ES2205207T3 - Suplementos alimenticios que contienen flavonoles. - Google Patents
Suplementos alimenticios que contienen flavonoles.Info
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Abstract
SE PRESENTA UNA COMPOSICION SECA QUE CONTIENE FLAVONOL DE ORIGEN VEGETAL ADECUADA PARA EL CONSUMO HUMANO, EN DONDE AL MENOS UN 25% DEL MATERIAL DE ORIGEN VEGETAL EN LA COMPOSICION COMPRENDE POLIFENOLES, TAMBIEN SE PRESENTAN USOS DE LA COMPOSICION.
Description
Suplementos alimenticios que contienen
flavonoles.
Se cree que al alto consumo de vino en Francia es
un factor dietético importante en la baja incidencia de mortalidad
por enfermedad cardíaca coronaria (CHD) y se ha sugerido al menos en
parte para proporcionar una posible explicación para el fenómeno
conocido como "French Paradox" (Renaud & De Lorgeril,
1992), siendo Francia una excepción en comparación con la mayoría de
los otros países debido a que la mortalidad por CHD es baja a pesar
de un alto consumo de grasa saturada.
Existe una considerable literatura sobre los
supuestos efectos beneficiosos del vino tinto en relación con la
prevención de la enfermedad cardíaca coronaria (CHD). Los datos
epidemiológicos sugieren que la protección proporcionada por el vino
es superior a la de otras bebidas alcohólicas tales como la cerveza
y los licores, indicando que factores diferentes al contenido de
alcohol en el vino contribuyen al efecto (St Lerger y otros, 1979;
Reanud & De Lorgeril, 1992). En un estudio prospectivo en
Copenhague, Dinamarca, se determinaron diversos parámetros
(incluyendo el consumo de alcohol, el hábito de fumar y el índice de
masa corporal) en 13.285 personas, seguido por un seguimiento de 12
años de la mortalidad. Se observó que el consumo de bajo a moderado
de vino (pero no cerveza o licores) estaba asociado con una
mortalidad inferior por enfermedades cardiovasculares y
cerebrovasculares y otras causas (Gronbaek y otros, 1995). Estos
resultados confirmaban los presentados previamente en los EE.UU. de
A. (Klatsky y Armstrong, 1993).
Existe una evidencia creciente de que la reacción
en cadena por radicales libres de la peroxidación de lípidos que
implica la oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) juega
un papel contributivo importante en el desarrollo de la
arteriosclerosis y la CHD (Steinberg, 1993).
Frankel y otros (Lancet 1993 341,
454-457) examinaron la capacidad de vino tinto
desalcoholizado diluido para inhibir la oxidación de LDL humana
in vitro, y encontraron que el vino era muy activo como un
antioxidante. Los autores sugirieron que el consumo habitual de vino
tinto puede "reducir la oxidación" de lipoproteínas y reducir
fenómenos trombóticos. Sin embargo, los autores admitieron que "se
necesita saber más acerca de la farmacocinética de los flavonoides
del vino y la absorción y el metabolismo de los fenoles del vino...
si ha de evaluarse adicionalmente el papel potencial de los
compuestos antioxidantes del vino tinto para reducir la CHD".
Los flavonoides pertenecen a un grupo de
substancias llamadas polifenoles (PP), llamadas así debido a que
contienen dos o más grupos fenólicos. Los polifenoles se presentan
abundantemente en el vino tinto y consisten en un gran número de
substancias químicas diferentes de diversos pesos moleculares. Los
componentes polifenólicos principales de las uvas y el vino, y sus
concentraciones, son descritos por Shahidi & Nazck (1995) en
"Food phenolics: sources, chemistry, effects and applications"
(Technomic Publishing Co., Lancaster Pa, USA)
p136-146. Entre los polifenoles existen las
siguientes clases: flavonoides (un término a menudo usado para
indicar polifenoles en general, pero más comúnmente en Europa para
indicar sólo las flavonas), los flavanoles, las proantocianidinas
(también llamadas procianidoles, procianinas, procianidinas y
taninos) y las antocianinas.
Las flavonas son compuestos con una estructura
básica mostrada en la figura 2 en la que dos anillos bencénicos (A y
B) están conectados con un anillo heterocíclico de seis miembros C
que contiene un grupo carbonilo. El anillo B puede enlazarse en las
posiciones 3, 5, 7 y 3', 4', 5' para dar los compuestos llamados
flavonoles. Ejemplos típicos de flavonoles son: quercetina
(posiciones hidroxiladas 3, 5, 7, 3', 4'), kaempferol (hidroxilado
en las posiciones 3, 5, 7, 4') y miricetina (hidroxilada en las
posiciones 3, 5, 7, 3', 4', 5'). Pueden existir naturalmente como la
aglicona o como O-glicósidos (por ejemplo,
D-glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa, etc.).
También se encuentran otras formas de substitución, tales como
metilación, sulfatación y malonilación.
Los flavanoles tienen una estructura básica
mostrada en la figura 3. Los dos flavanoles más comunes son la
catequina (posiciones de los grupos hidroxilo 5, 7, 3', 4') y su
estereoisómero epicatequina. Los grupos hidroxilo pueden
esterificarse con ácido gálico (mostrado en la figura 4). Las
proantiocianidinas son polímeros de catequina y/o epicatequina y
pueden contener hasta 8 unidades o más.
Las antocianinas son substancias coloreadas con
una estructura básica mostrada en la figura 5. A veces se denominan
antocianidinas. Ejemplos típicos son: cianidina (hidroxilada en las
posiciones 3, 5, 7, 3', 4'), delfinidina (hidroxilada en las
posiciones 3, 5, 7, 3', 4', 5') y pelargonidina (hidroxilada en las
posiciones 3, 5, 7, 3'). Los grupos hidroxilo están habitualmente
glicosilados y/o metoxilados (por ejemplo malvidina en 3', 5').
Dentro del término general “polifenoles” se
incluyen los ácidos dihidroxi- o
trihidroxi-benzoicos y las fitoalexinas, un ejemplo
típico de las cuales es el resveratrol (mostrado en la figura
6).
El método más ampliamente usado para la
determinación de la oxidación de LDL es emplear el metal de
transición cobre (específicamente iones Cu^{2}+) como un
catalizador para promover la oxidación de hidroperóxidos lipídicos
endógenos. Los antioxidantes presentes en LDL, especialmente el
alfa-tocoferol, retrasan el proceso de oxidación y
producen la llamada fase de retardo. El proceso puede seguirse
fácilmente en un espectrofotómetro UV debido a que la reacción de
oxidación produce dienos conjugados que pueden controlarse
continuamente a 234 nm (Esterbauer y otros, 1989). Para preservar la
LDL de la oxidación durante el almacenamiento, se añade EDTA para
complejar cobre y otros elementos traza. Este EDTA en exceso
interfiere con la oxidación catalizada con cobre. El EDTA puede
eliminarse dializando la preparación de LDL antes de la adición de
iones cobre o puede añadirse un exceso de iones cobre para compensar
los complejados con EDTA.
Los resultados de experimentos in vitro
algo similares a los descritos por Frankel y otros (Lancet 1993,
citado previamente) fueron también presentados por Frankel y otros
en 1995 (J. Agricult. and Food Chemistry 43,
890-894). Los autores de esta publicación prestaron
atención a la dificultad de interpretar datos in vitro. Así,
“aunque los compuestos fenólicos tienen propiedades químicas
similares, su capacidad reductora no es un indicador muy preciso de
su actividad antioxidante. En el ensayo de oxidación de LDL y otras
pruebas para la actividad antioxidante, el sistema es típicamente
heterogéneo y las propiedades físicas, tales como lipofilia,
solubilidad y reparto entre las fases acuosa y lipídica de LDL,
pueden convertirse en importantes para determinar la actividad
antioxidante”.
En efecto, los expertos en la técnica aprecian
que la extrapolación desde hallazgos in vitro hasta
situaciones in vivo es frecuentemente inapropiada. Como un
ejemplo, el lector es remitido a la publicación de McLoone y otros,
(1995 Proc. Nutr. Soc. 54, Abstract 168A), que muestra que aunque el
compuesto luteína tiene el potencial para inhibir la oxidación de
LDL in vitro, la complementación de la dieta de voluntarios
humanos con luteína durante 2 semanas (que da un incremento de 6
veces en los niveles de luteína en plasma) no tenía efecto sobre la
oxidación de LDL.
Se han efectuado algunos experimentos in
vitro para investigar los posibles beneficios del vino tinto
para la salud. Fuhrman y otros, (1995 Am. J. Clin. Nutr. 61,
549-554) encontraron que “algunas substancias
fenólicas que existen en el vino tinto, pero no el vino blanco, son
absorbidas, se unen a LDL plasmática y pueden ser responsables de
las propiedades antioxidantes del vino tinto” y proporcionaron, en
sus propias palabras, la primera demostración de “que el consumo de
vino tinto inhibe la propensión de las LDL a sufrir peroxidación
lipídica”, y que esto puede contribuir a la atenuación de la
aterosclerosis. Sin embargo, un estudio de Sharpe y otros, cuyos
resultados fueron publicados (Q.J. Med. 1995 88,
101-108) casi contemporáneamente con los de Fuhrman
y otros, encontró que ni el consumo de vino tinto ni el consumo de
vino blanco tenía ningún efecto “sobre el colesterol total, los
triglicéridos, la HDL o las medidas del estado antioxidante,
incluyendo la susceptibilidad de la LDL a la oxidación”.
De Rijke y otros también investigaron el asunto y
efectuaron un experimento doblemente ciego aleatorizado. Presentaron
sus hallazgos en 1996 (Am. J. Clin. Nutr. 63,
329-334) e indicaron que “los resultados de este
estudio no muestran un efecto beneficioso del consumo de vino tinto
sobre la oxidación de LDL”.
Así, en resumen, existen varios informes de que
el vino tinto diluido puede inhibir la oxidación de LDL en ensayos
in vitro, pero de que estos hallazgos no pueden
necesariamente extenderse a la situación in vivo. Por otra
parte, los datos in vivo relativos a la inhibición de la
oxidación de LDL por el consumo de vino tinto son como mínimo
conflictivos y no existe una evidencia clara para sugerir que el
consumo de vino tinto tenga ningún efecto beneficioso sobre la
oxidación de LDL.
Existe ahora un número de composiciones
públicamente disponibles que se preparan a partir de subproductos de
vino o uva y que pueden contener polifenoles (aunque en niveles
bastante bajos en algunas de las composiciones). Entre estas, están
las cápsulas French Paradox (disponibles de Arkopharma). Las
cápsulas French Paradox se elaboran preparando un extracto de
hollejo (el residuo de piel de uva que permanece después de la
fermentación del vino). La mayoría de los polifenoles presentes en
las pieles de uva son solubles en alcohol, y así tienden a extraerse
en el vino que fermenta. De ahí que las cápsulas French Paradox
tengan realmente un contenido de polifenoles bastante bajo. (Otras
composiciones públicamente disponibles incluyen un polvo que
contiene antocianina (obtenible de Sefcal) elaborado a partir de un
extracto de piel de uva, y que se usa como un colorante alimentario,
y una composición que contiene proantocianidina (“Endotelon”)
preparada a partir de semillas de uva).
Aunque las cápsulas French Paradox contuvieran
cantidades significativas de polifenoles, no está claro que el
consumo oral de tal composición polifenólica sintética ejerza el
mismo efecto terapéutico supuestamente asociado con el consumo de
vino tinto. Por ejemplo, según se explica por Goldberg (1995 Clin.
Chem. 41, 14-16), el contenido de alcohol del vino
mantiene los polifenoles en solución en vino y en el intestino
humano, de modo que podrían estar disponibles para la absorción. Un
polvo de polifenol sintético libre de alcohol puede ser
completamente ineficaz debido a que los polifenoles son
insuficientemente solubles en el intestino (en ausencia de alcohol)
para ser absorbidos. Adicionalmente, la absorción en la corriente
sanguínea puede no ser suficiente para que se ejerza un efecto
antioxidante sobre la LDL - puede requerirse una asociación íntima
de los polifenoles con la fracción de LDL.
Se reconoce que muchas enfermedades están
causadas o provocadas por un mecanismo de oxidación por radicales
libres, por ejemplo el cáncer, las cataratas, la diabetes, etc. Se
cree que nutrientes antioxidantes tales como la vitamina E, la
vitamina C y otros previenen la oxidación por radicales libres en
muchos órganos y tejidos. Así, es probable que la absorción de
polifenoles que son antioxidantes eficaces tenga un efecto sobre
enfermedades provocadas por radicales libres/oxidación en general y
el uso de polifenoles puede ser mucho más amplio que un tratamiento
o una prevención de la enfermedad cardíaca coronaria.
Sin embargo, la CHD es una de las principales
causas de mortalidad y morbidez en el mundo occidental, y por lo
tanto de particular interés. La patogénesis del estado consiste
esencialmente en un proceso en dos fases que implica en primer lugar
el desarrollo de placas ateroscleróticas y a continuación la
formación de un trombo (coágulo) sobre la placa (un proceso
denominado trombosis) que puede provocar la oclusión arterial, cuyas
consecuencias pueden ser el infarto de miocardio (MI) y la muerte
súbita. Otras enfermedades que son provocadas por la trombosis son
la apoplejía y la trombosis venosa. La fase inicial en la formación
de un trombo es la elevación de plaquetas que a continuación liberan
factores de coagulación a la sangre provocando la producción de
coágulos de fibrina. Una vez que se forman, los coágulos de sangre
pueden eliminarse mediante un proceso conocido como fibrinolisis,
que es esencialmente la disolución de los coágulos y la degradación
de fibrina hasta productos de degradación. Así, existen al menos dos
procesos por los que puede evitarse la trombosis: inhibir la
agregación de plaquetas o incrementar la fibrinolisis.
La proliferación de células vasculares anormales
del músculo liso (VSMC) puede contribuir a la formación de lesiones
obstructivas en la enfermedad cardíaca coronaria, la aterosclerosis,
la restenosis, la apoplejía y los neoplasmas del músculo liso del
intestino y el útero, el fibroide o fibroma uterino.
Se sabe desde hace muchos años que el
TGF-\beta es uno de los inhibidores del
crecimiento celular más potentes (Massagué, 1990), y varios autores
han encontrado que el TGF-\beta inhibe la
proliferación de VSMC (Assolian,1986; Bjorkerud,1991; Owens, 1988;
Kirschenlohr, 1993). Las VSMC humanas producen
TGF-\beta en una forma inactiva latente que es
activada proteolíticamente por la proteína serínica plasmina, que a
su vez puede obtenerse a partir de plasminógeno mediante una familia
de activadores del plasminógeno (PAs), tales como el activador del
plasminógeno tisular (tPA) (Lyons, 1990). Un incremento en el
TGF-\beta plasmático total se considera eficaz
para inhibir el crecimiento de VSMC, ya que la forma latente es
convertida en la forma activa por plasmina.
Varios autores han desarrollado métodos para la
estimación del nivel en plasma de TGF-\beta y para
buscar compuestos farmacéuticos que pueden estimular la producción
de TGF-\beta en la forma tanto latente como
activa. En US 5.545.569 (Grainger y otros) se reivindica un método
para determinar la eficacia in vitro de compuestos que
incrementan el nivel en plasma de TGF-\beta y
estimulan su producción usando las técnicas descritas allí.
WO94/26303 (Grainger y otros) describe un método para mantener o
incrementar el diámetro de la luz de los vasos en un vaso enfermo o
lesionado de un mamífero administrando una cantidad eficaz de
activador o estimulador de la producción de
TGF-\beta. Se reivindica que el compuesto
Tamoxifeno
(trans-2-[4-(difenil-1-butanil)fenoxi]dimetiletilamina)
es eficaz, ya que estimula la producción de
TGF-\beta e incrementa la relación de
TGF-\beta activo a latente. Otro compuesto que
muestra actividad es la aspirina (Grainger y otros, 1995) que
incrementa el TGF-\beta tanto total como activo en
suero en gente normal, pero sólo el TGF-\beta
total en pacientes con enfermedad cardíaca coronaria.
Un incremento en la agregación de plaquetas
también se ha asociado significativamente con la frecuencia (Elwood
y otros, 1991) y la incidencia (Thaulou y otros, 1991) de CHD. La
agregación de plaquetas se estudia convenientemente usando un
agregómetro de plaquetas en el que una suspensión de plaquetas
recientemente obtenidas de sangre se pone en contacto con un
agonista que provoca la agregación. Pueden usarse muchos agonistas
pero los más típicos son el ácido araquidónico, el ADP, el colágeno
y la trombina. A partir de una medida de la agregación máxima (%) es
posible estudiar los efectos de los inhibidores de la agregación de
plaquetas que pueden administrarse oralmente o mediante inyección al
sujeto. Una de las substancias más eficaces para evitar la
agregación de plaquetas es la aspirina, que inhibe la actividad de
la ciclooxigenasa y la formación de tromboxano, un factor necesario
en la formación de trombos (Moncada y Vane, 1979). La aspirina
también evita la CHD, la apoplejía y la muerte súbita (Hennekens y
otros, 1988).
El sistema fibrinolítico constituye una cascada
de reacciones proteolíticas extracelulares estrechamente reguladas
por activadores e inhibidores. El activador del plasminógeno de tipo
tisular (t-PA) enzimático convierte el plasminógeno
en plasmina, que a su vez disuelve coágulos de fibrina. El
t-PA es una glicoproteína sintetizada en las células
endoteliales, que es adsorbida sobre la fibrina para ser activada.
El inhibidor del activador del plasminógeno (PAI)-1,
es un inhibidor de serina proteasa y actúa como un inhibidor
específico de t-PA. El PAI-1 existe
en tres formas: activa, latente y como un complejo inactivo. Es
sintetizado en las células endoteliales, el hígado y las
plaquetas.
En la circulación, la mayoría del tPA (95%) está
complejada con PAI-1. Muy poco tPA y
PAI-1 están en la forma libre (activa). Se cree que
una actividad fibrinolítica disminuida se debe a un incremento en el
nivel o la actividad de PAI-1, que da como resultado
la activación disminuida de plasminógeno hasta plasmina por tPA.
Esto es importante debido a los informes de una asociación entre la
actividad fibrinolítica disminuida y el riesgo de CHD (Mehta y
otros, 1987) y MI. La fibrinolisis deteriorada, principalmente
debido a la elevación del PAI-1 en plasma, es un
hallazgo común en la enfermedad trombótica. En el Northwick Park
Heart Study, un estudio epidemiológico prospectivo de hombres de
mediana edad (40-54 a la entrada), Meade y otros
(1987) presentaron que una actividad fibrinolítica disminuida es un
factor de riesgo independiente principal para una CHD futura.
Estudios de la sección transversal de pacientes con angina de pecho
o infarto de miocardio previo han mostrado coherentemente una
actividad fibrinolítica disminuida en pacientes en comparación con
el control (Hamsten y otros, 1985 y 1986; Johnson 1984; Paramo y
otros, 1985; Aznar y otros, 1986; Francis 1988 y Olofson y otros,
1989). Se ha observado que las concentraciones de
PAI-1 son superiores en pacientes con MI en
comparación con controles (Hamsten y otros, 1987).
Debido al papel de la agregación de plaquetas y
la fibrinolisis en la formación de trombos, podría emplearse un
método para disminuir la agregación de plaquetas y/o incrementar la
fibrinolisis como un método de tratamiento de enfermedades
trombóticas en general, y CHD en particular.
En un primer aspecto la invención proporciona una
composición seca derivada de plantas adecuada para el consumo
humano, obtenida a partir de uvas, vino o subproductos que contienen
flavonoles o productos residuales del procedimiento de elaboración
del vino, en la que al menos 25% del material derivado de plantas en
la composición comprende polifenoles, comprendiendo la composición
al menos 0,1% p/p de flavonol y en donde el consumo de la
composición por un sujeto humano es eficaz para provocar en el
sujeto uno o más de lo siguiente: inhibir la oxidación de LDL del
plasma; estimular la producción de TGF-\beta;
inhibir la agregación de plaquetas y estimular la fibrinolisis.
A modo de explicación, las composiciones
derivadas de plantas pueden comprender extractos de plantas o partes
de las mismas (tales como uvas), que pueden procesarse de algún modo
(por ejemplo, mediante fermentación). Así, las composiciones
derivadas de plantas incluyen extractos en disolventes acuosos u
orgánicos de uvas o partes de las mismas, zumos de uva y licores de
fermentación (por ejemplo vino) producidos a partir de uvas o zumo
de uva, o composiciones obtenidas a partir de cualquiera de los
precedentes. El material de plantas se procesa (físicamente y/o
químicamente) típicamente durante la producción de la composición
para extraer polifenoles de la planta y así incrementar y enriquecer
el contenido de polifenoles de la composición.
Ventajosamente, la composición puede ser tal que
el material derivado de plantas comprenda al menos 35% de
polifenoles, o más preferiblemente al menos 45% de polifenoles.
La composición puede estar comprendida totalmente
o substancialmente por el material derivado de plantas del que se
obtiene el contenido de flavonoles de la composición.
Alternativamente, la composición puede comprender otro material, tal
como saboreantes, excipientes, portadores y similares, usados
convencionalmente para formular composiciones para consumo
humano.
El “material derivado de plantas” en la
composición se refiere a la porción de la composición que deriva de
la misma fuente que el contenido de flavonoles de la composición. La
composición también puede comprender otros ingredientes (por
ejemplo, almidón o sabores) obtenidos de plantas, pero estos no han
de considerarse “material derivado de plantas” si no se obtienen a
partir de la misma fuente que el contenido de flavonoles de la
composición.
Preferiblemente, la composición es tal que el
contenido de flavonoles es al menos 0,5% (p/p), preferiblemente al
menos 1% y más preferiblemente al menos 2% del contenido total de
polifenoles derivados de plantas de la composición.
También se prefiere que el contenido de
flavonoles de la composición como un todo sea al menos 0,1% (p/p), y
lo más preferiblemente al menos 1%.
Las composiciones definidas previamente son
típicamente sólidos a temperatura ambiente (760 mm de Hg) a lo largo
del intervalo de temperatura 10-20ºC. La composición
puede estar en partículas (por ejemplo, en polvo o granulada) o
puede formarse como cápsulas, tabletas y similares.
Los inventores han encontrado sorprendentemente
que las composiciones de acuerdo con la invención son eficaces,
después del consumo oral por sujetos humanos, para inhibir la
oxidación de LDL del plasma, según se mide mediante un número de
criterios. Así, el consumo oral de la composición es eficaz para
incrementar la fase de retardo en la oxidación de LDL de plasma
aislada según se determina por el método de Esterbauer y otros (1989
Free Radic. Res. Commun. 6, 67-75). Brevemente, en
este método, LDL aislada de un plasma de sujeto mediante una
ultracentrífuga se dializa para eliminar EDTA, y se añaden iones
cobre (5 \muM) a la LDL (presente en 50 mg/l). El tiempo de
retardo habitual antes de la formación del dieno es aproximadamente
50-60 minutos. La administración de la composición
de la invención al sujeto debe dar una prolongación del tiempo de
retardo de preferiblemente al menos 2 minutos (o aproximadamente 4%
o más). Lo más preferido está en el intervalo de
5-25 minutos (o aproximadamente
10-50%). Además, la composición es eficaz (después
del consumo oral) para reducir la cantidad de peróxidos lipídicos en
el plasma de sujetos humanos (según se determina mediante el método
de Gorog y otros, 1994, y se describe más adelante.
Las composiciones comprenden polifenoles
(incluyendo flavonoles) obtenidos de uvas (uvas enteras o partes de
las mismas, tales como pieles o zumo), vino (especialmente vino
tinto, que comprende concentraciones muy superiores de polifenoles
que el vino blanco) o subproductos que contienen flavonoles y/o
productos residuales del procedimiento de elaboración del vino,
tales como orujo (es decir, el residuo de uvas trituradas después de
la extracción del zumo) u hollejo (sólidos residuales que quedan
después de la fermentación inicial). Sin embargo, polifenoles tales
como flavonoles están presentes en una amplia gama de materiales
presentes en la naturaleza, muchos de los cuales contienen un
contenido superior de flavonoles que el vino tinto. Ejemplos de
tales materiales incluyen: fruta en general, tal como manzanas (por
ejemplo, variedad “Gravensteiner”), especialmente piel de manzana;
peras (por ejemplo, variedad “Williams Christs”); pimientos rojos
(por ejemplo, variedad “Yolo wonder”); grosellas rojas; grosellas
negras (particularmente preferidas ya que tienen un contenido
relativamente alto de flavonoles); limones; cerezas; arándanos;
grosellas espinosas; tomates; aceitunas; y hortalizas en general,
incluyendo: rábanos (por ejemplo, variedad “Saxa treib”); colinabo
(por ejemplo, variedad “Primavera”); rábano picante; patatas;
cebollas y espárrago.
En una modalidad particular, la composición se
deriva de un vino tinto y comprende un perfil representativo
substancialmente de todos los compuestos polifenólicos presentes en
el vino (típicamente, aunque no necesariamente, presentes en la
composición substancialmente en las cantidades relativas
representativas de las del vino del que se deriva la composición).
Tal composición puede denominarse un “conjunto de polifenoles
totales”.
Los polifenoles pueden obtenerse convenientemente
de vino tinto u otros líquidos que contienen polifenoles mediante
absorción sobre una columna de resina cromatográfica, con elución de
la fracción enriquecida en polifenoles de la columna (típicamente
después de una etapa de lavado) mediante el uso de un eluyente
etanólico al 40-50%, u otro disolvente orgánico
adecuado (tal como metanol, acetona, acetato de etilo, cloruro de
dimetileno y cloroformo - que pueden estar en solución acuosa). El
disolvente orgánico es preferiblemente relativamente volátil (es
decir, teniendo un punto de ebullición de entre 30 y 85ºC a una
presión de 760 mm de Hg) y así se elimina fácilmente, para dejar una
composición sólida substancialmente seca (es decir, menos de 10% p/p
de H_{2}O) que comprende polifenoles. Tal método puede usarse
satisfactoriamente para obtener un conjunto de polifenoles totales a
partir de vino tinto.
Alternativamente, los polifenoles pueden
obtenerse a partir de vino tinto u otro líquido que contiene
polifenoles mediante extracción con disolvente usando un disolvente
orgánico adecuado inmiscible con el vino u otro líquido.
Alternativamente, los polifenoles pueden obtenerse a partir de
sólidos que contienen polifenoles mediante extracción con disolvente
(típicamente, extracción con un disolvente orgánico tal como etanol
o acetato de etilo) - los sólidos pueden separarse a continuación
del disolvente mediante filtración o centrifugación. El disolvente
puede evaporarse a continuación para dejar una composición sólida
substancialmente seca que comprende polifenoles.
En modalidades preferidas, la composición se
presenta como un suplemento alimenticio. Este puede ser una
substancia para añadir como un ingrediente adicional durante la
fabricación del producto alimenticio, o puede ser una substancia
separada que ha de ser consumida por un individuo (por ejemplo, como
una tableta o cápsula) substancialmente aislada de (es decir, no
mezclada con) otros componentes alimenticios antes del consumo
(aunque, por supuesto, la tableta o la cápsula puede tomarse con
alimento). La invención incluye así dentro del su alcance un
producto, particularmente un producto alimenticio, que comprende una
composición de acuerdo con la invención. Alternativamente, la
composición puede presentarse como un sólido que ha de elaborarse
como una bebida mezclando con un diluyente fisiológicamente
aceptable (tal como leche, agua u otro líquido acuoso).
La dosificación de la composición dada a un
sujeto depende del grado de actividad del material pero estará entre
10 mg y 10 g al día. Para el conjunto polifenólico total obtenido a
partir de vino tinto, la dosis preferida es 0,1-4,0
g/día, y más preferiblemente 1-2 g/día, equivalente
a de 0,5 a 1 litro de vino tinto al día. La dosis preferida de
flavonol está en el intervalo 0,1-1000 mg al día,
preferiblemente en el intervalo 0,5-500 mg al día,
más preferiblemente en el intervalo 1-250 mg al
día.
Los expertos en la técnica podrán tomar la
preparación de polifenoles obtenida a partir de vino, uvas o
subproductos del vino y fraccionarla adicionalmente para obtener
composiciones con actividad más concentrada. Esto podría efectuarse
mediante cromatografía en columna, extracción con disolventes,
tamices moleculares con membranas semipermeables u otro método o
métodos usados convencionalmente en la industria alimentaria. La
ventaja es que el peso de substancia activa es menor y el color y el
gusto del suplemento se modifica beneficiosamente.
Las composiciones de acuerdo con la invención
pueden prepararse usando los agentes polifenólicos activos de
acuerdo con la práctica convencional de suplementos alimenticios o
productos farmacéuticos. Los diluyentes, excipientes o portadores,
etc. que pueden usarse son bien conocidos en la técnica de la
formulación y la forma elegida para cualquier régimen particular
dependerá del contexto dado y la elección del formulador. En
general, la dosis dependerá de la concentración de polifenoles en la
composición y de la identidad de los compuestos polifenólicos en
cuestión.
Por otra parte, las composiciones pueden
comprender cualquier número de componentes adicionales, tales como
los usados típicamente en la industria alimentaria y/o en la
industria farmacéutica. Tales componentes pueden incluir nutrientes
(especialmente elementos traza y vitaminas), antioxidantes,
substancias terapéuticas (especialmente las que tienen un efecto
terapéutico en relación con la prevención y/o el tratamiento de CHD,
en particular la aspirina), saboreantes y edulcorantes
(especialmente edulcorantes artificiales tales como aspartamo,
etc.).
Ejemplos de lo anterior incluyen los siguientes:
un carotenoide tal como luteína, licopeno o \alpha- y/o
\beta-caroteno; nutrientes antioxidantes o agentes
antiinflamatorios tales como vitamina A, vitamina C, vitamina E
(\alpha-tocoferol y otros tocoferoles activos),
ácido fólico, selenio, cobre, zinc, manganeso, ubiquinona (coenzima
Q10), ácido salicílico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico
y ácido 2,5-dihidroxibenzoico.
Antioxidantes tales como carotenoides y vitamina
E son destruidos parcialmente en el tracto gastrointestinal por
oxidación. Mediante la inclusión de estos compuestos en la
composición de la invención, se cree que este proceso se inhibe y se
absorben más antioxidantes. El uso de una composición que comprende
\alpha-tocoferol y/o aspirina se prefiere
especialmente ya que se cree que tal mezcla proporciona un efecto
sinérgico en presencia de polifenoles.
Dosis diarias adecuadas típicas de estos
componentes adicionales de la composición (y que por lo tanto pueden
incluirse en la composición de modo que el consumo normal de la
composición dará la dosis apropiada) son como sigue:
Así, en una modalidad, la composición toma la
forma de cápsulas, conteniendo cada cápsula 500 mg de composición
polifenólica, con una toma sugerida de una a cuatro cápsulas al día.
Otra presentación es una bebida no alcohólica que proporciona una
dosis eficaz de polifenoles cuando se disuelve en agua (destilada o
aireada) aromatizada y edulcorada al gusto, o se disuelve en un zumo
de frutas, por ejemplo, uva, manzana o naranja, etc.
Aunque puede preferirse por un número de razones
(por ejemplo, sociales, religiosas y económicas) proporcionar una
bebida libre de alcohol que comprende la composición de la
invención, tales bebidas pueden reforzarse con alcohol (por ejemplo,
de vodka, ginebra, güisqui) para dar un nivel deseable de
5-15% de alcohol dependiendo del gusto del
consumidor.
Otras presentaciones son como un ingrediente
alimenticio en productos lácteos tales como leche y yogures,
conservas y productos dietéticos destinados como suplementos o
substitutos de las comidas. Los ejemplos previos son solamente
ilustrativos y no pretenden ser limitativos de ningún modo.
Los presentes inventores han encontrado que no
sólo el consumo oral de la composición de la invención inhibe la
oxidación de LDL del plasma, la composición también tendrá el efecto
de estimular la producción de factor de crecimiento transformante
(TGF)-\beta in vivo. Adicionalmente, los
inventores han encontrado que el consumo oral de la composición de
la invención inhibirá la agregación de plaquetas y/o estimulará la
fibrinolisis, disminuyendo de ese modo la tendencia trombótica de un
individuo, lo que ayuda a prevenir y/o tratar enfermedades
trombóticas tales como CHD y apoplejía. En particular, se encuentra
que el consumo de la composición incrementa el nivel de actividad de
tPA en plasma (según se mide convenientemente por medio de ensayos
tales como el ensayo “Chromolize” RTM [disponible de Biopool,
Suecia] descrito más adelante), cuyo efecto es incrementar la
velocidad neta de fibrinolisis en el sujeto.
En un aspecto adicional la invención proporciona
el uso de una composición, de acuerdo con el primer aspecto de la
invención definido previamente, para la fabricación de un
medicamento para el consumo oral por un sujeto humano para inhibir
la oxidación de LDL de plasma en el sujeto.
En otro aspecto la invención proporciona el uso
de una composición, de acuerdo con el primer aspecto de la invención
definido previamente, para la fabricación de un medicamento para el
consumo oral por un sujeto humano para estimular la producción de
TGF-\beta en el sujeto.
En otro aspecto más la invención proporciona el
uso de una composición, de acuerdo con el primer aspecto de la
invención definido previamente, para la fabricación de un
medicamento para el consumo oral por un sujeto humano para inhibir
la agregación de plaquetas y/o estimular la fibrinolisis en un
sujeto (particularmente incrementando el nivel de actividad de tPA
en el plasma del sujeto humano).
La composición de acuerdo con el primer aspecto
de la invención conferirá típicamente todas las propiedades
mencionadas previamente al sujeto que consume la composición. Por lo
tanto, la invención también proporciona un método para elaborar un
medicamento para consumo oral por un sujeto humano con el propósito
de efectuar uno o más de lo siguiente en el sujeto: inhibición de la
oxidación de LDL de plasma; inhibición de la agregación de
plaquetas; estimulación de la fibrinolisis y estimulación de la
producción de TGF-\beta; comprendiendo el método
preparar una composición de acuerdo con el primer aspecto de la
invención; si es necesario, mezclar la composición con un excipiente
o portador fisiológicamente aceptable; y preparar dosis unitarias de
la composición. Métodos adecuados para elaborar los medicamentos son
bien conocidos por los expertos en la técnica pertinente.
Los medicamentos que tienen este efecto pueden
tomar la forma de suplementos o ingredientes alimenticios, según se
explica previamente, y deben ser útiles en la prevención o el
tratamiento de la enfermedad cardíaca coronaria. Las dosis adecuadas
de los medicamentos, según se explica previamente, dependerán de la
concentración y la identidad de los polifenoles en la composición, y
de la gravedad del estado de enfermedad en el sujeto que ha de
tratarse. Sin embargo, como una norma general, la dosificación debe
ser preferiblemente suficiente para dar la misma cantidad de consumo
de polifenoles que la proporcionada por el consumo de al menos un
vaso de vino al día (aproximadamente equivalente a 0,25 g del
conjunto de polifenoles totales procedente del vino tinto), pero más
preferiblemente de aproximadamente 0,5-1,0 l de vino
tinto al día (es decir, aproximadamente 1,0-2,0 g de
polifenol total del vino).
La invención se describe además a modo de ejemplo
ilustrativo y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 muestra una gráfica de la oxidación
de LDL frente al tiempo (minutos);
la figura 2 es una representación esquemática de
la estructura nuclear de las flavonas;
la figura 3 es una representación esquemática de
la estructura nuclear de los flavonoles;
la figura 4 es una representación esquemática de
la estructura del ácido gálico;
la figura 5 es una representación esquemática de
la estructura nuclear de las antocianinas; y
la figura 6 es una representación esquemática de
la estructura del resveratrol.
Se filtraron aproximadamente 2.000 litros de vino
tinto (Cabernet Sauvignon francés de 1993) para eliminar el
sedimento y se destilaron bajo vacío a una presión de 300 milibares
a de 75 a 80ºC durante 1 minuto, a continuación se enfriaron y se
concentraron bajo vacío a 55ºC y a continuación se enfriaron
rápidamente hasta 25ºC mediante refrigeración. El vino concentrado
se hizo pasar a través de una columna (55 cm de diámetro,
aproximadamente 2 metros de alto) que contenía 65 litros de resina
Diaion HP-20. La columna se lavó con 250 litros de
agua destilada y los polifenoles eluían aproximadamente 250 litros
de etanol al 50%, durante un período de 150 minutos aproximadamente.
Al final de este tiempo, el eluato estaba libre de polifenoles,
según se determinaba mediante el método de
Folin-Ciocalteu (descrito por Singleton y Rossi,
1965). El eluato se concentró a continuación hasta 35% de materia
seca bajo destilación a vacío y se secó por pulverización bajo
nitrógeno para producir aproximadamente 2 kg de polvo con un
contenido de humedad de 3 a 4%.
El polvo polifenólico es un excelente ingrediente
alimenticio que tiene un color rojo oscuro cuando se disuelve en
agua o alcohol acuoso, siendo bastante apetitoso, y dando un
"amargor" al paladar similar al del vino tinto. La dosis diaria
recomendada es 1-2 g/día.
La composición típica del polvo polifenólico se
compara más adelante con el contenido de polifenoles del vino tinto.
En comparación con el vino tinto, el polvo polifenólico contiene
proporcionalmente más de las proantocianinas que los otros
polifenoles, pero conserva esencialmente la abundancia relativa de
los diversos polifenoles.
Composición del vino tinto y el polvo
polifenólico
Se efectuaron estudios con voluntarios usando
polifenoles del vino para determinar la actividad antioxidante de
vino tinto y blanco y preparaciones polifenólicas en voluntarios
sanos.
Veintiséis hombres sanos, de 35 a 65 años de
edad, que eran no fumadores, que consumían una dieta del Reino Unido
estándar, participaron en un estudio privado y confidencial. Dos
semanas antes del estudio los voluntarios interrumpieron el consumo
de vino. Se requirió a todos los voluntarios para que mantuvieran su
dieta y estilo de vida habituales durante el estudio. Los
voluntarios se dividieron en grupos que consumían los siguientes
productos de vino o té con comidas durante dos semanas en las
cantidades mostradas en la Tabla 1. El vino tinto era Cabernet
Sauvignon (1993) y el vino blanco era de la región de Narbonne,
Francia. El vino proporcionado durante el estudio era el único vino
permitido durante el período experimental. Además, a los mismos
sujetos se les dio polvo polifenólico preparado a partir de la misma
partida de vino tinto usado en el estudio. El polvo se almacenó a
-20ºC (PP1) y una muestra reciente se preparó en Junio de 1996
(PP2). Los estudios comenzaron a primeros de Septiembre de 1995 y
duraban aproximadamente un año.
- 1)
- Vino tinto Cabernet Sauvignon (375 ml), que contenía 1,8 g/l de polifenoles
- 2)
- Vino blanco de mesa (375 ml), que contiene 0,2 g/l de polifenoles
- 3)
- Polvo polifenólico de vino tinto (preparado a partir del mismo vino que se da al grupo 1), 1 g en dos cápsulas de gelatina
- 4)
- Vino blanco que contiene en solución 1 g de polifenoles de vino tinto (véase más adelante)
- 5)
- Vodka y limonada (10% v/v de alcohol), 400 ml al día
- 6)
- 50 mg/día de antocianinas, como extracto de piel de uva (Sefcal, St. Julien de Peyrolas, Francia), dado como una bebida
- 7)
- Hollejo de vino blanco (French Paradox™, Arkopharma, Niza, Francia) dado como cápsulas (3 al día), comprendiendo cada cápsula 250 mg de hollejo
- 8)
- Proantocianidinas de semillas de uva, como cápsulas Endotelon™ (Sanofi-Winthrop, Francia) (3 al día), comprendiendo cada cápsulas 150 mg de proantocianidina
- 9)
- Extracto de té verde (Polyphenon™, Mitsui, Norin, Fujieda, Japón), 3 cápsulas al día, comprendiendo cada cápsula 100 mg de catequinas de té como sigue: 1,6% de galocatequina, 19,3% de epigalocatequina, 6,4% de epicatequinas, 59,1% de galato de epigalocatequina y 13,7% de galato de epicatequina.
Se extrajeron muestras de sangre en K_{3} EDTA
(1 milimol/l) 12 horas después de la cena, antes y al final del
período del consumo de producto de vino. Las muestras se
centrifugaron a 2000 x g durante 15 minutos a 4ºC para obtener
plasma. La LDL se separó mediante ultracentrifugación con gradiente
de densidad usando una Beckman modelo de laboratorio Optima TLX con
un rotor TLA 100.4 (Beckman, Palo Alto, CA) como sigue: se añadió
bromuro sódico a plasma hasta una densidad de 1,3 g/ml y se
estratificó bajo una solución de 1,006 g/ml de densidad. La
centrifugación tuvo lugar a 100.000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. La
banda de LDL naranja/amarilla se retiró y se centrifugó con
soluciones de 1,154 y 1,063 g/ml de densidad durante 30 minutos a
100.000 rpm y 4ºC.
La capa de LDL visible se retiró y se dializó con
solución salina tamponada con fosfato 10 mM con EDTA 2 \muM
durante 1 hora usando un casete de diálisis (Pierce
Slide-A-Lyzer, Perstorp Biotec
Company, EE.UU. de A.) a 4ºC durante una hora, y a continuación con
solución salina tamponada con fosfato 10 mM durante la noche.
Los polifenoles totales se determinaron en plasma
y en la fracción de LDL mediante el método de Singleton y Rossi
(1965). Brevemente, los polifenoles totales en plasma y la LDL se
midieron tomando 125 \mum de plasma o 400 \mul de LDL y
rellenando hasta 500 \mul con agua. Esta mezcla se añadió a 2,5 ml
de reactivo de Folin (diluido 1:100) y 2,0 ml de carbonato sódico
(75 mg/l). Después de mezclar bien, la solución se incubó a
temperatura ambiente durante 2,5 horas y a continuación se
centrifugó a 2.500 rpm durante 8 minutos. La densidad óptica del
sobrenadante se midió a 765. Se usó ácido gálico como un patrón para
comparación.
La proteína se determinó mediante el Método de
Bradford (Bradford, 1976) usando un estuche que contenía el reactivo
Bioquant (Merck, Darmstadt, Alemania).
Se usaron dos métodos independientes para
determinar la actividad antioxidante.
La lipoproteína (50 mg de proteína de LDL/l) se
incubó en presencia de sulfato de cobre (5 mM) a 37ºC durante 5
horas. La formación de dienos conjugados se controló continuamente
midiendo el incremento en la absorbancia a 234 nm y el tiempo de
retardo antes de la formación de dienos determinada de acuerdo con
el método de Esterbauer y otros (1989). La figura 1 muestra una
gráfica de la formación de dienos conjugados (según se mide mediante
absorbancia a 234 nm) frente al tiempo (en minutos). Se ilustran
curvas típicas para muestras tomadas al principio del experimento
(0) y después de 2 semanas. La fase de retardo se mide extrapolando
la parte lineal de las gráficas hasta el eje x (según se muestra por
las líneas quebradas). Preferiblemente, el consumo de las
composiciones de acuerdo con la invención dará como resultado un
incremento del tiempo de la fase de retardo de 2 minutos o más.
Todos los lípidos y las lipoproteínas del plasma
se eliminaron selectivamente usando
PHM-L-liposorb
(Calbiochem-Novabiochem, Reino Unido). Se suspendió
PHM-L-liposorb seco (20 mg) en 0,25
ml de cloruro sódico 150 mM que contenía citrato sódico 10 mM en un
tubo de microcentrífuga marrón de 2 ml, el contenido se agitó y se
dejó que se equilibrara durante 5 minutos. Se añadió a continuación
plasma (0,5 ml) o solución salina (blanco) a las suspensiones de
liposorb, se agitaron y los tubos se pusieron en un mezclador
giratorio durante 15 minutos. Después de la centrifugación (12.000 x
g durante 1 minuto) el sobrenadante se descartó y el gel del
liposorb se lavó dos veces mediante 1,5 ml de solución salina
seguido por agitación y centrifugación. El gel de liposorb lavado se
suspendió en 1,5 ml de reactivo de colesterol
oxidasa-yoduro (BDH-Merck) y se puso
en un mezclador giratorio y se agitó durante 60 minutos. Después de
la centrifugación (12.000 x g durante 3 minutos) a temperatura
ambiente, la densidad óptica del sobrenadante transparente se midió
en un espectrofotómetro a 405 nm frente a un blanco con solución
salina (Gorog y otros, 1994).
Preferiblemente, el consumo de las composiciones
de acuerdo con la invención dará como resultado una disminución en
la concentración de peróxidos lipídicos en plasma de al menos 0,1
\mumoles/g de proteína.
Los valores obtenidos se compararon antes y
después del tratamiento. La Tabla 1 resume los resultados que se dan
con detalle en las Tablas 2 a 6. Según se muestra en la Tabla 1, los
productos que contienen polifenoles del vino abundantes (vino tinto,
PP1, PP2, vino blanco + PP1) mostraban un incremento en los
polifenoles del plasma y LDL y una actividad antioxidante en LDL,
según se miden por las pruebas 1 y 2 previas.
Los dos polvos polifenólicos (PP1, PP2) daban
resultados de la misma magnitud que la cantidad equivalente de vino
tinto.
No había efecto con el vino blanco, el polvo de
antocianina (Sefcal™, un extracto de pieles de uva usado como un
colorante alimentario), el orujo de vino tinto, las cápsulas French
Paradox™ (Arkopharma) o Endotelon^{TM}
(Sanofi-Winthrop, una preparación de
proantocianidina de semillas de uva), ni con el extracto de té verde
(Polyphenon™) que contenía catequinas y sus ésteres.
La preparación polifenólica activa contenía el
conjunto de todos los polifenoles del vino tinto, y se procesaba
cuidadosamente a fin de evitar su oxidación. Por otra parte, se
observó que el contenido de polifenoles del plasma y LDL aislada se
elevaba en aquellos sujetos que recibían vino tinto o polvo
polifenólico obtenido de vino tinto o pieles de uva.
En confirmación de la actividad antioxidante de
la preparación, se usó un segundo ensayo en el que se trató plasma
con una resina absorbente que eliminaba lípidos y lipoproteínas y el
contenido de peróxidos lipídicos se determinó en la resina. El
contenido de peróxidos lipídicos se disminuía en los sujetos a los
que se daba vino tinto o la preparación polifenólica. De nuevo, la
magnitud del efecto del polvo polifenólico era equivalente a la
cantidad de vino tinto del que se obtenía.
Estos experimentos muestran concluyentemente que
los polifenoles son absorbidos después de la ingestión de vino tinto
y aparecen en el plasma y la LDL, y que los polifenoles aislados del
vino pueden tener un efecto similar. Por otra parte, los polifenoles
absorbidos tienen una actividad antioxidante potente. El modo de
acción de los polifenoles puede ser variado. Primeramente, pueden
secuestrar iones metálicos tales como cobre y hierro que promueven
la producción de peróxidos lipídicos in vivo. Estos iones
quelados son inactivos como pro-oxidantes. Los
polifenoles, debido al alto contenido de grupos hidroxi, comprenden
estructuras químicas que se sabe que quelan iones metálicos, y así
destruyen sus propiedades catalíticas.
Otra acción puede ser actuar como una substancia
de sacrificio que se oxida antes que la LDL, como es el caso del
alfa-tocoferol. Sin embargo, la invención no se
limita a ningún modo de acción particular.
Para investigar la importancia de la eliminación
de EDTA de la preparación antes de la oxidación con catalizador de
cobre, se realizó una comparación usando diálisis con y sin EDTA, y
un método de columna con resina. Cuando se añade EDTA al dializado,
la prolongación del tiempo de retardo producida por el polvo
polifenólico de vino tinto no se producía o se reducía notablemente.
La diálisis sin EDTA y el método de columna daban resultados
similares. El fallo de autores previos (de Rijke y otros, 1996) para
obtener el efecto del vino tinto en voluntarios podría explicarse
por la presencia de EDTA en sus preparaciones usadas para la
oxidación catalizada con cobre.
La actividad antioxidante de un 1 gramo de polvo
polifenólico de vino es equivalente a la mitad de una botella de
vino tinto. Una dosis diaria de 1-2 g de polvo
polifenólico tendría una actividad profiláctica potencial contra la
enfermedad cardíaca coronaria. Otros productos, tales como extracto
de piel de uvas usado en la industria alimentaria como un colorante,
una preparación de proantocianidina, cápsulas French Paradox y un
extracto de té verde que contiene catequinas y sus ésteres, son
inactivos.
Se preparó una cápsula a partir de los siguientes
ingredientes mediante mezcladura simple y encapsulación habitual
| mg | ||
| Polvo polifenólico de vino | 500 | |
| Ácido esteárico | 25 | |
| Estearato magnésico | 50 | |
| Celulosa microcristalina | 25 | |
| \overline{600} | mg |
Se toman de dos a cuatro cápsulas diarias con o
después de las comidas.
Se preparó una cápsula a partir de los siguientes
ingredientes mediante mezcladura simple y encapsulación
habitual.
| mg | ||
| Polvo polifenólico de vino | 400 | |
| \alpha-tocoferol | 150 | |
| Ácido fólico, 0,2 mg (1:50 en diluyente) | 10 | |
| Lecitina | 20 | |
| Cera de abejas | 20 | |
| \overline{600} | mg |
Deben tomarse con las comidas al menos tres
cápsulas al día.
Se añade un gramo de polvo polifenólico de vino a
una composición dietética con una fórmula de polvo seco que
proporciona 405 kilocalorías al día (42 g de proteína, 43 g de
carbohidrato y 8 g de grasa, RDA de vitaminas y minerales)
comercializada bajo el nombre comercial Cambridge Diet (Cambridge
Health Plan Ltd., Norwich, Reino Unido). El suministro de un día (3
comidas/día) proporciona una toma de polifenoles equivalente a 0,5 l
de vino tinto/día.
Se añaden 0,5 g de conjunto de polifenoles
totales de vino tinto a 250 ml de yogur normal que contiene sabor de
fresa y edulcorante. El material polifenólico de color rojo mejora
la apariencia del yogur y proporciona un producto alimenticio
altamente apetecible con beneficios para la salud.
La siguiente formulación es la de una bebida no
alcohólica proporcionada como un polvo que ha de mezclarse con
agua.
| Monohidrato de dextrosa | 300 g |
| Ácido cítrico | 32 g |
| Citrato trisódico | 5 g |
| Sabor de uva | 6 g |
| Sabor de limón | 1,4 g |
| Sabor de naranja | 1,4 g |
| Aspartamo | 1 g |
| Conjunto de polifenoles totales del vino (como el ejemplo 1) | 21 g |
Se disuelven 53 g del polvo en 1 litro de agua.
Una ración de 250 ml proporciona 0,75 g de polifenoles activos.
Lo siguiente es una bebida alcohólica
proporcionada como una mezcla embotellada lista para beber.
| Agua tónica desaireada | 450 ml |
| Vodka | 50 ml |
| Polifenoles totales del vino (como el ejemplo 1) | 1 g |
El polifenol se disuelve en la mezcla de tónica
descargada (desaireada) y a continuación se gasifica con dióxido de
carbono bajo presión para dar una bebida aireada. Se distribuyen en
botellas partes alícuotas de 450 ml, se añade el vodka y la botella
se cierra herméticamente con un tapón de rosca.
Aproximadamente 2000 kg de orujo obtenido de uvas
blancas se agitaron bien en un mezclador comercial con 2500 l de
agua destilada a 30ºC durante 4 horas. La mezcla se retiró a
continuación del mezclador y se puso en un depósito y se dejó
sedimentar durante 2 horas, el sobrenadante se extrajo a
continuación y se filtró para dar un líquido transparente. A
continuación, se empleó el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1
para la absorción de los polifenoles sobre la resina usando
cantidades similares de resina Diaion HP-20 y
disolvente de elución.
Durante la concentración de la solución en etanol
acuoso hasta 35% de materia seca, aparecía un sólido de color rojo
que pesaba aproximadamente 600 g. Este era soluble en alcohol acuoso
al 10% y se secó a continuación por pulverización para dar un sólido
insoluble en agua pero soluble en alcohol acuoso. La solución
restante se secó por pulverización a continuación bajo nitrógeno
para dar 1,4 kg de un material de color rojo que contenía
aproximadamente 50% de polifenoles. La composición de esto era
similar a la obtenida en el Ejemplo 1.
Este método tiene la desventaja de que el
procedimiento para obtener el extracto antes de la absorción sobre
la resina es más difícil y consume más tiempo. Aunque el rendimiento
es menor, la disponibilidad de pieles de uva a precio económico
tiene ventajas comerciales.
La bebida en polvo se reconstituyó y se
administró a 5 voluntarios durante dos semanas de acuerdo con el
procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Los resultados del ensayo de
oxidación de LDL catalizado por cobre eran como sigue:
| Antes | 78,8\pm7,2 minutos |
| Después de 2 semanas | 93,0\pm9,4 minutos |
| Cambio | 14,2\pm4,8 minutos |
| (valor p 0,003) |
Se concluye que un extracto de pieles de uva (en
este caso uvas blancas), es decir, orujo, podría ser un antioxidante
eficaz cuando se tomaba oralmente durante 2 semanas.
LDL de plasma (del grupo de voluntarios descrito
en el Ejemplo 2) se separó mediante ultracentrifugación y se dializó
contra tampón de fosfato según se describe en el Ejemplo 2. Las
substancias que contenían polifenoles se analizaron con respecto a
su contenido de polifenoles mediante el método de Singleton y Rossi
(1965) se incubó LDL de plasma (0,05 \mug de LDL en 1,0 ml) con
100 \mul de solución de sulfato de cobre (concentración final 5
\muM) a 37ºC y el tiempo de retardo se determinó mediante el
ensayo de dienos catalizado con cobre, según se describe en el
Ejemplo 2. La capacidad de las substancias que contienen polifenoles
para prolongar el tiempo de retardo in vitro se determinó
añadiendo 4 \mug de substancia polifenólica a 1 ml de LDL antes de
la adición del sulfato de cobre. Las substancias probadas eran como
sigue:
1) Vino tinto Cabernet Sauvignon
2) Vino blanco de mesa
3) Polifenoles de vino tinto, preparados como se
describe en el Ejemplo 1
4) Antocianina Sefcal™, según se describe en el
Ejemplo 2
5) Proantocianidinas Endotelon™, como las
descritas en el Ejemplo 2
6) Cápsulas French Paradox (hollejo de vino
tinto), como las descritas en el Ejemplo 2
7) Polyphenon™ (catequinas de té verde), según se
describe en el Ejemplo 2
Los resultados obtenidos in vivo mediante
el consumo oral de las substancias de prueba durante 2 semanas se
comparan con los resultados in vitro en la Tabla 7 siguiente.
Los resultados in vitro son una media de cuatro
determinaciones. El tiempo de retardo se incrementó con todas las
substancias añadidas a un nivel de 4 \mug/ml. El orden de magnitud
del efecto observado era polvo polifenólico = antocianinas >
catequinas de té verde > proantocianidinas de semillas de uva
> vino tinto > vino blanco > hollejo de vino tinto.
Cuando las substancias eran tomadas oralmente y
la LDL se separaba y se probaba como se describe en el Ejemplo 2,
sólo el vino tinto y los polifenoles de vino tinto daban una
prolongación del tiempo de retardo, todas las otras substancias que
contenían polifenoles eran inactivas. Esto muestra claramente que es
imposible predecir el efecto in vivo de una substancia a
partir de resultados in vitro. La falta de actividad de la
mayoría de las substancias in vivo podría deberse a su falta
de absorción desde el intestino, o un fallo al incorporarse a
LDL.
Veinte de los voluntarios mencionados previamente
del Ejemplo 2 se dividieron en grupos (A y B) de 6-9
sujetos y se les dio durante dos semanas:
- A)
- Una bebida con sabor de grosella negra (330 ml) que contenía 1 g de polifenoles totales de vino tinto y mezclada con un polvo disponible comercialmente (azúcar, ácido cítrico, citrato sódico, aspartamo, sabor sintético; Cambridge Manufacturing Co Ltd, Corby, Reino Unido) al que se añadió agua inmediatamente antes del consumo; o
- B)
- Cápsulas que contienen polvo polifenólico de vino tinto como el preparado previamente en una dosis de 2 g de polifenoles de vino tinto/día.
Los productos se dividieron a partes iguales y se
tomaron después de la comida y la cena. Se obtuvieron muestras de
plasma y se centrifugaron en una ultracentrífuga para obtener LDL
según se describe en el Ejemplo 2.
Se emplearon tres métodos para tratar la LDL
antes de la oxidación, como sigue.
La LDL se dializó con solución salina tamponada
con fosfato 10 mM que contenía EDTA 2 \muM durante una hora usando
un casete de diálisis (Pierce
Slide-A-Lyzer Perstop Biotec
Company, EE.UU. de A.) a 4ºC durante una hora, y a continuación con
solución salina tamponada con fosfato 10 mM durante la noche.
La LDL se retiró y se dializó a 4ºC como
previamente excepto que la diálisis era en todo momento con EDTA 10
mM en solución salina tamponada con fosfato 10 mM.
Se hizo pasar LDL a través de una columna de
desalado EcNo-pac 10DG (Bio-Rad
Labs, Reino Unido). La columna se lavó dos veces con PBS 10 mM
tratada [resina chelex-100 (Bio-Rad,
Reino Unido), 5 g/l de PBS mezclados y decantados]. Se cargaron a
continuación en la columna 600 \mul de LDL y se eluyeron con 3 ml
de tampón de PBS a un caudal de 0,6 ml/minuto usando una bomba
peristáltica Ismatec IPC (Ismatec, Weston Super Mare, Reino
Unido).
Se realizó a continuación la peroxidación
catalizada con cobre y el tiempo de retardo se midió como en el
Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
El consumo de polifenoles del vino tinto como una
bebida (1 g/día) o cápsulas (2 g/día) producía un incremento en el
tiempo de retardo (cuando se omitía el EDTA del dializado final) de
30% y 21%, respectivamente, y también mediante el método de columna
de 12% y 22%, respectivamente. La adición de EDTA al dializado
suprimía el efecto con 1 g/día de polifenoles del vino tinto y daba
sólo un pequeño incremento en el tiempo de retardo de 7% con 2
g/día.
Otro objetivo de la invención es proporcionar una
preparación activa de polifenoles (convenientemente derivada de
uvas, vino o subproductos del vino) para el tratamiento de la
enfermedad cardíaca coronaria y otras enfermedades asociadas con la
proliferación de células del músculo liso, tales como
aterosclerosis, restenosis, apoplejía y neoplasias del intestino y
el útero, fibroide o fibroma uterino.
Los inventores han encontrado sorprendentemente
que es posible preparar una composición polifenólica (por ejemplo, a
partir de vino tinto) que cuando se administra oralmente a un sujeto
humano estimula la producción de
TGF-\beta-1 total y activo.
Se ha demostrado que cuando vino tinto o una
preparación de polifenoles obtenida a partir de vino tinto
proporcionada como un polvo o un bebida se administran oralmente al
hombre, existe un incremento en el
TGF-\beta-1 total y activo en
plasma. El vino blanco, que contiene pocos polifenoles, es
inactivo.
La dosificación de la preparación polifenólica
depende del grado de actividad del material pero estará entre 10 mg
y 10 g al día. Para el conjunto polifenólico total obtenido a partir
de vino, la dosis preferida es 0,1-4 g/día y más
preferiblemente 1-2 g/día, equivalente a de 0,5 a 1
litro de vino tinto al día.
Vino tinto, vino blanco y una preparación de
polifenoles obtenidos de vino tinto (según se describe previamente
en el Ejemplo 1) en la forma de un polvo o una bebida aportados
mediante administración oral a sujetos humanos se han estudiado con
respecto a sus efectos sobre el TGF-\beta en
plasma.
Se solicitó a voluntarios humanos (30 hombres de
entre 35 y 65 años de edad) para que interrumpieran el consumo de
vino durante dos semanas. Se les administraron 375 ml de vino tinto
o vino blanco o 1 g de conjunto total de polifenoles del vino tinto
(preparado a partir del mismo vino Cabernet Sauvignon que
previamente) como cápsulas o como una bebida aromatizada en 330 ml
de agua. Cada suplemento se consumía dos veces al día después de las
comidas durante un período de dos semanas.
Se extrajeron muestras de sangre en K_{3} EDTA
(1 milimol/l) después del tratamiento y se centrifugaron para
obtener el plasma que se almacenó a 70ºC antes del análisis. Los
polifenoles en plasma totales se midieron mediante el método de
Singleton y Rossi (1965). El
TGF-\beta-1 total se determinó
mediante inmunoensayo usando dos anticuerpos policlonales diferentes
(métodos 1 y 2, descritos más adelante):
\newpage
Método
1
Se midió el TGF-\beta total
(latente + activo) mediante un estuche de inmunoensayo para
TGF-\beta humano Quantikine® suministrado por
R&D systems (Abingdon, Oxford, Reino Unido). Este ensayo emplea
la técnica cuantitativa de inmunoensayo tipo sándwich. El receptor
soluble de TGF-\beta tipo II se une a
TGF-\beta-1 que se ha revestido
previamente sobre una placa de microvaloración. Los patrones y las
muestras se pipetean en los pocillos y cualquier
TGF-\beta-1 presente se une con el
receptor inmovilizado. Después de lavar cualesquiera substancias no
unidas, se añade un anticuerpo policlonal ligado a enzimas
específico para TGF-\beta-1 a los
pocillos para emparedar el
TGF-\beta-1 inmovilizado durante
la primera incubación. Después de un lavado para retirar reactivo
enzimático de anticuerpo no unido, se añade una solución de
substrato a los pocillos que produce un color con la enzima. La
intensidad del color desarrollado es proporcional al
TGF-\beta-1 presente.
Antes de llevar a cabo el ensayo, el
TGF-\beta latente se convierte en la forma activa
añadiendo ácido acético y urea, incubando durante 10 minutos y a
continuación neutralizando con solución de hidróxido sódico/HEPES.
El método estima el TGF-\beta-1
(latente + activo). La activación del TGF-\beta
latente se realizó como sigue: se añadieron a 0,1 ml de plasma 0,1
ml de ácido acético 2,5 N/urea 10M, se mezclaron bien y se incubaron
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadió a esta solución
0,1 ml de NaOH 2,7 N/HEPES 1 M para neutralizar la mezcla y se
mezcló bien. Antes del ensayo, la muestra de plasma activada se
diluyo 10 veces con suero diluyente calibrador RD6M suministrado por
el fabricante del estuche.
El procedimiento de ensayo era como sigue: 200
\mul de muestra o patrón se añadieron a cada pocillo de la placa
de microvaloración. La placa se cubrió a continuación con una tira
adhesiva de material plástico y se incubó durante 3 horas a
temperatura ambiente. Cada pocillo se aspiró a continuación y se
lavó tres veces con 400 \mul de tampón de lavado. Se añadieron a
continuación a cada pocillo 200 \mul de conjugado de
TGF-\beta1 y la placa se cubrió de nuevo con una
tira adhesiva reciente y se incubó a temperatura ambiente durante
110 minutos. Los pocillos se aspiraron a continuación y se lavaron
tres veces con 400 \mul de tampón de lavado. Se añadieron 200
\mul de solución de substrato a los pocillos y la placa se incubó
durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron a
continuación 50 \mul de solución de H_{2}SO_{4} 2N a cada
pocillo y la densidad óptica se midió a 450 mm.
Método
2
Esencialmente, se empleó el mismo método que
anteriormente, excepto que la TGF-\beta no se
activaba antes de la estimación y, en lugar del anticuerpo
policlonal para TGF-\beta-1, se
usó un anticuerpo BDA-10 (R&D systems, Abingdon,
Oxford, Reino Unido). Este método estima una forma activa de
TGF-\beta-1.
Preferiblemente, el consumo de una composición de
acuerdo con la invención producirá un incremento de niveles de
TGF-\beta1 en el sujeto en al menos 1,5 ng/ml
según se juzga mediante el Método 1, o al menos 0,5 ng/ml, según se
juzga mediante el Método 2.
Según se muestra en la Tabla 8, los polifenoles
en plasma se incrementaban con el vino tinto pero no con el vino
blanco y con las cápsulas y la bebida polifenólicas. Un incremento
en el TGF-\beta-1 se observaba
mediante ambos métodos en el vino tinto y con las cápsulas y la
bebida polifenólicas pero no con el vino blanco. Esto indica que los
polifenoles del vino tinto incrementan tanto la cantidad total de
TGF-\beta-1 (latente + activo)
como la de una forma activa de
TGF-\beta-1. Se concluye que los
polifenoles del vino incrementan el
TGF-\beta-1 total y tiene el
potencial de inhibir la proliferación de VSMC.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los inventores han encontrado adicionalmente de
forma sorprendente que es posible preparar una composición
polifenólica (por ejemplo, a partir de vino tinto) que cuando se
administra oralmente a un ser humano inhiba la agregación de
plaquetas y estimule la fibrinolisis.
En particular, se ha demostrado que cuando una
preparación de polifenoles obtenida a partir de vino tinto se
administra oralmente al hombre, hay una disminución en la agregación
de plaquetas cuando se usan ácido araquidónico, ADP, colágeno o
trombina como agonistas. Por otra parte, el consumo de la
preparación polifenólica incrementa la actividad de tPA en el plasma
del sujeto.
La dosificación de la preparación polifenólica
depende del grado de actividad del material pero estará entre 10 mg
y 10 g al día. Cuando la composición comprende el conjunto fenólico
total obtenido a partir de vino tinto, la dosis preferida es de 0,1
a 4,0 g al día y más preferiblemente de 1 a 2 g, que es equivalente
a de 0,5 a 1 litro de vino tinto al día.
Se preparó una composición polifenólica de vino
tinto según se describe previamente (Ejemplo 1 previo).
La dieta de doce hombres sanos de 35 a 65 años de
edad se complementó con 2 g de polifenoles de vino tinto (según se
describe en el Ejemplo 2) o aspirina (75 mg) diariamente durante dos
semanas. Se recogió sangre citrada en ayunas como una línea de base
y a las cuatro horas y a las dos semanas después del comienzo del
experimento, como sigue: se obtuvo sangre de la vena antecubital,
con el sujeto en posición recostada, usando estasis mínima, en una
jeringa que contenía citrato 0,11 M (1:9 v/v a sangre). Se preparó
plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación de sangre a
250 g durante 10 minutos. La mayoría del PRP se retiró y el plasma
pobre en plaquetas (PPP) se preparó a continuación centrifugando la
sangre residual a 2.500 g durante 15 minutos. La concentración de
plaquetas en el PRP se determinó en un contador de células (Minos
STX, ABX Ltd, Montpellier, Francia). Las muestras con un conteo de
plaquetas fuera del intervalo de 150.000 a 350.000 por \mul se
rechazaron. El PRP se dejó en reposo durante al menos 30 minutos
antes del comienzo de los estudios de agregación. El tiempo entre la
recogida de sangre y la agregación de plaquetas no era nunca mayor
de 3 horas.
La agregación de plaquetas se determinó sobre las
plaquetas recientemente preparadas usando un agregómetro
PAP-4C (BioData, Alpha Laboratories, Southampton,
Reino Unido). Se añadió una muestra de 200 \mul de PRP a una
cubeta siliconizada y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La
agregación se indujo mediante la adición de 20 \mul del agonista
(uno de los siguientes: ácido araquidónico a 455 \mug/ml; 1,8
\mumoles/l de ADP; colágeno a 43 \mug/ml obtenido de BioData;
trombina a 0,11 U/ml, obtenida de Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido;
todas son concentraciones finales en la mezcla de agregación). La
suspensión de plaquetas se agitó a 1000 rpm a 37ºC durante 5
minutos. La agregación máxima (porcentaje desde la línea de base) se
determinó dentro de este tiempo. El valor era una medida del
potencial agregador de las plaquetas, indicando una disminución una
respuesta anti-agregatoria cuando se comparaban
muestras extraídas antes y después del consumo del material de
prueba. La significación estadística se determinó mediante la prueba
t apareada.
El polvo polifenólico de vino tinto inhibía la
agregación de plaquetas agudamente o crónicamente según se muestra
en la Tabla 9. Estos efectos son similares a pero inferiores que los
observados con la aspirina (75 mg al día), excepto para la trombina.
En particular, el efecto de los polifenoles sobre la agregación
inducida por araquidonato sugiere una inhibición de la actividad de
ciclooxigenasa de las plaquetas. Estos resultados sugerían que los
polifenoles del vino tinto tienen efectos similares a la aspirina,
aunque existe un efecto inhibidor adicional sobre la agregación
inducida por trombina.
El mismo experimento se usó para investigar los
niveles de actividad de PAI-1 y tPA en los sujetos.
Se obtuvo sangre de la venta antecubital, con el sujeto en posición
recostada usando estasis mínima, en una jeringa que contenía citrato
0,5 M, pH 4,3 (Stabilyte™, 1:9 v/v con respecto a la sangre). Se
preparó plasma mediante centrifugación de sangre a 2500 g durante 15
minutos a 4ºC y se congeló a -70ºC inmediatamente.
Las tres muestras (línea de base, 4 horas y 2
semanas) de un sujeto se descongelaron rápidamente a 37ºC en el día
del ensayo. Las actividades de tPA se determinaron usando un estuche
disponible comercialmente (Chromolize™, de Biopool, Umea, Suecia)
que es un ensayo inmunosorbente biofuncional. Se añadió muestra o
patrón (100 \mul) a cada pocillo. La placa de microvaloración se
incubó en un agitador de placa durante 20 minutos, tiempo después
del cual el contenido de los pocillos se descartó y los pocillos se
lavaron 4 veces. A continuación, se añadieron 50 \mul de solución
de substrato a cada pocillo, seguido por 50 \mul de reactivo de
plasminógeno, y la placa se incubó durante 90 minutos más.
Finalmente, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de solución de
ácido acético glacial 1,7M y se mezclaron durante 15 segundos. Las
absorbancias se midieron a 405 nm y la actividad de tPA en la
muestra se leyó a partir de una curva de calibración lineal. La
significación de las diferencias entre los valores de la línea de
base, de 4 horas y de 2 semanas, para cada tratamiento se determinó
mediante una prueba t apareada de dos colas. Los resultados se
muestran en la Tabla 10.
El enzima tPA constituye una proteína importante
en la ruta fibrinolítica, y se cree que su actividad juega un papel
principal en el sistema fibrinolítico. El papel fisiológico del tPA
es activar el plasminógeno hasta plasmina, que degrada la fibrina
hasta productos de degradación de fibrina solubles. En el ensayo de
tPA, el inhibidor específico PAI-1 está presente
habitualmente en un gran exceso y debe evitarse que amortigüe la
actividad de tPA. Esto se proporciona mediante el uso de tubos de
recogida de sangre Stabilyte™ que proporcionan una acidificación
suave de la muestra.
Debido a que se sabe que los valores de
PAI-1 están sometidos a variación diurna, se llevó a
cabo un experimento adicional en el que los mismos sujetos se
estudiaban usando agua como placebo, en lugar de polifenoles del
vino tinto. Los resultados se muestran en la Tabla 11.
Los polifenoles del vino tinto (2 g/día)
producían una disminución significativa en PAI-1
después de 4 horas, que estaba asociada con un incremento
significativo en la actividad de tPA (Tabla 10). No se observaban
cambios después de un ayuno nocturno después de un tratamiento de 2
semanas. Sin embargo, según se muestra en la Tabla 11, después de 4
horas la concentración de antígeno PAI-1 se
disminuye después de la administración de agua, indicando que los
efectos sobre la concentración de antígeno PAI-1
observados después del consumo de polvo polifenólico se debían
simplemente a la variación diurna. Sin embargo, la administración de
agua no incrementaba significativamente la actividad de tPA,
mientras que el polvo polifenólico de vino tinto daba un incremento
de 2,7 veces en la actividad de tPA. Se concluye que los polifenoles
del vino tinto producen un efecto beneficioso al estimular la
fibrinolisis incrementando la actividad de tPA, pero no tienen
efecto sobre la concentración de antígeno PAI-1. tPA
promueve la formación de plasmina a partir de plasminógeno y la
plasmina convierte la forma latente de TGF-\beta
en su forma activa que a continuación inhibe el crecimiento de
células del músculo liso vascular (VSMC) que contribuyen al
crecimiento de placas ateroscleróticas.
Preferiblemente, el consumo de una composición de
acuerdo con la invención provocará al menos una reducción de 2% en
la agregación de plaquetas máxima (según se determina mediante el
método descrito previamente) y/o un incremento en la actividad de
tPA de al menos 0,75 UI/ml (según se determina mediante el método
descrito previamente).
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Claims (17)
1. Una composición seca que contiene flavonoles
derivada de plantas adecuada para el consumo humano obtenida a
partir de uvas, vino o subproductos que contienen flavonoles o
productos residuales del procedimiento de elaboración del vino, en
la que al menos 25% del material derivado de plantas en la
composición comprende polifenoles, comprendiendo la composición al
menos 0,1% p/p de flavonol y en la que el consumo de la composición
por un sujeto humano es eficaz para provocar en el sujeto uno o más
de lo siguiente:
- inhibir la oxidación de LDL de plasma;
- estimular la producción de TGP-\beta;
- inhibir la agregación de plaquetas;
- estimular la fibrinolisis.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el contenido de flavonoles es al menos
1% (p/p).
3. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que el contenido de flavonoles comprende
al menos 0,5% del contenido total de polifenoles derivados de
plantas de la composición.
4. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la que el contenido de
flavonoles comprende al menos 1,0% del contenido total de
polifenoles derivados de plantas de la composición.
5. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la que el contenido de
flavonoles comprende al menos 2% del contenido total de polifenoles
derivados de plantas de la composición.
6. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que comprende el conjunto total
de polifenoles del vino tinto.
7. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que comprende un excipiente,
diluyente o portador.
8. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que comprende una o más
substancias seleccionadas del grupo que consiste en: nutrientes,
antioxidantes, substancias terapéuticas (especialmente las que
tienen un efecto terapéutico en relación con la prevención y/o el
tratamiento de CHD), saboreantes y edulcorantes.
9. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, que comprende una o más
substancias seleccionadas del grupo que consiste en: luteína,
licopeno, \alpha- o \beta-caroteno, vitamina A,
vitamina C, vitamina E (\alpha-tocoferol y otros
tocoferoles activos), ácido fólico, selenio, cobre, zinc, manganeso,
ubiquinona (coenzima Q10), ácido salicílico, ácido
2,3-dihidroxibenzoico, ácido
2,5-dihidroxibenzoico y aspirina.
10. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, envasada en forma de dosis
unitaria.
11. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en la forma de una tableta,
cápsula o píldora.
12. Un método para elaborar una bebida, que
comprende mezclar una composición de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11 con un líquido fisiológicamente
aceptable.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el líquido fisiológicamente aceptable comprende agua,
una solución acuosa, una solución alcohólica, zumo de frutas, leche
o yogur.
14. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la
fabricación de un medicamento para el consumo por un sujeto humano
para inhibir la oxidación de LDL de plasma en el sujeto.
15. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la
fabricación de un medicamento para el consumo por un sujeto humano
para estimular la producción de TGF-\beta en un
sujeto humano.
16. Uso de una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la
fabricación de un medicamento para el consumo por un sujeto humano
para inhibir la agregación de plaquetas y/o estimular la
fibrinolisis en el sujeto.
17. Un método para elaborar un medicamento para
el consumo oral por un sujeto humano con el propósito de efectuar
uno o más de lo siguiente en el sujeto: inhibición de la oxidación
de LDL de plasma; inhibición de la agregación de plaquetas;
estimulación de la fibrinolisis y estimulación de la producción de
TGF-\beta; comprendiendo el método preparar una
composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-11 y preparar dosis unitarias de la
composición.
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