CZ97399A3 - Potravinový doplněk s obsahem flavonolu - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká mimo jiné určitých sloučenin, jejich použití a potravinových doplňků a nápojů pro doplnění výživy lidí s obsahem těchto sloučenin.

Podstata vynálezu

Předpokládá se, že vysoká spotřeba vína ve Francii je důležitým dietetickým faktorem při nízkém výskytu úmrtnosti na koronární onemocnění srdce (coronary heart disease, CHD) a byly vysloveny hypotézy, že tato vysoká spotřeba vína poskytuje alespoň zčásti možné vysvětlení pro jev známý jako French Paradox (Renaud & De Lorgeril (1992), Lancet 339, 1523 - 1526), kde Francie představuje pro svou nízkou úmrtnost na CHD přes vysoký příjem nasycených tuků výjimku ve srovnání s ostatními státy.

Existuje velké množství literatury zabývající se údajnými prospěšnými účinky červeného vína na prevenci koronárního onemocnění srdce (CHD). Epidemiologická data ukazují, že ochrana dosažená vínem je vyšší než je tomu u jiných alkoholických nápojů jako je pivo a lihoviny, což ukazuje na to, že k tomuto jevu přispívají jiné faktory než obsah alkoholu ve víně (St Leger a další (1979), Lancet 1, 1017 - 1020; Renaud & De Lorgeril (1992), Lancet 339, 1523 - 1526). Ve výzkumné studii provedené v Kodani v Dánsku se měřily různé parametry (včetně příjmu alkoholu, kouření a indexu tělesné hmotnosti) u 13 285 lidí s následným sledováním úmrtnosti po dobu 12 let. Bylo ukázáno, že nízký až střední příjem vína (ale nikoliv piva nebo lihovin) byl spojen s nižší úmrtností na kardiovaskulární a cerebrovaskulární onemocnění a jiné příčiny (Gronbaek a další (1995),

4444 • 4 4 4 4 4 · 4*

4« 44 4

444 44 444

Brit. Med. J. 310, 1165 - 1169). Tyto výsledky potvrdily výsledky dříve získané v USA (Klatsky & Armstrong (1993), Amer. J. Cardiol. 71, 467 - 469).

Stále přibývají důkazy pro to, že důležitým faktorem přispívajícím k rozvinutí aterosklerózy a CHD je řetězová reakce volných radikálů při peroxidaci lipidů zahrnující oxidaci lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL) (Steinberg (1993), J. Intern. Med. 233, 227 232),

Frankel a další (Lancet 1993 341, 454 - 457) zkoumal schopnost zředěného, dealkoholizovaného červeného vína inhibovat oxidaci lidských LDL in vitro, a zjistil, že víno má jako antioxidant velmi vysokou účinnost. Tito autoři připustili, že pravidelná spotřeba červeného vína může „snížit oxidaci lipoproteinů a snížit trombotický jev“. Autoři však došli k názoru, že „jestliže máme dále hodnotit potenciální úlohu antioxidantů v červeném vínu při snížení CHD.....je potřeba vědět více o farmakokinetice flavonoidů přítomných ve vínu a absorpci a metabolismu fenolů vína.

Flavonoidy náležejí do skupiny látek zvaných polyfenoly (PP), které se takto nazývají proto, že obsahují dvě nebo více fenolické skupiny. Polyfenoly se v červeném vínu hojně vyskytují a skládají se z velkého počtu různých chemických látek s různými molekulovými hmotnostmi. Hlavní polyfenolové složky hroznů a vína a jejich koncentrace se popisují v Shahidi & Nazck (1995), Food fenolics: sources, chemistry, effects a applications (Technomic Publišhing Co., Lancaster Pa, USA) str. 136 - 146. Mezi polyfenoly patří následující třídy sloučenin: flavonoidy (termín často používaný pro obecné označení polyfenolů, ale v Evropě běžnější pro označení pouze flavonů), flavonoly, proanthocyanidiny (zvané také procyanidoly, procyaniny, procyanidiny a tanniny) a anthocyaniny.

Flavony jsou sloučeniny se základní strukturou uvedenou v obr. 2, kde dva benzenové kruhy (A a B) jsou spojeny s

99·· 9 9« 9999 99 99 «99 ·«* 99·« • 9 99999 9 « · 9

9 99 9 99 999999 ” 999999 99 »9 999 9« 999 99 99 heterocyklíckým šestičlenným kruhem C obsahujícím karbonylovou skupinu. Kruh B může být spojen v poloze 2 (jak je ukázáno) za poskytnutí flavonu nebo v poloze 3 za poskytnutí izoflavonu. Hydroxylace může probíhat v polohách 3, 5, 7 a 3', 4’, 5' za poskytnutí sloučenin zvaných flavonoly. Typické příklady flavonolů jsou kvercetin (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 3', 4'), kamferol (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 4'), a myricetin (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 3’,

4', 5'). Mohou existovat v přírodě ve formě aglykonu nebo jako 0glykosidy (např. D-glukóza, galaktóza, arabinóza, rhamnóza atd.). Vyskytují se také i jiné formy substituce jako je methylace, sulfatace a malonylace.

Flavonoly mají základní strukturu uvedenou na obr. 3. Dva nejběžnější flavonoly jsou katechin (hydroxylové skupiny v polohách 5,

7, 3', 4') a jeho stereoizomer epikatechin. Hydroxylové skupiny mohou být esterifikovány kyselinou gallovou (ukázáno na obr. 4). Proanthocyanidiny jsou polymery katechinu a/nebo epikatechinu a mohou obsahovat až osm nebo více jednotek.

Anthocyaniny jsou barevné látky se základní strukturou ukázanou na obr. 5. Někdy se nazývají anthocyanidiny. Typické příklady jsou: cyanidin (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 3', 4’), delfinidin (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 3’, 4', 5') a pelargonidin (hydroxylovaný v polohách 3, 5, 7, 3'). Hydroxylové skupiny jsou obvykle glykosylovány a/nebo methoxylovány (např. malvidin v polohách 3', 5').

Obecným názvem polyfenoly se označují kyseliny dihydroxynebo trihydroxybenzoové a fytoalexiny, jejichž typickým příkladem je resveratrol (ukázaný na obr. 6).

Nejrozšířenějším způsobem stanovení oxidace LDL je použití přechodového kovu mědi (konkrétně iontů Cu²⁺) jako katalyzátoru pro podporu oxidace endogenních hydroperoxidů lipidů. Antioxidanty přítomné v LDL, zvláště alfa tokoferol, zpožďují oxidaci a vyvolávají ·»«· • · *««· tzv. lag-fázi. Proces může být snadno sledován UV spektrofotometrem, protože oxidační reakcí vznikají konjugované dieny, které mohou být kontinuálně monitorovány při 234 nm (Esterbauer a další (1989), Free Radíc. Res. Commun. 6, 67 - 75). Pro ochranu LDL před oxidací při skladování se přidává EDTA pro převedení mědi a jiných stopových prvků do komplexu. Tento nadbytek EDTA interferuje s oxidací kataiyzovanou mědí. EDTA je možno odstranit dialýzou preparátu LDL před přídavkem iontů mědi nebo je možno přidat pro kompenzaci iontů mědi vázaných v komplexu s EDTA nadbytek iontů mědi.

Výsledky experimentů in vitro poněkud podobné experimentům popsaným u: Frankel a další (Lancet 1993, 341, 454 - 457) byly také publikovány u: Frankel a další v roce 1995 (J. Agricult. and Food Chemístry 43, 890 - 894). Autoři této publikace upozorňují na nesnadnost interpretace údajů in vitro. Uvádějí, že ačkoliv fenoiické sloučeniny mají velmi podobné chemické vlastnosti, jejich redukční schopnost nepředpovídá s velkou přesností jejich antioxidační aktivitu. Při testu oxidace LDL a jiných testech na antioxidační účinnost je systém typicky heterogenní a důležitou roli při stanovení antioxidační účinnosti mohou hrát fyzikální vlastnosti jako je lipofilnost, rozpustnost a rozdělení mezi vodnou a tukovou fázi LDL“.

Odborníci v oboru mohou tedy předpokládat, že extrapolace ze stanovení in vitro na situaci in vivo je často nevhodná. Jako příklad se čtenář odkazuje na publikaci McLoone a další, (1995 Proč. Nutr. Soc. 54, Abstract 168A), která ukazuje, že ačkoliv sloučenina lutein má schopnost inhibovat oxidaci LDL in vitro, doplnění diety dobrovolníků luteinem na dobu dvou týdnů (které poskytlo šestinásobné zvýšení hladiny luteinu v plazmě) nemělo na oxidaci LDL vliv.

Byly prováděny některé pokusy in vivo s cílem zkoumat možné prospěšné účinky červeného vína pro zdraví. Fuhrman a další (1995 Am. J. Clin. Nutr. 61, 549 - 554) zjistili, že „některé fenoiické látky *»·· « *« ···« «· ·· ··· · · a · 9 · *

9 · 9 9··· · 9 9 · . · · · 9 9 ········ ····· · · ·· «tt · « 9 · » 99 přítomné v červeném víně, ale nikoliv v bílém víně, se absorbují, vážou na LDL plazmy a mohou být odpovědné za antioxidační vlastnosti červeného vína“ a poskytli, užijeme-li jejich slov, první demonstraci „že spotřeba červeného vína inhibuje náchylnost LDL podléhat peroxidaci lipidů“, a že to může přispět ke zmírnění aterosklerózy. Studie Sharpeho a dalších, jejíž výsledky byly publikovány v (Q. J. Med. 1995 88, 101 - 108) téměř současně s výsledky Fuhrmana a dalších, však uvádí, že jak spotřeba červeného vína, tak i bílého vína nemá žádný vliv na „celkový cholesterol, triglyceridy, HDL nebo míru antioxidačního stavu, včetně vnímavosti LDL k oxidaci“.

Tuto oblast rovněž zkoumali De Rijke a další a provedli náhodnou studii dvakrát naslepo. Publikovali své výsledky v roce 1996 (Am. J. Clin. Nutr. 63, 329 - 334) a uvádějí, že „výsledky této studie nenaznačují prospěšný vliv spotřeby červeného vína na oxidaci LDL“.

V souhrnu je tedy několik publikací, které uvádějí možnost inhibice oxidace LDL zředěným červeným vínem v testech in vitro, ale tato zjištění nemusí být nutně rozšířena na situaci in vivo. Navíc data týkající se inhibice oxidace LDL červeným vínem in vivo jsou přinejlepším rozporná a neexistuje žádný jasný důkaz, že spotřeba červeného vína by mohla oxidaci LDL ovlivnit.

Nyní je volně dostupná řada prostředků připravených z vína nebo vedlejších produktů hroznů, které mohou obsahovat polyfenoly, i když v některých z těchto prostředků v poměrně nízkých hladinách. Mezi ně patří kapsle French Paradox (dostupné od firmy Arkopharma). Kapsle French Paradox se připravují přípravou extraktu z matoliny (odpad vinných slupek zbylý po kvašení vína). Většina polyfenolů přítomných ve slupce hroznů je rozpustných v alkoholu a tak mají sklon se extrahovat do kvašeného vína. Proto mají kapsle French Paradox ve skutečnosti spíše nízký obsah polyfenolů. (Jiné běžně dostupné prostředky jsou např. prášek obsahující anthocyanin

- 6 ««·* • Μ * ·

Ο 0

0 0 • 0 «00 * > 0000 00 0«

0 · 0 0 «

000 « « « «

00 000 000 0 fe 0«

0·· «0 00 (dostupný u firmy Sefcal) vyráběný z extraktu slupky hroznů, který se používá jako potravinářské barvivo a prostředek s obsahem proanthocyanidinu (Endotelon) vyrobený ze semen hroznů.)

I když kapsle French Paradox obsahují významné množství polyfenolů, není jasné, zda má přijímání tohoto syntetického polyfenolového prostředku ústy stejný terapeutický účinek, který má údajně mít spotřeba červeného vína. Jak například vysvětluje Goldberg (1995 Clín. Chem. 41, 14 - 16), obsah alkoholu ve víně udržuje polyfenoly v roztoku ve víně i v lidském žaludku, takže mohou být dostupné pro absorpci. Syntetický bezalkoholový polyfenolový prášek může být zcela neúčinný, protože polyfenoly jsou v žaludku nedostatečně rozpustné (v nepřítomnosti alkoholu), aby mohly být absorbovány. Navíc absorpce do krevního řečiště nemusí být dostatečná pro dosažení antioxidačního účinku na LDL - je možné, že je třeba dosáhnout bezprostředního kontaktu polyfenolů s frakcí LDL.

Je známo, že mechanismem oxidace volných radikálů je způsobována nebo provokována řada nemocí, například rakovina, zákaly, cukrovka atd. AntioxidaČní výživné látky jako je vitamin E, vitamin C a další jsou pravděpodobně schopny zabraňovat oxidaci volných radikálů v mnoha orgánech a tkáních. Absorpce polyfenolů, které jsou účinnými oxidanty, bude mít tedy pravděpodobně vliv na onemocnění způsobená volnými radikály/oxidací obecně a použití polyfenolů může být mnohem širší než pro léčení nebo prevenci koronárního onemocnění srdce.

CHD je nicméně jednou z hlavních příčin úmrtnosti a nemocnosti v západním světě, a proto se mu věnuje zvláštní pozornost. Patogeneze onemocnění se v podstatě skládá z dvoustupňového procesu, který nejprve zahrnuje vytvoření aterosklerotických plátů a potom vytvoření trombu (sraženiny) na plátu (proces nazývaný trombóza), který může způsobit uzavření tepny, jehož důsledkem může být infarkt myokardu (Ml) a náhlá smrt. Další onemocnění

- 7 9 9 9 .9 • * *· • · 9

4. · · • 99 94* • 4

9« způsobená trombózou jsou mrtvice a žilní trombóza. Počáteční stupeň při tvorbě trombu je agregace destiček, při které se uvolňují do krve koagutační faktory způsobující produkci fibrinové sraženiny. Jak se jednou vytvoří fibrinové sraženiny, mohou být odstraněny způsobem známým jako fibrinolýza, která je v podstatě rozpuštění sraženiny a rozklad fibrinu na degradační produkty. Existují tedy alespoň dva postupy, kterými je možno předcházet trombóze: inhibice agregace destiček nebo zvýšení fibrinolýzy.

Abnormální proliferace buněk hladkého svalstva cév (VSMC) může přispívat k vytváření obstruktivních poškození při koronárním srdečním onemocnění, ateroskleróze, restenóze, mrtvici a nádorům hladkého svalstva, tlustého střeva a dělohy, a fibroidům nebo fibromům dělohy.

Již dlouhou dobu je známo, že jedním z nejsilnějších inhibitorů buněčného růstu je TGF-β (Massagué (1990), Annual Rev. Cell. Biol. 6, 597 - 641), a několik autorů zjistilo, že TGF-β inhibuje proliferaci VSMC (Assolian & Sporn (1986), J. Cell. Biol. 102, 1712 - 1733; Bjorkerud (1991), Arteriosclerosis Thromb, 11, 892 - 902; Owens a další (1988), J. Celí Biol. 107, 771 - 780; Kirschenlohr a další (1993), Am. J. Phystol. 265 (Cell Physiol. 34), C571 - C576). Lidské VSMC produkují TGF-β v latentní, inaktivní formě, která se proteolyticky aktivuje serinovým proteinem plasminem, který se zase získá z plasminogenu skupinou plasminogenových aktivátorů (PAs), jako je tkáňový plasminogenový aktivátor (tPA) (Lyons a další (1990), J. Cell. Biol, 110, 1361 - 7). Přírůstek celkové hladiny TGF-β v plazme je považován za účinný při inhibici růstu VSMC, protože latentní forma se přeměňuje na aktivní formu plasminem.

Několik autorů vyvinulo metody odhadu hladiny TGF-β v plazmě a způsob hledání farmaceutických prostředků, které mohou stimulovat produkci TGF-β jak v latentní, tak i v aktivní formě. V US 5,545,569 (Grainger a další) sé nárokuje způsob stanovení účinnosti sloučenin, • 444

- 8 44

4 i 4 4 · ·

4444 · 44 4

4 44 ···«« t 4 4 4 4

444 44 44 které zvyšují hladinu TGF-β v plazmě a stimulují jeho produkci in vitro s použitím v tomto patentu popsaných technik. WO 94/26303 (Grainger a další) popisuje způsob zachování nebo zvýšení průsvitu Cévy u nemocné nebo poraněné cévy savce podáváním účinného množství aktivátoru TGF-β nebo stimulátoru jeho produkce. Jako účinná sloučenina je nárokován Tamoxifen (trans-2 [4(difenyl-1 butany!)fenoxy)-dimethylethylamin, protože stimuluje produkci TGF-β a zvyšuje poměr aktivního TGF-β k latentnímu. Další sloučeninou s podobnými účinky je aspirin (Grainger a další (1995), Nátuře Medicín 1, 74 - 79), který zvyšuje jak celkovou, tak i aktivní koncentraci TGF-β v séru u normálních lidí, ale pouze celkovou hladinu TGF-β u pacientů s koronárním srdečním onemocněním.

Zvýšení agregace destiček bylo také významně spojováno s převahou (Elwood a další (1991), Circulation 83, 38 - 44) a výskytem (Thaulou a další (1991), Circulation 84, 613 - 17) CHD. Agregaci destiček je možno pohodlně studovat použitím agregometru destiček, ve kterém se suspenze destiček čerstvě získaných z krve uvede do styku s agonistou, který způsobuje agregaci. Je možno použít mnoha agonistů, ale nejtypičtější jsou kyselina arachidonová, ADP, kolagen a trombin. Z měření maximální agregace (%) je možné studovat vliv inhibitorů na agregaci destiček, kde tyto inhibitory mohou být podávány ústy nebo injekcí. Jednou z nejúčinnějších látek zabraňujících agregaci destiček je aspirin, který inhibuje cyklooxygenázovou aktivitu a tvorbu thromboxanu, nutného faktoru při tvorbě trombu (Moncada & Vane, New Eng. J. Med. (1979) 300, 1142 47). Aspirin také předchází CHD, mrtvici a náhlé smrti (Hennekens a další, 1988).

Systém fibrinolýzy je tvořen kaskádou extracelulárních proteolytických reakcí přísně regulovaných pomoci aktivátorů a Inhibitorů. Enzym plasminogenový aktivátor tkáňového typu (tPA) konvertuje plasminogen na plasmin, který zase rozpouští sraženinu • 99« 9 «9 »··· *· ·· • · · · < « * «ι · *

9· · 9 9 999 9 9' 9 9 • 9 »9 9 99 ······ • · 9 « 9 9 9 «9 99« *« «9« 99 99 fibrinu. t-PA je glykoprotein syntetizovaný v endoteliálních buňkách, který se pro aktivaci adsorbuje na fibrin. Inhibitor aktivátoru plasminogenu (PAI)-1, je inhibitor na bázi serinové proteázy, který působí jako specifický inhibitor t-PA. PAI-1 existuje ve třech formách: aktivní, latentní a jako neaktivní komplex. Je syntetizován v endoteliálních buňkách, játrech a destičkách.

V krevním oběhu je většina tPA (95 %) v komplexu s PAI-1. Pouze velmi malé množství tPA a PAI-1 je ve volné (aktivní) formě.Předpokládá se, že snížená fibrinolytická aktivita je způsobena zvýšením hladiny nebo aktivity PAI-1, která vede ke snížené aktivaci plasminogenu na plasmin působením tPA. To je důležité, protože se uvádí spojení mezi sníženou fibrinolytickou aktivitou a rizikem CHD (Mehta a další, J. Am. Coll. Cardiol. (1987) 9, 26) a Ml. Nesprávná fibrinolýza, zejména v důsledku zvýšení koncentrace PAI-1 v plazmě je obvyklým nálezem u trombotického onemocnění. Ve studii Northwick Park Heart Study, epidemiologické studii u mužů středního věku (na začátku studie 40 - 54), uváděli Meade (1987), v Thrombosis a Haemostasis, Verstraete a další (eds.) Int. Soc. on Thrombosis a Haemostasis, Univ. Press Leuven, 37 - 60, ze snížená fibrinolytická aktivita je hlavním nezávislým rizikovým faktorem pro budoucí CHD. Křížové studie pacientů s angínou pectoris nebo předcházejícím infarktem myokardu souhlasně ukázaly sníženou fibrinolytickou aktivitu u pacientů ve srovnání s kontrolou (Hamsten a další, New Eng. J. Med. (1985), 313, 1557 - 1563; Hamsten a další, Brit. Heart J.

(1986), 55, 58 - 66; Johnson, Int. J. Cardiol., (1984) 6, 380 - 382; Paramo a další, Brit. Med. J. (1985) 291, 575 - 576; Aznar a další, Brit. Heart J. (1986) 59, 535 - 541; Francis, Am. Heart J. (1988), 115, 776 - 780; a Olofsson a další, Eur. Heart J. (1989) 10, 77 - 82). Bylo ukázáno, že koncentrace PAI-1 u pacientů s Ml jsou vyšší ve srovnání s kontrolou (Hamsten a další, Lancet, (1987) II, 3 - 9).

Pro úlohu agregace destiček a fibrinolýzy při tvorbě trombu by mohla být použita metoda snížení agregace destiček a/nebo snížení

- 10 4444 · ·'· 4444 ·· ·4.

4 4 4* 4 · 4 · • i- *♦ 44· * ♦ · 4

4 4 4 4 ·· ·«* * · 4 • 4 · 4 4 9 4 «· ··· ·· ··· ♦* 4* fibrinolýzy jako metoda pro léčení trombotických onemocnění obecně a CHD zvláště.

Podstata vynálezu

V prvním hledisku poskytuje vynález suchý prostředek s obsahem flavonolu získaný z rostlin určený pro konzumaci člověkem, kde alespoň 25% materiálu získaného z rostlin v prostředku tvoří polyfenoly.

Pro vysvětlení uvádíme, že prostředky získané z rostlin mohou obsahovat extrakty z rostlin nebo jejich částí (jako jsou hlízy, plody), které mohou být určitým způsobem zpracovány (např. kvašením). Prostředky získané z rostlin obsahují vodné extrakty nebo extrakty organickými. rozpouštědly rostlin nebo jejich částí, ovocné šťávy a kvašené tekutiny (např. víno) vyráběné z rostlin nebo ovocných šťáv nebo prostředky získané z kterýchkoliv předcházejících materiálů. Rostlinný materiál se v průběhu výroby prostředku typicky zpracovává (fyzikálně a/nebo chemicky) pro extrakci polyfenolů z rostliny a tak se zvyšuje a obohacuje obsah polyfenolů v prostředku.

S výhodou může mít prostředek takové složení, že materiál získaný z rostlin obsahuje alespoň 35 % polyfenolů, nebo výhodněji alespoň 45 % polyfenolů.

Prostředek může být složen úplně nebo částečně z materiálu získaného z rostlin, ze kterého se flavonol obsažený v prostředku získává. Alternativně může prostředek obsahovat další materiál, jako jsou chuťové přísady, pomocné látky, nosiče apod., které se běžně používají pro formulaci prostředků pro spotřebu člověkem.

Výraz „z rostlin získaný materiál“ v prostředku označuje část prostředku, která pochází ze stejného zdroje jako obsah flavonolů v prostředku. Prostředek může také obsahovat další složky (například škrob nebo příchutě) získané z rostlin, ale ty nejsou považovány za

-11 ·. * ¹

V t a *· 4*4 ·· 4« · · 4 ' 4 ·' ·; · * «··; ·«· 4 · *· 4* „z rostliny získaný materiál, pokud se nezískávají ze stejného zdroje jako je flavonolová složka prostředku.

S výhodou má prostředek takové složení, že obsah flavonolu je alespoň 0,5 % hmotnostních, s výhodou alespoň 1 % hmotnostní a výhodněji alespoň 2 % hmotnostní z celkového obsahu polyfenolu získaného z rostlin v přípravku.

Je také výhodné, jestliže je obsah flavonolu v prostředku jako celku alespoň 0,01 % hmotnostních, výhodněji alespoň 0,1 % hmotnostních a nejvýhodněji alespoň 1 % hmotnostní.

Ve druhém hledisku poskytuje vynález suchou směs obsahující flavonol získaný z rostlin s obsahem alespoň 0,01 % hmotnostních flavonolu, výhodněji alespoň 0,1 % hmotnostních a nejvýhodněji alespoň 1 % hmotnostní.

Výše uvedené prostředky jsou typicky při atmosférickém tlaku (101,325 kPa) v rozmezí teplot 10 - 20 °C pevné. Prostředek může být ve formě částic (tj. práškový nebo granulovaný) nebo může být ve formě kapslí, tablet apod.

Autoři vynálezu překvapivě zjistili, že prostředky podle vynálezu jsou účinné po orálním podání pacientovi při inhibici oxidace plazmatických LDL, přičemž měření byla prováděna pro řadu kritérií. Orální příjem prostředku tedy účinkuje na prodlužování lag-fáze při oxidaci izolovaných plazmatických LDL při určení metodou podle Esterbauera a dalších (1989 Free Radíc. Res. Commun. 6, 67 - 75). Ve stručnosti, při této metodě se LDL izolovaný z plazmy pacienta ultracentrifugací dialyzuje pro odstranění EDTA a k LDL se přidají ionty mědi (5 μΜ) (koncentrace LDL 50 mg/l). Obvyklá délka lag-fáze před vytvářením dienu je přibližně 50 - 60 min. Podání prostředku podle vynálezu pacientovi by mělo poskytnout prodloužení délky lagfáze s výhodou alespoň o 2 min (nebo přibližně o 4 % nebo více). Nejvýhodnější je rozmezí 5 - 25 min (nebo přibližně 10 -50%). Prostředek je navíc účinný (při podávání ústy) na snížení množství

- 12 *··· ϊ 9 «·

·. 1 •. · · 9» Μ

». »9* • t * 999

999 • ti 99* b 9 ·♦ «9 lipidových peroxidu v plazmě pokusných osob (při stanovení metodou Goroga a dalších (1994), Atherosclerosís 111, 47 - 53, jak bude popsáno dále).

Prostředky vhodně obsahují polyfenoly (včetně flavonolů) získané z hroznů (celých hroznů nebo jejich částí, jako je slupka nebo šťáva), vína (zvláště červeného vína, které obsahuje mnohem vyšší koncentrace polyfenolů než bílé víno) nebo vedlejších a/nebo odpadních produktů při výrobě vína. jako jsou výlisky (tj. zbytky rozdrcených hroznů po získání šťávy) nebo matoliny (odpadní tuhé látky zbylé po první fermentaci). Polyfenoly jako jsou flavonoly jsou však přítomny v celé řadě v přírodě se vyskytujících materiálů, z nichž mnoho obsahuje vyšší obsah flavonolů než červené víno a mohly by tak být vhodnějšími zdroji flavonolů. Příklady takových látek jsou: obecně ovoce jako jablka (např. var. Gravensteiner), zvláště jablečná dužina; hrušky (např. var. Williams Christs); papriky (např. var. Yolo wonder); červený rybíz; černý rybíz (zvláště výhodný pro svůj relativně vysoký obsah flavonolů); citrony; třešně; brusinky; angrešt; rajčata; olivy; a zelenina obecně, včetně ředkviček (např. var. Saxa treib); kedlubny (např. var. Primavera); křen; brambory, česnek a chřest.

Ve výhodném provedení je prostředek získán z červeného vína a obsahuje reprezentativní průřez v podstatě všech polyfenolových sloučenin přítomných ve vínu (typicky, ačkoliv to není nutné, přítomných v prostředku v relativních množstvích, která jsou pro víno, ze kterého je prostředek získán, v podstatě reprezentativní). Takový prostředek je možné označit jako „zdroj veškerých polyfenolů“.

Polyfenoly mohou být výhodně získány z červeného vína nebo jiných kapalin s obsahem polyfenolů absorpcí na kolonu s chromatografickou pryskyřicí a elucí frakce obohacené polyfenoly z kolony (typicky po kroku promývání) použitím 40 - 50 % ethanolu jako eluentu nebo jiného vhodného organického rozpouštědla (jako je

- 13methanol, aceton, ethylacetát, dimethylenchlorid, a chloroform - které mohou být ve vodném roztoku). Organické rozpouštědlo je s výhodou relativně těkavé (tj. s teplotou varu mezi 30 a 85 °C při tlaku 101,325 kPa) a může tak být snadno odstraněno za získání v podstatě suchého (tj. méně než 10 % hmotnostních H2O) pevného prostředku s obsahem polyfenolů. Tento způsob může být s úspěchem použit pro získání celkových polyfenolů z červeného vína.

Polyfenoly mohou být alternativně získány z červeného vína nebo jiné kapaliny s obsahem polyfenolů extrakcí rozpouštědly s použitím vhodného organického rozpouštědla nemísitelného s vínem nebo jinou kapalinou. Alternativně mohou být polyfenoly získány z pevných látek obsahujících polyfenoly extrakcí rozpouštědly (typicky extrakcí organickým rozpouštědlem jako je ethanol nebo ethylacetát) pevné látky mohou být potom od rozpouštědla odděleny filtrací nebo centrifugací. Rozpouštědlo se potom může odpařit za získání v podstatě suchého pevného prostředku s obsahem polyfenolů.

Ve výhodných provedeních je prostředek ve formě potravinového doplňku. Může jít o látku určenou pro přidávání do potravin jako další složka během výroby potravin nebo může jít o oddělenou látku přijímanou jednotlivcem (např. tabletu nebo kapsli) v podstatě v izolované formě (tj. ne ve směsi) s jinými složkami potravin před konzumací (ačkoliv může být tableta nebo kapsle samozřejmě přijímána s jídlem). Vynález tedy ve svém rámci zahrnuje produkt, zvláště potravinu, obsahující prostředek podle vynálezu. Alternativně může být prostředek přítomen jako pevná látka, ze které je možno připravit nápoj rozmícháním s fyziologicky přijatelným diluentem (jako je mléko, voda nebo jiná vodná kapalina).

Dávka prostředku podávaná subjektu je závislá na stupni účinnosti materiálu, ale bude mezi 10 mg a 10 g na den. Pro celkové polyfenoly získané z červeného vina je vhodná dávka 0,1 - 4,0 g/den, a výhodněji 1 - 2 g/den, což je ekvivalentní 0,5 až 1 I červeného vína ··*· · ·*·· *« »·

za den. Výhodná dávka flavonolu bude v rozmezí 0,1 - 1000 mg za den, s výhodou v rozmezí 0,5 - 500 mg za den, výhodněji v rozmezí 1 250 mg za den.

Odborníci v oboru budou schopni provést další frakcionaci preparátu polyfenolů získaných z vína, hroznů nebo vedlejších produktů vína pro získání prostředků s koncentrovanějším účinkem. To je možno uskutečnit chromatografii na koloně, extrakcí rozpouštědly, molekulárními síty s polopropustnými membránami nebo jiným způsobem (způsoby) běžně používanými v potravinářském průmyslu. Výhodou je, že se dosáhne menší hmotnosti aktivní látky a dojde k prospěšné modifikaci barvy a chuti doplňku.

Prostředky podle vynálezu mohou být vyrobeny s použitím aktivních polyfenolových preparátů podle běžné praxe výroby potravinových doplňků nebo farmaceutických prostředků. Použitelná řediva, pomocné látky nebo nosiče apod., jsou dobře známá z formulace farmaceutických prostředků a doplňků a forma zvolená pro každý konkrétní režim bude záviset na daných souvislostech a výběru odborníka. Dávka bude obvykle záviset na koncentraci polyfenolů v prostředku a na identitě polyfenolových sloučenin připadajících v úvahu.

Prostředky mohou navíc obsahovat jakékoliv další složky, které se typicky používají v potravinářském a/nebo farmaceutickém průmyslu. Mezi tyto složky mohou patřit výživné látky (zvláště stopové prvky a vitaminy), antioxidanty, léčebné látky (zvláště látky s terapeutickým účinkem co se týče prevence a/nebo léčení CHD, zvláště aspirin), barviva a sladidla (zvláště umělá sladidla jako je aspartam apod.).

Příklady výše uvedených látek jsou následující: karotenoidy jako je lutein, lykopen nebo a- a/nebo β-karoten; antioxidační živiny nebo protízánětlivé prostředky jako je vitamin A, vitamin C, vitamin E (atokoferol a jiné aktivní tokoferoly), kyselina listová, selen, měď, zinek,

- 15 »t»F ♦ / Ί * ♦

9. · ·

F* ···.

FF FF·· *«< 9 9 : :l. : »: i •J r·/ % * ·*· ·*· ·' < F F

FF- FFF FF' Ff mangan (koenzym Q10), kyselina salicylová, kyselina 2,3dihydroxybenzoová a kyselina 2,5-dihydroxybenzoová.

Antioxidanty jako jsou karotenoidy a vitamin E se v gastrointestinálním traktu částečně ničí oxidací. Přísadou těchto sloučenin do prostředku podle vynálezu se podle předpokladů může dosáhnout inhibice tohoto procesu a absorpce většího množství antioxidantů. Použití prostředku obsahujícího α-tokoferol a/nebo aspirin je zvláště výhodné, protože se předpokládá, že taková směs účinkuje v přítomnosti polyfenolů synergicky.

Typické vhodné denní dávky těchto dodatečných složek prostředku (které mohou být do prostředku přidány takovým způsobem, že normální spotřeba prostředku poskytne vhodnou dávku) jsou následující:

Lutein	2 až 50 mg například vhodně 7,5 mg
Beta karoten	2 až 20 mg např. vhodně 5 mg
Vitamin A	400 až 600 RE například vhodně 500 RE
Vitamin C	75 až 250 mg například vhodně 100 mg
Kyselina listová	0,1 až 1,0 mg například vhodně 0,2 mg
Selen	80 až 120 pg například vhodně 90 pg
Měď	2 až 4 mg například vhodně 3 mg
Zinek	10 až 20 mg například vhodně 15 mg
Koenzym Q10	10 až 200 mg, např. vhodně 30 mg
Aspirin	10 až 150 mg například vhodně 150 mg

V jednom provedení je tedy prostředek ve formě kapslí, kde každá kapsle obsahuje 500 mg polyfenolového prostředku, s navrhovaným příjmem jedné až čtyř kapslí za den. Další formou

- 16*444 4' /,·· 4·»· • Μ Γ ♦

·. i u ι··\

4 4 ί 4 • 4 ··» ·· 4*4 ι ··' ♦♦

4. '44 *

S ’·' · · · ,j 4 44» »4·

- b 4

4« »· provedení je nealkoholický nápoj, který poskytne účinnou dávku polyfenolů při rozpuštění ve vodě (obyčejné nebo sycené), ochucený a sladké chuti, nebo nealkoholický nápoj získaný rozpuštěním v ovocné šťávě, např. hroznové, jablečné nebo pomerančové apod.

I když může být z mnoha důvodů (sociálních, náboženských a ekonomických) výhodné poskytnout bezalkoholový nápoj obsahující prostředek podle vynálezu, tyto nápoje mohou být zesíleny alkoholem (např. z vodky, ginu,, whisky) pro získání požadovaného obsahu 515 % alkoholu v závislosti na chuti konzumenta.

Další formy jsou potravinové složky obsažené v mléčných výrobcích jako je mléko a jogurty, ochranné a dietní výrobky zamýšlené jako potravinové doplňky nebo náhražky. Výše uvedené příklady jsou pouze ilustrativní a v žádném případě nemají být omezující.

Ve třetím hledisku vynálezu se poskytuje způsob inhibice oxidace LDL v plazmě lidského pacienta; způsob zahrnuje přípravu prostředku podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu; a podávání prostředku příjemci.

Autoři vynálezu zjistili, že přijímání prostředku ústy neinhibuje pouze oxidaci LDL v plazmě, ale prostředek má také účinky na stimulaci produkce transformačního růstového faktoru (TGF)-p in vivo. Navíc autoři vynálezu zjistili, že příjem prostředku podle vynálezu ústy bude inhibovat agregaci destiček a/nebo stimulovat fibrinolýzu a tím snižovat trombotické sklony u jednotlivce, kterému se má pomoci v prevenci a/nebo léčení trombotických onemocnění jako je CHD a mrtvice. Konkrétně se zjistilo, že přijímání prostředku zvyšuje míru aktivity tPA v plazmě (měřenou vhodně testy jako je test ''Chromolize [dostupný u firmy Biopool, Švédsko] popsaný níže), jehož účinkem se zvyšuje celková rychlost fibrinolýzy u pacienta.

Podle čtvrtého hlediska vynálezu se poskytuje způsob stimulace produkce TGF-β u člověka; způsob zahrnuje přípravu prostředku podle

- 17 4*44

4ti ··4 4 *> 4 4

·] « ··*( • · 4 ·|· »4 444

44’· 44 * ·, · . 4' 4¹ • 44 44 , 4

4 ·« prvního nebo druhého hlediska vynálezu a podávání prostředku pacientovi.

V pátém hledisku poskytuje vynález způsob inhibice agregace destiček a/nebo stimulace fibrinolýzy u člověka, který zahrnuje přípravu prostředku podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu a podávání prostředku pacientovi.

V šestém hledisku poskytuje vynález použití prostředku podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu definovaného výše pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání ústy člověku pro inhibici oxidace LDL v plazmě pacienta.

V sedmém hledisku poskytuje vynález použití prostředku podle výše definovaného prvního nebo druhého hlediska vynálezu pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání ústy člověku pro stimulaci produkce TGF-β u pacienta.

V osmém hledisku poskytuje vynález použití prostředku podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu definovaných výše pro výrobu farmaceutického prostředku pro orální podávání člověku pro inhibici agregace destiček a/nebo stimulaci fibrinolýzy u pacienta (zvláště zvýšením míry aktivity tPA v plazmě ošetřovaného pacienta).

Prostředek podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu bude u pacienta přijímajícího tento prostředek typicky vykazovat všechny z výše uvedených vlastností. Vynález tedy také poskytuje způsob výroby farmaceutického prostředku pro podávání ústy člověku pro dosažení jednoho nebo více z následujících účinků u pacienta: inhibice nebo oxidace LDL v plazmě; inhibice agregace destiček; stimulace fibrinolýzy; a stimulace produkce TGF-β; způsob zahrnuje přípravu prostředku podle prvního nebo druhého hlediska vynálezu; v případě potřeby míšení prostředku s fyziologicky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou; a přípravu jednotkových dávek prostředku. Vhodné způsoby výroby prostředku jsou odborníkům v oboru známy.

000 0 ··,! e:i 00 J 0 · 0 · 0,1 0 0 0 0 '1 *'010

-1fi- · ♦** * 00 00 0.000 ¹ V 01 0 0 0J: 0 0 0 0

000 00 000 <0 00

Farmaceutické prostředky s uvedeným účinkem mohou být ve formě potravinových doplňků nebo složek jak je vysvětleno výše a měly by být používány při prevenci nebo léčení koronárního onemocněni srdce. Vhodné dávky prostředků, jak bylo vysvětleno výše, budou záviset na koncentraci a identitě polyfenolů v prostředku a na vážnosti stavu onemocnění u ošetřovaného subjektu. Obecné vodítko pro dávkování by však mělo být takové, aby poskytlo stejné množství spotřebovaného polyfenolů, jaké poskytne spotřeba alespoň jedné sklenice vína za den (ekvivalentní přibližně 0,25 g celkových polyfenolů červeného vína), ale s výhodou přibližně 0,5 - 1,0 1 červeného vína za den (tj. přibližně 1,0 - 2,0 g celkových polyfenolů vína).

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje graf závislosti oxidace LDL na čase (min); obr. 2 je schematické znázorněni struktury jádra flavonů; obr. 3 je schematické znázornění struktury jádra flavonolů; obr. 4 je schematické znázornění struktury kyseliny gallové; obr. 5 je schematické znázornění struktury jádra anthocyaninů; a obr. 6 je schematické znázornění struktury resveratrolu.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Výroba práškového polyfenolů z červeného vína

Asi 2000 I červeného vína (French 1993 Cabernet Sauvignon) bylo zfiltrováno pro odstranění sedimentu a destilováno ve vakuu při tlaku 30 kPa při teplotě 75 až 80 °C 1 min, potom bylo ochlazeno

- 19 »999 9' 99 9999 ί» 99 ·, ··. ·!| · * ·, > 9 9 9 • « 9 9 9 9·- · · 9 9 · 9' ·; i 9* *99 999

9.9 9 9. 9 9 9 9 «9 999 9* ·*· ·· *9 a koncentrováno ve vakuu při 55 °C a potom rychle ochlazeno na 25 °C mražením. Koncentrované víno bylo převedeno přes kolonu (průměr 55 cm, výška přibližně 2 m) obsahující 65 I pryskyřice Diaion HP-20. Kolona byla promyta 250 I destilované vody a polyfenoly eluovány přibližně 250 I 50 % ethanolu, v průběhu přibližně 150 min. Potom bylo zjištěno, že eluát neobsahuje polyfenoly stanovením metodou Folin-Ciocalteu (popsaná v Singleton & Rossi (1965), Amer. J. Enology a Viticuture 16, 144 - 158). Eluát byl potom koncentrován na obsah 35 % sušiny ve vakuu a potom sušen rozprašovacím způsobem pod dusíkem za získání přibližně 2 kg prášku s obsahem vlhkosti 3 až 4 %.

Polyfenolový prášek je vynikající přísadou do potravin tmavě červené barvy při rozpuštění ve vodě nebo vodném alkoholu, která má přijatelnou chuť poskytuje „říz“ podobné chuti jako červené víno. Doporučená denní dávka je 1 - 2 g/den.

Typický prostředek práškového polyfenolu se dále porovnává s obsahem polyfenolu v červeném víně. V porovnání s červeným vínem obsahuje práškový polyfenol poměrně více proanthocyaninů než jiných polyfenolů, ale v podstatě zachovává relativní zastoupení různých polyfenolů.

-209999 * 99 9999 ·· 99

9 9 9r 9 9 99«* ·' · 9 9 · 9 . ♦ 9 ' 9

9 » 9( « 9k> 99«,. 9*9

9 9 9 9 9 9

999 99 9·· 99 99

Složení červeného vína a práškového polyfenolu

	Červené víno ekv. kys. gallové	Práškový polyfenol
mg/l	%	červeného mg/g	vína %
Kyselina hydroxyskořicová	165	15	. 18	3
Katechiny	200	17	38	6
Flavonoly	20	2	14	2
Anthocyaniny	200	17	70	11
Proanthocyanidiny	550	49	480	77
Celkem	1135		620

Příklad 2

Byly prováděny studie s podáváním polyfenolu na dobrovolnících pro stanovení antioxidačního účinku červeného a bílého vína a polyfenolových přípravků na zdravé dobrovolníky.

Pokusné osoby a metody;

Soukromé a důvěrné studie se účastnilo 26 zdravých mužů ve stáří 35 až 65 let, nekuřáků, kteří konzumovali standardní anglickou dietu. Dva týdny před touto studií přerušili dobrovolníci konzumaci vína. Všichni dobrovolníci byli požádáni, aby v průběhu studie zachovali svou obvyklou dietu a styl života. Dobrovolníci byli rozděleni do skupin, které konzumovaly následující vinné nebo čajové výrobky při jídlech po dobu dvou týdnů v množství uvedeném v tabulce 1. Červené víno bylo Cabernet Sauvignon (1993) a bílé víno bylo z oblasti Narbonne, Francie. Víno podávané při studii bylo jediné víno,

- 21 ··· ·

4*4 •i · · • , · ··· 4j * • 4 ·· ·*· «· • · · · • · * · • '••l ··· • · • 4' »· které mohly při experimentu pokusné osoby konzumovat. Navíc dostávaly stejné pokusné osoby práškový polyfenol připravený ze stejné šarže červeného vína použité při studii. Prášek byl skladován při teplotě -20 °C (PP1) a čerstvý vzorek byl připraven v červnu 1996 (PP2). Studie započaly na začátku září 1995 a trvaly přibližně jeden rok.

Skupiny podle testovaných látek

1) Červené víno Cabernet Sauvignon (375 ml), obsahující 1,8 g/l polyfenolů

2) bílé víno Vin ordinaire(375 ml), obsahující 0,2 g/l polyfenolů

3) práškové polyfenoly červeného vína (vyrobené ze stejného vína jak bylo uvedeno pro skupinu 1), 1 g ve dvou želatinových kapslích

4) bílé víno obsahující v roztoku 1 g polyfenolů červeného vína (viz níže)

5) vodka a limonáda (10 % obj. alkoholu), 400 ml na den

6) 50 mg/den anthocyaninů, ve formě extraktu ze slupky hroznů (Sefcal, St Julien de Peyrolas, Francie) podávaného jako nápoj

7) matoliny červeného vína (French Paradox™, Arkopharma, Nice, Francie) podávané jako kapsle (3 denně), každá kapsle obsahuje 250 mg matolin

8) proanthocyanidiny semen hroznů jako Endotelon™ kapsle, (Sanofi-Winthrop, Francie) (3 denně), každá kapsle obsahuje 150 mg proanthocyanidinu;

9) extrakt zeleného čaje (Polyfenon™, Mitsui Norin, Fujieda, Japonsko), 3 kapsle denně, každá kapsle obsahuje 100 mg čajových katechinů následujícího složení; 1,6 % gallokatechinu, ·»*»

- 22 «« «»«« «· • · » · · * · • . · ♦·* · · · · ·'#.'· · , · ·»* ··* • · · · · • *· ··♦ ** ·«

19,3 % epigallokatechinu, 6,4 % epikatechinů, 59,1 % gallátu epigallokatechinu a 13,7 % gallátu epikatechinů

Vzorky krve byly odebírány do K₃ EDTA (1 mmol/l) 12 hod po večeři, před a na konci období konzumace vinného produktu. Vzorky byly centrifugovány při 2000 x g 15 min při 4 °C pro získání plazmy. LDL byl oddělen ultracentrifugací v hustotním gradientu s použitím stolní centrifugy Beckman Optima TLX s rotorem TLA 100.4 (Beckman, Palo Alto, CA) následujícím způsobem; do plazmy byl přidán bromid sodný do hustoty 1,3 g/ml a podvrstven pod roztok s hustotou 1,006 g/ml. Centrifugace probíhala při 100 000 ot/min 20 min při 4 °C. Oranžovožlutý pruh LDL byl oddělen a centrifugován s roztoky o hustotě 1,154 a 1,063 g/ml 30 min při 100 000 ot/min a4°C.

Viditelná vrstva LDL byla oddělena a dialyzována s 10 mM fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem a s 2 pM EDTA 1 hod v dialyzační kazetě (Pierce Slide-A-Lyzer, Perstorp Biotec Company, USA) při 4 °C 1 hod a potom s 10 mM fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem přes noc.

Celkové polyfenoly byly stanoveny v plazmě a ve frakci LDL metodou Singleton & Rossi (1965), Amer. J. Enology a Viticuture 16, 144 - 158. Ve stručnosti, celkové polyfenoly v plazmě a LDL byly měřeny odběrem 125 pl plazmy nebo 400 pl LDL a doplněním do 500 pl vodou. Tato směs byla přidána k 2,5 ml Folinova činidla (zředěného 1:10) a 2,0 ml uhličitanu sodného (75 g/l). Po dobrém promísení byl roztok inkubován při pokojové teplotě 2,5 hod a potom centrifugován při 2500 ot/min 8 min. Optická hustota supernatantů byla měřena pří 765 nm. Jako srovnávací standard byla použita kyselina gallová.

-23• 444 * » ·44· 4« 44 · 4 · I 4 · · 4 4

44444 *4<4 · 4 4 4 · *»· 444

4 * 444 4 »

444 44 444 44 ««

Protein byl stanoven Bradfordovou metodou (Bradford (1976),

Anal. Biochem. 72, 248 - 54) použitím kitu s obsahem činidla Bioquant (Merck, Darmstadt, Německo),

Pro stanovení antioxidační aktivity byly použity dvě nezávislé metody.

1) Oxidace LDL v přítomnosti mědi

Lipoprotein (50 mg LDL proteinu/l) byl inkubován v přítomnosti síranu měďnatého (5 mM) při 37 °C 5 hod. Tvorba konjugovaného dienu byla kontinuálně monitorována měřením přírůstku absorbance při 234 nm a délka lag-fáze před tvorbou dienu byla určena metodou Esterbauer a další (1989), Free Radíc. Res. Commun. 6, 67 - 75. Obr. 1 ukazuje graf tvorby konjugovaného dienu (měřením absorbance při 234 nm) v závislosti na čase (v min). Jsou uvedeny typické křivky pro vzorky odebrané na začátku pokusu (0) a po 2 týdnech. Délka lagfáze se měří extrapolací lineární části vynesených křivek na osu x (znázorněno přerušovanými čarami). Konzumace prostředků podle vynálezu bude s výhodou způsobovat prodloužení trvání lag-fáze o 2 min nebo více.

2) Peroxidy lipidů v plazmě

Všechny lipidy plazmy a lipoproteiny byly selektivně odstraněny materiálem PHM-L-liposorb (CalbioChem-Novabiochem UK). Suchý PHM-L-liposorb (20 mg) byl suspendován v 0,25 ml 150 mM chloridu sodného s obsahem 10 mM citrátu sodného ve 2 ml hnědé mikrocentrifugační zkumavce, obsah byl zamíchán a ponechán 5 min ekvilibrovat. Potom byla k suspenzím liposorbu přidána plazma (0,5 ml) nebo fyziologický roztok (blank), směs byla zamíchána a zkumavky vloženy na 15 min do rotační míchačky. Po centrifugací (12 000 x g/1 min) byl supernatant odlit a gel liposorbu dvakrát promyt

4444 • 4 4444 44 44

4 · · ·

44« 9 4 « • 4 4 444 44

4 4

444 44 44

1,5 ml fyziologického roztoku s následným promícháním a centrifugací. Promytý gel liposorbu byl suspendován v 1,5 ml činidla cholesteroloxidáza-jodid (BDH-Merck) a umístěn na rotační míchačku na 60 min. Po centrifugací (12 000 x g, 3 min) při pokojové teplotě byla změřena optická hustota čirého supernatantu ve spektrofotometru při 405 nm proti blanku s fyziologickým roztokem (Gorog a další (1994), Atherosclerosis 111, 47 - 53).

Konzumace prostředků podle vynálezu bude s výhodou vést ke snížení koncentrace lipidových peroxidů v plazmě alespoň o 0,1 pmol/g proteinu.

Výsledky

Získaná hodnoty byly porovnány před a po pokusu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1 a podrobněji v tabulkách 2 až 6. Jak je ukázáno v tabulce 1, produkty obsahující dostatek polyfenolů vína (červené víno, PP1, PP2, bílé víno + PP1) zvýšily koncentrace polyfenolů v plazmě a LDL a antioxidační účinky u LDL, jak bylo měřeno v testech 1 a 2 výše.

Dva práškové polyfenoly (PP1, PP2) poskytly výsledky stejného řádu jako ekvivalentní množství červeného vína.

Při použití bílého vína, práškového anthocyaninu (Sefcal™, extrakt ze slupek hroznů používaný jako potravinářské barvivo), výlisků červeného vína, kapslí French Paradox™ (Arkopharma) nebo Endotelon™ (Sanofi-Winthrop, proanthocyanidinový preparát ze semen hroznů), i extraktu zeleného čaje (Polyfenon™) s obsahem katechinů a jejich esterů, nebyl zjištěn žádný účinek.

Aktivní polyfenolový preparát obsahoval veškeré polyfenoly červeného vína a byl opatrně zpracován pro zabránění jejich oxidaci. Navíc bylo ukázáno, že u pokusných osob konzumujících červené vino nebo práškový polyfenol získaný z červeného vína nebo ze slupek

- 25 ♦ ··· •

• 9 «9 «·9· ·· ·9 «99 9 9 9 9

9 999 9 9 * *

9 9 9 9 999 >99

9 9 « 9

999 99 *9 hroznů došlo ke zvýšení obsahu polyfenolů v plazmě a izolovaném LDL.

Pro potvrzení antioxidační aktivity preparátu byl použit druhý test, při kterém byla plazma smísena s absorpční pryskyřicí, která odstranila lipidy a lipoproteiny, a v pryskyřici byl stanoven obsah peroxidů lipidů. U pokusných osob, které konzumovaly červené víno nebo polyfenolový preparát, byl obsah lipidových peroxidů snížen.

. . . Dosažený účinek byl opět řádově stejný u práškového polyfenolů i u ekvivalentního množství červeného vína, ze kterého byl polyfenol získán.

Tyto experimenty ukazují, že po požití červeného vína se polyfenoly absorbují a objevují se v plazmě a LDL, a že polyfenoly izolované z vína mohou mít podobný účinek. Navíc mají absorbované polyfenoly silné antioxidační účinky. Způsob působení polyfenolů může být různý. Polyfenoly mohou primárně „vychytávat“ kovové ionty jako je měď a železo, které podporují tvorbu peroxidů lipidů in vivo. Tyto chelatované ionty jsou jako prooxidanty neúčinné. Polyfenoly obsahují pro svůj vysoký obsah hydroxylových skupin chemické struktury, o kterých je známo, že chelatují kovové ionty, a tím ruší jejich katalytické vlastnosti.

Další mechanismus může být působení ve funkci látky, která se sama přednostně vzhledem k LDL oxiduje, jak je tomu v případě alfatokoferolu. Vynález však není omezen na kterýkoliv konkrétní způsob | ’ účinku.

Pro výzkum důležitosti odstranění EDTA z preparátu před katalytickou oxidací mědí bylo provedeno srovnání za pomoci dialýzy s a bez EDTA, a s použitím kolony s pryskyřicí. Jestliže se k dialyzátu přidá EDTA, nedošlo k prodloužení délky lag-fáze, kterou poskytoval práškový polyfenol červeného vína, nebo byla tato doba podstatně snížena. Dialýza bez EDTA a metoda s kolonou poskytla podobné výsledky. Neúspěch předcházejících autorů (de Rijke a další (1996),

4 4

• ··*· e · · * •· 4 · 44* 444 • 4 4 4 4

4 4 4 4 4 · · ·

Am. J. Clín. Nutr. 63, 329 - 34) při získání účinku červeného vína u dobrovolníků by mohl být vysvětlen přítomností EDTA v jejich preparátech použitých pro oxidaci katalyzovanou mědí.

Tabulka 1

Souhrn výsledků studie polyfenolů vína na dobrovolnících

... Polyfenoly Antioxidant Aktivita .

LDL v plazmě

Produkt	No.	Plazma	LDL	Oxidace s mědí	Peroxidy lipidů
Červené víno	9	+	+	+	+
Bílé víno	9	-	-	-	-
prášek PP 1	9	+	Μ-	+	+
prášek PP2	6	+	Ι	+	+
Bílé víno+PP1	6	+	+	+	+
Alkoholický nápoj	6	-	-	-	-
Anthocyaniny	5	-	-	-	-
Matoliny červeného vína	6	-	-	-	ND
Proanthocyanidiny semen hroznů	6	-	-	-	-
Extrakt zeleného	7				ND

čaje + - pozitivní účinek = bez účinku

ND = nebylo prováděno »444 *

- 27 Tabulka 2

Vliv vína a vinných produktů na koncentrace polyfenolů v plazmě mq/g proteinu ± (S.D.) • 4 «4»· 44 44 k 9 · >4 ·· * » 4 4 4 4 4 «4 I

4 «44

Produkt	No.	0	2 týdny	Hodnota P, párovaný t-test
Červené víno	9	16,2+5,6	22,6±2,7	0,008
Bílé víno	9	18,9±5,0	20,3±1,4	0,450
PP1	9	21,0±2,9	26,9±5,3	0,009
PP2	6	24,5 ± 1,4	26,0±1,8	0,070
Bílé víno + PP1	6	17,6±4,0	22,6+1,7	0,020
Alkoholický nápoj	6	23,9±1,0	24,0±1,2	0,860
Anthocyaniny	5	19,2±6,4	21,4±3,1	0,580
Matoliny červeného vína	6	22,6±0,7	23,4±1,2	0,158
Proanthocyanidíny semen hroznů	6	20,4±6,7	21,3±7	0,380
Extrakt zeleného	7	21,3+1,2	22,1+1,6	0,295

čaje

- 28 Tabulka 3

Účinek vína a vinných produktů na polyfenoly v LDLfmg/g proteinu ±

S.D.)

4444 * ·· 4 4 · »4 4 · ··· · · · · ·

4 4 4 · · • 4 444 ·· ···

9«

4 4

4» 4

444 44«

4 ··

Produkt	No	0	2 týdny	Hodnota P pár. t-test
Červené víno	9	34,0+6,2	42,3±8,1	0,001
Bílé víno	9	39,3+6,1	38,5 ±10,0	0,820 '
PP1	9	37,Q±4,6	47,6±6,2	0,002
PP2	6	35,5±5,1	46,0±10,0	0,006
Bílé víno +PP1	6	33,5±6,3	54,2±21,0	0,040
Alkoholický nápoj	6	39,4±4,5	43,7±1,6	0,084
Anthocyaniny	5	40,0±5,6	36,2±6,0	0,520
Matoliny červeného vína	6	41,7±3,6	38,4±3,4	0,063
Proanthocyanidiny semen hroznů	6	38,2±4,8	40,2+3,7	0,240
Extrakt zeleného	7	36,9±6,2	37,3+5,3	0,840

čaje

- 29 Tabulka 4

Účinek vína a vinných produktů na obsah peroxidů lipidů v plazmě (umol/g proteinu (± S. D.)

Produkt	No	0	2 týdny	Hodnota P pár.t-test
Červené víno	9	2,13±0,70	1,54±0,48	0,056
Bílé víno	9	1,73±0,55	’2,15±0,66	0,158
PP1	9	1,90±0,52	1,37±0,38	0,051
PP2	6	1,88±0,24	1,51+0,21	0,018
Bílé víno + ppi	6	1,70±0,51	1,19+0,19	0,040
Alkoholický nápoj	6	1,60±0,25	1,50±0,40	0,460
Anthocyaniny	5	3,04±0,73	2,93±0,56	0,260
Matoliny červeného vína	6		nebylo provedeno
Proanthocyanidiny semen hroznů	6	1,69±0,13	1,47±0,46	0,289
Extrakt zeleného čaje	7		nebylo provedeno

- 30 Tabulka 5

Účinek vína a vinných produktů na oxidaci LDL mědí: střední doba lagfáze v minutách (± S. D.)

9« 9999 » * *

9 99

9« ·*·

9« ·♦ ¹ · · Σ

I 9 · *

99« ··· • · »·

Produkt	No	0	2 týdny	Hodnota P pár. t-test
Červené víno	9	51,6±7,6	69,3±Í8,3	0,008
Bílé víno	9	63,8±18,5	63,6±9,9	0,950
PP1	9	51,7±5,6	65,9±12,8	0,006
PP2	6	60,0±9,2	73,7±11,0	0,001
Bílé víno + PP1	6	54,8±2,6	66,5+5,2	0,007
Alkoholický nápoj	6	54,0±4,6	56,6±4,2	0,140
Anthocyaniny	5	53,0±4,4	51,5±3,11	0,650
Matoliny červeného	6	62,0±2,7	60,3±5,2	0,500
vína
Proanthocyanidiny semen hroznů	6	69,5±24,0	62,8+5,4	0,499
Extrakt zeleného čaje	7	66,2±4,4	59,3±5,4	0,629
Závěry
Antioxidační účinky	1 g práškového	polyfenolů	vína jsou
ekvivalentní polovině	láhve	červeného vína. I	Potenciální	profylaktický

účinek proti koronárnímu srdečnímu onemocnění by měla denní dávka 1 - 2 g práškového polyfenolů. Další produkty jako extrakt ze slupek hroznů používaný v potravinářském průmyslu jako barvivo, proanthocyanidinový preparát, kapsle French Paradox a extrakt zeleného čaje obsahující katechiny a jejich estery byly neúčinné.

- 31 • 9 «* 999« 9« ·· * 9 9 9 9 «999 9 99 9

9 9 9· 9 9 9 9 * 9 · 9 9 9

99« * ·*

Příklad 3

Jednoduchým smísením a běžným způsobem plnění byly vyrobeny kapsle z následujících složek.

mg

Práškový polyfenol vína 500

Kyselina stearová 25

SteáYan hóřěčnaty ' ' 50 ....... '

Mikrokrystaliclá celulóza _25

600 mg

Denně se berou dvě nebo čtyři kapsle s jídlem nebo po jídle.

Příklad 4

Jednoduchým smísením a běžným způsobem plnění byly vyrobeny kapsle z následujících složek.

mg

Práškový polyfenol vína 400 a tokoferol 150

Kyselina listová 0,2 mg (1:50 v diluentu) 10

Lecithin 20

Včelí vosk 20

600 mg

Denně se berou s jídlem alespoň tři kapsle.

Příklad 5

Do práškového výživného prostředku poskytujícího 1696 kJ denně (42 g proteinu, 43 g uhlohydrátu a 8 g tuku, doporučená denní

- 32 • FFF ·· F F F ··

F FFFF

FFF F F F ·

FF FFF ···

F F F

FFF ·· · F dávka vitaminů a minerálů) dodávaného pod obchodním názvem Cambridge Diet (Cambridge Health Pian Ltd., Norwich, UK) se přidá 1 g práškového polyfenolů vína. Jedna denní dávka (3 jídla/den) poskytne příjem polyfenolů ekvivalentní 0,5 I červeného vína/den.

Příklad 6

0,5 g celkových polyfenolů získaných z červeného vína se přidá do 250 ml bílého jogurtu s obsahem jahodové příchuti a sladidla. Červeně zbarvený polyfenolový materiál zlepší vzhled jogurtu a poskytne zdravotně prospěšnou potravinu s velmi dobrou chutí.

Příklad 7

Následující prostředek je nealkoholický nápoj ve formě prášku určeného pro smísení s vodou.

Monohydrát dextrózy 300 g

Kyselina citrónová 32 g

Citrát sodný 5 g

Grapefruitová příchuť 6 g

Citrónová příchuť 1,4 g

Pomerančová příchuť 1,4 g

Aspartam 1 g

Celkové polyfenoly červeného vína (jako příkl. 1) 21 g g prášku se rozpustí v 1 l vody. Příjem 250 ml poskytne 0,75 g aktivních polyfenolů.

-334444 * ·4 .

·' 4' «· 4·«4 44 44

I · 4' 4 · 4 4

444· * 4« 4 « 4 · 4 *' 44 «44 444 « « t b t · · · ·« ·· ·* ··· ·’ ··

Příklad 8

Následující alkoholický nápoj je určen pro distribuci v lahvích k přímé spotřebě.

Odvzdušněný tonik 450 ml

Vodka 50 ml

Celkové polyfenoly vína (jako v příkl. 1) 1 g

Polyfenol se rozpustí v odvzdušněné směsi pro tonik a potom sytí oxidem uhličitým pod tlakem pro poskytnutí syceného nápoje. Do lahví se rozplňuje 450 ml, přidá se vodka a láhev se uzavře šroubovacím uzávěrem.

Příklad 9

Přibližně 2000 kg výlisků získaných z bílých hroznů se dobře míchá v běžném mixéru s 2500 I destilované vody při 30 °C 4 hod. Směs se potom z mixéru vyjme, umístí do nádrže a ponechá usadit 2 hod, supernatant se odtáhne a zfiltruje za získání čiré tekutiny. Pro absorpci polyfenolů na pryskyřici byl použit stejný postup jako v příkladu 1 s použitím podobných množství pryskyřice Diaion HP-20 a eluentu.

Při koncentraci vodného ethanolového roztoku na obsah 35 % sušiny se získá červeně zbarvená pevná látka o hmotnosti přibližně 600 g. Tato hmota byla rozpuštěna v .10 % vodném alkoholu a potom sušena rozprašovacím způsobem za získání pevné látky nerozpustné ve vodě, ale rozpustné ve vodném alkoholu. Zbylý roztok byl potom pod dusíkem rozprašovacím způsobem sušen za získání 1,4 kg červeně zbarveného materiálu s obsahem přibližně 50 % polyfenolů. Tento prostředek byl podobný jako prostředek získaný v příkladu 1.

9···

- 34 9« 999* 99 ··

9 * 9 9 9 · * 999 9 9 99 *

9 9» 999 9·9

Tento způsob má nevýhodu, že získání extraktu před absorpcí na pryskyřici je obtížnější a časově náročné. Ačkoliv je výtěžek nižší, komerční výhody má snadná dostupnost laciných slupek hroznů.

Práškový nápoj byl rekonstituován a podáván 2 týdny pěti dobrovolníkům podle protokolu popsaného v příkladu 2. Výsledky testu oxidace LDL s katalýzou mědí byly následující:

před po 2 týdnech

Změna

78,8 ± 7,2 min

93,0 ± 9,4 min

14,2 ± 4,8 min (Hodnota p 0,003)

Závěrem je možno uvést, že extrakt ze slupek hroznů (v tomto případě bílých hroznů), tj. výlisků, by mohl být účinným antioxidantem při orálním podávání po dobu dvou týdnů.

Příklad 10

Plazmatické LDL (od skupiny dobrovolníků popsané v příkladu 2) byly odděleny ultracentrífugací a dialyzovány proti fosfátovému pufru jak bylo popsáno v příkladu 2. Látky s obsahem polyfenolu byly analyzovány na obsah polyfenolů metodou Singleton & Rossi (1965), Amer. J. Enology a Viticuture 16, 144 - 158. Plazmatické LDL (0,05 pg LDL v 1,0 ml) byly inkubovány se 100 pl roztoku síranu měďnatého (konečná koncentrace 5 pM) při 37 °C a trvání lag-fáze bylo stanoveno testem na dieny s katalýzou mědí popsaným v příkladu 2. Schopnost látek obsahujících polyfenoly prodloužit trvání lag-fáze in vitro byla stanovena přídavkem 4 pg polyfenolového preparátu k 1 ml LDL před přídavkem síranu měďnatého. Bylo použito následujících testovaných látek:

-35»»·* » ·· j··· *· • »·, ·ι · ». · * · * · ···> · , a. t « a · .1 a a a ta. ta a.

aa »·» ·· ·»♦’ ··

1) Červené víno Cabernet Sauvignon

2) Bílé víno Vin ordinaire

3) Polyfenoly červeného vína, připravené podle příkladu 1

4) Anthocyanin Sefcal™ podle popisu v příkladu 2

5) Proanthocyanidiny Endotelon™ popsané v příkladu 2

6) Kapsle French Paradox (matoliny červeného vína) popsané v příkladů 2

7) Polyfenon™ (katechiny zeleného čaje), jak je popsáno v příkladu 2 ««· ·

Výsledky získané in vivo při orální konzumaci testovaných látek po dobu dvou týdnů se porovnávají s výsledky in vitro v tabulce 7 níže. Výsledky in vitro jsou střední hodnotou ze čtyř stanovení. Délka lagfáze se zvýšila u všech substancí podávaných v množství 4 pg/ml. Pozorované účinky je možno řádově srovnat takto: polyfenolový prášek = anthocyaniny > katechiny zeleného čaje > proanthocyanidiny semen hroznů > červené víno > bílé víno > matoliny červeného vína.

Jestliže byly látky podávány orálně a LDL separován a testován podle popisu v příkladu 2, prodloužení trvání lag-fáze poskytly pouze červené víno a polyfenoly červeného vína, všechny další látky s obsahem polyfenolů byly neaktivní. To jasně ukazuje, že z výsledků in vitro je nemožné předvídat účinky in vivo. Neúčinnost většiny látek in vivo by mohla být způsobena jejich nedostatečnou absorpcí ze střeva nebo nemožností inkorporace do LDL.

- 36 9999'

9' «9 1*99 99 ·· · * . 9 9*·

9 9 9 9) 9 99 9

9 99 999 999

9 9 9 * «9 999 99 *·

Tabulka 6

Porovnání látek s obsahem polyfenolů in vitro a in vivo při testu měď -

dien	In vitro	In vivo
Látka			Prodloužení lag- fáze		Prodloužení lag- fáze
	Obsah polyfenolu	min	%	Účinek**	Polyfenoly příjem/den	min	%	Účinek
Červené víno	1,8 g/l	26	100	++	675	17,8	100	++
Bílé víno	0,2 g/l	22	85	+	75	0,22	-1	-
Práškový polyfenol*	450 mg/g	65	230	+++	450	14,2	80	++
Anthocyaniny červeného vína	500 mg/g	66	255	+++	500	-1,5	-8
Proanthocy- aniny semen hroznů	425 mg/g	50	190	+++	750	-6,7	-38
Matoliny červeného vína..	210 mg/g	18	70	+	156	-1,7	-10
Katechiny zeleného čaje	960 mg/g	75	290	+++	300 4	-6,8	-38

* v kapslích * pozorované účinky: + malé, ++ střední, +++, velké, - žádné.

- 37 *444 . ϊ

4· *·*· • 4

4·*..

' ι • ♦ 1 · ♦ * ί * »· ·,€ · .* Jr

Příklad 11

Dvacet výše uvedených dobrovolníků z příkladu 2 bylo rozděleno do skupin (A a B) po 6 - 9 osobách, kterým bylo dva týdny podáváno:

A) Nápoj s příchutí červeného rybízu (330 ml) obsahující celkem 1 g polyfenolů červeného vína a smísený s komerčně dostupným práškem (cukr, kyselina citrónová, citran sodný, aspartam, synthetická příchuť; Cambridge Manufacturing Co. Ltd., Corby, UK), do kterého byla bezprostředně před použitím přidána voda; nebo

B) kapsle obsahující práškový polyfenol červeného vína připravený výše uvedeným postupem s dávkou 2 g polyfenolů červeného vína /den.

Produkty byly rozděleny na stejné díly a byly podávány po obědě a večeři.

Vzorky plazmy byly odebrány a centrifugovány v ultracentrifuze pro získání LDL jak bylo popsáno v příkladu 2.

Byly použity následující tři metody zpracování LDL před oxidací:

a) Konečná dialýza bez EDTA.

LDL byly dialyzovány jednu hodinu s 10 mM fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem s obsahem 2 pM EDTA v dialyzační kazetě (Pierce Slide-A-Lyzer Perstorp Biotec Company, USA) při 4 °C 1 hod, a potom s 10 mM fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem přes noc.

b) Kontinuální dialýza s EDTA

LDL byly odděleny a dialyzovány při 4 °C jak bylo popsáno výše s tím rozdílem, že dialýza probíhala v 10 μΜ EDTA v 10 mM fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem.

- 38 **4» ' £ •λ · . > 1 *4 ··· ·

4 * é 4 *·♦

4' * *, μ » r

U ·· « · * * ΐ · * '··.·« ·Μ * Ρ· >

c) Zpracování na koloně

LDL byly naneseny na odsolovací kolonu EcNo-pac 10DG (BioRad Labs, UK), Kolona byla dvakrát promyta s upraveným 10 mM PBS [pryskyřice chelex-100 (Bio-Rad, UK), 5 g/l PBS mícháno a dekantováno). 600 pl LDL bylo potom naneseno na kolonu a eluováno 3 ml pufru PBS s průtokem 0,6 ml/min s použitím - peristaltického’ čerpadla Ismatec IPC Peristaltic pump (Ismatěc,'

Weston Super Maře, UK).

Potom byla prováděna peroxidace katalyzovaná mědí s měřením’ délky lag-fáze stejně jako v příkladu 2, Výsledky jsou ukázány v tabulce 7.

Konzumace polyfenolů červeného vína buď ve formě nápoje (1 g/den) nebo kapslí (2 g/den) vedly k prodloužení lag-fáze (jestliže byla v konečném dialyzátu vynechána EDTA) 30 %, popřípadě 21 % a rovněž při použití metody s úpravou na koloně 12 %, popřípadě 22 %. Přídavek EDTA k dialyzátu zrušil účinek dávky polyfenolů červeného vína 1 g/den a poskytl pouze malé prodloužení lag-fáze 7 % pro 2 g/den.

*4

Tabulka 7

Délky lag-fáze (min) při peroxidaci katalyzované mědí při použití různých způsobů odsolení LDL

Doplněk	Č.	Dialýza	Dialýza	Bez dialýzy
		bez EDTA	s EDTA	kolona
Nápoj s polyfenoly vína
(1 g/dén)	6' '
Výchozí hodnota		60,0+5,3	64,3±3,8	54,2±4,6
Po 2 týdnech		77,7±8,4	64,5±3,9	60,6±4,7
Rozdíl středních hodnot		17,7±3,1	0,3±0,1	6,4±0,1
Hodnota P		0,02	0,9	0,005
Kapsle (2 g/den)	6
Výchozí hodnota		62,7±2,5	67,7±3,6	54,0+2,2
Po 2 týdnech		75,8±2,8	72,2±3,1	65,8±2,2
Rozdíl středních hodnot		13,2±0,3	4,5+0,5	11,8±0,1
Hodnota P		0,004	0,02	0,003

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí aktivního prostředku s obsahem polyfenolů (vhodně získaného z hroznů, vína nebo vedlejších produktů při výrobě vína) pro léčení koronárního srdečního onemocnění a dalších onemocnění spojených s proliferaci buněk hladkého svalstva jako je ateroskleróza, restenóza, mrtvice a nádory tlustého střeva a dělohy, fibroidy nebo fibromy dělohy.

Autoři vynálezu překvapivě zjistili, že je možné vyrobit prostředek s obsahem polyfenolů (např. z červeného vína), který bude stimulovat při orálním podávání člověku produkci celkového a aktivního TGF-p-1.

• ·» ·’

-40 Bylo ukázáno, že při podávání červeného vína nebo prostředku s obsahem polyfenolů získaných z červeného vína ve formě prášku nebo nápoje ústy člověku dojde ke zvýšení hladiny celkového a aktivního TGF-β-Ι v plazmě. Bílé víno, které obsahuje malé množství polyfenolů, je neaktivní.

Dávka prostředku s obsahem polyfenolů je závislá na stupni aktivity materiálu, ale bude mezi 10 mg a 10 g na den. Pro celkové . polyfenoly získané.z vína je-výhodná dávka 0,1-4 g/den- a výhodněji T

- 2 g/den, která je ekvivalentní 0,5 až 1 I červeného vína na den.

Přiklad 12

Červené víno, bílé víno a prostředky s obsahem polyfenolů získané z červeného vína (podle popisu v příkladu 1) ve formě prášku nebo nápoje podávané dobrovolníkům orálně byly studovány z hlediska jejich účinků na obsah TGF-β v plazmě.

Zdraví dobrovolníci (30 mužů ve věku 35 až 65 let) bylo požádáno, aby na dva týdny přerušili konzumaci vína. Dostávali buď 375 ml červeného vína nebo bílého vína nebo 1 g celkových polyfenolů červeného vína (připravených ze stejného vína Cabernet Sauvignon jako výše) buď ve formě kapslí nebo ochuceného nápoje ve 330 ml vody. Všechny doplňky byly konzumovány dvakrát denně po jídle po dobu dvou týdnů.

Po skončení podávání byly odebrány vzorky krve do K₃EDTA (1 mmol/l) a centrifugovány pro získání plazmy, která byla před analýzou skladována při -70 °C. Celkové polyfenoly v plazmě byly měřeny metodou Singleton & Rossi (1965), Amer. J. Enology a Viticuture 16, 144 - 158. Celkový TGF-β-Ι byl stanoven imunologickým testem s použitím dvou různých polyklonálních protilátek (metody 1 & 2, popsané níže):

-41 to ·* • to , ·*·* . J !

to *· ··' ··* *·

·· t

*· · to

Metoda 1

Obsah celkového (latentní + aktivní) TGF-β byl měřen testovací soupravou Quantikin® human TGF-β immuno assay kit firmy R&D systems (Abingdon, Oxford, UK). Tento test používá kvantitativní sendvičové imunologické techniky. Rozpustný receptor TGF-p typu II, kterým byla předem potažena mikrotitrační destička, se váže na TGFβ-Ι. Standardy a vzorky se pipetují do jamek a jakýkoliv přítomný TGFβ-Ι se váže na imobilizóvariý receptor. Po odmytí veškerých nenavázaných látek se do jamek přidá s enzymem spojená polyklonální protilátka specifická pro TGF-β-Ι, aby se sendvičově navázala na TGF-β-Ι imobilizovaný při první inkubaci. Po promytí s cílem odstranit nenavázanou protilátku se do jamek přidá enzymové činidlo a substrátový roztok, který způsobí působením enzymu zbarvení. Intenzita vytvořeného zbarvení je úměrná množství přítomného TGF-β-Ι.

Před provedením testu se latentní TGF-β přemění na aktivní formu přidáním kyseliny octové a močoviny, inkubací 10 min a potom neutralizací roztokem hydroxid sodný/HEPES. Touto metodou se určí (latentní + aktivní) TGF-βΊ. Aktivace latentního TGF-β byla provedena následujícím způsobem; k 0,1 ml plazmy bylo přidáno 0,1 ml 2,5 N kyseliny octové/10M močoviny, směs byla dobře promíchána a inkubována 10 min při pokojové teplotě. K tomuto roztoku bylo přidáno 0,1 ml 2,7 N NaOH/1 M HEPES pro neutralizaci vzorku a směs byla dobře promíchána. Před testem byl aktivovaný vzorem plazmy desetkrát naředěn kalibračním ředicím sérem RD6M dodaným výrobcem soupravy.

Vlastní test probíhal následujícím způsobem: 200 pl vzorku nebo standardu bylo přidáno do každé jamky mikrotitrační destičky. Destička byla potom překryta lepivým proužkem plastického materiálu a inkubována 3 hod při pokojové teplotě. Každá jamka byla potom odsáta a třikrát promyta 400 pl promývacího pufru. Potom bylo do

-42 9 ♦ 9 Β Β> ·• 99 • 99 ·· ·<ί · * ’

9« 91 9

99.

999

9· každé jamky přidáno 200 μΙ konjugátu TGF-β-Ι, destička byla znovu překryta čerstvým adhezívním páskem a inkubována při pokojové teplotě 110 min. Jamky byly potom odsáty a třikrát promyty 400 μΙ promývacího pufru. Do jamek bylo přidáno 200 μΙ roztoku substrátu a jamka byla inkubována 20 min při pokojové teplotě. Do každé jamky bylo potom přidáno 50 μΙ 2 N H₂SO₄ a byla změřena optická hustota při 450 nm.

Metoda 2

Bylo použito stejné metody jako výše s tím rozdílem, že TGF-β nebyl před testem aktivován a namísto polyklonální protilátky pro TGFβ-1 byla použita protilátka BDA-19 (R&D systems, Abingdon, Oxford, UK). Touto metodou se zjistí množství aktivní formy TGF-β-Ι.

Konzumace prostředku podle vynálezu poskytne u subjektu s výhodou zvýšení hladin TGF-β-Ι o alespoň 1,5 ng/ml podle testu metodou 1, nebo o alespoň 0,5 ng/ml podle testu metodou 2.

Výsledky

Jak je uvedeno v tabulce 8, hladina polyfenolů v plazmě se zvýšila u červeného vína, ale ne u bílého vína a u kapslí a nápoje s obsahem polyfenolů. Přírůstek TGF-β-Ι byl pozorován oběma metodami u červeného vína a u kapslí a nápoje s obsahem polyfenolů, ale ne u bílého vína. To ukazuje, že polyfenoly červeného vína zvyšují jak celkové množství (latentní + aktivní) TGF-β-Ι, tak i množství aktivní formy TGF-β-Ι. Z toho vyplývá závěr, že polyfenoly vína zvyšují celkovou hladinu TGF-β-Ι a mají schopnost inhibovat proliferaci buněk hladkého svalstva cév.

»•44

-43 4 **

4 • 4* ·« »4« • 4

4- · «

4? 4

4. 4 ·· • 44·' « ···>

• •4'

-4·· ···

-. 4 4’ • 4 ·»

Tabulka 8

Vliv červeného vína a polyfenolů červeného vína na obsah polyfenolů v plazmě a celkový obsah TGF-β dvěma rozdílnými metodami

Doplněk	No.	Polyfenoly	Celkový TGF-β
Červené víno	8	mg/g proteinu	Metoda 1 Metoda 2 ng/ml
Výchozí hodnota		16,2 ± 1,87	6,6 ±1,3	5,0 ±0,4
Po 2 týdnech		22,6 ± 0,91	15,5 ± 3,1	6,5 ±0,5
Rozdíl střed, hodnot		6,33 ± 0,96	8,9 ± 1,8	1,5 ± 0,1
Hodnota P Bílé víno	8	0,002	0,01	0,01
Výchozí hodnota		18,9 + 1,67	9,7 ±2,5	5,6 ± 0,6
Po 2 týdnech		20,2 ± 0,91	11,9 ± 3,4	5,3 ± 0,6
Rozdíl střed, hodnot		1,33 ± 0,76	2,2 ± 0,9	0,3 ±0,1
Hodnota P Kapsle s polyfenoly	8	0,5	0,5	0,8
Výchozí hodnota		21,0 ±0,96	9,0 ±2,3	6,0 ±0,7
Po 2 týdnech		26,9 ± 1,76	19,8 ±3,9	8,5 ± 0,9
Rozdíl střed, hodnot		5,86 ± 0,80	10,8 ± 1,6	2,5 ±0,2
Hodnota P Nápoj s polyfenoly	6	0,02	0,01	0,01
Výchozí hodnota		21,6 ± 0,35	9,2 ±1,1	5,0 + 1,5
Po 2 týdnech		23,6 ± 0,40	15,6 + 2,4	9,9 ± 1,1
Rozdíl střed, hodnot		2,05 ± 0,05	6,4 ±1,3	4,9 ±0,4
Hodnota P		0,03	0,03	0,03

- 44 ·;

Střední hodnota ± sem

Polyfenoly červeného vína (2 g/den) poskytovaly po 4 hod významný pokles koncentrace PAI-1, který byl spojen s významným zvýšením aktivity tPA (tabulka 10). Po hladovění přes noc nebyly pozorovány po 2 týdenním podávání žádné změny. Jak je však vidět v tabulce 11, po 4 hod se po podání vody sníží koncentrace antigenu PAI-1, což ukazuje na to, ze vliv na koncentrací antigenu PAI-1, který byl pozorován po konzumaci prášku s obsahem polyfenolů, byl jednoduše způsoben kolísáním během dne. Podání vody aktivitu tPA významně nezvýšilo, zatímco práškový polyfenol červeného vína poskytl 2,7 násobné zvýšení aktivity tPA. Z toho plyne, že polyfenoly červeného vína poskytují prospěšné účinky při stimulaci fibrinolýzy zvýšením aktivity tPA, ale nemají žádný vliv na koncentraci antigenu PAI-1. tPA podporuje tvorbu plasminu z plasminogenu a plasmin přeměňuje latentní formu TGF-β na aktivní formu, která potom inhibuje růst buněk hladkého svalstva cév (VSMC), který přispívá k růstu aterosklerotických plátů.

Konzumace prostředku podle vynálezu s výhodou způsobí alespoň 2 % snížení maximální agregace destiček (při stanovení výše popsanou metodou) a/nebo zvýšení aktivity tPA alespoň o 0,75 lU/ml (při stanovení výše popsanou metodou).

Claims (23)

1. Potravinový doplněk s obsahem flavonolů v suché. formě získaný z rostlin vyrobený z hroznů, vína nebo vedlejších nebo odpadních produktů při zpracování vína s obsahem flavonolů,

.....vyznačujíc. 1. .se ..tím., že alespoň- -25 -%materiálu v prostředku získaného z rostlin tvoří polyfenoly, prostředek obsahuje alespoň 0,01 % hmotnostních flavonolů a konzumace prostředku člověkem má jeden nebo více z následujících účinků:

inhibice oxidace plazmatických LDL; stimulace produkce TGF-β; inhibice agregace destiček; a stimulace fibrinolýzy.

2. Potravinový doplněk podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsah flavonolů je alespoň 0,1 % hmotnostních.

3. Potravinový doplněk podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsah flavonolů je alespoň 1 % hmotnostní.

4. Potravinový doplněk podle některého z nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že obsah flavonolů tvoří alespoň 0,5 % z celkového obsahu polyfenolu získaného z rostlin v potravinovém doplňku.

-46 ♦,· * 19 **·· » « >#··

11 11· ·♦ »· ·’, ·' · I * ·/ · * * • · · « · · • · ·· ··

5. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsah flavonolu tvoří alespoň 1,0 % z celkového obsahu polyfenolu získaného z rostlin v potravinovém doplňku.

6. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsah flavonolu tvoří alespoň 2 % z celkového obsahu polyfenolu získaného z rostlin v potravinovém doplňku.

7. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje veškeré polyfenoly červeného vína.

8. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje pomocnou látku, ředivo nebo nosič.

9. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více látek zvolených ze skupiny; živiny, antioxidanty, látky s léčebným účinkem (zvláště látky s léčebným účinkem při prevenci a/nebo léčení koronárního onemocnění srdce), příchuti a sladidla.

10. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více látek zvolených ze skupiny; lutein, lykopen, a- nebo β-47IH* · • ♦ · • · • <·· • 9 ·

99 ···

-99 9#·«

91, 9 9

9 ' 9 9«·

9J 9 ·,· «>'. 9 9

99 99999 99

9'tf · * 9. 1 9 9

9,9 9

9 9. 9 9 karoten, vitamin A, vitamin C, vitamin E (α-tokoferol a další aktivní tokoferoly), kyselina listová, selen, měď, zinek, mangan, ubichinon (koenzym Q10), kyselina salycilová, kyselina 2,3dihydroxybenzoová, kyselina 2,5-dihydroxybenzoová a aspirin.

11. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je v jednotkové dávkovači formě.

12. Potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že je ve formě tablety, kapsle nebo pilulky.

13. Nápoj vyznačující se tím, že obsahuje potravinový doplněk podle některého z předcházejících nároků a fyziologicky přijatelnou kapalinu.

14. Způsob výroby nápoje, vyznačující se tím, ž e zahrnuje míšení potravinového doplňku podle některého z nároků 1 až 12 s fyziologicky přijatelnou kapalinou.

15. Nápoj podle nároku 13 nebo způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že fyziologicky přijatelná kapalina obsahuje vodu, vodný roztok, alkoholický roztok, ovocnou šťávu, mléko nebo jogurt.

16. Způsob inhibice oxidace plazmatických LDL u člověka, který zahrnuje: přípravu doplňku podle některého z nároků 1 až 12

0900

-48 ♦ ·· • *

0 0 0 • v ·

00 ·*·

0« 0000 > * 0 • »·*· 0«' 0

0. 0 0/

00 000 *0 00 • «· 0-00 0

0 »·· 000 0 0

00 00 nebo nápoje podle nároku 13 a podání doplňku nebo nápoje subjektu.

17. Způsob stimulace produkce TGF-β u člověka, který zahrnuje: přípravu doplňku podle některého z nároků 1 až 12 nebo nápoje podle nároku 13 a podání doplňku nebo nápoje subjektu.

18. Způsob inhibice agregace destiček a/nebo stimulace fibrinolýzy u člověka, který zahrnuje: přípravu doplňku podle některého z nároků 1 až 12 nebo nápoje podle nároku 13 a podání doplňku nebo nápoje subjektu.

19. Použití doplňku podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání člověku pro inhibici oxidace plazmatických LDL u subjektu.

20. Použití doplňku podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání člověku pro stimulaci produkce TGF-β u subjektu.

21. Použití doplňku podle některého z nároků 1 až 12 pro výrobu farmaceutického prostředku pro podávání člověku pro inhibici agregace destiček a/nebo stimulaci fibrinolýzy u subjektu.

22. Způsob výroby farmaceutického prostředku pro orální podávání člověku pro dosažení jednoho nebo více z následujících účinků u subjektu: inhibice oxidace plazmatických LDL; inhibice agregace destiček; stimulace fibrinolýzy; a stimulace produkce ··«* «· ··«« ·· ·* » I « · · » • Μ» · · · · • · · ··· a·* a · · a aa aaa ·« *·

TGF-β; kde tento způsob zahrnuje výrobu doplňku podle některého z nároků 1 až 12 a výrobu jednotkových dávek doplňku.

23. Produkt, zvláště potravina, vyznačující se tím, ž e obsahuje doplněk podle některého z nároků 1 až 12.