DD142973A1 - Enzymelektrode zur atp-bestimmung - Google Patents

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DD142973A1
DD142973A1 DD21246579A DD21246579A DD142973A1 DD 142973 A1 DD142973 A1 DD 142973A1 DD 21246579 A DD21246579 A DD 21246579A DD 21246579 A DD21246579 A DD 21246579A DD 142973 A1 DD142973 A1 DD 142973A1
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enzyme electrode
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Frieder Scheller
Dorothea Pfeiffer
Ingrid Seyer
Klaus Riedel
Oda Scheller
Martina Siepe
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Frieder Scheller
Dorothea Pfeiffer
Ingrid Seyer
Klaus Riedel
Oda Scheller
Martina Siepe
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Enzymelektrode zur ATP-Bestimmung. Sie eignet sich besonders fuer den Einsatz in klinischen Labors, in der Mikrobiologie und Arzneimittelforschung. Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch die Kombination billiger Enzyme die ATP-Konzentration ohne Kofaktorverbrauch in physiologischen und mikrobiologischen Loesungen zu bestimmen. Die erfindungsgemaesse Enzymelektrode ist eine O&exp-!&ind2! oder H&ind2!O&ind2!-anzeigende Elektrode, die mit einer Enzymschicht versehen ist, in der die Glukoseoxidase und Hexokinase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und mit einem Dialyseschlauch abgedeckt ist. In die Messloesung wird eine definierte Glukosemenge zugegeben. die ATP-Bestimmung ist mit dieser Elektrode einfacher und billiger durchzufuehren.

Description

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Enzymelektrode zur ATP-Bestimmung Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von ATP. Die Enzymelektrode ist besonders für den Einsatz im klinischen Labor, in der Arzneimittelforschung sowie der Mikrobiologie geeignet, wo auf der Basis der ATP-Messung die enzymatisch^ Aktivität von Kinasen sowie die Konzentration derer Substrate (z.B. Glyzerol, Kreatinin), die Aktivität von ATP-asen sowie deren Hemmstoffen (herzwirksame Medikamente) und die Keimzahl in physiologischen und Permentationslösungen bestimmt werden kann.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Eine bekannte Methode zur ATP-Bestimmung beruht auf der ATP-abhängigen Lumineszenz von Luciferin in Gegenwart von Luciferase. Der Nachteil dieser Methodik liegt in dem großen apparativen Aufwand (Flurometer) sov/ie dem hohen Preis von Luciferin und Luciferase.
Eine andere Methode koppelt die Reaktionen von Hexokinase und Glukose-6~Phor>phatdehydrogenase, wobei das in der
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ersten Reaktion entstehende -G-6-P. unter Bildung von NADPH oxidiert wird. Die Messung der ATP-Konzentration erfolgt über die spektralphotometrisch gemessene NADPH-Menge. Der Nachteil dieser Methode liegt in der Notwendigkeit eines Spektralphotometers sowie des Verbrauchs von NADP in jeder Messung (Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, G. Guilbault, M. Dekker Inc., New York 1976).
Ziel der Erfindung
Das Ziel der Erfindung ist es, durch die Kombination billiger Enzyme die ATP-Konzentration mittels Enzymelektrode ohne Kofaktorverbrauch in physiologischen und mikrobiologischen Lösungen zu bestimmen«,
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Kombination der Enzyme Glukoseoxidase (GOD) und Hexokinase (HK) ein Signal zu erhalten, das von der ATP-Konzentration abhängt. Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst, daß die beiden Enzyme gemeinsam in einer Schicht vor einer üblichen Sauerstoffelektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt ist. In Abwesenheit von ATP tritt durch die Glukoseoxidation ein O^-Verbrauch auf, der der zugesetzten Glukosemenge proportional ist (Prinzip der Glukoseelektrode (F. Scheller et al., Z.med.Lab.Diagn. 18, 312(1977)). Bei Zugabe von ATP zu dieser Lösung wird ein Teil der Glukose durch die HK vor der Elektrode zu G-6-P umgesetzt, so daß eine Verkleinerung des Signals für Glukose auftritt, die von der ATP-Menge abhängt.
GOD Glukose + O2 Glukonsäure + H?02
HK Glukose + ATP G-6-P + ADP
Die erfindungsgemäße Enzymelektrode arbeitet also ohne die Verwendung eines Kofaktors. Sie erlaubt sowohl die kontinuierliche als auch die punktweise Bestimmung der ATP-Konzentration mit einfachen Geräten (pOp-Meter.) und ersetzt
-3- . 212465
teure Enzyme durch GOD«
Zur Bestimmung von Substraten von Kinaaen ist es zweckmäßig, daß die Enzymschicht zur Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich mit Glyzerol- oder Keratininkinase versehen ist·
Ausführungsbeiapiele
Die Erfindung soll nachstehend an 3 Ausführungsbeispielen erläutert werden·
EeispjLeJL
2000 U GOD und 300 U HK werden in 0,3 ml Lösung von 5 mg Acrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von 8 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und photopolymerisiert. Ein 3x3 großes Pilmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelbar vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert. Über die.Enzymschicht wird ein Dialyseschlauch mit einem O-Ring über den Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6 mit 10 mM MgCIp und ist an ein pOp-Meter mit Schreiber angeschlossen.
Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hatj wird eine Menge an Glukose zugegeben, sodaß die Konzentration in der Meßlösung 0,5 mM beträgt» ITach 2 Minuten ist der stationäre Strooiwert erreicht und es erfolgt 8-mal die Zugabe von jeweils 0,25 mM ATP (Aufnahme der Eichkurve)· Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung des Glukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach ATP-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt. Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete. Zur Messung der ATP-ase-Aktivität wird eine Lösung, die 0,5 mM Glukose und 2mM AT? enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitzt, wird die ATP-ase-Probe zugegeben. Durch die'Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die ATP-Konzentration verkleinert wird. Aus der Eichkurve kann damit die ATP-ase-Aktivi tät errechnet werden.
Der Zusatz von ATPase-Hemmern, z.B* Ouabain, ruft eine Verklei nerung des Anstiegs hervor. Durch Variation der Inhibitor-
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konzentration wird die notwendige Konzentration zur 50%igen Hemmung der ATP-ase ermittelt. Diese Größe ist ein Maß der Herzwirksamkeit von Medikamenten
2._BeispiejL
Eine photopolymerisierte Enzymschicht, die nur GCD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die Oo-Elektrode aufgebracht. Anschliessend wird eine zweite Polyacrylamidschicht von 100/U Dicke, die 30 U HK und 20 U Glyzerokinase je cm2 enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyaeschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenrnantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die 0,5 mlvl Glukose, 1 ml ATP und 1 mM HgGl2 in 0,1 M Phosphatpuff er pH 6 enthält. Nachdem sich der Strom stabilisiert hat werden 100/ul der Glyzerol-haltigen Meßprobe zugegeben. In der Enzymreaktion wird eine zur Ausgangskonzentration an Glyzerol proportionale ATP-Menge verbraucht, die aus der Änderung des Stromes über die Eichkurve bestimmt wird. Die Messung dauert 2 Minuten.
Über"den Elektrodenmantel wird ein Dialyseschlauch gespannt, auf dem eine Enzymschicht mit GOD und HK (wie in Beispiel 1). mit einem zweiten Dialyseschlauch fixiert wird. Die Pt-Elektrode wird auf >600 mV gegenüber der Bezugselektrode polarisiert, sodaß die HgOp-Oxidation erfaßt wird. Die Elektrode ist an einen Analogdifferenzierer angeschlossen, der den maximalen Anstieg der Strom-Zeit-K-urve anzeigte Der Grundstrom stellt sich in 2 ml einer Pufferlösung von pH mit 0,5 rnM Glukose, 1 mM MgCl2 ein. Danach erfolgt die Zugabe von 50/Ul des Filtrates, der mit Trichloressigsäure behandelten Fermentationslösung. Die Geschwindigkeit des Stromabfalls ist der ATP-Konzentration proportional, sodaß die Keimzahl über die ermittelte ATP-Konzentration erhalten wird. Bei glukosehaltigen Meßproben wird vor der ATP-Messung mit einer nur GOD-enthaltenden Enzymelektrode die Glukosekonzentration ermittelt und bei der Auswertung berücksichtigt·

Claims (2)

  1. & ϊ £. ν **
    Erfindungsangpruch
    t» Enzymeiektrode zur Beatimmung von ATP mittels einer Op- oder H^Op-attzeigenden Elektrode dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit einer Enzymachicht, in der Glukoseoxidase und Hexokinase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und durch einen Dialyseschlauch abgedeckt ist, wobei in die Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt ist,
  2. 2. Enzymelektrode nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht zur Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich Glyseroi- oder Kreatiüinkinase enthält·
DD21246579A 1979-04-25 1979-04-25 Enzymelektrode zur atp-bestimmung DD142973B1 (de)

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DD21246579A DD142973B1 (de) 1979-04-25 1979-04-25 Enzymelektrode zur atp-bestimmung
DE19803010119 DE3010119A1 (de) 1979-04-25 1980-03-15 Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren
FR8007590A FR2455279A1 (fr) 1979-04-25 1980-04-03 Electrode a base d'enzymes pour la determination de cofacteurs

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DD142973A1 true DD142973A1 (de) 1980-07-23
DD142973B1 DD142973B1 (de) 1982-06-30

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900423A (en) * 1986-04-02 1990-02-13 Unitika Ltd. Enzyme sensor using immobilized glucokinase
EP0516610A1 (de) * 1991-05-10 1992-12-02 AVL Medical Instruments AG Vorrichtung zur Bestimmung des Materieflusses

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900423A (en) * 1986-04-02 1990-02-13 Unitika Ltd. Enzyme sensor using immobilized glucokinase
EP0516610A1 (de) * 1991-05-10 1992-12-02 AVL Medical Instruments AG Vorrichtung zur Bestimmung des Materieflusses

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