stabilitou mRNA.

Obecně řečeno, retroviry nevykazují obdobné preference pro A a T, jak bylo zjištěno pro HIV. Ale rozdělíme-li tuto rodinu do dvou podskupin, to je na lentiviry a na retroviry nepatřící do skupiny lentivirů, byla pro lentiviry vypozorována obdobná preference pro A méně častá pro T na třetí pozici. Tímto byl podán dostatečný důkaz, že lentiviry zachovávají charakteristický motiv pro obalové kodóny ne z důvodů vlastní výhody pro reverzní transkripci nebo pro replikaci těchto zbytků, ale spíše z nějakých důvodu příznačných pro fyziologii této třídy virů. Hlavní rozdíl mezi lentiviry a nekomplexními retroviry, jak již bylo uvedeno dříve, je přítomnost dodatečné regulace a nezbytných přídatných genů u lentivirů. Tudíž, jedním z možných jednoduchých vysvětlení restrikce exprese obalových proteinů je to, že je založena na principu regulace důležitého mechanizmu pro jednu z těchto dodatečných molekul. Ve skutečnosti, je známo, že jedním z těchto proteinů by mohl být rev, který vykazuje největší homologii ve všech lentivirech. Čili užití kodónů ve virové mRNA má za následek vytváření řady transkriptů, které jsou citlivé ke stimulační aktivitě rev. Tato hypotéza byla potvrzena užitím podobné strategie, jaká byla uvedena výše, ale tentokrát byly užité kodóny zaměněny v opačném směru. Kodóny využívané vysoce se exprimujícím genem v buňce byly zaměněny za nejěastěji se vyskytující kodóny v obalu HIV. Jak se předpokládalo, expresní hladiny byly značně nižší ve srovnání s nativní molekulou, téměř v rozmezí dvou řádů, byla li měřena imunofluorescence povrchově exprimované molekuly proteinu.

Byl -li protein koexprimován s rev v pozici trans a část RRE v pozici cis, byla nalezena pouze velmi slabá indukce pro povrchovou molekulu. Avšak, byl-li jako sekretovaná molekula exprimován THY-1 , byla indukce pomocí rev více markantní, což také podpořilo výše uvedenou hypotézu. To můžeme také vysvětlit pravděpodobným hromaděním vylučovaného proteinu v supernatantu, což dále násobí účinek rev. Obecně řečeno, kdyby rev indukoval jen malé zvýšení v koncentraci proteinu povrchových molekul, tak by indukce obalu HIV pomocí rev nemohla být příčinou zvýšeného množství molekul na povrchu, ale spíše by byla příčinou zvýšené intracelulární hladiny gpl60. V tomto momentě je zcela nejasné, proč by měl nastat tento případ.

K objasnění faktu, zda takovéto malé dílčí části genu jsou dostatečné pro restrikci exprese a mohou ji způsobit, byly připraveny imunoglobulínové fuzní proteiny rTHYlenv závislé na rev , ve kterých pouze jedna třetina všech genů používala obalové kodóny. Hladiny exprese pro tyto konstrukty byly na střední úrovni, což značilo, že část negativní sekvence rTHY-lenv není dominantní nad imunoglobulínovou částí. Tento fuzní protein nebyl vůbec, nebo jen slabě, citlivý k působení rev, z čehož plyne závěr, že k rev citlivé mohou být pouze geny, které jsou téměř úplně potlačeny.

Další zákonitostí, která byla nalezena v tabulce četnosti výskytu kodónů , je nápadně nízké zastoupení CpG v tripletech. Ve srovnávací studii kodónů užitých vE.coli, kvasinkách, ···· > · · · « • · • ··· ·· ·· • · · · • · · · ··· ·· · • · ·♦ ·· drosofíle a primátech se prokázalo, že ve vysokém počtu analyzovaných genů primátů, je nejméně využívaných 8 kodónů , které všechny obsahovaly sekvenci dinukleotidu CpG.

Vyhýbání se užití kodónů se sekvencí tohoto motivu bylo nalezeno také v sekvencích pro další retroviry. Zdá se věrohodné, že důvodem pro tento nízký výskyt tripletů obsahujících CpG je snaha se vyhnout odmlce genu (gene silencing) způsobené metylací CpG cytosinů.

Skutečný počet CpG dinukleotidů pro HIV jako celek je jen asi jedna pětina množství, které by se dalo očekávát na základě složení. Toto by mohlo naznačit, že schopnost vysoké hladiny exprese je restaurována a že tento gen bude ve skutečnosti exprimován na vysoké úrovni v některém momentu během virové patogeneze.

Výsledky zde uvedené jasně dokazují, že preference kodónů má velký vliv na hladiny proteinů a podporují návrh, že translační prodloužení je mechanizmem kontrolujícím expresi savčích genů. Ale jsou zde ještě další faktory, které mohou hrát roli. Zaprvé, hromadění velkého množství ne úplně využité mRNA v eukaryotních buňkách naznačuje, že iniciace je, alespoň v některých případech, rychlost určujícím krokem translace. Jinak by všechny transkripty úplně pokryly ribozómy. Za další, jestliže by těmi mechanizmy byly zastavení ribozomů a následná degradace mRNA, suprese pomocí řídce se vyskytujících kodónů by byla s největší pravděpodobností nevratný děj, který nelze ovlivnit žádným regulačním mechanizmem, jako jsou ty, které byly uvedeny výše. Jedním z možných vysvětlení uplatnění vlivu obou zmíněných mechanizmů, to znamená iniciace a elongace , na aktivitu translace je, že buď rychlost iniciace nebo nadbytek ribozomů jsou kontrolovány zčásti podněty zprostředkovanými pomocí RNA. To znamená, že lentivirové kodóny, které se špatně iniciují, predisponují RNA, aby se hromadila v buňce. Avšak toto omezení nemusí mít kinetický charakter, například, výběr kodónů by mohl ovlivnit pravděpodobnost, že daný translační produkt, který už byl jednou iniciován, bude také řádně dokončen. Podle tohoto mechanizmu, hromadění méně favorizovaných kodónů by mohlo způsobit významnou rostoucí pravděpodobnost poruch v kompletaci nascentního polypeptidového řetězce.Takto izolovaná RNA by se potom mohla hodit ke zlepšení rychlosti iniciace působením rev . Protože na rev citlivé transkripty jsou bohaté na adenin, tak by mohla metylace adeninů v RNA zprostředkovat supresi translace.

Podrobný popis postupů

Ve výše popsaných pokusech byly použity následující postupy:

Analýza sekvence

Analýza sekvencí byla provedena pomocí softwaru vyvinutého Počítačovou skupinou na Wiskonsinské universitě (University of Wisconsin Computer Group).

Konstrukce plazmidů

Při konstrukci plazmidů byly použity následující metody. Vektory a inzerty DNA byly štěpeny v koncentraci O^g za použití daného doporučeného pufru po dobu 1 až 4 hodiny (celkový objem restrikční směsi byl 30pl).Naštěpený vektor byl potom před nanesením na elektroforézu smíchán s 10% (v/v) roztokem alkalické fosfatázy připravené z telecích střev o koncentraci Ipg/ml a nechán po 30 minut inkubovat. Oba štěpy, jak vektor, tak inzert (5 až 10 μΐ každého) byly naneseny na 1,5% gel z agarosy rozpouštějící se (tající) při nízké teplotě v TAE pufru a byly podrobeny elektroforéze. Proužky gelu obsahující námi požadovaný produkt byly přeneseny do l,5ml reakční zkumavky, zahřátý na teplotu 65° C, aby se rozpustila ···· ·· ·· « · · · • · · · ··· ·· · • · • · · · agarosa. Tato směs bez oddělení agarosy byla ihned podrobena ligaci. Ligace byla provedena většinou v objemu 25 μΐ v lx Low pufru, lx ligační přísady obsahující 200 až 400 U ligázy, μΐ vektoru a 4 μΐ insertu. Bylo -li to nutné, byly přesahující 5' konce zarovnány přidáním 1/10 objemu 250 μΜ Klenowovy polymerázy k tepelně inaktivovaným nebo fenolem extrahovaným štěpům. Po té následovala přibližně dvaceti minutová inkubace při pokojové teplotě. Bylo-li nutné zarovnat 3'přesahující konce, použil se postup zahrnující přidání l/10objemu 2,5 mM dNTPs a 5 až 10 U T4 DNA polymerázy k tepelně inaktivovaným, či fenolem extrahovaným štěpům. Potom následovala přibližně 30 minutová inkubace při 37° C.

V uvedených reakcích byly použity tyto následující pufry:

x Low pufr (60 mM Tris HC1, pH 7.5, 60 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 4mg/ml BSA, 70 mM β -merkaptoetanol, 0.02% NaN₃) x Medium pufř (60 mM Tris HC1, pH 7.5, 60 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 4mg/ml BSA, 70 mM β -merkaptoetanol, 0.02% NaN₃) x High pufr (60 mM Tris HC1, pH 7.5, 60 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 4mg/ml BSA, 70 mM β -merkaptoetanol, 0.02% NaN₃) x ligační přísady ( 1 mM ATP, 20 mM DTT, lmg/ml BSA, 10 mM spermidin) x TAE (2 M Tris acetát, 50 mM EDTA)

Syntéza a čištění oligonukleotidů

Oligonukleotidy se připravovaly na Milligen 8750 syntetizátoru (Millipore). Sloupec byl promýván 1 ml 30% hydroxidu amonného a vymyté oligonukleotidy byly deblokovány při 55°C po dobu 6 až 12 hodin. Po deblokaci bylo 150μ1 oligonukleotidů přesráženo v 1,5 ml zkumavkách použitím desetinásobného objemu nesaturovaného n- butanolu a po té centrifugováno při 15 000 rpm v mikrocentrifuze. Sraženina byla promyta 70% etanolem a resuspendována v 50 μΐ vody. Koncentrace byla určena z měření optické hustoty při 260 nm a v při ředění 1: 333 (lOD₂₆₀ = 30 pg/ml).

Pro konstrukci syntetického gpl20 genu byly použity následující oligonukleotidy ( všechny sekvence uvedené v tomto textu jsou psány ve směru od 5' k 3' konci).

Oligo 1 forward (Nhel): cgc ggg cta gcc acc gag aag ctg (Sekvence id. číslo : 1). Oligol: acc gag aag ctg tgg gtg acc gtg tac tac ggc gtg ccc gtg tgg aag ag ag gcc acc acc acc ctg ttc tgc gcc agc gac gcc aag gcg tac gac acc gag gtg cac aac gtg tgg gcc acc cag gcg tgc gtg ccc acc gac ccc aac ccc cag gag gtg gag ctc gtg aac gtg acc gag aac ttc aac at (Sekvence id. číslo : 2).

Oligo 1 reverzní: cca cca tgt tgt tet tcc aca tgt tga agt tet c (Sekvence id. číslo: 3). Oligo 2 forward: gac ega gaa ctt caa cat gtg gaa gaa caa cat (Sekvence id. číslo: 4). Oligo 2: tgg aag aac aac atg gtg gag cag atg cat gag gac atc atc agc ctg tgg gac cag agc ctg aag ccc tgc gtc gtg aag ctg acc cc ctg tgc gtg acc tg aac tgc acc gac ctg agg aac acc aac acc aac ac agc acc gcc aac aac aac agc aac agc gag ggc acc atc aag ggc ggc gag atg (Sekvence id. číslo : 5).

Oligo reverzní (Pstl): gtt gaa get gca gtt ctt cat ctc gcc gcc ctt (Sekvence id.

číslo:6).

Oligo 3 forward(Pstl): gaa gaa ctg cag ctt caa cat cac cac cag c (Sekvence id.

číslo: 7).

Oligo 3: aac atc acc acc agc atc cgc gac aag atg cag aag gag tac gcc ctg ctg tac aag ctg gat atc gtg agc atc gac aac gac agc acc agc tac cgc ctg atc tcc tgc aac acc agc gtg atc acc cag gcc tgc tgc ccc aag atc agc ttc gag ccc atc ccc atc cac tac tgc gcc ccc gcc ggc ttc gcc (Sekvence id. číslo: 8).

Oligo 3 reverzní: gaa ctt ctt gtc ggc ggc gaa gcc ggc ggg (Sekvence id. číslo : 9).

• ·

00 ···♦ 0 0 0 000 ·0 ► 0 0 * » 0 0 ·

000 000

0 0 0 0 0

Oligo 4 forward: gcg ccc ccg ccg gct tcg cca tcc tga agt gca acg aca aga agt tc (Sekvence id. číslo : 10).

Oligo 4: gcc gac aag aag ttc agc ggc aag ggc agc tgc aag aac gtg agc acc gtg cag tgc acc cac ggc atc cgg ccg gtg gtg agc acc cag ctc ctg ctg aac ggc agc ctg gcc gag gag gag gtg gtg atc cgc agc gag aac ttc acc cag ctc ctg ctg aac ggc agc ctg gcc gag gag gag gtg gtg atc cgc agc gag aac ttc acc gac aac gcc aag acc atc atc gtg cac ctg aat gag agc gtg cag atc (Sekvence id. číslo :11).

Oligo 4 reverzní (Mlul): agt tgg gac gcg tgc agt tga tet gca cgc tet c (Sekvence id.

číslo: 12).

Oligo 5 forward (Mlul):): gag agc gtg cag atc aac tgc acg cgt ccc (Sekvence id.

číslo : 13).

Oligo 5: aac tgc acg cgt ccc aac tac aac aag cgc aag cgc atc cac atc ggc ccc ggg cgc gcc ttc tac acc acc aag aac atc atc atc ggc acc atc ctc cag gcc cac tgc aac atc tet aga (Sekvence id. číslo: 14).

Oligo 5 reverzní: gtc gtt cca ctt ggc tet aga gat gtt gca (Sekvence id. číslo : 15).

Oligo 6 forward: gca aca tet cta gag cca agt gga acg ac (Sekvence id. číslo : 16).

Oligo 6: gcc aag tgg aac gac acc ctg cgc cag atc gtg agc aag ctg aag gag cag ttc aag aac aag acc atc atc gtg ttc ac cag agc agc ggc ggc gac ccc gag atc gtg atg cac agc ttc aac tgc ggc ggc (Sekvence id. číslo: 17)

Oligo reverzní (EcoRl): gca gta gaa gaa ttc gcc gcc gca gtt ga (Sekvence id.

číslo: 18).

Oligo7 forward (EcoRl): tea act gcg gcg gcg aat tet tet act gc (Sekvence id.

číslo: 19).

Oligo 7: ggc gaa ttc ttc tac tgc aac acc acc agc ccc ctg ttc aac agc acc tgg aac ggc aac aac acc tgg aac aac acc acc ggc agc aac aac aat att acc ctc cag tgc aag atc aag cag atc aac atg tgg cag gac gtg ggc aag gcc atg tac gcc ccc ccc atc gag ggc cag atc cgg tgc agc agc ( Sekvence id. číslo :20).

Oligo 7 reverzní: gca gac cgg tga tgt tgc tgc tgc acc gga tctmggc cct c (Sekvence id. číslo: 21).

Oligo 8 forward: ega ggg cca gat ccg gtg cag cag caa cat cac cgg tet g (Sekvence id. číslo: 22).

Oligo 8: aac atc acc ggt ctg ctg ctg acc cgc gac ggc ggc aag gag acc gac acc aac gac acc gaa atc ttc cgc ccc ggc ggc ggc gac atg cgc gac aac tgg aga tet gag ctg tac aag tac aag gtg gtg acg atc gag ccc ctg ggc gtg gcc ccc aag gcc aag cgc cgc gtg gtg cag cgc gag aag cgc (Sekvence id. číslo : 23).

Oligo 8 reverzní (Notl): cgc ggg cgg ccg ctt tag cgc ttc tcg cgc tgc acc ac (Sekvence id. číslo : 24).

Pro konstrukci ratTHY-lenv genu byly použity následující oligonukleotidy:

Oligo 1 forward (BamH17Hind3): cgc ggg gga tcc aag ctt acc atg att cca gta ata agt (Sekvence id. číslo : 25).

Oligo 1: atg aat cca gta ata agt ata aca tta tta tta agt gta tta caa atg agt aga gga caa aga gta ata agt tta aca gca tet tta gta aat caa aat ttg aga tta gat tgt aga cat gaa aat aat aca aat ttg cca ata caa cat gaa ttt tea tta acg (Sekvence id. číslo: 26).

Oligo 1 reverzní (EcoRl/Mlul): cgc gga tcc acg cgt gaa aaa aaa aaa cat (Sekvence id. číslo : 27).

Oligo 2 forward (BamHl/Mlul): cgc gga tcc acg cgt gaa aaa aaa aaa cat (Sekvence id. číslo : 28).

·· ····

• · · • · ·· • · • · • · ·

Oligo 2 : cgt gaa aaa aaa aaa cat gta tta agt gga aca tta gga gta cca gaa cat aca tat aga agt aga gta aat ttg ttt agt gat aga ttc ata aaa gta tta aca tta gca aat ttt aca aca aaa gat gaa gga gat tat atg tgt gag (Sekvence id. číslo : 29).

Oligo 2 reverzní (EcoRl/Sacl): cgc gaa ttc gag ctc aca cat ata atc tcc (Sekvence id číslo : 30).

Oligo 3 forward (BamHl/Sacl): cgc gga tcc gag ctc aga gta agt gga caa (Sekvence id. číslo : 31).

Oligo 3 : ctc aga gta agt gga caa aat cca aca agt agt aat aaa aca ata aat gta ata aga gat aaa tta gta aaa tgt ga gga ata agt tta tta gta caa aat aca agt tgg tta tta tta tta tta tta agt tta agt ttt tta caa gca aca gat ttt ata agt tta tga (sekvence id. číslo :32).

Oligo 3 reverzní (EcoRl/Notl): cgc gaa ttc gcg gcc gct tca taa act tat aaa atc (Sekvence id. číslo :33).

Polymerázová řetězová reakce

K amplifikaci dlouhých oligonukleotidů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) byly použity překrývající se krátké 15 až 25 oligonukleotidy přisedající na oba konce. Typické podmínky pro PCR byly následující: 35 cyklů, teplota přisedání (annealingu) byla 55° C, časový interval trval 0,2 sec. PCR produkty byly přečištěny na gelu, extrahovány fenolem a použity v další PCR reakci k vytvoření delších úseků sestávajících ze dvou malých fragmentů. Tyto delší fragmenty byly klonovány do plazmidu odvozeného CDM7 , který obsahuje vedoucí sekvenci povrchové molekuly CD5 následovanou polyfunkčním klonovacím místem (polylinkerem) s Nhel/Pstl/Mlul/EcoRl/BamHl možnými klonovacími místy.

V těchto reakcích byly použity následující roztoky:

x PCR pufr (500mM Kel, lOOmM Tris Hel, pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 2 mM každý dNTP).

Pro konečné použití byl pufr doplněn 10% DMSO, to proto, aby se zvýšila přesnost Taq polymerázy.

Příprava malých množství DNA

Transformované bakterie byly pěstovány v 3 ml LB kulturách po dobu delší než 6 hodin, nebo přes noc. Přibližně 1,5 ml každé kultury bylo přelito do 1,5 ml centrifugační zkumavky, centrifugováno po dobu 20 vteřin, aby se získal sediment buněk. Tento se resuspendoval v 200μ1 roztoku I. Následně se přidalo 400 μΐ roztoku II a 300 μΐ roztoku III.

Zkumavky byly zazátkovány, obsah v nich promíchán a znovu centrifugován po dobu kratší než je 30 vteřin. Supernatanty byly přeneseny do čistých zkumavek a extrahovány fenolem. DNA byla precipitována přidánín isopropanolu do zkumavek, promícháním a točena opět v microcentrifuze po dobu delší než 2 minuty. Pelet byl rozpuštěn v 70% etanolu a resuspendován v 50 μΐ dH20 obsahujícím 10μ1 RNA-ázy A. V postupech byly použity následující media a roztoky:

LB medium (1,0% NaCl, 0,5% kvasničný extrakt, 1,0 % trypton); roztok I (10 mM EDTA pH 8.0); roztok II (0,2M NaOH, 1,0% SDS); roztok III (2.5 M KOAc, 2,2 M ledová kyselina octová); fenol (pH upraveno na 6.0, přilití TE); TE (10 mM Tris Hel, pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8.0).

Příprava DNA ve velkých množstvích

Jeden litr kultury obsahující transformované bakterie se nechal růst po dobu 24 až 36 hodin, (pro buňky MC1061p3 transformované pCDM deriváty) nebo 12 až 16 hodin (pro MCI061 ·· »·*· • · ** · · · · 4 · ·

4 4 4

4 · • 4 ·44

4

transformované pUC deriváty) při 37° C buď v M9 bakteriálním mediu (pCDM deriváty) nebo LB mediu (pUC deriváty). Bakterie byly stočeny v 1 litrových lahvích v centrifuze Beckman J6 při 4200 rpm po dobu dvaceti minut. Pelet byl resuspendován ve 40 ml roztoku I. Následně bylo přidáno 80 ml roztoku II a 40 ml roztoku III. Lahve byly protřepávány se střední intenzitou dokud se neobjevily kousky o velikosti 2 až 3 mm v průměru. Obsah láhve byl znovu stočen při 4 200 rpm po dobu 20 minut. Supernatant byl přelit přes látkové síto do 250ml centrifugačních lahví. Na vrch každé láhve - kyvety byl navrstven isopropanol a obsah kyvet byl centrifugován po dobu 10 minut při 4 200 rpm. Pelet se po té rozsuspendoval ve 4,1 ml roztoku lak tomu se přidalo 4,5 g chloridu česného, 0,3 ml ethidium bromidu o koncentraci 10 mg/ml a 0,1 ml roztoku 1 % Tritonu X 100. Centrifugační kyvety byly centrifugovány ve vysokorychlostní centrifuze Beckman J2 při 10 000 rpm po dobu 10 minut. Supernatant byl přenesen do zatavitelných ultracentrifugačních kyvet Beckman Quick Seal a potom stočen v ultracentrifuze značky Beckman za použití úhlového rotoru NVT90 při 80 000 rpm po dobu kratší než 2.5 hodiny. Vzniklé proužky byly odděleny pod světlem ve viditelné oblasti spektra za použití 1 ml injekčních stříkaček (syringe) a kalibrované jehly číslo 20. K extrahovanému materiálu byl přidán stejný objem dH₂O. DNA se extrahovala použitím n-butanolu, který byl nasycen 1M chloridem sodným. Po té bylo přidán stejný objem 10 M acetátu amonného obsahujícího lmM EDTA. Takto získaný materiál byl přelit do uzavíratelných 13 ml centrifugačních kyvet a doplněn až po uzávěr absolutním etanolem.

Obsah byl promíchán a centrifugován v Beckman J2 centrifuze při 10 000 rpm po dobu deseti minut. Pelet byl promyt 70% etanolem a resuspendován v objemu 0,5 až 1 ml vody. Koncentrace DNA se určila z měření optické hustoty při 260 nm v ředění 1 : 200 ( 1 OD₂6o = 50 pg/ml).

V těchto uvedených postupech byly použity tyto roztoky a media:

M9 bakteriální medium ( 10 g M9 solí, 10 g kasaminových kyselin ( hydrolyzovaných), 10 ml M9dodatků, 7,5 pg/ml tetracyklin (500 μΐ množství ze zásobního roztoku o koncentraci 15mg/ml), 12,5 pg/ml ampicilinu (125 μΐ množství ze zásobního roztoku o koncentraci 10 mg/ml); M9 dodatky (10 mM CaCl₂ , 100 mM MgSCL, 200 μg/ml thiaminu, 70% glycerol); LB medium (1,0% NaCl, 0,5% kvasničný extrakt, 1,0% trypton); roztok I (10 mM EDTA pH 8.0); roztok II (0,2M NaOH, 1,0% SDS); roztok III (2.5 M KOAc, 2,5 M ledová kyselina octová)

Sekvenování

Syntetické geny byly sekvenovány Sangerovou dinukleotidovou metodou. Stručně popsáno, 20 až 50 pg dvouvláknové plazmidové DNA se denaturuje pomocí 0,5 M NaOH po dobu pěti minut. Následně se DNA precipituje 1/10 objemu acetátu sodného (pH 5,2) a dvěma objemy etanolu, potom následuje centrifugace po dobu pěti minut. Pelet se promyje 70% etanolem, resuspenduje se a naředí na koncentraci 1 pg/ml. Anealingová reakce ( přisedání) se provádí se 4 pg templátové DNA a 40 ng primeru rozpuštěného v 1 x annealingovém pufru na konečný objem 10 pg. Reakční směs se zahřeje na 65°C a pomalu ochladí na 37°C.

Ve zvláštní zkumavce připravená směs 1 pg 0.1 M DTT, 2 pl značící směsi, 0,75 pl dH₂O, 1 pl [³⁵S] dATP (lOpCi) a 0,25 pl Sequenase™ (12 U/ pl) se použije pro každou reakční směs. Pět mikrolitrů této směsi se přidá do každé zkumavky s přisedlým primerem a templátem a nechá se pět minut inkubovat při pokojové teplotě. Pro každou značenou reakci se odebere 2,5 pl každé ze čtyř konečných směsí a dá se na Terasakiho desku předehřátou na 37°C. Na konci inkubační doby se do inkubační směsi přidá 3,5 pl značící směsi do všech čtyř

9» * · » 9 4 » 4 44 4

44

4 1 terminačních směsí. Po pěti minutách se přidají 4 μΐ zastavovacího roztoku do každé reakce a Terasaciho destička se dá inkubovat při 80° C na deset minut do trouby. Sekvenační reakce se nanesou na elektroforézu a běh se provádí na 5% denaturačním polyakrylamidovém gelu. Roztok akrylamidu se připraví přidáním 200 ml ΙΟχ TBE pufru a 957 ml dH₂O ke 100 g směsi akrylamid : bisakrylamid (29 : 1 ). 5% polyakrylamid 46% močovina a lx TBE gel se připraví kombinací 38 ml akrylamidového roztoku a 28 g močoviny. Polymerizace se iniciuje přidáním 400 μΐ 0% persíranu amonného a 60μ1 TEMED. Gely byly nality pomocí posilikonovaných skleněných ploten a hřebenů a elektroforetický běh byl proveden v lx TBE pufru v rozsahu 60 až 100W po dvě až čtyři hodiny (v závislosti na oblasti, která měla být detekována). Gel se poté přenesl na blotovací papír Whatman, sušil se při 80° C po dobu jedné hodiny a byl přeexponován na roentgenografický film při pokojové teplotě. Obvyklý čas pro expozici byl 12 hodin.

Ve výše zmíněných postupech byly použity následující roztoky :

x annealingový pufr (200 mM Tris HC1, pH 7,5 , 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl); značící směs: (7,5 μΐ každého nukleotidu dCTP, dGTP a dTTP);

terminační směs: ( 80μ1 každého dinukleotidu dNTP, 50 mM NaCl, 8 μΜ ddNTP (jednoho každého);

zastavovací roztok: (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05% bromfenolová modř, 0,05% xylencyanol);

x TBE . ( 0,9 M Tris borát, 20 mM EDTA);

polyakrylamidový roztok: (96,7 g polyakrylamidu, 3,3 g bisakrylamidu, 200 ml lx TBE, 957 ml dH₂O).

Izolace RNA

Cytoplazmatická RNA byla izolována z buněk 293 T transfekovaných pomocí fosforečnanu vápenatého, a to z kultury 36 hodin po transfekci. Dále také z Hela buněk infikovaných virem neštovic, a to 16 hodin po transfekci, metodou popsanou Gilmanem (Gilman Preparation of cytoplasmic RNA firo tissue culture cells. V Current protocols in Molecular Biology. Ausubel a další., editoři, Wiley a synové, Newyork, 1992).

Popsáno ve zkratce, buňky byly lyžovány ve 400 μΐ lyzovacího pufru, jádra byla oddělena centrifugací, po té byla přidáno SDS v koncentraci 0,2% a proteináza K v koncentraci 0,2 mg/ml. Cytoplazmatické extrakty se inkubovaly při 37°C po dobu 20 minut, byly dvakrát extrahovány směsí fenol/ chloroform a precipitovány. RNA se rozpustila ve 100 μΐ pufru I a nechala se inkubovat při 37° C po dobu 20 minut. Reakce se ukončila přidáním 25 μΐ zastavovacího pufru a RNA se znovu vysrážela.

Ve výše zmíněných postupech byly použity následující roztoky :

Lyzovací pufr: (TRUSTEE obsahující 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0,5% NP40);

Pufr I: ( TRUSTEE pufr s 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,5 U/μΙ inhibitoru RNA-ázy z placenty, 0,1 U/μΙ RNA-ázy neobsahující DNA-ázu I);

Zastavovací pufr: ( 50 mMEDTA, 1,5 MNaOAc, 1 % SDS).

Slot-blot analýza

Pro provedení slot - blot analýzy se 10 μg cytoplazmatické RNA rozpustilo v 50 μΐ dH₂O , do které bylo přidáno 150 μΐ 10 x SSC/18% formaldehyd. Rozpuštěná RNA byla potom inkubována při 65° C po dobu 15 minuta přenesena do přístroje pro provádění slot-blotů. Pro ···· • · • · ·· 9 • · ♦ Β • Β Β

Β ♦ • Β

BBB Β

ΒΒΒ

Β

Β·· ··

Β Β Β ·

Β ··· Β

9

9

9 hybridizací byly použity radioaktivně značené sondy o velikosti 1,5 kb fragmentů gp 120111b a syngpl20mn . Každý z těchto dvou fragmentů byl náhodně označen v 50 μΐ reakční směsi obsahující 10 μΐ 5 x oligo-značícího pufřu, 8 μΐ BSA v koncentraci 2,5 mg/ ml, 4 μΐ [“ ³²P]dCTP ( 20uCi/ μΐ) a 5U Klenowova fragmentu. Po inkubaci trvající obvykle 1 až 3 hodiny při 37° C se přidalo 100 μΐ TRUSTEE a odstranil se nezabudovaný [“ ³²P]-dCTP pomocí centrifugační náplně sloupce G50. Aktivita se měřila pomocí Beckman beta-counteru. Pro hybridizací se užily aktivity, které dosahovaly stejné hodnoty . Membrány se prehybridizovaly 2 hodiny a vlastní hybridizace trvala od 12 do 24 hodin při teplotě 42° C v koncentraci 0,5xl0⁶ cpm sondy na mililitr hybridizační kapaliny. Po této době se membrána vymývala dvakrát po dobu pěti minut promývacím pufrem I za pokojové teploty, dále pak jednu hodinu promývacím pufrem II při 65°C. Potom následovala expozice s filmem používaným k detekci x- paprsků. Podobné výsledky se získaly použitím 1,1 kb Not/Sfil fragmentů z pCDM7, které obsahovaly 3' nepřekládanou oblast. Kontrola hybridizace byla prováděna pararelně s náhodně značenou sondou lidského beta-aktinu. Exprese RNA byla kvantifikována snímáním hybridizovaných nitrocelulozových membrán pomocí přístroje Magnetic Dynamics phosphoimageru.

Ve výše zmíněných postupech byly použity následující roztoky:

x oligo-značící pufr (250 mM TrisHCl, pH 8,0, 25 mM MgCl₂, 5 mM beta-merkaptoetanol, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, mM dTTP, 1 M Hepes pH 6,6, 1 mg/ml hexanukleotidy [dNTP]6); Hybridizační roztok : ( 0,05 M fosfát sodný, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% dextransulfát, 50% formamid, 100 μg/ml denaturované DNA z lososích spermií);

Promývací roztok I: (2x SSC, 0,1% SDS);

Promývací roztok II: ( 0,5 x SSC, 0,1% SDS);

x SSC : ( 3 MNaCl, 0,3 N citrát trojsodný, pH upraveno na 7,0).

Rekombinace viru neštovic

Rekombinace viru neštovic se prováděla metodou užívající modifikace postupu popsaného Romeem a Seedem ( Romeo a Seed, Cell, 64: strana 1037, 1991).

Stručně popsáno, buňky CV1 v konfluenci, která se pohybovala od 70 do 90 % byly infikovány 1 až 3 μΐ nativního typu viru neštovic WR (2 x 10⁸ pfu/ml) po jednu hodinu v kultivačním mediu bez telecího séra. Po 24 hodinách byly buňky transfekovány pomocí fosforečnanu vápenatého DNA z plazmidu TKG v koncentraci 25 pg na misku. Po další inkubaci trvající 48 hodin byly buňky staženy z misek, stočeny a znovu resuspendovány v objemu 1 ml. Po trojím proběhnutí cyklu zmrazení/ roztaní byl přidán trypsin do koncentrace 0,05 mg/ml a lyzát se inkuboval po dobu dvaceti minut. K infikování malých misek ( průměr 6 cm) se použila ředící řada a použitá ředění byla 10, 1 a 0,1 μΐ tohoto lyzátu na jednu misku. Misky byly předem ošetřeny preinkubací s 12,5 pg/ml kyseliny mykofenolové, 0,25 mg/ml xantinu a 1,36 mg/ml hypoxantinu po dobu 6 hodin. Infikované buňky byly pěstovány 2 až 3 dny a následně označeny monoklonální protilátkou NEA9301 připravenou proti gp 120 s následnou reakcí druhé protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou. Buňky se inkubovaly s 0,33 mg/ml NBT a 0,16 mg/ml BCIP v AP pufru a nakonec byla tato buněčná kultura navrstvena na plotnu z 1% agarosy v PBS. Pozitivní kolonie byly vyjmuty a resuspendovány ve 100μ1 Tris pH 9,0.

Purifikace plaků byla ještě jednou zopakována. K přípravě zásobního materiálu o vyšším titru se infekce pomalu zvyšovala. Nakonec byla jedna velká plotna Hela buněk infikována polovinou viru získaného v předchozím pokuse. Infikované buňky byly po oddělení resuspendovány ve 3 ml PBS, lyžovány pomocí homogenizátoru značky Dounce a přečištěny

4444 ·· 4

4444 • · • 44«

444

4 4

4 4

444 4

4 4 centrifugací, kdy byly odstraněny větší buněčné zbytky. Rekombinantní vakcína VPE-8 byla poskytnuta s laskavým svolením AIDS respirátory, Rockville, MD a HIV-1 TTTB gpl20 byl exprimován pod smíšeným promotorem 7,5 early/late (Earl a další, J.Virol.. 65: strana 31,1991). Ve všech pokusech s rekombinantní protilátkou byly buňky infikovány na několikanásobnou hodnotu infektivity,dosahující nejméně deseti násobku.

Ve výše zmíněném pokuse byl použit tento roztok:

AP pufr: (lOOmM Tris Hel, pH 9,5, lOOmMNaCl, 5 mM MgCl₂ )

Buněčná kultura

Buněčné linie CV1 a Cos7 ledvinového karcinomu opic, buněčná linie 293 T lidského ledvinového karcinomu a buněčná linie Hela z lidského karcinomu děložního čípku byly získány z American Tissue Typing Collection a byly namnoženy v doplněném IMDM. Buňky byly pěstovány na miskách pro tkáňové kultury o průměru 10 cm a obvykle děleny 1:5 až 1: 20 každé 3 až 4 dny. V tomto postupu bylo použito následující medium:

Doplněné IMDM : ( 90% Iscoves modifikované Dulbecco medium, 10% telecí sérum, obohaceno železem, inaktivováno zahřátím na teplotu 56°C po dobu 30 minut, 0,3 mg/ml Lglutamin, 25μg/ml gentamycin, 0,5 mM beta-merkaptoetanol (pH upraveno 5 MNaOH,

0,5 ml)).

Transfekce

Transfekce buněk 293T pomocí fosforečnanu vápenatého byla provedena pomalým přidáváním a současným mícháním 10gg plazmidové DNA v 250μ1 0,25 M CaCl₂ ke stejnému objemu 2 x HEBS pufru za stálého míchání vortexem. Po inkubaci trvající 10 až 30 minut při pokojové teplotě byl DNA precipitát přidán na malou misku s 50 až 70% konfluentními buňkami. V pokusech se současnou transfekcí s rev byly buňky transfekovány s 10μg gpl20IIIb, gpl20IIIbrre, syngpl20mnrre nebo rTHY-lenveglrre a 10 μg pCMVrev nebo CDM7 plazmidovou DNA.

V předchozím postupu byly použity tyto roztoky:

2x HEBS pufr: ( 280 mM NaCl, lOmM Kel, 1,5 mM sterilně filtrovaný);

0,25 mM CaCl₂ (autoklávovaný).

Imunoprecipitace

Po 48 nebo 60 hodinách se vyměnilo medium a buňky byly inkubovány po dalších 12 hodin v mediu neobsahujícím Cys/Met, ale obsahujícím 200μΟ ³⁵S jako značku. Supernatanty se slily a stočily 15 minut při 3000 rpm. Tak byly odstraněny buněčné zbytky. Po přidání proteázových inhibitorů - leupeptinu, aprotininu a PMSF v koncentracích 2^g/ ml, 50 μg/ml a 100 μg/ml se 1 ml supernatantu inkuboval buď samostatně s 10 μΐ předem připravené protein A sepharosy (rTHY-lenveglrre) nebo s protein A sepharosou a 3 μg purifikovaného CD4/ imunoglobulin fuzního proteinu (laskavě poskytnuto fy Boehring) (všechny gpl20 konstrukty) při 4° C po dobu 12 hodin na rotátoru. Následně se částice s proteinem A promyjí 5 krát po 5 až 15 minutách pro každé promytí. Po posledním promytí bylo přidáno 10μ1 nanášecíbo pufru a vzorky se povařily 3 minuty a nanesly na 7% (všechny kostrukty gpl20) nebo 10% (rTHY-lenveglrre) SDS polyakrylamidové gely (TRIS pH 8,8 pufr byl použit v dělícím gelu a TRIS pH 6,8 pufr v zaostřovacím gelu, TRIS - glycin komorový pufr, Maniatis a další, supra 1989). Gely byly zafixovány v 10% kyselině octové a 10% metanolu, inkubovány s Amplify po dobu 20 min, usušeny a podrobeny po dobu 121 hodin expozici.

···· •

9

9·

9 •9 9999 • · • 999

999

99

9 9

9 9

999 999

9

99

V uvedené postupu byly použity následující roztoky:

Promývací pufr : (lOOmM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 % NP-40);

x komorový pufr : ( 125 mM Tris, 1,25 M glycin, 0,5% SDS);

Nanášecí pufr :(10 % glycerol, 4 % SDS, 4% beta-merkaptoetanol, 0,02 % bromfenolová modř).

Imunofluorescence

293 T buňky byly transfekovány pomocí fosforčnanu vápenatého koprecipitací a po třech dnech analyzovány na povrchovou expresi THY-1. Po převedení buněk do lmM EDTA/PBS pufru se buňky označily monoklonální protilátkou OX-7 v ředění 1 : 250 při 4° C podobu 20 minut, po té promyly PBS a následně se inkubovaly s FITC konjugátem kozího anti myšího imunoglobulinového séra v ředění 1 : 500.Buňky byly znovu promyty, resuspendovány v 0,5 ml fixačního roztoku a analyzovány na EPICS XL cytofluorimetru (Coulter).

V výše popsaném postupu byly použity následující roztoky:

PBS : (137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄ pH upraveno na 7.4);

Fixační roztok : (2 % formaldehyd v PBS).

ELISA

Koncentrace gpl20 v supematantech kultur se určovala pomocí destiček na ELISA testy, které byly potaženy CD4 a pomocí kozího anti -gpl20 antiséra jako rozpustné fáze. Supernatanty buněk 293 T transfekovaných pomocí fosforečnanu vápenatého se sklízely po čtyřech dnech , centrifugovaly se při 3 000 rpm po dobu 10 minut, aby se odstranily zbytky buněk. Potom se supernatanty nanesly na destičku, kde se inkubovaly po dobu 12 hodin při 4°C . Následovalo 6 x promytí pomocí PBS a nanesení 100 μΐ kozího antiséra proti gpl20 v ředění 1: 200. Inkubace trvala 2 hodiny. Po opětném promytí a inkubaci s peroxidázovým konjugátem králičího anti-kozího IgG antiséra ředěného 1: 1000 trvající dvě hodiny, byly desky opět promyty a inkubovány 30 minut se 100μ1 substrátového roztoku obsahujícího 2mg/ml ofenylendiaminu v citrátovém pufru. Reakce byla ukončena přidáním 100μ1 4M kyseliny sírové. Hodnoty absorbance na deskách při 490 um byly odečteny pomocí Coulter microplate readeru. Jako kontrola byl použit purifikát rekombinantního gp 120111b.

V předešlém postupu byly použity následující roztoky:

Promývací roztok: (0,1% NP40 v PBS);

Substrátový roztok: (2mg/ml o-fenylendiamin v Na-citrátovém pufru).

PŘÍKLAD 2

Syntetický gen pro zeleně fluoreskující protein

Účinné nahrazení kodónů pro gpl20 předpokládá, že dojde k nahrazení kodónů nepreferovaných za kodóny méně preferované či preferované a dále také, že dojde k nahrazení

4444

4444 • · 4

4

4 • 4

4 4

4 4

444 • 4 4 4 méně preferovaných kodónů za kodóny preferované. Tím se zvýší exprese dalších proteinů, to znamená dalších eukaryotických proteinů, v savčích buňkách.

Zeleně fluoreskující protein (GFP) získaný z medúzy Aequorea victoria ( Ward, Photochem.Photobiol, 4: strana 1, 1979; Prasher a další, Gene 111: strana 229, 1992; Cody a další, Biochem, 32: strana 1212,1993) připoutal na sebe již dříve pozornost hlavně tím , že ho lze použít jako markér nebo reportér pro transfekci a studium rodokmenů (Chalfie a další, Science 263; strana 802, 1994).

Prozkoumáním tabulky zkonstruované z nativních sekvencí kódujících GFP vzhledem k zastoupení kodónů se zjistilo, že GFP kodóny upřednostňují buď A nebo U na své třetí pozici. V případě GFP kodónů je upřednostnění užití A na třetí pozici sice méně zjevné než je tomu u gpl20, aleje přesto podstatné. Syntetický gen byl vytvořen tak, že jeho přirozená sekvence byla sestrojena metodami genového inženýrství, které jsou shodné jako pro gpl20 (Obrázek 11; Sekvence id. číslo : 40). Mimo to, byla sekvence pro iniciaci translace GFP nahrazena sekvencemi odpovídající konvenční sekvenci (Obrázek 10B a Obrázek 10C)

Kromě toho bylo vyzkoušen vliv mutace pro záměnu Ser65 za Thr, o které se vědělo, že zlepšuje účinnost excitace GFP při 490 nm , a proto sejí přednostně využívá pro fluorescenční mikroskopii (Heim a další, Nátuře 373: strana 663, 1995). (Obrázek 10D). Cílená záměna kodónů je spojována s významným zvýšením účinnosti exprese (která se většinou vyjadřuje jako procento buněk zjevně pozitivních v transfekci) a kombinací mutace Ser65 za Thr a následnou optimalizací kodónů, jehož výsledkem je segment DNA kódující savčí markerový protein s vysokou rozlišitelností. (Obrázek 10D).

V předchozím textu popsaná sekvence kódující syntetický zeleně fluoreskující protein byla sestavena podobným způsobem jako gpl20 sestavený ze šesti fragmentů o přibližné délce rovnající se 120 bp každý. Postup užitý pro jejich sestavení byl založen na schopnosti restrikčních enzymů Bsal a Bbsl vyštěpit jimi rozpoznávanou sekvenci. Byly nasyntetizovány dlouhé oligonukleotidy, které obsahovaly části kódujících sekvencí pro GFP vloženou mezi hraniční sekvence kódující EcoRI a Bsal na jednom konci a BamHI a Bbsl na konci druhém . Tak každý oligonukleotid má konfiguraci EcoRI/Bsal/GFPfragment/BbsI/BamHI. Restrikční konce vzniklé působením Bsal a Bbsl byly navrženy tak, aby vytvořily kompatibilní konce , které by se mohly spojit s přilehlými (sousedními) fragmenty GFP : Každý z těchto kompatibilních konců byl navržen tak, aby byl specifický a aby nebyl komplementární sám se sebou. Požadované segmenty syntetické DNA se amplifikovaly pomocí PCR, byly vloženy do plazmidu pUC9 mezi restrikční místa EcoRI a BamHI a sekvenovány. Následně byla kompletní kódující sekvence složena v ligaci ze šesti fragmentů, a to pomocí vložených fragmentů připravených štěpením restrikčními enzymy Bsal a Bbsl. Dva ze šesti plazmidů, které byly výsledkem ligace, obsahovaly inzert požadované velikosti, jeden obsahoval požadovanou sekvenci odpovídající celkové délce sekvence . Mutační záměna Ser65 za Thr byla udělána standardní metodou pro provedení mutageneze založenou na PCR . Použité primery překrývaly svým složením unikátní štěpné místo BssSI v syntetickém GFP.

Optimalizace kodónů jako strategie pro vylepšení exprese v savčích buňkách

Zde prezentované výsledky ukazují, že pomocí postupů genového inženýrství uměle vytvořené kódující sekvence by mohly být obecně využity k vylepšení exprese savčích a také jiných než savčích eukaryotických genů v savčích buňkách. Zde získané výsledky se třemi nepříbuznými proteiny : HIV gpl20, krysím buněčným povrchovým antigenem Thy-1 a zeleně fluoreskujícím proteinem z Aequorea victoria a lidským Faktorem VIII (viz další text) ukazují, že optimalizace kodónů se může stát velmi úspěšnou strategií ve vylepšení exprese široké škály různých eukaryotních genů v savčích buňkách.

0000 • 0 •

·

0 •0 0000 * · • 000

0 0 0

00«

0 0 0 0 0 0 ·

000 000 0 0 ··

PŘÍKLAD 3

Návrh optimalizace kodónů pro genovou expresi lidského Faktoru VIII, který neobsahuje centrální B doménu

Byl navržen syntetický gen kódující maturovaný lidský Faktor VIII, kde chyběly aminokyselinové zbytky 760 až 1639, včetně zbytků prekurzoru (799 až 1658 včetně). Syntetický gen byl vytvořen výběrem odpovídajících kodónů z těch kodónů, které se vyskytují ve vysoce exprimovaných lidských genech. Byly učiněny některé odchylky od přísného dodržování předlohy pro preferované kodóny, a to proto, aby byla zachována unikátní štěpná místa pro restrikční enzymy, která jsou do genu zavedena, aby se usnadnily budoucí manipulace s genem. Pro přípravu syntetického genu byla sekvence rozdělena do 28 segmentů po 150 párech baží a 29. segment o počtu 161 páru baží.

Syntetický gen pro expresi lidského Faktoru VIII, ve kterém chybí centrální doména B, byl připraven následujícím postupem: Bylo nasyntetizováno dvacet devět párů templátového oligonukleotidu ( viz dále). 5'templátový oligonukleotid byl 105 baží dlouhý a 3'oligonukleotid byl 104 baží dlouhý (výjimkou je poslední 3'oligonukleotid, který byl 125 zbytků dlouhý). Templátový oligonukleotid byl navržen tak, že každý přisedající pár je složen z jednoho oligonukleotidu z 5'a jednoho oligonukleotidu z 3', tak se vytvoří 19 párů dlouhé dvouvláknové oblasti.

K usnadnění PCR a následujících manipulací, 5' konce oligonukleotidových párů byly navrženy tak, aby byly neměnné v oblasti prvních 18 zbytků, což usnadní běžné párování PCR primerů, které jsou užity pro amplifikaci a dále umožní použití stejných podmínek pro PCR pro všechny užité páry. Prvních 18 zbytků z 5' konce templátových párů měly následující sekvenci: cgc gaa ttc gga aga ccc (Sekvence id. číslo : 110) a prvních 18 zbytků každého 3'templátového konce má sekvenci: ggg gat cct cac gtc tea ( Sekvence id. číslo : 43).

V PCR reakční směsi se páry oligonukleotidů nechaly přisednout (annealing), po té došlo k prodloužení (extenci) a následně k amplifikaci. Podmínky pro PCR reakci byly následující: annealing - templáty byly použity v koncentraci 200 μΐ/ml, každý v PCR pufru (10 mM TrisHC1, 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KC1, 100 μΐ/ml želatiny, pH 8,3). PCR reakce obsahovaly 2ng přisedajícího templátového oligonukleotidu, 0,5 μg každého ze dvou 18-nácti měrových primerů (popsáno dále v textu), 200 μΜ každého deoxynukleosid trifosfátu , 10% objemových DMSO a PCR pufr, který byl dodán firmou Boehringer Manheim Biochemicals, v konečném objemu 50μ1. Po přidání Taq polymerázy (2,5 jednotek, 0,5 μΐ; Boehringer Manheim Biochemicals). Amplifikace byla prováděna v termálním cykléru firmy Perkin Elmer, trval 25 cyklů ( 94° C po dobu 30 sec, 55° C po dobu 30 sec a 72° C po dobu 30 sec). Poslední cyklus byl následován 10 minut trvající extenzí při 72° C.

Amplifikované fragmenty byly štěpeny pomocí EcoRl a BamHI ( štěpení na koncích 5'a 3' fragmentů) a ligovány do plazmidu odvozeného od pUC9 , který byl naštěpen EcoRl a BamHI.

Jednotlivé klony byly sekvenovány a byla vybrána sada plazmidů obsahujících požadovanou sekvenci. Klony byly potom podrobeny multifragmentární ligaci, která využila výhod restrikčních míst na 3 koncích a na PCR primerech, které přiléhaly k amplifikované sekvenci. 5' PCR primer obsahoval Bbsl místo a 3'PCR primer obsahoval BsmBI místo, obě místa jsou umístěna tak, že štěpení těmito restrikčními enzymy odstraní první nukleotidy amplifikovaného zbytku a zbylé vytvořené 4 báze na 5' konci přesahují první čtyři baze druhé • · ·· ···· * · • ··· • · • ·

9* • 9 ··

9 9 9

9 9 9 • 999 999

9

99 amplifikované části. Současné štěpení pomocí Bbsl a BsmBI tak umožní uvolnění amplifíkované části s unikátními 4 bázemi přesahujícími 5' konec na každém vlákně, kde není lokalizována žádná ze sekvencí primerů.

Obecně shrnuto, tyto přesahy nejsou komplementární samy se sebou, umožňují multifragmentární ligační reakce, a tím se připraví požadovaný produkt s vysokou účinností. Specifická část prvních 28 amplifikovaných oligonukleotidových párů dala vzniknout 154 párům baží a po štěpení dal každý vzniknout fragmentu dlouhému 150 bp s unikátními konci. Ale první a poslední fragment nevznikly tímto způsobem, jelikož obsahují jiná restrikční místa, která byla navržena v jejich sekvencích tak, aby usnadňovala vložení sestavených sekvencí do vhodného savčího expresního vektoru. Vlastní sestavovací postup probíhal následovně:

Sestavení genu pro syntetický gen pro FaktoVIII

Krok 1: Spojení 29 fragmentů vedoucí k vytvoření 10 fragmentů párů oligonukleotidů, které tvoří, jestliže se párují, segmenty 1 až 29 je popsáno dále: Plazmidy nesoucí segmenty 1,5,9, 12,16, 20, 24 a 27 byly naštěpeny EcoRI a BsmBI a fragmenty o odpovídající délce 170 bp byly vyizolovány. Plazmidy nesoucí segmenty číslo 2, 3, 6, 7, 10, 13, 17, 18, 21, 25 a 28 byly štěpeny Bbsl a BsmBI a fragmenty o odpovídající délce 170 bp byly vyizolovány. Plazmidy nesoucí segmenty 4, 8, 11, 14, 19, 22, 26 a 29 byly štěpeny pomocí restrikčních enzymů EcoRI a Bbsl a vyizoloval se fragment vektoru o velikosti 2440 bp. Fragmenty nesoucí segmenty 1, 2, 3 a 4 byly potom ligovány a vytvořily fragment označený „A“ ; fragmenty nesoucí segmenty 5, 6, 7 a 8 vytvořily ligací segment označený „B“; fragmenty nesoucí segmenty 9, 10 a 11 vytvořily ligací segment označený „C“; fragmenty nesoucí segmenty 12, 13 a 14 vytvořily ligací segment označený „D“; fragmenty nesoucí segmenty 16,17, 18 a 19 vytvořily ligací segment označený „F“; fragmenty nesoucí segmenty 20, 21 a 22 vytvořily ligací segment označený „G fragmenty nesoucí segmenty 24, 25 a 26 vytvořily ligací segment označený „I a fragmenty nesoucí segmenty 27,28 a 29 vytvořily ligací segment označený „J “.

Krok 2: Spojení 10 vzniklých fragmentů z kroku 1 do tri nových fragmentů

Plazmidy, které nesou segmenty „A „ , „ D“ a „ G“ se štěpily pomocí restrikčních enzymů EcoRI a BsmBI, plazmidy , které nesly segmenty „B“, 15, 23 a „I“.se štěpily Bbsl a BsmBI, plazmidy obsahující segmenty „C“, „F“ a „J“ se štěpily EcoRI a Bbsl. Fragmenty nesoucí segmenty „A“, „B“ a „C“ vytvořily ligací segment „K“; fragmenty nesoucí „D“, 15 a „F“ vytvořily ligací segment „O“; a fragmenty nesoucí segmenty „G“, 23, „I“ a „J“ vytvořily pomocí ligace segment „P“.

Krok 3: Sestavení tri konečných kusů

Plazmid nesoucí segment „K“ byl štěpen restrikčním enzymem EcoRI a BsmBI, plazmid obsahujícíc segment „O“ byl štěpen pomocí Bbsl a BsmBI a plazmid obsahující segment „P“ se štěpil EcoRI a Bbsl. Tři vzniklé fragmenty se podrobily ligaci a vytvořily segmenty.

Krok 4: Inzerce syntetického genu do savčího expresního vektoru

Plazmid nesoucí segment „S“ byl štěpen restrikčními enzymy Nhel a Notl a vložen mezi štěpná místa pro Nhel a Eagl v plazmidu CD51Negl. Tak vznikl plazmid cd51sf8b-.

4·

44 ····

4 * ♦ ·

44 444 • 4 4 4 « · · ·

444 44 444 ··

4 4 · « · · · •44 444 ·

4·

Sekvenování a úprava syntetického genu pro Faktor VIII

Po sestavení umělého ( syntetického) genu se ukázalo, že v genové sekvenci jsou obsaženy dva kódující nežádoucí zbytky. Jedním byl zbytek Arg v pozici 749, který je přítomný v sekvenci udávané z Genové banky (Gen Bank), která je založená na údajích majících původ v údajích získaných z Genetechu, ale není uveden v sekvenci uveřejněné Genetechem v literatuře. Dalším je zbytek Ala v pozici 146, kde by měl být správně Pro. Tato mutace se vyskytla v jednom z kroků (nelze přesně určit ve kterém) následujících po sekvenování 29 stavebních fragmentů. Mutace Pro749Arg byla opravena vložením požadované změny do PCR primeru (ctg ctt ctg acg cgt gct ggg gtg gcg gga gtt; Sekvence id. číslo : 44). Tato sekvence obsahuje restrikční místo pro Mlul v pozici 2335 v sekvenci uvedené dále v textu ( sekvence od místa pro HindlII k místu pro Notl) a amplifikací úseku mezi výše uvedeným primerem a 5' primerem (ctg ctg aaa gtc tec agc tgc; Sekvence id. číslo : 45) který odpovídá úseku s místem SgrAI místu v pozici 2225. Fragment vymezený restrikčními místy SgrAI a Mlul byl potom vložen do expresního vektoru a správnost výsledné sekvence byla ověřena sekvenováním. Mutace Pro 146Ala byla opravena zavedením požadované změny do sekvence ligonukleotidu (ggc agg tgc tta agg aga acg gcc cta tgg cca; Sekvence id. číslo : 46), který obsahuje štěpné místo pro AflII ve zbytku 504. Po té následovala amplifikace fragmentu vzniklého v PCR reakci mezi oligonukleotidem a primerem, který má sekvenci cgt tgt tet tea tac gcg tet ggg gct cct cgg ggc (Sekvence id. číslo : 109), vyštěpením vzniklého PCR fragmentu pomocí AflII a AvrlI ve zbytku 989 a dále jeho vložením do expresního vektoru byla provedena daná záměna. Provedená změna byla potvrzena sekvenováním.

Konstrukce vhodného nativního genu exprimujícího lidský Faktor VIII, který neobsahuje centrální doménu B

Byl sestrojen vhodný expresní plazmid obsahující sekvenci nativních kodónů pro Faktor VIII s delecí domény B, a to pomocí zavedení restrikčního místa pro Nhel na 5'konec původní kódující sekvence. Toto místo bylo zavedeno pomocí primeru ege caa ggg cta gcc gcc acc aga aga tac tac ctg ggt (Sekvence id. číslo : 47). Amplifikací probíhající mezi tímto primerem a primerem att cgt agt tgg ggt tec tet gga cag ( odpovídající zbytkům 1067 až 1093 v sekvenci uvedené níže), dále štěpením užitím Nhel a AflII (zbytek 345 v sekvenci udvedené níže) a vložením vzniklého fragmentu do vhodně naštěpeného plazmidu nesoucího nativní Faktor VIII. se vytvořil požadovaný konstrukt. Delece pro doménu B se vytvořila pomocí překrývajících se PCR sekvencí, a to pro 5'překryv ctg tat ttg atg aga acc g (odpovídající zbytkům 1813 až 1831 v sekvenci uvedené dále) a caa gac tgg tgg ggt ggc att aaa ttg ctt t (Sekvence id. číslo : 48) ( odpovídající zbytkům 2342 až 2372 v dodatku uvedeném níže) a aat gcc acc cca cca gtc ttg aaa ege ca (Sekvence id. číslo : 49) (odpovídá zbytkům 2352 až 2380 v sekvenci uvedené dále) a cat ctg gat att gca ggg ag (Sekvence id. číslo : 50) (odpovídá pozicím 3145 až 3164). Produkty vzniklé v těchto dvou jednotlivých PCR reakcích byly smíchány a reamplifikovány za použití nej vzdálenějších primerů. Výsledné fragmenty byly rozštěpeny v místě Asp718 (Kpnl isoschizomer, 1837 v sekvence uvedené níže) a pomocí PflMI ( 3100 v sekvenci uvedené níže). Vzniklé fragmenty byly vloženy do vhodně naštěpených expresních plazmidů nesoucích nativní Faktor VIII.

Kompletní sekvence odpovídající nativnímu genu pro lidský Faktor VIII, ve kterém chybí centrální oblast B je označena jako (Sekvence id. číslo : 41) a je znázorněna na Obrázku 12. Kompletní sekvence syntetického genu (Sekvence id. číslo : 42) pro Faktor VIII s vynechanou centrální oblastí je znázorněn na Obrázku 13.

«·4«

999· 9 • 99 • 9 • 9 • 9 9

1« ·· 9

Příprava a vyzkoušení expresních plazmidů

Dva nezávisle pořízené izoláty nativních plazmidů a čtyři nezávisle pořízené izoláty expresních plazmidů pro synteticky Faktor VIII byly odděleně namnoženy v bakteriích a jejich DNA se připravila centrifugací v hustotním gradientu v CsCl a následnou extrakcí fenolem. Analýza supernatantů COS buněk transfekovaných plazmidy ukázala, že užití syntetického genu zvyšuje přibližně čtyřikrát expresi Faktoru VIII, ve srovnání s užitím nativního genu.

COS buňky byly transfekovány použitím 5pg každého konstruktu pro Faktor VIII na misku o průměru 6 cm použitím DEAE- dextranové metody. 72 hodin po transfekci se na každou misku přidaly 4 ml čerstvého media obsahujícího 10% telecí sérum. Vzorky medií se odebíraly 12 hodin po té. Vzorky se testovaly pomocí ELISA metody použitím lehkých řetězců myší monoklonální protilátky připravené proti lidskému Faktoru VIII a jako druhá protilátka se užíval peroxidázový konjugát polyklonální kozí protilátky proti lidskému Faktoru VIII. Jako kontrola se užíval purifikovaný lidský plazmatický Faktor VIII. Buňky podrobené transfekci se syntetickým genovým konstruktem pro Faktor VIII exprimovaly 138 + 20,2 ng/ml Faktoru VII (n=4) (ekvivalent ng/ml nedeletovaného Faktoru VIII), zatímco buňky transfekované nativním genem pro Faktor VIII exprimovaly 33,5 + 0.7 mg/ml Faktoru VIII (ekvivalent ng/ml nedeletovaného Faktoru VIII) (n=2).

Následující oligonukleotidové templáty byly použity pro konstrukci syntetického genu pro Faktor VIII:

rl bbs 1 pro (gcta) cgc gaa ttc gga aga ccc gct agc cgc cac Irl ccg ccg cta cta cct ggg cgc cgt gga gct gtc ctg gga cta cat gca gag ega cct ggg ega gct ccc cgt gga (Sekvence id. číslo :51) ggg gat cct cac gtc tea ggt ttt ctt gta 1 bam cac cac gct ggt gtt gaa ggg gaa gct ctt ggg cac gcg ggg ggg gaa gcg ggc gtc cac ggg g^ag ctc g^{cc ca} (Sekvence id. číslo : 52) fl bbs 2 pro (aacc) cgc gaa ttc gga aga ccc aac cct gtt cgt 2rl gga gtt cac ega cca cct gtt caa cat tgc caa gcc gcg ccc ccc ctg gat ggg cct gct ggg ccc cac cat cca (Sekvence id. číslo : 53) ···· · ·· «··· ·· ·· ··· · · · ····

4 4 4 ··· 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 444 444

444 44 4 4 4

444 »4 444 44 44 ggg gat cct cac gtc tca gtg cag gct gac 2 bam ggg gtg gct ggc cat gtt ctt cag ggt gat cac cac ggt gtc gta cac ctc ggc ctg gat ggt ggg gcc cag ca ( Sekvence id. číslo : 54 ) rl bbs 3 for (gcac) cgc gaa ttc gga aga ccc gca cgc cgt ggg 3 rl cgt gag cta ctg gaa ggc cag ega ggg cgc ega gta ega ega cca gac gtc cca gcg ega gaa gga gga ega caa ( Sekvence id. číslo : 55 ) ggg gat cct cac gtc tca gct ggc cat agg 3 bam gcc gtt ctc ctt aag cac ctg cca cac gta ggt gtg gct ccc ccc cgg gaa cac ctt gtc gtc ctc ctt ctc gc ( Sekvence id. číslo : 56 ) rl bbs 4 for (cagc) ’ cgc gaa ttc gga aga ccc cag ega ccc cct 4rl gtg cct gac cta cag cta cct gag cca cgt · gga cct ggt gaa gga tet gaa cag cgg gct gat cgg cgc cct gct ₍ Sekvence id. číslo : 57 ) ' ggg gat cct cac gtc tca gaa cag cag gat 4 bam

0 gaa ctt gtg cag ggt ctg ggt ttt ctc ctt ggc cag gct gcc ctc gcg aca cac cag cag ggc gcc gat cag cc ( Sekvence id. číslo : 58 ) • · • · · · · · · · · · • · · · ··· · · · · • · ·· · ·· ······ ······ · · • · ··· ·· · ·· ·· ·· rl bbs 5 for (gttc) cgc gaa ttc gga aga ccc gtt cgc cgt gtt 5 rl ega ega ggg gaa gag ctg gca cag ega gac taa gaa cag cct gat gca gga ccg ega cgc cgc cag cgc ccg cgc ( Sekvence id. číslo : 59 ) ggg gat cct cac gtc tca gtg gca gcc gat 5 bam cag gcc ggg cag gct gcg gtt cac gta gcc gtt aac ggt gtg cat ctt ggg cca ggc gcg ggc gct ggc ggc gt ( Sekvence id. číslo : 60 ) rl bbs 6for(ccac)

- cgc gaa ttc gga aga ccc cca ccg caa gag 6 rl cgt gta ctg gca cgt cat cgg cat ggg cac cac ccc tga ggt gca cag cat ctt cct gga ggg cca cac ctt cct ( Sekvence id. číslo : 61) ggg gat cct cac gtc tca cag ggt ctg ggc 6 bam agt cag gaa ggt gat ggg gct gat ctc cag gct ggc ctg gcg gtg gtt gcg cac cag gaa .

ggt gtg g^{cc ctc ca} ( Sekvence id. číslo : 62 ) ¹ rl bbs 7 for (cctg) _ _

0 cgc gaa ttc gga aga ccc cct gct gat gga 7 rl cct agg cca gtt cct gct gtt ctg cca cat --cag cag cca cca gca ega cgg cat gga ggc tta cgt gaa ggt gga ( Sekvence id. číslo : 63 ) • ···

··· ggg gat cct cac gtc tca gtc gtc gtc gta 7bam gtc ctc ggc ctc ctc gtt gtt ctt cat gcg cag ctg ggg ctc ctc ggg gca gct gtc cac ctt cac gta agc ct ( Sekvence id. číslo : 64 ) rl bbs 8for(cgac) cgc gaa ttc gga aga ccc ega cct gac ega 8 rl cag ega gat gga tgt cgt acg ctt ega ega ega caa cag ccc cag ctt cat cca gat ccg cag cgt ggc caa gaa ( Sekvence id. číslo : 65 ) ¹⁰ ggg g^{at cct cac} g^{tc tca tac ta}g ^cgg gg^c & bam gta gtc cca gtc ctc ctc ctc ggc ggc gat gta gtg cac cca ggt ctt agg gtg ctt ctt ggc cac gct gcg ga ( Sekvence id. číslo : 66 ) rl bbs 9 for (agta) cgc gaa ttc gga aga ccc agt act ggc ccc 9 rl ega ega ccg cag cta caa gag cca gta cct gaa caa cgg ccc cca gcg cat cgg ccg caa gta caa gaa ggt gcg ( Sekvence id. číslo : 67) i

ggg gat cct cac gtc tca gag gat gcc gga 9 bam

0 ctc gtg ctg gat ggc ctc gcg ggt ctt gaa agt ctc gtc ggt gta ggc cat gaa-gcg cac ctt ctt gta ctt gc ( Sekvence id. číslo : 68 ) • · • ·· • · · · · rl bbs 10 for (cctc) cgc gaa ttc gga aga ccc cct cgg ccc cct 10 rl gct gta cgg ega ggt ggg ega cac cct gct gat cat ctt caa gaa cca ggc cag cag gcc cta caa cat cta ccc ( Sekvence id. číslo : 69 ) ggg gat cct cac gtc tca ctt cag gtg ctt 10 bam cac gcc ctt ggg cag gcg gcg gct gta cag ggg gcg cac gtc ggt gat gcc gtg ggg gta gat gtt gta ggg cc ( Sekvence id. číslo : 70 ) rl bbs 11 for (gaag) cgc gaa ttc gga aga ccc gaa gga ctt ccc 11 rl. cat cct gcc cgg ega gat ctt caa gta caa gtg gac cgt gac cgt gga gga cgg ccc cac caa gag ega ccc ccg ( Sekvence id. číslo : 71 ) ¹⁵ ggg g^{at cct cac} gta^tca g^cc g^{at ca}g^tcc 11 bam gga ggc cag gtc gcg ctc cat gtt cac gaa gct gct gta gta gcg ggt cag gca gcg ggg gtc gct ctt ggt gg ζ Sekvence id. číslo : 72 ) rl bbs 12 for (cggc)

0 cgc gaa ttc gga aga ccc cgg ccc cct gct 12 rl gat ctg cta caa gga gag cgt gga cca gcg cgg caa cca gat cat gag ega caa gcg caa cgt gat cct gtt cag g_ek_vence jj číslo _; 73)

9···

999 999 9999 •·999·9.9999 • · ·· 9 · · 999 9·9

9 · ·· · · « ·· ··· · · ··· · · · · 34 ggg gat cct cac gtc tca agc ggg gtt ggg 12 bam cag gaa gcg ctg gat gtt ctc ggt cag ata ' cca gct gcg gtt ctc gtc gaa cac gct gaa cag gat cac gtt gc ( Sekvence id. číslo : 74) rl bbs 13 for (cgct) cgc gaa ttc gga aga ccc cgc tgg cgt gca 13 rl gct gga aga tcc ega gtt cca ggc cag caa cat cat gca cag cat caa cgg cta cgt gtt ega cag cct gca gct ( Sekvence id. číslo : 75) l o ggg gat cct cac gtc tca cag gaa gtc ggt 13 bam ctg ggc gcc gat gct cag gat gta cca gta ggc cac ctc atg cag gca cac gct cag ctg cag gct gtc gaa ca ( Sekvence id. číslo : 76) rl bbs 14 for (cctg) cgc gaa ttc gga aga ccc cct gag cgt gtt 14 rl ctt ctc cgg gta tac ctt caa gca caa gat _____ ggt gta ega gga cac cct gac cct gtt ccc ctt ctc cgg ega gac ( Sekvence id. číslo : 77 ) !

ggg gat cct cac gtc tca gtt gcg gaa gtc 14 bam gct gtt gtg gca gcc cag aat cca cag gcc ggg gtt ctc cat aga cat gaa cac agt ctc gcc gga gaa ggg ga ( Sekvence id. číslo : 78 ) • 9

4 9« • 9 4 4 · 4

4 9

4 4 • · 9 9 4« • 4 rl bbs 15 for (caac) cgc gaa ttc gga aga ccc caa ccg cgg cat 15 rl gac tgc cct gct gaa agt ctc cag ctg ega caa gaa cac cgg ega cta cía ega gga cag cta ega gga cat ctc ( Sekvence id. číslo : 79 ) ggg gat cct cac gtc tea gcg gtg gcg gga 15 bam gtt ttg gga gaa gga gcg ggg ctc gat ggc gtt gtt ctt gga cag cag gta-ggc gga gat gtc ctc gta gct gt ( Sekvence id. číslo : 80 ) rl bbs 16 for (ccgc) cgc gaa ttc gga aga ccc ccg cag cac gcg 16 rl tea gaa gca gtt caa cgc cac ccc ccc cgt gct gaa gcg cca cca gcg ega gat cac ccg cac cac cct gca aag ( Sekvence id. číslo : 81 ) ggg gat cct cac gtc tea gat gtc gaa gtc' 16 bam ctc ctt ctt cat ctc cac gct gat ggt gtc gtc gta gtc gat ctc ctc ctg gtc gct ttg cag ggt ggt gcg gg ( Sekvence id. číslo : 82 ) rl bbs 17 for (catc)

0 cgc gaa ttc gga aga ccc cat cta ega ega 17 r 1 gga ega gaa cca gag ccc ccg ctc ctt cca aaa gaa aac ccg cca cta ctt cat cgc cgc cgt gga gcg cct gtg ( Sekvence id. číslo : 83 )

999 9 9 9 9999

99999999999 · ·· 9 · 9 ······

999 99 9 9 9

999 · 9 999 99 99 ggg gat cct cac gtc tca ctg ggg cac gct 17 bam gcc gct ctg ggc gcg gtt gcg cag gac gtg ggg gct gct gct cat gcc gta gtc cca cag gcg ctc cac ggc gg ( Sekvence id. číslo : 84 ) rl bbs 18 for (ccag) cgc gaa ttc gga aga ccc cca gtt caa gaa 18 rl ggt ggt gtt cca gga gtt cac ega cgg cag ctt cac cca gcc cct gta ccg cgg ega gct gaa ega gca cct ggg ( Sekvence id. číslo : 85 ) ggg gat cct cac gtc tca ggc ttg gtt gcg .... 18.bam _ gaa ggt cac cat gat gtt gtc ctc cac ctc ggc gcg gat gta ggg gcc gag cag gcc cag gtg ctc gtt cag ct ( Sekvence id. číslo : 86 ) rl bbs 19 for(agcc) cgc gaa ttc gga aga ccc age ctc ccg gcc 19 rl cta ctc ctt cta ctc ctc cct gat cag cta ega gga gga cca gcg cca ggg cgc ega gcc ccg caa gaa ctt cgt ( Sekvence id. číslo : 87 ) ggg gat cct cac gtc tca ctc gtc ctt ggt 19 bam

0 ggg ggc cat gtg gtg ctg cac ctt cca gaa gta ggt ctt agt ctc gtt ggg ctt cac gaa _ gtt ctt gcg ggg ct ( Sekvence id. číslo : 88 ) ···· · ·· ···· ·· ·· • ·· · · · ···· • · · · ♦ · · ···· • · · · · · · ······ ······ · · ·· ··* ·· ··· ·· ·· rl bbs 20 for (cgag) cgc gaa ttc gga aga ccc ega gtt ega ctg 20 rl caa ggc ctg ggc cta ctt cag ega cgt gga cct gga gaa gga cgt gca cag cgg cct gat cgg ccc cct gct ggt ( Sekvence id. číslo : 89 ) ggg gat cct cac gtc tca gaa cag ggc aaa 20 bam ttc ctg cac agt cac ctg cct ccc gtg ggg ggg gtt cag ggt gtt ggt gtg gca cac cag ^cag ggg g^cc g^&t^ca ( Sekvence id. číslo : 90 ) rl bbs 21 for (gtte) cgc gaa ttc gga aga ccc gtt ctt cac cat 21 rl ctt ega ega gac taa gag ctg gta ctt cac ega gaa cat gga gcg caa ctg ccg cgc ccc ctg caa cat cca gat ( Sekvence id., číslo : 91 ) ¹5 ggg gat cct cac gtc tca cag ggt gtc cat 21 bam gat gta gcc gtt gat ggc gtg gaa gcg gta gtt ctc ctt gaa ggt ggg atc ttc cat ctg gat gtt gca ggg gg ( Sekvence id. číslo : 92 ) rl bbs 22 for (cctg)

0 cgc gaa ttc gga aga ccc cct gcc cgg cct 22 rl ggt gat ggc cca gga cca gcg cat ccg ctg gta cct gct gtc tat ggg cag caa ega gaa cat cca cag cat cca ( Sekvence id. číslo : 93 )

4444 » 44 4444 44 4« · 4 » 4 4 4444

4 44444 4444

4 44 4 44 444444 •44444 44

444 44 444 44 49 ggg gat cct cac gtc tca gta cag gtt gta 22 bam cag ggc cat ctt gta c.tc ctc ctt ctt gcg cac ggt gaa aac gtg gcc gct gaa gtg gat gct gtg gat gttct ( Sekvence id. číslo : 94 ) rl bbs 23 for (gtac) cgc gaa ttc gga aga ccc gta ccc cgg cgt 23 rl gtt ega gac tgt gga gat gct gcc cag caa ggc cgg gat ctg gcg cgt gga gtg cct gat cgg ega gca cct gca ( Sekvence id. číslo : 95 ) ¹⁰ ggg gat ^{ccí cac} gte^tca g^cí gg^{c caí} g^cc 23 bam cag ggg ggt ctg gca ctt gtt gct gta cac cag gaa cag ggt gct cat gcc ggc gtg cag gtg ctc gcc gat ca ( Sekvence id. číslo : 96 ) rl bbs 24 for (cagc)

Ϊ5 cgc gaa ttc gga aga ccc cag cgg cca cat 24 rl ccg ega ctt cca gat cac cgc cag cgg cca gta cgg cca gtg ggc tcc caa gct ggc ccg cct gca cta cag cgg ( Sekvence id. číslo : 97 ) ggg gat cct cac gtc tca cat ggg ggc cag 24 bam

0 cag gtc cac ctt gat cca gga gaa ggg ctc ctt ggt ega cca ggc gtt gat gct gcc gct gta gtg cag gcg gg ( Sekvence id. číslo : 98 )

FFFF » FF ♦ »·· FF FF

F F F F F F FFFF • ' F · · FFF * · · ·

F F * · F F F FFF FFF

FFFFFF · F

F F FFF · F f · · F F FF rl bbs 25 for (catg) cgc gaa ttc gga aga ccc cat gat cat cca 25 rl cgg cat caa gac cca ggg cgc ccg cca gaa gtt cag cag cct gta cat cag cca gtt cat cat cat gta ctc tet ( Sekvence id. číslo : 99 ) ggg gat cct cac gtc tca gtt gcc gaa gaa 25 bam cac cat cag ggt gcc ggt gct gtt gcc gcg gta ggt ctg cca ctt ctt gcc gtc tag aga gta cat gat gat ga ( Sekvence id. číslo : 100) io rl bbs 26 for (caac) cgc gaa ttc gga aga ccc caa cgt gga cag 26 rl cag cgg cat caa gca caa cat ctt caa ccc ccc cat cat cgc ccg cta cat ccg cct gca ccc cac cca cta cag ( Sekvence id. číslo : 101 ) ggg gat cct cac gtc tca gcc cag ggg cat 26 bam gct gca gct gtt cag gtc gca gcc cat cag ctc cat gcg cag ggt gct gcg gat gct gta gtg ggt ggg gtg ca ( Sekvence id. číslo : 102 ) ¹ rl bbs 27 for (gggc) cgc gaa ttc gga aga ccc ggg cat gga gag 27 rl caa ggc cat cag ega cgc cca gatcac cgc ctc cag cta ctt cac caa cat gtt cgc cac ctg gag ccc cag caa ( Sekvence id. číslo : 103 ) • ••9 •

0

0

009 •0 0000

0 0

0 0 0 9

9« φ

0 0

000

000

0 0 0

0 0 0 ggg gat cct cac gtc tea cca ctc ctt ggg 27 bam gtt gtt cac ctg ggg gcg cca ggc gtt gct gcg gcc ctg cag gtg cag gcg ggc ctt gct ggg gct cca ggt gg ₍ sekvence id. číslo : 104) rl bbs 28 for (gtgg) cgc gaa ttc gga aga ccc gtg gct gca ggt 28 rl gga ctt cca gaa aac cat gaa ggt gac tgg cgt gac cac cca ggg cgt caa gag cct gct gac cag cat gta cgt ( Sekvence id. číslo : 105 ) ¹⁰ ggg g^at cct ^cac g^tc tca ctt g^cc gtt ^ttg 28 bam gaa gaa cag ggt cca ctg gtg gcc gtc ctg gct gct gct gat cag gaa ctc ctt cac gta cat gct ggt cag ca ( Sekvence id. číslo : 106) rl bbs 29 for (caag) cgc gaa ttc gga aga ccc caa ggt gaa ggt 29 rl gtt cca ggg caa cca gga cag ctt cac acc ggt cgt gaa cag cct gga ccc ccc cct gct gac ccg cta cct gcg ( Sekvence id. číslo : 107 ) ;

ggg gat cct cac gtc tca gcg gcc gct tca 29 bam 20 gta cag gtc ctg ggc ctc gca gcc cag cac ctc cat gcg cag ggc gat ctg gtg cac cca gct ctg ggg gtg gat gcg cag gta gcg ggt cag ca ( Sekvence id. číslo : 108 )

4444 · • · 4 • ·

4

4 4 ··· ···· • · • *·· • 44 4

4 4 ···

44

4 4 4 • 4 4 4 • 444 444

4

4 4 4

Užití kodónů v přirozeně se vyskytujících a syntetických genech popsaných výše jsou uvedeny v Tabulce 3 a 4.

TABULKA 3: Frekvence využití kodónů v syntetickém genu pro Faktor VIII s deletovanou B doménou

AA Kodon Číslo /1000 . Frakce

	Gly	GGG	7.00	4.82	0.09
	Gly	GGA	1.00	0.69	0.01
	Gly	GGT	0.00	0.00	0.00
10	Gly	GGC	74.00	50.93	0.90
	Glu	GAG	81.00	55.75	0.96
	Glu	GAA	3.00	2.06	0.04
	Asp	GAT	4.00	2.75	0.05
15	Asp	GAC	• 78.00	53.68	0.95
	Val	GTG	77.00	52.99	0.88
	Val	GTA	2.00	1.38	0.02
	Val	GTT	2.00	1.38	0.02
20	Val	GTC	7.00	4.82	0.08
	Ala	GCG	0.00	0.00	0.00
	Ala	GCA	0.00	0.00	0.00
	Ala	GCT	3.00	2.06	0.04
25	Ala	GCC	67.00	46.11	0.96
	Arg	AGG	2.00-	1.38	0.03
	Arg	AGA	0.00	0.00	0.00
	Ser	AGT	0.00	0.00	0.00
30	Ser	AGC	97.00	66.76	0.81
	Lys	AAG	75.00	51.62	0.94
	Lys	AAA	5.00	3.44	0.06
	Asn	AAT	0.00	0.00	0.00
35	Asn	AAC	63.00	43.36	1.00

4444 ** 4444 44 44 ··· · 4 · 4 4 9 4 · >«·«· 4 4 4 4 • 4*44 4 4 444 444 • 4 4 4 4 4 4

444 44 444 44 49

-Arg	AGG	18.00	12.39	0.25
Arg	AGA	·_ 22.00	15.14	0.30
Ser	AGT	22.00	15.14	0.18
Ser	AGC	24.00	16.52	0.20
Lys	AAG	32.00	22.02	0.40
Lys	AAA	48.00	33.04	0.60
Asn	AAT	38.00	26.15	0.60
Asn	AAC	25.00	17.21	0.40
Met	ATG	43.00	29.59	1.00
Ile	ATA	13.00	8.95	0.18
Ile	ATT	36.00	24.78	0.49
Ile	ATC	25.00	17.21	.0.34
Thr	ACG	1.00	0.69	0.01

Thr ACA 23.00 15.83 0.28

Thr ACT 36.00 24.78 0.43

Thr ACC 23.00 15.83 0.28

Trp TGG 28.00 19.27 1.00

End TGA 1.00 0.69 1.00

Cys TGT 7.00 4.82 0.37

Cys TGC . 12.00 8.26 0.63

End TAG 0.00 0.00 0.00

End TAA 0.00 0.00 0.00

Tyr TAT 41.00 28.22 0.60

Tyr TAC 27.00 18.58 0.40

Leu TTG 20.00 13.76 0.16

Leu TTA 10.00 6.88. 0.08

Phe TTT 45.00 30.97 0.58

Phe TTC 32.00 22.02 0.42

Ser TCG 2.00 1.38 0.02

Ser TCA 27.00 18.58- 0.22

- Ser TCT 27.00 18.58 0.22

Ser TCC 18.00 12.39 0.15 ···♦

9* 99« · 99 99 «·9 * 9 9 9999 · 9 9 «99 9 9 9 9

9 · 9 9 · 9 999 999

999 99 9 99

999 99 999 «9 «9

Met	ATG	43.00	29.59	1.00
Ile	ATA	0.00	0.00	0.00
Ile	ATT	2.00	1.38	0.03
5 Ile	ATC	72.00	49.55	0.97

	Thr	ACG	2.00	1.38	0.02
	Thr	ACA	1.00	0.69	0.01
	Thr	ACT	10.00	6.88	0.12
10	Thr	ACC	70.00	48.18	0.84
	Trp	TGG	28.00	19.27	1.00
	End	TGA	1.00	0.69	1.00
	Cys	TGT	1.00	0.69	0.05
15	Cys	TGC	18.00	12.39	0.95
	End	TAG	0.00	0.00	0.00
	End	TAA	0.00	0.00	0.00
	Tyr	TAT	2.00	1.38	0.03
20	Tyr	TAC	66.00	45.42	0.97
	Leu	TTG	0.00	0.00	0.00
	Leu	TTA ·	0.00	0.00	0.00
	Phe	TTT	.1.00	0.69	0.01
25	Phe	TTC	76.00	52.31	0.99
	Ser	TCG	-1.00	0.69	0.01
	Ser	TCA	0.00	0.00	0.00
	Ser	TCT	3.00	2.06	0.03
30	Ser	TCC	19.00	13.08	0.16
	Arg	CGG	1.00	0.69	0.01
	Arg	CGA	0.00	0.00	0.00
	Arg	CGT	1.00	0.69	0.01
35	Arg	CGC	69.00	47.49	0.95
	Gin	CAG	62.00	42.67	0.93
	Gin	CAA	5.00	3.44	0.07
	His	CAT	1.00	0.69	0.02
40	His	CAC	50.00	34.41	0.98

4444 ·« ··«· 44 • 4 4 4 4 4 4

4 444 · 4 4 4 • 4 44 444 444 • 4 4 4 4

444 44 44

Leu	CTG	118.00	81.21	0.94
Leu	CTA	3.00	2.06	0.02
Leu	CTT	1.00	0.69	0.01
Leu	CTC	3.00	2.06	0.02
Pro	CCG	4.00	2.75	0.05
Pro	CCA	0.00	0.00	0.00
Pro	CCT	3.00	2.06	0.04
Pro	CCC	68.00	46.80	0.91

TABULKA 4: Frekvence využití kodónů v nativním genu pro Faktor VIII s deletovanou B doménou

AA Kodon Číslo /1000 Frakce

Gly	GGG GGA GGT	12.00 34.00 16.00	8.26 23.40 11.01	0.15 0.41 0.20
	Gly Gly
20	Gly	GGC	20.00	13.76	0.24
	Glu	GAG	33.00	22.71	0.39
	Glu	GAA	51.00	35.10	0.61
	Asp	GAT	55.00	37.85	0.67
2-5	Asp	GAC	27.00	18.58	0.33
	Val	GTG	29.00	19.96	0.33
	Val	GTA	19.00	13.08	0.22
	Val	GTT	17.00	11.70	0.19
30	Val	GTC	23.00	15.83	0.26
	Ala	GCG	2.00	1.38	0.03
	Ala	GCA	18.00	12.39	0.25
	Ala	GCT	31.00	21.34	0.44
35	Ala	GCC	20.00	13.76	0.28

i a.

9*99 '9999 • · · 9 9 *·

99

Arg	CGG	6.00	4.13	0.08
Arg	CGA	10.00	6.88	0.14
	CGT	7.00	4.82	n.in
Arg	CGC	10.00	6.88	• 0.14
Gin	CAG	42.00	28.91	0.63
Gin	CAA	25.00	17.21	0.37
His	CAT	28.00	19.27	0.55
His	CAC	23.00	15.83	0.45
Leu	CŤG	36.00	24.78	0.29
Leu	CTA	15.00	10.32	0.12
Leu	CTT	24.00	16.52	0.19
Leu	CTC	20.00	13,76	0.16
Pro	CCG	1.00	0.69	0.01
Pro	CCA	32.00	22.02	0.43
Pro	CCT	26.00	17.89	0.35
Pro	CCC	15.00	10.32	0.20

0 ---------------- —..........................— - ' ......

Užití

Syntetické geny podle vynálezu se dají využít pro expresi proteinu, který se exprimuje za normálních podmínek v savčích buňkách v buněčné kultuře (například pro komerční přípravu lidských proteinů, jako jsou hGH, TPA, Faktor VIII a Faktor IX). Syntetické geny podle vynálezu jsou také využitelné pro genovou terapii. Například, syntetický gen kódující vybraný protein může být zaveden do buňky, která může exprimovat daný protein. Takto vytvořená buňka může být podána pacientovi, který potřebuje daný protein. Takovéto techniky buněčně založené genové terapie jsou dobře známy odborníkům pracujícím v daném oboru, pro přehled je možné se podívat například do Anderson a další, U.S. Patent číslo: 5, 399,349; Mulligan a Wilson, U.S. Patent číslo: 5,460, 959.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Syntetický gen kódující zeleně fluoreskující protein, kde je v něm alespoň jeden nepreferovaný nebo méně preferovaný kodón vyskytující se v přirozeném genu kódujícím uvedený protein nahrazen preferovaným kodónem kódujícím tutéž aminokyselinu, uvedený syntetický gen je schopný exprimovat uvedený protein v množství dosahujícím alespoň 110% množství proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v savčím buněčném systému za shodných podmínek.
2. 2. Syntetický gen kódující protein Faktoru VIII, ve kterém chybí centrální část domény B, kde je v něm alespoň jeden nepreferovaný nebo méně preferovaný kodón vyskytující se v uvedeném přirozeném genu kódujícím uvedený protein nahrazen preferovaným kodónem kódujícím tutéž aminokyselinu, uvedený syntetický gen je schopný exprimovat daný protein v množství dosahujícím alespoň 110% množství proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v savčím buněčném systému za shodných podmínek.
3. 3. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde je uvedený syntetický gen schopný exprimovat uvedený protein v množství dosahujícím alespoň 150 % množství téhož proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v buněčném systému za shodných podmínek.
4. 4. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde je uvedený syntetický gen schopný exprimovat uvedený protein v množství dosahujícím alespoň 200 % množství téhož proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v buněčném systému za shodných podmínek.
5. 5. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde je uvedený syntetický gen schopný exprimovat uvedený protein v množství dosahujícím alespoň 500 % množství téhož proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v buněčném systému za shodných podmínek.
6. 6. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde je uvedený syntetický gen schopný exprimovat uvedený protein v množství dosahujícím alespoň 1000 % množství téhož proteinu exprimovaného uvedeným přirozeným genem in vitro v buněčném systému za shodných podmínek.
7. 7. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený syntetický gen obsahuje méně než 5 výskytů sekvence CG.
8. 8. Syntetický gen podle nároku lnebo 2, kde nejméně 10 % kodónů v uvedeném přirozeném genu jsou nepreferované kodóny.
9. 9. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde nejméně 50 % kodónů v uvedeném přirozeném genu jsou nepreferované kodóny.

   9···

   99 9999

   99 99

   9 9 9 9 9 • 9 999 99 99
10. 10. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde nejméně 50 % nepreferovaných nebo méně preferovaných kodónů přítomných v uvedeném přirozeném genu je nahrazeno preferovanými kodóny.
11. 11. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde nejméně 90 % nepreferovaných nebo méně preferovaných kodónů přítomných v uvedeném přirozeném genu je nahrazeno preferovanými kodóny.
12. 12. Syntetický gen podle nároku 1 nebo 2, kde alespoň 20 % kodónů jsou preferované kodóny.
13. 13. Syntetický gen podle nároku 1, kde má uvedený gen kódující sekvenci znázorněmou v Sekvenci id. číslo : 40.
14. 14. Syntetický gen podle nároku 2, kde má uvedený gen kódující sekvenci znázorněmou v Sekvenci id. číslo : 42.
15. 15. Expresní vektor obsahující syntetický gen podle nároku 1 nebo 2.
16. 16. Expresní vektor podle nároku 15, kde uvedený vektor je savčím expresním vektorem.
17. 17. Savčí buňka obsahující syntetický gen podle nároku 1 nebo 2.
18. 18. Způsob přípravy syntetického genu kódujícího zeleně fluoreskující protein, vyznačující se tím, že zahrnuje rozpoznávání nepreferovaných a méně preferovaných kodónů vyskytujících se v přirozeném genu kódujícím zeleně fluoreskující protein a nahrazení jednoho nebo více těchto nepreferovaných nebo méně preferovaných kodónů v přirozeně se vyskytujícím genu za preferované kodóny, které kódují stejnou aminokyselinu jako nahrazovaný kodón.
19. 19. Způsob přípravy syntetického genu kódujícího protein Faktoru VIII, ve kterém chybí centrální část domény Bvyznačující se tím, že zahrnuje rozpoznávání nepreferovaných a méně preferovaných kodónů vyskytujících se v přirozeném genu kódujícím uvedený protein Faktoru VIII, ve kterém chybí centrální část domény B, a nahrazení jednoho nebo více uvedených nepreferovaných nebo méně preferovaných kodónů za preferované kodóny, které kódují stejnou aminokyselinu jako nahrazovaný kodón.