DD139710A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Klasse von Peptiden, die nach parenteraler Verabreichung analgetisch wirksam sind.
Vor kurzem wurden endogene Substanzen mit morphinähnlichen Eigenschaften aus Hirn- oder Cerebrospinalflüssigkeit von Säugetieren extrahiert. Bei diesen Substanzen, welche als Enkephaline bezeichnet werden, handelt es sich nach Nature 258, 577 (1975) um Pentapeptide mit folgenden Sequenzen:
H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.
Diese Verbindungen werden als Methionin-Enkephalin bzw. Leucin-Enkephalin bezeichnet.
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Diese Verbindungen haben sich nach intracerebroventrikularer Verabreichung an Mäuse zwar als analgetisch wirksam erwiesen (Nature 261, 423, 1976), sie zeigen nach parenteraler Verabreichung jedoch praktisch gar keine anaigetische Wirksamkeit.
Ziel der Erfindung Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Klasse von Peptiden gefunden. Diese Verbindungen verfügen nach systemischer Verabreichung über eine beachtliche analgetische Wirksamkeit.
Die Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel
R£> ° ° ORR
\ .» Il Il I4 I5
^N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH -C-N-C-Z
R 3 · CH
Λ ,Λ
OY
und den pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalzen hiervon,
L und D gegebenenfalls eine Chirialität ausdrücken soll,
R1 und R0 unabhängig voneinander Wasserstoff oder primäres
bedeuten,
-3- 2 08 248
R, für primäres oder sekundäres C.-C4-Alkyl oder -CH2CH2-S-CH3 steht,
R. Wasserstoff oder primäres C1-C,-Alkyl ist,
R5 Wasserstoff oder primäres C1-C3-A^yI bedeutet,
Y Wasserstoff oder Acetyl darstellt und
0 Z für -C-NH2 ; -CH2OH oder -CN steht,
mit der Maßgabe, daß, einer der S.ubstituenten R. und R5 für primäres C1-C3-AIlCyI und der andere für Wasserstoff stehen muß,
dadurch gekennzeichnet, daß man von der jeweiligen entsprechend geschützten Verbindung der oben angegebenen Formel (I) mit einem sauren Medium die Schutzgruppen abspaltet.
Zu geeigneten pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalzen gehören die Säureadditionssalze organischer und anorganischer Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glykolsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure, Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Propionsäure. Bevorzugt werden Säureadditionssalze von Chlorwasserstoff säure, Essigsäure oder Bernsteinsäure. Alle angegebenen Salze lassen sich in herkömmlicher Weise herstellen.
Wie die Definition der verschiedenen Substituenten in Formel (I) zeigt, handelt es sich bei den von dieser Struktur definierten Verbindungen um primäre Amid-, primäre Alkoholoder Nitrilderivate spezieller Tetrapeptide. Die Stereo-
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konfiguration der Verbindungen der Formel (I) ist eines ihrer wesentlichen Merkmale. Der Einfachheit halber sind die Aminosäurereste der modifizierten Tetrapeptide der Formel (I) der Reihe nach durchnummeriert, und zwar beginnend mit dem Rest an der endständigen Aminofunktion. Die Chirialität der Aminosäurereste, gelesen von Stellung. 1 bis Stellung 3, beträgt L oder D, oder es gibt gar keine Chirialität. Der Rest in Stellung 3 ist ein Glycinrest, so daß es bezüglich dieses Restes keine Chirialität gibt. Bezüglich Stellung 4 (der C-Endstellung), bei der es sich um ein primäres Amid, einen primären Alkohol oder ein Nitril handelt, ist die Chirialität in Überexnstimmung mit dem entsprechenden mutmaßlichen L-Aminosäurerest festgelegt. ,
Die Gruppen R1, R2', R- und R5 können unter anderem für primäres C^-C3-AIkYl stehen. Unter primären C.-C_-Alkyl wird Methyl, Ethyl und n-Propyl verstanden.
Die Gruppe R- in obiger Strukturformel kann unter anderem primäres oder sekundäres C1-C4-AIkYl bedeuten. Unter einem primären oder sekundären Cj-C.-Alkyl wird Methyl, Ethyl, n-Propyl, isopropyl, η-Butyl, Isobutyl oder s-Butyl verstanden.
Bezüglich der jeweiligen Reste in jeder der Stellungen der modifizierten Tetrapeptide der Formel (I) gilt folgendes:
(A) Stellung 1 .
Diese Stellung stellt den aminoendständigen Teil des Peptids dar. Der ensprechende Rest stammt von L-Tyrosin oder L-(O-Acetyl)tyrosin. Der Rest kann jeweils N-unsubstituiert sein, und in diesem Fall stehen die Substituenten R1 und R2 jeweils für Wasserstoff. Der Rest kann jedoch auch durch ein oder mehr primäre C^-C^-Alkylgruppen substituiert sein, und in diesem Fall steht R und/oder R3 für primäres C1-C3-AIkYl. Beispiele für eine Substitution durch primäres C.-C_-Alkyl sind N-Methyl, N-Ethy1, N-n-Propyl/ Ν,Ν-Dimethyl, N,N-Diethyl, N,N-Di-n-propyl,
N-Methy1-N-ethyl, N-Methyl-N-n-propyl und N-Ethyl-N-n-propyl.*Die in Stellung 1 des Peptids der Formel (I) vorhandenen Tyro- syl- oder O-Acetyltyrosylreste sind vorzugsweise N-unsubstituiert. Weiter handelt es sich bei diesem Rest in bevorzugter Weise um Tyrosyl.
(B) Stellung 2
Der Aminosäurerest, der in Stellung 2 des Peptids der Formel (I) vorhanden ist, muß das D-Stereoisomer sein, und es kann sich dabei um irgendeinen aus mehreren Aminsäureresten handeln. Hierzu gehören beispielsweise Reste von D-Alanin (Ala) (R3 = Methyl) , D-alpha-Aminobuttersjäure (Abu) (R3 = Ethyl) , D-Norvalin (Nva) (R-. = n-Propyl) T D-Valin (VaI)
(R_ = Isopropyl), N-Norleucin (Nie) (R^ = n-Butyl), D-Leucin (Leu) (R- = Isobutyl), D-Isoleucin (lie) (R_ = s-Butyl) und D-Methionin (Met) (R3 = -CH2CH2-S-CH3). Vorzugsweise handelt es sich hierbei um einen von D-Alanin abgeleiteten Rest.
(C) Stellung 3
Der in dieser Stellung vorhandene Aminosäurerest ist von Glycin (GIy) abgeleitet.
(D) Stellung 4
Der in der C-Endstellung vorhandene Rest ist abgeleitet von L-Phenylalanin (Phe) oder einem primären Alkohol- oder Nitrilderivat hiervon. Der Rest kann ein primäres Amin (Phe-0
Il
NH9) (Z = -C-NH0), ein primärer Alkohol (Phe-A) (Z = -CH-OH) oder ein Nitril (Phe-CN) (Z = -CN) sein. Bei einer bevorzugten
Il
Klasse von Verbindungen steht Z für -C-NH9.
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Der Rest kann entweder unsubstituiert oder am Aminostickstoff (R4) substituiert sein. Ist dieser Rest N-substituiert, dann handelt es sich dabei um N-Methyl, N-Ethyl oder N-n-Propyl. Falls dieser Rest am Aminostickstoff unsubstituiert ist, dann muß er zusätzlich am alpha-Kohlenstoff (R5) substituiert sein. In einem solchen Fall steht R für Methyl, Ethyl oder n-Propyl. Einzige beschränkende Bedingung ist, daß einer der Reste R4 oder R5 für primäres C1-C3-Alkyl und der andere für Wasserstoff stehen muß. Die primäreC.-C_-Alkylgruppe bedeutet vorzugsweise Methyl. Besonders bevorzugt werden daher Verbindungen, bei denen R4 oder R- für Methyl steht, und insbesondere solche, bei denen R. Methyl bedeutet. .
In der vorliegenden Beschreibung wird von einer Reihe allgemein üblicher Abkürzungen Gebrauch gemacht, die folgende Bedeutungen haben:
| Abu | - alpha-Amxnobuttersäure |
| AIa | - Alanin |
| Cy s | - Cystein |
| GIy | - Glycin |
| Hse | - Homoserin |
| He | - Isoleucin |
| Leu | Leuc in |
| Met | Methionin |
| Nie | - Norleucin |
| Nva | Norvalin |
| Phe | - Phenylalanin |
| Phe-NH2 | - Phenylalaninamid |
| Phe-A | - primäres Alkoholderivat von |
| Phenylalanin | |
| Phe-CN | - Nitrilderivat von Phenyl |
| alanin | |
| Ser | Serin |
| Tyr | Tyrosin |
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| VaI | - Valin |
| Ac .., | - Acetyl |
| Me | - Methyl |
| Et | - Ethyl |
| 1P | - Isopropyl |
| Pr | - n-Propyl |
| Bu | - n-Butyl |
| i-Bu | Isobutyl |
| t-Bu | - t-Butyl |
| s-Bu | - s-Butyl |
| BOC | - t-Butyloxycarbonyl |
| BzI | - Benzyl |
| DCC | - N,N1-Dxcyclohexylcarbodximid |
| HBT | 1-Hydroxybenzotriazol |
| DMF | N,N-Dimethylformamid |
| TFA | - Trxfluoressxgsäure |
| THF | Tetrahydrofuran |
| DEAE | Diethylaminoethyl |
| DCHA | Dicyclohexylamin |
Beispiele für typische Verbindungen der Formel (I) sind folgende:
H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-A; . H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Me)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Et)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-CN; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-A;
H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(N-Et)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(N-Me)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(N-Me)Phe-A; H-L-Tyr-D-Mst-Gly-L-(N-Et)Phe-CN; H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(a-Et)PHe-NH3; H-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(a-Pr)Phe-NH^; H-L-Tyr (Ac)-D-Ala-Gly-L-(N-Me) PlIe3 H-L-Tyr(Ac)-D-Nle-Gly-L-(a-Me)Phe-NH2; (N-Et)-L-Tyr-D-Abu-Gly-L-(N-Et)Phe-NH2;
(N,N-di-Pr)-L-Tyr-D-Val-Gly-L-(α-Me)Phe-NH2;
(N-Pr)-L-Tyr-D-Leu-Gly-L-'-(a-Et) Phe-NH2 ;
(N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-Met-Gly-L-(a-Pr)Phe-NH2; (N-Me,N-Et)-L-Tyr(Ac)-D-Nle-Gly-L-(a-Me)Phe-NH2; (N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-Ile-Gly-L-(a-Et)Phe-NH2; (N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-Leu-Gly-L-(a-Me)Phe-CN; (N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-Nva-Gly-L-(a-Pr)Phe~A; (N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(α-Me)Phe-NH2; .(N-Et)-L-Tyr(Ac)-D-Abu-Gly-L-(a-Pr)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Me)Phe-CN; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(α-Me)?he-A; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Et)Phe-A; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Pr)Phe-NH2; H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Pr)Phe-CN; (N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Et)Phe-A; (N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-NH2; (N,N-Di-Et)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-CN;
(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-A; (N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Me)Phe-NH2;
(N,N-Di-Me)-L-Tyr-D-V.al-Gly-L-(N-Me) Phe-NH2; (N,N-Di-Pr)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(N-Pr)Phe-NH2;
(N-Me)-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-(a-Et)Phe-NH ;
(N,N-Di-Me)-L-Tyr(Ac)-D-Ala-Gly-L-(N-Et)Phe-CN; (N,N-Di-Pr)-L-Tyr(Ac)-D-Met-Gly-L-(N-Me)Phe-A; · (N-Et) -L-Tyr (Ac) -D-MetrGly-L- (N-Pr) Phe-NH2 ;. land (N-Me)-L-Tyr(Ac)-D-Met-Gly-L-(α-Me)Phe-NH.
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Die Verbindungen der Formel (I) lassen sich durch übliche Methoden zur Peptidsynthese herstellen. Während der Synthese bestimmter Verbindungen der Formel (I) kann es zu einer Teilracemisierung kommen. Diese.eventuell auftretende Racemisierung ist jedoch nicht so stark, daß sich hierdurch die analgetische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel (I) ernsthaft verändert. ,· ' .
Die Herstellung der Verbindungen der Formel (I) erfolgt durch Kupplung von Aminosäuren oder Peptidfragmenten durch Umsetzen der jeweiligen Carboxylfunktion mit der jeweiligen Aminofunktion unter Bildung einer Amidbrücke. Für eine entsprechende saubere Kupplung sollten (1) alle nicht direkt an der Reaktion teilnehmenden reaktionsfähigen funktioneilen Gruppen durch entsprechende Blockiergruppen inaktiviert und (2) die zu kuppelnde Carboxylfunktion so aktiviert sein, daß es zu der gewünschten Kupplung kommen kann. Hierzu muß man sowohl die Reaktionsfolge als auch die Reaktionsbedingungen sorgfältig auswählen und gleichzeitig auch spezielle Blockiergruppen verwenden, so daß sich das jeweils gewünschte Peptid ergibt. Jede Aminosäure, die zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) verwendet wird und die über die jeweils gewählten Schutzgruppen und/oder aktivierenden Funktionen verfügt, läßt sich nach in der Peptidchemie üblichen Techniken herstellen.
An jedem Punkt der Totalsynthese der Verbindung der Formel (I) wird mit ausgewählten Kombinationen von Blockiergruppen gearbeitet. Diese besonderen Kombinationen haben sich als am saubersten wirksam erwiesen. Im Prinzip lassen sich zur Synthese der Verbindungen der Formel (I) zwar auch andere Kombinationen verwenden, was gegebenenfalls jedoch weniger erfolgreich sein kann. Zur Synthese der Verbindungen der Formel (I) kann man als Aminoblockiergruppen beispielsweise folgende verwenden: Benzyloxycarbonyl (CBz), t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl (AOC), p-Methoxybenzyloxycarbonyl (MBOC), Adamantyloxycarbonyl (AdOC) und Isobornyloxycarbonyl. Als Hydroxyschutzgruppe
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für den Tyrosylrest wird im allgemeinen Benzyl (BzI) eingesetzt, es kann jedoch genauso gut auch mit anderen Gruppen gearbeitet werden, wie p-Nitrobenzyl (PNB) oder p-Methoxybenzyl (PMB).
Als Carboxylgruppen zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) lassen sich alle typischen esterbildenden Gruppen verwenden, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Benzyl, p-Nitrobenzyl, p-Methoxybenzyl und 2,2,2-Trichlorethyl.
Die Kupplung der geeignet geschützten N-blockierten Aminosäure oder des entsprechenden Peptidfragments mit einer geeignet geschützten carboxylblockierten Aminosäurje oder einem entsprechendem Peptidfragment zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) besteht darin, daß man die freie Carboxylfunktion der Aminosäure oder des Peptidfragments gegenüber der Kupplungsreaktion aktiv macht. Dies kann nach den verschiedensten hierzu üblichen Techniken erreicht werden. Eine derartige Aktivierungstechnik besteht in einer Umwandlung der Carboxylfunktion in ein gemischtes Anhydrid. Die freie Carboxylfunktion wird durch Umsetzen mit einer anderen Säure aktiviert, am besten mit einem Derivat einer Carbonsäure, beispielsweise einem entsprechenden Säurechlorid. Beispiele für solche zur Bildung gemischter Anhydride verwendbare Säurechloride sind Ethylchlorformiat, Phenylchlorformiat, s-Butylchlorformiat, Isobutylchlorformiat oder Pivaloylchlorid. Isobutylchlorformiat wird bevorzugt verwendet.
Eine andere Methode zur Aktivierung der Carboxylfunktion zürn Zwecke der Durchführung der Kupplungsreaktion besteht in einer Umwandlung in ihr aktives Esterderivat. Beispiele für solche aktive Ester sind 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester oder p-Nitrophenylester. Eine andere geeignete Kupplungsmethode stellt die bekannte Azid-Kupplungsmethode dar.
Die bevorzugte Kupplungsmethode zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) besteht im Einsatz von NfN'-Dicyclphexylcarbodiimid (DCC) zur Aktivierung der freien Carboxylfunktion, so daß die Kupplung ablaufen kann. Diese Aktivierungs- und Kupplungstechnik wird unter Verwendung einer äguimolaren Menge DCC in bezug auf die Aminosäure oder das Peptidfragment durchgeführt und in Gegenwart einer äquimolaren Menge 1-Hydroxybenzotrxazol (HBT) vorgenommen. Das HBT unterdrückt dabei unerwünschte Nebenreaktionen unter Einschluß einer möglichen Racemisierung.
An bestimmten Punkten der zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) zu verwendenden Synthesefolge müssen ausgewählte Blockiergruppen abgespalten werden. Ein mit der Peptidsynthese vertrauter Fachmann kann aus den verfügbaren Schutzgruppen ohne weiteres diejenigen auswählen, die in dem Sinne verträglich sind., daß sich eine selektive Abspaltung des Produkts unter Entfernung einer oder mehrerer, jedoch nicht aller an der Aminosäure oder dem Peptidfragment vorhandener Schutzgruppen erreichen läßt. Hierbei handelt es sich um in der Peptidchemie übliche Techniken. Bezüglich einer ausführlichen Erörterung der für eine selektive Abspaltung entsprechender Schutzgruppen geeigneten Techniken wird auf Schröder and Lübke, The Peptides, Volume I, Academic Press, New York,, (1965) und insbesondere die4 Tabelle auf den Seiten 72 bis 75 dieses Buches, hingewiesen.
Eine Abspaltung von Carboxylschutzgruppen läßt sich durch alkalische Verseifung erreichen. Zur Abspaltung der Estergruppen von der geschützten Carboxylgruppe wird.im allgemeinen unter verhältnismäßig starken alkalischen Bedingungen gearbeitet, beispielsweise unter Verwendung eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid. Die Reaktionsbedingungen, unter denen sich eine derartige Verseifung erreichen läßt, sind dem Fachmann bekannt. Die Carboxylschutzgruppen können ferner auch durch katalytische Hydrogenolyse
abgespalten werden, beispielsweise durch Hydrogenolyse in Gegenwart eines Katalysators, wie Palladium-auf-Kohle. In denjenigen Fällen, in denen die Carboxylschutzgruppen p-Nitrobenzyl oder 2,2,2-Trichlorethyl sind,. lassen sich diese Schutzgruppen durch Reduktion in Gegenwart von Zink und Chlorwasserstoffsäure abspalten.
Die Aminoschutzgruppen werden durch Behandeln der geschützten Aminosäure oder des geschützten Peptids mit einer Säure, wie Ameisensäure, Trifluoressigsäure (TFA), p-Toluolsulfonsäure (TSA), Benzolsulfonsäure (BSA) und Naphthalinsulfonsäure abgespalten, wodurch als Produkt das entsprechende Säureadditionssalz entsteht. Die Aminoschutzgruppen fassen sich ferner auch durch Behandeln der geschützten Aminosäure oder des geschützten Peptids mit einem Gemisch aus Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff und Essigsäure abspalten, wodurch man das entsprechende Hydrobromidsäureaddxtionssalζ oder Hydrochloridsäureadditionssalz erhält. Jeweils angewandtes Verfahren und Reagenz sind abhängig von den chemischen oder physikalischen Eigenschaften der bei der jeweiligen Abspaltrektion beteiligten Materialien. In denjenigen Fällen, bei denen der Rest R4 eine andere Bedeutung als Wasserstoff hat, und bei denen ein Peptid, das wenigstens drei Aminosäurereste enthält, von den Schutzgruppen befreit v/erden soll, verwendet man zur Deblockierung eines derartigen Peptids am besten Trifluoressigsäure oder Ameisensäure, wodurch das entsprechende Säureadditionssalz 'gebildet wird. Durch Behandlung mit einem geeigneten Ionenaustauscherharz, wie DEAE Sephadex 25 und Amberlyst A27, läßt sich dieses Salz in eine pharmazeutisch besser geeignete Form überführen.
Die am Tyrosylrest vorhandene Hydroxylschutzgruppe läßt sich während der ganzen Herstellungsfolge am Peptid behalten, und sie wird schließlich während der letzten Synthesestufe in Verbindung mit der Abspaltung der Aminoschutζgruppe entfernt. Je nach den zur Entfernung der Carboxylschutzgruppe verwendeten Bedingungen läßt sich diese Gruppe jedoch auch bereits früher bei
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der Herstellungsfolge abspalten. Spaltet man die Carboxylschutzgruppe durch alkalische Verseifung ab, dann wird die Hydroxylschutzgruppe beibehalten. Wird die Carboxylschutzgruppe jedurch durch katalytische Hydrogenolyse abgespalten, dann kommt es hierbei ebenfalls zu einer Abspaltung der Hydroxylschutzgruppe. Letzteres bereitet kein ernsthaftes Problem, da sich die Verbindungen der Formel (I) in Gegenwart eines Tyrosylrests herstellen lassen, der eine freie Hydroxylgruppe aufweist.
Ein bevorzugtes spezielles Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) besteht in einer Kupplung eines getrennt hergestellten N-endständigen Tripeptids mit einem getrennt hergestellten "C-endständigen Phenylalanylamid O.
(Z = -C-NH2) oder dem entsprechenden Alkohol (Z = -CH2OH) oder dem entsprechenden Nitril (Z = -CN) unter anschließender entsprechender Deblockierung eventuell noch vorhandener blockierter Reste. Wahlweise läßt sich die getrennt hergestellte C-endständige Phenylalanylverbindung, die mit dem N-endständigen Tripeptid umgesetzt wird, auch so ausstatten, daß sie eine Gruppe enthält, die einen Vorläufer für Amid-, Alkohol- oder Nitrilreste darstellt. Die allgemeine Verfahrensfolge zur Herstellung eines Tetrapeptids der Formel (I) geht aus folgendem Reaktionsschema hervor. Das Symbol AA bedeutet darin den Aminosäurerest, und die diesem Symbol beigefügte Zahl gibt die Stellung der Aminosäure in dem fertigen Peptidprodukt an.
A. Herstellung des Tripeptidsegments:
BOC-L-Ty Γ-ΟΗ -...-.+ H-D-(AA)z-OBz!
OBzI
DCC HBT
BOC-L-Ty r-D-(AA)s-OBzI I OBzI
OH
BOC-L-Ty r-D-(AA)2-OH I OBzI
H-GIy-OBzI DCC HBT
BOC-L-Tyr-D-(AA)a-GIy-03zI I 03z I
Hz Pd/C
BOC-L-Tyr-D-(AA)2-GIy-OH I OH
NaOH THF/HaO
BX-L-Ty r-D- (AA) a-G I y-OH I 03zl
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B. Kupplung des Tripeptids mit dem endständigen Phenylalanylrest:
BOC- L-Ty r-D- (AA) a-G I y-OH
| R4 R5 | |
| I F | |
| + | HN-C-Q |
| I | |
| CHs | |
| I | |
| DCC | Ph |
| HBT |
R4 R5
I I
•BOC-L-Tyr-D- (AA) a-GI y-N—C-Q 1 I
OV CH2
[ Ph
In obigem Reaktionsschema bedeutet Ph Phenyl, während Q für
-C-NH2, -CH2OH, -CN, -COCH3, -C-OCH3Ph und andere ähnliche Gruppen steht.
O O
Il Il
Steht Q für -C-OCH3, -C-OCH2Ph und andere ähnliche Estergruppen, dann läßt es sich nach entsprechender Kupplung durch Behandlung mit Natriumborhydrid in -CH3OH überführen. Diese Reduktionstechnik wird in US-PS 37 OO 651 beschrieben. Bedeutet Q einen Benzylester oder einen sonstigen Ester, der eine durch Hydrogenolyse leicht entfernbare Gruppe enthält, dann läßt es sich durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladium-auf-Kohle in die freie Säure überführen. Die freie Säure kann durch Behandeln mit Ammoniak in Gegenwart von DCC und HBT in das Amid überführt werden.
Der Amidrest kann durch Wasserabspaltung in das Nitril überführt werden, in dem man ihn nach dem in Bull, of the Chem. Soc. of Japan 50, 1088-1093 (1977) beschriebenen Verfahren mit p-Toluolsulfonylchlorid und Pyridin behandelt.
Bei der Herstellung der Verbindungen der Formel (I) nach der oben beschriebenen Verfahrensfolge empfiehlt sich als C-endständiger Reaktant besonders die Verwendung einer Verbindung, die die Gruppe Z des gewünschten Endprodukts enthält.
Nach Herstellung des gewünschten modifizierten Tetrapeptids mit der C-endständigen Gruppe läßt sich die O-Schutzgruppe am Tyrosyl (falls vorhanden) durch Hydrogenolyse und die N-BOC-Schutzgruppe durch Behandeln mit Trifluoressigsäure entfernen.
Die obigen Angaben beziehen sich lediglich auf eine Verfahrensfolge zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I). Es kann hierzu jedoch auch nach anderen Verfahrensfolgen gearbeitet werden. Eine hierzu geeignete weitere Methode besteht in einem stufenweisen aufeinanderfolgenden Zusatz einzelner Aminosäuren oder Aminosäurederivate zum Aufbau der Peptidkette, beginnend mit dem Carboxamid-, Alkohol- oder Nitrilendstück. Dieses Verfahren kann nach den oben beschriebenen Reaktionstechniken sowie anderen üblichen präparativen Reaktionsfolgen durchgeführt werden.
Eine weitere Methode zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I) besteht in einer Festphasensynthese. Bei dieser Methode wird der C-endständige Rest an einen geeigneten polymeren Träger gebunden, wobei man das Peptid dann Rest für Rest solange weiter aufbaut, bis das gewünschte Peptid, welches immer noch mit dem polymeren Träger verbunden ist, synthetisiert ist. Das Peptid läßt sich dann durch Verwendung eines geeigneten Deblockiermittels vom Träger entfernen. Zur Durchführung dieses Verfahrens kuppelt man beispielsv/eise einen entsprechenden C-endständigen Rest, dessen alpha-Aminogruppe durch eine t-Butyloxycarbonylgruppe geschützt ist, durch Aktivierung mit DCC mit einem Benzhydry!polymer. Zur Entfernung
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der N-BOC-Gruppe setzt man den an das Polymer gebundenen Rest mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid um. Das erhaltene Salz wird mit einem geeigneten t-Amin neutralisiert, worauf man die Reaktionsfolge zur Ankupplung der jeweils nächsten Aminosäure wiederholt. Nach beendeter Herstellung der beabsichtigten Peptidsequenz entfernt man das blockierte Peptid durch Behandeln mit Fluorwasserstoff bei 0 0C vom polymeren Träger. Anschließend läßt sich das Produkt chromatographisch reinigen. Die im einzelnen für diese Synthese zu wählenden Bedingungen, wie Reaktionszeit, Reaktionstemperaturen, Waschzeiten, Reagenzien, Schutzgruppen und dergleichen, sind dem mit der Festphasenpeptidsynthese vertrautem Fachmann geläufig.
Bei der Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger kommt es gleichzeitig auch zu einer Entfernung aller Schutzgruppen unter Bildung des Tetrapeptidzwischenprodukts. Da jedoch eine Beibehaltung derartiger Schutzgruppen bei der Umwandlung des Produkts in die Nitrilverbindung äußerst erwünscht ist, empfiehlt sich die Festphasensynthese nicht zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I), bei.der Z für -CN steht.
Bei bestimmten Verbindungen der Formel (I) sind ein oder mehr Gruppen R1, R„ oder R. primäres C.-C...-Alkyl. In solchen . Fällen wird bei der Herstellungsfolge die entsprechende N-substituierte Aminosäure verwendet. Alle N-monosubstituierten Aminosäuren lassen sich nach der im folgenden angegebenen Reaktionsfolge unter Anwendung einer N-geschützten Aminosäure als Ausgangsmaterial herstellen:
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K+
BOC-N-(AA)-COOH —: -~ BOC-N -(AA)-COO K
ie-Kr.ön'e-6-ether
THF
DMF
C —C primäres
1 3
AlkyIio,did (R l)
B0C-iM-(AA)-C00H
Wie die obige Reaktionsfolge zeigt, wird die N p a-geschützte Aminosäure zuerst mit Kaliumhydrid in Gegenwart eines geeigneten Kronenethers behandelt, um so das Dianion zu bilden. Durch .nachfolgende Behandlung des erhaltenen Zwischenprodukts mit dem entsprechenden Alkyliodid gelangt man zur gewünschten N-substituierten Aminosäure.
Der mit der Peptidsynthese vertraute Fachmann weiß, daß es unter stark alkalischen Bedingungen, wie sie beispielsweise bei dem oben angegebenen Alkylierungsverfahren angewandt werden, zu einer Racemisierung am alpha-Kohlenstoffatom kommen.kann. Das Ausmaß dieser Racemisierung ist abhängig von der jeweils verwendeten Aminoverbindung. Die Racemisierung läßt sich minimal halten, wenn man mit einem Überschuß an Alkylierungsmittel arbeitet und die Umsetzungszeit möglichst kurz hält. Sogar bei einer übermäßigen Racemisierung läßt sich das Produkt jedoch entsprechend reinigen, indem man es beispielsweise in Form eines Salzes mit einem geeigneten chiralen Amin, wie dem Salz von d(+) alpha-Phenylethylamin, umkristallisiert.
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Die erhaltene Aminosäure, bei der R^ für primäres Cj-C^ steht, kann nach jeder oben beschriebenen Technik in das jeweilige Amid, den jeweiligen Alkohol oder das jeweilige Nitril überführt werden. .
Handelt es sich bei den Substituenten R1 und R_ jeweils um das gleiche primäre C.-C_-Alkyl, dann läßt sich das gewünc Ν,Ν-disubstituierte Tyrosin in folgender Weise herstellen:
R CHO J RxCH-
t\ A^nvj X 2\., /ΛΛ\ λΑ^ι ι
H N-(AA)-COOH -2 -^ /N-(AA)-COOH
H , Pd/C / R CH ζ' ' xz
R CHO bedeutet darin beispielsweise Formaldehyd, Acetaldehyd
oder Propionaldehyd.
Stellen die Reste R1 und R2 verschiedene primäre Cj-C^ gruppen dar, dann läßt sich das Ν,Ν-disubstituierte Tyrosin herstellen, indem man das entsprechende N-monosubstituierte Tyrosin, welches nach obiger Reaktionsfolge hergestellt worden ist, in der beschriebenen Weise mit Formaldehyd oder Acetaldehyd behandelt.
Bei bestimmten Verbindungen der Formel (I) steht der Rest Rc für primäres C.-C3-Alkyl. Zur Herstellung dieser Verbinddüngen verwendet man dann die jeweilige, am alpha-Kohlenstoffatom substituierte Aminosäure oder entsprechende Ester-, Amid-, Alkohol- oder Nitrilderivate hiervon. Das jeweilige am alpha-Kohlenstoffatom substituierte Phenylalanin läßt sich beispielsweise nach dem in Journal of the American Chemical Society, Vol.. 77, 700-703 (1955) beschriebenen Verfahren bilden.
Die Auftrennung des dabei erhaltenen racemischen Gemisches kann nach J. Org. Chem., Vol. 40, 953-955 (1975) durchgeführt werden. Das auf diese Weise gewonnene alpha-substituierte Phenylalanin läßt sich nach den bereits beschriebenen Methoden zum entsprechenden Amid, Alkohol oder Nitril umwandeln. Dies kann entweder vor oder nach seiner Verwendung zur Herstellung der Tetrapeptidsequenz vorgenommen werden. Vorzugsweise tut man es jedoch vor der Herstellung des Tetrapeptids.
Diejenigen Verbindungen, der Formel (I) , bei denen Y für Acetyl steht, werden aus dem entsprechenden Peptid hergestellt, bei welchem Y Wasserstoff bedeutet und die endständige Aminogruppe zweckmäßiger Weise blockiert ist. Zu diesem Zweck behandelt man eine derartige Verbindung zuerst mit Essigsäureanhydrid in Gegenwart von Pyridin, Wodurch das entsprechende N-blockierte O-Acetylpeptid entsteht. Nach Deblockierung mit einem Gemisch aus Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure gelangt man zur gewünschten Verbindung.
Die Verbindungen der Formel (I) sind wertvolle Heilmittel. Sie sind analgetisch wirksam, wobei sie sich insbesondere parenteral an Säugetiere unter Einschluß des Menschen verabfolgen lassen. Die Verbindungen der Formel (I) können als solche oder in compoundierter und zu pharmazeutischen Zubereitungen formulierter Form in entsprechenden Einheitsdosierungsformen für eine parenterale Verabfolgung verabreicht werden. Zur Compoundierung und Formulierung können organische oder anorganische Feststoffe und/oder Flüssigkeiten verwendet werden, bei denen es sich um pharmazeutisch unbedenkliche Träger handelt. Zu diesem Zweck geeignete Träger sind dem Fachmann geläufig. Entsprechende Zubereitungen können die Form von Tabletten, Pulvern, Granulaten, Kapseln, Suspensionen oder Lösungen haben. .
Die Verbindungen der Formel (I) ergeben nach Verabreichung in einer wirksamen Menge eine analgetische Wirkung. Zu diesem Zweck wird im allgemeinen mit Dosierungsmengen zwischen etwa 0,1 und 100 mg pro kg Körpergewicht des jeweiligen Trägers gearbeitet. Bevorzugt wird im allgemeinen ein Dosierungsbereich von etwa 1,0 bis 20 mg pro kg Körpergewicht.
Ausfühlungsbeispiele '
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. ·' ·
Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-methyl-L-phenylalany lamid-acetatsal ζ
A. Benzyl-D-alinat-p-toluolsulfonat
Ein Gemisch aus 100 ml Benzylalkohol und 200 ml Benzol, das 55,1 g (0,29 M) p-Toluolsulfonsäuremohohydrat enthält, wird mit 25 g (0,281 M) D-Älanin versetzt. Das Gemisch wird auf Rückflußtemperatur gebracht und das entstehende Wasser in einer Dean-Stark-Apparatur azeotrop entfernt. Das Gemisch wird 15 Stunden erhitzt, worauf man es auf Raumtemperatur abkühlt und mit Ether verdünnt. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt und aus Methanol/Ether umkristallisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 55,3 g (56 %) der Titelverbindung, die bei 112 bis 115 0C schmilzt.
Analyse für C17H21NO5S (351,42):
berechnet: C 58,10; H 6,02; N 3,99; gefunden: C 58,19; H 6,06; N 3,82..
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B. Benzyl~Na ^ a-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alinat
200 ml trockenes Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF) versetzt man mit
35.1 g (0,1 M) des nach Teil A erhaltenen Produkts. Das Gemisch wird gerührt und auf 0 0C gekühlt, worauf man es mit
11.2 g (O,1 M) Diazabxcyclooctan (DABCO) versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 0 °C gerührt, worauf man zuerst 37,1 g (0,1 M) Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosin und anschließend .13,5 g (0,1 M) 1-Hydroxybenzotriazol (HBT) sowie 20,6 g (0,1 M) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zugibt. Sodann wird das Gemisch 3 Stunden bei 0 0C gerührt und nachfolgend 24 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird das Gemisch auf 0 0C gekühlt, worauf man die erhaltene Suspension filtriert und das Filtrat unter Vakuum einengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, worauf man die Lösung der Reihe nach.mit 1n Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75 normaler kalter Citronensäure und erneut mit Wasser wäscht. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum eiingeengt. Der Rückstand wird in heißem Ethanol gelöst. Beim Abkühlen kommt es zur 'Kristallisation. Das erhaltene Produkt wird einmal aus Ethanol umkristallisiert, wodurch man zu 41,5 g (80 %) reiner Titelverbindung gelangt, die bei 121 bis 123 0C schmilzt.
Analyse für C 3O H36 N2°6 (52O'63):
berechnet: C 69,21; H 6,97; N 5,38; gefunden: C 68,99; H 6,75; N 5,17.
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C. Na P a-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanin
Ein Gemisch aus 200 ml Tetrahydrofuran (THF) und 20 ml Wasser versetzt man mit 31,2 g (0,06 M) des nach Teil B erhaltenen Produkts. Die Lösung wird auf 0 0C gekühlt und langsam mit 13,2 ml (1,1 Äquivalent) 5n Natriumhydroxid versetzt. Sodann läßt man das Gemisch unter Rühren langsam auf Raumtemperatur kommen. Nach 5 Stunden verteilt man das Gemisch zwischen Wasser und Ether. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und abgekühlt, worauf man den pH-Wert durch Zugabe von Citronensäure auf 2 einstellt und das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit Ether verdünnt. Durch Sammeln des angefallenen Niederschlags gelangt man zu 17,7 g (67 %) der Titelverbindung, die bei 160 bis" 162 0C schmilzt.
Analyse für c 24H3oN2°6 <442'51):
berechnet: C 65,14; H 6,83; N 6,63; gefunden: C 64,73; H 6,70; N 6,20.
D. Benzyl-N p a-t-butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinat
70 ml trockenes DMF versetzt man mit 6,74 g (0,02 M) des p-Toluolsulfonsäuresalzes von Benzylglycinat. Das erhaltene Gemisch wird auf 0 0C gekühlt und mit 2,24 g (0,020 M) DABCO versetzt. Das Gemisch wird einige Minuten gerührt, worauf man zuerst 8,84 g (0,020 M) des nach Teil C erhaltenen Produkts und anschließend 2,7 g (0,020 M) HBT sowie 4,12 g (0,020 M) DCC zugibt. Das Reaktionsgemisch wird erst 2 Stunden bei 0 0C und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Suspension wird auf 0 0C abgekühlt, worauf man das Ganze filtriert und .das Filtrat unter Vakuum einengt. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wäscht man der Reihe nach mit 1n Natriumbxcarbonat, Wasser, kalter O,.75n Citronen-
säure und erneut mit Wasser. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Vakuum eingeengt. Durch nachfolgendes Umkristallisieren des erhaltenen Rückstands aus Ethanol gelangt man zu 1O,8 g (92 %) reiner Titelverbindung, die bei 145 bis 147 0C schmilzt.
Analyse für C33H39N.^-, (589,69):
berechnet: C 67,22; H 6,67; N 7,13; gefunden: C 67,32; H 6,83; N 6,91 .
E. N " -t-Butyioxycarbonyl-O-benzyl-lj-tyrosyl-D-alanyl-glycin
150 ml eines 9:1 Gemisches aus Tetrahydrofuran und Wasser versetzt man mit 15,95 g (27 inMJ des nach Teil D erhaltenen Produkts. Das Gemisch wird unter Rühren auf 0 0C gekühlt und tropfenweise mit 30 ml 1n Natriumhydroxid versetzt. Nach Beendigung der tropfenweisen Zugabe wird das Gemisch 2 Stunden gerührt und anschließend zweimal mit Ether extrahiert. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird durch Zugabe von 30 ml 1n Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,5 angesäuert. Die hierbei auskristallisierende Titel- · verbindung wird abfiltriert, worauf man sie zuerst einmal aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser und anschließend zweimal aus Ethylacetat umkristallisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 11,43 g (85 % der Theorie) der Titelverbindung, die bei 104 bis 107 0C schmilzt; /alpha/;?5 = +31,4 ° (C = 0,5, MeOH).
Analyse für C36H33N3O7 (499,54):
berechnet: C 62,51; H 6,66; N 8,41; gefunden: C 62,31; H 6,83; N 8,12.
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F. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanind-(+)-alpha-methylbenzylaminsalz '
75 ml Tetrahydrofuran werden mit 13,26 g (0,05 M) Nalpha-tbutyloxycarbonyl-L-phenylalanin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann tropfenweise über eine Zeitdauer von 30 Minuten zu einer mechanisch gerührten Suspension von 0,15 M Kaliumhydrid und 0,5 g 18-Krone~6-ether unter Stickstoffatmosphäre bei 0 0C gegeben. Hierauf wird das Gemisch eine weitere Stunde bei 0 0C gerührt. Sodann gibt man tropfenweise über eine Zeitdauer von 15 Minuten eine Lösung von 6,23 ml (0,1 M) Methyliodid in 15 ml Tetrahydrofuran zu. Man läßt das Gemisch 2 Stunden stehen, worauf man es tropfenweise zuerst mit einem Gemisch aus 10 ml Essigsäure und 10 ml Tetrahydrofuran und anschließend mit 20 ml Ethanol versetzt. Das Gemisch wird dann auf 400 ml Eis gegossen. Die dabei erhaltene wäßrige Phase wird zur Einstellung des pH-Werts auf 12 bis 13 mit 2-normalem Natriumhydroxid versetzt. Das wäßrige Gemisch wird zweimal mit Ether extrahiert, worauf man es durch Zugabe von fester Citronensäure auf pH 3,0 ansäuert. Das wäßrige Gemisch wird dreimal mit 200 ml Ether extrahiert. Die Etherextrakte werden vereinigt, mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wird in 50 ml Ether gelöst, und die Lösung versetzt man mit 6,44 ml (0,05 M) d(+)-alpha-Methylbenzylamin. Die Lösung wird dann mit 350 ml Hexan verdünnt und durch Kratzen zur Kristallisation gebracht. Durch Abfiltrieren des dabei erhaltenen Produkts gelangt man zu 15,83 g (79 % der Theorie) der Titelverbindung. Nach Umkristallisieren aus Ethylacetat erhält man 13,70 g (68 % der Thorie) der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 136 bis 139 0C; /alpha/^5 = -28,2° (C = 1, EtOH).
Analyse für C23H32N3O4 (4O0·50)·"
berechnet: C 68,97; H 8,05; N 6,99; gefunden: C 68,75; H 7,81; N 6,74.
203 24;
G. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanylamid
Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanin (4,0 g; 0,01 M, hergestellt durch Ansäuern des d(+)-alpha-Methylbenzylaminsalzes und Extraktion in Ether) wird in 20 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Das Gemisch wird auf -15 0C abgekühlt, worauf man es zuerst mit 1,56 ml (0,012 M) Isobütylchlorformiat und dann mit 1,32 ml (0,012 M) N-Methylmorpholin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei -15 0C gerührt, worauf man 1,5 Stunden wasserfreies Ammoniak einleitet. Sodann wird das Gemisch 1 Stunde bei -15 0C gerührt und anschließend in ein Gefäß gegossen, das 200 ml Eis enthält. Die wäßrige Lösung wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und der Reihe nach mit 1,5-normaler Citronensäure, Wasser, 1-normalem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem Sirup eingeengt. Durch anschließendes Umkristallisieren dieses Sirups aus einem Gemisch aus Ether und Petrolether gelangt man zu 2,12 g (76 % der Theorie) der Titelverbindung, die bei 91 bis 92 0C schmilzt; /alpha/^5 = -111,2° (C = 0,5, CHCl3).
Analyse für C15H22N3O3 (278,33):
berechnet: C 64,73; H 7,97; N 10,06; gefunden: C 64,95; H 7,81; N 9,79.
H. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanylglycyl-Na p a-methyl-L-phenylalanylamid
20 ml frisch hergestellten Eisessig, der wasserfreien Chlorwasserstoff (1-normal) und 2 ml Anisol enthält, versetzt man mit 1,95 g (0,007 Mol) Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-methyl-L-phenylalanylamid. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei
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Raumtemperatur gerührt und dann in Ether gegossen. Der anfallende' Niederschlag wird gesammelt und getrocknet (1,5 g). Das Hydrochloridsalz wird hierauf in 30 ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf 0 0C gekühlt und mit 1,4 ml (.0,007 M) Dicyclohexylamin versetzt. Das Gemisch wird einige Minuten gerührt, worauf man es mit 3,5 g (0,007 M) Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin, 950 mg. (0,007 M) HBT und 1,4 g (0,007 M) DCC versetzt. Sodann rührt man das Reaktionsgemisch zuerst 2 Stunden bei 0 0C und anschließend 24 Stunden bei 4 0C. Das Gemisch wird auf 0 0C abgekühlt und dann filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt, welches man in Ethylacetat löst. Die Ethylacetatlösung wird der Reihe nach mit 1-normalem Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75-noirmaler Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Das öl wird über eine 40 χ 3 cm messende und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) in Chloroform gefüllte Säule chromatographiert. Das gewünschte Produkt wird dann stufenweise unter Anwendung eines Gradienten aus Chloroform bis zu einem Gemisch aus 10 % Methanol in Chloroform eluiert. Durch entsprechende Isolierung des Produkts nach dem Dünnschichtprofil der anfallenden Fraktionen gelangt man zu 3,55 g
(77 % der Theorie) der Titelverbindung; /alpha/^5 = -9,2° (C = 0,5, MeOH).
Analyse für C36H45N5O7 (659,8): · .
berechnet: C 65,54; H 6,57; N 10,61; gefunden: C 65,46; H 6,58; N 10,36.
I. N^P^-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N31^3-methyl-L-phenylalanylamid
Das nach Teil H erhaltene Produkt (3,2 g, 0,0485 M) wird in 60 ml Ethanol gelöst, worauf man das erhaltene Gemisch mit einer wäßrigen Aufschlämmung von 1,5 g 5-prozentigem Palladiumauf-Kohle versetzt- Über ein Gasverteilungsrohr leitet man in
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das Reaktionsgemisch dann zuerst etwa 5 Minuten. Stickstoff und anschließend 6 Stunden Wasserstoff ein. Das Reaktionsgemisch wird dann mit Stickstoff gespült, worauf man den Palladiumkatalysator durch Filtrieren entfernt. Das Gemisch wird unter Vakuum zu einem Sirup eingeengt. Der Sirup wird in Chloroform gelöst und auf einer 40 χ 3 cm großen und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllten Säule absorbiert.. Das Produkt wird von der Säule unter Verwendung eines Gradienten von Chloroform bis zu 10 % Methanol in Chloroform stufenweise eluiert und aufgrund des Dünnschichtprofils der einzelnen Fraktionen gesammelt. Auf diese Weise gelangt man
zu 2,0 g (74 % der Theorie) der Titelverbindung; /alpha/'
— — JLJ
= -9,9° (C = 0,5, MeOH).
Eine Aminosäureanälyse des Produkts ergibt folgende Werte: GIy ·= 1,01; AIa = 0,99; Tyr = 0,99;· NH3 = 1,14.
J. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na p a-methyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz
Das nach Teil I erhaltene Produkt (1,6 g, 0,00281 M) wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst, die 0,5 ml Anisol enthält. Das Gemisch wird 30 Minuten bei O 0C gerührt. Sodann wird das Gemisch in Ether gegossen, worauf man den erhaltenen Niederschlag sammelt und trocknet (1,1 g). Der Feststoff wird in einer solchen Menge einer wäßrigen Pufferlösung (1 % Pyridin und 0,05 % Essigsäure) gelöst, daß sich 15 ml ergeben, worauf man die erhaltene Lösung auf eine 2,5 χ 99 cm messende und mit DEAE-Sephadex A-25. (Acetat) gefüllte Säule aufbringt, die man vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert hat. Das Eluat wird bei 280 nm automatisch überwacht, und die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Durch Relyophilisierung aus 10-prozentiger Essigsäure und anschließende Lyophilisierung aus einem 75:25-Gemisch aus Wasser und Acetonitril gelangt man zu 0,84 g der Titelverbindung; /alpha/p5 = + 27,8 (C = 1, 1n HCl).
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Eine entsprechende Aminosäureanalyse des obigen Produkts ergibt folgende Werte: Tyr = 0,98; AIa = 1,03; GIy = 1.00; NH3 = 1,05.
Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalanylamid-acetatsalz ·_
A. L-alpha-Methylphenylalanin-benzylester-tosylatsalz
100 ml Benzol werden mit 3,0 g (0,0168 M) L-alpha-Methylphenyl-•alanin versetzt. Die erhaltene Suspension wird dann mit 3,5 g (1,1 Äquivalent) p-Toluolsulfonsäurehydrat und 10 ml Benzylalkohol versetzt. Das Gemisch wird in Gegenwart einer Dean-Stark-Wasserfalle 4 Tage auf Rückflußtemperatur erhitzt. Sodann wird das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Ausfällung des Tosylatsalzes mit Ether versetzt. Der angefallene Niederschlag wird gesammelt und getrocknet, wodurch man zu 7,0 g (94 %) der Titelverbindung gelangt, die bei 129 bis 131 °C schmilzt, /alpha/ 25 fe ,^70 (c = Q^ 1N MeQH) ^
Analyse für C34H27NO5S (441,5):
berechnet: N 3,17; gefunden: N 2,87.
B. N- -t-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanylglycy1-L-alpha-methylphenylalanin-benzyIester
80 ml DiMF werden mit 5,74 g (0,013 mM) des nach Teil A erhaltenen Produkts versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten auf 0 0C gekühlt, worauf man es mit 6,5 g (13 mM) N p -t-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin (hergestellt gemäß Beispiel 1), 1,8 g (13 mM) HBT und 2,7 g (13 mM) DCC versetzt. Das Gemisch wird zuerst 2 Stunden bei 0 0C und anschließend 24 'Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird auf 0 0C abgekühlt, worauf man den erhaltenen Niederschlag abfiltriert.
Das Filtrat wird unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, worauf man die Ethylacetatlösung der Reihe nach mit 1-normalem Natriumbicarbonat, Wasser, 0,75-normaler Citronensäure und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öl eingedampft. Das öl wird aus Ether kristallisiert, worauf man das erhaltene Material aus einem Gemisch aus Ethylacetat und Ether umkristallisiert. Auf diese Weise gelangt man
25
zu 7,0 g (72 %) der Titelverbindung, /alpha/' = +7,9° (C = 0,5, MeOH).
Analyse für C43 H5O N4O 8 (750,86):
berechnet: C 68,78; H 6,71; N 7,46; gefunden: C 68,75; H 6,46; N 7,21.
C. N p -t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalahin-dicyclohexylaminsalz
50 ml Ethanol versetzt man mit 4,0 g (0,0053 M) des nach Teil B erhaltenen Produkts. Sodann gibt man eine Aufschlämmung von 2,0 g 5-prozentigem Palladium-auf-Kohle in DMF zu. Anschliessend leitet man in das Reaktionsgemisch durch ein Gasverteilüngsröhrchen zuerst 5 Minuten lang Stickstoff und dann 4 Stunden Wasserstoff ein. Das Gemisch wird hierauf mit Stickstoff gespült, und der Palladiumkatalysator wird abfiltriert. Das·Filtrat wird unter Vakuum zu einem Sirup eingeengt. Der Sirup wird in Chloroform aufgenommen und auf eine 10 χ 2 cm große und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule wird stufenweise unter einem Gradienten von Chloroform bis zu Chloroform-Methanol (9,5:0,5) eluiert. Die Hauptfraktionen werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird verdampft. Das erhaltene Öl wird in Ethylacetat gelöst, und die Lösung versetzt man mit 1 ml Dicyclohexyl· amin. Der anfallende Niederschlag wird gesammelt und getrocknet,
208 24;
wodurch man zu 2,6 g (65 %) der Titelverbindung gelangt, die
bei 142 bis 146 0C schmilzt, /alpha/j:5 = +4-6,3° (C = 0,5, MeOH)
D. N ^ a-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alphamethylphenylalanylamid
Das nach Teil C erhaltene Produkt (2,0 g, 0,0027 M) wird mit einem Gemisch aus Ethylacetat und 0,75-normaler Citronensäure neutralisiert. Die organische Schicht wird abgetrennt, mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öl eingedampft (1,5 g). Die erhaltene freie Säure wird in 30 ml DMF gelöst, worauf man die Lösung in einer Druckflasche auf 0 0C kühlt. Sodann gibt man DCC (560 mg) 0,0027 M) zu, worauf man das Gemisch zuerst 4 Stunden bei 0 0C und anschließend 3 Stunden bei Raumtemperatur rührt. Hierauf wird die Flasche auf -78 0C gekühlt und mit 30 ml wasserfreiem Ammoniak versetzt. Die Druckflasche wird erneut verschlossen, worauf man das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur rührt. Sodann wird das Gemisch auf -78 0C gekühlt und die Flasche geöffnet, worauf man das Ammiak bei Raumtemperatur verdampfen läßt. Sodann wird das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft. Der angefallene Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, worauf man die Ethylacetalösung zurst mit 0,75-normaler Citronensäure und anschließend mit Wasser extrahiert. Die Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, und die erhaltene Lösung gibt man auf eine 3 χ 45 cm große und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllte Säule auf. Die Säule wird unter einem Gradienten von Chloroform bis zu Chloroform zu Methanol (9:1) stufenweise eluiert. Die entsprechenden Fraktionen werden auf Basis des Dünnschichtprofils gesammelt, wodurch man nach Verdampfen des Lösungsmit-
25 tels zu 1,1 g (72 %) der Titelverbindung gelangt; /alpha/ = -26
(C = 0,4, MeOH).
Eine entsprechende Aminosäureanalyse ergibt folgende Werte: GIy = 0,99; AIa = 1,00; Tyr = 0,99; NH3 = 1,12.
208 24
E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalanyl-amidacetatsalz
20 ml eines Gemisches aus 1-normalem gasförmigem Chlorwasserstoff in Eisessig, das 0,3 ml Anisol enthält, werden mit 900 mg (0,0016 M) des nach Teil D erhaltenen Produkts versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann in Ether gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt und getrocknet (720 mg). Der Feststoff wird in einer solchen Menge wäßriger Pufferlösung (1 % Pyridin und 0,05 % Essigsäure) gelöst, daß sich ein Volumen von 5 ml ergibt, und die erhaltene Lösung wird auf eine 2,5 χ 99 cm messende und mit DEAE-Sephadex A-25 (Acetat) gefüllte Säule aufgegeben, die man vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert hat. Das Eluat wird bei 28Ö nm überwacht, und es werden entsprechende Fraktionen vereinigt und lyophylisiert. Durch Relyophilisierung aus 10 % Essigsäure und anschließende Lyophilisierung aus einem 75:25-Gemisch aus Wasser und Acetonitril gelangt
25
man zu 400 mg der Titelverbindung; /alpha./ = +23,9° (C = 0,5, 1n HCl) . ·
Analyse für C36H35N5O7 (529,6O):
berechnet: C 58,97; H 6,66; N 13,22; 0 21,15; gefunden: C 59,02; H 6,36; N 12,99; 0 21,41.
Eine entsprechende Aminosäureanalyse ergibt folgende Werte: Tyr = 0,96; AIa = 1,01; GIy = 1,00; NH3 = 1,03.
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phenylalanylamid-acetatsalz
A. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-n-propyl-L-phenylalanin
Zu 70 ml Tetrahydrofuran werden 10,6 g (0,04 M) Nalpha-t-Butyl-· oxycarbonyl-L-phenylalanin gegeben. Das erhaltene Gemisch wird tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zu einer mechanisch gerührten Suspension von 0,12 M Kaliumhydrid in 220 ml Tetrahydrofuran und 0,5 g 18-Krone-6-ether bei 0 0C unter Stickstof fatmosphäre gegeben. Sodann wird das Gemisch weitere 10 Minuten bei 0 0C gerührt. Anschließend versetzt man es über eine Zeitdauer von 20 Minuten tropfenweise mit eirier Lösung von 23,3 ml (0,24 M) 1-Iodpropan in 40 ml Tetrahydrofuran. Sodann hält man das Gemisch 2,5 Stunden auf 0 0C und versetzt es tropfenweise mit 11,5 ml (0,12 M) 1-Iodpropan. Das Gemisch wird weitere 2 Stunden bei 0 0C gerührt, mit 10 ml Eisessig versetzt und dann weitere 10 Minuten gerührt. Hierauf gießt man das Gemisch auf zerstoßenes Eis. Anschließend wird der pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht mit 2n Natriumhydroxid auf 8,0 erhöht. Das wäßrige Gemisch wird zweimal mit Ether extrahiert, worauf man es durch Zusatz von kalter 2n Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,5 ansäuert. Sodann wird das wäßrige Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wird einmal mit Wasser extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wird in 200 ml Ether ge-. löst, und die Lösung versetzt man mit 8 ml (0,04 Mol) DCHA. Der anfallende Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat wird eiinmal mit 1,5n Citronensäure und Wasser extrahiert. Die Etherschicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öl eingedampft. Anschließend chromatographiert man das erhaltene öl über einer 40 χ 3 cm großen und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllten Säule in Chloroform. Das Produkt wird stufenweise unter Arbeiten mit einem Gradienten von Chloroform bis zu einem Gemisch aus 5 % Methanol in Chloroform eluiert.
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Das Produkt wird nach dem Dünnschichtprofil der anfallenden Fraktionen isoliert, wodurch man zu 3,6 g (31 % der Theorie) der Titelverbindung gelangt; /alpha/^5 = -153,3 (C = 1, MeOH). NMR delta (-CO2H) = 10,47; delta ((Me3)C-) =1,50.
Analyse für C17H25NO4 (307,4):
berechnet: C 66l,43; H 8,20; N 4,56; gefunden: C 66,16; H 7,99; N 4,45·.
B. Na p a-t-Butyloxycarbonyl-Na p a-n-propyl-L-phenylalanylamid
Das nach Teil A hergestellte Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalphan-propyl-L-phenylalanin wird in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Das Gemisch wird auf -15 0C.gekühlt und zuerst mit 1 Äquivalent Isobutylchl'orformiat und anschließend mit 1 Äquivalent N-Methylmorpholin versetzt. Sodann wird das Gemisch 10 Minuten bei -15 °C gerührt, worauf man über eine Zeitdauer von 30 Minu- ten wasserfreies Ammoniak einleitet. Anschließend wird das Gemisch 1 Stunde bei -15 0C gerührt und dann in ein mit 200 ml Eis gefülltes Gefäß gegossen. Die wäßrige Lösung wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird abgetrennt und der Reihe nach mit 1,5-normaler Citronensäure, Wasser, 1-normalem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wodurch man zur Titelverbindung gelangt.
C. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Nalpnan-propyl-L-phenylalanylamid
20 ml frisch hergestellten Eisessig, der wasserfreien Chlorwasserstoff (1-normal) und 2 ml Anisol enthält, versetzt man mit 1 Äquivalent Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-n-propyl-L-phenylalanylamid. Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Gemich in Ether gegossen, worauf man den angefallenen Niederschlag sammelt und trocknet. Das Hydrochloridsalz wird in 30 ml DMF gelöst. Die
-as- 208 248
Lösung wird auf O 0C gekühlt und mit 1 Äquivalent Dicyclohexyl- amin versetzt. Das Gemisch wird einige Minuten gerührt und dann mit 1 Äquivalent Na ^ a-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin (hergestellt nach Beispiel 1E) ,. 1 Äquivalent HBT und 1 Äquivalent DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann zuerst 2 Stunden bei 0 0C und anschließend 24 Stunden bei 4 0C ' gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch auf 0 °C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt, das man wieder in Ethylacetat auflöst. Die Ethylacetatlösurig wird der Reihe nach mit 1-normalem Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 0,75-normaler Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das öl wird über eine 40 χ 3 cm messende und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllte Säule in Chloroform chromatographiert. Das Produkt wird stufenweise unter einem Gradienten von Chloroform bis zu einem Gemisch von 10 % Methanol in Chloroform eluiert. Das Produkt wird dann nach dem Dünnschichtprofil der anfallenden Fraktionen isoliert, wodurch man zu Na ^ a-t-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na p a-n-propyl-L-phenylalanylamid gelangt.
Das in obiger Weise erhaltene Produkt wird in 6O ml Ethanol gelöst, worauf man das erhaltene Gemisch mit 1,5 g 5-prozentigem Palladium-auf-Kohle in Form einer wäßrigen Aufschlämmung versetzt. Sodann leitet man in das Reaktionsgemisch durch ein Gasvertexlungsröhrchen zuerst etwa 5 Minuten Stickstoff und anschließend 6 Stunden Wasserstoff ein. Das Reaktionsgemisch wird hierauf mit Stickstoff gespült, und der Palladium-Katalysator wird dann abfiltriert. Das Gemisch wird unter Vakuum zu einem Sirup eingeengt. Der Sirup wird in Chloroform gelöst und auf einer 40 χ 3 cm messenden und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) gefüllten Säule adsorbiert. Das Produkt, wird stufenweise unter einem Gradienten von Choroform bis zu 10 % Methanol in Chloroform eluiert und nach dem Dünnschichtprofil der dabei anfallenden Fraktionen isoliert. Auf diese Weise gelangt man zur Titelverbindung; /alpha/^5 = -34,8 ° (C = 0,5, MeOH).
208 24S
berechnet: C 62,29; H 7,25; N 1.1,72; gefunden: C 62,13; H 7,24; N 11,70.
D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-n-propyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz ^
Das nach Teil C erhaltene Produkt (800 mg, 1,34 mM) wird in 10 ml Trifluoressigsäure, die 0,5 ml Anisol enthält, gelöst. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0 0C gerührt, worauf man das Reaktionsgemisch lyophilisiert. Der erhaltene Feststoff wird dann in soviel wäßriger Pufferlösung (jl % Pyridin und 0,05 % Essigsäure) gelöst, daß sich insgesamt ein Volumen von 10 ml ergibt, worauf man die Lösung auf eine 2,5 χ 99 cm messende und mit DEAE-Sephadex A-25 (Acetat) gefüllte Säule aufgibt, die man zuerst mit dem gleichen Puffer äquilibriert hat. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht, und die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Durch aschließende Relyophilisierung aus 1-molarer Essigsäure gelangt man zu 655 mg der Titelverbindung; /alpha/^5 = -11,0 ° (C = 0,5, 1n HCl).
Analyse für C28H39NpO7 (557,6):
berechnet: C 60,31; H 7,05; N 12,56; gefunden: C 60,23; H 6,98; N 12,49.
Eine Aminosäureanalyse ergibt folgende Werte: Tyr = 0,99; AIa = 1,00; GIy = 1,01; NH3 = 0,96. .
208 248
Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na p a-ethyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz
A. Nalpha-Butyloxycarbonyl-Nalpha-ethyl-L-phenylalanin
70 ml Tetrahydrofuran werden mit 10,6 g (0,04 M) Nalpha-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird dann tropfenweise über eine Zeitdauer von 30 Minuten zu einer mechanisch gerührten Suspension von 0,12 M Kaliumhydrid in 220 ml Tetrahydrofuran und 0,5 g 18-Krone-6-ether bei 0 0C unter Stickstoffatmosphäre gegeben. Sodann wird das Gemisch weitere 10 Minuten bei 0 0C gerührt. Anschließend versetzt man das 'Reaktionsgemisch tropfenweise über eine Zeitdauer von 20 Minuten mit einer Lösung von 19,4 ml (0,24 M) Ethyliodid in 40 ml Tetrahydrofuran. Das Gemisch wird dann 4 Stunden auf 0 0C gehalten. Sodann versetzt man das Reaktionsgemisch in 2 gleichen Teilmengen mit weiteren 19,4 ml (0,24 M) Ethyliodid. Das Gemisch wird weitere 2 Stunden bei 0 0C gerührt und dann mit 10 ml Eisessig versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten gerührt, worauf man es auf 400 ml zerstoßenes Eis gießt. Sodann erhöht man den pH-Wert der erhaltenen wäßrigen Schicht durch Zusatz von 2-normalem Natriumhydroxid auf 8,0. Das wäßrige Gemisch wird zweimal mit Ether extrahiert und dann .durch Zugabe von kalter 2-normaler Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,5 angesäuert. Das wäßrige Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird.mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Der Sirup wird in 200 ml Ether gelöst, und die Lösung versetzt man mit 8 ml (0,04 m) DCHA. Der angefallene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat mit 1,5-normaler Citronensäure und Wasser extrahiert. Die Etherschicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu 4,6 g (39 % der Theorie) der Titelverbindung gelangt;
0 NMR delta (Phenyl) = 7,2; delta (Me3COC-) = 1,4.
~38 - 2
B. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-ethyl-L-phenylalanyl-amid
Man löst Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-ethyl-L-phenylalanin (4,3 g; 0,0146 M; hergestellt gemäß Teil A) in 60 ml Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF). Das Gemisch wird auf 0 0C abgekühlt und mit 3,0 g (0,0146 M) N,N1-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird zuerst 2 Stunden bei. 0 °C und anschließend 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sodann wird das Gemisch auf 0 °C abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt, das man anschließend in Ethylacetat löst. Die Lösung wird mit 1-normalem Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 1,5 normaler Citronensäure und Wasser extrahiert.' Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, wodurch man zu 3,93 g (91 % der Theorie) der Titelverbindung gelangt; /alpha/J5 = -101,51° (C = 1, MeOH).
— — υ
Analyse für c-jgH24N2°3 (292'4):
berechnet: C 65,73; h 8,27; N 9,58; gefunden: C 66,03; H 8,13; N 9,85.
CN p -Ethyl-L-phenylalanylamid-hydrochloridsalz
Man löst Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-Nalpha-ethyl-L-phenylalanylamid (3,5 g; 11,95 mM, hergestellt nach Teil B) in 40 ml frisch, hergestelltem Eisessig, der wasserfreien Chlorwasserstoff (1-normal) und 1,5 ml Anisol enthält, sowie in 1,5 ml (C9Hn.)-,SiH- Das erhaltene Gemisch wird 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird dann in Ether gegossen, worauf man den angefallenen Niederschlag sammelt und trocknet. Auf diese Weise gelangt man zu 2,6g (96 % der Theorie) der Titelverbindung, die bei 276 bis 277 °C schmilzt.
Analyse für C11H16N2OCl (227,7):
berechnet: C 58,02; H 7,08; N 12,30 gefunden: C 57 , 97; H 7,26; N 12,54
208 248
D. Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Nalphaethyl-L-phenylalanylamid
Man versetzt 50 ml DMF mit 1,14 g (0,005 MoI) Nalpha-Ethyl-L-phenylalanylamid-hydrochloridsalz (hergestellt nach Teil C) . Das Gemisch wird auf 0 0C gekühlt und dann mit 2,95 g (0,005 M)' Nalpha-t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycin-DCHA-Salz versetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten bei 0 0C gerührt und anschließend mit 675 mg (0,005 M) HBT sowie 1,03 g (0,005 Mol) DCC versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann zuerst 6,5 Stunden bei 0 0C und anschließend 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird hierauf auf 0 0C abgekühlt und filtriert. Das FiItrat wird unter Vakuum zu einem öl eingeengt, das man dann in Ethylacetat auflöst. Die Lösung wird mit 1-normalem Natriumbicarbonat, Wasser, kalter 1,5-normaler Citronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einem öl eingeengt. Das öl wird über eine 40 χ 3 cm große und mit Silicagel (Grace and Davison, Sorte 62) in Chloroform gefüllte Säule chromatographiert. Das Produkt wird anschließend stufenweise unter einem Gradienten aus Chloroform bis zu einem Gemisch von 15 % Methanol in Chloroform eluiert. Das Produkt wird nach dem Dünnschichtprofil der gesammelten Fraktion isoliert, wodurch man zu 1,13 g (39 % der Theorie) der Titelverbindung gelangt; ^5 = -21,0 ° (C = 0,5, MeOH).
Analyse für C30H41N5O7 (583,7).
berechnet: C 61,73; H 7,08; N 12,00; gefunden: C 60,35; H 7,26; N 11,25.
E. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N p a-ethyl-L-phenylalanylamidacetatsalz
Das nach Teil D erhaltene Produkt (1 g, 1,71 mM) wird in 20 ml Trifluoressigsäure gelöst, die 3 ml Anisol und 3 ml (C2H5)^SiH enthält. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0 0C gerührt. Sodann wird das Gemisch in Ether gegossen, worauf man den erhaltenen Niederschlag sammelt und trocknet (660 mg). Der Feststoff wird anschließend in soviel wäßriger Pufferlösung (10 % Pyridin und 0,5 % Essigsäure) gelöst, daß sich insgesamt ein Volumen von 10 ml ergibt, und die hierdurch erhaltene Lösung gibt man dann auf eine 2,5 χ 90 cm messende und mit DEAE-Sepahdex A-25 (Acetat) gefüllte Säule auf, die man vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert hat. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht, und die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Der hierdurch erhaltene Feststoff wird in 0,2-molarer Essigsäure (10 ml) gelöst, und die Lösung wird über eine 2,5 χ 99 cm messende und mit G-10 Sephadex gefüllte Säule chroma tographiert, die man vorher mit dem gleichen Lösungsmittel äquilibriert hat. Das Eluat wird bei 280 nm überwacht, und die entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Auf diese Weise gelangt man zu 448 mg (48 % der Theorie) der Titelverbindung; /alpha/^5.= -10,6° (C = 0,5, 1n HCl).
Analyse für C37H37N5O7 (543.6):
berechnet: C 59,65; H 6,86; N 12,88; gefunden: C 59,41; H 7,26; N 13,18.
Eine entsprechende Aminosäureanalyse ergibt folgende Werte: Tyr = 1,03; AIa = 0,99; GIy = 0,97; NH3 =0,98.
Die Verbindungen der Formel (I) sind wertvolle Heilmittel, und sie stellen insbesondere interessante Analgetika dar. Die anal getische Wirksamkeit der Verbindungen der Formel (I) läßt sich durch den sogenannten Heizplatten-Versuch an der Maus zeigen.
41 - 2 08 248
Hierzu gibt man eine Maus ins Innere' eines aufrecht stehenden Zylinders aus Acrylharz/ der auf einer Heizplatte steht, welche auf 52 0C gehalten wird. Der jeweiligen Versuchsmaus injiziert man subkutan eine vorbestimmte Menge der jeweils zu untersuchenden Verbindung, die in einem geeigneten Träger gelöst oder suspendiert ist. Nach Verabreichung der jeweils zu untersuchenden Verbindung läßt man eine bestimmte Zeit vergehen, worauf man die Maus auf die Heizplatte legt. Die jeweilige Versuchsmaus wird entsprechend beobachtet, wobei man die Zeitdauer in Sekunden bestimmt, innerhalb der es zu zwei getrennten Erscheinungen kommt. Als erstes wird die Zeitdauer ermittelt, welche vergeht, bis die Maus ihre Hinterpfote ableckt. Als zweites ermittelt man diejenige Zeitdauer, welche vergeht, bis 'die Maus von der Heizplatte aufspringt. Ein entsprechendes analgetisch wirksames Mittel ergibt bei einem derartigen Versuch gegenüber entsprechenden Kontrolltieren, denen man lediglich den Träger injiziert hat, erhöhte Zeitdauern. Dieser Effekt muß innerhalb eines Dosierungsbereichs auftreten, die zu keiner motorischen Inkoordination oder Gebrauchsunfähigkeit führt. Die bei den obigen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse gehen aus den folgenden Tabellen im Vergleich zu Kontrollversuchen mit einer Salzlösung hervor. Tabelle I zeigt im einzelnen die bis zum Ablecken der Hinterpfote vergehende Zeitdauer, während aus Tabelle II die bis zum Aufspringen der Maus vergehende Ze.itdauer hervorgeht. Als Kriterium für einen positiven analgetischen Effekt gilt folgendes: Die bis zum Ablecken der Hinterpfote oder bis zum Aufspringen bei einem behandelten Tier vergehende Zeitdauer muß gleich oder größer sein als die entsprechende mittlere Zeitdauer bei einem Kontrollversuch plus zwei Standardabweichungen vom Mittelwert. Alle in den folgenden Tabellen I und II angegebenen Versuchswerte stellen Mittelwerte plus oder minus dem jeweiligen Standard-Fehler dar.
T a b e 1 1 e I
Analgetische Wirksamkeit Zeitdauer bis zum Ablecken der Hinterpfote, see.
| Verbin dung1^ | vergan gene Zeit, Min. | Kontrolle 0,3 | 33, |
| A | 15 | 26,6+1,7 | |
| . 15 | 31,4+3,1 | ||
| 15 | 33,4+2,2 | ||
| . 30 | 32,0+2,7 | ||
| 60 | 28,2+0,9 | ||
| 90 | 28,2+0,9 - | ||
| 15 | 26,9+3,1 29,4+2,7 | ||
| 15 | 25,0+1,9 34,0+1,51 | ||
| 120 | 28,0+1,7 | ||
Dosis, mg/kg
33,2+2,23 114,4+24,42
48,1+7,63
101,7+15,9 X 71,2+7,I1 46,2+6,32 32;0+3,5
30.2+2,9
T a- b e 1' le I (Fortsetzung)
Analgetische Wirksamkeit Zeitdauer bis zum Ablecken der Hinterpfote, see.
Verbindung^
vergangene Zeit,
Min.
15
15
30
60
15
60
90
120
120
15 15
15 15
Kontrolle
0,3
29,2+1,7 31,4+1,7 29,8+6,9 29,.8+6,9 25,0+1,9 30,0+2,6 30.0+2,6 23,7+1,4 28,0+1,7
31,9+1,9"
26,4+1,8 32,9+2,3"
26,1+1,7
30,2+2,7 25,7+1,1
32,0+2,7
34,8+2,5
32,4+2,4'
42,2+3,9" Dosis, mg/kg
a)
35,7+2,3" 40,5+2,7'
35,2+2,7^
63,4+12,6-
59,4+10,0" 43,4+6,1
37,0+3,8 30,1+3,9 29,6+3,6 25,8+1,6
58?l+5,r
54,2+7,2X 240,0+0"
30
T a b e 1 1 e II
Analgetische Wirksamkeit Zeitdauer bis zum Aufspringen der Maus, see.
Verbindungb)
vergangene Zeit,
Min.
Kontrolle
0,3
15 15
* 15 30
• 60 90 15 15
120
15 15 30 60
48,4+4,7
62,1+9,1
80,2+7,4
60,2+6,1
80,5+8,8
80,5+8,8
73,7+6,9 126,2+14,7'
63,7+9,1 107,0+8,I1
69,8+4,2
43,8+5,5 62,9+10,3 73,8+14,6 73,8+14,6 Dosis, mg/kg
133.1-KL4.-81 222,2+9,1 140,4+19,0x
' * τ ι
112,2+21,2 237,3+2,7X 189,2+12,8
2 3
144,3+13,2
105,0+14,2
110,2+9,8
104,7+7,0χ 226,2+7,7
218,3+16,4· 89,4+16,7
30
Tabelle II (Fortsetzung)
Analgetische Wirksamkeit Zeitdauer bis zum Aufspringen der Maus, sec.
vergan-
Verbin- Zeit^ Dosis, mg/kga)
dung
'
Min. Kontrolle 0,3 1 3 10
B 15 63,7+9,1 130,7+15,B1 - - - '
60 59,2+5,8 - - - 84,3+13,23 -
90 59,2+5,8 - - - 89,4+7,52
79,4+5,7 - - - 104,1+5,82
69.8+4,2 - - - 126,4 + 11,71 - -t
C 15 62,7+7,5 118,9+15,52 120,6+14,21 - -
15 75,6 + 5,7 - - 155,0+l?^1 237,6+2^1
D 15 63,8+7,7 121,2+15,72 185,1+15,O1 ' · ·
1 1
15 797l+7,7 - - 218,4+16^1 240,0+O
Fußnoten:
a. Die in obigen Tabellen aufscheinenden hochgestellten Zahlen "1", "2" und "3" besagen, daß das jeweilige Ergebnis über Signifikanzwerte von p<0,001, P <Ό,01 bzw. P <C 0,05 verfügen.
b. Es wurden folgende Verbindungen verwendet:
A. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na p -methyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz,
B. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalanylamid-acetatsalz,
C. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-n-propyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz.
D. L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na p a-ethyl-L-phenylalanylainid-acetatsalz.
Claims (9)
- Erfindungsanspruch.1«, Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Formel(L) (D) (L)0 0 0 R R Il Il Il I4 I-c-NH-CH-c-NH-CH -c-n—c-z ι 2ι ι 2 ι• OYund den pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalzen hiervon,L und D gegebenenfalls eine Chirialität ausdrücken soll,R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff oder primäres C1-C3-AIkYl bedeuten,R_ für primäres oder sekundäres C.-G4-Alkyl oder-CH2CH2-S-CH3 steht,R. . Wasserstoff oder primäres C.-C^-Alkyl ist,R5 Wasserstoff oder primäres Cj-C^-Alkyl bedeutet,2 03 2Y Wasserstoff oder Acetyl darstellt und0 Z für -C-NH2, -CH2OH oder-CN steht,mit der Maßgabe, daß einer der. Substituenten R. und R5 für primäres C1-C3-Al]CyI und der andere für Wasserstoff stehen muß, fcdadurch gekennzeichnet, daß man von der jeweiligen entsprechend geschützten Verbindung der oben angegebenen Formel (I) mit einem sauren Medium die Schutzgruppen abspaltet.
- 2. Verfahren'nach Punkt · ^ > dadurch gekennzeichnet , daß man als saures Medium Trifluoressigsäure, Eisessig mit Chlorwasserstoffgas oder Ameisensäure verwendet.
- 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß man Verbindungen verwendet, bei denen der Substituent R. für primäres C.-C,-Alkyl steht.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet , daß man Verbindungen verwendet, bei denen der Substituent R 'für primäres C1-C^-Alkyl steht.
- 5. Verfahren nach Punkt "*' dadurch gekennzeichnet , daß man Verbindungen verwendet, bei denen der Substituent Z für-C-NH2 steht.
- 6. Verfahren nach . Punkt 1 zur Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-methyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz, dadurch gekennzeichnet, daß man N " t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na " -methyl-L-phenylalanylamid mit Trifluoressigsäure umsetzt und das Ganze dann aus Essigsäure lyophilisiert.
- 7. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalanyiamid-acetatsalz, dadurch gekennzeichnet, daß man N " t-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-L-alpha-methylphenylalanylamid mit Chlorwasserstoff in Eisessig umsetzt und das Ganze dann aus Essigsäure lyophilisiert.
- 8. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na " a-n-propyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz, dadurch gekennzeichnet, daß man Na p at-Butyloxycarbonyi-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-n-propyl-L-phenylalanylamid mit Chlorwasserstoff in Eisessig umsetzt und das Ganze dann aus Essigsäure lyophilisiert.
- 9. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von L-Tyrosyl-D-alanyl-glycyl-Na ^ a-ethyl-L-phenylalanylamid-acetatsalz, dadurch gekennzeichnet, daß man Na Pl-at-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-D-alanyl-glycyl-N3 p a-ethyl-L-phenylalanylamid mit Trifluoressigsäure umsetzt und das Ganze dann aus Essigsäure lyophilisiert.
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