CZ98699A3 - Motor s kmitavými písty - Google Patents

Description

Způsob identifikace genetických druhů chmelu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu identifikace druhů chmelu a především identifikační metody, která využívá technologii genetického inženýrství.

Dosavadní stav techniky

Chmel dává pivu jedinečné aroma a hořkost, a pomáhá vysedimentování přebytečných bílkovin a potlačuje bakteriální proliferaci. Nicméně míra účinku chmelu se liší v tomto směru podle druhu chmelu, proto je nutné identifikovat druhy chmelu pro udržení výroby piva stejné kvality a pro vývoj nových druhů piv.

Obvykle je identifikace druhů chmelu založená na jejich základních složkách, tj. hořkých složkách (a kyseliny / β kyseliny kohumulonové / humulonové, kolupulon / lupulon) a esenciálních olejových složek (farnezen, karyofylen).

Kromě faktu, že identifikační metoda založená na hořkosti a olejích vyžaduje namáhavá měření všech složek, také není schopná přesně určit druhy, protože tyto složky dokonce vtom stejném druhu závisí na pěstované oblasti a roku.

Současný vývoj v genetickém inženýrství, množství pokusů provedených k vyřešení sekvence chromozómů, která závisí na druhu rostlin a založené na zjištění sekvence bází, umožnil identifikovat odrůdy s různou genetickou informací mezi různými rostlinami, nebo druhy té stejné rostliny, t.j. z polymorfismu DNA sekvence.

Identifikace rostlinných druhů podle tohoto typu polymorfismu je spolehlivá, protože samotná sekvence DNA stěží podléhá vlivům prostředí a je proto neměnná.

Z tohoto hlediska, předpokládaný vynález poskytuje spolehlivý a jednoduchý způsob identifikace chmelových druhů, použitím uvedené genetické techniky.

Podstata vynálezu

Způsob identifikace chmelového druhu podle vynálezu geneticky detekuje tento polymorfismus založený na různých mezidruhových sekvencích DNA. Jmenovitě, části sekvence DNA chmelu, které vykazují polymorfismus, jsou amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí (dále jako PÓR) použitím identifikačního očka a druhy jsou pak identifikovány analýzou takto amplifikované DNA.

K použití výše uvedeného způsobu je důležité poznat polymorfismus DNA mezi různými druhy chmelu.

Pojem polymorfismus specificky zahrnuje rozdíl v genetice sekvence, který je způsobený inzercí, delecí nebo substitucí. Délka této sekvence může být 1 bp nebo několik desítek a více bp, ale s výhodou v rozmezí několika bp nebo několik desítek bp.

Tento sekvenční polymorfismus mezi druhy může být detekován určením sekvencí částí odpovídající chromozómové DNA každého druhu a potom provedením porovnávací analýzy sekvencí. Jednoduchým způsobem je použití RAPD ( Náhodná amplifikovaná polymorfická DNA) techniky vyvinuté Williamsem a spol. (Nucleic Acids Research, Vol. 18, p. 6531, 1990).

Tato RAPD technika detekuje polymorfismus mezi neznámými sekvencemi DNA použitím PCR. Jmenovitě, očka nízké specifičnosti, zahrnující relativně krátké syntetické nukleotidy, asi 10 bází, jsou smíchána s mnoha typy DNA a provede se PCR.

Když sekvence chmelu obsahuje sekvenci, která je zcela nebo částečně komplementární k očkům, očka tepelně hybridizují s úplnou nebo částečnou komplementární sekvencí a část ohraničená očky je syntetizována a amplifikována. Jestliže jsou rozdíly v sekvencích takové, jako je inzerce nebo delece DNA v části mezi očky, v PCR se získají amplifikované fragmenty různých velikostí v závislosti na druhu. Dále jestliže sekvence jednoho druhu tepelně hybridizuje s očkem a druhý druh ne, tak získáme jen PCR fragmenty prvního druhu. Polymorfismus může být pak detekovaný frakcionací, například elektroforézou.

RAPD metoda může být použita nejen k detekci polymorfismu podle výše popsaného vynálezu, ale také k výběru oček, které mohou detekovat polymorfismus pomocí PCR, t.j. jako metoda určující očko.

Předmětem způsobu podle vynálezu jsou všechny polymorfní oblasti DNA chmelových druhů detekované RAPD metodou. Tedy všechny očka, které mohou amplifikovat polymorfní oblast detekovanou RAPD metodou, mohou být použity jako identifikační očka podle vynálezu.

Identifikační očka podle vynálezu vyvinutá výše uvedeným způsobem, mohou být jedním nebo dvěma typy nebo více typy syntetických oligonukleotidů.

Délka syntetického oligonukleotidu je v rozsahu 6 - 40, s výhodou 10 - 21. Jmenovitě je výhodné používat oligonukleotidy obsahující sekvence bází ukázané v SEKV. IČ: 1 -14 v sekvenčním seznamu.

Druhý způsob určení identifikačních oček podle vynálezu zahrnuje následující stupně:

Tento způsob nejprve stanovuje sekvenci bází amplifikovaných fragmentů získaných polymerázovou řetězovou reakcí použitím identifikačního očka (t. j. očka, které může amplifikovat polyformní oblast detekovanou výše uvedenou metodou RAPD, dále uvedené jako primární očko). Nakonec jsou syntetizována dvě identifikující očka, která jednotlivě doplňují pozici dříve určeného intervalu výše uvedeného fragmentu polymorfní sekvence, to znamená, že produkují amplifikovaný fragment, který umožňuje identifikaci polymorfní sekvence s primárním očkem, s vysokou reprodukovatelností a jednoduchostí.

Jinými slovy, podle výše uvedeného způsobu může být identifikační očko selektivně určeno na základě polymorfní sekvence a okolních sekvencích.

Uvedené primární očko může být oligonukleotid složený ze sekvence bází popsané v SEKV. IČ. 1-14 v sekvenčním seznamu.

Například první sekvence identifikačního očka může být určená tak, že další nebo obě očka obsahují celou nebo část výše uvedené polymorfní sekvence.

Když se provede identifikace druhu s dříve uvedenými očky a použije se druh, který obsahuje vybranou polymorfní sekvenci, s PCR amplifikacemi DNA druhu, je získána specifická amplifikovaná DNA, protože druh neobsahuje komplementární sekvenci. V tomto případě je možná identifikace druhu podle přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaného fragmentu. Sekvence druhého identifikačního očka může být určena tak, že dva typy oček jsou umístěny jeden nad a druhý pod odpovídající polymorfní sekvenci.

Jestliže je provedena identifikace druhu použitím výše uvedených identifikujících oček, je produkována pomocí PCR DNA, mající různé vnitřní sekvence bází, které jsou závislé na druhu a v některých případech také různý počet bází. Druh může být identifikován z pohyblivosti vzorku, získané frakcionací amplifikované DNA elektroforézou, pokud je nutné elektroforézou po štěpení restrikčními enzymy, denaturační enzymovou elektroforézou nebo teplotní gradientovou gelovou elektroforézou.

Třetí identifikační očko může být určeno tak, aby na 5'konci obsahovalo sekvenci primárního očka, sekvence bází v polymorfní části připojenou k této sekvenci obsahující 5-20 bází společně vázaných. Identifikace druhu použitím tohoto identifikačního očka je vhodná, když je například polymorfní sekvence na místě, ke kterému je primární očko komplementární. Jinými slovy, polymorfní sekvence může být detekovaná s vyšší specifitou, než se samotným primárním očkem připojením k němu sekvenci 2 - 5 bází.

Dále jiné identifikační očko neobsahující tento typ sekvence může být také vhodně použito jako identifikační očko chmelu a to v případě, že je určeno podle výše uvedeného způsobu.

Specificky, identifikační očko určené podle výše uvedeného způsobu, může být syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci bází v SEKV. IČ 15 - 40 sekvenčního seznamu nebo vhodná kombinace dvou syntetických oligonukleotidů, ze kterých každá obsahuje část této sekvence bází, pokud je výhodnější.

Případně může být identifikačním očkem syntetický oligonukleotid, který obsahuje část sekvence bází genomové DNA mezi místem, kde sekvence bází s SEKV. IČ: 15 (17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39) je hybridizována ke genomové DNA a místem, kde je sekvence bází SEKV. IČ: 16 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40) hybridizována ke genomové DNA.

Podle tohoto způsobu určení identifikačního očka (t. j. s tímto složením), je možné stanovit sekvenci bází úseku, který představuje polymorfismus a tedy způsob poskytuje očko, které může spolehlivěji identifikovat druh.

Takto, provedením porovnávací analýzy DNA mezi druhy, založené na genetické technice podle způsobu identifikace druhu podle vynálezu, chmelové druhy mohou být spolehlivě identifikovány bez vlivu prostředí, ve kterém byly pěstovány.

Vynález bude nyní popsán podrobněji a to s odkazy a specifickými případy, ale musí být jasné, že vynález v žádném případě není omezen těmito příklady.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 je fotografie ukazující pohyb vzorku získaného, když části z DNA Hallertauer Tradition (HT) a Shinshu Wase (SW) byly jednotlivě amplifikovány s použitím primárního očka (jeden typ očka: B72) a amplifikované fragmenty byly podrobeny elektroforéze ( podle způsobu určení druhého identifikačního očka).

Obr. 2: je diagram, který ukazuje sekvenci bází amplifikovaných fragmentů podrobených elektroforéze v okolí 600 bp ukázaných šipkou na obr. 1; horní skupina ukazuje sekvenci bází HT a dolní skupina ukazuje sekvenci bází SW. Identická místa bází patřící k HT v horní skupině jsou označeny černými tečkami (°) a jsou ukázány báze, kde substituce bází je v místech odpovídající oběma dvěma. Místa, která nepatří k bázím ani jednoho typu, t. j. chybějící místa, jsou ukázány značkou minus ()· .

Orámovaná B72WF2 obsahuje sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 27 sekvenčním seznamu, která je vybrána jako identifikační očko. Rám uzavírající B72WR2 obsahuje sekvenci bází popsanou v SEKV.IČ 28 sekvenčního seznamu, což je komplementární sekvence k identifikačnímu očku.

Obr. 3: je fotografie, která ukazuje výsledky elektoforézy frakcionace amplifikovaných fragmentů, když je PCR provedena použitím identifikačního očka obsahujícího B72WF2 (SEKV.IČ: 27) a komplementární sekvence B72WR2 (SEKV.IČ 28) ukázané na obr. 2.

Obr. 4: je výkres ukazující sekvenci bází jiného polymorfního amplifikovaného fragmentu (RAPD značka).

Obr. 5: je výkres vykazující sekvenci bází ještě jiných polymorfních amplifikovaných fragmentů (RAPD značka)

Příklady provedení vynálezu

Ve způsobu identifikace chmelového druhu podle vynálezu, polymorfní oblasti, t.j. části DNA, ve kterých DNA sekvence je odlišná u různých druhů chmelu, jsou amplifikovány PCR použitím identifikačního očka a druhy jsou identifikovány analýzou rozdílů mezi jednotlivými amplifikovanými fragmenty.

Sbírka DNA chmelu

Chmelová DNA může být pro studium odebrána z malého množství chmelových listů, plodů a zrnek.

Chmelová DNA může být získána metodou všeobecně používanou k tomuto účelu z rostlinných vzorků, například typickou metodou je extrakce DNA, popsaná v Nucleic Acids Res., 8, 4321 (1980) nebo jednodušeji proveditelná extrakce použitím komerční Soupravy pro DNA krve a buněčné kultury (QLAGEN lne.). Při použití Soupravy je DNA absorbována na záporný ion ionoměničové, pryskyřičné kolony a opět uvolněna, takže problém způsobený příměsí látek, které mohou interferovat s reakcí může být vyřešen.

Teď budou popsány některé způsoby určení identifikačního očka, které může být použito ve vynálezu.

První způsob určení identifikačního očka

K určení očka může být použita jakákoliv metoda, která nalézá oligonukleotidy, které detekují polymorfní část nebo sekvenci různých odrůd pomocí PCR, ale zvláště vhodná je RAPD metoda.

K provedení RAPD metody se nejdříve připraví skupina oček obsahující různá očka.

Očka použitá v běžné RAPD metodě mohou být získány z DNA použitím automatické syntetické soupravy, například fosfoamididovou technikou. Mají náhodné sekvence a jejich délka je 6 - 40 nukleotidů nebo s výhodou 10-21 nukleotidů.

Také může být použita sekvence bází objevená Williamsem a spol. (Nucleic Acid Research, Vol. 18, p.6531, 1990), podle Bečka společné očka nebo komerční oligonukleotidy z Operon 10 - mer souprav vyrobených OPERON Co. PCR je pak provedena s různými typy chmelové DNA, přičemž je použito jedno nebo více oček z výše uvedené skupiny za stejných podmínek, které budou dále popsané v „PCR reakci“.

Dále, fragmenty amplifikované pomocí PCR jsou frakcionované na vhodném elektroforetickém gelu a jsou porovnávány stupně pohyblivosti amplifikovaných fragmentů mezi druhy.

Jestliže výsledkem výše uvedeného pozorování jsou nalezené odlišné amplifikované fragmenty nebo fragmenty s různou velikostí mezi druhy, vezmou se jako polymorfní amplifikované fragmenty (RAPD značky) a jedno nebo dvě očka produkující tyto fragmenty jsou vybrány z výše uvedené skupiny oček, aby byly použitelné jako identifikační očka.

Příkladem touto cestou vybraného identifikačního očka je syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 1 - 14 sekvenčního seznamu a samozřejmě tyto sekvence mohou být použité jako komplementární sekvence.

Jakýkoliv oligonukleotid obsahující část sekvence bází ukázané v SEKV. IČ: 1 - 14 sekvenčního seznamu může být použit v PCR reakci jako identifikační očko, které může amplifikovat jakoukoliv vybranou polymorfní sekvenci chmelové DNA.

Dále v závislosti na reakčních podmínkách PCR reakce může být použit jakýkoliv oligonukleotid obsahující sekvenci podobnou výše uvedeným syntetickým oligonukleotidům.

Podle první zjišťovací metody se lehce určuje identifikační očko, které může detekovat polymorfismus v chmelu obsahujícím neznámou sekvenci.

Kromě toho tímto způsobem vybrané identifikační očko plní svoji funkci velmi dobře, jak bude ukázáno v následujících případech.

Druhý způsob určení identifikačního očka

Druhý způsob určení identifikačního očka stanovuje sekvenci bází polymorfních amplifikovaných fragmentů (RAPD značek) zjištěných prvním způsobem určení identifikačního očka a zjistí polymorfní sekvence.

Sekvence, které může produkovat amplifikovaný fragment obsahující polymorfní sekvenci, jsou vybrány jako identifikační očka ze sekvence v těchto stanovených polymorfních amplifikovaných fragmentech.

Očko může být určeno z typového seznamu „PCR technology“ ed. Henry A. Erlich, Takara Shuzo Co. Ltd., který je často citován v PCR.

Specificky, když se vybraná sekvence očka z DNA amplifikovaného fragmentu liší velikostí od RAPD značky, je vybrána libovolná sekvence bází oligonukleotidů obsahující sekvenci uloženou na straně inzerce nebo na straně delece v RAPD značce.

Příkladem takovéhoto identifikačního očka je kombinace oligonukleotidů obsahujících sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 27, 28 sekvenčního seznamu.

Velikost RAPD značky je od 1 bp až několik sto bp, ale velikost asi 10 bp až několik desítek je k identifikaci obvyklejší. Také tam může být párová substituce, která může být identifikována restrikčními enzymy nebo podobně, dokonce když se neliší velikostí.

Velikost, která může být snadno rozeznána elektroforézou závisí na typu a koncentraci použitého gelu, ale jako pravidlo může být 1/10 nebo více z celkové délky. Například očko je určeno tak, že když sekvence inzertu je 20 bp, celá délka amplifikovaného produktu je 200 bp nebo méně. Proto použitím takového typu očka pro PCR jsou získány amplifikované fragmenty, jejichž velikost umožňuje snadnější rozlišení polymorfismu.

Případně, jestliže amplifikované fragmenty mezi druhy mají různou velikost, mohou být vybrány oligonukleotidy, které obsahují vnitřní sekvence na straně inzertu a sekvence na místech, která spojují místa, kde byla delece. Proto použitím PCR s tímto typem identifikačního očka se získají fragmenty s různou velikostí inzerce nebo delece.

Jestliže může být RAPD značkou identifikována přítomnost nebo nepřítomnost specifických pásů amplifikované DNA v závislosti na druhu, jako očko je vybrán oligonukleotid z vnitřní sekvence bází RAPD značky, obsahující optimální sekvenci pro polymerázovou řetězovou reakci. Příkladem takového očka jsou oligonukleotidy obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 35, 36 sekvenčního seznamu.

Dále se ukazuje, že polymorfismus je jen v miste, kde se primární očko hybridizuje, může být vybrán syntetický oligonukleotid obsahující sekvenci primárního očka na 5'konci a obsahující 5 -20 sekvencí bází RAPD značky.

Například, když je použito očko obsahující vnitřní sekvenci bází RAPD značky a pomocí PCR jsou touto cestou produkovány amplifikované produkty té stejné velikosti pro všechny druhy, může být výběrem očka zvýšena specifičnost. Specifickým příkladem je očko obsahující sekvenci bází v SEKV. IČ: 15 a 16 sekvenčního seznamu, která je připojená k sekvenci bází na 5'konci (obr. 5). Jestliže však je sekvence bází, která je připojena v RAPD značce, příliš krátká, zvýší se v PCR nespecifická amplifikace pásů a detekce polymorfismu není možná.

Jestliže jsou rozpoznávaná místa pro restrikční enzymy v sekvenci bází RAPD značky, která by umožnila identifikovat druh, tak může být k získání amplifikovaných produktů určeno primární očko, které má zachovány tyto enzymem rozpoznávaná místa. Příklad takovéhoto očka jsou oligonukleotidy obsahující sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 33, 34 sekvenčního seznamu.

Když je očko určeno touto cestou, hybridizační teplota může být určena tak, že provedením PCR jsou amplifikované jen cílové fragmenty (RAPD značka). Identifikace DNA amplifikovaných pásů je proto snadná a získali jsme spolehlivé výsledky.

Syntetické oligonukleotidy poskytují jednoduchý způsob získání oček určených dále popsanou cestou. Syntetická očka použitá ve vynálezu se mohou získat použitím komerčního DNA autosyntetizujícího přístroje, pomocí například fosfoamididové metody.

Délka řetězce takových oligonukleotidů je 15-40, s výhodou 20 - 30. S výhodou mohou být použity jakékoliv oligonukleotidy, které obsahují sekvenci bázi popsanou v SEKV. IČ: 1 - 40 sekvenčního seznamu.

Kromě toho dále mohou být použity syntetické oligonukleotidy obsahující část sekvence bází chmelové DNA mezi místem, ke kterému jsou komplementární jiné syntetické oligonukleotidy obsahující dva druhy sekvencí bází ze sekvencí bází popsaných v SEKV. IČ: 15 - 40 sekvenčního seznamu (například 15 a 16, 17 a 18, ...35 a 36, atd.).

Identifikační očka, podle dříve uvedeného určujícího způsobu amplifikace polymorfní oblasti, umožňují vhodnou identifikaci založenou na polymorfních amplifikovaných fragmentech, t. j. sekvencích obklopujících polymorfní sekvenci a také obsahujících sekvenci vhodnou pro PCR. Použitím těchto oček může být proto uskutečněná přesná identifikace druhu.

PCR reakce

Dále polymorfní oblast DNA chmelu je amplifikována pomocí PCR použitím identifikačního očka určeného podle výše uvedeného prvního nebo druhého určovacího způsobu.

PCR reakce je např. popsána Saiki a spol., Science, Vol. 230, p. 1350 - 1354. Specificky, reakce se skládá z následujících kroků: stupeň denaturace matrice DNA, stupeň hybridizace očka s DNA matricí a stupeň pro provedení replikačního cyklu DNA obsahujícího prodlužovací stupeň s DNA polymerázou s očkem, jako startovacím bodem.

PCR byla provedena zpracováním každého druhu v samostatné reakční zkumavce. Reakční roztok byl připraven přidáním jednoho nebo dvou typů syntetických oligonukleotidů, DNA polymerázy, 4 druhů deoxyribonukleotidů (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), DNA z každého druhu chmelu jako matrice DNA a amplifikační tlumivý roztok (obsahující asi 1,0 μΜ až 4,0 μΜ, ale s výhodou asi 1,5 μΜ až 3,0 μΜ chloridu hořečnatého, chlorid draselný, želatinu, hovězí sérový albumin a povrchově aktivní látku (např. Tween 20, NP-40, Triton X-100 (vše komerční názvy) a dimethylsulfoxid). Reakční zkumavka obsahující reakční roztok byla vložena do termocyklovače nebo podobně a uskutečnil se vhodný počet cyklů dříve zmíněného DNA replikačního cyklu, například asi 20 až 50 cyklů, ale nejlépe 25 až 40 cyklů.

PCR reakční stupně mohou být provedeny, například za následujících podmínek.

Denaturační krok se normálně uskuteční zahřátím od 90 °C do 95 °C, ale s výhodou od 94 °C do 95 °C, přibližně 1 minutu do přibližně 3 minut, ale s výhodou od přibližně 1 minuty do přibližně 2 minut.

Stupeň tepelné hybridizace očka se provede inkubací s očkem při 30 °C do přibližně 42 °C přibližně 1 minutu do přibližně 3 minut, ale s výhodou od přibližně 1 minuty do přibližně 2 minut. Identifikační očko může být jednoho typu nebo kombinací dvou nebo více typů podle přání.

Prodlužovací stupeň s DNA polymerázou se uskuteční v přítomnosti termostabilní DNA polymerázy, normálně při přibližně při přibližně 70 °C do přibližně 73 °C, ale s výhodou při přibližně 72 °C až do přibližně 73 °C, a přibližně 1 minutu až přibližně 4 minuty, ale s výhodou přibližně 2 minuty až přibližně 3 minuty. Tato termostabilní DNA polymeráza může být komerční, termostabilní DNA polymeráza vyrobená PERKIN ELMER s. r. o.

Žádaná amplifikovaná DNA se může získat opakováním předcházejících stupňů.

Analýza amplifikovaných fragmentů

Amplifikovaná DNA produkovaná PCR reakcí použitím identifikačního očka je frakcionovaná elektroforézou, která je obvyklou metodou frakcionace DNA. Druh může být identifikovaný na základě pohyblivosti získaných pásů.

V elektroforéze, vhodná pohyblivost pásů může být získána použitím přibližně 3% až přibližně 20% polyakrylamidového gelu pro DNA fragmenty s velikostí 1000 deoxyribonukleotidových párů a méně a pro delší fragmenty v přibližně 0,2% až přibližně 2% agarózovém gelu.

Pro elektroforézu může být použit jako elektroforetický tlumivý roztok systém Tris - kyselina fosforečná (pH 7,5 - 8,0), Tris - kyselina octová (pH 7,5 - 8,0), ale s výhodou systém Tris - kyselina boritá (pH 7,5 -8,3), ale výhodnější je systém Tris kyselina fosforečná. Jestliže je nutné, může být přidána EDTA.

Podmínky elektroforézy se liší a závisí na velikosti elektroforetické aparatury, ale mohou být například 50 - 300 V, 10 -120 minut, ale s výhodou 150 V, 30 minut. K porovnání velikosti se současně přidávají značky při elektroforéze, mohou být použity komerční značky, například 100 Base Pair Ladder (Pharmacia lne.)

Amplifikovaná DNA může být zviditelněna detekováním s látkami, jako je fenantridinové barvivo, například ethidiumbromid, které mohou reagovat s nukleovými kyselinami. Technika barvení se provede buď přidáním takové látky, jako je ethidiumbromid, aby byla jeho konečná koncentrace přibližně 0,5 mg/ml nebo se gel po elektroforéze ponoří do vhodného roztoku ethidiumbromidu o přibližně 0,5 mg/ml na přibližně 10 až 60 minut. Když se obarvený gel ozáří UV zářením při 254 nm nebo 366 nm v tmavé místnosti, může být pohyblivost vzorku detekována jako červené pásy DNA, které jsou spojeny s ethidiumbromidem. Výhodou je že, když se přidá barvící roztok do elektroforetické aparatury, pohyblivost vzorku může být dokonce pozorována také v průběhu elektroforézy. Kromě této elekroforetické metody amplifikovaná DNA může být analyzovaná čímkoliv, co může detekovat její přítomnost nebo nepřítomnost nebo velikost.

Identifikace druhu

Druh může být identifikovaný porovnávací analýzou pohyblivosti vzorku, získané jak bylo popsáno výše. Porovnávací analýza mezi druhy může být provedena tak, že je například založena na různé přítomnosti nebo nepřítomnosti nebo různé velikosti předurčené amplifikované DNA.

Přítomnost nebo nepřítomnost amplifikované DNA v určitých druzích, ukazuje zda očko použité pro PCR obsahuje sekvenci pro tepelnou hybridizaci (t.j. komplementární sekvenci) a rozdíly velikostí amplifikované DNA ukazují, že existují polymorfní sekvence, například delece nebo inzerce v částech amplifikovaných pomocí PCR, které závisí na odrůdě.

K přesnější identifikaci druhů je výhodnější se nespoléhat jen na výsledky PCR, ale srovnat pohyblivost vzorku amlifikovaných fragmentů, když jsou použity jako identifikační očka jeden nebo dva různé oligonukleotidy.

Kromě toho přesnost, se kterou může být druh identifikován a kapacita k rozlišení mezi nimi, může být dokonalejší sledováním výsledků získaných při různých podmínkách PCR, například hybridizační teplotě, koncentraci hořčíku v reakčním tlumivém roztoku, atd.

Způsob identifikace chmelových druhů podle vynálezu, provedená předcházejícími postupnými operacemi, může jasně rozlišit různé odrůdy.

Aplikace

Způsob identifikace druhů podle vynálezu může být aplikován k ověření čistoty odrůd chmelu pro použití takových produktů chmelu, jako jsou chmelové pelety.

Například studium je provedeno na základě rozdílu mezi amplifikovanými DNA získanými ze standardních chmelů a amplifikovanými DNA získanými z chmelových peletů. Jestliže je amplifikovaná DNA jiná než ta, která je získána ze standardního chmelu, může být stanoveno, že jiné odrůdy nebo druhy jsou smíchány se standardním chmelem v peletech.

Pokud je očekávána přítomnost jiných odrůd nebo druhů, množství amplifikované DNA, rozsah v jakém jsou jiné odrůdy nebo druhy přítomny t. j. čistota, může být měřena pozorováním například intenzity obarvení s ethidiumbromidem, jak bylo popsáno výše.

V tomto případě také přesnost odhadu čistoty může být zvýšená použitím dvou nebo více syntetických oligonukleotidů společně podle vynálezu.

Může se očekávat, že nukleotidy vynálezu mohou být aplikovány pro identifikaci jiných druhů rostlin než chmelu (například moruše, jahody, třešně, atd.) Místa, kde sekvence deoxyribonukleotidů je u blízkých druhů různá, jsou místa, kde se snadno objevují mutace DNA, a proto jsou omezena. Například je popsáno, že místo kódující rDNA může být použito k identifikaci druhů bakterií (E. coli, bakterie mléčného kvašení) nebo rostlin (semínek rýže, pomerančů). Proto místa, které byly podle vynálezu nalezeny jako odlišné u blízkých druhů, mohou být pravděpodobně použity také k identifikaci druhů jiných rostlin.

Způsob identifikace odrůdy podle vynálezu provádí analýzu založenou na polymorfismu sekvencí mezi druhy, a proto mohou přesně rozlišit druhy chmelu bez vlivu prostředí. Dále, identifikační způsob podle vynálezu může nejen identifikovat druhy, ale také měřit čistotu různých druhů chmelu ve chmelových produktech.

Příklady 1-12 ukazují identifikaci druhu chmelu při použití identifikačního očka určeného prvním určujícím způsobem identifikačního očka.

Příklad 1

Extrakce genomové DNA

Byl použit chmel Brewer's Gold (dále označený jako druh č. 1), Nothern Brewer (dále označovaný jako druh č.2), Tettnanger (dále označený jako druh č. 3), Saazer (dále označený jako druh č. 4), Hersbrucker speat (dále označený jako druh č. 5), Spalter select (dále označený jako druh č. 6), Hallertauer tradition (dále jako druh č. 7), Shinshu Wase (dále označený jako druh č. 8) a Furano Ace (dále označený jako druh č. 9).

Tkáň zelených listů (surová hmotnost 1 g) z výše uvedených druhů bylo jemně nasekané a fragmenty tkáně zmrazené ponořením do kapalného dusíku. Po změně zmrazených látek na prášek v tekutém dusíku při použití Polytronu, byla genomová DNA extrahována z 50 mg prášku pomocí Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN Inc.). Nakonec se získalo 10 - 20 mg genomové DNA.

Příklad 2

Klasifikace chmelových odrůd se provádí pomocí PCR, jako očko se použijí oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.1 a 2. Polymerázová řetězová reakce se provedla v mikrozkumavkách obsahujících 50 μΜ KCI, 1,5μΜ MgCL a 10 μΜ Tris HCI tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1% Triton X-100. Do zkumavky se přidala jedna jednotka termostabilní DNA polymerázy (Wako Pure Chemicals), 20 nmol čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 0,1 mg genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle Příkladu 1 a jako očko se přidalo 33 pmol oligonukleotidů popsaných v SEKV.IČ: 1 a 2. Konečný objem reakčního roztoku byl 30 μΙ a ke každé zkumavce se přidalo přibližně 20 μΙ minerálního oleje, aby se zabránilo odpařování reakčního roztoku.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce byla provedena za následujících podmínek. Nejprve, po udržení teploty 94 °C po dobu 3 minut se uskutečnil denaturační stupeň zahřátím při 94 °C po dobu 1 minuty a stupeň teplotní hybridizace s očkem se uskutečnil při 35 °C po dobu 1 minuty. Prodlužovací stupeň s DNA polymerázou byl proveden uskutečněním 35 cyklů s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 2 minut a udržení teploty 72 °C po dobu 10 minut. Produkt se uskladnil při 4 °C.

Amplifikované DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou reakcí byla oddělena elektroforézou při 150 V, po dobu 30 minut v tlumivém roztoku 100 μΜ Tris - kyselina boritá (pH 8,0), obsahujícím 2 μΜ EDTA za použití 5% polyakrylamidového gelu. Jako značka velikosti se použil 100-Basé-Pair Ladder (Pharmacia lne.).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethilidiumbromidu na 10 minut a ozářil se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti.

Byly detekovány červené pásy, které patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou znázorněny v Tabulce 1.

Z tabulky je jasné, že když se použily jako očka oligonukleotidy obsahující sekvenci deoxyribonukleotidů popsanou v SEKV. IČ: 1 a 2, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 520 bp a přibližně 530 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti těchto pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

TABULKA 1

sekv. i0:	1, 2	3, 4	5, 6	7, 8	9
Amplifikovaná DNA(bp)	520 530	750 850	270	370	950 1200
Druh chmelu č.
1	0	0	0		0
2	0	0
3	0	0			0
4	0	0			0
5	0	0 0		0
6	0	0
7	0
8	0	0	0		0
9	0	0 0	0		0

Příklad 3

Způsob byl stejný jako v příkladě 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 3 a 4 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 40 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 3 a 4, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 750 bp a přibližně 850 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do čtyř kategorií.

Příklad 4

Způsob byl identický jako v Příkladě 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 5 a 6 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 40 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 5 a 6, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 270 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 5

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 7 a 8.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 7 a 8, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 370 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 6

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 9 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 40 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 9, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 950 bp a přibližně 1200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do třech kategorií.

Příklad 7

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 10 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 10, byly detekovány tři amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 650 bp a přibližně 700 bp a přibližně 1200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do čtyř kategorií.

SEKV. Ič:	10	11	12
Amplifikovaná DNA (bp)	650 700 1200	1400	550 800
Druh chmelu č.
1	0	0	0 0
2	0 0
3	0 0
4	0
5	0
6	0
7	0		0
8	0 0 0	0	0
9	0	0	0

Příklad 8

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 11 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 11, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 1400 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 9

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 12 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 2.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 12, byly detekovány dva amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 550 bp a přibližně 800 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do čtyř kategorií.

Příklad 10

Způsob byl identický jako v Příkladě 2, kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 13 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 3.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 13, byly detekovány čtyři amplifikované genomové pásy o velikosti přibližně 500 bp, 640 bp, 650 bp a přibližně 1400 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů se devět chmelových kategorií klasifikovalo do pěti kategorií.

Příklad 11

Způsob byl identický jako v Příkladě 2 kromě toho, že jako očka se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 14 a tepelný hybridizační stupeň v polymerázové řetězcové reakci byl proveden při 38 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 3.

Když se použily jako očka syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ.: 14, byl detekován jeden amplifikovaný genomový pás o velikosti přibližně 540 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo devět chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Tabulka 3

sekv. ič:	13	14
Amplifikovaná DNA (bp)	500	640	650	1400	540
Druh chmelu č.
1	0		0	0	0
2	0		0		0
3	0	0
4	0
5			0	0
6			0	0
7	0		0		0
8		0		0	0
9	0		0	0

Příklad 12

Chmelový pelet, prodávaný jako druh č. 8 (vyráběný Northern Hop Agricaltural

Cooperative, Iwate-ken v licenci Sapporo Breweries Ltd.) byl ve třecí misce rozdrcen na prášek a z 20 mg prášku se extrahovalo přibližně 5 mg genomové DNA za použití Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN Inc.). Aplikoval se ten stejný postup jako v příkladě 2, jako očko se použil syntetický oligonukleotid obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: ΐ a 2.

K ověření čistoty se stanovil rozdíl mezi detekovanou amplifikovanou genovou DNA a amplifikovaným genomem ze standardního druhu č. 8.

Dále, identifikace chmelového druhu použitím očka určeného podle druhého identifikačního způsobu určení očka, bude popsaná v Příkladech 13-30. Příklad 13

Extrakce genomu DNA

Tkáň ze zelených listů (surová váha 1 g) z výše uvedených druhů se jemně nasekala a fragmenty tkáně se zmrazily ponořením dp kapalného dusíku. Po změně zmrazených látek v kapalném dusíku na prášek při použití Polytronu, se genomová DNA extrahovala z 50 mg prášku pomocí Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN Inc.). Nakonec se získalo z každého druhu 10 - 20 mg genomové DNA. Příklad 14

Výběr RAPD značek

Po získání RAPD značky se provedla PCR s 0,34 μΜ očkem - B72 (Obr. 2)

Polymerázová řetězová reakce se provedla v mikrozkumavce obsahující 50 μΜ KCI, 1,5 μΜ MgCI₂ a 10 μΜ Tris - HCI tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1 % Triton X-100. Do zkumavky se přidalo 0,25 jednotek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K.K.), 200 μΜ každé ze čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle Příkladu 13. Konečný objem reakce byl 10 μΙ.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce se provedla za následujících podmínek. Nejdříve, po udržení teploty 94 °C po dobu 1 minuty byl proveden denaturační stupeň zahřátím při 94 °C po dobu 30 sekund a stupeň teplotní hybridizace s očkem byl proveden při 33 °C po dobu 1 minuty. Prodlužovací stupeň s DNA polymerázou byl proveden uskutečněním 35 cyklů s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 30 sekund a udržením teploty 72 °C po dobu 1 minuty.

Amplifikované DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou reakcí byla oddělená elektroforézou při 150 V po dobu 30 minut v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlumivém roztoku (pH 8,0), obsahujícím 2 μΜ EDTA za požití 5 % polyakrylamidového gelu. Jako signální značka velikosti se použil Marker 9 (Nippon Gene).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethidiumbromidu na 10 minut a ozáří se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti. Červené pásy, které byly detekované patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou ukázány na obr. 1.

Z obr. 1 je patrné, že velikost pásů na místě ukázaném šipkou je různá pro HT a SW. Pozice pásu ukázaného šipkou odpovídá RAPD značce.

Příklad 15

RADP značka připravená v příkladě 14 se vyřízla z elektroforetického gelu, vložila do dializační zkumavky, vystavila napětí a eluovala se z gelu.

K RADP značce získané způsobem popsaným v „PCR Technology“ (ed., Henry A. Erlich, pub. Takara Shuzi Co, Ltd.) se přidala rozpoznávající sekvence pro restrikční enzymy Bg III nebo Pstl. Po subklonování s pUC plazmidem, za použití takových sekvencí rozpoznané restrikčními enzymy se stanovila sekvence deoxyribonukleotidů pomocí dideoxy metody a je ukázána na obr. 2. Na obrázku ukazuje symbol tečky (°) ty stejné deoxyribonukleotidy jako v horní řadě a čárky (-) ukazují chybějící báze. Podtržená část je sekvence deoxyribonukleotidů očka B 72 a sekvence deoxyribonukleotidů uzavřená rámečkem je sekvence deoxyribonukleotidů ,která bude popsána v dalším Příkladě 16.

Příklad 16

Určily se RAPD značky získané v Příkladě 15, syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ 27 v sekvenčním seznamu se získaly vztažením k sekvenci deoxyribonukleotidů B72WF2 uzavřené v rámečku, ukázané na obr. 2 a sekvence deoxyribonukleotidů popsaná v SEKV IČ: 28, získaná z komplementární sekvence B72WR2 (produkce Sawaddy Technology).

Tyto syntetické oligonukleotidy se použily jako souprava oček v následující PCR reakci. PCR se provedla v 10 μ I reakčního roztoku obsahujícího 50 μΜ MgCI₂ a 10 μΜ Tris - HCI tlumivý roztok (pH 8,8) obsahující 0,1 % Triton X-100 a 0,25 jednotek Taq DNA polymerázy (Nippon Gene K.K.), 200 μΜ ze všech čtyř bází (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) a 17,5 ng genomové DNA z každého druhu chmelu připraveného podle Příkladu 13 a 0,34 μΜ syntetických oligonukleotidů.

Výše uvedená polymerázová řetězová reakce se provedla za následujících podmínek. Nejdříve, po udržení teploty 94 °C po dobu 1 minuty byl proveden denaturační stupeň zahřátím při 94 °C po dobu 1 minuty a stupeň teplotní hybridizace s očkem byl proveden při 60 °C po dobu 1 minuty. Prodlužovací stupeň s DNA polymerázou byl proveden 35 cykly s termostabilní DNA polymerázou, každý při 72 °C po dobu 30 sekund a udržením teploty 72 °C po dobu 30 sekund.

Amplifikovaná DNA získaná výše uvedenou polymerázovou řetězovou reakcí byla oddělená elektroforézou při 150 V, po dobu 30 minut v 100 μΜ Tris - kyselina boritá tlumivém roztoku (pH 8,0), obsahujícím 2 μΜ EDTA za požití 5 % polyakrylamidového gelu. Jako signální značka velikosti se použil Marker 9 (Nippon Gene).

Po elektroforéze se gel ponořil do 0,5 mg/ml vodného roztoku ethidiumbromidu na 10 minut a ozáří se UV zářením při 254 nm v tmavé místnosti. Červené pásy, které byly detekované patřily sloučeninám DNA s ethidiumbromidem. Získané výsledky jsou ukázány na obr. 3.

Stejný postup byl proveden s ostatními odrůdami a výsledky jsou ukázány na obr. 3. Druhy, které se použily: Fuggle (FU), Cascade (CC), Brewer's Gold (BG), Nothern Brewer (NB), Tettanger (TE), Saazer (SA), Hersbrucker spaet (HE), Perle (PE), Spatter select (SS) a Furano Ace (FA).

Jak je vidět z obrázku, pro BG, NB, TE, SW a FA byla pozorována amplifikace 329 bp fragmentu (šipka), který obsahuje inzerční místo. U všech druhů byl pozorován 299 bp fragment, který inzerční místo neobsahoval. Také byly pozorovány druhově-specifické fragmenty 600 bp, 700 bp, 710 bp. Fragmenty jsou lehce identifikovatelné a pozorovala se vysoká reprodukčnost.

Přiklad 17

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 15 a 16. Výsledky jsou ukázány v tabulce 4.

Z tabulky je vidět, že když se jako očko použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 15 a 16, byl detekovaný jeden amplifikovaný genomový pás· přibližně 500 bp. Z přítomnosti nebo z nepřítomnosti tohoto pásu bylo dvanáct chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 18

Způsob byl identický v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 17 a 18 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden při 62 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 17 a 18, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 260 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti tohoto pásu.

Příklad 19

Způsob byl identický v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 19 a 20 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 65 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 19 a 20, detekovaly se dva amplifikované genomové pásy přibližně 500 bp a přibližně 550 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů Příklad 20

Způsob byl identický v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 21 a 22. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 21 a 22, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 710 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu.

Příklad 21

Způsob byl identický v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 23 a 24. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. lč: 22 a 23, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 330 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takového pásu bylo dvanáct chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií Příklad 22

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. lč: 25 a 26 a po PCR bylo provedeno 20 cyklů PCR, které se provedly při těch stejných podmínkách jako v předcházející PCR, použitím 1 μΙ reakčního roztoku jako templátu DNA. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 25 a 26, se detekovaly dva amplifikované genomové pásy přibližně 160 bp přibližně 200 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo dvanáct chmelových odrůd klasifikováno do dvou kategorií.

Příklad 23

Způsob byl identický v Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 29 a 30 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden při 57 °C. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy SEKV. IČ: 29 a 30, se detekoval jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 350 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů Příklad 24

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v Příkladě 22, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: 30 a 31, PCR proběhlo dvakrát a reakční roztok se vystavil působení restrikčního enzymu Nlalll (Daiichi Pure Chemicals). Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily oligonukleotidy obsahující sekvence deoxyribonukleotidů popsané v SEKV. IČ: 31 a 32, detekovaly se dva amplifikované genomové pásy přibližně 220 bp a přibližně 360 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů se do čtyřech kategorií klasifikovalo dvanáct chmelových odrůd.

Příklad 25

Způsob byl identický Příkladě 16, jen jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 33 a 34 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 67 °C a reakční roztok se vystavil působení restrikčního enzymu Taq I (Boehringer Mannheim). Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 33 a 34, detekovaly se dva amplifikované genomové pásy přibližně 220 bp a přibližně 270 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů Příklad 26

Způsob byl identický se způsobem uvedeným v Příkladě 16, jerr jako očko se použily syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 35 a 36 a stupeň tepelné hybridizace v PCR byl proveden za 58 °C . Výsledky jsou ukázány v Tabulce 4.

Jako očko se použily syntetické oligonukleotidy SEKV. IČ: 35 a 36, detekoval se jeden amplifikovaný genomový pás přibližně 440 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů se do dvou kategorií klasifikovalo dvanáct chmelových odrůd.

Příklad 27

PCR a elektroforéza byly provedeny tou stejnou cestou jako v příkladě 14 s použitím 33 pmol Beckova očka (A25; 5'-GGTCAGGCACCA-3')· Jako výsledek bylo pozorováno více jak 10 pásů přibližně 200 až 2000 bp a pás přibližně 500 bp, jehož přítomnost nebo nepřítomnost byla závislá na druhu, použil se jako RAPD značka. Výsledky stanovení sekvence deoxyribonukletidů této RAPD značky jsou ukázány na obr. 4.

Syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV IČ: 19 a 20 byly podle sekvencí označeny jako A a B, uzavřeny v rámečku na obr.4. Oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ 37 a 38 byly určeny podle sekvencí, označeny jako C a D a jsou podtrženy na obr. 4. Tyto oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ: 37 a 38 obsahovaly část RAPD značky. Oligonukleotidy popsané v SEKV. IČ 19 a 20 obsahovaly primární sekvenci na 5'konci.

Postup byl identický jako v příkladě 16 kromě toho, že se provedlo 35 tepelných hybridizačních cyklů při 65 °C s použitím SEKV. IČ: 19 a 20 jako očka a 30 tepelných hybridizačních cyklů při 60°C s použitím SEKV. IČ: 37 a 38 jako očka. Při použití SEKV.IČ: 19 a 20 jako očka se pozorovaly pásy 500 bp a 550 bp, ukázané v tabulce 4 a když se použila jako očko SEKV. IČ: 37 a 38, pozoroval se pás 459 bp. Z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo klasifikováno dvanáct chmelových odrůd do dvou kategorií.

Příklad 28

PCR a elektroforéza byly provedeny tou stejnou cestou jako v příkladě 14 s použitím 33 pmol Beckova očka (C16; 5'-CGCCCTGCAGTA-3'). Jako výsledek bylo pozorováno více jak 10 pásů přibližně 200 až 2000 bp a pás přibližně 500 bp, kterého přítomnost nebo nepřítomnost byla závislá na druhu, použil se jako RAPD značka. Výsledky stanovení sekvence deoxyribonukletidů této RAPD značky jsou ukázány na obr. 5.

Syntetické oligonukleotidy popsané v SEKV IČ: 15 a 16 byly podle sekvencí označeny jako A a B, uzavřeny v rámečku na obr.4. Oligonukleotidy popsané v

SEKV. IČ 39 a 40 byly založeny podle sekvencí, označeny jako C a D, podtrženy na obr. 5.

Sekvence IČ: 39 a 40 byly použity jako očko a bylo provedeno 30 tepelných hybridizačních cyklů při 60 °C. Amplifikovaný genomový pás 500 bp byl pozorovaný ve všech odrůdách, ale odrůdy nemohou být identifikovány. Na druhé straně, když následoval totožný postup s použitím 15 a 16, amplifikované genomové pásy jsou ukázány v tabulce 4, z přítomnosti nebo nepřítomnosti takových pásů bylo klasifikováno dvanáct chmelových odrůd do dvou kategorií.

Příklad 29

Ze všeobecného pohledu na tabulku 4, která shrnuje typy v příkladech 16-28 je patrné, že se dá rozlišit všech 12 odrůd chmelu.

Příklady, kde je vytvořený seznam fragmentů se vzaly jako doporučení k identifikaci odrůd a příklady, kde bylo provedeno zpracování restrikčními enzymy jsou ukázány v závorkách ().

TABULKA 4

Sada oček SEVK. IČ.	(bp)	FU	CC	BG	NB	Druh TE	SA	HE	PE	ss	HT	sw	FA
15/16	500	0		0							0		0
17/18	260	0	0		0	0	0	0	0	0	0	0
19/20	500		0	0	0	0					0	0	0
19/20	550		0	0	0	0					0	0	0
21/22	710				0							0
23/24	330			0								0
25/26	200	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
25/26	160	0			0	0				0		0
27/28	710											0
27/28	700											0
27/28	600			0	0	0							0
27/28	329			0	0	0						0	0
27/28	299	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
29/30	350	0	0		0	0	0		0	0	0__		0
31/32	360 (NI a III)	0	0				0		0	0	0	0
31/32	220 (NI a III)	0	0		0	0		0				0	0
33/34	270 (Taq I)	0	0	0		0			0				0 t
33/34	220 (Taq I)			0	0	0	0	0	0	0	0	0
35/36	400		0
37/38	459		0	0	0	0					0	0	0___
39/40	500	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0___

Příklad 30

Shinsu Wase chmelový pelet (vyrobený Northen Hop Agrocultural Cooperative, Iwate-ken s licencí od Sapporo K.K.) se ve třecí misce rozetřel na prášek a z 20 mg prášku se extrahovalo přibližně 5 mg genomové DNA s použitím Soupravy pro DNA krve a buněčných kultur (QIAGEN Inc.). Čistota získané DNA se stanovila tím stejným postupem jako je to v Příkladě 29, za použití syntetických oligonukleotidů obsahujících sekvenci deoxyrobonukleotidů popsanou v SEKV. IČ: 15 až 40.

Objevilo se několik nespecifických pásů a žádaná značka se mohl snadno ověřit. Také se dosáhla vysoká reprodukčnost výsledků v opakovaných testech čistoty.

Průmyslová využitelnost

Podle identifikačního způsobu podle vynálezu se může provést přesná a jednoduchá identifikace odrůd chmelu, která není ovlivněna prostředím ani jinými podmínkami. Genetický identifikační způsob podle vynálezu může být také efektivně použit ke stanovení čistoty produktů, ve kterých chmel je jako surovina. A tak, pomocí identifikace chmelových druhů může být genetický identifikační způsob podle vynálezu použit k udržení kvality produktů obsahující chmel na konstantní úrovni nebo ke zdokonalení kvality.

SEKVENČNÍ SEZNAM

SEKV.IČ: 1

Délka sekvence: 19

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTATTCTGGCTAGTTCTGC

SEKV.IČ: 2

Délka sekvence: 19

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTATTTTGGCCAGTTTTGT

SEKV.IČ: 3

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AGCTGAGCAAGCTTCTTTGG

SEKV.IČ: 4

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCCTTTATATACACTGCCGA

SEKV.IČ; 5

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

TAGCATCGGTAATCTCTCGC

SEKV.IČ: 6

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AACATGCTGGGCAACTCCCA

SEKV.IČ: 7

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGAGACATCATCGAATCAGA

SEKV.IČ: 8

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AACCAGAGCAGCCATGTTAGT

SEKV.IČ: 9

Délka sekvence: 10

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAATCGCCGT

SEKV.IČ: 10

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGCTGTACG

SEKV.IČ: 11

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AGGTACGCCCGA

SEKV.IČ: 12

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTA

SEKV.IČ: 13

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence: CCATCCGCACGA

SEKV.IČ: 14

Délka sekvence: 12

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence: GGTCAGGCACCA

SEKV.IČ: 15

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTACCTTCCTGTAAG

SEKV.IČ: 16

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CGCCCTGCAGTAGAGCACTTCTAT

SEKV.IČ: 17

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAATCGCCGTCTTGGTAGCGTA

SEKV.IČ: 18

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAATCGCCGTTGAGAAAGTTAAGTA

SEKV.IČ: 19

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGGCACCATGTACTAGCTGGC

SEKV.IČ: 20

Délka sekvence: 25

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGTCAGGCACCAAGGCCACCATCTG

SEKV.IČ: 21

Délka sekvence: 26

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGCTGTACGATGCCATGACCTTA

SEKV.IČ: 22

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCAGCTGTACGCCCCGGAAGGAA

SEKV.IČ: 23

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

ACTCACCACGCAGAAACCCAGGC

SEKV.IČ: 24

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCTCGACAAGTGAGATGTTGACC

SEKV.IČ: 25

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCCACATTATCAAGGCAATACAC

SEKV.IČ: 26

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GGCATGACTCATGCCAGCTG

SEKV.IČ: 27

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GTCCCTCCTAGACACCTACATA

SEKV.IČ: 28

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GCTCCTGACAGCAAGGTAAGC

SEKV.IČ: 29

Délka sekvence: 22

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GAATACTGAGATTTTTATGAGG

SEKV.IČ: 30

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CAGGTCATGACTCATTGCTAA

SEKV.IČ: 31

Délka sekvence: 28

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AAGGTGTTGCGGCCCTTAACAACTTCTT

SEKV.IČ: 32

Délka sekvence: 28

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

AAGGTGTTGCGGAGAGTGTTCTAGAaGA

SEKV.IČ: 33

Délka sekvence: 23

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

ATCGAGCGAACGTATCAGCTGCG

SEKV.IČ: 34

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCTTTCCGACGTCACTAATCGTGG

SEKV.IČ: 35

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

TTAAATGACATGATCACCTCTCCC

SEKV.IČ: 36

Délka sekvence: 24

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

TAACACAGAGGTACCTCACTGTCT

SEKV.IČ: 37

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CTCCCACTGCACACCTATTTC

SEKV.IČ: 38

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CACCATCTGAAGGAGGTCAAG

SEKV.IČ: 39

Délka sekvence: 20

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

CCTTCCTGTAAGGGTTTACA

SEKV.IČ: 40

Délka sekvence: 21

Sekvence z: nukleové kyseliny

Počet vláken: 1

Topologie: lineární

Typ sekvence: syntetická DNA

Popis sekvence:

GAGCACTTCTATCATTTTTCG

Claims (14)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace genetických druhů k identifikaci chmelových odrůd, vyznačující s e t í m, že obsahuje analyzující DNA amplifikovanou polymerázovou řetězovou reakcí použitím identifikačního očka určeného k amplifikaci oblasti obsahující polymorfismus v sekvencích deoxyribonukleotidů různých druhů chmelové DNA.

2. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 1, vyznačující se t í m, že uvedené identifikační očko obsahuje jeden nebo více syntetických oligonukleotidů.

3. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 1, vyznačující se t í m, že polymorfismus je způsobený odlišným uspořádáním sekvencí deoxyribonukleotidů vzniklým v důsledku inzerce, delece nebo substituce jedné nebo více bází.

4. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 1, vyznačující se t í m, že uvedená analýza je založená na alespoň jednom porovnání přítomnosti nebo nepřítomnosti délky a předurčené délky enzymového restrikčního fragmentu amplifikované DNA různých druhů.

5. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 1,vyznačující se t í m, že identifikační očko je určené výběrem syntetického oligonukleotidu z mnohých syntetických oligonukleotidů, na amplifikaci oblastí obsahujících polymorfismus mezi druhy, v uvedené polymerázové řetězové reakci.

6. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 5, vyznačující se t í m, že uvedené identifikační očko obsahuje jednu nebo dvě sekvence t deoxyribonukleotidů ze SEKV. IČ: 1 -14 sekvenčního seznamu a ke každé sekvenci komplementární sekvenci.

7. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 1, vyznačující se t í m, že určení uvedeného očka obsahuje:

(a) stupeň amplifikace DNA k amplifikaci řady druhů chmelu pomocí polymerázové řetězové reakce za použití libovolného vybraného primárního očka, (b) stupeň výběru polymorfního amplifikovaného fragmentu pro výběr polymorfních amplifikovaných fragmentů vykazujících polymorfismus amplifikované DNA mezi druhy,

c) stupeň určení polymorfní sekvence k určení polymorfní sekvence v uvedeném amplifikovaném polymorfním fragmentu, a (d) stupeň syntézy identifikačního očka na syntézu dvou identifikačních oček, ze kterých každé jednotlivě je komplemntární k sekvenci chmelové DNA na místě předurčeného intervalu tak, aby byl produkován fragment obsahující polymorfní sekvenci a mající délku, která může být analyzována.

8. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že uvedené identifikační očka obsahují část polymorfního amplifikovaného fragmentu.

9. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že uvedené dvě identifikační očka spojují polymorfní sekvenci.

10. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se tím, že aspoň jedno ze dvou uvedených identifikačních oček obsahuje část nebo celý polymorfní amplifikovaný fragment.

11. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že uvedené identifikační očko obsahuje optimální sekvenci pro PCR.

12. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že aspoň jedno ze dvou identifikačních oček obsahuje sekvenci primárního očka 5'konci.

13. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že primární očko může být jedno, dvě nebo více oček obsahujících sekvenci deoxyribonukleotidů popsanou v SEKV. IČ: 1 -14.

14. Způsob identifikace genetických druhů podle nároku 7, vyznačující se t í m, že pár identifikačních oček obsahuje libovolnou kombinaci očka obsahujícího sekvenci bází popsanou v SEKV. IČ: 15-40 sekvenčního seznamu a očko obsahující komplementární sekvenci.