DD140503A5 - Diagnostisches verfahren - Google Patents

Abstract

In vitro durchzuführendes diagnostisches Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß Lymphozyten mit einem synthetischen Peptid hoher Basizität inkubiert werden, wonach deren Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld gemessen wird.

Description

Diagno stisehe s Verfahr on

Berlinj den 9* 3· 1979 AP Cr 01 Ν/208 922 GZr 54· 320 11

^giiebiet^

Die Erfindung betrifft ein Verfahren in vitro durchzuführenden Diagnostik der ze3,lvermittelten Immunitätslage von Mensch und 0}ier durch den Nachweis der veränderten Beweglichkeit von geladenen Irsdikatorpartikeln im elektrischen Feld, die mit einem Medium aus mit Antigenen inkubierten Lymphozyten behandelt worden

sind,

Charakteristik-.der bekannten technischen Lösungen

Aus den DE-Patentanmeldungen 2 441 536 und 2 462 416 ist ein diagnostisches Verfahren in vitro bekannt« Danach werden Lymphozyten mit Antigenen inkubiert, das Inkubationsgemisch oder der zellfreie überstand wird su einer Dispersion von Indikatorpartikeln gegeben und danach wird die Wanderungsgeschwindigkeit der Indikatorpartikel in einem elektrischen Feld gemessen«, Als Indikatorpartikel werden dabei solche Partikel verwendet j die im elektrischen PeId ein im wesentlichen einheitliches Verhalten zeigen und die mit dem. Lymphozytenüberstand Wechselwirkungen eingehen_s wodurch das Verhalten der Partikel im elektrischen Feld meßbar verändert wird«, In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Indikatorpa.rtikel äenatuierte Erythrozyten eingesetzt* Als denaturierende Agensien v/erden Tannin oder/und Sulfosalizilsäure bevor-

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LtLt diesem auf E* J* Field und B. A_e Gaspary, The Lancet, 1970, Seite 1337 - 1341, zurückgehenden Verfahren ist es möglichj maligne Erkrankungen zu diagnostizieren, wenn als Antigen der sogenannte enzephalitogerse Eaktor (BI¹) oder ein basisches Protein aus zentralnervösem Gewebe eingesetzt wird«

Diese antigenen Substanzen sind nicht nur wenig definiert, sondern auch schwer zugänglich. Ihre Eigenschaften sind von dem.Verfahren, ihrer Herstellung beeinflußt·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten diagnostischen Verfahrens zur Erkennung maligner Erkranlaingen durch den Nachweis sensibilisierter .Lyapho'syten«

Darlegimg des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde _} die bisher für den Nachweis sensibilisierter Lysiphozyfcen ^:2ur Diagnostik maligner Erkrankungen angewandten Antigene durch definierte ehe«« 'mische Substanzen zu ersetzen·

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß ein Ersatz des bzw» des basischen Proteins aus zentralnervösem Gewebe durch synthetische Peptide möglich ist_β

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein diagnostisches Verfahren in vitro j bei dem Lymphozyten mit einem synthetischen Peptid hoher Basizität inkubiert werden, wonach deren Wanderungsgesehwindigkeit im elektrischen" Feld gemessen wird* Die

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~ 3

Lymphozyten. steilen demzufolge Indikatorpartikel dar¹, deren elektrisches Verhalten nach ihrer Inkubation mit einem synthetischen Peptid meBbar verändert wird. Das Inkubationsgemisch, bestehend aus Lymphozyten und dem Peptid erfährt bei der Inkubation seinerseits eine Veränderung seiner Zusammensetzung, welche durch ein verändertes elektrisches Verhalten eines zweiten partikelären Indikators nachgewiesen werden kann* Der nachweis des geänderten elektrischen Verhaltens erfolgt zweckmäßig in der Messung der Wanderiingsgeschwindigkext im elektrischen.FeIcL

Als basische Peptide im Sinne der Erfindimg v/erden bevorzugt synthetische Polypeptide, bestehend im wesentlichen aus Lysin, Arginin und/oder Ornithin, insbesondere .Poly~Ir-Lysin, PoIy-L-Arginin oder PoIy-L-Ornithin, aber auch deren homogene oder heterogene Mischungen« Besonders vorteilhaft wird im Sinne der Erfindung Poly-L—Lysin mit einem Molekulargewicht von 750 - 1OcOOO, vorzugsweise ein solches mit einem Molekulargei^icht von '7.50 - 5»000 verwendet« PoIy-L-Lysin besitzt den Vorteil, daß es als Salz, z„ B, als Hydrobromid oder Hydrochlorid, in weitgehend stabiler Porm erhältlich ist«

Zunächst sind als Indikatorpartikel die Lymphozyten selbst anzusehen, deren elektrisches Verhalten nach der Inkubation mit einem synthetischen.Peptid hoher Basizität meßbar verändert wird« Eine höhere Empfindlichkeit zeigt das Verfahren _% wenn nicht die Lymphozyten selbst In ihrem Verhalten gemessen werden j sondern wenn die bei der Inkubation in dem Inku'-bationsgemisch aufgetretenen Veränderungen auf andere Indi~ katorpai'tikel übertragen und deren geändertes elektrisches

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Verhalten bestimmt wird* Als solche anderen Indikatorpartikel kommen im wesentlichen diejenigen in !frage, die in einem elektrischen 3?eld ein praktisch einheitliches Verhalten zeigen und die mit den'Bestandteilen des Inkubationsgemisches aus synthetischem Peptid und Lyinphozyten Wechselwirkungen eingehen, dergestalt,-daß das Verhalten der Partikel im elektrischen Feld meßbar verändert wird und die mit einer geeigneten Vorrichtung direkt beobachtet oder meßbar sind« Insbesondere sind mit denaturierenden.Agenzien behandelte_? beispielsweise !Tannin·» und/oder Sulfosalizilsäure-behandelte, menschliche oder tierische Erythrozyten als Indikator» partikel verwendbar« Vorzugsweise v/erden als Indikatorpartikel tannierte Erythrozyten-verwendet« die nach dem Verfahren von Bechtj J, Immunol.'10^₁ S₀ 18 - 22 (1968) mit Sulfosalizilsäure stabilisiert wurden* Geeignet sind auch ^:Lipo~ somen-Membran~Partikele

Die Lymphozyten werden nach an sic3i bekannten Verfahren aus pheripherem Blut isoliert, nachdem es wie üblich ungerinnbar gemacht worden ist, beispielsweise durch Zusatz einer ger.innungshemmenden Substanz wie Heparin* Die auf diese Weise gewonnenen gereinigten Lymphozyten können nun mit den synthetischen basischen Polypeptiden unter den Bedingungen des ο© ge Verfahrens inkubiert werden* Sind in dem jnkubationsansätz Lymphozyten vorhanden, welche mit tumorassoziierten Intigeiien sensibi3,isiert sind, werden Substanzen, möglicherweise sogenannte Lymphokine_s freigesetzt· Deren Wechselwirkung mit den Indikatorpartikeln führt zu einer Veränderung ihrer Wanderungsgeschwindigkeit' im elektrischen Feld. Diese Veränderung ist meßbare

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Werden tannierte Erythrozyten oder andere Indikatorpartikel verwendet, die mit einem Inkubationsineäiuia aus dem zell~ freien Lymphosytenüberstand versetzt werden, so empfiehlt es sich O₉I bis 1,0 ml einer Suspension mit 1 χ 10' bis 5 χ 10^ Partikeln pro ml mit 1 bis 10 ml vorzugsweise 3 BiI des Inkubationsmediuriis zn versetzen»

Das Inkubationsmedium kann wie folgt erhalten Werdens

6 7

1,x 10 bis 1 ζ 10' durch Gradientenzentrifugation gev/onnene Lymphozyten eines Probanden werden mit O₅OI bis 100 /üg eines synthetischen Peptids, vorzugsweise PoXy-Lysin, 90 Ivün« bis 1800 Liin« "bei 25 bis 37 ⁰C inkubiert« Danach werden die Lymphozyten vom überstand, zweckmäßig durch Zentrifugation_f abgetrennt und der Überstand zur Beladung der Indikatorpar·-* tikel wie oben ausgeführt, eingesetzt. Es ist jedoch nicht erforderlich, den zellfreien Lymphozytenüberstand z\i verwenderu Vorhandene 3Jymphozyten stören den Ansatz kaum·

Die behandelten Indikatorpartikel werden beispielsweise' in einem Zellelektrophoresesystem anaiysiertj weiches die Re~ gistrierung der Wanderungsgeschv/indigkeit gestattet* Dio Auswertung erfolgt durch Feststellung der Abweichung der elektrophor©tischen Wanderungsgeschwindigkeit vom Hullwert und dem Wert_$ der sich bei Verwendung von Lymphozyteü von gesunden Personen ergibt» Lymphozyten eines tumorverdächti~ gen Patienten bewirken im Inkubationsüberstand eine Ve?^lang-" samung der elektrophoretischen Beweglichkeit der damit beladenen Indikatorpartikel gegenüber IndikatorρartikeIn₉ die nur mit einem physiologisch verträglichen Inkubationsmedium (Nullwert) sowie gegenüber Indikatorpartikeln, die mit dem Überstand der Inkubation des Polypeptide mit Lynrphozyten ge-

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sunder Personen gewonnen wurde» Eine derartige Verlangsanrung wird diagnostisch als pathologisch bewertete

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung vjird am nachstehenden Beispiel näher erläutert s

Beispiel 1 -

m*n mm ffo niiiiijcmoow) - _ '

In einer Spritze.' mit 0$5 ial Heparinlösung werden einem Probanden 25 BiI venöses Blut abgenommene Die Blutprobe wird auf eine Säule (2 cm 0$ 30 cm Höhe), gefüllt mit Glasperlen (2 mm 0)_s gegeben und im Brutschrank bei 37 ⁰O über 90 Min_e stehengelassen* Anschließend wird das Eluat der Säule im Verhältnis 1 : 4 mit Hanks' Lösung mit einem Gehalt von Oj05 % IEiXDA, 'dem Hap-Salz der-Äthylendiamintetraessigsäure, verdünnt* Das verdünnte Eluat wird über 1/4 des Volumens einer Lösuagj bestehend aus Natrium-, Calcium-, Magnesium·» und Methylglykaminsalsen der Metrizoesäure (Ronpacon ₅ Cilag—Ghemie Gnibllj Aisbach) und eines hochmolekularen Copolymeren von Saccharose und Epichlorhydrin (KLcoll ^" , Pharmacia_s Uppsala) mit der Dichte 1,074 geschichtet und ixber 1J? Min* bei 250 g zentrifugiert« Der über dem Dichtegradienten liegende Lymphozytenring wird abgehebert _f einmal mit der erwähnten Hanks¹- und EDTA-Lösung und anschließend zweimal mit Hanks⁵-Lösung gewascheru Die Zellen werden abaentrifugiert und in 0j5 ml KPMI 1640 Medium ohne Serum aufgenommen. EPMI, 1640 Medium ist ein Kulturmedium, für das Zellwachstum und besteht aus einer Mschung von Aminosäuren, Vitaminen, anorganischen Salzen," Puffersubstanzen und Antibiotika in folgender Zusammensetzung;

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Komponente mg/L

NaCl NaHCO-

Glukose Glutathion (reduziert) Phenol-rot L-Arginin (freie Bass) L~Asparagin L~Asparaginsäure L~Cystin Ir-Glutamin s äur e L" Glutamin Glycin Ir-Hißtidin (freie Base) L-Hydr oxypr ο lin L-Isoleucin (AlIo frei) L-Leucin (Methionin frei) Ir-Lysin HCl L-Metkionin L-Phersyialanin If-Prolin (Hydroxyl-Ir-Prolin frei) 3> Serin Ir-Threonin (AlIo frei) L~Tryptophan Ir-Thyrosin Ir-Valin Biotin

100,0 400,0 100,0 6000,0 2000,0 1512,0 2000,0

1,0

5,0

200,0

50,0

20,0

50,0

20 _s0 300,0

10,0 15,0

20,0 50,0 50,0 40,0 15,0 15,0 20,0 3O₅O 2O₅O

5*0 20_so 20,0

0.2

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D-Oa-pantothenat 0,25

Cholin-Chlorid 3,0

Folsäure 1,0

i-Inosit 35$O

Hikotinamid 1,0

Para-aminobenzoesäure . 1_fO

Pyridoxin HCl 1,0

Riboflavin 0,2

Tüiamin HCl . 1,0

Vitamin B^₂ 0,005

Moore, G* E·,. Sandberg, A„ A. and Ulrich, K₈, J* Vat« Can Inst«, 36/3: 4-05 (March, 1966)« Ss ist im Handel erhältlich.

Die Zellzahl wird im Coulter-Counter (Herstellers Coulter Electronics, Erefeld) bestimmt und die Lymphozyten-Suspension EUt EPiIL 1640 Medium auf 1 χ Λ(?.. Zellen pro ml eingestellt» 0,7 ml dieser Zellsuspension werden zentrifugiert, das Sediment in 3 ml EPiQ". 1640 Medium aufgenommen, das O₅OI mg/ml Poly~L-lysin MG 3400 enthält und über 18 Stunden irücubiert« Danach werden die Lymphozyten abzentrifugiert und 3 des "überstandes mit 1 ml einer Zellsuspension (5.x 10' stabilisierte und tannierte Erythrozyten pro ml Hanks¹) 1-2 Stunden inkubiert« Anschließend wird diese Zellsuspension zur Messung in ein Gerät für die Zellelektrophorese gegeben und die elektrophoretisch^ Wanderung der Partikel diagnostisch auf das Vorliegen einer Krebserkrankung ausgewertete

Als Gerät für die Zellelektrophorese dient ein Mikroskop, das zur Bestimmung der elektrischen Oberflächenladung suspen dierter mikroskopischer Teilchen auf Grund ihrer Wanderungs-

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geschwindigkeit im elektrischen Feld (Elektrophorese) geeignet ist. Die dazu benutzte Suspension befindet sich in der Meßkammer eines sogenannten Slektrophoresesystems» Die optische Achse des Mikroskops ist horizontal angeordnet_s da die Meßkammer senior echt stehen muß· Dadurch werden Einflüsse ausgeschaltet $ v/elche die Messung der WanderuBgsgeschwindig»· keit verfälschen können» '

Claims (1)

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   1«, In vitro durchzuführendes diagnostisches Verfahren₅ gekennzeichnet dadurchj daß Lymphozyten mit einem synthe~ tischen Peptid hoher Basizität inkubiert werden_} wonach deren Waaderungsgeschwindigkeit im. elektrischen Feld"gemessen wird* · .

   2β Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß nach Inkubation der Lymphozyten mit dem synthetischen Peptid entweder das Inkubationsgemisch oder der zellfreie Überstand su einer Dispersion von Indikatorpartikeln gegeben und sodann deren Wanderungsgeschwindigkeit; im elektrischen Feld gemessen wird«

   3«. Verfahren nach einem der Punkte 1 und 2, gekennzeichnet dadurch j daß als synthetisches Peptid hoher Basizität ein synthetisches Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus Lysinj Arginin oder Ornithin, verwendet wird»

   4* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3» gekennzeichnet dadurch, daß als synthetisches Peptid hoher Basizität Poly-Ir-Lysin, PoIy-L-Arginin oder PoIy-Ir-Ornithin verwendet wird© "

   5· Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch _t daß als synthetisches Peptid hoher Basizität Poly-Ir-Lysin mit einem Molekulargewicht von 750 - 100*000 verwendet wird©