PL191300B1 - Syntetyczny gen kodujący białko fluoryzujące na zielono, wektor ekspresji, komórka ssaka oraz sposób wytwarzania genu - Google Patents

Abstract

1. Syntetyczny gen kodujacy bialko fluoryzujace na zielono, w którym co najmniej jeden nieko- rzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodujacym to bialko zastapiono korzystnym kodonem kodujacym ten sam aminokwas, przy czym wspomniane korzystne kodony wybrane sa z grupy obejmujacej gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc cac atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac, i mniej korzystne kodony sa wybrane z grupy obejmujacej gtg, ggg, att, ctc, tcc, gtc i agg i wspomniane nie korzystne kodony sa wszystkimi kodonami innymi niz wspomniane korzystne kodony i mniej korzyst- ne kodony. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny gen kodujący białko fluoryzujące na zielono, wektor ekspresji, komórka ssaka oraz sposób wytwarzania genu.

Ekspresja produktów eukariotycznych genów w prokariontach jest niekiedy ograniczana obecnością kodonów rzadko używanych w E. coli. Ekspresja takich genów może być polepszona przez systematyczną substytucję endogennych kodonów kodonami nadreprezentowanymi w dających silną ekspresję prokariotycznych genów (Robinson i in., Nucleic Acids Res. 12:6663, 1984). Przypuszcza się pospolicie, że rzadkie kodony powodują pauzowanie rybosomu, co prowadzi do nieukończenia powstającego łańcucha polipeptydowego i rozkojarzenia transkrypcji i translacji. Pauzowanie rybosomu ma prowadzić do odsłonięcia końca 3' mRNA na działanie komórkowych rybonukleaz.

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny gen kodujący białko floryzujące na zielono, w którym co najmniej jeden nie-korzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodującym białko zastąpiono korzystnym kodonem kodującym tensamaminokwas.

Korzystnymi kodonamisą: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc);His(cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac) i Val (gtg).Mniej korzystnymi kodonami są: Gly (ggg); Ile (att);Leu(ctc);Ser(tcc); Val (gtc) i Arg (agg). Wszystkiekodony,któreniemieszcząsięw opisie korzystnych kodonów lub mniej korzystnych kodonów, oznaczająniekorzystnekodony. Ogólnie,stopieńpreferencji konkretnegokodonujest wskazywany przez przeważanie kodonu w ludzkich genach o wysokiej ekspresji, jak wskazano w tabeli 1pod nagłówkiem Wysoka Np., atc reprezentuje 77% kodonów Ile genów ssaka o wysokiej ekspresji i jest korzystnym kodonem Ile; att reprezentuje 18% kodonów Ile genów ssaka o wysokiej ekspresji i oznacza mniej korzystny kodon Ile. Sekwencja ata reprezentuje tylko 5% kodonów Ile ludzkich genów o wysokiej ekspresji jako niekorzystny kodon Ile. Zastąpienie kodonu innym kodonem przeważającym w ludzkich genach o wysokiej ekspresji będzie ogólnie zwiększało ekspresję genu w komórkach ssaka. Odpowiednio, wynalazek obejmuje zastąpienie mniej korzystnego kodonu korzystnym kodonem, jak też zastąpienie niekorzystnego kodonu korzystnym lub mniej korzystnym kodonem.

Przez białko normalnie ulegające ekspresji w komórce ssaka rozumie się białko, które ulega ekspresji w ssaku w naturalnych warunkach. Termin obejmuje geny w genomie ssaka, takie jak kodujące czynnik VIII, czynnik IX, interleukiny i inne białka. Termin obejmuje także geny, które ulegają ekspresji w komórce ssaka w warunkach choroby, takie jak onkogeny, jak też geny, które są kodowane przez wirusa (w tym retrowirusa) i które ulegają ekspresji w komórkach ssaka po infekcji. Przez białko normalnie ulegające ekspresji w eukariotycznej komórce rozumie się białko, które ulega ekspresji w eukarioncie w warunkach naturalnych. Termin obejmuje także geny, które ulegają ekspresji w komórce ssaka w warunkach choroby.

W korzystnych odmianach wynalazku syntetyczny gen jest zdolny do ekspresji białka ssaka lub eukariotycznego na poziomie, który wynosi co najmniej 110%, 150%, 200%, 500%, 1000%, 5000% lub nawet 10000% poziomu ekspresji dla naturalnego (lub natywnego) genu w układzie kultury komórek ssaka in vitro w identycznych warunkach (to jest, ten sam typ komórki, te same warunki kultury, ten sam wektor ekspresji).

Odpowiednie układy kultur komórkowych do mierzenia ekspresji syntetycznego genu i odpowiedniego naturalnego genu opisano poniżej. Inne odpowiednie układy ekspresji wykorzystujące komórki ssaka są dobrze znane specjalistom i są opisane w, np., standardowych publikacjach informacyjnych z dziedziny biologii molekularnej wspomnianych poniżej. Wektory odpowiednie do ekspresji syntetycznych i naturalnych genów opisano poniżej oraz w standardowych publikacjach informacyjnych zacytowanych poniżej. Przez ekspresje rozumie się ekspresję białka. Ekspresję można mierzyć stosując przeciwciało specyficzne dla danego białka. Takie przeciwciała i techniki pomiaru są dobrze znane specjalistom. Przez naturalny gen i natywny gen rozumie się sekwencję genu (w tym naturalnie występujące warianty allelowe), która naturalnie koduje białko, to jest, natywną lub naturalną sekwencję kodującą.

W innych korzystnych odmianach co najmniej 10%, lub 50%, kodonów w naturalnym genie to niekorzystne kodony.

W innych korzystnych odmianach co najmniej 50 lub 90% niekorzystnych kodonów w naturalnym genie zastępuje się korzystnymi kodonami lub mniej korzystnymi kodonami.

W innych korzystnych odmianach co najmniej 90% niekorzystnych kodonów w naturalnym genie zastępuje się korzystnymi kodonami.

PL 191 300 B1

W korzystnej odmianie białko oznacza białko fluoryzujące na zielono.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresji obejmujący syntetyczny gen.

W innym aspekcie przedmiotem wynalazku jest komórka zawierająca syntetyczny gen. W różnych korzystnych odmianach komórka oznacza prokariotyczną komórkę i komórka oznacza komórkę ssaka.

Białko może być retrowirusowym białkiem lub białkiem lentiwirusowym, ewentualnie białkiem HIV. Mogą to być białka: gag, pol, env, gp120 lub gp160. Może to być także białko ludzkie, w tym białko czynnika VIII i białko ludzkiego czynnika VIII z wyciętym regionem B.

W korzystnych odmianach syntetyczny gen obejmuje mniej niż 5, lub nie obejmuje sekwencji cg.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania syntetycznego genu kodującego białko fluoryzujące na zielono polegający na identyfikacji niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów w naturalnym genie kodującym białko fluoryzujące na zielono i zastąpieniu jednego lub kilku niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas co zastąpiony kodon.

W pewnych okolicznościach (np., aby pozwolić na wprowadzenie miejsca restrykcji) może być pożądane zastąpienie niekorzystnego kodonu mniej korzystnym kodonem, a nie korzystnym kodonem.

Nie jest konieczne zastępowanie wszystkich mniej korzystnych lub niekorzystnych kodonów korzystnymi kodonami.

Zwiększoną ekspresję można uzyskać nawet przy częściowym zastąpieniu mniej korzystnych lub niekorzystnych kodonów korzystnymi kodonami. W pewnych okolicznościach może być pożądane tylko częściowe zastąpienie niekorzystnych kodonów korzystnymi lub mniej korzystnymi kodonami w celu uzyskania pośredniego poziomu ekspresji.

W innych korzystnych odmianach przedmiotem wynalazku są wektory (w tym wektory ekspresji) obejmujące jeden lub więcej syntetycznych genów.

Przez wektor rozumie się cząsteczkę DNA, pochodzącą, np., z plazmidu, bakteriofaga lub wirusa ssaka lub owada, do której można wstawiać lub klonować fragmenty DNA. Wektor będzie zawierał jedno lub kilka unikalnych miejsc restrykcji i może być zdolny do autonomicznej replikacji w zdefiniowanym gospodarzu lub organizmie przenoszącym tak, że klonowana sekwencja reprodukuje się. Tak więc przez wektor ekspresji rozumie się dowolny autonomiczny element zdolny do kierowania syntezą białka. Takie wektory ekspresji DNA obejmują plazmidy ssaka i wirusy.

Możliwe jest także wytwarzanie fragmentów syntetycznego genu kodującego żądaną część białka. Takie fragmenty syntetycznego genu są podobne do syntetycznych genów według wynalazku poza tym, że kodują tylko część białka. Takie fragmenty genów korzystnie kodują co najmniej 50, 100, 150 lub 500 przylegających aminokwasów białka.

Przy konstruowaniu syntetycznych genów według wynalazku może być pożądane unikanie sekwencji CpG, ponieważ te sekwencje mogą powodować milknięcie genu. Tak więc w korzystnej odmianie region kodujący syntetycznego genu CpG nie obejmuje 30 sekwencji cg.

Syntetyczne geny według wynalazku można wprowadzać do komórek żywego organizmu. Np., wektory (wirusowy lub niewirusowy) można stosować do wprowadzania syntetycznego genu do komórek żywego organizmu w celu terapii genowej.

Odwrotnie, może być pożądane zastępowanie korzystnych kodonów w naturalnie występującym genie mniej korzystnymi kodonami jako środkiem obniżania ekspresji.

Standardowe pozycje literaturowe opisujące ogólne zasady techniki rekombinacji DNA obejmują Watsona i wsp., Molecular Biology of the Gene, tomy I i II, wydawca Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnella i in. , Molecular Cell Biology, wydawca Scientific American Books, Inc., New York, N.Y. (1986); Olda i wsp., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, wyd. 2, wydawca University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatisa i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, wydawca Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); oraz Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel i wsp., Wiley Press, New York, NY (1992).

Przez transformowaną komórkę rozumie się komórkę, do której (lub jej przodka) wprowadzono, metodą technik rekombinacyjnych DNA, wybraną cząsteczkę DNA, np., syntetyczny gen.

Przez ustawioną do ekspresji rozumie się, że cząsteczka DNA, np., syntetyczny gen, jest umieszczony w sąsiedztwie sekwencji DNA, która kieruje transkrypcją i translacją sekwencji (to jest, ułatwia wytwarzanie białka kodowanego przez syntetyczny gen.

PL 191 300 B1

Figura 1 pokazuje sekwencję syntetycznego genu gp120 i syntetycznego genu gp160, w których kodony zastąpiono znajdowanymi w ludzkich genach o wysokiej ekspresji.

Figura 2 jest schematem syntetycznego genu gp120 (HIV-1 MN). Zacienione części oznaczone v1 do v5 wskazują regiony silnie zmienne. Wypełniony prostokąt wskazuje miejsce wiązania CD4. Pokazano ograniczoną liczbę unikalnych miejsc restrykcji: H (Hind3), Nh (Nhe1), P (Pst1), Na (Nae1), M (Mlu1), R (EcoR1), A (Age1) i No (Not1). Chemicznie zsyntetyzowane fragmenty DNA służące jako wzorce PCR pokazano poniżej sekwencji gp120, wraz z lokacjami starterów użytych do ich wzmacniania.

Figura 3 jest fotografią wyników prób przejściowej transfekcji użytych do pomiaru ekspresji gp120. Elektroforeza żelowa immunoprecypitowanych supernatantów komórek 293T transfekowanych plazmidami ekspresji gp120 kodowanymi przez izolat IIIB HIV-1 (gp120IIIb), izolat MN HIV-1 (gp120mn), izolat MN HIV-1 zmodyfikowany przez substytucję endogennego liderowego peptydu peptydem antygenu CD5 (gp120mnCD5L), lub chemicznie zsyntetyzowanym genem kodującym wariant MN HIV-1 z ludzkim CD5Leader (syngp120mn). Supernatanty zbierano po 12 godzinach znakowania 60 godzin po transfekcji i immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4:IgG1 i Sepharose białka A.

Figura 4 jest wykresem ilustrującym wyniki prób ELISA użytych do pomiaru poziomów białka w supernatantach przejściowo transfekowanych komórek 293T. Supernatanty komórek 293T transfekowanych plazmidami ekspresji gp120 kodowanego przez izolat IIIB HIV-1 (gp120 Illb), izolat MN HIV-1 (gp120mn), izolat MN HIV-1 zmodyfikowany przez substytucję endogennego liderowego peptydu peptydem antygenu CD5 (gp120mnCD5L), lub chemicznie zsyntetyzowanym genem kodującym wariant MN HIV-1 z ludzkim CD5Leader (syngp120mn) zebrano po 4 dniach i testowano w ELISA gp120/CD4. Poziom gp120 wyrażono w ng/ml.

Figura 5A jest fotografią żelu ilustrującą wyniki próby immunoprecypitacji użytej do pomiaru ekspresji natywnego i syntetycznego gp120 w obecności rev w pozycji trans i RRE w cis. W tym eksperymencie komórki 293T były przejściowo transfekowane przez współstrącanie z fosforanem wapnia μg plazmidu dającego ekspresję: (A) syntetycznej sekwencji gp120MN i RRE w cis, (B) części gp120 IIIB HIV-1, (C) części gp120 IIIB HIV-1 i RRE w cis, wszystkie w obecności lub nieobecności ekspresji rev. Konstrukty RRE gp120IIIbRRE i syngp120mnRRE wytworzono stosując fragment Eag1/Hpa1 RRE klonowany metodą PGR z prowirusowego klonu HXB2 HIV-1. Każdy plazmid ekspresyjny gp120 kotransfekowano 10 μg plazmidu DNA pCMVrev lub CDM7. Supernatanty zbierano 60 godzin po transfekcji, immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4:IgG i agarozą białka A, i wprowadzono na 7% redukującą SDS-PAGE. Czas wystawiania na żel przedłużano, aby wykazać indukcję gp120IIIbrre przez rev.

Figura 5B jest fotografią z krótszym naświetlaniem podobnego eksperymentu, w którym syngp120mnrre kotransfekowano zlubbezpCMVrev.

Figura 5C jest schematem konstruktów użytych na fig. 5A.

Figura 6jest porównaniem sekwencji dzikiego typu genu ratTHY-1 (wt)i syntetycznego genu ratTHY-1(env)skonstruowanegometodąsyntezychemicznejimającegowiększośćprzeważających kodonówznajdowanychwgenieenvHIV-1.

Figura 7 jest schematem syntetycznego genu ratTHY-1. Pełny czarny prostokąt oznacza peptyd sygnałowy. Zacieniony prostokąt oznacza sekwencje w prekursorze, które kierują przyłączaniem zakotwiczenia glikanu fosfatydylo-inozytolowego. Unikalne miejsca restrykcji użyte do składania konstruktów THY-1 oznakowano H (Hind3), M (Mlu1), S (Sac1)i No (Not1). Pozycję syntetycznych oligonukleotydów stosowanych w konstrukcji pokazano na dole figury.

Fiura8 jest wykresem ilustrującym wyniki analizy cytometrii przepływowej. W tym doświadczeniu komórki 293T przejściowo transfekowane dzikiego typu plazmidem ekspresyjnym ratTHY-1 (gruba linia), ratTHY-1 z plazmidem ekspresji kodonów otoczki (cienka linia), lub tylko wektorem (kropkowana linia) metodą współstrącania z fosforanem wapnia. Komórki zabarwiano monoklonalnym przeciwciałem OX7 anty-ratTHY-1, następnie poliklonalnym sprzężonym z FITC anty-mysim przeciwciałem IgG 3 dni po transfekcji.

Figura9A jest fotografią żelu ilustrującą wyniki analizy immunoprecypitacji supernatantów ludzkich komórek 293T transfekowanych syngp120mn (A) lub konstruktem syngp120mn.rTHY-1env, który zawiera gen rTHY-1env w nietranslowanym regionie 3' genu syngp120mn (B). Konstrukt syngp120mn.rTHY-1env wytworzono wstawiając adapter Not1 do lepkiego miejsca Hind3 plazmidu rTHY-1env. Następnie fragment Not1 0,5 tys. par zasad zawierający gen rTHY-1env klonowano do

PL 191 300 B1 miejsca Not1 plazmidem syngp120mn i testowano dla zapewnienia poprawnej orientacji. Supernatan35 ty znakowanych ³⁵S komórek zebrano 72 godziny po transfekcji, strącono fuzyjnym białkiem CD4:IgG i agarozą białka A, i wprowadzono na 7% redukującą SDS-PAGE.

Figura 9B jest schematem konstruktów użytych w eksperymencie zilustrowanym na fig. 9A.

Figura 10A jest fotografią komórek COS transfekowanych wektorem nie wykazującym tylko fluorescencji GFP.

Figura 10B jest fotografią komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresyjnym CDM7 kodującym natywny GFP przetworzoną tak, aby zawierała sekwencję zgodności inicjacji translacji.

Figura 10C jest fotografią komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresyjnym mającym takie same flankujące sekwencje i sekwencje zgodności inicjacji jak na fig. 10B, ale niosącym sekwencję genu optymalizowaną co do sekwencji.

Figura 10D jest fotografią komórek COS transfekowanych plazmidem ekspresyjnym jak na fig. 10C, ale niosącym Thr jako resztę 65 w miejsce Ser.

Figura 11 ilustruje sekwencję syntetycznego genu kodującego białka o zielonej fluorescencji (SEKW. NR ID.:40).

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.

Przykład 1

Konstrukcja syntetycznego genu gp120 mającego kodony znajdowane w ludzkich genach o wysokiej ekspresji.

Tabela częstotliwości kodonów dla prekursora otoczki podtypu LAV HIV-1 wytworzona z użyciem oprogramowania opracowanego przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Wyniki zestawiono w tabeli 1z wzorem użycia kodonów ze zbioru ludzkich genów o wysokiej ekspresji. Dla dowolnego aminokwasu kodowanego przez zdegenerowane kodony, najkorzystniejszy kodon genu o wysokiej ekspresji jest różny od najkorzystniejszego kodonu prekursora otoczki HIV. Ponadto prosta zasada opisuje wzór korzystnych kodonów otoczki, gdzie się ona stosuje: korzystne kodony maksymalizują liczbę reszt adeninowych w wirusowym RNA. We wszystkich przypadkach poza jednym oznacza to, że kodon, w którym trzecia pozycja oznacza A, jest najczęściej stosowany. W specjalnym przypadku seryny, trzy kodony jednakowo stosują jedną resztę A w mRNA; razem te trzy stanowią 85% serynowych kodonów istotnie stosowanych w transkryptach otoczki. Szczególnie uderzający przykład tendencji A znajduje się w doborze kodonów dla argininy; gdzie tryplet AGA stanowi 88% kodonów argininy. Poza przewagą reszt A, widać znaczącą preferencję dla urydyny pośród zdegenerowanych kodonów, których trzecia reszta musi być pirymidyną. Na koniec, niespójności pośród rzadziej używanych wariantów można przypisać obserwacji, że dinukleotyd CpG jest niedoreprezentowany; tak więc trzecia pozycja mniej prawdopodobnie jest G, podczas gdy drugą pozycją jest C, jak w kodonach dla alaniny, proliny, seryny i treoniny; a tryplety CGX dla argininy są w zasadzie nieużywane.

Tab e l a 1:

Częstość występowania kodonów w genie env Illb HIV-1 i w ludzkich genach o wysokiej ekspresji.

	Wysoka	Env		Wysoka	Env
Ala	Cys
1	2	3	4	5	6	7	8
GC	C	53	27	TG	C	68	16
	T	17	18		T	32	84
	A	13	50
	G	17	5	Gln
				CA	A	12	55
Arg					G	88	45
CG	C	37	0
	T	7	4	Glu

PL 191 300 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
	A	6	0	GA	A	25	67
	G	21	0		G	75	33
AG	A	10	88
	G	18	8	Gly
				GG	C	50	6
Asn					T	12	13
AA	C	78	30		A	14	53
	T	22	70		G	24	28
Asp				His
GA	C	75	33	CA	C	79	25
	T	25	67		T	21	75
				Ile
				AT	C	77	25
					T	18	31
					A	5	44
Leu				Ser
CT	C	26	10	TC	C	28	8
	T	5	7		T	13	8
	A	3	17		A	5	22
	G	58	17		G	9	0
TT	A	2	30	AG	C	34	22
	G	6	20		T	10	41
Lys				Thr
AA	A	18	68	AC	C	57	20
	G	82	32		T	14	22
	A	14	51		G	15	7
Pro				Tyr
CC	C	48	27	TA	C	74	8
	T	19	14		T	26	92
	A	16	55
	G	17	5
Phe				Val
TT	C	80	26	GT	C	25	12
	T	20	74		T	7	9
					A	6	62
					G	64	18

PL 191 300 B1

Częstość kodonów obliczono stosując program GCG wykonany przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Liczby oznaczają procent przypadków, w których występuje konkretny kodon. Częstości stosowania kodonów genów otoczki innych izolatów wirusa HIV-1 są porównywalne i wykazują podobną tendencję.

W celu wytworzenia genu gp120 zdolnego do wysokiego poziomu ekspresji w komórkach ssaka skonstruowano syntetyczny gen kodujący segment gp120 HIV-1 (syngp120mn), oparty na sekwencji najpospolitszego północnoamerykańskiego podtypu, HIV-1 MN (Shaw i wsp., Science 226:1165, 1984;Galloiwsp.,Nature 321:119, 1986). W tym syntetycznym genie gp120prawie wszystkie natywne kodony zastąpiono systematycznie kodonami najczęściej stosowanymi w ludzkich genach o wysokiej ekspresji (fig. 1). Ten syntetyczny gen zestawiono z chemicznie zsyntetyzowanych oligonukleotydów mających po 150 do 200 zasad długości. Jeśli oligonukleotydy przekraczające 120 do 150 zasad zsyntetyzuje się chemicznie, procent pełnej długości produktu może być niski, a znaczna większość materiału składa się z krótszych oligonukleotydów. Ponieważ te krótsze fragmenty hamują klonowanie i procedury PCR, może być bardzo trudne stosowanie oligonukleotydów przekraczających pewną długość. W celu zastosowania surowego materiału z syntezy bez wcześniejszego oczyszczania, jednoniciowe grupy oligonukleotydów wzmacniano PCR przed klonowaniem. Produkty PCR oczyszczano na żelach agarozowych i stosowano jako wzorce w dalszym etapie PCR. Dwa sąsiadujące fragmenty można wspólnie wzmacniać ze względu na nakładające się sekwencje na końcu każdego fragmentu. Te fragmenty, które miały pomiędzy 350 i 400 par zasad, subklonowano do pochodzącego z pCDM7 plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5, a następnie polilinker Nhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1. Każdy z enzymów restrykcyjnych w tym polilinkerze oznacza miejsce obecne na końcach 5' lub 3' wytworzonych w PCR fragmentów. Tak więc przez kolejne subklonowanie każdego z 4 długich fragmentów zestawiono cały gen gp120. Dla każdego fragmentu subklonowano trzy do sześciu różnych klonów i sekwencjonowano przed składaniem. Schematyczny szkic sposobu użytego do konstruowania syntetycznego gp120 pokazano na fig. 2. Sekwencja syntetycznego genu gp120 (i syntetycznego genu gp160 utworzonego z użyciem tego samego podejścia) przedstawiono na fig. 1.

Szybkość mutacji była znacząca. Najczęściej spotykane mutacje były delecjami krótkimi (1nukleotyd) i długimi (do 30 nukleotydów). W pewnych przypadkach była konieczna wymiana części z syntetycznymi adapterami lub kawałkami innych subklonów bez mutacji w tym konkretnym regionie. Pewne odchylenia od ścisłego trzymania się optymalizowanego zastosowania kodonów wykonano dla przystosowania do wprowadzenia miejsca restrykcji do powstałego genu dla ułatwienia zastępowania różnych segmentów (fig. 2). Te unikalne miejsca restrykcjiwprowadzono do genu w odstępach około 100 par zasad. Natywną sekwencję liderową HIV wymieniono na wysoce wydajny liderowy peptyd ludzkiego antygenu CD5 dlaułatwienia sekrecji (Aruffo i wsp., Cell 61:1303, 1990).Plazmid użyty do konstrukcji jest pochodną wektora ekspresji ssaka pCDM7 transkrybującegowstawiony gen pod kontrolą silnego ludzkiego natychmiastowego wczesnego promotora CMV.

Dla porównania dzikiego typu i syntetycznej sekwencji kodującej gp120, syntetyczną sekwencję kodującą gp120 wstawiono do wektora ekspresji ssaka i testowano w próbach przejściowej transfekcji. Kilka różnych natywnych genów gp120 użyto jako kontrolnych dla wykluczenia wahań w poziomach ekspresji pomiędzy różnymi izolatami wirusa i artefaktami indukowanymi przez odmienne sekwencje liderowe. Konstrukt gp120 HIV Illb użyty jako kontrolny wytworzono metodą PCR stosując fragment otoczki HXB2 HIV-1Sal1/Xho1jako wzorzec. Dla wykluczenia indukowanych PCR mutacji, fragment Kpn1/Ear1 zawierający około 1,2 tys. par zasad genu wymieniono na odpowiednią sekwencję prowirusowego klonu. Dzikiego typu konstrukty gp120mn użyte jako kontrolne klonowano metodą PCR z zainfekowanych HIV-1 MN komórekC8166 (AIDS Repository, Rockville, MD) i otrzymywano ekspresję gp120 z natywną otoczką lub sekwencją liderową CD5. Ponieważ prowirusowe klony nie były dostępne w tym przypadku, dwa klony każdego konstruktu testowano dla uniknięcia artefaktów PCR. Dla określenia wielkości sekrecji gp120 półilościowe supernatanty komórek 293T przejściowo transfekowane przez współstrącanie z fosforanem wapnia immunoprecypitowano rozpuszczalnym fuzyjnym białkiem CD4:immunoglobulina i Sepharose białka A.

Wyniki tej analizy (fig. 3) pokazują, że syntetyczny produkt genowy ulega ekspresji na bardzo wysokim poziomie wporównaniu z natywnym kontrolnym gp120. Masa cząsteczkowa syntetycznego genu gp120 była porównywalna z masą kontrolnych białek (fig. 3) i mieściła się w zakresie od 100 do 110 kDa. Nieco szybsza migracja może być wyjaśniona faktem, że w pewnych liniach komórkowych nowotworów, np., 293T, glikozylowaniejestniekompletnelubzmienionedopewnegostopnia.

PL 191 300 B1

Dla porównania ekspresji dokładniej poziomy białka gp120 oceniono ilościowo stosując ELISA gp120 z CD4 w unieruchomionej fazie. Ta analiza pokazuje (fig. 4) że dane ELISA były porównywalne z danymi z immunoprecypitacji, ze stężeniemgp120 około 125 ng/ml dla syntetycznego genu gp120 i mniejszym niż wartość tła (5 ng/ml) dla wszystkich natywnych genów gp120. Tak więc ekspresja syntetycznego genu gp120 okazuje się być co najmniej jeden rząd wielkości wyższa niż dzikiego typu genów gp120. W pokazanym eksperymencie wzrost był co najmniej 25-krotny.

Rolarevwekspresjigp120

Ponieważ revwydaje się wywierać działanie na kilka etapów ekspresji wirusowego transkryptu, zbadano możliwą rolę nietranslacyjnych efektów w polepszonej ekspresji syntetycznego genu gp120. Po pierwsze, dla wykluczenia możliwości, że elementy sygnalizacji negatywnej powodujące zwiększoną degradację mRNA lub retencję jądrową usunięto zmieniając sekwencję nukleotydową, zbadano cytoplazmatyczne poziomy mRNA. Cytoplazmatyczny RNA wytworzono przez lizę NP40 przejściowo transfekowanych komórek 293T i następną eliminację jąder przez odwirowanie. Cytoplazmatyczny RNA wytworzono następnie z lizatów metodą wielokrotnej ekstrakcji fenolem i strącania, umieszczono na nitrocelulozie stosując szczelinowy aparat do hybrydyzacji na koniec hybrydyzowano ze specyficzną dla otoczki sondą.

Krótko, cytoplazmatyczny mRNA z komórek 293 transfekowanych CDM&, gp120IIIB lub syngp120 wydzielono 36 godzin po transfekcji. Cytoplazmatyczny RNA komórek Hela infekowanych dzikiego typu wirusem krowianki lub rekombinacyjnym wirusem z ekspresją gp120IIIb lub syntetycznego genu gp120 pod kontroląpromotora 7.5 wydzielono 16 godzin po infekcji. Równe ilości umieszczono na nitrocelulozie stosując szczelinowy aparat do hybrydyzacji i hybrydyzowano ze stochastycznie znakowanymi fragmentami 1,5 tys. par zasad gp120IIIbi syngp120 lub ludzką beta-aktyną. Poziomy ekspresji RNA oceniono ilościowo przeglądając hybrydyzowane membrany fosfoimagerem. Procedury użyte opisano dokładniej poniżej.

Ten eksperyment wykazał, że nie było znaczącej różnicy w poziomach mRNA komórek transfekowanych natywnym lub syntetycznym genem gp120. Istotnie, w pewnych eksperymentach cytoplazmatyczne poziomy mRNA syntetycznego genu gp120 były nawet niższe niż dla natywnego genu gp120.

Te dane potwierdził pomiar ekspresji rekombinacyjnego wirusa krowianki. Ludzkie komórki 293 lub komórki Hela zainfekowano wirusem krowianki z ekspresją dzikiego typu gp120IIIb lub syngp120mn w liczebności infekcji co najmniej 10. Supernatanty zebrano 24 godziny po infekcji i immunoprecypitowano fuzyjnym białkiem CD4:immunoglobina i Sepharose białka A. Procedury użyte w tym doświadczeniu są opisane bardziej szczegółowo poniżej.

Ten eksperyment pokazał, że zwiększona ekspresja syntetycznego genu była nadal obserwowana, gdy endogenny produkt genowy i syntetyczny produkt genowy poddano ekspresji z rekombinantów wirusa krowianki pod kontrolą silnego mieszanego wczesnego i późnego promotora 7.5k. Ponieważ mRNA wirusa krowianki są transkrybowane i translowane w cytoplazmie, zwiększona ekspresja syntetycznej otoczki genu w tym doświadczeniu nie może być przypisana polepszonemu eksportowi z jądra. Ten eksperyment powtórzono w dwu dodatkowych typach ludzkich komórek, linii komórek raka nerki 293 i komórek Hela. Jak dla transfekowanych komórek 293T, poziomy mRNA były podobne w komórkach 293 infekowanych rekombinacyjnym wirusem krowianki. Użycie kodonów w lentiwirusie.

Ponieważ okazuje się, że użycie kodonów ma znaczący wpływ na ekspresję w komórkach ssaka, zbadano częstość kodonów w genach otoczki innych retrowirusów. To studium nie dało wyraźnego wzoru preferencji kodonów ogólnie pomiędzy retrowirusami. Jednakże gdy wirusy z rodzaju lentiwirusów, do których należy HIV-1, zanalizowano odrębnie, znaleziono tendencję użycia kodonów prawie identyczną jak dla HIV-1. Utworzono tabelę częstotliwości kodonów z otoczki glikoproteinowejróżnych (głównie typu C) retrowirusów poza lentiwirusami i porównano częstości kodonów z tabeliutworzonej dla sekwencji otoczki czterech lentiwirusów nie związanych zbyt ściśle z HIV-1(wirus koziego zapalenia stawów i mózgu, koński wirus zakaźnej anemii, koci wirus braku odporności, oraz wirus visna) (tabela2). Wzór użycia kodonów dla lentiwirusów jest uderzająco podobny do wzoru dla HIV-1, we wszystkich przypadkach poza jednym, korzystny kodon dla HIV-1jest taki sam jak korzystny kodon dla innych lentiwirusów. Wyjątkiem jest prolina, która jest kodowana przez CCT w 41% reszt otoczek lentiwirusowych nie-HIV, i przez CCA w 40% reszt, sytuacja także jasno odzwierciedlająca znaczącą preferencję dla trypletu kończącego się na A. Wzór użycia kodonów przez nie-lentiwirusowe białka otoczki nie pokazuje podobnej przewagi reszt A, i nie jest także przesunięty w kierunku reszt z trzecią

PL 191 300 B1 pozycją C i G, jak dla użycia kodonów ludzkich genów o wysokiej ekspresji. Ogólnie nie-lentiwirusowe retrowirusy wydają się wykorzystywać różne kodony bardziej równomiernie, według wzoru dzielonego z ludzkimi genami o słabszej ekspresji.

Tab e l a 2:

Częstość kodonów w genie otoczki lentiwirusów(lenti) i nie-lentiwirusowych retrowirusów (inne)

		Inne	Lenti			Inne	Lenti
1	2	3	4	5	6	7	8
Ala				Cys
GC	C	45	13	TG	C	53	21
	T	26	37		T	47	79
	A	20	46
	G	9	3	Gln
				CA	A	52	69
Arg					G	48	31
CG	C	14	2
	T	6	3	Glu
	A	16	5	GA	A	57	68
	G	17	3		G	43	32
AG	A	31	51
	G	15	26	Gly
				GG	C	21	8
Asn					T	13	9
AA	C	49	31		A	37	56
	T	51	69		G	29	26
Asp					His
GA	C	55	33	CA	C	51	38
	T	51	69		T	49	62
				Ile
				AT	C	38	16
					T	31	22
					A	31	61
Leu				Ser
CT	C	22	8	TC	C	38	10
	T	14	9		T	17	16
	A	21	16		A	18	24
	G	19	11		G	6	5
TT	A	15	41	AG	C	13	20
	G	10	16		T	7	25
Lys				Thr
AA	A	60	63	AC	C	44	18

PL 191 300 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7	8
	G	40	37		T	27	20
	A	19	55
Pro					G	10	8
CC	C	42	14
	T	30	41	Tyr
	A	20	40	TA	C	48	28
	G	7	5		T	52	72
Phe				Val
TT	C	52	25	GT	C	36	9
	T	48	75		T	17	10
	A	22	54		G	25	27

Częstość kodonów obliczono stosując program GCG opracowany przez University of Wisconsin Genetics Computer Group. Liczby oznaczają procent, w którym jest używany konkretny kodon. Użycie kodonów nie-lentiwirusowych retrowirusów zestawiono z sekwencji prekursora otoczki bydlęcego wirusa białaczki, kociego wirusa białaczki, ludzkiego wirusa białaczki komórek T typu I, ludzkiego limfotropowego wirusa komórek T typu II, izolatu wirusa mysiej białaczki nakierowanego na komórki norki (MuLV), izolatu Rauschera nakierowanego na komórki śledziony, izolatu 10A1, amfotropowego izolatu 4070A i izolatu wirusa białaczki szpikowej, oraz wirusa białaczki szczura, wirusa mięsaka małpy, wirusa małpiej białaczki komórek T, leukemogennego retrowirusa T1223/B i wirusa małpiej białaczki gibbona. Tabele częstość kodonów dla lentiwirusów nie-HIV, nie-SIV zebrano z sekwencji prekursora otoczki dla wirusa koziego zapalenia stawów i mózgu, końskiego wirusa zakaźnej anemii, kociego wirus braku odporności, oraz wirusa visna.

Poza przewagą kodonów zawierających A, lentiwirusowe kodony trzymają się wzorca HIV silnego niedoreprezentowania CpG, tak że trzecia pozycja trypletów alaniny, proliny, seryny i treoniny rzadko jest G. Tryplety retrowirusowej otoczki pokazują podobne, lecz słabiej zaznaczone, niedoreprezentowanie CpG. Najbardziej oczywista różnica pomiędzy lentiwirusami i innymi retrowirusami ze względu na przewagę CpG leży w użyciu wariantu CGX trypletów argininy, który jest dość często reprezentowany pośród sekwencji kodującej retrowirusowej otoczki, lecz prawie nigdy nie jest obecny w porównywalnych sekwencjach lentiwirusa.

Różnice w zależności od rev pomiędzy natywnym i syntetycznym gp120

Dla zbadania, czy regulacja przy pomocy rev jest związana z użyciem kodonów HIV-1, zbadano wpływ rev na ekspresję natywnego i syntetycznego genu. Ponieważ regulacja przy pomocy rev wymaga miejsca wiązania rev RRE w cis, utworzono konstrukty, w których to miejsce wiązania było klonowane do nietranslowanego regionu 3' natywnego i syntetycznego genu. Te plazmidy współtransfekowano rev lub kontrolnym plazmidem w trans do komórek 293T, i mierzono poziomy ekspresji gp120 w supernatantach półilościowo metodą immunoprecypitacji. Procedury zastosowane w tym doświadczeniu opisano szczegółowo poniżej.

Jak pokazano na fig. 5Ai fig. 5B, rev reguluje w górę natywny gen gp120, ale nie mawpływu na ekspresję syntetycznego genu gp120. Tak więc działanie rev nie jest oczywiste na substracie pozbawionym sekwencji kodującej endogenne wirusowe sekwencje otoczki.

Ekspresja syntetycznego genu ratTHY-1 z kodonami HIV otoczki

Powyżej opisany eksperyment sugeruje, że w istocie sekwencje otoczki muszą być obecne dla potrzeby regulacji rev. W celu sprawdzenia tej hipotezy, syntetyczną wersję genu kodującego małe, typowo o dużej ekspresji białko powierzchni komórki, antygen ratTHY-1. Syntetyczną wersję genu ratTHY-1 zaprojektowano z użyciem kodonów takim, jak w gp120 HIV. Przy projektowaniu tego genu unikano syntetycznych sekwencji AUUUA, który są związane z niestabilnością mRNA. Ponadto wprowadzono dwa miejsca restrykcji dla uproszczenia manipulacji powstałym genem (fig. 6). Syntetyczny gen z użyciem kodonów otoczki HIV (rTHY-1env) wytworzono stosując trzy mające 150 do 170 merów

PL 191 300 B1 oligonukleotydy (fig. 7). W przeciwieństwie do genu syngp120mn, produkty PGR bezpośrednio klonowano i złożono w pUC12, i z kolei klonowano do pCDM7.

Poziomy ekspresji natywnego rTHY-1 i rTHY-1 z kodonami otoczki HIV oceniono ilościowo metodą immunofluorescencji przejściowo transfekowanych komórek 293T. Fig. 8 pokazuje, że ekspresja natywnego genu THY-1 jest prawie o dwa rzędy wyższa od poziomu tła kontrolnych transfekowanych komórek (pCDM7). Przeciwnie, ekspresja syntetycznego ratTHY-1 jest znacząco niższa niż ekspresja natywnego genu (pokazana przez przesunięcie piku w kierunku niższego numeru kanału).

Dla wykazania, że nie wprowadzono nieodwracalnie negatywnych elementów sekwencji promujących degradację mRNA, wytworzony konstrukt, w którym gen rTHY-1env był klonowany na końcu 3' z syntetycznym genem gp120 (fig. 9B). W tym doświadczeniu komórki 293T transfekowano genem syngp120mn lub fuzyjnym genem syngp120/ratTHY-1env (syngp120mn.rTHY-1env). Ekspresję mierzono metodą immunoprecypitacji z fuzyjnym białkiem CD4:IgG i agarozą białka A. Procedury użyte w tym doświadczeniu opisano szczegółowo powyżej.

Ponieważ syntetyczny gen gp120 ma kodon stopu UAG, rTHY-1env nie jest translowany z tego transkryptu. Jeśli negatywne elementy powodujące przyspieszoną degradację są obecne w sekwencji, poziomy białek gp120 z ekspresji z tego konstruktu powinny zmniejszyć się w porównaniu z konstruktem syngp120mn bez rTHY-1env. Fig. 9A pokazuje, że ekspresja obu konstruktów jest podobna, wskazując na to, że niska ekspresja musi być związana z translacją.

Zależnaod rev ekspresja syntetycznego genu ratTHY-1 z kodonami otoczki

Dla zbadania, czy rev może regulować ekspresję genu ratTHY-1 mającego kodony env, wykonano konstrukt z miejscem wiązania rev na końcu 3' otwartej ramki odczytu rTHY-1env. Dla zmierzenia odpowiedzi na rev konstruktu ratTHY-1env mającego 3' RRE, ludzkie komórki 293T współtransfekowano ratTHY-1envrre i CDM7 lub pCMVrev. W 60 godzin po transfekcji komórki odłączono 1 mM EDTA w PBS i zabarwiono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX-7 anty-rTHY-1 i drugorzędowym sprzężonym z FITC przeciwciałem. Natężenie fluorescencji mierzono stosując cytofluorometr EPICS XL. Te procedury opisano szczegółowo powyżej.

W powtórzonych eksperymentach wykryto słaby wzrost ekspresji rTHY-1env, jeśli rev współtransfekowano genem rTHY-1env. Dla dalszego zwiększenia wrażliwości układu próby wytworzono konstrukt dający ulegającą ekspresji i sekrecji wersję rTHY-1env. Ten konstrukt powinien dawać pewniejsze dane, ponieważ łączna ilość ulegającego sekrecji białka w supernatancie odzwierciedla wynik wytwarzania białka przez dłuższy czas, w przeciwieństwie do białka z ekspresją powierzchniową, które wydaje się silniej odzwierciedlać bieżącą szybkość wytwarzania. Gen zdolny do ekspresji ulegającej sekrecji formy wytworzonometodąPCRstosującstarterynormalnei odwrotne zgrzewające koniec 3' endogennej sekwencji liderowej i koniec 5' motywu sekwencji koniecznego do zakotwiczenia glikanu fosfatydylo-inozytolu, odpowiednio. Produkt PCR klonowano do plazmidu, który już zawierał sekwencję liderową CDS, tworząc w ten sposób konstrukt, w którym wycięto zakotwiczenie membrany i sekwencję liderową wymieniono na heterologiczny (i zapewne bardziej skuteczny) peptyd liderowy.

Odpowiedź na rev ulegającej sekrecji formy ratTHY-1env mierzono metodą immunoprecypitacji supernatantów ludzkich komórek 293T współtransfekowanych plazmidem ekspresji ulegającej sekrecji formy ratTHY-1env i sekwencji RRE w cis (rTHY-1envPI-rre) i CDM7 lub pCMVrev. Konstrukt rTHY1envPI-RRE wytworzono metodą PCR stosując oligonukleotyd: cgcggggctagcgcaaagagtaataagtttaac (SEKW. NR ID.:38) jako starter normalny, oligonukleotyd: cgcggatcccttgtattttgtactaata (SEKW. NR

ID.:39) jako starter odwrotny, i syntetyczny konstrukt rTHY-1env jako wzorzec. Po trawieniu Nhe1 i Not1 fragment PCR klonowano do plazmidu zawierającego lider CD5i sekwencje RRE. Supernatan35 ty znakowanych ³⁵S komórek zbierano 72 godziny po transfekcji, strącono mysimi monoklonalnymi przeciwciałami OX7 wobec rTHY-1 i anty-mysią Sepharose IgG, i podano na 12% redukującą SDSPAGE.

W tym doświadczeniu indukcja rTHY-1env przez rev była znacznie wyraźniejsza i wyrazistaniż w powyżej opisanym eksperymencie i silniej sugeruje, że rev może translacyjnie regulować transkrypty, które są tłumione przez kodony rzadziej stosowane.

Niezależna odrev ekspresja białka fuzyjnego rTHY-1env:immunoglobulina

Dla sprawdzenia, czy rzadziej stosowane kodony muszą być obecne w całej sekwencji kodującej lub wystarczy krótki region dla nadania reaktywności na rev, wytworzono fuzyjne białko rTHY1env:immunoglobulina. W tym konstrukcie gen rTHY-1env (bez motywu sekwencji odpowiedzialnej za zakotwiczenie glikanu fosfatydylo-inozytolu) jest związany z zawiasem ludzkiej IgG1, domenami CH2 i CH3. Ten konstrukt wytworzono metodą kotwiczącego PCR stosując startery z miejscami restrykcji

PL 191 300 B1

Nhe1i BamH1oraz rTHY-1envjako wzorcem. Fragment PCR klonowano do plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5 i zawias, części CH2 i CH3 ludzkiej immunoglobuliny IgG1. Fragment Hind3/Eag1 zawierający insert rTHY-1enveg1 klonowano następnie do pochodzącego z pCDM7 plazmidu z sekwencją RRE.

Dla zmierzenia odpowiedzi fuzyjnego genu rTHY-1env/immunoglobina (rTHY-1enveg1rre) na ludzkie komórki 293T rev współtransfekowane rTHY-1enveg1rre i pCDM7 lub pCMVrev. Konstrukt rTHY-1enveg1rre utworzono metodą kotwiczącego PCR z użyciem normalnych i odwrotnych starterów z miejscami restrykcji Nhe1i BamH1, odpowiednio. Fragment PCR klonowano do plazmidu zawierają35 cego lider CD5 i ludzki zawias IgG1, domeny CH2 i CH3. Supernatanty znakowanych ³⁵S komórek znakowano 72 godziny po transfekcji, strącono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX7 wobec rTHY-1 i anty-mysią Sepharose IgG, i wprowadzono na 12% redukującą SDS-PAGE. Użyte procedury opisano szczegółowo powyżej.

Jak przy produkciegenu rTHY-lenvPI-, to fuzyjne białko rTHY-1env/immunoglobulina ulega sekrecji do supernatantu. Tak więc ten gen powinien odpowiadać za indukcję rev. Jednakże w przeciwieństwie do rTHY-1envPI-, współtransfekcja rev w trans indukuje żaden lub tylko pomijalny wzrost ekspresji rTHY-1enveg1.

Ekspresję fuzyjnego białka rTHY-1: immunoglobulina z natywnymi kodonami otoczki rTHY-1 lub HIV mierzono metodą immunoprecypitacji. Krótko, ludzkie komórki 293T transfekowano rTHY1enveg1 (kodony env) lub rTHY-1wteg1 (kodony natywne). Konstrukt rTHY-1wteg1 wytworzono w sposób podobny do zastosowanego dla konstruktu rTHY-1enveg1, poza tym, że plazmid zawierają35 cy natywny gen rTHY-1 użyto jako wzorzec. Supernatanty znakowanych ³⁵S komórek zebrano 72 godzin po transfekcji,strącono mysim monoklonalnym przeciwciałem OX7 wobec rTHY-1 i anty-mysią Sepharose IgG, i wprowadzono na 12% redukującą SDS-PAGE. Użyte procedury opisano szczegółowo poniżej.

Poziomy ekspresji rTHY-1enveg1 zmalały w porównaniu z podobnym konstruktem z dzikiego typu rTHY-1 jako fuzyjnym partnerem, lecz były wciąż znacznie wyższe niż dla rTHY-1env. Odpowiednio, obie części fuzyjnego białka wpływały na poziomy ekspresji. Dodanie rTHY-1env nie ogranicza ekspresji do równych poziomów, jak widać dla samego rTHY-1env. Tak więc regulacja przez rev wydaje się być nieskuteczna, jeśli białkoekspresyjneniejestprawiecałkowiciewytłumione.

PreferencjakodonówwgenachotoczkiHIV-1.

Bezpośrednie porównanie pomiędzy częstotliwością użycia kodonów w otoczce HIV i ludzkich genach o silnej ekspresji ujawnia uderzającą różnicę dla wszystkich 20 aminokwasów.Jedną prostą miarą statystycznego znaczenia tej preferencji kodonów jest stwierdzenie, że pośród 9 aminokwasów z podwójną degeneracją kodonów korzystną trzecią resztą jest A lub U we wszystkich dziewięciu. Prawdopodobieństwo, że wszystkie 9 z dwu równie prawdopodobnych wyborów będą takie same, wynosi około 0,004, a więc w dowolnej konwencjonalnej mierze dobór trzeciej reszty nie może być uważany za przypadkowy. Dalsze dowody tendencji w preferencji kodonów znajdują się pośród bardziej zdegenerowanych kodonów, gdzie można widzieć silną selekcję trypletów niosących adeninę. Jest to przeciwieństwem wzoru dla genów o silnej ekspresji, która faworyzuje kodony niosące C, lub rzadziej G, w trzecim położeniu kodonów z potrójną lub wyższą degeneracją.

Systematyczna wymiana natywnych kodonów na kodony ludzkich genów o silnej ekspresji dramatycznie zwiększała ekspresję gp120. Ilościowa analiza metodą ELISA pokazała, że ekspresja syntetycznego genu była co najmniej 25-krotnie wyższa w porównaniu z natywnym gp120 po przejściowej transfekcji do ludzkich komórek 293. Poziomy stężeń w eksperymencie ELISA okazały się raczej niskie. Ponieważ ELISA użyta do kwantyfikacji byłaoparta na wiązaniu gp120 do CD4, wykryto tylko na tywny, nie denaturowany materiał. Może to wyjaśnić pozorną niską ekspresję. Pomiar poziomów cytoplazmatycznego mRNA pokazuje, że różnica w ekspresji białka jest spowodowana różnicami w translacji, a nie trwałością mRNA.

Retrowirusy ogólnie nie wykazują podobnej preferencji dla A i T, jaką znaleziono dla HIV, lecz gdy tę rodzinę podzielono na dwie podgrupy, lentiwirusy i nielentiwirusowe retrowirusy, wykryto podobną preferencję dla A i, rzadziej, T, na pozycji trzeciego kodonu dla lentiwirusów. Tak więc dowody sugerują, że lentiwirusy zachowują charakterystyczny wzór otoczki kodonów, nie z powodu nieodłącznej przewagi odwrotnej transkrypcji lub replikacji takich reszt, lecz z pewnego powodu osobliwego z punktu widzenia fizjologii tej klasy wirusów. Główną różnicą pomiędzy lentiwirusami i niekompleksowymi retrowirusami są dodatkowe regulacyjne i nie zasadnicze pomocnicze geny w lentiwirusach, jak już wspomniano. Tak więc jedno proste wyjaśnienie restrykcji dla ekspresji otoczki może być takie, że

PL 191 300 B1 może być oparty na niej ważny regulacyjny mechanizm jednej z tych dodatkowych cząsteczek. W istocie, wiadomo, że jednego z tych białek, rev, które najprawdopodobniej ma homologi we wszystkich lentiwirusach. Tak więc dane użycia kodonów w wirusowym mRNA stosuje się do utworzenia klasy transkryptów, które są podatne na stymulujące działanie rev. Tę hipotezę sprawdzono stosując podobną strategię jak powyżej, lecz tym razem dane użycia kodonów zmieniły się w kierunki przeciwnym. Użycie kodonów z komórkowego genu o silnej ekspresji zamieniono na najczęściej stosowane kodony w otoczce HIV. Jak zakładano, poziomy ekspresji były wyraźnie niższe w porównaniu z natywną cząsteczką, prawie o dwa rzędy wielkości, gdy analizowano je metodą immunofluorescencji cząsteczki z ekspresją na powierzchni. Jeśli rev ulegał współekspresji w trans i element RRE był obecny w cis, dla powierzchniowej cząsteczki wykrywano tylko słabą indukcję, jednakże jeśli THY-1 ulegał ekspresji jako ulegająca sekrecji cząsteczka, indukcja przez rev była znacznie bardziej wyraźna, wspierając powyższą hipotezę. Można to zapewne wyjaśnić akumulacją sekrecyjnego białka w supernatancie, co znacząco wzmacnia wpływ rev. Jeśli rev indukuje ogólnie tylko maływzrost dla powierzchniowych cząsteczek, indukcja otoczki HIV przez rev nie może mieć na celu zwiększenia występowania na powierzchni, lecz zwiększenia wewnątrzkomórkowego poziomu gp160. Zupełnie nie wiadomo obecnie, dlaczego tak powinno być.

Dla zbadania, czy małe niecałkowite elementy genu są dostateczne do ograniczenia ekspresji i spowodowania jej zależności od rev, wytworzono fuzyjne białka rTHY1env:immunoglobulina, gdzie tylko około jednej trzeciej całego genu wykazywało użycie kodonów jak w otoczce. Poziomy ekspresji tego konstruktu miały poziom pośredni, wskazując, że negatywny element sekwencja rTHY-1env nie jest dominujący nad częścią immunoglobulinową. To fuzyjne białko nie reagowało lub reagowało słabo na rev, co wskazuje, że tylko geny prawie całkowicie stłumione mogą reagować na rev.

Inną charakterystyczną cechą odkrytą w tabelach częstości kodonów jest zaskakujące niedoreprezentowanie trypletów CpG. W porównawczym studium użycia kodonów w E. coli, drożdżach, muszkach owocowych i naczelnych wykazano, że w znacznej liczbie zanalizowanych genów naczelnych 8 ostatnio użytych kodonów zawiera wszystkie kodony z sekwencją dwu nukleotydową CpG. Unikanie kodonów zawierających ten dwunukleotydowy motyw odkryto także w sekwencji innych retrowirusów. Wydaje się możliwe, że powodem niedoreprezentowania niosących CpG trypletów ma coś wspólnego z unikaniem uciszania genu przez metylowanie cytozyn CpG. Spodziewana liczba dwunukleotydów CpG dla HIV jako całości wynosi około jednej piątej wartości spodziewanej na podstawie zasadniczej kompozycji. Może to wskazywać, że możliwość wysokiej ekspresji jest zachowywana, i że gen w istocie musi mieć silną ekspresję w pewnym punkcie podczas wirusowej patogenezy.

Wyniki przedstawione tutaj jasno wskazują, że preferencja kodonów ma silnywpływ na poziomy białka i sugerują, że wydłużenie translacyjne kontroluje ekspresję genu ssaka. Jednakże inne czynniki mogą grać tutaj rolę. Po pierwsze, nadmiar wcale nie w pełni obciążonych mRNA w eukariotycznych komórkach wskazuje, że inicjacja ogranicza szybkościowo translację w co najmniej pewnych przypadkach, ponieważ przeciwnie wszystkie transkrypty będą całkowicie pokryte rybosomami. Ponadto jeśli wyłączanie rybosomu i dalsza degradacja mRNA byłoby tym mechanizmem, zahamowanie przez rzadkie kodony nie mogłoby być prawdopodobnie odwracane żadnym regulacyjnym mechanizmem, takim jak przedstawiony tutaj. Jednym możliwym wyjaśnieniem dla wpływu inicjacji i wydłużania na translacyjną aktywność jest to, że szybkość inicjacji lub dostępu do rybosomów, jest kontrolowana częściowo przez elementy sterujące rozłożone w RNA, tak że lentiwirusowe kodony predysponują RNA do umieszczenia w puli słabo inicjowanych RNA. Jednakże takie ograniczenie nie musi być kinetyczne; np., dobór kodonów może wpływać na prawdopodobieństwo, że dany produkt translacji,raz zainicjowany, jest poprawnie kończony. Przy tym mechanizmie nadmiar mniej faworyzowanych kodonów spowoduje znaczące kumulatywne prawdopodobieństwo nieudanego zakończenia rozpoczętego łańcucha polipeptydowego. Zamaskowany RNA uzyska następnie zwiększoną szybkość inicjacji pod działaniem rev. Ponieważ reszty adeninowe występują w nadmiarze w reagujących na rev transkryptach, może być tak, że metylowanie adeniny RNA pośredniczy w tym hamowaniu translacji.

Szczegółowe procedury.

Następujących procedur użyto w powyżej opisanych eksperymentach.

Analizasekwencji

AnalizasekwencjiwykorzystywałaoprogramowanieopracowaneprzezUniversityofWisconsin

ComputerGroup.

PL 191 300 B1

Konstruowanie plazmidów

Konstruowanie plazmidów wykorzystywało następujące sposoby. Wektory i insert DNA trawiono w stężeniu 0,5 μg/10 μΐ w odpowiednim buforze restrykcyjnym przez 1-4 godziny (łączna objętość reakcji około 30 μ^. Trawiony wektor potraktowano 10% (objętościowo) 1 μg/ml zasadowej fosfatazy z jelit cielęcych przez 30 minut przed elektroforezą żelową. Wektor i insert po trawieniu (5 do 10 μΐ każdego) podano na 1,5% niskotopliwy żel agarozowy z buforem TAE. Paski żelu zawierające potrzebne pasma przeniesiono do probówki reakcyjnej 1,5 ml, stopiono w temperaturze 65°C i bezpośrednio podano do ligacji bez usuwania agarozy. Ligacje typowo prowadzono w łącznej objętości 25 μl w 1x niskiego bufora 1x dodatków ligacji z 200-400 U ligazy, 1 μl wektora i 4 μl insertu. Gdy to konieczne, nawisające końce 5' wypełniano dodając 1/10 objętości 250 μΜ dNTP i 2-5 U polimerazy Klenowa do dezaktywowanych przez ogrzanie lub ekstrahowanych fenolem produktów trawienia i inkubacji przez około 20 minut w temperaturze pokojowej. Gdy to konieczne, nawisające końce 3' wypełniono dodając 1/10 objętości 2,5 mM dNTPs i 5-10 U polimerazy DNA T4 do dezaktywowanych przez ogrzanie lub ekstrahowanych fenolem produktów trawienia, następnie inkubując w temperaturze 37°C przez 30 minut. Następujących buforów użyto w tych reakcjach: 10x niski bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3); 10x średni bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3; 10x wysoki bufor (60 mM Tris HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 4 mg/ml BSA, 70 mM b-merkaptoetanolu, 0,02% NaN3); 10x dodatki ligacji (1 mM ATP, 20 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 10 mM spermidyny); 50x TAE (2 M octan Tris, 50 mM EDTA).

Synteza i oczyszczanie oligonukleotydów

Oligonukleotydy wytworzono w syntezatorze Milligen 8750 (Millipore). Kolumny eluowano 1 ml

30% wodorotlenku amonu i eluowane oligonukleotydy odblokowywano w temperaturze 55°C przez 6 do 12 godzin. Po odblokowaniu, wytrącono 150 μl oligonukleotydu 10x objętością nienasyconego n-butanolu w 1,5 ml probówkach reakcyjnych, następnie odwirowano przy 15000 obr. na minutę w mikrowirówce. Peletkę przemyto 70% etanolem i umieszczono w zawiesinie w 50 μl H2O. Stężenie określono mierząc optyczną gęstość przy 260 nm w rozcieńczeniu 1:333 (1 OD260 = 30 μg/ml).

Następujących oligonukleotydów użyto do konstrukcji syntetycznego genu gp120 (wszystkie sekwencje pokazane w tym tekście są w kierunku 5'do 3'). oligo 1normalny (Nhe1): cgc ggg eta gcc acc gag aag ctg (SEKW. NR ID.:1). oligo1 : accgagaagctgtgggtg acc gtgtactacggcgtg ccc gtg tgg aag ag ag gcc acc acc acc ctg ttctgc gcc agc gac gccaaggcgtacgac acc gag gtg cac aac gtg tgg gcc acc cag gcgtgcgtgcccaccgacccc aacccccaggaggtggag ctc gtg aacgtgaccgagaacttc aac at (SEKW. NRID.:2).

oligo 1 wsteczny: cca cca tgt tgt tct tcc aca tgt tga agttct c(SEKW.NRID.:3).

oligo 2 normalny: gac egagaacttcaacatgtggaagaa caa cat (SEKW. NRID.:4) oligo 2: tgg aag aac aac atg gtg gag cag atg cat gag gac atc atc agc ctg tgg gac cag agc ctg aag ccc tgc gtg aag ctg acc cc ctg tgc gtg acc tg aac tgc acc gac ctgaggaac acc acc aacaccaacacagcacc gcc aacaacaacagcaacagcgagggc acc atc aag ggc ggc gag atg (SEKW. NR ID.:5).

oligo 2 wsteczny (Pst1): gttgaagct gcagttctt cat ctc gccgccctt(SEKW.NRID.:6).

oligo 3 normalny (Pst1):gaagaactgcagcttcaa cat cac cac cag c (SEKW. NRID.:7).

oligo 3: aacatc accaccagcatccgcgac aagatgcag aag gagtacgccctgctgtacaagctggat atc gtg agc atc gac aac gac agcaccagctaccgcctgatctcctgcaacaccagcgtgatc acc cag gcc tgc ccc aag atc agc ttc gag ccc atc ccc atc cac tactgcgcccccgccggcttcgcc (SEKW. NRID.:8).

oligo 3 wsteczny: gaa ctt ctt gtcggcggcgaagccggc ggg(SEKW.NRID.:9).

oligo 4 normalny:gcg ccc ccg ccg gct tcg cca tcc tga agt gca acg aca aga agt tc (SEKW. NR ID.:10) oligo 4: gccgac aag aag ttc agc ggc aag ggc agc tgc aag aacgtgagcaccgtgcagtgcacccacggcatccggccg gtg gtg agcacccagctcctgctgaacggcagcctggccgaggag gag gtg gtgatccgcagcgagaacttcaccgacaacgccaagaccatc atc gtgcacctgaat gag agc gtg cag atc (SEKW. NR ID.:1 1)

PL 191 300 B1 oligo 4 wsteczny (Mlu1):agttgggacgcgtgcagttgatct gcacgctctc(SEKW.NRID.:12).

oligo 5 normalny (Mlu1):gagagcgtgcagatcaactgcacg cgt ccc (SEKW . N R ID.:13). oligo 5:aactgcacgcgtcccaactacaacaagcgcaagcgc atccacatcggccccgggcgcgccttctacaccaccaagaacatc atc ggc acc atc ctc cag gcc cac tgc aac atc tct aga (SEKW. NR ID.:14).

oligo 5 wsteczny: gtc gtt cca ctt ggc tct aga gat gtt gca(SEKW.NRID.:15).

oligo 6 normalny: gca aca tct eta gag cca agt gga acg ac (SEKW. NR ID.:16).

oligo 6: gcc aag tgg aac gac acc ctg cgc cag atc gtg agc aagctgaaggagcagttcaagaacaagaccatcgtgttcaccag agc agc ggc ggc gac ccc gag atc gtg atg cac agc ttc aac tgc ggcggc(SEKW.NRID.:17).

oligo 6 wsteczny (EcoR1): gca gta gaa gaa ttc gcc gcc gcagttga(SEKW.NRID.:18). oligo 7 normalny (EcoR1): tca act gcg gcg gcg aat tct tct act gc (SEKW. NR ID.:19). oligo 7: ggcgaattcttctactgcaacaccagccccctgttc aac agc acc tgg aac ggc aac aac acc tgg aac aac acc acc ggc agc aac aac aat att acc ctc cag tgc aag atc aag cag atc atc aac atg tgg cag gag gtg ggc aag gcc atg tac gcc ccc ccc atc gag ggc cag atc cgg tgc agc agc (SEKW . NR ID.:20) oligo 7 wsteczny:gcagaccggtgatgttgctgctgcacc ggatctggccctc(SEKW.NRID.:21).

oligo 8 normalny: cga ggg cca gat ccg gtg cag cag caa cat cac cgg tct g (SEKW . NRID.:22).

oligo 8:aacatcaccggtctgctgctgacccgcgacggcggc aaggacaccgacaccaacgacaccgaaatcttccgccccggcggc ggcgacatgcgcgacaactggagatctgagctgtacaagtacaag gtggtgacgatcgagcccctgggcgtggcccccaccaaggccaag cgccgcgtggtgcagcgcgagaagcgc(SEKW.NRID.:23).

oligo 8 wsteczny (Not1): cgc ggg cgg ccg ctt tag cgc ttc tcgcgctgcaccac(SEKW.NRID.:24).

Następujących oligonukleotydów użyto do konstrukcji genu ratTHY-1env.

oligo1normalny(BamH1/Hind3):cgcgggggatccaagctt acc atg att cca gta ata agt (SEKW. NR ID.:25).

oligo 1: atg aat cca gta ata agt ata aca tta tta tta agt gta tta caa atg agt aga gga caa aga gta ata agt tta aca gca tct tta gta aat caa aat ttg aga tta gat tgt aga cat gaa aat aat aca aat ttg cca ata caa cat gaa ttt tca tta acg (SEKW . NR ID.:26).

oligo 1wsteczny (EcoR1/Mlu1): cgc ggg gaa ttc acg cgt taatgaaaattcatgttg(SEKW.NRID.:27).

oligo 2 normalny (BamH1/Mlu1):cgc gga tcc acg cgt gaa aaa aaa aaa cat (SEKW. NR ID.:28).

oligo 2:cgt gaa aaa aaa aaa cat gta tta agt gga aca tta gga gta cca gaa cat aca tat aga agt aga gta aat ttg ttt agt gat aga ttc ata aaa gta tta aca tta gca aat ttt aca aca aaa gat gaa gga gat tat atg tgt gag (SEKW . NR ID.:29).

oligo 2 wsteczny (EcoR1/Sac1): cgc gaa ttc gag ctc aca cat ata atc tcc (SEKW. NR ID.:30). oligo 3 normalny (BamH1/Sac1):cgc gga tcc gag ctc aga gta agt gga caa (SEKW. NR ID.:31).

oligo 3:ctc aga gta agt gga caa aat cca aca agt agt aat aaa aca ata aat gta ata aga gat aaa tta gta aaa tgt ga gga ata agt tta tta gta caa aat aca agt tgg tta tta tta tta tta tta agttta agt ttt tta caa gca aca gat ttt ata agt tta tga (SEKW. NR ID.:32).

oligo 3 wsteczny (EcoR1/Not1):cgc gaa ttc gcg gcc gct tca taa act tat aaa atc (SEKW. NR ID.:33).

PL 191 300 B1

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Krótkie,nakładającesię15do25-meroweoligonukleotydy zgrzewane na obu końcach użyto do wzmacniania długich oligonukleotydów metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Typowe warunkiPCRto:35cykli,55°Ctemperaturazgrzewania, 0,2 s czas wydłużania. Produkty PCR oczyszczononażelu,ekstrahowanofenolemiużytowdalszymPCRdogenerowaniadłuższychfragmentów obejmujących dwa sąsiadujące małe fragmenty. Te dłuższe fragmenty klonowano do pochodzącego z CDM7 plazmidu zawierającego sekwencję liderową powierzchniowej cząsteczki CD5, następnie polilinkerNhe1/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1.

Następujących roztworów użyto w tych reakcjach: 10x bufor PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris HCl, pH7,5,8mMMgCl2,2mMkażdegodNTP).Końcowybuforuzupełniono10%DMSOdla zwiększenia dokładności polimerazy Taq.

MałoskalowewytwarzanieDNA

Transformowane bakterie hodowano w 3 ml kulturze LB przez ponad 6 godzin lub przez noc. Około 1,5 ml każdej kultury wylano do 1,5 ml probówek wirówkowych, wirowano przez20 s do stanu peletki i zawieszono ponownie w 200 μl roztworu I. Następnie dodano 400 μl roztworu II i 300 μl roztworu III. Probówki wirówkowe zakryto, mieszano i wirowano przez >30 s.Supernatanty przeniesiono do świeżych probówek i raz ekstrahowano fenolem. DNA wytrącono przez napełnienie probówek izopropanolem, zmieszanie i odwirowanie w mikroprobówce przez >2 minuty. Peletki przepłukano w 70% etanolu i zawieszono ponownie w 50 μl dH₂O zawierającej 10 μl RNAse A. Następujących pożywek i roztworów użyto w tych procedurach: pożywki LB (1,0% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdży, 1,0% trypton); roztworu I (10 mM EDTA pH 8,0); roztworu II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); roztworu III (2,5 M KOAc, 2,5 M lodowaty kwas octowy); fenolu (pH ustawione na 6,0, zalane TE); TE (10 mM Tris HCl, pH 7,5,1mM EDTA pH 8,0).

WielkoskalowewytwarzanieDNA

Jednolitrowe kultury transformowanych bakterii hodowano 24 do 36 godzin (MC1061p3 transformowane pochodnymi pCDM) lub 12 do 16 godzin (MC1061 transformowane pochodnymi pUC) w temperaturze 37°C w bakteryjnej pożywce M9 (pochodne pCDM) lub LB (pochodne pUC). Bakterie odwirowano w 1l butlach stosując wirówkę Beckman J6 przy 4200 obrotach na minutę przez 20 minut. Peletkę zawieszono ponownie w 40 ml roztworu I. Następnie dodano 80 ml roztworu II i 40 ml roztworu III i butle wytrząsanodośćenergiczniedopojawieniakawałków2do3mm.Butlęodwirowano przy 4200 obrotach na minutę przez 5 minut i supernatantwylanoprzeztkaninędo250mlbutli.

Izopropanol dodano na wierzch i butlę odwirowano przy 4200 obrotach na minutę przez 10 minut. Peletkę zawieszono ponownie w 4,1ml roztworu I i dodano do 4,5 g chlorku cezu, 0,3 ml 10 mg/mlbromku etydiowego i 0,1 ml roztworu 1% Triton X100. Probówki odwirowano w ultrawirówce Beckman J2 przy 10000 obrotach na minutę przez 5 minut. Supernatant przeniesiono do probówek do ultrawirowania Beckman Quick Seal, które następnie zamknięto i wirowano w ultrawirówce Beckman stosując rotor o stałym kącie NVT90 przy 80000 obrotach na minutę przez >2,5 godziny. Pasmo ekstrahowano w świetle widzialnym stosując 1ml strzykawkę i igłę numer 20. Równą objętość dH2Ododano do ekstrahowanego materiału. DNA ekstrahowano raz n-butanolem nasyconym 1M chlorkiem sodu, następnie dodano równą objętość 10 M octanu amonu/1mM EDTA. Materiał wylano do 13 ml zatrzaskiwanej probówki, którą napełniono do wierzchu absolutnym etanolem, mieszano i odwirowano w wirówce Beckman J2 przy 10000 obrotach na minutę przez 10 min. Peletkę przepłukano 70% etanolem i zawieszono ponownie w 0,5 do 1ml H2O. Stężenie DNA określono mierząc gęstość optyczną przy 260 nmw rozcieńczeniu 1:200 (1 OD₂₆₀ = 50 μg/ml).

Następujących pożywek i buforów użyto w tych procedurach: bakteryjną pożywkę M9 (10 g soli M9, 10 g kwasów kazaminowych (hydrolizowanych), 10 ml dodatków M9, 7,5 μg/ml tetracykliny (500 μg/ml 15 mg/ml roztworu podstawowego), 12,5 μg/ml ampicyliny (125 μl 10 mg/ml roztworu podstawowego); dodatki M9 (10 mM CaCl₂, 100 mM MgSO₄, 200 μg/ml tiaminy, 70% gliceryny); pożywkę LB (1,0% NaCl, 0,5% ekstrakt drożdży,1,0%trypton);roztworuI(10mMEDTApH8,0);roztworuII (0,2MNaOH1,0%SDS);roztworuIII(2,5MKOAc2,5MHOAc)

Sekwencjonowanie

Syntetyczne geny sekwencjonowano metodą didezoksynukleotydową Sangera. W skrócie, 20 do 50 μg dwuniciowego plazmidu DNA denaturowano w 0,5 M NaOH przez 5 minut. Następnie DNA strącono 1/10 objętości octanu sodu (pH 5,2) i 2 objętościami etanolu i odwirowano przez 5 minut. Peletkę przemyto 70% etanolem i zawieszono ponownie w stężeniu 1 μg/μl. Reakcję zgrzewania proPL 191 300 B1 wadzono z 4 μο wzorca DNA i 40 ng startera w 1x bufora zgrzewania w końcowej objętości 10 μ!.

Reakcję ogrzewano do 65°C i powoli ochłodzono do 37°C.

W oddzielnej probówce 1 μ! 0,1 M DTT, 2 μ! mieszanki znakującej, 0,75 μ! dH₂O, 1 μ! [³⁵S]dATP (10 μ^) i 0,25 μ! Sequenase™ (12 U/μΟ dodano do każdej reakcji. 5 μ! tej mieszanki dodano do każdej wygrzanej probówki ze starterem-wzorcem i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dla każdej reakcji znakowania dodano 2,5 μ! każdej z mieszanek kończących 4 na płytce Terasaki i ogrzano wstępnie w temperaturze 37°C. Na koniec okresu inkubacji dodano 3,5 μ! znakującej mieszaniny reakcyjnej do każdej z 4 mieszanek kończących. Po 5 minutach dodano 4 μ! roztworu kończącego do każdej reakcji i płytkę Terasaki inkubowano w temperaturze 80°C przez 10 minut w piecu. Reakcje sekwencjonowania prowadzono na 5% denaturującym żelu poliakryloamidowym. Roztwór akrylamidu wytworzono dodając 200 ml 10x bufora TBE i 957 ml dH2O do 100 g akrylamidu:bisakrylamidu (29:1). Wytworzono 5% poliakrylamid 46% mocznik i 1x żel TBE łącząc 38 ml roztworu akrylamidu i 28 g mocznika. Polimeryzację rozpoczęto dodatkiem 400 μ! 10% nadtlenodisiarczanu amonu i 60 μl TEMED. Żele wylano stosując silanizowane szklane płytki i zębate grzebienie i rozwijano w1x buforze TBE przy 60 do 100 W przez 2 do 4 godzin (w zależności od regionu czytanego). Żele przeniesiono na sączki Whatmana, suszono w temperaturze 80°C przez około 1 godzinę i umieszczono przy filmie rentgenowskim w temperaturze pokojowej. Typowy czas ekspozycji wynosił 12 godzin. Następujących roztworów użyto w tych procedurach: 5x bufora zgrzewania (200 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl₂, 250 mM NaCl); mieszanki znakującej (7,5 μΜ każdej dCTP, dGTP i dTTP); mieszanek kończących (80 μM każdej dNTP, 50 mM NaCl, 8 μM ddNTP (po jednej)); roztworu zatrzymującego (95% formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % błękitu bromofenolowego, 0,05 % ksylenocyjanolu); 5x TBE (0,9 M boranu Tris, 20 mM EDTA); roztworu poliakrylamidu (96,7 g poliakrylamidu, 3,3 g bisakrylamidu, 200 ml 1x TBE, 957 ml dH2O).

WydzielanieRNA

Cytoplazmatyczny RNA wydzielono z transfekowanych fosforanem wapnia komórek 293T 36 godzin po transfekcji i z zakażonych krowianką komórek Hela 16 godzin po infekcji dokładnie jak opisuje Gilman. (Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. W Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel i wsp., Wiley & Sons, New York, 1992). Krótko, komórki lizowano w 400 μl bufora lizy, jądra odwirowano i SDS oraz proteazę K dodano do 0,2% i 0,2 mg/ml odpowiednio. Cytoplazmowe ekstrakty inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut, ekstrahowano dwukrotnie fenolem/chloroformem i wytrącono. RNA rozpuszczono w 100 /ul bufora Ii inkubowano w temperaturze 37°C przez 20 minut. Reakcję zatrzymano dodając 25 μl bufora kończącego i wytrącono ponownie.

Następujących roztworów użyto w tej procedurze: bufora lizy (TRUSTEE zawierający 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP40); bufora I (bufor TRUSTEE z 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 U^l łożyskowego inhibitora RNAse, 0,1 U^l DNAse I bez RNAse) bufora kończącego (50 mM EDTA 1,5 M NaOAc 1,0% SDS).

Szczelinowa analiza hybrydyzacyjna

Dla szczelinowej analizy hybrydyzacyjnej 10 μg cytoplazmatycznego RNA rozpuszczono w 50 μl dH₂O, do której dodano 150 μl 10x SSC/18% formaldehydu. Roztworzony RNA inkubowano następnie w temperaturze 65°C przez 15 minut i umieszczono w szczelinowym aparacie do hybrydyzacji. Radioaktywnie znakowane sondy 1,5 tys. par zasad z fragmentów gp120lllb isyngp120mn użyto do hybrydyzacji. Każdy z dwu fragmentów stochastycznie znakowano w 50 μl reakcji z 10 μl 5x bufora oligoznakującego, 8 μl 2,5 mg/ml BSA, 4 μl [^a32P]-dCTP (20 μ^/μΗ 6000 Ci/mmol), oraz 5 U fragmentu Klenowa. Po 1 do 3 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C dodano 100 μl TRUSTEE i niezwiązany [^a32P]-dCTP usunięto stosując kolumnę wirówkową G50. Aktywność mierzono licznikiem beta Beckmana, i użyto równych aktywności właściwych do hybrydyzacji. Membrany prehybrydyzowano przez 2 godziny i hybrydyzowano przez 12 do 24 godzin w temperaturze 42°C z sondą 0,5 x 10⁶ cpm na ml płynu hybrydyzacyjnego. Membranę przemyto dwukrotnie (5 min) buforem myjącym 1 w temperaturze pokojowej, przez godzinę buforem myjącym II w temperaturze 65°C, a następnie zetknięto z filmem rentgenowskim. Podobne wyniki otrzymano stosując fragment 1,1 tys. par zasad Not1/Sfi1 pCDM7 zawierający nietranslowany region 3. Kontrolne hybrydyzacje wykonano równolegle z sondą ze stochastycznie znakowanej ludzkiej beta-aktyny. Ekspresję RNA oceniono ilościowo przeglądając hybrydyzowane membrany nitrocelulozowe fosfoimagerem Magnetic Dynamics.

Następujących roztworów użyto w tej procedurze: 5x bufora oligo-znakującego (250 mM Tris HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 5 mM b-merkaptoetanolu, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, mM dTTP, 1 M He18

PL 191 300 B1 pes pH 6,6, 1 mg/ml heksanukleotydów [dNTP]6); roztwór hybrydyzacyjny (0,05 M fosforan sodu, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% siarczan dekstranu, 50% formamidu, 100 μg/ml denaturowanego DNA spermy łososia); bufora myjącego I (2x SSC, 0,1% SDS); bufora myjącego II (0,5x SSC, 0,1% SDS); 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na3cytrynian, pH ustawione na 7,0).

Rekombinacja w krowiance

Rekombinacja w krowiance stosuje modyfikację sposobu opisanego przez Romeo i Seeda (Romeo i Seed, Cell, 64: 1037, 1991). Krótko, komórki CV1 przy 70 do 90% zlewaniu zakażono 1 do 3 μΐ dzikiego typu krowianki WR(2 x 10⁸ pfu/ml) przez 1godzinę w pożywce kultury bez surowicy cielęcej. Po 24 godzinach komórki transfekowano z fosforanem wapnia z 25 μg DNA plazmidu TKG na naczynie. Po dodatkowych 24 do 48 godzinachkomórki zdrapano z płytki, odwirowano i zawieszono ponownie w objętości 1ml. Po 3 cyklach zamrożenia/rozmrożenia dodano trypsynę do 0,05 mg/ml i lizaty inkubowano przez 20 minut. Serii rozcieńczeń 10, 1 i 0,1 μl tego lizatu użyto do zainfekowania małych naczyń (6 cm) z komórkami CV1, które wstępnie potraktowano 12,5 μg//ml kwasu mykofenolowego, 0,25 mg/ml ksantyny i 1,36 mg/ml hipoksantyny przez 6 godzin. Infekowane komórki hodowano przez 2 do 3 dni, a następnie zabarwiono monoklonalnym przeciwciałem NEA9301 wobec gp120 i sprzężonym z zasadową fosfatazą drugorzędowym przeciwciałem. Komórki inkubowano z 0,33 mg/ml NBT i 0,16 mg/ml BCIP w buforze AP i na koniec pokryto 1% agarozą w PBS. Pozytywne łysinki pobrano i zawieszono ponownie w 100 μl Tris pH 9,0. Oczyszczanie łysinek powtórzono raz. Dla utworzenia roztworów o wysokim mianie infekcję powoli przeskalowano w górę. Na koniec, jedną dużą płytkę komórek Hela zainfekowano połową wirusa z poprzedniej rundy. Zainfekowane komórki odłączono w 3 ml PBS, lizowano w homogenizatorze Dounce i oczyszczono z większych resztek przez odwirowanie. Zapas rekombinacyjnej krowianki VPE-8 otrzymano dzięki uprzejmości składnicy AIDS, Rockville, MD, z ekspresją HIV-1 IIIB gp120 z mieszanym wczesnym/późnym promotorem 7.5 (Earl i wsp., J. Virol., 65:31, 1991). We wszystkich eksperymentach z rekombinacyjnymi komórkami z krowianką zakażano przy krotności infekcji co najmniej 10.

Następującego roztworu użyto w tej procedurze: bufor AP (100mMTrisHCl,pH9,5,100mM NaCl,5mMMgCl2)

Kulturakomórek

Linie komórkowe raka nerki małpy CV1 i Cos7, linię komórkową ludzkiego raka nerki 293T i linię komórkową ludzkiego raka szyjki macicy Hela otrzymano z American Tissue Typing Collection i trzymano w uzupełnionym IMDM. Trzymano je na 10cm płytkach do kultur i typowo dzielono 1:5 do 1:20 co 3 do 4 dni. Następujące pożywki użyto w tej procedurze: uzupełnionego IMDM (90% zmodyfikowana przez Iscove pożywka Dulbecco, 10% surowica cielęca, uzupełniona w żelazo, zdezaktywowana ciepłem 30 minut, 56°C, 0,3 mg/ml L-glutaminy, 25 μg/ml gentamycyny 0,5 mM b-merkaptoetanolu (pH ustawione 5 M NaOH, 0,5 ml)).

Transfekcja

Transfekcję fosforanem wapnia komórek 293T przeprowadzono metodą powolnego dodawania z mieszaniem 10 μg plazmidu DNA w 250 μl 0,25 M CaCl₂ do tej samej objętości 2x bufora HEBS z mieszaniem. Po inkubacji przez 10 do 30 minut w temperaturze pokojowej osad DNA dodano do małego naczynia zlanych w 50 do 70% komórek. W eksperymentach współtransfekcji z komórkami rev transfekowano 10 μg gp120lllb, gp120IIIbrre, syngp120mnrre lub rTHY-1enveg1rre i 10 μg pCMVrev lub plazmidu DNA CDM7.

Następujących roztworów użyto w tej procedurze: 2x bufora HEBS (280 mM NaCl, 10 mM KCl,

1,5 mM sterylnie przesączonego); 0,25 mM CaCl2 (autoklawowany).

Immunoprecypitacja

Po48do60godzinachpożywkęwymienionoikomórkiinkubowano przez dodatkowe 12 godzin w wolnej od Cys/Met pożywce zawierającej 200 μφ znacznika S-trans. Supernatanty zebrano i odwirowano przez 15 minut przy 3000 obrotach na minutę dla usunięcia resztek. Po dodaniu inhibitorów proteazy, leupeptyny, aprotyniny i PMSF do 2,5 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml odpowiednio, 1 ml supernatantu inkubowano z 10 μl upakowanej Sepharose białka A (rTHY-1enveg1rre) lub Sepharose białka A i 3 μg oczyszczonego fuzyjnego białka CD4/immunoglobulina (grzeczność Behring) (wszystkie konstrukty gp120) w temperaturze 4°C przez 12 godzin na wirówce. Następnie kulki białka A przemyto 5 razy przez 5 do 15 minut za każdym razem. Po końcowym przemyciu dodano 10 μl bufora obciążającego zawierającego, próbki gotowanoprzez3minutyi nałożonona7% (wszystkie konstrukty gp120) lub 10%(rTHY-1enveg1rre)żelepoliakryloamidowe SDS (TRIS pH 8,8 bufor do rozwijania, TRIS pH 6,8 bufor w żelu magazynowym, TRIS-glicyna bufor bieżący, Maniatis i wsp., supra 1989). Żele utrwalano

PL 191 300 B1 w 10% kwasie octowym i 10% metanolu, inkubowano z Amplify przez 20 minut, osuszono i wystawiono na 12 godzin.

Następujące bufory i roztwory użyto w tej procedurze:

bufor myjący (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1% NP-40) ; 5x bufor bieżący (125 mM Tris, 1,25 M glicyny, 0,5% SDS); bufor obciążający (10% gliceryny, 4% SDS, 4% b-merkaptoetanolu, 0,02 % błękitu bromofenolowego).

Immunofluorescencja

Komórki 293T transfekowano metodą współstrącania z fosforanem wapnia i zanalizowano na powierzchniową ekspresję THY-1 po 3 dniach. Po odłączeniu 1 mM EDTA/PBS, komórki zabarwiono monoklonalnym przeciwciałem OX-7 w rozcieńczeniu 1:250 w temperaturze 4°C przez 20 minut, przemyto PBS i następnie inkubowano z rozcieńczeniem 1:500 sprzężonej z FITC koziej anty-mysiej immunoglobulinowej antysurowicy. Komórki przemyto ponownie, zawieszono ponownie w 0,5 ml roztworu utrwalającego i zanalizowano na cytofluorometrze EPICS XL (Coulter).

Następujących roztworów użyto w tej procedurze: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM KH2PO4, pH ustawione na 7,4); roztworu utrwalającego (2% formaldehydu w PBS).

ELISA

Stężenie gp120 w supernatantach kultury określono stosując powlekane CD4 płytki ELISA i kozie anty-gp120 antysurowice w fazie rozpuszczalnej. Supernatanty komórek 293T transfekowane metodą z fosforanem wapnia zebrano po 4 dniach, odwirowano przy 3000 obrotach na minutę przez 10 minut dla usunięcia resztek i inkubowano przez 12 godzin w temperaturze 4°C na płytkach. Po 6 przemywaniach PBS dodano 100 μΐ kozich anty-gp120 antysurowic rozcieńczonych 1:200 na 2 godziny. Płytki przemyto ponownie i inkubowano przez 2 godziny ze sprzężonym z peroksydazą króliczą anty-kozią IgG antysurowicą 1:1000. Następnie płytki przemyto i inkubowano przez 30 minut ze 100 μΐ roztworu substratu zawierającego 2 mg/ml ofenylenodiaminy w buforze cytrynianu sodu. Reakcję na koniec zatrzymano 100 μΐ 4 M kwasu siarkowego. Płytki odczytano przy 490 nm czytnikiem mikropłytek Coulter. Oczyszczony rekombinacyjny gp120lllb użyto jako kontrolę. Następujące bufory i roztwory użyto w tej procedurze: buforu myjącego (0,1 % NP40 w PBS); roztworu substratu (2 mg/ml o-fenylenodiaminywbuforzecytrynianusodu).

Przykład 2

Syntetycznygenbiałkazzielonąfluorescencją

Skuteczność zastąpienia kodonów dla gp120 sugeruje, że zastąpienie niekorzystnych kodonów mniej korzystnymi kodonami lub korzystnymi kodonami (i zastąpienie mniej korzystnych kodonów korzystnymi kodonami) podwyższy ekspresję w komórkach ssaka innych białek, np., innych eukariotycznych białek.

Białko z zieloną fluorescencją (GFP) meduzy Aequorea victoria (Ward, Photochem. Photobiol. 4:1, 1979; Prasher i wsp., Gene 111:229, 1992; Cody i wsp., Biochem. 32:1212, 1993) przyciągało ostatnio uwagę ze względu na możliwą przydatność jako marker lub reporter dla transfekcji i badań szczepów (Chalfie i wsp., Science 263:802, 1994).

Badanie tabeli użycia kodonów zbudowanej dla natywnej sekwencji kodującej GFP wykazało, że kodony GFP faworyzują Alub U na trzeciej pozycji. Tendencja w tym przypadku faworyzuje A mniej niż przy gp120, lecz jest nadal znacząca. Utworzono syntetyczny gen, w którym naturalną sekwencję GFP przebudowano w prawie taki sam sposób jak dla gp120 (fig. 11; SEKW. NR ID.:40). Ponadto sekwencję inicjacji translacji GFP zastąpiono sekwencjami właściwymi dla zgodności inicjacji translacji. Ekspresję powstałego białka zestawiono z ekspresją sekwencji dzikiego typu, podobnie przetworzonej, aby niosła optymalizowaną zgodność inicjacji translacji (fig. 10B i fig. 10C). Ponadto zbadano wpływ włączenia mutacji Ser 65>Thr, która miała poprawiać skuteczność wzbudzenia GFP przy 490 nm korzystnie przez fluorescencyjnej mikroskopii (Heim i wsp., Nature 373:663, 1995), (fig. 10D). Poprawienie kodonów podwyższyło znacząco wydajność ekspresji (towarzyszący procent komórek pozornie pozytywnych dla transfekcji), a kombinacja mutacji Ser 65>Thr i optymalizacji kodonu dała segment DNA kodujący wyraźnie widoczne markerowe białko ssaka (fig.10D).

Powyżej opisaną syntetyczną sekwencję kodującą białko z zieloną fluorescencją zestawiono w podobny sposób jak dla gp120 z 6 fragmentów po około 120 par zasad, stosując strategię składania opartą na zdolności enzymów restrykcyjnych BsaI i BbsI do przecinania na zewnątrz ich sekwencji rozpoznającej . Zsyntetyzowano długie oligonukleotydy, które zawierały porcje sekwencji kodującej dla GFP wstawione we flankujące sekwencje kodujące EcoRIi Bsal na jednym końcu, a BamHI iBbsI na drugim końcu. Tak więc każdy oligonukleotyd ma konfigurację EcoRI/Bsal/fragment GFP/BbsI/BamHI.

PL 191 300 B1

Końce miejsc restrykcji generowane przez miejsca Bsal i BbsI zaprojektowano z wytworzeniem zgodnych końców, które można było użyć do połączenia sąsiadujących fragmentów GFP. Każdy z kompatybilnych końców zaprojektowano jako unikalny i niekomplementarny ze sobą. Surowe syntetyczne segmenty DNA wzmacniano metodą PCR, wstawiano pomiędzy EcoRI i BamHI w pUC9 i sekwencjonowano. Następnie nietkniętą sekwencję kodującą zestawiono w sześciofragmentowej ligacji, stosując insertowe fragmenty wytworzonez Bsal i BbsI. Dwa z sześciu plazmidów powstałych z ligacji miało insert właściwych rozmiarów, a jeden zawierał żądaną pełną długość sekwencji. Mutację Ser65 do Thr przeprowadzono metodą standardowej opartej o PCR mutagenezy, stosując starter nakrywający unikalne miejsce BssSI w syntetycznym GFP.

Optymalizacja kodonów jako strategia polepszania ekspresji w komórkach ssaka

Dane przedstawione tutaj sugerują, że przerabianie sekwencji kodującej może mieć ogólną przydatność do polepszania ekspresji eukariotycznych genów ssaków i nie-ssaków w komórkach ssaka. Wyniki otrzymane tutaj z trzema niespokrewnionymi białkami: gp120 HIV, powierzchniowym antygenem powierzchni komórki szczura Thy-1 i białkiem z zieloną fluorescencją z Aequorea victoria, oraz ludzkim czynnikiem VIII (patrz poniżej) sugerują, że optymalizacja kodonów może się okazać korzystną strategią polepszania ekspresji w komórkach ssaka dlawielueukariotycznychgenów.

Syntetyczne geny według wynalazku są przydatne do ekspresji białka normalnie ulegającego ekspresjiw komórkach ssaka w kulturze komórek (np. dla celów przemysłowej produkcji ludzkich białek takich jak hGH, TPA, czynnik VIII i czynnik IX). Syntetyczne geny według wynalazku są także przydatne do terapii genowej. Np., syntetyczny gen kodujący wybrane białko można wprowadzać do komórki, która może dawać ekspresję białka, dla utworzenia komórki, która może być podawana pacjentowi potrzebującemu tego białka. Takie oparte na komórkach techniki terapii genowej są dobrze znane specjalistom, patrz, np., Anderson, i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5399349; Mulligan i Wilson, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5460959.

Claims (17)

1. Syntetyczny gen kodujący białko fluoryzujące na zielono, w którym co najmniej jeden niekorzystny lub mniej korzystny kodon w naturalnym genie kodującym to białko zastąpiono korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas, przy czym wspomniane korzystne kodony wybrane są z grupy obejmującej gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc cac atc, ctg, aag,ccc, ttc, agc, acc, tac, i mniej korzystne kodony są wybrane z grupy obejmującej gtg, ggg, att, ctc, tcc, gtc iaggiwspomnianenie korzystnekodonysąwszystkimikodonamiinnyminiżwspomnianekorzystnekodonyimniej korzystnekodony.

2. Syntetyczny gen według zastrz.1 , znamienny tym,żesyntetycznygenjestzdolnydoekspresjibiałkanapoziomie,którywynosiconajmniej110%poziomuekspresjinaturalnegogenuwukładziekulturykomórekssakain vitro w identycznych warunkach.

3. Syntetyczny gen według zastrz. 1 , znamienny tym,żesyntetycznygenjestzdolnydoekspresjibiałkanapoziomie,którywynosiconajmniej150%poziomuekspresjinaturalnegogenuwukładziekulturykomórekssakain vitrowidentycznych warunkach.

4. Syntetyczny gen według zastrz. 1 , znamienny tym,żesyntetycznygenjestzdolnydoekspresjibiałkanapoziomie,którywynosiconajmniej200%poziomuekspresjinaturalnegogenuwukładziekulturykomórekssakain vitro w identycznych warunkach.

5. Syntetyczny gen według zastrz. 1 , znamienny tym,żesyntetycznygenjestzdolnydoekspresjibiałkanapoziomie,którywynosiconajmniej500%poziomuekspresjinaturalnegogenuwukładziekulturykomórekssakain vitro w identycznych warunkach.

6. Syntetyczny gen według zastrz. 1 , znamienny tym,żesyntetycznygenjestzdolnydoekspresji białka na poziomie, który wynosi co najmniej 1000% poziomu ekspresji naturalnego genu wukładziekulturykomórekssakain vitro w identycznych warunkach.

7. Syntetyczny gen według zastrz. 1 , znamienny tym, że syntetyczny gen zawiera mniej niż 5 wystąpieńsekwencjiCG.

8. Syntetyczny gen według zastrz. ralnymgenietoniekorzystnekodony.

9. Syntetyczny gen według zastrz. ralnymgenietoniekorzystnekodony.

1, znamienny tym, że co najmniej 10% kodonów w natu1, znamienny tym, że co najmniej 50% kodonów w natuPL 191 300 B1

10. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 50% niekorzystnych kodonówi mniej korzystnych kodonów obecnych w naturalnym geniezastąpionokorzystnymi kodonami.

11. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 90% niekorzystnych kodonówi mniej korzystnych kodonów obecnych w naturalnym genie zastąpiono korzystnymi kodonami.

12. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej 20% kodonów to korzystnekodony.

13. Syntetyczny gen według zastrz. 1, znamienny tym, że gen ma sekwencję kodującą przedstawioną na SEKW. NRID.:40.

14. Wektor ekspresji, znamienny tym, że obejmuje syntetyczny gen jak zdefiniowano w zastrz. 1.

15. Wektor ekspresji według zastrz. 14, znamienny tym, żejest wektoremekspresji ssaka.

16. Komórka ssaka mieszcząca syntetyczny gen jak zdefiniowano w zastrz. 1 .

17. Sposób wytwarzania syntetycznego genu białka fluoryzującego na zielono, jak zdefiniowano w zastrz. 1, znamienny tym, że identyfikuje się niekorzystne i mniej korzystne kodony w naturalnym genie białka fluoryzującego na zielono i zastępuje jeden lub więcej niekorzystnych i mniej korzystnych kodonów korzystnym kodonem kodującym ten sam aminokwas, co zastąpiony kodon o sekwencji.